Məlumat

Statistik olaraq, niyə kimyəvi mutagenezlə müalicə olunan yumurtalarda mutasiyaya uğramış genlərin sayı birdir?

Statistik olaraq, niyə kimyəvi mutagenezlə müalicə olunan yumurtalarda mutasiyaya uğramış genlərin sayı birdir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

-dən götürülmüşdür Neyrologiyada Tədqiqat Texnikaları üçün Bələdçi [1]:

Kimyəvi mutagenezdə bir alim etil metan sulfonat (EMS) və ya N-etil-N-nitrozourea (ENU) kimi mutagenləşdirici kimyəvi maddəni minlərlə yumurta/larvaya tətbiq edir ki, bu da statistik olaraq mutasiyaya malik heyvanların cizgilərini yaradır. genomda tək gen.

Mənim fərziyyəm ondan ibarətdir ki, mutasiyaya uğramış genlərin sayının diskret ehtimal paylanması orta=1 olan normal paylanma ilə təxmin edilə bilər, buna görə də statistik olaraq mutasiyaya uğramış genlərin sayının bir olduğu deyilir. Bəs elm adamları hansı orqanizmin və ya hüceyrənin yalnız bir mutasiyaya uğramış genin və ya yalnız kimyəvi mutagenez nəticəsində yaranan bir mutasiyaya uğramış genin olduğunu necə bilə bilər?


[1] Carter, Matt və Jennifer C. Shieh. Neyrologiyada Tədqiqat Texnikaları Bələdçisi. Akademik Mətbuat, 2015. ISBN: 978-0-12-374849-2


Reminin də qeyd etdiyi kimi, gözlənilən mutasiya sayı normal paylanmaya (ND) uyğun gəlməyəcək, çünki ND-nin də mənfi dəyərləri olacaq, çünki o, $(-infty,infty)$ arasında dəyişir. Bir çox hallarda ND təxmin edilə bilər, çünki dispersiya o qədər az olacaq ki, praktiki olaraq heç bir mənfi dəyər tapa bilməyəcəksiniz. Bununla belə, bütün bioloji statistikaları standart olaraq ND hesab etmək yanlış bir fərziyyədir. Zəhmət olmasa bu posta baxın. Əsasən, ND təxminləri mərkəzi limit teoreminə əməl edən çoxlu ölçmələrdə edilə bilər. İndi, 1-də mərkəzləşdirilmiş ND vəziyyətinizdə bunun necə mümkün olmadığını sizə izah edəcəyəm. Sizdə 2 və 2-dən çox mutasiya ola bilər, lakin 0-dan az mutasiya ola bilməz. Paylanma simmetrik deyil və sağa əyilmişdir. Siz həmçinin fraksiya mutasiyalara malik ola bilməzsiniz və buna görə də paylama diskret olmalı və davamlı olmamalıdır.

Mutagenezin özü bir Puasson prosesi kimi modelləşdirilə bilər. Bu barədə daha çox məlumat üçün bu posta baxın. Beləliklə, zaman pəncərəsində $k$ mutasiyalarının ehtimalı, $t$ aşağıdakı tənliklə təmsil oluna bilər:

$$P(n=k)=frac{(lambda t)^ke^{-lambda t}}{k!}$$

Burada $lambda$ mutagenez sürətidir.

Mutasyonların orta sayı (həmçinin Puasson paylanması üçün dispersiya) $lambda t$ olacaq.

İndi mutagenezin sürəti mutagenin konsentrasiyası ilə mütənasib olacaq. I spekulyasiya etmək onlar arasındakı əlaqənin doyma kinetikasına (Michaelis-Menten kimi) əməl edəcəyini, lakin daha aşağı konsentrasiyalarda o, mahiyyətcə xətti olacaq.

Üstəlik, mutagenezin sürəti də hüceyrə tipindən asılı olacaq.

Buna görə də, standartlaşdırma tələb olunur və bu sahədə uzun müddət işləyən laboratoriyalar çoxsaylı mutasiyaların qarşısını almağa imkan verən standartlaşdırılmış protokollar (xüsusi mutagen konsentrasiyaları və müalicə müddətləri ilə) hazırlayırlar. Bununla belə, qeyri-mutantları süzgəcdən keçirmək üçün çoxlu fərdləri sınamalı olurlar.

Prinsipcə, sehrli nömrə yoxdur.


İrəli genetik ekran yanaşması ilə siz orqanizmi mutageninizlə müalicə edəcək və mutantlar yaratmaq üçün onları keçəcəksiniz. İrəli genetika ilə bir genin xəritəsini çıxarmaq üçün fenotipdən istifadə edirsiniz. Siz mutantları fenotip əsasında təcrid edirsiniz və mutasiyanın eyni gendə və ya fərqli genlərdə olub-olmadığını müəyyən etmək üçün tamamlama testi həyata keçirirsiniz. Bu klassik olaraq edildi Drosophila.

Klassik genetik yanaşmaya əsasən, tədqiqatçı daha sonra digər qeyri-adi xüsusiyyətləri daşıyan fərdlərlə çarpazlaşaraq və iki əlamətin birlikdə nə qədər tez-tez miras alındığına dair statistik məlumatlar toplamaq yolu ilə onun xromosomunda genin yerini müəyyənləşdirir (xəritəsini). Klassik genetiklər yeni mutant allellərinin xəritəsini çıxarmaq üçün fenotipik əlamətlərdən istifadə edərdilər. Nəhayət, ümid odur ki, bu cür ekranlar kifayət qədər böyük miqyasda olacaq ki, yeni yaranan mutasiyaların əksəriyyəti və ya hamısı genomu mutasiyalarla doyuran ikinci bir lokusu təmsil edəcək. Klassik eksperimentlərdə bu tip doyma mutagenezindən spesifik fenotiplərin görünüşü üçün minimum olan gen dəstlərini müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir. Bununla belə, bu cür ilkin ekranlar ya natamam idi, çünki onlarda lazımsız lokuslar və epigenetik effektlər yox idi və birbaşa ölçülə bilən fenotipləri olmayan müəyyən fenotiplər üçün belə ekranların icrası çətin idi. Bundan əlavə, klassik genetik yanaşma əhəmiyyətli dərəcədə uzun çəkir.

Mənbə: Vikipediya

Bu cavabı yerləşdirməyimin səbəbi mənbənizin 335-də verilmiş kimyəvi mutagenez konteksti ilə bağlıdır:

Kimyəvi mutagenez EMS və ya ENU kimi kimyəvi maddələrin, irəli genetik ekranın aparılması məqsədilə yüzlərlə və ya minlərlə yumurta/larvanın mutagenləşdirilməsi üçün istifadəsi.


Məncə, mətn nə deyir

Sitat etdiyiniz mətn bir az anlaşılmazdır (qeyd edək ki, bu, istifadə olunan dil nəzərə alınmaqla nəzərdən keçirilən məqalə deyil). Sitata əsaslanaraq düşünürəm ki, müalicə elə seçilir ki, gözlənilən mutasiya sayı 1 olsun.

Bəs elm adamları hansı orqanizmin və ya hüceyrənin yalnız bir mutasiyaya uğramış gen ehtiva etdiyini necə bilə bilər?

Güman edirsiniz ki, onlar tək mutasiya olanları tapmaq üçün sətirlər arasından keçirlər. Sitatlanan mətnin iddia etdiyi bu deyil. Sitat edilən mətn yalnız müalicənin genom başına 1 nisbətində mutasiyalar yaratdığını bildirir.

Əgər onlar haradasa bir mutasiyaya malik olanları seçmək üçün sətirlər arasından keçməli olsaydılar, o zaman ardıcıllıq yeganə həll yolu olardı.

Statistikaya dair qeyd

Müalicədən sonra mutasiyaya uğramış genlərin sayı, ehtimal ki, Poisson paylanmışdır, normal olaraq paylanmır. Normal paylanma onsuz da davamlı ehtimal paylanmasıdır və $-infty$ və $+infty$ arasında məhdudlaşır, mənfi sayda mutasiya isə heç bir məna kəsb etmir.

Postun dizaynına diqqət yetirin

Mənbəyə birbaşa keçid etməlisiniz. Cavab vermək istəyənlər üçün daha asan olacaq


Dupleks ardıcıllığından istifadə edərək in vivo mutagenez və kanserogenezin birbaşa kəmiyyətinin müəyyən edilməsi

Səhvlə düzəldilmiş yeni nəsil ardıcıllıq (ecNGS) hər hansı bir toxumada, istənilən növdən, istənilən genomik məkanda ətraf mühitə məruz qalmaların və ya endogen proseslərin in vivo mutagen təsirini sürətlə aşkar etmək və kəmiyyətini müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər. Mövcud metodlarla müqayisədə ecNGS-nin daha yüksək sürəti, yüksək miqyaslılığı, daha zəngin məlumat çıxışları və növlər arası və çarpaz yerlərdə tətbiqi onu mutasiya tədqiqatları, tənzimləyici təhlükəsizlik testləri və yeni yaranan klinik tətbiqlər üçün güclü yeni alətə çevirir.


MATERİALLAR VƏ METODLAR

Kök populyasiyası: 1998-ci ilin oktyabrında biz panmiktik laboratoriya populyasiyasına başladıq D. melanoqaster Ithaca, NY-da vəhşi populyasiyadan nümunə götürülmüş 50 cütləşmiş dişilərdən. Bu populyasiya eksperiment başlamazdan əvvəl üç nəsil ərzində 16 ° -dən aşağı saxlanıldı.

Mədəni vəziyyət: Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə, milçəklər 12/12 işıq dövrü ilə, 25° və 75% rütubətdə yetişdirilmişdir. Biz 10 q aqar, 80 q pivə mayası, 80 q qlükoza və hər litr suya 8 ml propion turşusu olan 10 ml mühiti olan 95 × 25 mm flakonlardan istifadə etdik, bir neçə canlı maya dənələri ilə toxumlandı. CO2 milçəkləri idarə edərkən anesteziyadan istifadə olunurdu.

EMS mutagenezi: 1999-cu ilin yanvar ayında gövdə populyasiyasından ~500 kişi nümunə götürüldü. Kişilər 16 saat yeməksiz və susuz saxlanıldı və sonra 2% saxarozada EMS məhlulu (21,2 m m) ilə isladılmış filtr kağızı olan flakonlara 20 saat yerləşdirildi (A shburner 1989). Bu müalicədən altı saat sonra bu kişilər sperma dövranını stimullaşdırmaq və mutasiyaların məhsuldarlığını artırmaq üçün 24 saat birlikdə olduqları bakirə dişilərlə “vaxtından əvvəl doğuldular” (A shburner 1989). Bu dişilər atıldı və erkəklər daha çox analiz üçün nəsil çıxarmaq üçün yenidən cütləşdirildi.

Beş göz rəngində mutasiyaların aşkarlanması: Cəmi 200 EMS ilə müalicə olunan kişi, göz rənginə təsir edən aşağıdakı beş resessiv allel üçün homozigot olan 200 dişi ilə cütləşdi: pr 1 , cn 1 , bw 1 , st 1 , və kar 1. Hər birində 2 kişi və 2 dişi olan 100 flakon hazırladıq. Bir flakonda ~100 yumurta qoyulduqdan sonra valideynlər atıldı. Beləliklə, bir flakonun daşıma qabiliyyəti ~300 milçək olduğundan, nəsillər arasında rəqabət zəif idi. Hər bir flakondakı nəsillər gündəlik hesablanmış və göz rəngi mutantları üçün yoxlanılmışdır.

Kəmiyyət əlamətlərini yoxlamaq üçün milçək istehsalı: Cəmi 200 EMS ilə müalicə olunmuş erkək gövdə populyasiyasından (T cütləşməsi) yabanı tipli bakirə dişilərlə fərdi və təsadüfi cütləşdi. Eyni zamanda, gövdə populyasiyasından müalicə olunmamış 200 erkək və 200 bakirə dişi də fərdi və təsadüfi cütləşdi (U cütləşməsi). T və U cütləşmələrinin valideynləri 3 gündən sonra çıxarıldı və hər cinsin 3-4 nəsli hər bir qardaşdan ayrıca toplandı. Müxtəlif T və U cütləşmələrindən olan nəsillər fərdi və təsadüfi şəkildə dörd mümkün xaç növünü yaratmaq üçün cütləşdirildi: T × T, T × U, U × T və U × U (birinci simvol ananın mənşəyinə uyğundur, ikinci simvol isə atanın mənşəyinə uyğun gəlir). Həmçinin, bəzi hallarda biz eyni U cütləşməsində (U × UInbr). Valideynlər 3 gün bir yerdə saxlanılır, sonra təzə flakonlara köçürülür və yumurta qoymaq üçün 1 gün orada saxlanılır. Bu xaçlardan alınan nəsillər (F-milçəklər) inkişaf zamanı istisna olmaqla, bütün fitness analizləri üçün istifadə edilmişdir. Beləliklə, çox yüngül CO istifadə edərək, ehtiyatla rəftar edildi2 anesteziya.

İnkişaf vaxtı: Dörd növ xaç hazırlayan valideynlər (yuxarıya bax) sonra hər flakonda 10 dişi və 10 kişidən ibarət dəstlərə birləşdirildi və hər qrupa 2 saat ərzində yumurta qoymağa icazə verildi. Bu yumurtalar daha sonra 25° və ya 20° və daimi işığa qoyulur. Hər bir flakon üçün biz hər saat çıxan milçəkləri sayırdıq.

F-dişilərdə resessiv X ilə əlaqəli ölümcül mutasiyaların sayı

Həyat qabiliyyəti: S habalina prosedurlarına əməl etdik və b. (1997) bəzi dəyişikliklərlə. Dörd xaçdan 2-3 günlük bakirə F-milçəkləri gövdə populyasiyasından olan erkəklərlə cütləşdi və 3 gün aşağı sıxlıqda saxlanıldı. Bütün eksperimental sürfələrlə rəqabət üçün istifadə olunan istinad xətti homozigot ilə qeyd edilmişdir bw 1 allel, outbred və genetik olaraq kök populyasiyamıza bənzəyirdi. Referans xəttindən olan qadınlar eyni yaşda idi və eyni şəkildə rəftar edildi, lakin istinad xəttinin kişiləri ilə cütləşdirildi. Əvvəllər cütləşdirilmiş 5-6 günlük F-dişiləri və istinad xətti dişiləri 2 gün ərzində erkəksiz bir yerdə yerləşdirildi. Hər flakonda hər növdən 4 və ya 8 dişi var idi. 3-cü günün günorta saatlarında hər flakondan olan dişilər anesteziya olmadan, tərkibində zəif qida (20 q pivə mayası, 30 q qlükoza, 10 q agar və hər litr suya 0,2% propion turşusu) olan dar flakonlara (95 × 20 mm) köçürüldü. ) və 24 ± 0,1 saat ərzində yumurta qoymağa icazə verilir. 4-cü gün günorta saatlarında hər kiçik flakondan olan dişilər atılmadan əvvəl yumurta qoymaq üçün yenidən 4 ± 0,1 saat ərzində standart yaxşı qida olan böyük flakona (95 × 28 mm) köçürüldü. Bu dişilərin nəsli tükənməyə başlayanda vəhşi tipli və qəhvəyi gözlü milçəklərin sayı gündəlik hesablanır və 3 gün ərzində hər flakondan çıxarılır.

Məhsuldarlıq: Dörd xaçın hər birindən Virgin F-milçəkləri 3 gün ərzində aşağı sıxlıqda (hər flakonda ~25 milçək) saxlanıldı. Bundan sonra hər bir dişi gövdə populyasiyasından iki erkəklə fərdi olaraq cütləşdirilib və 3 gün onlarla saxlanılıb. Sonra, bu ailələr 40 dəqiqə ərzində və anesteziya olmadan təzə flakonlara köçürüldü və dişilər çıxarılmadan əvvəl 24 ± 0,1 saat ərzində yumurta qoydular. Hər dişinin erkək və dişi nəsli sayılmışdır.

X xromosomunda ölümcül mutasiyalar: Döllülük haqqında məlumatlar da ölümcül mutasiyaları aşkar etmək üçün istifadə edilmişdir. Biz belə nəticəyə gəldik ki, erkək nəslin sayı o qədər azdır ki, cins nisbətinin 1:1 olduğu fərziyyəsini 95% inamla rədd etmək olarsa, X ilə əlaqəli resessiv öldürücü üçün heterozigot ana tərəfindən bir qardaşlıq yaranmışdır.

Uzunömürlülük: Bakirə F-milçəkləri toplanmış və 3-4 gün ərzində aşağı sıxlıqda və optimal şəraitdə ayrıca saxlanılmışdır. Bundan sonra onlar pleksiglas qutulara köçürüldü. Hər 150 mm × 150 mm × 150 mm qutuda eyni cinsdən 300 milçək var idi. Milçəklər 25° və 70% rütubətdə saxlanılırdı. Yemək qutunun altındakı kiçik bir petri qabında verilir və gündəlik dəyişdirilirdi. Ölü milçəklər hər gün çıxarılır və qeydə alınır.

Metabolik dərəcələr: 5-6 günlük F-milçəkləri N-dən istifadə edərək yüngülcə anesteziya edildi2, cinsiyyətə bölünür və flakonlara yerləşdirilir. Sonra hər bir flakonu rezin tıxacla bağladıq. Milçəklər tez sağaldılar və anesteziyadan sonra 5 dəqiqə ərzində uça bildilər. Flakonlar CO ilə 90 ml/dəq axını ilə 15 saniyə ərzində yuyuldu2-su ilə doymuş (100% nisbi rütubət) otaq havası. Milçəklər kameralarda 1 saat 24,5°-də möhürlənmiş vəziyyətdə qaldı. 1,1 ml-lik (standart temperatur və təzyiq) qaz nümunəsi daha sonra şprislə flakondan çıxarıldı və Sable System TR-2 karbon qazı respirometriya sisteminə yeridildi. Sonra flakon CO ilə dolduruldu2-sərbəst hava və 1 saat sonra ikinci nümunə götürüldü. CO miqdarı2 hər milçək tərəfindən istehsal edilən DATACAN proqramından istifadə etməklə hesablanmışdır. Bu iki ölçmənin ortalaması istifadə edilmişdir.

F-milçəklərinin inkişaf vaxtının (saatlarla) vasitələri və standart səhvləri

Hərəkətlilik: F-erkəkləri 3 gün aşağı sıxlıqda və optimal şəraitdə saxlanıldı, bundan sonra onların hərəkətliliyi S habalina-da təsvir olunduğu kimi qaçış reaksiyası ilə yoxlanıldı. və b. (1997). Bir sözlə, qaçış reaksiyası aşağıdakı kimi ölçüldü. 10 kişidən ibarət dəst eksperimental borunun yuxarı hissəsində (500 mm × 40 mm × 40 mm) kiçik bir bölməyə yerləşdirildi və 30 saniyədən sonra boru tərsinə çevrildi və bölməni qalan hissədən ayıran sürüşmə divarı. boru çıxarıldı. Hər kişinin 100 mm-ə qalxması vaxtı qeydə alınıb.

—İki temperaturda F-milçəklərinin inkişaf vaxtının kumulyativ tezlik paylanması. (A) Dişilər 20 ° inkişaf etdi (B), kişilər 20 ° (C) inkişaf etdi, qadınlar 25 ° inkişaf etdi və (D) kişilər 25 ° inkişaf etdi.

Bədən çəkisi: Metabolik sürətin öyrənilməsində istifadə edilən milçəklər daha sonra mikrobalansda ən yaxın mikroqrama qədər çəkildi.

F-milçəklərin nəslinin həyat qabiliyyətinin vasitələri və standart səhvləri

Tük nömrələri: Dişilərin sternoplevral (hər iki tərəf) və abdominal (beşinci seqment) tüklərinin sayı qeydə alınıb.

Statistik təhlil: Bütün əlamətlərin paylanması normadan əhəmiyyətli dərəcədə kənara çıxmadı. Yeganə istisna canlılıq idi, bu halda log-transformasiyadan istifadə edildi. EMS mutagenezinin hər bir əlamətin orta göstəricisinə təsiri əlamət dəyərlərinin EMS ilə müalicə olunan genomun fraksiyasına reqressiya əmsalı kimi qeydə alınmışdır. Bu təsirlərin etibarlılıq hədləri istifadə edərək müəyyən edilmişdir t-test. Mutasiyalar arasında mümkün epistaz əlamətin orta dəyərinin EMS ilə müalicə olunan genom fraksiyasından asılılığında xəttilikdən əhəmiyyətli sapmalarla aşkar edilə bilərdi. EMS mutagenezinin U × U və T × T çarpazlarında əldə edilən F-milçəklərində əlamət paylanmasının dispersiyalarında fərqlər kimi göstərilən əlamətin dispersiyasına təsiri müqayisə edilmişdir. Təhlilin əksəriyyəti üçün JMP proqram paketindən istifadə edilmişdir.

— Dörd növ şəraitdə F-milçəklərin nəsillərinin həyat qabiliyyətinin kümülatif tezlik paylanması. (A) Yüksək sıxlıqlı və zəif qida (B) yüksək sıxlıq və yaxşı yemək (C) aşağı sıxlıq və zəif qida və (D) aşağı sıxlıq və yaxşı yemək.


İçindəkilər

Mutantlar yaratmaq üçün etil metansülfonat və dimetil sulfat, radiasiya və ya transpozon kimi kimyəvi mutagenlərdən istifadə kimi müxtəlif mutagen yetişdirmə növləri var. Mutasion yetişdirmə ümumiyyətlə bitkilərdə təbiətdə tapıla bilməyən və ya təkamül zamanı itirilən daha böyük toxumlar, yeni rənglər və ya daha şirin meyvələr kimi əlamətlər yaratmaq üçün istifadə olunur. [6]

Bitkilərin radiasiyaya məruz qalması bəzən radiasiya seleksiyası adlanır və mutagen yetişdirmənin alt sinfidir. Radiasiya seleksiyası 1920-ci illərdə Missuri Universitetindən Lewis Stadler qarğıdalı və arpa üzərində rentgen şüalarından istifadə edərkən aşkar edilmişdir. Arpa vəziyyətində yaranan bitkilər ağ, sarı, solğun sarı və bəzilərində ağ zolaqlar var idi. [7] 1928-ci ildə Stadler ilk dəfə bitkilərdə radiasiyanın səbəb olduğu mutagenezlə bağlı tapıntılarını dərc etdi. [8] 1930-2004-cü illər ərzində radiasiyaya səbəb olan mutant sortlar əsasən qamma şüalarından (64%) və rentgen şüalarından (22%) istifadə edilərək hazırlanmışdır. [4] : 187

Radiasiya yetişdirilməsi atom bağlarında [8] baş verə bilər və toxumları daha çox kosmik radiasiyaya məruz qoymaq üçün orbitə göndərilmişdir. [9]

İonlaşdırıcı şüalanma nəticəsində yaranan xromosom aberrasiyalarının yüksək dərəcələri və müşayiət olunan zərərli təsirlər tədqiqatçıları mutasiyaların yaranması üçün alternativ mənbələr axtarmağa məcbur etdi. Nəticədə bir sıra kimyəvi mutagenlər aşkar edilmişdir. Ən çox istifadə edilən kimyəvi mutagenlər alkilləşdirici maddələrdir. Etil metansülfonat (EMS) effektivliyi və idarə edilməsinin asanlığı, xüsusilə utilizasiya üçün hidroliz vasitəsilə detoksifikasiyası sayəsində ən populyardır. Nitrozo birləşmələri geniş istifadə olunan digər alkilləşdirici maddələrdir, lakin onlar işığa həssasdırlar və daha yüksək dəyişkənliyə görə daha çox tədbir görülməlidir. EMS, TILLING populyasiyalarının inkişafı kimi skrininq üçün çoxlu sayda mutantların inkişafı üçün ümumi istifadə edilən mutagenə çevrilmişdir. [10] Bir çox kimyəvi maddələr mutagen olsa da, praktiki seleksiyada yalnız bir neçəsi istifadə edilmişdir, çünki dozaları optimallaşdırmaq lazımdır və həmçinin çoxları üçün bitkilərdə effektivlik yüksək deyil.

Bağ tarixçisi Peyc Consona görə

İkinci Dünya Müharibəsindən sonra atom enerjisinin "dinc" istifadəsini tapmaq üçün birgə səy göstərildi. İdeyalardan biri, bitkiləri radiasiya ilə bombalamaq və çoxlu mutasiya yaratmaq idi, bəzilərinin isə daha ağır, xəstəliklərə və ya soyuqlara davamlı və ya sadəcə qeyri-adi rənglərə malik bitkilərə gətirib çıxaracağına ümid edilirdi. Təcrübələr əsasən ABŞ-da, eləcə də Avropada və keçmiş SSRİ ölkələrində milli laboratoriyaların bazasında nəhəng qamma bağlarında aparılıb. [11]

Geni dəyişdirilmiş qidalarla bağlı müzakirələrdə transgen proseslərin istifadəsi tez-tez mutagen proseslərlə müqayisə edilir və müqayisə edilir. [12] İnsan qida sistemlərində transgen orqanizmlərin bolluğu və müxtəlifliyi və onların kənd təsərrüfatının biomüxtəlifliyinə, ekosistemin sağlamlığına və insan sağlamlığına təsiri bir qədər yaxşı sənədləşdirilmiş olsa da, mutagen bitkilər və onların insan qida sistemlərindəki rolu daha az məlumdur, bir jurnalist "Az tanınmasına baxmayaraq, radiasiya seleksiyası minlərlə faydalı mutant və dünya məhsullarının əhəmiyyətli bir hissəsini istehsal etmişdir. düyü, buğda, arpa, armud, noxud, pambıq, nanə, günəbaxan, fıstıq, qreypfrut, küncüt, banan, manyok və sorqo." [7] Kanadada mutasiya yolu ilə yetişdirilən məhsullar gen mühəndisliyi ilə əldə edilən məhsullarla eyni qaydalara və sınaqlara məruz qalır. [13] [14] [15] [16] Mutagen sortlar, istifadə şərtləri kimi getdikcə daha çox məhdudiyyətlərə malik olan bir çox kommersiya bitki sortlarından və ya germplazmadan fərqli olaraq, bitki yetişdirilməsi üçün sərbəst buraxılmağa meyllidirlər [4] : 187 , patentlər və təklif olunan genetik istifadəçi məhdudiyyəti texnologiyaları və digər əqli mülkiyyət rejimləri və icra üsulları.

Tipik olaraq bir və ya iki hədəf genin daxil edilməsini nəzərdə tutan geni dəyişdirilmiş məhsullardan fərqli olaraq, mutagen proseslər nəticəsində təsadüfi, çoxsaylı və qeyri-spesifik genetik dəyişikliklərlə inkişaf etdirilən bitkilər [17] narahatlıq doğuran məsələ kimi müzakirə edilmişdir [18], lakin heç bir millətin üzvi bitkiləri tərəfindən qadağan edilmir. standartlar. ABŞ Milli Elmlər Akademiyasının hesabatlarında deyilir ki, gen mühəndisliyi ilə işlənmiş məhsulların tənzimlənməsi üçün heç bir elmi əsaslandırma yoxdur, eyni zamanda mutasiya ilə yetişdirilən bitkilər üçün deyil. [5]

Bir neçə üzvi qida və toxum şirkətləri həm kimyəvi, həm də nüvə mutagenezindən istifadə edərək hazırlanmış sertifikatlı üzvi məhsulları təbliğ edir və satırlar. [19] Şirkətləri GMO məhsullarının ciddi etiketlənməsini və ya açıq qadağalarını dəstəkləyən bir neçə sertifikatlı orqanik brendlər, bu genetik manipulyasiyaya istinad etmədən, markalı buğdadan və mutagen proseslərdən əldə edilən digər sort ştammlardan istifadəni bazara çıxarırlar. [19] Bu üzvi məhsullar üzvi pivələrdə istifadə edilən mutagen arpa və buğda tərkib hissələrindən [20] üzvi olaraq istehlakçılara birbaşa satılan mutagen qreypfrut sortlarına qədər dəyişir. [21]

Məhdudiyyət endonükleazları Redaktə edin

Bitki DNT-sindəki iki zəncirli qırılmaları öyrənmək üçün bakterial məhdudlaşdırıcı endonükleazların (RE) istifadəsinə maraq 90-cı illərin ortalarında başlamışdır. DNT-dəki bu qırılmaların, başqa cür DSBs kimi tanınan, eukaryotlarda çoxlu xromosom zədələnməsinin mənbəyi olduğu və bitki növlərində mutasiyalara səbəb olduğu aşkar edilmişdir. RE-lər bitki DNT-si üzərində ionlaşdırıcı şüalanma və ya radiomimetik kimyəvi maddələrin nəticəsinə oxşar nəticə yaradır. DNT-dəki küt sonlu qırılmaların, yapışqan sonlu qırılmalardan fərqli olaraq, xromosom zədələnmələrində daha çox variasiya meydana gətirdiyi və onları mutasiyaların yetişdirilməsi üçün daha faydalı qırılma növü etdiyi aşkar edilmişdir. RE-nin xromosom aberrasiyaları ilə əlaqəsi əsasən məməlilərin DNT-si üzərində aparılan tədqiqatlarla məhdudlaşsa da, məməlilər üzərində aparılan tədqiqatlardakı uğur elm adamlarının arpa genomlarında zədələnmiş RE-induksiya edilmiş xromosom və DNT ilə bağlı daha çox araşdırma aparmasına səbəb oldu. Məhdudiyyətli endonükleazların xromosomlarda və DNT-də zədələnməsini asanlaşdırmaq qabiliyyətinə görə, RE-lər mutasiyaya uğramış bitki sortlarının çoxalmasını təşviq etmək üçün yeni mutagenez üsulu kimi istifadə olunmaq qabiliyyətinə malikdir. [22]

Kosmik yetişdirmə Edit

Bitkilərin inkişaf və inkişaf qabiliyyəti kosmosda mikroqravitasiya və kosmik şüalanma kimi şərtlərdən asılıdır. Çin kosmosa toxum göndərərək bu nəzəriyyəni sınaqdan keçirir, kosmos uçuşlarının genetik mutasiyalara səbəb olub-olmadığını yoxlamaq üçün sınaqdan keçirir. 1987-ci ildən bəri Çin kosmosda yetişdirmə proqramı vasitəsilə kosmosdan 66 mutant çeşid yetişdirmişdir. Toxumlar aerokosmosa göndərildikdə, yer üzündəki analoqları ilə müqayisədə xromosom aberrasiyaları çox artdı. Kosmos uçuşunun toxumlara təsiri onların növündən və müxtəlifliyindən asılıdır. Məsələn, kosmosda yetişdirilən buğda, Yerə bağlı nəzarətlə müqayisədə toxum cücərməsində böyük bir artım gördü, lakin kosmosda yetişdirilən düyünün nəzarəti ilə müqayisədə heç bir nəzərəçarpacaq üstünlüyü yox idi. Kosmosa uçuş zamanı müsbət mutasiyaya uğramış növlər üçün onların böyümə potensialı təkcə Yerdə yetişdirilən həmkarlarının deyil, həm də Yerdəki şüalanmış həmkarlarının böyümə potensialını üstələyirdi. Ənənəvi mutagen üsullarla müqayisədə kosmosda yetişdirilmiş mutasiyaların effektivliyi daha yüksəkdir, çünki onlar ilk nəsil mutasiyaya müsbət təsir göstərirlər, halbuki şüalanmış bitkilər ilk nəsillərində çox vaxt sərfəli mutasiyalar görmürlər. Çoxsaylı təcrübələr kosmos uçuşunun toxum mutasiyasına müsbət təsirini göstərsə də, aerokosmik sahənin hansı aspektinin bu cür faydalı mutasiyalar meydana gətirdiyi ilə bağlı heç bir aydın əlaqə yoxdur. Kosmik şüalanmanın xromosom aberrasiyalarının mənbəyi olması ilə bağlı çoxlu fərziyyələr var, lakin indiyə qədər belə bir əlaqənin konkret sübutu yoxdur. Çinin kosmik heyvandarlıq proqramının çox uğurlu olduğu göstərilsə də, proqram böyük büdcə və texnoloji dəstək tələb edir ki, bu da bir çox digər ölkələrin təmin etmək istəmədiyi və ya edə bilməyəcəyi, yəni Çindən kənarda bu proqramın həyata keçirilməsi mümkün deyil. Bu cür məhdudiyyətlərə görə, elm adamları Yerdə eyni məqsədəuyğun kosmosda doğulmuş mutasiyaları təşviq etmək üçün Yerdəki kosmik vəziyyəti təkrarlamağa çalışırlar. Belə replikasiyalardan biri Yerinkindən daha zəif maqnit sahəsi olan bir sahə yaradan maqnit sahəsindən azad fəzadır (MF). MF müalicəsi mutagen nəticələr verdi və düyü və yoncanın yeni mutant sortlarının becərilməsi üçün istifadə edilmişdir. Kosmik şəraitin digər təkrarlanmalarına toxumların ağır 7 Li-ion şüası və ya qarışıq yüksək enerjili hissəciklərlə şüalanması daxildir. [23] Kosmosda yetişdirilən bu növlər artıq ictimaiyyətə təqdim olunur. 2011-ci ildə Çində keçirilən Milli Lotus Çiçəkləri Sərgisi zamanı gül sərgisində "Kosmos Günəşi" adlı mutant lotus nümayiş etdirilib. [24]

İon şüa texnologiyası Redaktə edin

İon şüaları genomdan çoxlu əsasları silməklə DNT-ni mutasiya edir. Qamma şüaları və rentgen şüaları kimi ənənəvi radiasiya mənbələri ilə müqayisədə ion şüalarının DNT-də bir-birinə toxunması daha çətin olan daha ciddi qırılmalara səbəb olduğu və DNT-dəki dəyişikliyin ənənəvi şüaların yaratdığı dəyişikliklərdən daha kəskin olmasına səbəb olduğu göstərilmişdir. şüalanma. İon şüaları DNT-ni elə bir şəkildə dəyişdirir ki, onun orijinal makiyajından çox fərqli görünsün, ənənəvi şüalanma üsullarından daha çox. İon şüası texnologiyasından istifadə edilən təcrübələrin əksəriyyəti Yaponiyada aparılıb. Bu texnologiyadan istifadə edən görkəmli obyektlər Yaponiya Atom Enerjisi Agentliyinin TIARA, RIKEN Sürətləndirici Tədqiqat Qurumu və digər müxtəlif Yapon institutlarıdır. İon şüası radiasiyası zamanı toxumlar iki kapton filmi arasında sıxılır və təxminən iki dəqiqə şüalanır. Mutasion tezliklər elektron şüalanma ilə müqayisədə ion şüa şüalanması üçün xüsusilə yüksəkdir və mutasiya spektri qamma şüası ilə müqayisədə ion şüa şüalanması üçün daha genişdir. Daha geniş mutasiya spektri ion şüaları tərəfindən istehsal olunan çox müxtəlif miqdarda çiçək fenotipləri vasitəsilə aşkar edilmişdir. İon şüaları ilə mutasiyaya uğramış çiçəklər müxtəlif rənglər, naxışlar və formalar nümayiş etdirirdi. İon şüa radiasiyası vasitəsilə bitkilərin yeni növləri becərildi. Bu bitkilər ultrabənövşəyi şüalara B-yə davamlı, xəstəliklərə davamlı və xlorofil çatışmazlığı kimi xüsusiyyətlərə malik idi. İon şüası texnologiyası daha möhkəm bitkilərin yaradılması üçün məsul olan yeni genlərin kəşfində istifadə edilmişdir, lakin onun ən çox yayılmış istifadəsi kommersiya məqsədi ilə zolaqlı xrizantema kimi yeni çiçək fenotiplərinin istehsalıdır. [25]

Qamma radiasiyası ilə müalicə olunan yetkin polen Edit

Qamma şüalanması, keçid üçün istifadə olunan ana bitkiləri istehsal etmək üçün yetkin düyü polenində istifadə olunur. Ana bitkilərdəki mutasiyaya uğramış əlamətlər onların nəsil bitkiləri tərəfindən miras alına bilir. Düyü poleninin ömrü çox qısa olduğundan, tədqiqatçılar qamma şüalarını düyü bitkilərindən yetişdirilmiş sünbüllərdə partlatmalı oldular. Təcrübə nəticəsində, şüalanmış quru toxumlardan daha çox şüalanmış polendə daha çox mutasiya olduğu aşkar edilmişdir. 46Gy qamma radiasiya ilə müalicə olunan polen ümumi taxıl ölçüsündə və digər faydalı dəyişikliklərdə artım göstərdi. Tipik olaraq, şüalanmış ana düyü bitkilərinin kəsişməsindən sonra hər bir taxılın uzunluğu daha uzun idi. Düyü nəsli də ana düyü bitkilərinin görünüşünü yaxşılaşdıraraq daha az təbaşirli bir görünüş nümayiş etdirdi. Bu texnika Çində iki yeni düyü sortunu, Jiaohezaozhan və Jiafuzhan yaratmaq üçün istifadə edilmişdir. Bu iki düyü sortunun yaradılmasını asanlaşdırmaqla yanaşı, yetkin düyü poleninin şüalanması təxminən iki yüz mutant düyü xətti meydana gətirdi. Bu xətlərin hər biri həm daha keyfiyyətli, həm də daha böyük ölçüdə düyü taxılları istehsal edir. Bu texnikanın yaratdığı mutasiyalar hər nəsildə dəyişir, yəni bu mutasiyaya uğramış bitkilərin daha da çoxalması yeni mutasiyalar yarada bilər. Ənənəvi olaraq, qamma şüalanması polen üzərində deyil, yalnız yetkin bitkilərdə istifadə olunur. Yetkin tozcuğun şüalanması mutant bitkilərin qamma radiasiyası ilə birbaşa təmasda olmadan böyüməsinə imkan verir. Bu kəşf əvvəllər qamma şüalanması ilə bağlı inanılanlardan fərqlidir: o, yalnız bitkilərdə mutasiyalar yarada bilər, polen yox. [26]


Nəticələr

Mutagen mühitdə uyğunluğun qiymətləndirilməsi: Zərərli mutasiyalar ilkin qiymətləndirməni qarışdırır

1a və 1b tənliklərindəki uyğunluqlar mutasiyaya məruz qalarkən virusun böyüdüyü mühitə aiddir. Beləliklə, həm əsas hazırlığı ölçmək lazımdır, W0, və son uyğunluq, , həmin mühitdə. Klinik olaraq mutagen dərmanlara məruz qalan T7 və faktiki olaraq bütün viruslar ilə həmin mühit hüceyrələrin mutagenə məruz qaldığı mühitdir. Modeli parametrləşdirərkən bu problem ölçmədir W0 mutagen mühitdə, analiz zamanı dəqiq bir qiymətləndirməni qarışdıran mutasiyaları təqdim edir W0.

Mutagen mühitdə viral böyümənin fitnes nəticələrini aşağıdakı kimi bölmək olar:

Mutagen bakteriya fiziologiyasını və böyüməsini pozur, hüceyrə tərəfindən istehsal olunan fag nəslinin sayını azaldır, baxmayaraq ki, daha az nəsil istehsal olunur, istehsal olunan nəsil bu mexanizmdən təsirlənmir.

Mutagendə yetişdirilən sahiblərdən gələn nəsil viruslarının virionlarında potensial olaraq struktur qüsurları var, bu təsirlər irsi xarakter daşımır, lakin həmin nəslin infeksiyaları başlatma qabiliyyətinə təsir göstərir.

Mutagenlərdə yetişdirilən ev sahiblərində virusların təkrarlanması nəsil viral genomlarında ölümcül olmayan mutasiyalara səbəb olur, bu təsirlər irsi xarakter daşıyır və gələcək nəsillər arasında uyğunluğa təsir göstərir.

Mutagendə yetişdirilən ev sahiblərində virusun təkrarlanması bəzi nəsil nəsillərində ölümcül mutasiyalara səbəb olur və ölümcül mutasiyalar heç bir nəsil buraxmır və onları hesablamaq mümkün deyil.

Çətinlik ondadır ki, irsi olmayan təsirlər (ilkin) uyğunluğu ölçərkən irsi təsirlərlə qarışdırılır, lakin model yalnız irsi olmayan təsirlərin daxil edilməsini tələb edir. Tutaq ki, mutagen olmadıqda vəhşi tipli genomun partlama ölçüsü (bu misalda uyğunluq) 100-dür. Mutagenin iştirakı ilə aparılan fitnes analizi vəhşi tip üçün 30 (yaşayış qabiliyyəti) partlamasını aşkar edir və belə təəssürat yaradır ki, W0 30-dur. Bununla belə, fərz edək ki, ev sahibinin faq artımını dəstəkləmək qabiliyyəti azalıb – yuxarıdakı siyahıda 1 və 2-ci təsirlər – və doğru W0 50 ölümcül mutasiya həmin nəslin 60%-dən başqa hamısını öldürür. dəyəri W0 beləliklə, 100 və ya 30 deyil, 50-dir. Bununla belə, mutagenin ev sahibi üzərində irsi olmayan təsirini mutagenin faktiki nəslin 40%-nin öldürülməsindəki təsirindən ayırmağın heç bir aşkar yolu yoxdur. Problemə məhəl qoymamaq və müşahidə edilən 30 kimi davranmaq W0 son uyğunluğun çox aşağı olduğunu proqnozlaşdırmağa gətirib çıxarır, buna görə də model düzgün olsa belə rədd ediləcək. T7 vəziyyətində, ilkin uyğunluq W0 altı nəsilləri əhatə edən təhlilə əsaslanırdı, buna görə də təsir əhəmiyyətli ola bilər. Erkən mutasiyaların gözlənilən təsiri nə qədər ciddidir?

Davamlı mutagenez ilə fitnesin azalması

Mutagenezin fitnes effekti Puasson modeli altında asanlıqla hesablanır. Johnson (1999) mütərəqqi mutasiyanın təsirinin iterativ olaraq hesablana biləcəyi bir sıra rekursiyalar təqdim etdi, baxmayaraq ki, bizə lazım olan düstur hələ də əldə edilməməlidir. Bütün mutasiyalar zərərli olsun. Zərərli mutasiyalar dəstində var n təsir ölçüsünə görə siniflər: zərərli təsir göstərənlər si genomik sürətlə əmələ gəlir Ui. Bütün mutasiyalar üzrə ümumi zərərlilik dərəcəsi . Bundan əlavə, bir genomun uyğunluğunun mutasiyalar dəsti ilə multiplikativ şəkildə azalmasının əlverişli xüsusiyyətini fərz edirik. Orta fitnessdən sonra k mutasiya və seçmə nəsilləri (2) (Əlavə). Ekspozisiya və seçimin ilk iki nəsilində orta uyğunluq aşağıdakılardan ibarətdir və (üçün). bütün mutasiyaların ya neytral, ya da öldürücü olması istisna olmaqla, həmişə olduğundan kiçikdir. Orta və daha yüksək səviyyəli anlarda müvafiq məhdudiyyətlərlə s, orta uyğunluq təxminən güc kimi azalır k prosesin əvvəlində.

Yaşanan mutasiya yükü kmutagenezin ci nəsli. Qalıq yük, yəni., nəsillər boyu yaşanan k, belədir. This residual load is what is measurable in protocols that assay initial fitness during exposure to mutagen, for assays lasting k nəsillər. As , the residual load vanishes even at low k because the full effect of mutation is experienced after few generations of mutagenesis.

From (2), there are important consequences of a mutagenesis protocol using fitness measured in the mutagenic environment. Overall, the observed decline in fitness between the initial and final estimates will be less than the true negative impact of mutations on fitness, as given by (1b). The observational bias is worse still if the “final” population has not attained equilibrium. This bias arises because the observed initial fitness is confounded by deleterious mutations accumulating during the assay, and the bias increases the larger the mutational effects and the longer the assay continues. Failure to account for this bias—by assuming that the initial fitness estimate represents W0 instead of —will overpredict the expected fitness decline from a high mutation rate. The theory would then be tested inappropriately.

A few comments about model (2) are warranted. First, the model assumes an infinite number of sites in each class i. Thus a genome can theoretically experience and accumulate infinitely many mutations in each class. Second, the model admits beneficial mutations (sj < 0), but with even a single class of beneficial mutations, fitness increases without bound as k increases to infinity (Uj(1 − sj) k → ∞). The unbounded fitness is due to the infinite sites assumption, which allows genomes to accumulate ever-increasing numbers of beneficial mutations (as favored by selection). Consequently, use of (2) with beneficial mutations should be limited to the initial generations of mutagenesis. The long-term equilibrium may be calculated for a finite number of beneficial mutations by assuming that initial genotype has already acquired the beneficial mutations (with W0 adjusted accordingly).

The average effect of a random deleterious mutation (including lethals) has been estimated as ∼ 0.68 in VSV (vesicular stomatitis virus, calculated from Table 1 in Sanjuán və b. 2004) and as 0.40 3 and 0.45 in two phages (Domingo-Calap və b. 2009). With these values, approximately half the long-term deleterious fitness effect of a high mutation rate is experienced in the first generation and will not be detectable by many methods that assay fitness in the mutagenic environment. The average fitness effect of all mutations is −0.3 and −0.36 for the two phages, and even more negative for VSV. By this measure as well, there should be a substantial fitness decline in the first few generations.

T7 revisited

In the study of bacteriophage T7 mutagenesis, initial growth rate of the wild-type virus in the mutagenic environment was 18.3 doublings/hr (Springman və b. 2010). From a directly measured 4.3 viable mutations per genome per generation, the viable deleterious mutation rate was converted to 2.6 by assuming a deleterious fraction of 0.6 (based on direct estimates from other viruses). A model similar to that in Equation 1b but tailored to viral growth rate gave a predicted equilibrium of 8.6 doublings/hr. The observed fitness after 200 generations of propagation was 21.9, higher than fitness of the initial virus and a profound failure of the theory. Per 20 min viral generation, the difference between 21.9 and 8.6 is equivalent to a 20-fold difference in number of offspring.

Several possibilities were addressed in attempting to account for those results (Springman və b. 2010):

The phage may have evolved a lower mutation rate during the adaptation. T7 encodes its own DNA polymerase (DNAP) for genome replication, and resistance to mutagen could easily have evolved in that gene. However, a replicate evolution in which the phage DNAP was prevented from evolving exhibited a similar lack of fitness decline.

Deleterious fitness effects may be too small to expect a fitness drop in 200 generations. This possibility is inconsistent with the fitness effects of mutations reported in other viruses.

With 200 generations of evolution, beneficial mutations may have been able to ascend and offset the decline. The trajectory of fitness evolution supported this possibility, but with only a small magnitude of effect: fitness at 15 generations was not significantly below that of the estimated W0, but fitness at 80 generations showed a significant but small decline of about one doubling per hour below that of W0. Fitness at generation 200 thus implied a rise from generation 80 of about four doublings per hour. The question was why fitness exhibited such a modest decline at the earlier time points.

The question raised by the preceding analysis is whether the predicted impact of mutations was affected by a biased estimate of W0. It is of course not possible to explain a fitness artırmaq from this bias, but an upward correction of the predicted final fitness certainly helps reduce the discrepancy. The solution suggested by (2) is to correct for the early accumulation of deleterious mutations. However, if the distribution of deleterious fitness effects is not known, the correction is not straightforward.

As one approach, Springman və b. (2010) developed a model that partitioned lethals separately from other deleterious mutations and then parameterized the model so that the predicted fitness drop was restricted to the nonlethal component. This correction mirrors the one suggested above—the fitness impact of lethals on mean fitness is the same from the first generation onward so is independent of the duration of the fitness assay. In contrast, the fitness impact of nonlethals accumulates gradually and is thus possibly detectable when comparing assays of different durations.

Partitioning the deleterious mutation rate U into a lethal rate (UL) and a nonlethal rate (UnL), Equation 1b may be rewritten as . The product in parentheses is the initial viable fitness. This value corresponds to the 30 in our example three sections above and is easily measurable. Using this adjusted fitness as initial fitness, the predicted decline from other deleterious mutations is now the component due to nonlethals, . This decline should accumulate gradually and thus be detectable with the methods used in the study, to the extent that the average effect of nonlethal, deleterious mutations is small. Of course, this drop does not represent the full negative impact of deleterious mutations, but understanding its magnitude could facilitate resolving the enigma of T7 evolving higher fitness under mutagenesis.

As the standard fitness assay spans several generations and thus might have partitioned some of the nonlethal component into , the T7 study estimated initial fitness in two ways. One method directly measured fitness (growth rate) from viral titers compared between three and six generations, so that estimate would indeed have been depressed below its true value by the early accumulation of nonlethal mutations. The other estimate, which avoids this problem, parameterized a fitness function using fitness components obtained during the first generation of mutagen exposure. This latter method should avoid the effects of deleterious mutations, save for lethal mutations (which were already accounted for by using the viable burst size).

The two fitness estimation methods gave broadly similar values, albeit variance in the fitness function estimate was not quantified. Consequently, there was no obvious bias attributable to nonlethals accumulated during the first six generations of mutagenic growth. For both fitness estimates, the long-term predicted fitness decline was the component based on the nonlethal mutation rate, and a directly measured nonlethal mutation rate was used to parameterize that component. The predicted decline was substantial and profoundly at odds with the fitness increase observed at the end of the experiment. Thus it does not seem that the failure of the theory is due to a biased initial fitness estimate.

A surrogate fitness measure in T7

To test the model appropriately, the assays used to estimate fitness must represent fitness as it applies during the mutagenic evolution thus the most appropriate fitness assay environment would use mutagenic growth. For short-term evolution, however, fitness measured in a nonmutagenic environment may correspond to fitness in the mutagenic environment so that alternative fitness assays are acceptable. Specifically, if most mutations deleterious in the mutagenic environment are also deleterious in a surrogate environment, the fitness decay over a few generations of mutagenesis may parallel each other in the two environments. A fitness decline may then be more easily documented in a nonmutagenic environment and be free of the estimation biases noted above. In the long term, adaptive evolution specific to the mutagenic environment may destroy any correspondence in fitness between the two environments, but this problem will not arise in the very short term.

We thus attempted an alternative fitness assay of T7 exposed to mutagen to shed light on these anomalies of initial fitness measures. As in prior work, T7 was grown on cells exposed to nitrosoguanidine to introduce mutations, but here fitnesses of those stocks were assayed in the absence of mutagen. We obtained samples of phage exposed for zero generations (mutagen-free control), exposed for one generation, or exposed for three generations. These phage were then added to separate, mutagen-free cultures of cells, with titers determined at 2 min and 13 min the sample at 2 min represents the number of viable parent phage and the sample at 13 min represents the number of progeny after a single infection cycle. For the mutation-free control, burst occurs at just under 11 min (Heineman and Bull 2007), so the titer at 13 min should be an effective burst size. For mutated genomes, the effective burst may be reduced by three mechanisms—reduced adsorption rate, reduction of progeny in the cell, and delay of burst (an infected cell not yet burst plates as a single progeny phage). If there is a rapid accumulation of deleterious, nonlethal mutations during the first few generations of mutagenesis, these effective burst sizes should decline progressively with the number of generations of exposure.

Figure 1 reveals that the highest effective burst size is with no exposure (red squares), but no further decline is seen between 1 and 3 generations of exposure (solid blue and open black circles). There is thus an apparent contradiction here: from Equation 2, a decline in the first generation should be followed by additional declines in the next few generations unless is near 1. Herein lies a methodological problem, however. The observed decline in the first generation need not be due to classic mutations it could be due to mutagen effects on the nongenomic part of the virion or to epigenetic effects on the genome (see the following section for an example of the former). Thus these data fail to provide clear evidence of a short-term fitness decline from nonlethal mutations. These results are consistent with those of Springman və b. (2010), whose assay of initial fitness based on six generations of mutagenic growth matched the estimate based on one generation. The failure of T7 fitness to decline on long-term mutagenic propagation appears to reside at a fundamental level of evolution, such as neglecting beneficial mutations or overestimating the deleterious fraction of mutations, not to a confounded estimate of W0.

Effective burst sizes after exposure to nitrosoguanidine for zero, one, and three generations. Across three trials, there is a clear pattern of decline from zero- to one-generation exposure and no evident decline from one- to three-generations exposure. For each trial (conducted with a different, freshly mutagenized phage stock) the three pairs of values exhibit statistically significant heterogeneity. Methods: Populations of T7salam from Heineman and Bull (2007) were grown in 10 μg/ml of the mutagen nitrosoguanidine for a single infection cycle (one generation, or 1 g), or for 70 min (three generations) or grown without mutagen (zero generations) and collected over chloroform to kill cells. These phage stocks were then added to mutagen-free cells that had been grown for 1 hr to a density of 1 × 10 8 cells/ml and plated at 2 min and 13 min after infection without killing cells. Burst size was calculated as the phage titer at 13 min divided by the titer at 2 min. Points shown are the raw data. Broth was LB and cells Escherichea coli IJ1133 methods, bacterial strain genotype and recipes otherwise follow Springman və b. (2010).

Avoiding problems with in vivo mutagenesis: Virions exposed to mutagen

If viral growth in the presence of mutagen confounds mutagenic effects on the virus with impairment of host, one solution is to mutate the genome separately from the host, by treating free virus particles (virions) with mutagen. The fitness of both the wild-type and mutated viruses can be measured in the mutagen-free environment, fully avoiding the estimation biases highlighted in the preceding section. If sequencing is employed to measure the average mutation rate, and a Poisson distribution is assumed for the incidence of mutations per genome, the surviving fraction of virions can be used to calculate the lethal mutation rate. An average burst size among the survivors may even be used to estimate an average fitness effect of nonlethal mutations.

Virion survival upon exposure to mutagens was assayed extensively nearly half a century ago (məs., Benzer 1961 Tessman və b. 1964, 1965 Tessman 1968 Botstein and Shortle 1985). For chemicals supposedly creating base changes (hydroxylamine, nitrous acid, EMS, MMS), the typical decay in viability was log-linear with time of exposure. Log-linear decay is expected if there is a constant rate of lethal mutations per unit time, even if the fraction of mutations that are lethal differs across genes. For example, if the mutation rate per unit time is Ui for gene i (U is the total genomic rate and Ui = səhiU) and the lethal fraction within that gene is Li, the viable fraction of genomes viable (V) under a Poisson model is (3) where . is independent of the total mutation rate, so if the mutation rate U is linear with time of exposure, the plot of log(V) will decline linearly with time, as commonly reported. In phage T4, for example, the log linearity spans the entire viability plot, nearly 6 orders of magnitude survival (Tessman 1968).

At face value, the virion survival methods developed in this early work are ideally suited to test the foundations of lethal mutagenesis theory, because they seem to provide genome survival rates that could be aligned with base substitution rates. However, there are reasons to question whether those mutagens act solely or even primarily through classical mutations. Consider the mutagen hydroxylamine, reported to induce largely C → T transitions. Using phage T4, Tessman (1968) observed log-linear declines in viability across 5–6 orders of magnitude with time of exposure. Mutations in the survivors were detected phenotypically in a diagnostic phage gene, indicating that at least some of the mutagen’s effect was an induction of standard mutations. However, base substitutions may not be the only cause of virion death. Hydroxylamine is also known to cause breaks in DNA and to cleave specific protein bonds, both of which will cause virion death (Rhaese and Freese 1968 Tessman 1968 Taylor və b. 1970 Rauko və b. 1993 Robins və b. 2013). Thus, virion decay may be due to a combination of effects, only some of which are due to classic mutations.

Is log linearity expected from point mutations?

Another reason to question whether log-linear survival under chemical mutagenesis is due chiefly to base changes comes from recent work measuring retention of protein function for genes subjected to various base substitution rates. In these studies, mutations were generated by error-prone PCR and average base substitution rates from libraries of clones were evaluated directly by sequencing. Relationships between base substitution rate and protein survival did not obey log linearity but instead exhibited a shoulder effect, with an accelerating downward slope at higher mutation rates—as if robustness to mutation deteriorated once a few mutations were acquired in the protein (Bloom və b. 2005, 2006, 2007). This curvature implies negative epistasis on a multiplicative fitness scale, the deleterious effects of mutations together being stronger than when alone. The absence of log-linear survival for individual proteins seems incompatible with log linearity of genome survival. However, it is not intuitive how much deviation from log linearity to expect at the genome level when log linearity is violated at the gene level. We thus offer a model bridging the two processes. The model is simplified for analytical tractability.

Suppose that there are n genes in the genome. Genome survival is the product of gene survival rates across all genes. Let survival of gene i be 1 in the absence of mutation, 1 − s for a single mutation, and 0 for two or more mutations in that gene the latter assumption implies negative epistasis within genes on the multiplicative scale except for s = 1. (Lethality of two or more mutations is assumed because it greatly facilitates the calculations.) Let the mutation rate of gene i olmaq Ui ( ), and for further mathematical necessity, all genes have the same mutation rate,: Ui = U/n, and all mutations have the same fitness effect, s.

The surviving fractions for genomes with different numbers of mutations are calculated as follows. Qoy Yi be the number of mutations arising in gene i at rate U/n. The probability of k single mutations in any set of k genes is times the probability that the singles fall in the first k genes (since all possible combinations have the same probability) and is A genome with k single mutations has survival (1 − s) k , so viability over all possible numbers of single mutations per genes becomes (4) When s = 1, we recover the result that survival is merely eU . Əgər s = 0, and then as n increases without bound, the survival probability approaches e U eU = 1. This result is easily understood: with infinitely many genes and a finite number of mutations, two mutations never fall in the same gene.

As seen in Figure 2, the deviation from log-linear viability is pronounced for strong epistasis (s = 0, gray curve) but barely detectable for moderate epistasis ( , blue line). The slopes are greatly affected by s, but it is the curvature that is of interest when interpreting the published data, as we have no basis for interpreting that slope. The observation of log linearity for whole genomes is thus visually compatible with moderate epistasis at the level of individual genes. For comparison to the case, the figure also shows a curve for a mixed genome in which half the genes experience s = 1 and the other half experience s = 0 (viability follows ). The latter shows a slightly greater curvature than does (dashed green line) but is still not pronounced curvatures for s between and 1 are likewise slight (not shown). While the generality of these results remains to be demonstrated with more realistic models, the suggestion here is that log linearity is only slightly violated by moderate levels of epistasis within genes.

Log survival per mutation rate for different values of s for a genome with 30 genes (n = 30) from Equation 4 all genes experience the same value of s except where indicated. The gray curve represents maximal epistasis within genes (s = 0), the red line is no epistasis (s = 1), and the blue curve represents intermediate epistasis s = 0.5 (epistatic if fitness is multiplicative within genes). The curve for s = 1 is strictly linear. The thin black line overlaid on the blue curve is also strictly linear, so the blue curve is seen to bend only slightly. The dashed green curve represents a genome with an equal mix of genes with s = 1 və s = 0 and is seen to have slightly greater curvature than the curve for . However, both the blue and green curves deviate from linearity only slightly over four logs—suggesting that a modest level of epistasis within genes might not be detectable in these plots.

Hydroxylamine and T7

Using T7, we revisited the effect of hydroxylamine on virion survival and also measured mutation rates of DNA extracted from exposed virions over a three- to four-log drop in survival (Table 1). The viability varies fivefold across the three trials for the longest treatment time (45 hr) and twofold for the 21-hr treatments. When subtracting baseline error/mutation rates, nearly the total increase in average mutations per genome is due to C → T transitions, as expected for this mutagen. To attribute the loss in viability to the measured increase in point mutations, consider the 21-hr data. The most generous, high survival rate is 0.05, and the excess mutations per genome is 4.6. The lethal fraction (L) of those mutations under a Poisson model is found as e −4.6 L = 0.05, or L = 0.65. Considering that approximately one-third of the genome is nonessential, that the lethal rate observed in a variety of small genome viruses ranges from 0.2 to 0.4 (Sanjuán və b. 2004 Domingo-Calap və b. 2009), and that only ∼1/5 of residues of an essential T7 protein are lethal when mutated (Robins və b. 2013), it appears that the loss in viability from exposure to hydroxylamine is too high to be explained by the observed rate of point mutations (under a Poisson model).

A possible concern with virion mutagenesis is an unequal distribution of mutations across the genome. DNA density in phage heads is 500 mg/ml, approaching crystalline density (Earnshaw and Casjens 1980). If only a small fraction of the genome is exposed to mutagen, as may be plausible, the observed relationship between average mutation rate and virion survival may poorly reflect the genome-wide tolerance of mutations. A plot of C → T mutation frequency across hydroxylamine-treated genomes suggests only modest variation in exposure across different regions (Figure 3). As the sliding window method obscures site–site variation on a local scale, we also counted the incidence of sites with no mutations, singles, and so on (17586, 837, 134, 40, 11, 7, 1, 1), observing one site each with six and seven mutations. Ignoring the site–site variation in number of reads, these numbers show a strong violation of Poisson due to an excess of multiply hit sites, consistent with the much earlier results of Benzer (1961). Thus, there appears to be quantitative, nonrandom variation in exposure to the mutagen, but not strong enough that large portions of the genome completely avoid exposure.

A sliding window analysis of the number of C to T mutations in a T7salam genome treated with hydroxylamine 45 hr exhibits a modest deviation from uniformity, suggestive of unequal exposure across the genome. The counts are 10,000 times the total number of C to T mutations observed in all reads within the window, divided by the number of reads at which a C was observed as the template base within the window. A window span of 1001 nucleotides was applied stepwise across the genome and plotted every 50 bases. Methods are as in Table 1, except that a minimum quality score of 20 was applied here.

Measuring the relevant mutation rate in double-strand genomes

Although it is easy to model an arbitrary mutation rate, fitting the relevant empirical rate may be challenging. In a double-stranded genome, mutagenesis typically converts a base on one side of the duplex, not also its complement. If no subsequent replication occurs before the genome infects, virions will then carry different mutations on each strand. There are several ramifications of this heteroduplex asymmetry that depend on the viral life cycle, the fitness effect of the mutations, and on recombination. For tractability in everything that follows, we consider a single episode of mutation—progeny are not exposed to further mutagenesis.

Consider first that all mutations have no fitness effect (are neutral): all infections are equally viable regardless of mutation content on either strand. Upon infection by a heteroduplex genome, and in the absence of DNA repair, semiconservative replication of the parent genome will distribute mutations on each strand to half the genomes destined for progeny, but now as homoduplexes. In T7 at least, recombination among the homoduplexes will create progeny genomes with a mix of mutations from the two parental strands for convenience the mix may be assumed to obey linkage equilibrium, each mutation at a frequency of 0.5. If the mutation rate per parental strand is U, progeny carry an average total of 2U mutations in their double-strand genomes. With free recombination, individual progeny inherit half the total, an average of U. The distribution (Poisson) will be the same as in single strands of the parent genomes. The same result would apply if there was no recombination during the process.

The situation changes when mutations have deleterious effects. Consider the extreme case that all mutations are lethal and furthermore that they are lethal regardless of strand. If the lethal rate per strand is UL, parent genomes are now subject to a lethal rate of 2UL, twice the per-strand rate. In the absence of other types of mutations, sequencing would observe a mutation rate UL, whereas the survival rate would be observed to decline at 2UL, an apparent impossibility under the standard Poisson model. As no real system experiences only lethal mutations, the ramifications of this process would merely be an overestimate of the fraction of mutations that are lethal. Recombination makes no difference in this case.

A less extreme case is one that applies to T7: all genes are transcribed from the same strand, and mutations on that strand will largely determine viability of the infection (Molineux 2005). Again assume that only lethal mutations occur, albeit a lethal mutation on the non-transcribed strand (NTS) does not manifest an effect until its complement is generated by replication using products made from the transcribed strand of the infecting genome. Lethals arise at rate UL on each genomic strand, independently of the opposing strand. The transcribed strand escapes lethals with probability , which is thus the fraction of virions that produce viable progeny. Of interest, then is the fraction of progeny in those viable infections that inherit lethal mutations from the NTS.

Within viable infections and with complete recombination, the surviving progeny for different numbers of mutations on the NTS are enumerated in Table 2. The fraction of all progeny in viable infections escaping inheritance of lethals from the NTS sums as (5) and is thus . A plot of surviving infectious particles (parent genomes producing at least some viable progeny) would be log-linear with slope −U, but the number of viable progeny from mutagenized parents would have slope −1.5U. As before, therefore, mutations arising independently on each strand will have a greater lethal effect than expected from the mutation rate observed using sequence methods (which is per strand).

Abolishing recombination among progeny genomes raises fitness in this case. In the absence of recombination, minimally half the progeny of a viable infection are themselves viable because their genome is descended from the mutation-free transcribed strand of the parent progeny survival follows eU (1 + eU )/2. Progeny survival without recombination is invariably larger than with recombination, markedly so at high mutation rates. Without recombination, survival is approximately and would not necessarily be empirically distinguishable from eU .


Müzakirə

This report presents the first forward and reverse genetic screens for chemically induced mutations in X. tropicalis. We have isolated a diverse set of heritable phenotypic abnormalities in organogenesis and differentiation, and also successfully identified frogs carrying mutations in known genes for use in future studies of specific gene functions. Some of the phenotypes isolated in our forward screen resemble those already uncovered in other model systems, validating our screen design. Others, such as the cyd vicious phenotype, do not appear to resemble known mutations, and confirm that X. tropicalis forward genetics can be a highly effective tool for discovery of novel gene functions. While this pilot screen clearly demonstrates the feasibility of the approaches we have taken, there are a number of factors to consider for future screens.

Gynogenetic Forward Screen Limitations

In our screen strategy, in vitro mutagenesis followed by gynogenesis and morphological inspection was employed to perform rapid surveillance of postneurulation phenotypes. While this approach permits screening only one life cycle after mutagenesis and greatly reduces colony requirements, several types of bias are introduced. First, highly penetrant phenotypes in early development will not be isolated in this pilot screen. Embryos with these types of defects can be difficult to identify on the complex background of nonspecific gastrulation defects associated with early pressure gynogenesis and incomplete rescue from the haploid state. The overlooked gene functions may include many housekeeping genes required for cell survival, as well as a number of tissue-specific zygotic genes involved in early tissue movements and embryogenesis. Replacement of early pressure with early cold shock to effect gynogenesis reduces this background noise to a degree, and may permit isolation of earlier phenotypes. Second, gynogenesis by suppression of polar body formation is biased towards recovery of centromerically linked loci due to meiotic recombination [5,20,27,28], so effectively only this subset of the genome is being screened. This bias comes with the significant advantage that mapping studies can focus on these centromeric regions. In some cases, we have observed additional phenotypes segregating in Mendelian ratios in the F3 progeny of sibling crosses, which were not observed in gynogenetic embryos, consistent with recovery of more distal alleles. Third, in vitro mutagenesis of mature sperm results in a mosaic F1 generation, further reducing the frequency with which recessive gynogenetic phenotypes may be observed. We chose an arbitrary number of 20 viable gynogenetic F2 neurulae as a practical threshold at which to consider an F1 genome screened examination of larger numbers of embryos is likely to result in the identification of additional phenotypes. Likewise, germline mosaicism can also interfere with recovery of detected phenotypes, so we have designated as “provisional” (color-coded green in Tables 2 and 3, and Figure 2) alleles that have not yet been shown to be heritable. However, it should be noted that 100% (29/29) of those phenotypes which have been observed twice in the gynogenetic progeny of F1 founders have been shown to be heritable thus far. As a practical point, this suggests that it should be feasible to perform preliminary characterization of a large number of provisional alleles, which can be maintained long-term as individual F1 founder frogs. Limited colony resources can then be dedicated to breeding specific phenotypes of interest, without undue risk that many will not be heritable. Replacing gynogenetic screens with a conventional three-generation screen design is unwieldy in combination with in vitro mutagenesis, as mosaicism in the F1 animals greatly reduced the frequency with which nonmosaic F2 carriers will be randomly paired in matings to produce F3 embryos to screen. Finally, morphological inspection is a relatively superficial approach, and additional phenotypes might be recovered by use of in situ hybridization or mutagenesis of transgenic multireporter strains [13] to detect more subtle variations in gene expression.

Structure of Induced Mutations

We initially chose to pursue in vitro chemical mutagenesis of postmeiotic sperm, rather than in vivo spermatogonial treatment, for speed of analysis and efficiency of mutation induction. One drawback to this approach is that the F1 animals generated by in vitro fertilization with mutagenized sperm are mosaic, and hence phenotypes in their progeny may not appear in Mendelian ratios. As our forward genetic screen was based on gynogenesis, which precludes the production of Mendelian ratios, this was not a significant problem. In addition, mutations induced by postmeiotic sperm mutagenesis in other vertebrates include not only point mutations [39,40] but also deletions and chromosomal rearrangements [41–43]. Deletions can be highly useful genetic resources for functional and mapping studies, but as yet neither deletions nor translocations have been identified among our induced mutations. The majority of mutations that have been subjected to F2 sibling intercrosses in our study have produced Mendelian phenotypic ratios in F3 progeny, which are not indicative of gross chromosomal defects [28]. While it is possible that multigene deletions are induced in our protocol, these may result in a higher frequency of early lethal phenotypes, which we have discarded. It has also been proposed that subtle differences in mutagenesis conditions may result in significant differences in the kinds of lesions produced [41]. What is clear is that the sequence of a large number of specific amplicons in our mutagenized population indicates a high frequency of induced point mutations. While direct sequencing will not detect deletions or rearrangements, we conclude that single base changes are induced highly efficiently in our protocol. Mapping and cloning studies will ultimately be required to confirm whether point mutations or deletions are responsible for the majority of the phenotypes observed in the forward screen.

Direct sequencing of genomic PCR products also confirms a varying degree of mosaicism in the F1 generation, as demonstrated by the observation of one mutation at a frequency of

1/5 and others at 1/24 or less. In the first case, the observed ratio is in line with the expected result of in vitro ENU mutagenesis of mature sperm. If a DNA adduct forms on one strand of sperm DNA, that lesioned strand might be expected to be distributed to one of two cells at first cleavage, resulting in a 50% mosaic heterozygous embryo, such that on average 25% of the germline might carry a specific lesion. The majority of the phenotypes obtained in the forward screen are likely to be of this less-mosaic category. Two explanations are likely for the higher observed level of mosaicism in some of the other families. One is that there may be a degree of selection in the F1 spermatogonia against individual germ cells carrying particular combinations of mutations. The second possibility is that repair of modified bases carried by the mutagenized sperm may be delayed for a number of cell divisions, resulting in a significantly higher degree of mosaicism, and a lower frequency of specific F1 carriers. Consistent with this notion, it is not until later stages of development that cells carrying damaged DNA are recognized and eliminated by apoptosis [44,45].

Several observations suggest that the majority of these mutations are induced, rather than already present in the strain of frogs used. Naturally occurring recessive alleles have been found in an inbred N (Nigerian) strain [46], and a number have been recovered from outbred wild-caught X. tropicalis [21]. One of these naturally occurring mutations, grinch, has been identified in our N strain stock and confirmed in complementation tests (Tim Grammer and Richard Harland, personal communication). Since the stocks used for mutagenesis are the grandchildren of a single pair of animals, a maximum of four alleles preexisted at each locus in the population. We would therefore expect background mutations to be recovered several times in a pilot of this size, as indeed we have seen with grinch. While we have only shown complementation among a limited number of mutations, the majority of the remainder are phenotypically distinct, consistent with induced mutations in a number of different genes. In addition, gynogenesis of nonmosaic F2 animals can also provide an indication of whether loci are distinct, since the frequency with which recessive phenotypes are uncovered is inversely dependent on meiotic recombination rate, a function of the gene–centromere distance [47]. Mutations that are recovered with different frequencies in the gynogenetic progeny of nonmosaic females are likely to be distinct loci. Finally, the appearance of mosaicism in the F1 generation, which is expected in the products of in vitro mutagenesis of mature sperm, also supports the induced nature of the mutations. This mosaicism is evident in Table 3, in which the preponderance of mutant phenotypes are observed at a lower frequency in the gynogenetic progeny of F1 females compared with those of (nonmosaic) F2 females. Background recessive mutations would be expected to be nonmosaic in both the F1 and F2 generations, and the ratio recovered in the gynogenetic progeny of carrier females would not be expected to change.

Reverse Screen

This TILLING screen demonstrates the feasibility of identifying and recovering carriers of mutations in known genes. Our pilot scheme, designed for speed, was somewhat hampered by dependence on recovering carriers among the progeny of variably mosaic F1 animals. Efficiency in future screens can be increased by sequencing exons from an adult nonmosaic F2 mutagenized population, among whose progeny carriers can be expected to be recovered in predictable Mendelian ratios. Accordingly, we are in the process of generating a library of F2 DNA and germline stocks (maintained both as frozen sperm and living frogs), which will greatly enhance recovery of identified mutations. While maintaining a living library is more space- and labor-intensive, fertilization yield from an individual X. tropicalis ' frozen testes is typically limited to about 500 embryos, and sperm viability after freezing can vary. X. tropicalis females are fecund (producing up to 9,000 eggs per ovulation and capable of breeding six times per year [14]), long-lived, and are likely to be fertile for more than 10 y (in contrast to zebrafish or mice, with a typical fertility span of less than 2 y). As each individual X. tropicalis may harbor a number of different mutations, it may be very useful to be able to perform multiple screens over a decade. Resequencing a large number of X. tropicalis exons validates the quality of the genome assembly as well as the annotation used to identify intron/exon boundaries for primer design. These data also provide a useful estimation of the induced mutation rate, which was found to be about double that calculated in zebrafish and rat TILLING screens following spermatogonial mutagenesis [10,48].

Microarray Analysis

Microarrays are the most efficient means to quickly obtain expression information for thousands of genes. We have utilized the exceptional sequence resources now available for X. tropicalis to construct custom microarrays for a first-pass analysis of phenotypes identified in forward and reverse screens. By choosing well-described genes with known expression patterns and functions, our array design seeks to provide a snapshot description of phenotypes in order to suggest further strategies for characterization. Comparison of gene expression patterns in the wha mutation relative to wild-type embryos confirms that we can observe specific changes consistent with the observed morphological phenotype, as well as obtain new information suggesting fresh avenues for investigation. The combination of these molecular phenotyping tools with the mutagenesis procedures and genetic screens described here helps to establish an infrastructure for obtaining and analyzing chemically induced phenotypes in the emerging model vertebrate Xenopus tropicalis .


Isoform-specific Functions of Kras in Lung Carcinogenesis

As a result of alternative splicing, the human and mouse Kras loci encode two highly similar proteins, Kras4A and Kras4B, that are jointly affected by activating mutations commonly found in cancer ( Figure 1 ). ikən Kras4B is ubiquitously expressed, albeit at varying levels across tissues, Kras4A expression is tissue-specific and not essential for embryonic development, suggesting that Kras4A has a minor role in Kras biology. However, we have shown that mice lacking Kras4A are highly resistant to carcinogen-induced lung tumor development [33] . Similar findings have been reported using a different mouse model that also lacks Kras4A [52] . These studies suggest that Kras4A is essential for lung Carcinogenesis. The requirement for Kras4A in Carcinogenesis is compatible with the observation that Kras4A is expressed in the lung and a number of other tissues from which arising tumors frequently harbor Kras mutations, namely the colon and the pancreas [53] , [54] . In the lung, Kras4A is highly expressed in a subset of epithelial cells, which could potentially be the originating cells of NSCLC [33] . Studies of the cellular origin of NSCLC in the mouse have identified a number of candidates [55] , [56] , but their relationship to Kras4A müəyyən etmək qalır. Nevertheless, the identification of Kras4A as an essential component of mutant Kras-driven lung tumors may have important implications for the design and development of KRAS-targeted therapeutics.


Appendix: Mean Fitness per Generation Under Mutagenic Exposure

We consider the fitness of a genotype G in generation k + 1 based on its mutational and selective history through the previous generations. Qoy P(Mj) represent the Poisson probability of the set of M mutations that were acquired by genotype G in generation j: mj,1 mutations acquired in class 1 at rate U1, mj,2 in class 2 at rate U2, and so on for j = 1 though k. Mean fitness in generation j is W ¯ j . The fitness of a genotype G in generation k + 1 is


LD50 determination and phenotypic evaluation of three Echeveria varieties induced by chemical mutagens

The study aims to determine the Lethal Dose 50 (LD50) of Echeveria varieties as induced by chemical mutagens.

Metodlar

Three cultivated varieties from Echeveria species, namely ‘Brave,’ ‘Viyant,’ and ‘Snow bunny,’ were induced with chemical mutagens: colchicine, ethyl methanesulfonate (EMS), methyl methanesulfonate (MMS), and sodium azide (NaN3). Each mutagen was diluted to different concentrations: colchicine (0.2%, 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0%), NaN3 (0.02%, 0.04%, 0.06%, 0.08%, 0.1%), EMS, and MMS (0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%). Soaking durations for each concentration level were 3, 6, 9, and 12 h. The survival rate and phenotypic data for mutated plants per variety in response to chemical mutagens were collected.

Nəticələr

LD50 evaluation revealed maximum concentration and treatment duration vary per varieties. Regardless of varieties, EMS-treated leaf cuttings had the highest survival rate. However, upon phenotypic evaluation, the results revealed that mutagenic plants were only taken from those treated with colchicine.

Nəticə

The use of colchicine to produce mutated succulents should be further investigated at the molecular level. Tədqiqatın nəticələri digər şirəli sortlar və ya digər əlaqəli bitkilər üçün mutasiya seleksiyası proqramları üçün çox faydalıdır.


Videoya baxın: mutasiya deyishkenliyi (BiləR 2022).