Məlumat

7.25D: Qərb Boltlar - Biologiya

7.25D: Qərb Boltlar - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Öyrənmə Məqsədləri

  • Western Blots istifadəsini göstərin

Western blot (bəzən protein immunoblot adlanır) müəyyən bir toxuma homogenatı və ya ekstraktı nümunəsində xüsusi zülalları aşkar etmək üçün istifadə edilən geniş yayılmış analitik üsuldur. Western blot nümunələri bütün toxumadan və ya hüceyrə mədəniyyətindən götürülə bilər. Qatı toxumalar əvvəlcə ya qarışdırıcı (daha böyük nümunə həcmləri üçün), homogenizator (kiçik həcmlər) və ya sonikasiya yolu ilə mexaniki olaraq parçalanır. Hüceyrələrin parçalanmasını təşviq etmək və zülalları həll etmək üçün müxtəlif yuyucu vasitələr, duzlar və tamponlar istifadə edilə bilər. Texnika yerli zülalları 3 ölçülü quruluşa görə və ya polipeptidin uzunluğuna görə denatürasiya edilmiş zülalları ayırmaq üçün gel elektroforezindən istifadə edir.

Zülallar daha sonra membrana (adətən nitroselüloza və ya PVDF) köçürülür, burada hədəf zülala xas olan antikorlarla boyanır. İndi siqnal yollarına və ya hüceyrə səthi reseptor antigenlərinə və ya digər hüceyrə və ya həll olunan komponentlərə aid on minlərlə müxtəlif zülallara qarşı antikorların (həm monoklonal, həm də poliklonal antikorlar) təmin edilməsində ixtisaslaşan bir çox reagent şirkətləri var. Ticarət antikorları bahalı ola bilər, baxmayaraq ki, bağlanmamış antikor təcrübələr arasında təkrar istifadə edilə bilər. Bu üsul molekulyar biologiya, biokimya, immunogenetika və digər molekulyar biologiya fənləri sahələrində istifadə olunur. Digər əlaqəli üsullara immun boyama və fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi (ELISA) ilə toxumalarda və hüceyrələrdə zülalları aşkar etmək üçün antikorlardan istifadə daxildir. Bu üsul Stenfordda Corc Starkın laboratoriyasında yaranıb. Western blot adı texnikaya W. Neal Burnette tərəfindən verilmişdir və əvvəllər Edwin Southern tərəfindən hazırlanmış DNT aşkarlanması üçün bir texnika olan Southern blot adına bir oyundur. RNT-nin aşkarlanması Şimal ləkəsi adlanır.

Əsas Nöqtələr

  • SDS-PAGE istifadə edərək gel elektroforezi ilə ayrıldıqdan sonra zülallar nitroselüloz adlanan xüsusi ləkə kağızı vərəqinə köçürülür, baxmayaraq ki, digər kağız növləri və ya membranlar istifadə oluna bilər. Zülallar geldə olan eyni ayrılma modelini saxlayırlar.
  • Ləkə nitroselülozda qalan yapışqan yerlərə bağlanmaq üçün ümumi zülal (məsələn, süd zülalları) ilə inkubasiya edilir. Daha sonra məhlula onun xüsusi zülalına bağlana bilən bir antikor əlavə edilir. Antikor qələvi fosfataz və ya horseradish peroksidaza ilə birləşir.
  • Antikorun yeri onu rəngsiz bir substratla inkubasiya etməklə aşkar edilir ki, ona əlavə olunmuş ferment görünən və fotoşəkil çəkilə bilən rəngli məhsula çevrilir.

Əsas Şərtlər

  • elektroforez: iri molekulların (məsələn, zülalların) kolloid məhlulunu gel vasitəsilə köçürməklə onların ayrılması və təhlili üsulu; gel elektroforezi

Poliakrilamid gel elektroforezi

Poliakrilamid gel elektroforezi (SƏHİFƏ) biokimya, məhkəmə kimyası, genetika, molekulyar biologiya və biotexnologiyada bioloji makromolekulları, adətən zülalları və ya nuklein turşularını elektroforetik hərəkətliliyinə görə ayırmaq üçün geniş istifadə olunan texnikadır. Elektroforetik hərəkətlilik molekulun uzunluğundan, konformasiyasından və yükündən asılıdır. Poliakrilamid gel elektroforezi RNT nümunələrini təhlil etmək üçün istifadə edilən güclü vasitədir. Elektroforezdən sonra poliakrilamid gel denatürasiya edildikdə, RNT növlərinin nümunə tərkibi haqqında məlumat verir. [1]

Akrilonitrilin nəmləndirilməsi akrilamid molekullarının əmələ gəlməsi ilə nəticələnir (C
3 H
5 NO ) nitrilhidratazası ilə. [2] Akrilamid monomeri su əlavə edilməzdən əvvəl toz halındadır. Akrilamid insan sinir sistemi üçün zəhərlidir, ona görə də onunla işləyərkən bütün təhlükəsizlik tədbirlərinə əməl edilməlidir. Akrilamid suda həll olunur və sərbəst radikal təşəbbüskarları əlavə etdikdən sonra polimerləşir və poliakrilamid əmələ gəlir. [2] Məsamə ölçüsü tənzimlənə bildiyi üçün akrilmidin nəmləndirilməsi yolu ilə poliakrilamid gel hazırlamaq faydalıdır. Akrilamidin artan konsentrasiyası polimerləşmədən sonra məsamə ölçüsünün azalması ilə nəticələnir. Kiçik məsamələri olan poliakrilamid gel daha kiçik molekulları daha yaxşı tədqiq etməyə kömək edir, çünki kiçik molekullar məsamələrə daxil olur və böyük molekullar məsamə açılışlarında sıxışaraq geldən keçə bilir.

Bütün gel elektroforez formalarında olduğu kimi, molekullar molekulların daha yüksək səviyyəli strukturunu qoruyaraq, öz doğma vəziyyətində işlədilə bilər. Bu üsul adlanır doğma-SƏHİFƏ. Alternativ olaraq, bu quruluşu aradan qaldırmaq və molekulu hərəkətliliyi yalnız uzunluğundan asılı olan struktursuz bir molekula çevirmək üçün kimyəvi denaturant əlavə edilə bilər (çünki zülal-SDS komplekslərinin hamısı oxşar kütlə-yük nisbətinə malikdir). Bu prosedur SDS-PAGE adlanır. Natrium dodesil sulfat poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAGE) molekulları molekulyar çəkilərinin fərqinə əsasən ayırmaq üsuludur. Gel elektroforezinin aparıldığı pH-da SDS molekulları mənfi yüklənir və müəyyən nisbətdə zülallara bağlanır, hər 2 amin turşusu üçün təxminən bir SDS molekulu. [3] : 164–79 Beləliklə, yuyucu vasitə bütün zülalları vahid yük-kütlə nisbəti ilə təmin edir. Yuyucu vasitə zülallara bağlanaraq onların ikinci, üçüncü və/və ya dördüncü strukturunu məhv edərək onları denatürasiya edir və mənfi yüklü xətti polipeptid zəncirlərinə çevirir. PAGE-də elektrik sahəsinə məruz qaldıqda, mənfi yüklü polipeptid zəncirləri müxtəlif hərəkətliliklə anoda doğru hərəkət edir. Onların hərəkətliliyi və ya molekulların qət etdiyi məsafə molekulyar çəkilərinin loqarifmi ilə tərs mütənasibdir. [4] Hər bir zülalın qət etdiyi məsafənin gel uzunluğuna (Rf) nisbi nisbətini müqayisə edərək, zülalların nisbi molekulyar çəkisi haqqında nəticə çıxarmaq olar, burada jelin uzunluğu qət etdiyi məsafə ilə müəyyən edilir. izləmə boyası kimi kiçik molekul. [5]

Nuklein turşuları üçün karbamid ən çox istifadə edilən denaturantdır. Zülallar üçün natrium dodesil sulfat (SDS) denatürləşdirilmiş zülalın hər iki amin turşusuna iki mənfi yük (hər SDS molekulundan) ötürmək üçün zülalları örtmək üçün zülal nümunələrinə tətbiq edilən anion yuyucu vasitədir. [3] : 161-3 2-merkaptoetanol həmçinin zülal kompleksləri arasında olan disulfid bağlarını pozmaq üçün istifadə edilə bilər ki, bu da zülalın daha da denatürasiyasına kömək edir. Əksər zülallarda SDS-nin polipeptid zəncirlərinə bağlanması vahid kütlə üçün yükün bərabər paylanmasını təmin edir və bununla da elektroforez zamanı təxmini ölçüyə görə fraksiyalaşma ilə nəticələnir. Daha çox hidrofobik tərkibə malik olan zülalların - məsələn, bir çox membran zülalları və öz mühitlərində səthi aktiv maddələrlə qarşılıqlı əlaqədə olanlar - bağlanmış SDS nisbətinin daha çox dəyişkənliyi səbəbindən bu metoddan istifadə edərək dəqiq müalicə etmək daha çətindir. [6] Prosedur olaraq həm Native, həm də SDS-PAGE-dən birlikdə istifadə zülalın müxtəlif alt bölmələrini təmizləmək və ayırmaq üçün istifadə edilə bilər. Native-PAGE oliqomerik formanı toxunulmaz saxlayır və geldə fəaliyyət səviyyəsini təmsil edən bir zolaq göstərəcək. SDS-PAGE denatürasiya edəcək və oliqomerik formanı monomerlərinə ayıracaq və onların molekulyar çəkilərini təmsil edən zolaqları göstərəcək. Bu zolaqlar zülalın saflığını müəyyən etmək və qiymətləndirmək üçün istifadə edilə bilər. [3] : 161–3