Məlumat

7.12E: Genetik materialla (DNT və RNT) manipulyasiya etmək üçün əsas üsullar - Biologiya

7.12E: Genetik materialla (DNT və RNT) manipulyasiya etmək üçün əsas üsullar - Biologiya



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Genetik materialın manipulyasiyasında istifadə olunan əsas üsullara ekstraksiya, gel elektroforezi, PCR və ləkələmə üsulları daxildir.

TƏLİM MƏQSƏDLƏRİ

DNT və RNT-ni manipulyasiya etmək üçün istifadə olunan əsas üsulları ayırd edin

Əsas Nöqtələr

  • Nuklein turşularını öyrənmək və ya onlarla işləmək üçün ilk addım hüceyrələrdən DNT və ya RNT-nin təcrid edilməsi və ya çıxarılmasını əhatə edir.
  • Gel elektroforezi molekulları ölçüsünə görə ayırmaq üçün neytral və ya əsas pH-da nuklein turşularında mövcud olan mənfi yüklü ionlardan asılıdır.
  • Əlavə analiz üçün polimeraza zəncirvari reaksiyadan istifadə etməklə DNT-nin xüsusi bölgələri gücləndirilə bilər.
  • Southern blotting DNT-nin neylon membrana köçürülməsini nəzərdə tutur, şimal blotting isə RNT-nin neylon membrana köçürülməsidir; bu üsullar nümunələrin müəyyən ardıcıllıqların mövcudluğunu yoxlamağa imkan verir.

Əsas Şərtlər

  • denaturasiya: qızdırma, pH dəyişməsi və ya müəyyən kimyəvi maddələrə məruz qalma nəticəsində zülalın qatlanan strukturunun (və beləliklə, fiziki xüsusiyyətlərinin) dəyişməsi
  • elektroforez: zülallar və ya nuklein turşuları kimi böyük molekulların kolloid məhlulunu elektrik sahəsinin təsiri altında gel vasitəsilə köçürməklə onların ayrılması və təhlili üsulu
  • polimeraza zəncirvari reaksiya: nümunədən DNT-nin çoxsaylı nüsxələrini yaratmaq üçün molekulyar biologiyada texnika

Genetik materialı (DNT və RNT) manipulyasiya etmək üçün əsas üsullar

Nuklein turşuları ilə işləmək üçün istifadə olunan əsas texnikaları başa düşmək üçün unutmayın ki, nuklein turşuları fosfodiester bağları ilə bağlanmış nukleotidlərdən (şəkər, fosfat və azotlu əsas) ibarət makromolekullardır. Bu molekullardakı fosfat qruplarının hər birinin xalis mənfi yükü var. Nüvədəki DNT molekullarının bütün dəsti genom adlanır. DNT-də qoşalaşmış əsaslar arasında hidrogen bağları ilə əlaqəli iki tamamlayıcı zəncir var. İki zəncir yüksək temperaturlara məruz qalaraq (DNT denaturasiyası) ayrıla bilər və soyudularaq yenidən qızdırıla bilər. DNT DNT polimeraza fermenti tərəfindən təkrarlana bilər. Eukaryotik hüceyrələrin nüvəsində yerləşən DNT-dən fərqli olaraq, RNT molekulları nüvəni tərk edir. Təhlil edilən RNT-nin ən çox yayılmış növü messenger RNT-dir (mRNA), çünki o, aktiv şəkildə ifadə olunan protein kodlaşdıran genləri təmsil edir.

DNT və RNT çıxarılması

Nuklein turşularını öyrənmək və ya manipulyasiya etmək üçün əvvəlcə DNT və ya RNT təcrid olunmalı və ya hüceyrələrdən çıxarılmalıdır. Bu, müxtəlif texnikalar vasitəsilə edilə bilər. Nuklein turşusunun çıxarılması üsullarının əksəriyyəti hüceyrəni açmaq və arzuolunmaz bütün makromolekulları (arzuolunmaz molekulların parçalanması və DNT nümunəsindən ayrılma kimi) məhv etmək üçün enzimatik reaksiyalardan istifadə etmək üçün addımları əhatə edir. Hüceyrələr bir liziz tamponu (əsasən yuyucu vasitə olan bir həll) istifadə edərək qırılır; lizis "parçalamaq" deməkdir. Bu fermentlər hüceyrənin və nüvənin membranlarında olan lipid molekullarını parçalayır. Makromolekullar zülalları parçalayan proteazlar və RNT-ni parçalayan ribonukleazlar (RNTazlar) kimi fermentlər vasitəsilə inaktivləşdirilir. DNT daha sonra spirt istifadə edərək çökdürülür. İnsan genomik DNT adətən jelatinli, ağ kütlə şəklində görünür. Nümunələr -80°C-də illərlə saxlanıla bilər.

Hüceyrələrdə gen ifadə nümunələrini öyrənmək üçün RNT analizi aparılır. RNT təbii olaraq çox qeyri-sabitdir, çünki RNT-lər təbiətdə adətən mövcuddur və inaktivləşdirilməsi çox çətindir. DNT kimi, RNT hasilatı makromolekulları təsirsiz hala gətirmək və RNT-ni qorumaq üçün müxtəlif tamponların və fermentlərin istifadəsini nəzərdə tutur.

Gel elektroforezi

Nuklein turşuları sulu mühitdə neytral və ya əsas pH-da mənfi yüklü ionlar olduqları üçün elektrik sahəsi ilə hərəkətə keçə bilərlər. Gel elektroforezi bu yükdən istifadə edərək ölçü əsasında molekulları ayırmaq üçün istifadə edilən bir texnikadır və bütöv xromosomlar və ya fraqmentlər kimi ayrıla bilər. Nuklein turşuları məsaməli gel matrisinin mənfi elektrodu yaxınlığındakı yuvaya yüklənir və gelin əks ucundakı müsbət elektroda doğru çəkilir. Kiçik molekullar geldəki məsamələrdən daha böyük molekullara nisbətən daha sürətli hərəkət edir; köç sürətindəki bu fərq fraqmentləri ölçüyə görə ayırır. Ölçü müqayisəsini təmin etmək üçün molekullarla yanaşı işlənə bilən molekulyar çəkidə standart nümunələr var. Gel matrisindəki nuklein turşuları müxtəlif flüoresan və ya rəngli boyalardan istifadə etməklə müşahidə edilə bilər. Fərqli nuklein turşusu fraqmentləri ölçülərinə görə gelin yuxarı hissəsindən (mənfi elektrod ucu) müəyyən məsafələrdə lentlər şəklində görünür.

Polimeraza zəncirvari reaksiya ilə nuklein turşusu fraqmentlərinin gücləndirilməsi

Polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) əlavə analiz üçün DNT-nin xüsusi bölgələrini gücləndirmək üçün istifadə edilən bir texnikadır. PCR laboratoriyalarda bir çox məqsədlər üçün istifadə olunur, məsələn, genetik xəstəliklərin təhlili üçün gen fraqmentlərinin klonlaşdırılması, nümunədə çirkləndirici xarici DNT-nin müəyyən edilməsi və ardıcıllıq üçün DNT-nin gücləndirilməsi. Daha praktik tətbiqlərə atalığın müəyyən edilməsi və genetik xəstəliklərin aşkarlanması daxildir.

DNT fraqmentləri də əks transkriptaza PCR (RT-PCR) adlanan prosesdə RNT şablonundan gücləndirilə bilər. İlk addım DNT nukleotidlərini mRNT-yə tətbiq etməklə orijinal DNT şablon zəncirini (cDNA adlanır) yenidən yaratmaqdır. Bu proses əks transkripsiya adlanır. Bunun üçün əks transkriptaza adlı bir fermentin olması lazımdır. cDNA hazırlandıqdan sonra onu gücləndirmək üçün adi PCR istifadə edilə bilər.

Hibridləşmə, Cənubi Blotting və Northern Blotting

Parçalanmış genomik DNT və RNT ekstraktları kimi nuklein turşusu nümunələri müəyyən ardıcıllığın mövcudluğu üçün yoxlanıla bilər. Zondlar adlanan qısa DNT fraqmentləri aşkarlanmağa kömək etmək üçün radioaktiv və ya flüoresan boyalarla hazırlanmış və etiketlənmişdir. Gel elektroforezi nuklein turşusu fraqmentlərini ölçülərinə görə ayırır. Daha sonra geldəki fraqmentlər blotting adlanan prosedurla neylon membrana köçürülür. Membran səthinə bağlanmış nuklein turşusu fraqmentləri daha sonra xüsusi radioaktiv və ya flüoresan işarəli zond ardıcıllığı ilə yoxlana bilər. DNT bir neylon membrana köçürüldükdə, texnika Southern blotting adlanır; RNT neylon membrana köçürüldükdə buna şimal blotlama deyilir. Cənubi ləkələr müəyyən bir genomda müəyyən DNT ardıcıllığının varlığını aşkar etmək üçün istifadə olunur və şimal ləkələri gen ifadəsini aşkar etmək üçün istifadə olunur.