Məlumat

Mikroinyeksiya bağırsaq orqanoidləri

Mikroinyeksiya bağırsaq orqanoidləri


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən Eppendorf FemtoJet 4i mikroinjektoru və Femtotip kapilyarlarından istifadə edərək kiçik bağırsaq orqanoidlərini mikroinyeksiya etməyə çalışıram və bir neçə problemlə rastlaşdım. Bu, laboratoriyamızda yeni qurulmuşdur və mən buna ilk cəhd edirəm, ona görə də əsas suallara görə üzr istəyirəm.

Femtotip kapilyarlarını iynə və ya Western blot ucu ilə doldurmağa cəhd edərkən maye yuxarı qalxır və kapilyarları doldurmur və böyük hava qabarcığı buraxır. Bu, Femtotip kapilyarlarında ümumi bir problemdirmi? Doldurmağın başqa üsulları varmı (xüsusi mikroyükləyici tələb olunmur)?

Mən mayenin cazibə qüvvəsi ilə dibinə çəkilməsinə icazə verdiyim bir ucdan istifadə etməyə cəhd edərkən, ucun altından sızma ilə bağlı problemlərim var idi. Tamamilə aydın olmaq üçün, inyeksiyadan əvvəl bütün ucun maye ilə doldurulması lazımdırmı (hava qabarcıqları yoxdur)?

Nəhayət, inyeksiya təzyiqi və orqanoidlər üçün istifadə olunan vaxtla bağlı hər hansı məsləhətə görə minnətdar olaram.

Çox sağ ol


Mən tapdım ki, Femtotip yükləyicilərindən istifadə fasiləsiz maye bloku verir və bu maye bir neçə dəfə vurularaq ucun ucuna köçürülə bilər. Ucunda mayenin üstündə hava olması yaxşıdır.


Bağırsaq və mikroblar arasında qarşılıqlı əlaqəni öyrənmək üçün insan bağırsaq modelləri

Instituto Mexicano del Seguro Social, Unidad de Investigación Médica və Medicina Reproductiva, Unidad Médica de Alta Especialidad and Ginecología y Obstetricia No. 4 ‘Dr. Luis Castelazo Ayala', Av. Río Magdalena No. 289, Polkovnik Tizapán San Ángel, C.P. 01090 Ciudad de México, Meksika

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, Fransa

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, Fransa

Centre National de la Recherche Scientifique, UMR3691, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, Fransa

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, Fransa

Centre National de la Recherche Scientifique, ERL9195, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, Fransa

Instituto Mexicano del Seguro Social, Unidad de Investigación Médica və Medicina Reproductiva, Unidad Médica de Alta Especialidad and Ginecología y Obstetricia No. 4 ‘Dr. Luis Castelazo Ayala', Av. Río Magdalena No. 289, Polkovnik Tizapán San Ángel, C.P. 01090 Ciudad de México, Meksika

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, Fransa

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, Fransa

Centre National de la Recherche Scientifique, UMR3691, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, Fransa

Institut Pasteur, Unité d'Analyse d'Images Biologiques, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, Fransa

Centre National de la Recherche Scientifique, ERL9195, 25 Rue du Dr Roux, 75015 Paris, Fransa


ÜÇ ÖLÇÜLÜ BARSAQ MƏDƏNİYYƏLƏRİ ÜÇÜN NOMENKLATURA

“Organoid” termini ilk dəfə 1987-ci ildə neyroblastomalardan (46) və ağciyərdən (134) əldə edilən in vitro mədəniyyətləri təsvir etmək üçün istifadə edilmişdir. Qısamüddətli bağırsaq kulturaları ilk dəfə Evans et al. (25), bağırsaq orqanoidini in vitroda böyüyən kript və villi quruluşu kimi təyin etdi. Sato və Klevers 2009-cu ildə bağırsaq kök hüceyrələrinin (ISC) üçölçülü mədəniyyətlərini “orqanoidlər” kimi təsvir etmiş və sırf epitelial mədəniyyətlərə orqanoidlər kimi istinad etməyə davam etmişlər (95a). Elə həmin il Ootani və Kuo bağırsaq parçalarının üçölçülü mədəniyyətlərini bildirdilər, onlar da orqanoidlərə istinad etdilər (65). 2012-ci ildə Bağırsaq Kök Hüceyrə Konsorsiumu bağırsaq kulturalarının növlərini ayırd etmək üçün nomenklatura təlimatlarını nəşr etdi (109). Bu işin müəllifləri epiteliya və mezenxim də daxil olmaqla çoxsaylı hüceyrə tiplərini ehtiva edən mədəniyyətlər üçün "orqanoid" terminini təklif edir, təmiz epiteliya populyasiyalarının kulturaları isə nazik bağırsaqdan və ya kolondan əmələ gələrsə, "enteroidlər" və ya "kolonoidlər" kimi təyin olunur. müvafiq olaraq. “Sferoid” termini epitelial üçölçülü mədəniyyətləri ifadə etmək üçün də istifadə edilmişdir (76). Bu icmalda bütün üçölçülü orqan strukturları "orqanoidlər" adlanır və toxuma yeri, növ və toxuma növünə görə təsnif edilir (məsələn, "kolon şişi orqanoidi").


Orqanoid yetişməsini təşviq etmək üçün yanaşmalar

Orqanoidlər məhdud böyümə nümayiş etdirir in vitro çünki onlar yaşamaq üçün oksigen və ekzogen qidaların diffuziyasına arxalanmalıdırlar. Bundan əlavə, hPSC-dən əldə edilən bir çox orqanoid modellər yetişməmiş toxumaya daha çox bənzəyir və mədəniyyət müddətindən asılı olmayaraq yetkinləşə bilmir. Bununla belə, orqanoidlərin məməlilərin sahiblərində müxtəlif sahələrə transplantasiyası orqanoidlərin yetişməsi və toxuma funksionallığının artması ilə nəticələnmişdir (Şəkil 2). Organoidlər həm ortotopik olaraq (yəni analoqlara) nəql edilmişdir in vivo yeri) və ektopik (yəni, yerli xaricindəki bir bölgədə). in vivo ətraf mühit) və hər iki transplantasiya metodu orqanoid yetişmə üçün icazəlidir (Dye et al., 2016 Finkbeiner et al., 2015b Sugimoto et al., 2018 Takebe et al., 2013 van den Berg et al., 2018). Bu tədqiqatlar göstərdi ki, orqanoid modellər əlavə işarələrlə təmin edildikdə yetkinləşə bilirlər. in vivo ətraf mühit, bununla da insan orqanogenezini öyrənmək və preklinik modellər kimi və ya regenerativ təbabətdə istifadə üçün müraciətlərini artırır. Burada transplantasiya yolu ilə orqanoid mürəkkəbliyi və yetkinliyi yaxşılaşdırmaq üsullarını müzakirə edirik in vivo.

İnsan orqanoidlərinin ortotopik və ektopik transplantasiyası. Həm hPSC, həm də ilkin toxuma immun çatışmazlığı olan siçanlara köçürülüb. Rənglər, göstərilən yerlərə köçürülmüş həm əsas, həm də hPSC-dən alınmış müxtəlif növ orqanoidləri təmsil edir. Ortotopik transplantasiya analoji transplantasiyaya aiddir in vivo yer, ektopik transplantasiya isə yerli xaricindəki bir bölgəyə transplantasiyaya aiddir in vivo ətraf mühit (yəni böyrək kapsullarının altında, yağ yastıqları içərisində).

İnsan orqanoidlərinin ortotopik və ektopik transplantasiyası. Həm hPSC, həm də ilkin toxuma immun çatışmazlığı olan siçanlara köçürülüb. Rənglər, göstərilən yerlərə köçürülmüş həm əsas, həm də hPSC-dən alınmış müxtəlif növ orqanoidləri təmsil edir. Ortotopik transplantasiya analoji transplantasiyaya aiddir in vivo yer, ektopik transplantasiya isə yerli xaricindəki bir bölgəyə transplantasiyaya aiddir in vivo ətraf mühit (yəni böyrək kapsullarının altında, yağ yastıqları içərisində).

Orqanoidlərin ektopik transplantasiyası

Bir çox təcrübələrdə yetkinləşmə üçün immuniteti zəif olan siçanlara orqanoidlər köçürüldü. Tipik olaraq, orqanoidlər, fare orqanının lazımi funksiyasına mane olmadan bir neçə aya qədər orqanoidlərin aşılanması və böyüməsi üçün uyğun olan yüksək damarlaşmış ərazilərə köçürülürdü. Belə yerlərə epididimal yağ yastıqları (Dye et al., 2016) və altındakı böyrək kapsulları (Finkbeiner et al., 2015a,b Múnera et al., 2017 Trisno et al., 2018 Tsai et al., 2017 Watson et al., 2014 Workman et al., 2016). Həqiqətən də, əvvəllər təsvir edilən birgə mədəniyyətlərin mürəkkəbliyi transplantasiya ilə daha da artırıla bilər (Schlieve et al., 2017 Takebe et al., 2013 Workman et al., 2016).

HİO-lar bir neçə həftə ərzində böyrək kapsul transplantasiyasından sonra əhəmiyyətli yetkinlik göstərən orqanoid modelin nümunəsidir (Finkbeiner et al., 2015b Watson et al., 2014). Transplantasiya edilmiş HİO-ların (tHIOs) həm epiteli, həm də mezenximi, transplantasiyadan əvvəl görünməyən epiteliyada düzgün naxışlı villus-kript arxitekturasının meydana çıxması ilə inkişaf etmiş təşkilat nümayiş etdirdi. Bundan əlavə, hamar əzələ aktin (SMA) - və trombositdən qaynaqlanan böyümə faktoru reseptoru alfa (PDGFRA) ifadə edən mezenximal nəsillər yerli insan bağırsağından fərqlənməyən bir şəkildə təşkil edildi (Finkbeiner et al., 2015b). Siçan qan damarlarının vaskulyarizasiyası nəql edilmiş HİO-ların ölçüsündə 100 qata qədər əhəmiyyətli artımı dəstəklədi (Watson et al., 2014). Bu yaxınlarda, HIO'lar bağırsaq mezenteriyasına uğurla köçürüldü və böyrək kapsulunun altına köçürülənlər kimi oxşar böyümə və yetkinlik əlamətlərini nümayiş etdirdi (Cortez et al., 2018 Finkbeiner et al., 2015a). Buna görə də bağırsaq mezenteri tamamlayıcı transplantasiya yeridir və yerli bağırsaqa yaxın olması səbəbindən gələcək tərcümə tədqiqatları üçün fizioloji cəhətdən daha uyğun ola bilər.

hPSC-dən əldə edilən ağciyər orqanoidləri (HLOs) başqa bir şeydir in vitro transplantasiyadan sonra təkmilləşdirilmiş toxuma arxitekturasını və yetkinliyini göstərən model. Maraqlıdır ki, bir sıra digər orqanoid modellərdən fərqli olaraq, HLO-lar böyrək kapsulunun altındakı transplantasiyadan sağ çıxa bilmədilər (Dye et al., 2016). Əksinə, HLO transplantasiyasını dəstəkləmək üçün mədəaltı vəzinin beta hüceyrələrini nəql etmək üçün geniş istifadə olunan mikroməsaməli polilaktid-ko-qlikolid (PLG) iskeledən istifadə edilmişdir (Gibly et al., 2011 Hlavaty et al., 2014). PLG iskele, böyüdülmüş HLO-lardan daha yetkin insanın proksimal tənəffüs yollarına daha çox bənzəyən proksimal tənəffüs yollarına (yəni traxeya/bronxlar) inkişaf etmiş epitel quruluşunu, morfologiyasını və diferensiallaşmasını nümayiş etdirən transplantasiya edilmiş HLO-ların sağ qalması və yetkinləşməsini dəstəkləmək üçün fiziki bir yer kimi xidmət etdi. in vitro. Bu nəticə bunu deməyə əsas verirdi in vivo HLO-nun yetişməsini dəstəkləmək üçün iskele ilə birlikdə işarələr tələb olunur. Baxmayaraq ki, alveolyar nəsillər mövcud idi in vitro transplantasiya edilmiş HLO-larda don HLO-ları, alveolyar hüceyrə növləri və strukturları dəstəklənmir (Dye et al., 2015, 2016). Xüsusilə, HLO-lar epididimal piy yastığı içərisinə köçürülməlidir, çünki böyrək kapsul bölməsi iskeleyi yerləşdirmək üçün kifayət qədər böyük deyildi. Transplantasiya yerinin fərqliliyinə baxmayaraq, bağırsaq orqanoidlərinə bənzər, HLO-lar ev sahibi damarlar tərəfindən geniş şəkildə vaskulyarlaşdırıldı və həm epiteliya, həm də mezenximal komponentlər sonra yetkinləşdi. in vivo artım (Dye et al., 2016 Finkbeiner et al., 2015b Watson et al., 2014). Bu tədqiqat transplantasiya edilmiş HLO-ların sağ qalmasını, differensiasiyasını və yetkinləşməsini dəstəkləmək üçün fiziki niş tələbini nümayiş etdirdi.

Bu tədqiqatlar göstərdi ki, vaskulyarizasiya transplantasiya edilmiş orqanoid toxumaların aşılanması, böyüməsi və sağ qalması üçün açardır, lakin transplantasiyadan əvvəl vaskulyarizasiyaya malik olmayan orqanoid sistemlər üçün vaskulyarizasiya yavaş və/yaxud səmərəsiz ola bilər. Əvvəlcədən mövcud olan endotel hüceyrələri (HUVEC) olan qaraciyər qönçəsi orqanoidləri yalnız bir neçə gün ərzində həkk olundu və qan axını qurdu (Takebe et al., 2013). Bundan əlavə, kranial pəncərəyə transplantasiya orqanoidlərin canlı görüntülənməsinə imkan verdi və HUVEC-lərin ev sahibi ilə sabit bir damar əlaqəsi meydana gətirdiyini nümayiş etdirdi.

Məlumatlar göstərir ki, əksər orqanoid modellər təbii olaraq damarları ehtiva etmir, lakin endogen damar hüceyrələri hPSC-dən əldə edilən böyrək orqanoidlərində mövcuddur. Bu, çox güman ki, hPSC-ləri aralıq mezoderm taleyinə itələyən, nefrogenik nəsillər və həmçinin endotel hüceyrələri yaradan istiqamətləndirilmiş diferensiallaşma yanaşmasından irəli gəlir (Freedman et al., 2015 Takasato et al., 2015, 2016). Böyrək kapsulunun altındakı transplantasiyadan sonra böyrək orqanoidləri transplantasiyanın ən azı 2 həftəsi ərzində davam edən həm host, həm də orqanoid endotel hüceyrələri tərəfindən geniş şəkildə vaskulyarlaşdırıldı (van den Berg et al., 2018). Üstəlik, abdominal görüntüləmə pəncərəsinin istifadəsi transplantasiya zamanı orqanoidlərin canlı görüntülənməsinə imkan verdi. Qanda flüoresan dekstranın infuziyası qan axınının vizuallaşdırılmasına imkan verdi və sidiyi qandan süzmək funksiyasını yerinə yetirən böyrək orqanoidindəki glomerular strukturların vaskulyarlaşdığını nümayiş etdirməyə kömək etdi. Bu, glomerular zirzəmi membranının çökməsi və transplantasiya edilmiş orqanoidlər içərisində fenestralı endotel də daxil olmaqla, glomerular yetişmənin yaxşılaşmasına səbəb oldu.

Ortotopik orqanoidlərin transplantasiyası

Ektopik transplantasiya orqanoidlərin yetişməsinə imkan verən dəyərli bir vasitə olsa da, anlayışımızı inkişaf etdirmək üçün orqanoidlərin və ya orqanoid törəmə hüceyrə növlərinin ortotopik transplantasiyasına maraq var. in vivo orqanoidlərin olgunlaşmasını tənzimləməkdə nişlər, həmçinin orqan əvəzedici müalicələr üçün orqanoid modellərin tərcümə potensialını artırmaq. Yetkin siçan modellərində fizioloji cəhətdən uyğun yerlərdə həm əsas, həm də hPSC-dən əldə edilən orqanoid oyma üçün icazə verilən nişlər yaratmaq üçün müxtəlif orqan sistemlərində zədə modelləri istifadə edilmişdir (Huch et al., 2015 Miller et al., 2018 Sampaziotis et al., 2017 Sugimoto et al., 2018). Məsələn, son səylər endogen epitelin pozulmasından sonra insan ilkin toxumasından əldə edilən kolon epitel orqanoidlərini ortotopik şəkildə uğurla köçürdü (Sugimoto et al., 2018). Burada nümayiş etdirildi ki, bir neçə ay ərzində insan toxumasının aşınmasını və davamlılığını təşviq etmək üçün kifayət qədər böyük bir yuva yaratmaq üçün əhəmiyyətli bir zədə sahəsi tələb olunur. Daha kiçik xəsarətlər də aşılamağa imkan verirdi, lakin nəticədə həkk olunmuş insan toxuması zamanla itdi. Bir genomla işlənmiş bağırsaq kök hüceyrəsinə xas LGR5-CreER və insan kolon orqanoidlərində bir nəsil müxbiri istifadə edərək bağırsaq kök hüceyrələrinin nəsil axtarışı siçan və insan kolon kök hüceyrələri arasında dövr etmə müddətində növə xas əhəmiyyətli fərqləri aşkar etdi (Sugimoto et al. ). Bağırsağın kök hüceyrə yuvasına dair bu anlayış ektopik transplantasiya ilə mümkün olmazdı.

Bənzər yaralanma-eşdirmə yanaşmaları, hPSC-dən əldə edilən insan ağciyər qönçəsi ucu epitelial progenitor orqanoidləri yaralı bir yetkin siçan ağciyərinə daxil etmək üçün istifadə edilmişdir (Miller et al., 2018 Miller et al., 2019). İnsan ağciyər qönçələrinin ucları kimyəvi səbəbli bronxiol zədələnməsindən sonra siçan ağciyərinin nəfəs borusuna və proksimal tənəffüs yollarına keçə bilər. Üstəlik, bu hüceyrələr zədədən 6 həftə sonra selik əmələ gətirən hüceyrələr, kirpikli hüceyrələr və neyroendokrin hüceyrələr də daxil olmaqla bir neçə proksimal nəsil fenotiplərinə çoxlu nəsil diferensiasiya potensialını nümayiş etdirdi. Xüsusilə, bu əcdadlar göstərdi in vitro alveolyar differensiasiya imkanları, lakin bu cür nəsillər müşahidə edilmədi, çox güman ki, hüceyrələr bu xüsusi zədə modelində heç bir zədə olmayan alveolyar nahiyələrə əkilməmişdir. Bu nəticənin əhəmiyyətini vurğulayır in vivo orqanoid progenitor diferensiasiyasında vasitəçilik edən mikromühit (Miller et al., 2018). Nəhayət, iskelelərə əkilmiş ekstrahepatik xolangiosit əsas toxuma törəmə orqanoidlər, ekstrahepatik öd yollarının zədələnməsinin siçan modellərini funksional olaraq xilas etmək üçün öd kisəsi və ümumi öd yollarının epitelinə keçə bildi (Sampaziotis et al., 2017).

İnsan hPSC-dən əldə edilən beyin orqanoidləri, prosedurun invazivliyinə baxmayaraq, sağlam orqanoid oyma və ev sahibi sağ qalma nisbətləri ilə yetkin siçanların beyninə uğurla nəql edilmişdir (Mansour et al., 2018). Yaş uyğunluğu ilə müqayisədə in vitro-yetişdirilmiş beyin orqanoidləri, transplantasiya edilmiş beyin orqanoidləri müşahidə edilən nisbətən yetişməmiş neyron prekursorları ilə müqayisədə astrositlər və oliqodendrositlərin daxil olduğu yetkin neyron hüceyrə taleyinin daha yüksək nisbətini ehtiva edirdi. in vitro. Bundan əlavə, akson proyeksiyalarının ev sahibi beynin müxtəlif bölgələrini işğal etdiyi göstərildi və marker təhlili insan orqanoidindən əldə edilən bu aksonların siçan neyronları ilə sinaptik əlaqə yaratdığını göstərdi. İlkin tədqiqatlar göstərdi ki, transplantasiya edilmiş beyin orqanoidləri xarici kalsium stimulyasiyasına yetkin deyil, inkişaf etməkdə olan beyinə ən çox oxşar sinxronlaşdırılmış şəkildə cavab verir. Buna görə də, bu, beyin orqanoidlərində təsirli bir irəliləyiş olsa da, mövcud transplantasiya yanaşmaları yalnız qismən yetişmə ilə nəticələnir (Mansour et al., 2018). Səylər həmçinin hPSC-lərdən endotel hüceyrələri olan beyin orqanoidlərini əldə etmişdir ki, bu da birgə kultivasiya edilə bilər. in vitro 5 həftəyə qədər və ən azı 2 həftə müddətində bir siçan ev sahibinə transplantasiya edilmiş, transplantasiya edilmiş beyin orqanoidlərində insan damarlarının yaradılması üçün prinsipin sübutunu nümayiş etdirir (Pham və digərləri, 2018).

Kollektiv olaraq, ortotopik transplantasiya yanaşmalarının yaradılması yerli toxuma mikromühitində orqanoid yetişmənin öyrənilməsinə imkan verir və eyni zamanda tədqiqatçıları orqanoid texnologiyaları üçün tərcümə tətbiqlərinə bir addım yaxınlaşdırır. İstər ektopik, istərsə də ortotopik yanaşmalarda sətəlcəmdəki dəqiq faktorları müəyyən etmək çətin olmuşdur. in vivo orqanoidlərin yetişməsindən məsul olan ev sahibi mühit. İrəliləyərkən, bunların həllinə başlamaq vacib olacaq in vivo yeməkdə yetkin orqanoidlər yaratmaq üçün yetişmə prinsiplərini tətbiq etmək üçün qarşılıqlı əlaqə. Bu sualları həll etmək üçün gələcək təcrübələr CRISPR nokaut kitabxanasından orqanoidlər yarada və ya yetkinləşmə faktorlarını müstəqil qiymətləndirmək üçün kiçik molekul kitabxanasını ekranlaşdıra bilər.

Orqanoid yetkinliyini artırmaq üçün mühəndislik-transplantasiya yanaşmaları

Bağırsaq orqanoidləri qısa bağırsaq sindromu kimi şərtlər üçün əvəzedici toxumanın perspektivli mənbəyidir, lakin klinik tətbiqi funksional bağırsaq toxuması yaratmaq üçün ölçü və yetkinliyin artırılmasını tələb edəcəkdir. Bu problemi həll etmək üçün bir yanaşma toxuma mühəndisliyi ilə hazırlanmış kiçik bağırsaq (TESI) istehsal etmək üçün iskelelərə əkilmiş HİO-lardan istifadə etdi (Finkbeiner et al., 2015a). HİO-lar hüceyrəsiz donuz bağırsaq matrislərinə, eləcə də poliqlikolik/poli L laktik turşusundan (PGA/PLLA) ibarət sintetik skafoldlara əkilmişdir. Bu yanaşmadan istifadə edərək, HİO-lar hüceyrəsiz matrisləri uğurla təkrarladılar in vitro lakin immuniteti zəif olan siçanlara köçürüldükdə bağırsaq şəxsiyyətini saxlamadı və ya saxlamadı. Hüceyrəsiz matrislərin zəif performansı decellularizasiya zamanı təlimatlandırıcı işarələrin aradan qaldırılması və ya matris tərəfindən HİO-lara damar infiltrasiyasının tıxanması ilə bağlı ola bilər. Bununla birlikdə, sintetik matrislər üzərində əkilmiş HIO-lar inkişaf etdi in vivo və epitelial yetkinlik nümayiş etdirdi, nəticədə yetkin bağırsağa bənzəyən toxuma meydana gəldi. Bu boru formalı iskelelər çoxlu HİO-ların əkilməsi üçün perspektivli bir yanaşmadır və daha uzun, daha yetkin bağırsaq toxuması yaradır. in vitro. Baxmayaraq ki, burada təsvir edilən TESI, bağırsaq sinir sistemi kimi əsas bağırsaq hüceyrə tiplərinə malik olmasa da, bu, yuxarıda təsvir edildiyi kimi aradan qaldırıla bilər (Schlieve et al., 2017 Workman et al., 2016).

HİO-lardan böyüyən, yetkin bağırsaq toxuması yaratmaq üçün daha yeni bir yanaşma, uzatma yaylarından istifadə edərək mexaniki gərginliyi birləşdirdi (Poling və digərləri, 2018). Mexanik gərginliyin bağırsaq inkişafında rol oynadığı göstərilmişdir (Kurpios et al., 2008 Savin et al., 2011 Shyer et al., 2015, 2013) və yay və ya uzanmağa əsaslanan uzatma cihazları müalicə üsulları kimi hazırlanmışdır. qısa bağırsaq sindromu (Demehri və digərləri, 2015, 2014 Ralls və digərləri, 2012 Rouch və digərləri, 2016 Stark və digərləri, 2012 Sueyoshi və digərləri, 2013). Bu yanaşmada HİO-lar 10 həftə ərzində immun çatışmazlığı olan siçanlara köçürüldü. Bu müddətdən sonra sıxılmış nitinol yayları əlavə 14 gün ərzində transplantasiya edilmiş HİO-lara cərrahi yolla daxil edilmişdir. Gərginliyə məruz qalmış transplantasiya edilmiş HİO-lar bağırsaq uzunluğunun artması, daha böyük villi və daha dərin kriptlər nümayiş etdirdi və bulaqsız köçürülmüş HİO-larla müqayisədə qlobal gen imzalarına əsasən daha yetkin göründü. Bu tədqiqatlar HİO-ların klinik tətbiqlərini təşviq etmək üçün biomühəndislik yanaşmalarını vurğulayır və orqanoidlərin yetişməsinin təşviqində həm bioloji, həm də mexaniki işarələrin əhəmiyyətini nümayiş etdirir.


Mikroinyeksiya bağırsaq orqanoidləri - Biologiya

Bu kod Hill və digərlərinin "Bakteriyaların kolonizasiyası yetişməmiş insan bağırsaq epitelində mürəkkəb fizioloji reaksiyanı stimullaşdırır" məqaləsi ilə əlaqələndirilir. eLife, 2017. http://dx.doi.org/10.7554/eLife.29132

İnsan bağırsaq orqanoidlərində epiteliya maneə keçiriciliyinin real vaxtda ölçülməsi

David R. Hill 1# , Şa Huang 1 , Yu-Hwai Tsai 1 , Jason R. Spence 1,2 və Vincent B. Young 1,3,4 ,

1 Daxili Xəstəliklər Departamenti, Qastroenterologiya Bölməsi, Miçiqan Universiteti, Ann Arbor MI 48109 2 Hüceyrə və İnkişaf Biologiyası Departamenti, Miçiqan Universiteti, Ann Arbor MI 48109 3 Daxili Xəstəliklər Departamenti, Yoluxucu Xəstəliklər Bölməsi, Miçiqan Universiteti, Ann Arbor MI 48109 4 Mikrobiologiya və immunologiya şöbəsi, Miçiqan Universiteti, Ann Arbor MI 48109

# yazışma üçün müəllif: David R. Hill ([email protected])

Bu protokol flüoresan mikroskopiya və canlı hüceyrə mikroskopiyasından istifadə edərək insan bağırsaq orqanoidlərində farmakoloji müalicədən sonra real vaxt rejimində epitelial maneə keçiriciliyinin ölçülməsini təsvir edir.

Biyopsiya yolu ilə əldə edilən və ya yönəldilmiş differensiasiya yolu ilə pluripotent kök hüceyrələrdən əmələ gələn bağırsaq toxumalarının 3D mədəniyyətindəki irəliləyişlər in vitro bağırsaq mukozasının modelləri. Bu inkişaf etməkdə olan model sistemlərdən istifadə etmək 2D mədəniyyət sistemləri və heyvanlar üçün hazırlanmış alət və texnikaların uyğunlaşdırılmasını tələb edəcəkdir. Burada biz real vaxt rejimində insan bağırsaq orqanoidlərində epiteliya maneə keçiriciliyini ölçmək üçün bir texnika təsvir edirik. Bu, flüoresan etiketli dekstranın mikroinyeksiyası və epiflüoresan filtrlərlə təchiz edilmiş ters çevrilmiş mikroskopda görüntüləmə yolu ilə həyata keçirilir. Bağırsaq orqanoidlərində maneə keçiriciliyinin real vaxt rejimində ölçülməsi insan bağırsaq epiteliya toxumasında yüksək rezolyusiyaya malik müvəqqəti məlumatların yaradılmasını asanlaşdırır, baxmayaraq ki, bu texnika sabit vaxt nöqtəsi görüntüləmə yanaşmalarına da tətbiq oluna bilər. Bu protokol farmakoloji agentlərə, bakterial məhsullara və ya toksinlərə və ya canlı mikroorqanizmlərə məruz qaldıqdan sonra epitelial maneə keçiriciliyinin ölçülməsi üçün asanlıqla uyğunlaşdırıla bilər. Kiçik dəyişikliklərlə, bu protokol həm də bağırsaq orqanoidlərinin mikroinyeksiyasında ümumi primer rolunu oynaya bilər və istifadəçilər mikroinyeksiyadan sonra bu protokolu əlavə və ya alternativ aşağı axın tətbiqləri ilə tamamlamağı seçə bilərlər.

A 2 mq/ml FITC-dekstran (4 kDa) ilə mikroinyeksiya edilmiş kök hüceyrədən əldə edilən insan bağırsaq orqanoidləri (HIO) 20 saat ərzində təsvir edilmişdir. HİO-lar həmçinin PBS (nəzarət) və ya mikroinyeksiya edilmişdir Clostridium difficile toksin TcdA (12.8 ng/μl) və ya xarici mədəniyyət mühitinə əlavə edilmiş 2 mM EGTA ilə müalicə olunur. 4X böyütmə. B PBS (nəzarət), TcdA və ya EGTA ilə müalicə olunan HIO-larda zamanla orta normallaşdırılmış FITC intensivliyinin qrafiki. Səhv çubuqları S.E.M və N = qrup başına 4-6 HİO-nu təmsil edir.

Bu protokol bir səbəbdən GitHub-dadır. Sizi suallar verməyə, təkliflər verməyə və burada təqdim olunan elmlə məşğul olmağa dəvət edirik. İctimai müzakirəyə təqdim etmək istədiyiniz sualları və şərhləri yerləşdirmək üçün GitHub "Məsələlər" funksiyasından istifadə edin. Bu depoya töhfə verən kimi əlavə olunmaq istəyirsinizsə, müəlliflərlə əlaqə saxlayın. Çəkmə sorğusu göndərin. Və ya bu deponu bağlayın və öz dəyişikliklərinizi edin

Biz istifadəçilərin əksəriyyətinin sadəcə olaraq əlyazmanın PDF versiyasını yükləmək istəyəcəyindən şübhələnirik. Bunun üçün get!

Əgər siz analizin aparılması və kağızın yaradılması kodunun daxili işini başa düşmək istəyirsinizsə (“Reproduktiv Tədqiqat” adlı bu şey haqqında eşitmisinizmi?), Siz bu anbarı kompüterinizə klonlaşdırmağa və kağızı tərtib etməyə cəhd edə bilərsiniz. .

Kağızı mənbədən tərtib etmək üçün sizə aşağıdakı alətlər lazımdır:

Sonra bu deponun yerli klonunuza gedin və əmr sorğusuna aşağıdakıları yazın:

Hill, D. R., Huang, S., Tsai, Y. H., Spence, J. R., Young, V. B. İnsan bağırsaq orqanoidlərində epiteliya maneə keçiriciliyinin real vaxtda ölçülməsi. J. Vis. Exp. (), e56960, doi: 10.3791/56960 (2017).


Bağırsaq Crypt Organoids Ekranı: Kompleks Biologiya üçün Sadə Oxu

Ağız və bağırsaq mukoziti radiasiya müalicəsinin zəiflədici yan təsiridir. Radiasiyadan qaynaqlanan selikli iltihabın siçan modeli, standart qayğı müalicəsi olan keratinosit böyümə faktoruna (KGF) cavab verən insan xəstəliyini əks etdirən çəki itkisinə və toxuma zədələnməsinə səbəb olur. Mədəni bağırsaq kripti orqanoidləri bağırsaq epitelinin müalicəsinin radiasiya nəticəsində yaranan zədələnməyə təsirini izləyən analizin inkişafına imkan verdi. Bu in vitro analiz siçan modelinə bənzəyir, çünki KGF və dam lövhəsinə məxsus spondin-1 (RSPO1) şüalanmadan sonra gücləndirilmiş kript orqanoid bərpası. Skrininq postradiasiya orqanoidlərinin sağ qalmasını artıran birləşmələri müəyyənləşdirdi. Bu birləşmələrin sınaqları orqanoidlərin zamanla cavablarını dəyişdiyini ortaya qoydu. Bu adaptiv davranışı araşdırmaq üçün mədəniyyətin müxtəlif vaxt nöqtələrində kript orqanoid mədəniyyətlərində qərəzsiz transkriptom analizi aparılmışdır. Bir sıra genlərin və yolların zamanla modulyasiya edildiyi aşkar edildi, bu da orqanoid mədəniyyətlərin dəyişdirilmiş həssaslığına əsas verir. Bu hesabat insan xəstəliklərinin aspektlərini əks etdirən in vitro analizi təsvir edir. Təhlil bioaktiv birləşmələri müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir ki, bu da uzun müddətli mədəniyyət üzərində kript orqanoidlərinin biologiyasını sorğulamaq üçün zond rolunu oynayır. Zamanla dəyişən yollar mukozitin müalicəsi üçün potensial hədəflər təklif edə bilər.

Açar sözlər: KGF RSPO mukoziti ilkin 3D hüceyrə mədəniyyətləri kiçik bağırsaq kripti orqanoidləri.


Standartlaşdırma üçün əsas problem olaraq qalır In Vitro İltihab modelləri

Göstərildiyi kimi, kök hüceyrə və orqanoid sahəsində böyük irəliləyişlər meydana çıxdı və onların tərcümə tədqiqatlarında və hətta səhiyyədə potensialı göz qabağındadır, lakin orqanoidlərin mövcud məhdudiyyətləri vacib bir xəbərdarlıq olaraq qalır (Şəkil 2B).

Orqanoid törəmənin ümumi məhdudiyyəti onların yarada biləcəyi fenotiplərin yüksək dəyişkənliyidir. Orqanoid və kök hüceyrə mədəniyyəti sistemləri və onların molekulyar nəticəsi nümunə götürülmüş toxumanın keyfiyyətindən və xassələrindən çox asılıdır. Əvvəlcədən emal mərhələsindəki dəyişikliklər bu nümunələrin immun imzalarına ciddi şəkildə müdaxilə edir. Bundan əlavə, iltihablı toxumanın hüceyrə ölümünə məruz qalma ehtimalı daha yüksəkdir, fərqli qida və kultivasiya ehtiyacları ola bilər və beləliklə, iltihablı toxumadan həyati orqanoidlərin bərpa sürəti əhəmiyyətli dərəcədə aşağıdır (60). İltihab imzaları olsa da ex vivo onlara bənzəyir in vivo mənşəli (9), xüsusilə İBH kimi mürəkkəb xəstəliklər müxtəlif iltihablı ləzzətlərlə xarakterizə olunur. Bundan əlavə, biopsiyalar nümunə götürülmüş bölgənin biologiyasını əks etdirir və buna görə də kök hüceyrələr/orqanoidlər müxtəlif bölgələrdən yığılmalıdır. İPSC-lərdən istifadə edərkən, fərdin genetik fonundan və laboratoriya tərəfindən istifadə edilən mədəniyyət protokolundan asılı olaraq orqanoidlərdə variasiyalar mövcuddur. Yaranan izogen xətlər vasitəsilə gen redaktə yanaşmaları genetik fərqlərlə bağlı bu dəyişkənliyi məhdudlaşdıra bilər.

İPSC-lərdən olan orqanoidlər homojen populyasiyanın diferensiasiyası yolu ilə əmələ gəldiyi üçün toxumalara xas hüceyrə növləri və onların mikromühiti yeni yaradılmalıdır. Bu, iPSC-lərin istifadəsini çətinləşdirir və orqanoid və yetkin toxuma arasında struktur və funksiyada əhəmiyyətli oxşarlıqlara baxmayaraq, orqanoidlər tez-tez yetişməmiş xüsusiyyətləri saxlayır və onları fetal toxumaya daha çox bənzədir. iPSC-dən əldə edilən bağırsaq orqanoidinin nümunəsində bu məhdudiyyəti ya onu daha real inkişaf nişini təmin edən T hüceyrələri ilə birgə kulturasiya etməklə (61), orqanoid arxitekturasını təkmilləşdirmək və beləliklə də orqanoid arxitekturasını təkmilləşdirmək üçün daha mürəkkəb 3D skafoldların mühəndisliyi ilə həll edilə bilər. orijinal toxuma in vivo (62, 63) və ya in vivo bağırsaq kök hüceyrə yuvaları, kript/villus arxitekturası və laminasiya edilmiş insan mezenximası olan yetkin bağırsaq epiteli ilə nəticələnən transplantasiya, hər ikisi siçan damarlarının böyüməsi ilə dəstəklənir (64). Yetişməmiş xüsusiyyətlərə əlavə olaraq, orqanoidlər müəyyən bir ölçüyə çatdıqdan sonra çox vaxt məhdud bir ömür göstərir. Diffuziya olmaması səbəbindən hüceyrələr davamlı inkişafı dəstəkləmək üçün kifayət qədər qida ilə təmin edilmir. Bioreaktorların istifadəsi qida təchizatını yaxşılaşdıra bilər. İdeal olaraq, orqanoidlər bu yaxınlarda göstərildiyi kimi vaskulyarizasiya ilə nəticələnən endotel inkişafının induksiyası üçün hazırlanmışdır (41). Başqa bir strategiya, orqanoid inkişafı zamanı endotel hüceyrələrini və ya onların törəmələrini inteqrasiya etmək və endotel hüceyrələri üçün 3D-skelelərin dizaynı üçün bioprinting üsullarını daxil etmək olardı (65, 66). Bununla belə, iPSC-dən əldə edilən orqanoidlərin orijinal material toxuması adətən iltihablanmır, məs. dəri fibroblastları və iltihab mühitinin olmadığı bir neçə həftədən aylara qədər yenidən proqramlaşdırılmış və becərilmişdir. Mürəkkəb, multifaktorial iltihabın öyrənilməsi üçün iPSC-dən əldə edilən sistemlər model baxımından ilk seçim deyil. Əksinə, iPSC-dən əldə edilən orqanoidlər monogen İBH kimi əsasən genetik səbəb olan iltihabi xəstəlikləri öyrənmək üçün əla vasitə ola bilər.

Digər mühüm problem orqanoid mədəniyyətlərə sərf olunan səy, vaxt və xərclərin böyüklüyüdür. Adi orqanoid kulturalar üçün idarə oluna bilən qiymətlərlə kifayət qədər sadə protokollar mövcud olsa da, diferensiasiya protokollarına ya bahalı amillər, ya da becərmə mühiti daxildir və ya qidalandırıcı hüceyrə xətləri tərəfindən istehsal edilməli olan şərti mühit tələb olunur. Birgə kulturasiya sistemlərinə çox vaxt daha yüksək becərmə səyləri və vaxt tələb edən 2D modellər daxildir. Bu problemə əlavə olaraq, iPSC-nin yaranması və onların spesifik toxumalara differensasiyası tez-tez bir neçə həftəlik intensiv kultivasiya səylərini tələb edir ki, bu da mənfi hadisələrin riskini artırır, məsələn. çirklənmə və ya arzuolunmaz fərqləndirmə.

Yuxarıda qeyd olunan problemlərlə mübarizə aparmaq üçün akademik tədqiqat və yüksək texnologiyalı sənaye tərəfdaşlarının sıx əməkdaşlığı infrastruktur problemlərini aradan qaldırmaq üçün perspektivli strategiya ola bilər. Akademiya problemdən irəli gələn ideyalar və yeni xəstəlik modellərinin fərziyyəyə əsaslanan baxışını təmin edə bilsə də, sənaye genişmiqyaslı istehsal və standartlaşdırma üçün lazımi texnologiya, imkanlar təqdim edə bilər. Bu əməkdaşlıq infrastrukturlarının yaradılması zəruridir və kök hüceyrə texnologiyasının gələcək inkişafını təşviq edə bilər.


Bağırsağın inkişafı və xəstəliklərinin modelləşdirilməsi üçün bağırsaq orqanoidləri

İnkişaf etmiş ölkələrdə mədə-bağırsaq xəstəlikləri getdikcə daha çox yayılır. Ölümsüzləşdirilmiş hüceyrələr və heyvan modelləri bu xəstəlikləri başlatan və yayan mexanizmlər haqqında vacib, lakin məhdud məlumat verdi. Bağırsağın strukturunu və funksiyasını təkrarlaya bilən bağırsaq inkişafı və xəstəliklərinin insana xas modellərinə çox ehtiyac var. in vitro. Pluripotent kök hüceyrələr və ilkin toxuma mədəniyyəti texnikasındakı irəliləyişlər bağırsaq epitel hüceyrələrini üç ölçüdə yetişdirməyə imkan verdi ki, onlar öz-özünə yığılaraq “bağırsaq orqanoidləri” əmələ gətirirlər. Bu orqanoidlər mədə-bağırsaq xəstəlikləri haqqında məlumat əldə etmək və onları müalicə etmək üçün potensial olaraq yeni müalicələr təqdim etmək üçün istifadə edilə bilən yeni, insana xas modellər yaratmağa imkan verir. Burada cari nəzərdən keçiririk in vitro inkişaf modelləşdirmə, dərman/toksiklik testi və terapevtik istifadə sahələrində təkmilləşdirmələrin edilə biləcəyi yerləri və potensial gələcək tətbiqləri nəzərə alaraq bağırsaq inkişafı və xəstəliklərinin modelləri.

Bu məqalə “Dizayner insan toxuması: yaxınlıqdakı laboratoriyaya gəlmək” mövzusunun bir hissəsidir.

1. Bağırsağın quruluşu və funksiyası

Bağırsaqlar qəti endodermadan əmələ gələn həyati orqandır və kiçik və yoğun bağırsaqlara bölünə bilər [1]. Collectively, the small and large intestines perform the vital function of digestion, nutrient absorption and waste elimination [2]. The small intestine contains several functionally distinct areas including the duodenum, jejunum and ilium, and its surface comprises a highly folded epithelium of villi, microvilli and intestinal crypts [3]. This intricate folding of villi and microvilli serves to dramatically increase the total surface area of the small intestine, thereby facilitating greater nutrient absorption. The intestinal crypt functions as the niche in which the LGR5 + stem cells reside [4]. LGR5 + cells are relatively slow cycling cells and give rise to a highly proliferative and multipotent progenitor population known as the transit-amplifying (TA) cells, which differentiate as they migrate from the crypt towards the villi. By the time TA cells have moved out of the crypt, they are fully differentiated into one of the many cell types required for normal functionality of the epithelium [5].

The large intestine comprises four main regions: the ascending, transverse, descending and sigmoid colon [6]. While most digestion occurs in the small intestine, the large intestine functions to absorb water and ions, in addition to vitamins and short chain fatty acids (SCFA) synthesized by commensal bacteria. Production of SCFA by commensal bacteria in the large intestine is recognized as an important feature of maintaining normal gut health and has been shown to have several protective effects including creating an environment hostile to pathogenic microbes, providing an energy source for intestinal epithelial cells and enhancing mucus production [7].

2. Cells of the small and large intestine

The intestinal epithelium comprises several different cell types including enterocytes, goblet cells, Paneth cells and enteroendocrine cells, all of which are derived from the resident LGR5 + stem cells found at the base of intestinal crypts [8] (figure 1). Epithelial cells are critical in maintaining immune homeostasis within intestinal tissue, closely regulating the interplay between the intestinal mesenchyme, and commensal and pathogenic bacteria. They maintain a barrier formed with tight junctions, essential to the control of macromolecular transport and immune homeostasis. Enterocytes are the most common cell type found in the epithelium, and they mainly function in nutrient absorption. Secretory epithelial cells consist of Paneth and goblet cells and multiple enteroendocrine cell types, with functions ranging from cytokine to hormone production [9].

Figure 1. Anatomy of the small and large intestine. The small intestine is composed of repetitive villus and crypt structures. LGR5 + stem cells and Paneth cells are located at the base of the crypts, followed by the TA cells, and then mature epithelium composed of goblet cells, enteroendocrine cells and enterocytes (a). The large intestine lacks the villi structures of the small intestine and instead is composed of colonic crypts. At the base of colonic crypts are LGR5 + stem cells and Reg4 + cells, followed by TA cells and mature epithelium that contains a high proportion of goblet cells (b).

Goblet cells play a critical role in the functioning and protection of the intestinal tract. There are nearly twice as many goblet cells in the colon as in the small intestine, which is in proportion to the increase in bacteria [10]. Goblet cells function by producing glycoproteins known as mucins, which are vital constituents of the mucus that lines the epithelium. This mucosal layer acts as the first line of defence, preventing the bacteria present in the gut from being in direct contact with the intestinal epithelium [11]. Mucus production is increased in response to inflammatory cytokines including interferon-γ and interleukins-9, -10 and -13 [12]. The glycoproteins that comprise this mucus are toxic to many strains of bacteria. Additionally, this layer acts as a matrix to which defensins and antibodies adhere that target specific pathogenic bacteria adhere. When mucus production is hindered, this can cause commensal bacteria in the gut microbiota to penetrate the epithelial barrier, triggering an immune response [13]. Goblet cells also produce other constituents of the mucus layer, including trefoil factors that stabilize the mucus layer by forming cross-links between different components of the mucus [14]. This cross-linking creates a unique property in that the innermost layer is thicker and more viscous while the outer layer is more aqueous, allowing commensal bacteria to reside there.

The small and large intestine is a high turnover organ, with complete epithelial renewal approximately every 7 days. This process is driven by LGR5 + intestinal stem cells (figure 1a,b). The pioneering work of Hans Clevers demonstrated that LGR5 + stem cells reside at the base of the intestinal crypts that form the intestinal stem-cell niche [8,15]. LGR5 + cells are crucial for the continual renewal of the intestinal epithelium and undergo asymmetric division approximately every 24 h, giving rise to a daughter stem cell and a TA cell. These rapidly proliferating TA cells begin in the TA zone and migrate up the intestinal crypt, while dividing four to five times along the way, before terminally differentiating into any of the intestinal cell types [16]. Once differentiated, these cells continue to migrate upwards towards the top of the crypts and have a lifespan of approximately 7 days. Once these cells have reached the top of the villi, they typically undergo anoikis and are shed into the intestinal lumen.

Paneth are also generated from the asymmetrical division of the LGR5 + stem cell [16]. However, instead of migrating upwards, Paneth cells migrate downwards into the base of the crypt. Paneth cells are a longer-lived cell type, surviving for approximately 30 days at the base of intestinal crypts where they play an integral role in producing and maintaining the stem-cell niche [17,18]. In addition to maintaining the niche, Paneth cells secrete a substantial amount of antimicrobrial peptides such as defensins that help regulate intestinal microbiota and protect against invading pathogens.

Paneth cells are absent in the majority of colonic crypts. However, secretory cells expressing typical Paneth cell markers, including CD24 are present. Reg4 has been found to be a reliable marker of these cells, residing adjacent to LGR5 + stem cells in all colonic crypts [19]. These cells have been shown to secrete epidermal growth factor (EGF) and the Notch ligands DII1 and DII4, while LGR5 + stem cells were found to express the corresponding receptors [19]. These secretory Reg4 + cells were found to more closely resemble Paneth cells, rather than goblet cells found in either the small or large intestine. Reg4 + cells are integral to controlling stem-cell positioning in the crypt and for maintaining stemness of LGR5 + colonic stem cells. These cells have many distinct similarities with Paneth cells of the small intestine, with the exception that Reg4 + cells do not produce Wnt ligands, while colonic LGR5 + stem cells do express Wnt receptors [19]. Therefore, mesenchymal tissue surrounding the colonic crypts, known to produce Wnt ligands, may provide the necessary Wnt required for stem-cell maintenance in the intestinal crypt in vivo [20].

3. Cell signalling in the intestinal epithelium

Self-renewal and differentiation of LGR5 + stem cells are achieved via tight regulation of several signalling pathways within the intestinal crypts. Wnt signalling is considered the central signalling pathway maintaining LGR5 + stem-cell proliferation, controlling cell positioning within the crypt and activating terminal differentiation of Paneth cells. Dysregulation of this pathway has been shown to be important in the development of some colon cancers [21].

Higher concentrations of Wnt3a and EGF are present at the base of the crypts and are required for stem-cell maintenance and proliferation, respectively [22] (figure 2a). A concentration gradient of Wnt3a is established in the intestinal crypt, with highest levels found in the base of the crypt that then decrease towards the top of the crypt [23]. This concentration gradient along with a decrease in Notch signalling and increased BMP signalling at the top of the crypts facilitates the initial differentiation of the LGR5 + stem cells along with the proliferation and terminal differentiation of the TA cells [24]. Paneth cells are integral in producing the crypt environment via secretion of several factors, including Wnt3a, EGF, transforming growth factor α (TGFα) and the Notch ligand D114 [18].

Figure 2. Regulation of stemness in the intestinal stem-cell niche. During normal maintenance of the stem-cell niche several signalling gradients are established that either promote stemness (Wnt) or differentiation (BMP) (a). Multiple signal pathway agonists and antagonists are active in the intestinal crypts that are also used during in vitro culture to simulate the crypt niche environment (b).

4. Intestinal organoids

The identification of LGR5 + stem cells and the characterization of the intestinal stem-cell niche has led to the development of three-dimensional (3D) organoid cultures and the ability to amplify intestinal epithelium in vitro. These primary tissue cultures can be maintained long term without any substantial changes to genetic integrity or tissue physiology.

Organoids are now becoming an increasingly popular option for exploring an array of diseases currently lacking suitable treatments. Multiple organoid culture platforms have now been described including liver and pancreatic organoids [25–28], kidney organoids [29], central nervous system organoids [30] and intestinal organoids [31–33]. An organoid is often defined as ‘an in vitro 3D cellular cluster derived exclusively from primary tissue, ESCs or IPSCs, capable of self-renewal and self-organization, and exhibiting similar organ functionality as the tissue of origin' [34]. Indeed, intestinal organoids are clusters of cells that self-organize in 3D structures that recapitulate major features of their native tissue. Intestinal organoids have been derived from both human stem cells and direct biopsy of adult intestinal tissue. In each case, the resulting intestinal organoids share many features, including a highly folded epithelium structure consisting of crypts and villi similar to native intestinal epithelium. Once embedded in Matrigel™, they self-assemble so that the luminal surface of epithelium is directed towards the centre of the organoid and the basolateral side is in contact with the Matrigel™ and surrounding medium. Analysis of the different cell types present within intestinal organoids has shown that all cell types usually found in vivo are present, and are therefore useful for studying the complexities of interplay between cell types during homeostasis and disease states.

Intestinal organoids have been shown to exhibit the same functions as those that occur in vivo, including mucus production, and absorptive and secretory functions [24]. Intestinal organoids mimic in vivo epithelial regenerative capacity, with apoptotic cells being continually released into the lumen of the organoid as new cells are differentiated from the LGR5 + cells within the crypts to replenish the epithelium.

5. Isolation and culture of intestinal organoids

There are two approaches to creating intestinal organoids: either through isolation of intestinal crypts from patient donors or via in vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hIPSCs). Both methods result in organoids comprising all intestinal epithelial cell types found in vivo, in similar proportions and arrangements.

Culture conditions for both primary tissue and stem-cell-derived organoids are essentially the same, requiring a basal media comprising Advanced DMEM/F12, supplemented with N2 and B27, nicotinamide and N-acetylcysteine. To the basal medium additional growth factors are added to support the growth of the organoids including EGF, Noggin and gastrin, which are essential for regulation of gut mucosal growth and proliferation of intestinal epithelial cells. The presence of Wnt3a is crucial to regulate self-renewal, proliferation and differentiation, as expression of LGR5 in stem cells found in intestinal crypts is dependent upon the canonical Wnt signalling pathway, regulated by R-Spondin-1 and BMP4 inhibition by Noggin [35,36] (figure 2b).

Intestinal crypts can be isolated from intestinal biopsies during endoscopy or surgical resection [18,37] (figure 3). Crypts are manually dissected from the epithelium and embedded into a Matrigel™ containing Wnt, R-Spondin, EGF and Noggin. Once Matrigel™ has solidified and encapsulated the isolated crypts, the Matrigel™ is overlaid with tissue culture medium containing all additives and growth factors. Over the course of 7–10 days intestinal crypts elongate and expand to form the first organoid structures, which can then be manually dissociated and expanded. In addition to LGR5 + stem cells, mature enteroids and colonoids comprised enterocytes, enteroendocrine cells, goblets cells and Paneth cells.

Figure 3. Schematic of human intestinal organoid creation. Intestinal organoids can be generated directly from intestinal biopsy or tissue from surgical resection. Isolated crypts can be placed directly into 3D Matrigel™ cultures along with Wnt, Noggin, EGF and R-Spondin to establish stable cell lines. An alternative approach to generating patient-specific intestinal organoids requires a skin biopsy, isolation and amplification of skin fibroblasts. Skin fibroblasts can then be reprogrammed to hIPSCs using the Yamanaka factors and differentiated into endoermal cells and finally, intestinal epithelium before long-term culture in 3D Matrigel™ conditions.

Using a stem-cell-based approach, hESCs or hIPSCs can be differentiated following normal developmental stages to generate intestinal epithelium (figure 3). This includes differentiation of cells via the major developmental milestones of definitive endoderm, hindgut endoderm and intestinal progenitor cell stages. Once differentiated into sufficiently committed intestinal progenitor cells, they can be transitioned from what is normally a two-dimensional (2D) differentiation platform into the 3D organoid platform, where cells then spontaneously rearrange themselves into intestinal organoids.

6. Functional analysis of organoids

A variety of assays have been used to assess functionality of intestinal organoids. A primary function of enterocytes is transport of water and electrolytes across the intestinal barrier. In vitro, organoids have been shown to maintain this function via derivation of organoids lacking the apical transporters SGLT-1 or PEPT1. These organoids were shown to have inhibited d -glucose, d -fructose and peptide transport across the epithelial membrane, validating their potential use as a model of nutrient and drug transport mechanisms [38].

Permeability of the intestinal epithelium is an important factor in both health and disease, affecting the diffusion of small molecules across the intestinal barrier and preventing bacterial translocation via the bloodstream. Recently, it has been demonstrated that intestinal organoids can be used to model epithelial permeability and changes can be recorded in real time [39]. təpə və b. [39] demonstrated this technique by injecting fluorescently labelled dextran into the lumen of organoids while automated microscopy was used to capture, in real time, live cells and quantify breaks in the luminal surface. Using this technique, alterations to intestinal permeability can be studied under chronic inflammatory conditions and during bacterial invasions.

Forskolin-induced organoid swelling assay has also been used to demonstrate functionality of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) ion channel. Organoids with a functional CFTR swell in response to forskolin treatment, while any changes to the function of CFTR due to inhibition or genetic mutation can be detected due to lack of swelling [40]. This assay has the potential to be adapted to a drug-screening platform for cystic fibrosis (CF).

7. Applications of organoid technology

Owing to its differing physiology and distinct functions, the gastrointestinal tract is affected by an array of disorders. The intestinal epithelium is continuously exposed to antigens from commensal bacteria and consumed food, hence it has an extensive immune system, inclusive of adjacent lymphoid tissue, heavily populated with lymphocytes. The mucosa is the main site at which the immunological functions take place however, loss of this carefully maintained immune homeostasis can cause chronic inflammation and multiple disorders. Intestinal organoids have now become increasingly popular as a platform to model many intestinal diseases caused by chronic inflammation or physical injury.

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic, progressive and relapsing disease affecting the entire gastrointestinal tract. It is a result of dysregulated innate and adaptive immune responses against antigens present in the gastrointestinal tract. IBD is categorized into two main subtypes: ulcerative colitis (UC), which is restricted to the colon, and Crohn's disease (CD), which can affect any area of the digestive tract [41]. During active IBD, the small and large intestine can become highly inflamed, leading to destruction of the epithelium and deterioration in digestive capacity. Intestinal organoids derived from IBD patients present an opportunity to understand how innate immunity is regulated in IBD patients and to identify novel therapeutics to reduce the severity of the disease.

Short bowel syndrome (SBS) develops often due to partial resection of large intestine as a result of IBD, colorectal cancer (CRC) or ischaemic disease, or can be present at birth. Owing to a significantly reduced surface area of the intestinal epithelium, malabsorption and malnutrition are major issues. Congenital SBS has a genetic basis linked with the CLMP gene. Patient-derived small intestinal organoids offer a chance to study the genetic susceptibility in greater detail, including the molecular mechanisms involved in impaired intestinal elongation during development that are currently not well understood [42]. Furthermore, the combination of intestinal organoids with tissue-engineering techniques for the lengthening of the small intestine, offer a potential method for the restoration of normal functioning of the bowel irrespective of the cause of SBS.

Coeliac disease is an example of an autoimmune disease mainly affecting the small intestine upon consumption of gluten. The resulting inflammation causes malabsorption, leading to a range of other successive symptoms. Without exclusion of all gluten products from the diet, prolonged inflammation can lead to osteoporosis and cancer. Organoids cultured from patients suffering from coeliac disease can offer insight into genetic predispositions and mechanisms driving the disease forward. Alterations to intestinal barrier integrity, which are known to occur in coeliac patients, can be explored using organoids [43]. Similarly, patient-derived organoids could be used as a drug-screening platform for the identification of novel therapies.

Diverticular disease occurs typically in the sigmoid colon and is the result of physical damage to the intestines leading to loss of function. Diverticula are sacs that form from the herniation of the intestinal epithelium, erupting through the surrounding muscular layer. They are suspected to form due to excessive pressure throughout the large intestine, due, in part, to a low-fibre diet, however, aetiology remains largely unknown. These diverticula can become infected and inflamed, leading to the patient developing fever, pain, nausea and diarrhoea. A genetic element is suspected that predisposes individuals to developing diverticulitis. Therefore, genetic factors involved in the pathogenesis of diverticulitis can be studied using patient tissue-derived organoids from a relatively non-invasive intestinal biopsy. These can then be compared to healthy intestinal tissue to determine genetic and functional differences. Owing to the mechanical nature of the development of diverticular disease, mechanical stress could be applied to the individual organoids to examine the response of the intestinal epithelium under differing levels of stretch stress. However, a tissue-engineering approach is required in combination with organoid technology to model the development of diverticula. Intestinal organoids alone would not be suitable to model diverticula development due to the involvement of the mesenchyme and muscular layer surrounding the intestinal epithelium in vivo.

Cystic fibrosis is perhaps best known for its effect in the lung but also causes complications in other organs, including the pancreas and intestines. The most serious acute complication of the intestine in CF is obstruction of the terminal ileum or proximal large intestine, which if untreated can result in rupture and sepsis. Intestinal organoids are a suitable model of CF due to their expression of CFTR and by using a combination of forskolin-induced swelling and voltage-gate measurements, fluid and ion transport can be accurately measured. This assay has been performed on human intestinal organoids, demonstrating physiologically accurate CFTR function [44]. Drug responsiveness can, therefore, be measured using the current organoid model to identify the most effective treatment for CF or as a diagnostic tool [45].

CRCs are among the most commonly diagnosed cancers in the developed world. There are many contributing factors to development of CRC, but importantly long-term CD or UC significantly increases lifetime risk. Organoids are increasingly being used as models of CRC. Current models of CRC are unable to reproduce the progression of the disease at the early stages and are not representative of the heterogeneous nature of tumours. Genome-editing techniques, such as CRISPR/Cas9, however, can be used as a means to introduce genetic mutations into genes of interest. Following genetic manipulation organoids can then be transplanted into mice, in which the in vivo mechanisms of tumour progression and invasion can be measured [46].

8. Host–pathogen interactions

Different methods are employed to expose intestinal organoids to bacteria. Microinjection of live bacteria or bacterial proteins is a common approach to study intestinal infections, including SalmonellaClostridium difficile infections. For example, Forbester və b. [31] used hIPSCs to generate intestinal organoids that were then microinjected with Salmonella. mRNA sequencing was used to create a global profile of changes in gene expression in response to Salmonella infection [31]. Similarly, Leslie və b. [35] used a microinjection methodology to deliver C. difficile into the lumen of hIPSC-derived intestinal organoids. They then observed that C. difficile remained in the lumen for a prolonged duration, suggesting that organoids possess suitable conditions for the survival of C. difficile and hence other obligate anaerobes. Microinjection of C. difficile toxins has also been shown to exhibit expected effects on epithelial integrity and changes to the expression of certain tight junctions [35].

9. Limitations of organoids

Despite increasing interest in organoid platforms to model intestinal development and disease, organoids used in today's research lack certain elements of the complete organ found in vivo (cədvəl 1). This includes a lack of mesenchymal tissue, immune and neural cells that in vivo contribute to the overall structure and functioning of the intestines. Organoids currently used in research are comprised mainly of epithelium, including the niche that enables self-renewal of intestinal stem cells.

Table 1. Advantages and disadvantages for the use of intestinal organoids in the study of disease.

Organoids differentiated from induced pluripotent stem cells (IPSCs) into intestinal epithelial structures are known as induced intestinal organoids [47]. The differentiation protocols promoting the generation of such organoids also generates mesenchyme that, when transplanted under the renal capsule of mice, differentiate into smooth muscle and myofibroblasts [24]. These, therefore, are more representative of the intestines in vivo. However, they require a longer period of time to generate and are still devoid of immune cells which are necessary to address the most common intestinal disease IBD.

Other limitations of intestinal organoid include practical limitations due to the fact that cells must be embedded in Matrigel™ and grown in 3D. This creates additional complications when manipulating cells for simple procedures such as isolating mRNA, DNA and performing immuncytochemistry because organoids will require removal from Matrigel™ prior to processing. 3D culture also creates problems when attempting genetic manipulation via transfection and CRISPR/Cas9 gene editing approaches. Again, cells require removal of Matrigel™ prior to manipulation, which can create suboptimal conditions for organoid maintenance and growth.

It is clear that intestinal organoids can be used as an effective model of host–pathogen interactions that occur within the intestinal tract. However, further study is required to incorporate additional immune elements into the model to give a more complete illustration of inflammatory response. Thus far, microinjection has been used effectively to deliver the bacteria into the lumen of the organoid. However, this is a time-consuming technique. Therefore, other techniques have been trialled as more efficient alternatives. Treating a monolayer, for example, is much quicker to execute, however, this method is less indicative of how the 3D in vivo intestine would respond due to the lack of 3D architecture and the stem-cell niche. Without this native architecture it cannot be determined how intestinal stem cells would respond to such an infection.

10. Future challenges

Intestinal organoids remain a promising, tunable model for developmental and disease modelling, drug and toxicity testing, and host–pathogen interaction studies. In the future, in conjunction with CRISPR/Cas9 technology intestinal organoids hold great potential for gene therapy and transplantation applications in humans to treat chronic inflammatory disorders, such as CD, UC and CRCs. However, there are many aspects of this technology that still require significant investment to create a model that is more representative of in vivo tissue and their translational use in humans to become a reality.

Culturing intestinal organoids in 3D creates additional layers of complexity when attempting manipulations involving gene editing, transfection or when studies require access to the apical surface of intestinal epithelium. Previously, processing organoids has required specialized and time-consuming procedures such as the use of micromanipulator and microinjection platforms. More recently, several studies have addressed this problem and have begun developing methodologies to use 2D culture of dissociated intestinal organoids as a platform for high-throughput drug testing, migration assays and host–pathogen interaction studies. By using transwells with permeable membranes, experimentation can be performed with ease of access to both the apical and basolateral sides of the newly formed epithelial membrane [24]. However, this approach also disrupts the stem-cell compartment, meaning that using current culture conditions cells cannot be propagated long term using this 2D culture approach. It is feasible, however, to maintain organoids in 3D while performing manipulations in transient 2D cultures.

Current organoid platforms require the spontaneous self-assembly of epithelial tissue following dissociation and then embedding in Matrigel™. This approach creates organoids of differing shapes and sizes that lack the gross anatomical features of the intestine. Accuracy in developmental and disease modelling will be dramatically enhanced by the use of 3D scaffolds constructed from either decellularization and then recellularization of an ex vivo extracellular matrix or a cellularized synthetic scaffold. This approach offers a base on which to culture the cells into the tubular structure with more precise patterning of epithelium and consistent numbers of cells. This technique is potentially tunable, enabling the cell composition to be altered depending on the region of intestinal tract being studied or disease process being modelled. This model, as well as being a closer approximation of the intestine, is likely to be easier to manipulate by providing easier access to apical and basolateral sides of cells. Studies carried out into the development of this model have shown that it can accumulate a mucus layer on the luminal surface, as with organoids, with a thickness of 20 µm [48]. This can, therefore, recapitulate the host–pathogen interactions, occurring in vivo, that require an intact mucosal layer. So far, these models lack neural and immune cells to form a complete organ and require many months of set-up until the platform is suitable for experimental use. A notable disadvantage to this system is the deterioration in the model after only a few weeks following the seeding of cells to the 3D scaffold, which could be due to nutrient and oxygen starvation of cells, further reinforcing the need for models that recapitulate the complete organ including vascularization. This, therefore, must be overcome before it can be used for longer-term studies, including that of chronic inflammation.

Several studies have demonstrated the potential for direct transplantation of intestinal organoids into mice and rodents [32,49]. Fordham və b. successfully transplanted fetal intestinal progenitors, which had not yet been differentiated into intestinal organoids, into a colonic injury mouse model [32]. They found that immature enterospheres have regenerative capacity when transplanted into adult damaged colonic epithelium. Additionally, they demonstrated the ability of these immature cells to mature in vivo, appropriate for the region of engraftment, expressing Mucin-2-positive goblet cells and lacking markers of small intestine. Whether the same approach could be used to treat human intestinal injury from both acute and chronic IBD is yet to be determined. When combined with decellularization/recellularization techniques, 3D printing and development of synthetic and biodegradable scaffold technologies, stem-cell-derived intestinal tissue or patient-derived intestinal tissue could be used to replace large segments of the small and large intestine.

One of the more significant drawbacks to modelling disease using intestinal organoids is the absence of an immune element that can be used to understand mechanisms driving the autoimmune destruction of the intestinal mucosa that occurs during CD and UC in vivo. Thus far, intestinal organoids have been able to model the immune response at an innate level, determining the effects of gene expression and cytokine signalling in the development of CD and in host–pathogen interaction studies. CD is known to be triggered by a combination of genetic susceptibility and environmental factors, resulting in dysregulation of immune homeostasis. Studies have shown that human intestinal organoids generated from hIPSCs are a suitable model for studying the interactions between intestinal epithelium and the enteric pathogen Salmonella typhimurium to dissect elements of the innate immune response [31]. The model, however, needs to be further developed to include elements of systemic immune regulation including cells such as macrophages, neutrophils, T cells, B lymphocytes, NK cells and dendritic cells. Addition of these cell types will create a more complete model but will be a significant challenge requiring all cell types to be from the same donor.

Intestinal organoids, whether derived from primary tissue biopsy or stem-cell differentiation techniques, have great potential in the future of disease modelling, drug discovery and personalized medicine. They have been shown to have stable phenotype, are relatively simple to create and manipulate while at the same time able to be maintained in long-term culture. However, current organoid derivation and culture techniques do not allow for the assembly of complex multi-cell-type organoids that can model the complete complexity of a multifactoral disease such as IBD. Furthermore, as our need to modify and manipulate organoids and organoid culture conditions advances, the practice of culturing intestinal organoids may pose technical limitations on what is achievable. Developing our understanding of the initiation and development of complex intestinal disease, such as IBD and CRC, will require continued investment and research into the development of more complex intestinal organoid platforms.


Mücərrəd

Oral and intestinal mucositis is a debilitating, often dose limiting side effect of radiation treatment. A mouse model of mucositis, induced by gamma irradiation, leads to weight loss and tissue damage, similar to that observed in patients. This model reflects the human ailment as it responds to keratinocyte growth factor (KGF), the standard of care treatment.
Culturing of intestinal crypt organoids derived from primary cells allowed the development of a 3D assay to monitor the effect of treatments of intestinal epithelium to radiation-induced damage. This in vitro assay closely resembles the mouse model as KGF and Roof Plate-Specific Spondin-1 (RSPO1) enhanced the recovery of crypt organoids following radiation. Screening identified tool compounds that increased the survival of organoids post radiation. Repeated testing of these compounds revealed that the organoids changed their response over time. To investigate this adaptive behavior, intestinal organoid cultures were studied over time. Samples of organoids at various time points were used to prepare mRNA for unbiased transcriptome analyses. This expression profiling revealed a number of genes and pathways that were modulated over time, providing a rationale for the altered sensitivity of the intestinal crypt organoid cultures.
This report describes the development of an in vitro assay that reflects the response of disease to therapeutic treatment. The assay was miniaturized and used to identify bioactive tool compounds, which served as probes to interrogate the patho-physiology of organoids over prolonged culture conditions. In vitro disease models based on primary 3D cell cultures represent valuable tools to identify potential drug targets and bioactive hits.


Əlaqələr

Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard University, Cambridge, MA, USA

Benjamin E. Mead & Jeffrey M. Karp

Institute for Medical Engineering and Science (IMES), Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Department of Chemistry, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Ragon Institute of Massachusetts General Hospital, Massachusetts Institute of Technology and Harvard University, Cambridge, MA, USA

Engineering in Medicine, Department of Medicine, Center for Regenerative Therapeutics, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Harvard−Massachusetts Institute of Technology Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA


Videoya baxın: Qəbzlik. Bağırsaq xəstəlikləri. Запор - симптомы, лечение, профилактика, причины. (BiləR 2022).