Məlumat

Ev Tapşırığı Problemləri - Ədəbiyyat Öyrənmə Modulu: Transkripsiya faktoru İkaros Protein Fosfataz 2A (PP2A) nı sıxışdırır: ƏSAS - Biologiya

Ev Tapşırığı Problemləri - Ədəbiyyat Öyrənmə Modulu: Transkripsiya faktoru İkaros Protein Fosfataz 2A (PP2A) nı sıxışdırır: ƏSAS - Biologiya



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Transkripsiya faktoru Ikaros Protein Fosfataz 2A (PP2A) İfadəsini İntronik Bağlama Sahəsi vasitəsilə sıxışdırır. Bioloji Kimya Jurnalı, 289, 13751-13757 (2014).

Ümumi məlumat və baxış

Sistemik lupus eritematoz (SLE) əsasən reproduktiv yaşda olan qadınlara təsir edən multifaktorial otoimmün xəstəlikdir. İmmunitet sistemindəki pozğunluqlar, xüsusən də T hüceyrələrində, bu xəstəliyin patologiyasına səbəb olan amillərdən biridir. SLE xəstələrindən təcrid olunmuş T hüceyrələrində aberrant siqnal tirozinin fosforlaşmasının artması kimi atipik xüsusiyyətlərə gətirib çıxarır.

SLE patogenezində siqnal qüsurlarına töhfə verən əsas komponentlərdən biri serin/treonin protein fosfataz 2A (PP2A)dır. PP2A, hüceyrə bölünməsi, hərəkətlilik, sitoskeletal dinamika və s. kimi bir sıra hüceyrə proseslərində əsas rol oynayan, hər yerdə ifadə olunan, yüksək dərəcədə qorunan serin/treonin fosfatazdır. PP2A skafold alt bölməsi A və katalitik alt bölmədən ibarət üçtərəfli struktura malikdir. əsas fermenti meydana gətirir və funksional holoenzim yaratmaq üçün əsas fermentə bağlanan çoxlu tənzimləyici alt bölmələrdən birini təşkil edir. PP2A zülalı və mRNT səviyyələri, eləcə də katalitik alt bölmənin enzimatik aktivliyi sağlam insanlarla müqayisədə SLE xəstələrinin T hüceyrələrində artır.

PP2A promotorunda bir siklik AMP (cAMP) cavab elementi (CRE) SLE T hüceyrələrində hipometilləşir. Bundan əlavə, cAMP reaksiya elementini bağlayan zülalın (CREBP) transkripsiya amilinin bağlanması PP2A-nın ifadə səviyyələrinə kömək edir. cAMP, cAMP əmələ gətirərək adenilat siklazanın aktivləşməsinə səbəb olan G-proteinlə əlaqəli reseptor (GPCR) ilə bağlanan xarici siqnala cavab olaraq hüceyrədə artır. cAMP daha sonra digər zülalları, o cümlədən əsasən sitoplazmada yerləşən CREB zülalını fosforilləşdirən Protein Kinaz A-ya bağlanır və aktivləşdirir. Fosforlanmış CREB, gen transkripsiyasına səbəb olan nüvəyə köçür.

a. cAMP-də artımın CREB aktivləşdirilmiş genlərinin transkripsiyasına necə səbəb olduğunu göstərən cizgi filmi çəkin.

b. Promotorun hipometilasiyası transkripsiyanı gücləndirir. Şiş supressor genlərinin promotorlarının hipermetilizasiyasının şiş hüceyrələrinə təsiri necə olacaq? Hipometilasiya SLE kimi otoimmün xəstəliklərdə immun hüceyrələrdə iştirak edən genlərə hansı təsir göstərə bilər?

Cavab: Şiş supressor genlərində promotor bölgənin DNT hipermetilasiyası onların susmasına, nəticədə hüceyrənin nizamlanmasının pozulmasına və böyümənin artmasına səbəb olacaq. Bunun əksinə olaraq, DNT hipometilasiyası immun hüceyrələrin genlərinin aktivləşməsinə gətirib çıxara bilər ki, bu da gen transkripsiyasının tarazlığını xroniki iltihab və otoimmün xəstəliklə xarakterizə olunan fenotipə çevirə bilər.

Əlavə mexanizmlər PP2A ifadəsinə təsir göstərir. Genom geniş assosiasiya tədqiqatı (GWAS) tədqiqatı PPP2CA-nın ilk intronunda SLE ilə əlaqəli olan tək nukleotid polimorforizmini (SNP) müəyyən etdi. Bu SNP-nin risk alleli böyrək xəstəliyi, anti-cüt zəncirli DNT və anti-ribonukleoprotein antikorları, hər iki SLE markerləri ilə əlaqəli idi. Üstəlik, PP2A ifadəsi bu alleli daşıyan xəstələrdə daha yüksək idi və bu, bu SNP-nin PP2A ifadəsinin tənzimlənməsində rol oynaya biləcəyini göstərirdi. Bir intronda mutasiya gen transkripsiyasına necə təsir edə bilər?

Cavab: İntronlardakı mutasiya transkripsiya, poliadenilləşmə, mRNT ixracı, mRNT lokalizasiyası, tərcümənin effektivliyi və sürəti daxil olmaqla RNT istehsalı və emalının bütün aspektlərinə təsir göstərə bilən dilimləməni dəyişdirərək gen ifadəsinə (son nəticədə protein tərcümə məhsulunun miqdarı ilə müəyyən edilir) təsir göstərə bilər. mRNT-nin çürüməsi. Onlar xromatinin strukturuna və transkripsiya səriştəsinə təsir edən rrankripsiya amilləri (zülallar, RNT) üçün bağlayıcı sahə (promotorlar, gücləndiricilər, susdurucular) kimi xidmət edə bilər. Onlar həmçinin gen tənzimləyici məhsulları istehsal etmək üçün müxtəlif oxu çərçivələrində transkripsiya edilə bilər.


Məqalədən suallar

1. SLE xəstələrində PP2A-nın 1-ci intronunda aşkar edilmiş SNP-yə əsasən, tədqiqatçılar transkripsiya faktorunun vəhşi tipli intron 1-ə bağlanmasının PP2A transkripsiyasının tənzimlənməsində iştirak etdiyini fərz etdilər.

a. İntronda SNP-nin PP2A transkripsiyasına təsir göstərə biləcəyi iki fərqli yolu göstərin?

Cavab: Əgər SLE xəstələrində intron 1-də SNP PP2A-nın transkripsiyasının artmasına gətirib çıxarırsa, ehtimal olunan transkripsiya amilinin normal intron 1-ə bağlanması çox güman ki, PP2A geninin transkripsiyasını sıxışdıracaq (yəni funksiyanın itirilməsi). Alternativ, daha az ehtimal olunan izahat, transkripsiya faktorunun bağlanmasının yalnız SNP-nin iştirakı ilə baş verməsi ola bilər. Bu funksiya mutasiyası qazanacaq, sonra genin ifadəsini artıracaq.

Şəkil 1A PP2A-nın gen strukturunun sxematik təsvirini göstərir (orijinal kağızda səhv etiketlənmişdir). Yaşıl qutular intronları təmsil edir.

Variant yerini ehtiva edən ardıcıllıq qırmızı və ox ilə təsvir edilmişdir.

b. Müstəntiqlər potensial transkripsiya faktorunu, İkaros vasitəsilə aşkar etdilər silisiumda İntron 1-ə bağlana bilən təcrübələr. Bağlanmanı öyrənmək üçün onlar xromatin immunoprecipitation (ChIP) analizindən istifadə ediblər. Qısa müddətə nəzarət və eksperimental hüceyrələr DNT-ni bağlayan zülalları DNT-dəki hədəf yerlərinə kovalent şəkildə bağlamaq üçün formaldehidlə müalicə olundu. Hüceyrələr əvvəlcə sitoplazmik zülalları çıxarmaq üçün yumşaq bir şəkildə parçalanır. Hüceyrələri tam parçalamaq üçün 1% SDS əlavə edilir. Bunun ardınca DNT-ni kiçik parçalara ayırmaq üçün sonikasiya aparılır. Hədəf zülalına antikor kəsilmiş xromatinə əlavə edilir və hədəf zülal üçün antikorun tanınmasında iştirak etməyən Fc domeninə bağlanan zülala (A və ya G zülalına) kovalent şəkildə bağlanmış muncuq vasitəsilə immunoprecipitasiya edilir. Çarpaz keçid geri qaytarıla bilər və DNT-nin bağlanma yeri və/yaxud hədəf zülal müəyyən edilə bilər. Müvafiq qarşılıqlı əlaqələri göstərən cizgi filmi çəkin.

Cavab:

Tədqiqatçılar normal intron 1-in müvafiq bölgəsini təmsil edən biotin etiketli oliqo və təsadüfi nəzarət oliqosu yaratdılar. Jurkat hüceyrə nüvə ekstraktlarını əlavə etdilər. Kompleks biotini sıx bağlayan kovalent avidin olan muncuqlarla aşağı çəkildi (immunoprecipitated). Eluatlar bir SDS PAGE geli üzərində işlədilib, ardınca ayrılmış zülalların nitroselüloz membranına köçürüldüyü Western blot tətbiq olundu. Membranlar anti-Ikaros antikoru ilə problanmış membran idi. İmmunoblotun (IB) nəticələri Şəkil 1B-də göstərilmişdir. Nəticələri şərh edin? Müəlliflərin fərziyyəsi doğru olsaydı, SLE-də tapılan SNP-ni ehtiva edən oliqodan istifadə etsəydilər, ləkə necə görünərdi?

Cavab: Təxminən 62K olan xüsusi oliqo üçün güclü zolaq oliqoya bağlı İkaros transkripsiya faktorunu təmsil edir. Nəzarət oliqo immunoprecipitation addımı kiçik İkarosu aşağı saldı, İkarosun bu sahəyə bağlanmasının spesifik olduğunu göstərir. Bu nəticələri şərh edərkən çox diqqətli olmaq lazımdır, lakin biz immun blotların kəmiyyət olduğunu fərz edirik. Əgər onlar SNP ilə oliqodan istifadə etsələr, IKZF1-in bağlanması nəzərəçarpacaq dərəcədə azalacaq, nəticədə Qərb ləkəsində zəif bir zolaq yaranacaq.

2. Tədqiqatçılar protein ifadəsini aşkar etmək üçün istifadə oluna bilən bioluminescent protein olan protein lusiferaza üçün genin yuxarı axınında klonlanmış olaraq PP2A üçün promotoru, ardınca isə İntron 1-i əlaqələndirən lusiferaza reportyor konstruktorlarını qurdular. Bu konstruksiyadan bir karikatura çəkin.

Cavab:

Şəkil 2B-də 2 milyon 293T hüceyrəsi ya yuxarıdakı məruzəçi plazmidlə (250 ng) və ya müxtəlif miqdarda İkaros ifadə vektoru ilə (İkaros geni ilə 50, 100 və ya 200 ng vektor ehtiva edən) kombinasiyada transfeksiya edilmişdir. IKZF1) Lipofectamine 2000 istifadə edərək. Transfeksiyadan iyirmi dörd saat sonra hüceyrələr toplandı və parçalandı və Dual-Lusiferaza analiz sistemindən istifadə etməklə lusiferaza aktivliyi ölçüldü.

Şəkil 2C-də oxşar təcrübələr mutant (mut) məruzəçi konstruksiya ilə keçici ifadə analizində aparılıb, burada İkaros bağlama sahəsi silinib. Nəticələr orta � S.D. üç müşahidədən ibarətdir. Takozlar artan konsentrasiyaları göstərir. PP2A promotoru - Intron 1 əlavəsini ehtiva etməyən bir nəzarət vektoru da istifadə edilmişdir.

b. 2B-də göstərilən nəticələri izah edin.

Cavab: İkarus üçün artan miqdarda IKZF1 geninin birgə ifadəsi PP2A promouterindən ekspressiyanı dozadan asılı olaraq inhibə etdi və bu, İkarusun Intron 1-ə bağlana və PP2A transkripsiyasını maneə törədə biləcəyini göstərir.

c. 2C-də göstərilən nəticələri izah edin.

Şəkil 2C göstərir ki, vəhşi tipli reportyorla müqayisədə mutant reportyor reportyor fəaliyyətini artırıb. (yəni mutant Intron 1-ə bağlana bilmədi və müxbirin ifadəsini sıxışdıra bilmədi). Bundan əlavə, vəhşi tipli konstruksiyadan fərqli olaraq, mutant reportyor fəaliyyətinə İkaros ifadəsi təsir etməmişdir (sütun 3 və 5-i müqayisə edin) =. Bu onu göstərir ki, İkarosun PP2A-nın ilk intronundakı xüsusi sahəyə bağlanması PP2A reportyor fəaliyyətinin azalması ilə nəticələnir.

3. Tədqiqatçılar İkarosun PP2A ifadəsini tənzimləyə biləcəyini soruşdular. Bu məqsədlə biz reportyor analizlərində deyil, sağlam fərdlərdən təcrid olunmuş CD3+ T hüceyrələrində (immun hüceyrələri) İkarosu həddindən artıq ifadə etdik. Mədəniyyətdə 36 saatdan sonra hüceyrələr toplandı və immunoblotinq üçün emal edildi. Şəkil 3A (aşağıda) üçün sağlam fərdlərdən təcrid olunmuş T hüceyrələri boş vektor və ya 0,5, 1 və ya 2 μq İkaros ifadə plazmidi/1 milyon hüceyrə ilə transfeksiya edilmişdir. Hər şərt üçün beş milyon hüceyrə istifadə edilmişdir. Transfeksiyadan 36 saat sonra hüceyrələr ya real vaxt rejimində PCR (real vaxtda mRNT-ni izləyir, sol panel) və ya Western blotting (mərkəz panel) istifadə edərək protein analizi ilə davam etmək üçün yığılmışdır. Real vaxt rejimində PCR üçün, normallaşdırma üçün ev təsərrüfatı geni β-aktin istifadə edilmişdir. Western blot analizləri vəziyyətində, membran anti-Ikaros ilə yoxlandı, zülalları soyundu və anti-PP2A ilə yenidən yoxlandı. β-aktin yükləmə nəzarəti kimi istifadə edilmişdir. IKZF1 və PP2A-nın bant sıxlıqları Quantity One proqram təminatından istifadə etməklə ölçüldü və β-aktinə normallaşdırıldı. Açıq barlar, IKZF1; qara çubuqlar, PP2A. IB, immunoblot.

Nəticələri izah edin. Müəlliflər niyə aktin üçün immunoblot etdilər?

Cavab: İkarosun məcburi ifadəsi PP2A-nın zülal səviyyəsinin əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına səbəb oldu (Şəkil 3A, sağ panel). Üstəlik, bu azalma dozadan asılı idi. Hüceyrələrə köçürülmüş İkaros miqdarının artması PP2A ifadəsinin daha da azalmasına səbəb oldu. İkarosun PP2A ifadəsini transkripsiya səviyyəsində repressiya edib-etmədiyini müəyyən etmək üçün İkarosu ifadə edən hüceyrələrdə PP2A-nın mRNA səviyyələrini qiymətləndirdik. PP2A mRNA səviyyələri Ikarosun həddindən artıq ifadəsinə cavab olaraq eyni şəkildə azaldıldı (Şəkil 3A, sol panel). Aktin nəzarət funksiyasını yerinə yetirir, çünki bu ev saxlama geninin konsentrasiyada dəyişməsi gözlənilmir.

Şəkil 3B-də, T hüceyrələri AMAXA istifadə edərək ya qarışdırılmış siRNA, ya da IKZF spesifik siRNA (5 və ya 10 nm son konsentrasiya) ilə transfeksiya edilmişdir. Transfeksiyadan 72 saat sonra hüceyrələr yığıldı və ya real vaxt rejimində PCR analizinə, ya da Western blotting istifadə edərək protein analizinə məruz qaldı. Western blot analizləri vəziyyətində, membran anti-Ikaros ilə yoxlandı, zülalları soyundu və anti-PP2A ilə yenidən yoxlandı. Nəticələri izah edin.

Cavab: İkarosun PP2A ifadəsini transkripsiya səviyyəsində repressiya edib-etmədiyini müəyyən etmək üçün biz İkarosu ifadə edən hüceyrələrdə PP2A-nın mRNT səviyyələrini qiymətləndirdik. PP2A mRNA səviyyələri eyni şəkildə İkarosun zülal kimi həddindən artıq ifadəsinə cavab olaraq azaldı (3A-da). Daha sonra İkaros susdurmasının PP2A ifadəsinə təsirini araşdırdıq. İkarosun siRNA-ya imkan verən susdurulması PP2A mesajının və zülalın səviyyəsinin artmasına səbəb oldu (Şəkil 3B, müvafiq olaraq sol və sağ panellər). Beləliklə, Ikaros PP2A ifadəsi üçün repressor rolunu oynayır.

4. Müəlliflər İkarosun mobil mühitdə bu xüsusi sayta işə götürülməsini təsdiqləmək üçün ChIP analizlərindən istifadə ediblər. Onlar boş vektor (pCMV) və ya İkaros ifadə vektoru ilə kombinasiyada PP2A promotor-intron reportyor konstruksiyası (yuxarıda təsvir edilmişdir) ilə transfeksiya edilmiş 293T hüceyrəsindən istifadə etmişlər. İmmunopresipitatlar bir Ikaros antikoru və ya nəzarət IgG istifadə edərək hazırlanmışdır. İmmunoprecipitated DNT təmizləndi və spesifik intronik DNT-nin mövcudluğu real vaxt PCR analizindən istifadə edilərək ölçüldü.

a. Bu təcrübələrdə istifadə edilən mutant (Mut) reportyorlarının sxemi aşağıda göstərilmişdir.

b. Aşağıdakı Şəkil 4B-də 293T hüceyrələrində müxbir ChIP. 293T hüceyrələri ya yalnız yabanı tip (sol panel) və ya mutant reportyor (sağ panel) və ya müxbir Lipofectamine 2000 istifadə edərək İkaros ifadə plazmidi ilə birlikdə. Transfeksiyadan iyirmi dörd saat sonra hüceyrələr toplandı və ChIP analizi aparıldı. Xüsusi intron sahəsini əhatə edən bölgə kəmiyyət PCR ilə gücləndirildi və giriş DNT-dən alınan dəyərlərə normallaşdırıldı. The qrafik göstərir � S.D. cntrl, nəzarət; ab, antikor; Rb, dovşan. .

Nəticəni şərh edin və izah edin.

Cavab: Cavab: Biz pCMV ilə transfeksiya edilmiş nümunələrdə İkarosun PP2A introna cəlb edilməsinin pCMV ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələrlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə artdığını müşahidə etdik ki, bu da İkarosun PP2A-nın birinci intronunda bu sahəyə cəlb edilməsini təklif edir (Şəkil 4B, solda). panel). Biz həmçinin bu saytın spesifikliyini yoxlamaq üçün üç mutant (Şəkil 4A-da təsvir) yaratmaq üçün vəhşi tipli müxbiri mutasiya etdik. Bu mutantlardan ikisi silinmə mutantları idi, burada ya yalnız əsas İkaros bağlanma yeri (Del-2) və ya əsas sahəyə əlavə olaraq bir neçə baza silindi (Del-1), üçüncü mutant isə bəzi əsasları dəyişərək tərk etdi. Ikaros bağlama yeri qismən bütövdür. Hər iki silinən mutantın İkarosu işə götürə bilmədiyini müşahidə etdik, bu saytın olmaması İkarosun bağlanmasına mane olduğunu göstərir (Şəkil 4B, sağ panel). Bəzi bazaların dəyişdirildiyi mutantla, İkaros bağlama yerini qismən bütöv qoyaraq, biz vəhşi tipli reportyorla müqayisədə işə qəbulda azalma görə bildik, lakin tam ləğv edilmədi. Bu onu göstərir ki, İkarosun PP2A introna cəlb edilməsi üçün bütöv bir İkaros bağlama yeri lazımdır.

4C. Daha fizioloji cəhətdən daha uyğun bir test üçün müəlliflər endogeni tədqiq etdilər PPP2CA birincil T hüceyrələrində ChIP analizləri ilə T hüceyrələrində genin öyrənilməsi və İkarosa xüsusi antikordan istifadə edərək endogen İkaros zülalının immunopresipitasiyasi aparılmışdır. Hər bir antikor/nümunə üçün 5 milyon təzə təcrid olunmuş əsas T hüceyrəsi istifadə edilmişdir. Transfeksiya baş vermədi və xromatinin immunopresipitiasiyası üçün endogen zülallardan istifadə edildi. Qrafik orta � S.D-ni göstərir. Nəticəni şərh edin və izah edin.

Cavab: Müəlliflər nəzarət IgG ilə müqayisədə İkaros-spesifik anticisim halında bu sahəyə genişlənmiş işə qəbulu müşahidə etmişlər və beləliklə, İkarosun endogen PPP2CA geninin introna cəlb olunduğunu təsdiq etmişlər.

5. İkaros sink barmağının transkripsiya faktorudur və karboksil terminalında dimerləşmə domenini də özündə saxlayır, onun vasitəsilə Sin3A, Sin3B və histon deasetilaz 1 və ya HDAC1 kimi xromatini dəyişdirən komplekslər də daxil olmaqla, çoxlu müxtəlif zülalları və transkripsiya tənzimləyicilərini işə götürə bilir.

- HDAC yuxarıda təxmin edildiyi kimi İkarosla bağlanarsa, histonların deasetilizasiyasının PP2A transkripsiyasına ehtimal olunan təsiri nə ola bilər?

Cavab: Əgər bağlanarsa, Onun lizin yan zəncirlərinin deaseilasiyası Lys-in epsilon amin yan zəncirində mümkün müsbət yükün yaranmasına, onun mənfi yüklü DNT ilə qarşılıqlı təsirinin artmasına və promotorun ətrafında nukleosomların reformasiyasına, transkripsiyanı maneə törədər.

a. HEK 293T hüceyrələrində keçici transfeksiyalar, sonra immunopresipitasiya analizləri aparıldı. Biotinləşdirilmiş oliqolardan istifadə edərək, HDAC1-nin PP2A-nın ilk intronundakı xüsusi sahəyə bağlandığını da göstəririk (Şəkil 5B). Həm reportyor ChIP-də, həm də birincil T hüceyrələrində endogen ChIP-də biz nəzarət IgG ilə müqayisədə HDAC1-in intronik sahəyə daha çox cəlb olunduğunu görə bildik (şəkil 5C, müvafiq olaraq sol və sağ panellər), beləliklə HDAC1-in bu sahəyə bağlandığını təsdiqlədik. PP2A intron 1-də.

Şəkil 5A, İkarosun HDAC1 ilə bağlanmasını göstərən koimmunoprecipitation (IP) analizinin nəticələrini göstərir. 293T hüceyrələri Lipofectamine 2000 istifadə edərək müxtəlif plazmid kombinasiyaları ilə transfeksiya edildi. Transfeksiyadan iyirmi dörd saat sonra hüceyrələr parçalandı və supernatantlar 4 ½C-də 2 saat ərzində İkaros antikoru ilə inkubasiya edildi. Antikor ilə preinkubasiyadan sonra, agaroz A/G muncuqları hər bir nümunəyə əlavə edildi və gecə ərzində 4 ½C-də inkubasiya edildi. İmmunopresipitatlar sonradan bir gel üzərində işlədildi, PVDF membranına köçürüldü və göstərilən zülallar üçün ləkələndi. Bütün nümunələrdə zülalların bərabər ifadəsini təsdiqləmək üçün saxlanan girişlər də gel üzərində işlədilib. IB, immunoblot.

Nəticələri şərh edin:

Cavab: Şəkil 5A-da göstərildiyi kimi, HDAC1 İkaros ilə koimmunoprecipitasiya edilə bilər ki, bu da Ikaros və HDAC1-in həqiqətən fiziki olaraq qarşılıqlı əlaqədə olduğunu göstərir.

b. Şəkil 5B, Jurkat hüceyrə nüvə ekstraktları ilə biotin-konjugasiya edilmiş, intron-spesifik oliqonun (sp. oliqo) və ya təsadüfi idarəolunan oliqonun açılma analizlərinin nəticələrini göstərir. Eluatlar bir gel üzərində işlədilmiş və anti-HDAC1 antikoru ilə sınaqdan keçirilmişdir.

Nəticələri izah edin.

Cavab: Biotinləşdirilmiş oliqolardan istifadə etməklə biz HDAC1-nin PP2A-nın ilk intronundakı xüsusi sahəyə bağlandığını da göstəririk (Şəkil 5B)

c. Şəkil 5C-də müvafiq olaraq 293T və əsas T hüceyrələrində müxbir ChIP (sol panel) və ChIP (sağ panel) nəticələri göstərilir. 293T hüceyrələri (sol panel) Lipofectamine 2000 istifadə edərək İkaros və HDAC1 ifadə plazmidləri ilə birlikdə reportyorla transfeksiya edildi. Transfeksiyadan iyirmi dörd saat sonra hüceyrələr toplandı və MAGnify ChIP dəstindən istifadə edərək ChIP analizi aparıldı. Birincil T hüceyrələrində (sağ panel) endogen zülalı olan ChIP üçün hər bir antikor (ab)/nümunə üçün 5 milyon təzə təcrid olunmuş əsas T hüceyrəsi istifadə edilmişdir. cntrl, nəzarət; Rb, dovşan; Xanım, siçan. Nəticəni izah edin.

Cavab: Həm reportyor ChIP-də, həm də birincil T hüceyrələrində endogen ChIP-də nəzarət IgG ilə müqayisədə HDAC1-in intronik sahəyə artan cəlb edilməsini görə bildik (şəkil 5C, müvafiq olaraq sol və sağ panellər),

d. Şəkil 5D-də T hüceyrələri nəzarət siRNA və ya 10 nm HDAC1 spesifik siRNA ilə İkaros plazmidinin kotransfeksiyası ilə və ya olmadan transfeksiya edilmişdir. Transfeksiyadan 72 saat sonra hüceyrələr yığıldı və real vaxt rejimində PCR analizinə məruz qaldı. Normallaşma üçün ev təsərrüfatı geni β-aktin istifadə edilmişdir. Nəticələri izah edin.

Cavab: HDAC1-in Ikaros ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu və bu sayta cəlb olunduğunu müəyyən edərək sübut etmək istədik ki, gördüyümüz PP2A ifadəsinin repressiyası HDAC1 ilə bağlıdır. Bunun üçün iki fərqli yanaşmadan istifadə etdik. siRNA-dan istifadə edərək, İkarosu həddindən artıq ifadə edən hüceyrələrdə HDAC1-i susdurduq və PP2Ac-in mRNA səviyyələrini qiymətləndirdik. Gözlənildiyi kimi, İkarosun həddindən artıq ifadəsi PP2A mRNA səviyyələrinin azalmasına səbəb oldu. Bununla belə, bu hüceyrələrdə HDAC1-in siRNA vasitəçiliyi ilə susdurulması PP2A səviyyələrini orijinalın təxminən 50%-nə qədər bərpa etdi və bu, HDAC1 olmadıqda Ikaros vasitəçiliyi ilə PP2A repressiyasının o qədər də səlahiyyətli olmadığını göstərir (Şəkil 5D).

Şəkil 5E. E, əsas T hüceyrələri AMAXA istifadə edərək Ikaros plazmidi ilə transfeksiya edilmişdir. Transfeksiyadan iyirmi dörd saat sonra hüceyrələr 12 saat ərzində 100 ng/ml trichostatin A (TSA) ilə müalicə olundu. Avtomobil nəzarətində olduğu kimi eyni həcmdə dimetil sulfoksid istifadə edilmişdir. Hüceyrələr yığıldı və real vaxt rejimində PCR aparıldı. Nəticəni izah edin.

Cavab: İkincisi, biz bunu təsdiqləmək üçün HDAC1 inhibitoru, trichostatin A istifadə etdik. T hüceyrələri İkaros ilə transfeksiya edildi, ardınca trichostatin A ilə 12 saatlıq müalicə aparıldı. Hüceyrələrin trichostatin A ilə müalicəsi PP2A ifadəsinin tam bərpasına səbəb oldu (Şəkil 5E). Beləliklə, İkarosun həddindən artıq ifadəsində görülən PP2A ifadəsinin repressiyası ən azı qismən eyni sayta HDAC1-in cəlb edilməsi ilə bağlıdır. Bu sayta HDAC1 işə götürülməsi transkripsiya faktorlarının promotora əlçatanlığına təsir göstərə bilər və beləliklə, PP2A-nın gen ifadəsinə təsir edə bilər.

6. Bu sənədin əsas nəticələrini ümumiləşdirən paraqraf yazın:

Ikaros PP2A ifadəsinin modulatorudur. O, PPP2CA-nın ilk intronundakı bir yerə bağlanır və PP2A-nın ifadə səviyyələrini azaldır. İkarosun repressiv qabiliyyəti, ən azı qismən, histon deasetilaz HDAC1-in işə götürülməsindən asılıdır və beləliklə, xromatinə əlçatanlığa təsir göstərir. Klassik transkripsiya faktoru üçün bu yeni mexanizm sistemik lupus eritematozda PP2A aktivliyinin pozulmasını izah etməyə kömək edə bilər.


Videoya baxın: 6-cı Sinif DİM Riyaziyyat Test Kitabının Cavabları (Avqust 2022).