Məlumat

Y = Fx Dimer əmələ gəlməsinə qarşı Mo (qrafik 2) - Biologiya

Y = Fx Dimer əmələ gəlməsinə qarşı Mo (qrafik 2) - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Y = Fx Dimerin formalaşması və Mo (qrafik 2)

Qarşılıqlı təsir enerjisi

A və B molekulları arasında qarşılıqlı təsir enerjisi (ΔE AB ) dimerin enerjisi (E A,B ) ilə monomer enerjilərinin cəmi (E A + E B ) arasındakı fərq kimi müəyyən edilir.

ABC trimerinin qarşılıqlı təsir enerjisi, ΔE ABC, iki şəkildə ifadə edilə bilər [42b]: kompleksin və monomerlərin elektron enerjisinin fərqi kimi

və ya üç cüt əlavə qatqıların və üç gövdəli ΔE 3 termininin cəmi kimi

Üç bədən termini aşağıdakı kimi ifadə edilə bilər:

Metodologiya müvafiq olaraq tetramerlər və daha böyük komplekslər üçün genişləndirilir. Genişlənmiş sistemlərin təhlili seçilmiş molekullar qrupunu bir alt sistem kimi nəzərdən keçirməklə sadələşdirilə bilər. Məsələn, hidratlanmış kationlar və əsas cütləri və trimerlər arasında komplekslərdə qarşılıqlı təsirlərin qeyri-additivliyini qiymətləndirərkən hidratlanmış kation (kation plus su molekulları) bir alt sistem kimi nəzərdən keçirilə bilər [13c].

Bir dimerin dayanıqlığına kompleksin əmələ gəlməsi zamanı monomerlərin deformasiyası daha da təsirlənir. Bu, optimallaşdırılmış təcrid olunmuş monomerlərin (E Ai, E Ai) enerjisini dimer həndəsəsindəki (E A, E B) monomerlərin enerjilərindən çıxmaqla qiymətləndirilə bilər. Müvafiq deformasiya (relaksasiya) enerjisi ΔE DEF müsbətdir (itici).

Ümumi kompleksləşmə enerjisi ΔE T beləliklə müəyyən edilir

və (5) və (6) tənlikləri sadə şəkildə trimerlərə və daha böyük klasterlərə də şamil edilə bilər.

Əgər hesablamalar elektron korrelyasiya effektləri daxil edilməklə aparılırsa, onda qarşılıqlı təsir enerjiləri ΔE və onların komponentləri HF və elektron korrelyasiya komponentlərindən ibarətdir.

Əvvəlki terminə əsasən elektrostatik, induksiya, yük ötürülməsi və elektron mübadilə töhfələri daxildir. Dispersiya enerjisi digər töhfələrə də təsir edən elektron korrelyasiyasından qaynaqlanır.


Y = Fx Dimer əmələ gəlməsinə qarşı Mo (qrafik 2) - Biologiya

Qan laxtalanma (trombotik) epizodlarını istisna etmək və trombozla əlaqəli şərtləri diaqnoz etməyə kömək etmək

Dərin venaların trombozu (DVT), ağciyər emboliyası (PE) və ya yayılmış damardaxili laxtalanma (DIC) kimi qan laxtalanması və ya uyğun olmayan qan laxtalanmasına səbəb olan vəziyyətin simptomları olduqda və DIC və həddindən artıq laxtalanma şəraitinin müalicəsini izləmək üçün

Qolunuzdakı bir damardan alınan qan nümunəsi

Test nəticələrinizi laboratoriyanızın veb saytında və ya xəstə portalında tapa bilərsiniz. Bununla belə, siz hazırda Lab Tests Online-dasınız. Sizi yerinə yetirdiyiniz test(lər) haqqında əsas məlumatı təmin etmək üçün laboratoriyanızın vebsaytı tərəfindən bura yönəlmiş ola bilərsiniz. Test nəticələrinizi əldə etmək üçün laboratoriyanızın veb saytına və ya portalına qayıtmalı və ya həkiminizlə əlaqə saxlamalısınız.

Laboratoriya Testləri Onlayn laboratoriya testləri haqqında məlumat təqdim edən, mükafat qazanan xəstə təhsili veb saytıdır. Laboratoriya alimləri və digər tibb mütəxəssisləri tərəfindən nəzərdən keçirilmiş saytın məzmunu saytda qeyd olunan hər bir test üçün nəticələrin nə demək ola biləcəyinə dair ümumi izahatlar təqdim edir, məsələn, yüksək və ya aşağı qiymətin sizin həkiminizə nə təklif edə biləcəyi kimi. sağlamlıq və ya tibbi vəziyyət.

Testləriniz üçün istinad diapazonları laboratoriya hesabatınızda tapıla bilər. Onlar adətən nəticələrinizin sağında tapılır.

Laboratoriya hesabatınız yoxdursa, istinad diapazonunu əldə etmək üçün tibb işçinizlə və ya test(lər)i həyata keçirən laboratoriya ilə məsləhətləşin.

Laboratoriya testlərinin nəticələri özlüyündə məna kəsb etmir. Onların mənası istinad diapazonları ilə müqayisədən irəli gəlir. İstinad diapazonları sağlam insan üçün gözlənilən dəyərlərdir. Onlar bəzən "normal" dəyərlər adlanır. Test nəticələrinizi istinad dəyərləri ilə müqayisə edərək, siz və tibb işçiniz test nəticələrinizdən hər hansı birinin gözlənilən dəyərlər çərçivəsindən kənarda olub-olmadığını görə bilərsiniz. Gözlənilən diapazondan kənarda olan dəyərlər mümkün şərtləri və ya xəstəlikləri müəyyən etməyə kömək etmək üçün ipucu verə bilər.

Son bir neçə onillikdə laboratoriya sınaqlarının dəqiqliyi əhəmiyyətli dərəcədə inkişaf etsə də, sınaq avadanlığı, kimyəvi reagentlər və texnikalardakı fərqlərə görə bəzi laboratoriyadan laboratoriyaya dəyişkənlik yarana bilər. Bu saytda bu qədər az istinad diapazonunun təqdim edilməsinin səbəbi budur. Nəticələrinizin "normal hədlər daxilində" olub-olmadığını qiymətləndirmək üçün testinizi aparan laboratoriya tərəfindən verilən diapazondan istifadə etməli olduğunuzu bilmək vacibdir.

Ətraflı məlumat üçün lütfən, İstinad diapazonları və onların nə demək olduğunu məqaləsini oxuyun.

D-dimer, qan laxtasının bədəndə həll edildiyi zaman əmələ gələn protein parçalarından biridir. Bədəndə qan pıhtılarının əmələ gəlməsi və parçalanması istisna olmaqla, normal olaraq aşkar edilmir və ya çox aşağı səviyyədə aşkar edilə bilər. Sonra qanda onun səviyyəsi əhəmiyyətli dərəcədə yüksələ bilər. Bu test qanda D-dimeri aşkar edir.

Bir qan damarı və ya toxuması zədələndikdə və qanaxmağa başladıqda, qanaxmanı məhdudlaşdırmaq və nəticədə dayandırmaq üçün qan laxtası yaratmaq üçün bədən tərəfindən hemostaz adlanan bir proses başlayır. Bu proses fibrin adlı bir zülalın iplərini əmələ gətirir və bu iplər bir-birinə çarpaz bağlanaraq fibrin şəbəkəsi əmələ gətirir. Bu şəbəkə trombositlərlə birlikdə yaralanma yerində əmələ gələn qan laxtasını sağalana qədər yerində saxlamağa kömək edir.

Ərazinin sağalması üçün vaxt tapdıqdan və laxtalanmaya ehtiyac qalmayandan sonra orqanizm plazmin adlı fermentdən istifadə edərək laxtanı (trombusu) kiçik parçalara ayırır ki, onu çıxarmaq mümkün olsun. Laxtada parçalanan fibrinin fraqmentləri müxtəlif ölçülü çarpaz bağlı fibrin parçalarından ibarət olan fibrin deqradasiya məhsulları (FDP) adlanır. İstehsal edilən son fibrin parçalanması məhsullarından biri mövcud olduqda qan nümunəsində ölçülə bilən D-dimerdir. Bədəndə fibrin laxtalarının əhəmiyyətli dərəcədə formalaşması və parçalanması zamanı qanda D-dimerin səviyyəsi əhəmiyyətli dərəcədə yüksələ bilər.

Qanın laxtalanması (tromboz) və/və ya trombotik emboliya üçün aşağı və ya orta risk altında olan bir şəxs üçün D-dimer testinin gücü ondan ibarətdir ki, laxtalanma ehtimalını müəyyən etmək üçün xəstəxananın təcili yardım otağında istifadə edilə bilər. . Mənfi D-dimer testi (D-dimer səviyyəsi əvvəlcədən müəyyən edilmiş kəsilmə həddinin altındadır) trombun olması ehtimalının çox az olduğunu göstərir. Lakin müsbət D-dimer testi laxtanın olub-olmadığını təxmin edə bilməz. Bu, əlavə diaqnostik prosedurların (məsələn, ultrasəs, CT angioqrafiyası) tələb olunduğunu göstərir.

Uyğun olmayan qan laxtasının əmələ gəlməsi ilə əlaqəli bir neçə amil və şərtlər var. Ən çox görülənlərdən biri dərin damar trombozu (DVT), bədənin dərin damarlarında, ən çox da ayaqların alt hissəsində laxtalanma əmələ gəlməsidir. Bu laxtalar çox böyüyə və ayaqlarda qan axını maneə törədə, şişlik, ağrı və toxuma zədələnməsinə səbəb ola bilər. Laxtanın bir parçasının qoparaq bədənin digər hissələrinə keçməsi mümkündür. Bu "emboliya" ağciyərlərdə yerləşə bilər və pulmoner emboliya və ya emboliyaya (PE) səbəb ola bilər. DVT-dən ağciyər emboliyası hər il ABŞ-da 300.000-dən çox insana təsir edir.

Laxtalar ən çox ayaqların damarlarında əmələ gəlsə də, digər nahiyələrdə də əmələ gələ bilər. D-dimerin ölçülməsi bu yerlərin hər hansı birində laxtalanma aşkarlanmasına kömək etmək üçün istifadə edilə bilər. Məsələn, koronar arteriyalarda laxtalanmalar miokard infarktı (infarkt) səbəbidir. Ürəyin və ya klapanlarının selikli qişasında, xüsusən də ürək nizamsız döyündükdə (atriyal fibrilasiya) və ya klapanlar zədələndikdə laxtalar əmələ gələ bilər. Aterosklerozun daralması və zədələnməsi nəticəsində iri damarlarda da laxtalanma əmələ gələ bilər. Bu cür laxtaların parçaları qoparaq başqa bir orqanda, məsələn, beyində (insult yaradaraq) və ya böyrəklərdə arteriyanı bağlayan emboliyaya səbəb ola bilər.

Yayılmış damardaxili laxtalanmanın (DIC) diaqnozuna kömək etmək üçün digər testlərlə birlikdə D-dimerin ölçülməsi də sifariş edilə bilər. DIC, laxtalanma faktorlarının aktivləşdiyi və sonra bütün bədəndə istifadə edildiyi bir vəziyyətdir. Bu, çoxsaylı kiçik qan laxtaları yaradır və eyni zamanda, təsirlənmiş insanı həddindən artıq qanaxmaya qarşı həssas edir. Bu, bəzi cərrahi əməliyyatlar, sepsis, zəhərli ilan sancmaları, qaraciyər xəstəlikləri və doğuşdan sonra müxtəlif vəziyyətlərdən yarana bilən mürəkkəb, bəzən həyati təhlükəsi olan bir vəziyyətdir. Əsas vəziyyət aradan qaldırılarkən təsirlənmiş şəxsə dəstək olmaq üçün addımlar atılır. D-dimer səviyyəsi adətən DIC-də çox yüksək olacaqdır.


Martinize2 (əlyazması hazırlanır) və bu işdə istifadə edilən Martinate kodları https://github.com/marrink-lab/ ünvanında açıqdır. Daha ətraflı məlumat üçün Əlavə Kodlara baxın.

Bottaro, S. & amp Lindorff-Larsen, K. Biofiziki təcrübələr və biomolekulyar simulyasiyalar: mükəmməl uyğunluq? Elm 361, 355–360 (2018).

Ingolfsson, H. I. et al. Biomolekulyar simulyasiyalarda qaba dənənin gücü. Wiley Discip. Rev. Comput. Mol. Sci. 4, 225–248 (2014).

Marrink, S. J., De Vries, A. H. və Mark, A. E. Yarımmiqdarlı lipid simulyasiyaları üçün qaba dənəli model. J. Fizika. Kimya. B 108, 750–760 (2004).

Marrink, S. J., Risselada, H. J., Yefimov, S., Tieleman, D. P. & de Vries, A. H. MARTINI qüvvə sahəsi: biomolekulyar simulyasiyalar üçün qaba dənəli model. J. Fizika. Kimya. B 111, 7812–7824 (2007).

Uusitalo, J. J., Ingólfsson, H. I., Axshi, P., Tieleman, D. P. & amp Marrink, S. J. Martini qaba dənəli güc sahəsi: DNT-yə genişlənmə. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 11, 3932–3945 (2015).

Abellón-Ruiz, J. et al. Bakterial xarici membranın lipid asimmetriyasının saxlanması üçün struktur əsaslar. Nat. Mikrobiol. 2, 1616–1623 (2017).

Yen, H. Y. və b. PtdIns(4,5)P2 GPCR-lərin aktiv vəziyyətlərini stabilləşdirir və G-protein birləşməsinin seçiciliyini artırır. Təbiət 559, 423–427 (2018).

Van Eerden, F. J., Melo, M. N., Frederix, P. W. J. M., Periole, X. & amp Marrink, S. J. Fotosistem II kompleksində plastoquinone və plastoquinolun mübadilə yolları. Nat. Kommun. 8, 15214 (2017).

Vögele, M., Köfinger, J. & Hummer, G. Lipid membran simulyasiyalarında diffuziyanın hidrodinamiği. Fizik. Rev. Lett. 120, 268104 (2018).

Agostino, M. D., Risselada, H. J., Lürick, A., Ungermann, C. & amp Mayer, A. Bağlama kompleksi SNARE-dən asılı membran birləşməsinin terminal mərhələsini idarə edir. Təbiət 551, 634–638 (2017).

Jeena, M. T. və başqaları. Mitokondriyanın lokalizasiyası hüceyrə disfunksiyası üçün peptid amfifillərinin öz-özünə yığılmasına səbəb oldu. Nat. Kommun. 8, 26 (2017).

Jiang, Z. et al. Subnanometre liqand-qabıq asimmetriyası Janus kimi nanohissəcik membranlarına gətirib çıxarır. Nat. Mater. 14, 912–917 (2015).

Maingi, V. et al. Membran əhatə edən DNT nanoməsamələrinin sabitliyi və dinamikası. Nat. Kommun. 8, 14784 (2017).

Frederix, P. W. J. M. et al. Yeni hidrogellərin layihələndirilməsi və kəşf edilməsi üçün (tri-)peptidlərin öz-özünə yığılması üçün ardıcıllıq sahəsinin araşdırılması. Nat. Kimya. 7, 30–37 (2015).

Bochicchio, D., Salvalaglio, M. & Pavan, G. M. Submolekulyar həlldə supramolekulyar polimerin dinamikasına. Nat. Kommun. 8, 147 (2017).

Stark, A. C., Andrews, C. T. & amp Elcock, A. H. Sulu məhlullarda zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsi üçün optimallaşdırılmış potensial funksiyalara doğru: MARTINI qaba dənəli güc sahəsindən istifadə edərək osmotik ikinci virial əmsal hesablamaları. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 9, 4176–4185 (2013).

Javanainen, M., Martinez-Seara, H. & amp Vattulainen, I. Martini modelində membran zülallarının həddindən artıq yığılması. PLoS BİR 12, e0187936 (2017).

Schmalhorst, P. S., Deluweit, F., Scherrers, R., Heisenberg, C.-P. & Sikora, M. Polisaxaridlərin simulyasiyalarında MARTINI qüvvə sahəsinin məhdudiyyətlərinin aradan qaldırılması. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 13, 5039–5053 (2017).

Alessandri, R. et al. Martini modelinin tələləri. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 15, 5448–5460 (2019).

Uusitalo, J. J., Ingólfsson, H. I., Marrink, S. J. & amp Faustino, I. Martini qaba dənəli güc sahəsi: RNT-yə genişlənmə. Biofiz. J. 113, 246–256 (2017).

Ben-Naim, A. Məhlulların molekulyar nəzəriyyəsi (Oxford Univ. Press, 2006).

Ploetz, E. A., Bentenitis, N. & Smith, P. E. Kirkwood-İdeal həllər üçün Buff inteqralları. J. Chem. Fizik. 132, 164501 (2010).

Zych, A. J. & Iverson, B. L. Bağlanmış, özünü mürəkkəbləşdirən 1,5-dialkoksinaftalin/1,4,5,8-naftalentetrakarboksilik diimid sistemlərinin sintezi və konformasiya xarakteristikası. J. Am. Kimya. Soc. 122, 8898–8909 (2000).

Gabriel, G. J. & Iverson, B. L. Sulu məhlulda hetero duplekslər əmələ gətirən aromatik oliqomerlər. J. Am. Kimya. Soc. 124, 15174–15175 (2002).

Liu, W. et al. GPCR-lərin natrium ionları ilə allosterik tənzimlənməsinin struktur əsasları. Elm 337, 232–236 (2012).

Gao, Z. G. & amp Ijzerman, A. P. Amilorid analoqları və natrium ionları ilə A (2A) adenozin reseptorlarının allosterik modulyasiyası. Biokimya. Farmakol. 60, 669–676 (2000).

Okur, H. İ. və b. Hofmeister seriyasından kənarda: zülallara və onların bioloji funksiyalarına ion spesifik təsirləri. J. Fizika. Kimya. B 121, 1997–2014 (2017).

Dupont, D., Depuydt, D. & Binnemans, K. Duzların ikifazalı ionlu maye/su həlledicisi ekstraksiya sistemlərinə təsirinin icmalı: anion mübadiləsi, qarşılıqlı həllolma və termomorfik xüsusiyyətlər. J. Fizika. Kimya. B 119, 6747–6757 (2015).

Naert, P., Rabaey, K. & Stevens, C. V. İon maye ion mübadiləsi: güclü qarşılıqlı təsirlərdən kənarda qalma kationları ən zəif qarşılıqlı anionlara məhkum edir və reaksiya tarazlığını diktə edir. Yaşıl Kimya. 20, 4277–4286 (2018).

Xan, H. M. və başqaları. MARTINI qüvvə sahəsində kolin-aromatik kation-π qarşılıqlı təsirlərinin tutulması. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 16, 2550–2560 (2020).

Tanaka, K., Caaveiro, J. M. M., Morante, K., González-Manãs, J. M. & Tsumoto, K. Zülal və lipidlə örtülmüş sitolitik məsamələrin öz-özünə yığılması üçün struktur əsas. Nat. Kommun. 6, 6337 (2015).

Huang, G., Willems, K., Soskine, M., Wloka, C. & Maglia, G. FraC nanopores ilə peptid və protein biomarkerlərinin elektro-osmotik tutulması və ion ayrı-seçkiliyi. Nat. Kommun. 8, 935 (2017).

Alessandri, R., Uusitalo, J. J., De Vries, A. H., Havenith, R. W. A. ​​& amp Marrink, S. J. Kobud dənəli həlledici buxarlanma simulyasiyalarından atomistik həlli ilə toplu heterounction morfologiyaları. J. Am. Kimya. Soc. 139, 3697–3705 (2017).

Chiu, M. Y., Jeng, U. S., Su, C. H., Liang, K. S. & Wei, K. H. Polimer heterojunction günəş hüceyrələrində nanometr ölçülü faza ayrılmasını təhlil etmək üçün kiçik və geniş bucaqlı rentgen üsullarının eyni vaxtda istifadəsi. Adv. Mater. 20, 2573–2578 (2008).

Petrov, D. & amp Zagrovic, B. Mövcud atom qüvvəsi sahələri izdihamlı mühitlərdə zülalları öyrənmək üçün kifayət qədər dəqiqdirmi? PLoS Comput. Biol. 10, e1003638 (2014).

Højgaard, C. et al. Yüklü amin turşusu qalıqları olmayan həll olunan qatlanmış zülal. Biokimya 55, 3949–3956 (2016).

Ruckenstein, E. & Shulgin, I. L. Duzların və üzvi əlavələrin sulu məhlullarda zülalların həllinə təsiri. Adv. Kolloid İnterfeys Elmi. 123–126, 97–103 (2006).

Zhou, F. X., Cocco, M. J., Russ, W. P., Brunger, A. T. & Engelman, D. M. Sarmallararası hidrogen bağı membran zülallarında güclü qarşılıqlı təsirlərə səbəb olur. Nat. Struktur. Biol. 7, 154–160 (2000).

Zhou, F. X., Merianos, H. J., Brunger, A. T. & Engelman, D. M. Qütb qalıqları polileucin transmembran sarmallarının birləşməsinə səbəb olur. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 98, 2250–2255 (2001).

Grau, B. et al. Hüceyrələrdə transmembran sarmal qablaşdırmada hidrofobik uyğunluğun rolu. Hüceyrə Stressi 1, 90–106 (2017).

Chen, L., Merzlyakov, M., Cohen, T., Shai, Y. & Hristova, K. Lipid billayerlərində ErbB1 transmembran domeninin dimerizasiyasının enerjisi. Biofiz. J. 96, 4622–4630 (2009).

Artemenko, E. O., Egorova, N. S., Arseniev, A. S. & Feofanov, A. V. EphA1 reseptorunun transmembran sahəsi membrana bənzər mühitdə dimerlər əmələ gətirir. Biokim. Biofiz. Akta 1778, 2361–2367 (2008).

Sarabipour, S. & Hristova, K. Glycophorin CHO, HEK 293T və A431 hüceyrələrindən əldə edilən plazma membran veziküllərində transmembran domeninin dimerləşməsi. Biokim. Biofiz. Acta - Biomembr. 1828, 1829–1833 (2013).

Chen, L., Novicky, L., Merzlyakov, M., Hristov, T. & Hristova, K. Məməlilərin membranlarında membran zülalının dimerizasiyasının enerjisinin ölçülməsi. J. Am. Kimya. Soc. 132, 3628–3635 (2010).

Nash, A., Notman, R. & Dixon, A. M. De novo transmembran sarmal-spiral qarşılıqlı təsirlərinin dizaynı və bioloji membranda sabitliyin ölçülməsi. Biokim. Biofiz. Acta - Biomembr. 1848, 1248–1257 (2015).

Finger, C. et al. Bioloji membranda ölçülən transmembran sarmal qarşılıqlı təsirlərinin sabitliyi. J. Mol. Biol. 358, 1221–1228 (2006).

Hong, H., Blois, T. M., Cao, Z. & Bowie, J. U. Sterik tələdən istifadə edərək lipid ikiqatlarında güclü protein-zülal qarşılıqlı təsirlərini ölçmək üçün metod. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 107, 19802–19807 (2010).

Sparr, E. et al. Model membranlarda transmembran α-sarmalların öz-özünə assosiasiyası: spiral istiqamətinin əhəmiyyəti və hidrofobik uyğunsuzluğun rolu. J. Biol. Kimya. 280, 39324–39331 (2005).

MacKenzie, K. R., Prestegard, J. H. & amp Engelman, D. M. Transmembran sarmal dimer: quruluş və təsirlər. Elm 276, 131–133 (1997).

Trenker, R., Call, M. E. & Call, M. J. Lipid kub fazasında qlikophorinin A transmembran dimerinin kristal quruluşu. J. Am. Kimya. Soc. 137, 15676–15679 (2015).

Domanski, J., Sansom, M. S. P., Stansfeld, P. J. və Best, R. B. Transmembran spiral-spiral birləşməsini tutmaq üçün güc sahəsi zülal-lipid qarşılıqlı təsirini balanslaşdırmaq. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 14, 1706–1715 (2018).

Souza, P. C. T., Thallmair, S., Marrink, S. J. və Mera-Adasme, R. Mis, sink superoksid dismutazındakı allosterik yol G93A amiotrofik yanal sklerozla əlaqəli mutasiyasının molekulyar mexanizmini açır. J. Fizika. Kimya. Lett. 10, 7740–7744 (2019).

Brini, E. et al. Yumşaq maddələrin simulyasiyaları üçün sistematik qaba dənəli üsullar - baxış. Yumşaq Maddə 9, 2108–2119 (2013).

Foley, T. T., Shell, M. S. və Noid, W. G. Qətnamənin entropiyaya təsiri və qaba dənəli modellərdə məlumat. J. Chem. Fizik. 143, 243104 (2015).

Wagner, J. W., Dama, J. F., Durumeric, A. E. P. & Voth, G. A. Təmsil problemi və qaba dənəli modellərin fiziki mənası haqqında. J. Chem. Fizik. 145, 044108 (2016).

Wörner, S. J., Bereau, T., Kremer, K. & Rudzinski, J. F. Transformasiya edilmiş atomistik çarpaz korrelyasiya vasitəsilə iri dənəli modellərlə cüt paylama funksiyalarının reproduksiyasına birbaşa yol. J. Chem. Fizik. 151, 244110 (2019).

Noid, W. G., Chu, J. W., Ayton, G. S. & Voth, G. A. Çoxölçülü qaba dənəli və struktur korrelyasiya: maye-hal nəzəriyyəsi ilə əlaqələr. J. Fizika. Kimya. B. 111, 4116–4127 (2007).

Wu, Z., Cui, Q. & amp Yethiraj, A. Hidrofobik peptidlərin birləşməsi üçün hərəkətverici qüvvə: qaba dənəli su modellərində elektrostatik qarşılıqlı təsirlərin əhəmiyyəti. J. Fizika. Kimya. Lett. 2, 1794–1798 (2011).

Jin, J., Yu, A. & amp Voth, G. A. Temperatur və faza ötürülə bilən aşağıdan yuxarı qaba dənəli modellər. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 16, 6823–6842 (2020).

Yesylevskyy, S. O., Schäfer, L. V., Sengupta, D. & Marrink, S. J. Kobud dənəli MARTINI qüvvə sahəsi üçün qütbləşə bilən su modeli. PLoS Comput. Biol. 6, e1000810 (2010).

Michalowsky, J., Schäfer, L. V., Holm, C. & Smiatek, J. Uzun mənzilli elektrostatik qarşılıqlı təsirlərə malik iri dənəli MARTINI qüvvə sahəsi üçün təmizlənmiş qütbləşə bilən su modeli. J. Chem. Fizik. 146, 054501 (2017).

Marrink, S. J. və Tieleman, D. P. Martini modelinə baxış. Kimya. Soc. Rev. 42, 6801–22 (2013).

Bruininks, B. M. H., Souza, P. C. T. və Marrink, S. J. Biomolekulyar Simulyasiyalar: Metodlar və Protokollar (red. Bonomi, M. & Camilloni, C.) 105-127 (Humana Press Inc., 2019).

Liu, J. et al. Yan zəncirləri uyğunlaşdırmaqla donor-akseptor kopolimerlərinin molekulyar n-tipli dopinqinin gücləndirilməsi. Adv. Mater. 30, 1704630 (2018).

Vazquez-Salazar, L. I., Selle, M., de Vries, A., Marrink, S. J. & Souza, P. C. T. Martini imidazolium əsaslı ion mayelərinin qaba dənəli modelləri: nanostruktur quruluşdan maye-maye ekstraksiyasına qədər. Yaşıl Kimya. 22, 7376–7386 (2020).

Souza, P. C. T. və başqaları. Kobud dənəli Martini modeli ilə zülal-ligand bağlanması. Nat. Kommun. 11, 3714 (2020).

López, C. A. və başqaları. Martini qaba dənəli güc sahəsi: karbohidratlara uzanma. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 5, 3195–3210 (2009).

Monticelli, L. et al. MARTINI qaba dənəli güc sahəsi: zülallara genişlənmə. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 4, 819–834 (2008).

Grunewald, F., Rossi, G., de Vries, A. H., Marrink, S. J. & Monticelli, L. Poli(etilen oksidinin köçürülə bilən MARTINI modeli). J. Fizika. Kimya. B 122, 7436–7449 (2018).

de Jong, D. H. et al. Martini qaba dənəli zülal qüvvə sahəsi üçün təkmilləşdirilmiş parametrlər. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 9, 687–97 (2013).

Herzog, F. A., Braun, L., Schoen, I. & Vogel, V. Protein-lipid interfeyslərinin MARTINI simulyasiyalarında təkmilləşdirilmiş yan zəncir dinamikası. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 12, 2446–2458 (2016).

Poma, A. B., Cieplak, M. və Theodorakis, P. E. Zülallarda konformasiya keçidlərinin molekulyar dinamika tədqiqatları üçün MARTINI və quruluşa əsaslanan qaba dənəli yanaşmaların birləşdirilməsi. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 13, 1366–1374 (2017).

Periole, X., Cavalli, M., Marrink, S.-J. & Ceruso, M. A. Elastik şəbəkənin iri dənəli molekulyar qüvvə sahəsi ilə birləşdirilməsi: struktur, dinamika və molekullararası tanınma. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 5, 2531–2543 (2009).

Wassenaar, T. A., Ingólfsson, H. I., Böckmann, R. A., Tieleman, D. P. & amp Marrink, S. J. Deli olan hesablama lipidomikası: molekulyar simulyasiyalar üçün xüsusi membranlar yaratmaq üçün çox yönlü bir vasitədir. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 11, 2144–2155 (2015).

Melo, M. N., Ingólfsson, H. I. & amp Marrink, S. J. Martini sterolları və hopanoidləri üçün virtual sayt təsvirinə əsaslanan parametrlər. J. Chem. Fizik. 143, 243152 (2015).

López, C. A., Sovova, Z., van Eerden, F. J., de Vries, A. H. & Marrink, S. J. Martini qlikolipidlər üçün güc sahəsinin parametrləri. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 9, 1694–1708 (2013).

Carpenter, T. S. və başqaları. Zərif Martini qaba dənəli güc sahəsi ilə üçlü lipid qarışıqlarının faza davranışının tutulması. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 14, 6050–6062 (2018).

de Jong, D. H., Baoukina, S., Ingólfsson, H. I. & Marrink, S. J. Martini düz: daha qısa kəsmə və GPU-lardan istifadə edərək performansı artırmaq. Hesablama. Fizik. Kommun. 199, 1–7 (2016).

Hockney, R. W., Goel, S. P. & Eastwood, J. W. Plazmanın səssiz yüksək keyfiyyətli kompüter modelləri. J. Comput. Fizik. 14, 148–158 (1974).

Páll, S. & Hess, B. SIMD arxitekturalarında cüt qarşılıqlı əlaqənin hesablanması üçün çevik alqoritm. Hesablama. Fizik. Kommun. 184, 2641–2650 (2013).

Verlet, L. Klassik mayelər üzərində kompüter “təcrübələri”. I. Lennard-Cons molekullarının termodinamik xassələri. Fizik. Rev. 159, 98–103 (1967).

Tironi, I. G., Sperb, R., Smith, P. E. & amp Van Gunsteren, W. F. Molekulyar dinamika simulyasiyaları üçün ümumiləşdirilmiş reaksiya sahəsi metodu. J. Chem. Fizik. 102, 5451–5459 (1995).

Essmann, U. et al. Hamar hissəcik şəbəkəsi Ewald üsulu. J. Chem. Fizik. 103, 8577–8593 (1995).

Bussi, G., Donadio, D. & Parrinello, M. Sürəti yenidən ölçmə yolu ilə kanonik seçmə. J. Chem. Fizik. 126, 014101 (2007).

Parrinello, M. & Rahman, A. Tək kristallarda polimorfik keçidlər: yeni molekulyar dinamika üsulu. J. Tətbiq. Fizik. 52, 7182–7190 (1981).

Abraham, M. J. et al. GROMACS: noutbuklardan superkompüterlərə qədər çox səviyyəli paralellik vasitəsilə yüksək performanslı molekulyar simulyasiyalar. SoftwareX 1–2, 19–25 (2015).

Van Der Spoel, D. et al. GROMACS: sürətli, çevik və pulsuz. J. Comput. Kimya. 26, 1701–1718 (2005).

Wassenaar, T. A., Ingólfsson, H. I., Prieß, M., Marrink, S. J. & Schäfer, L. V. Qarışdırma MARTINI: hibrid atomistik-qaba dənəli biomolekulyar simulyasiyalarda elektrostatik birləşmə. J. Fizika. Kimya. B. 117, 3516–3530 (2013).

Wassenaar, T. A. və başqaları. Membran zülallarının dimer və trimer montajının yüksək məhsuldar simulyasiyaları. DAFT yanaşması. J. Chem. Nəzəriyyə Hesablama. 11, 2278–91 (2015).

Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. VMD - vizual molekulyar dinamika. J. Molec. Qrafik. 14, 33–38 (1996).

Gowers, R. J. et al. MDAanalysis: molekulyar dinamika simulyasiyalarının sürətli təhlili üçün Python paketi. in Proc. 15-ci Python Sci. Konfrans 98–105 (2016).


Təşəkkürlər

Bu iş NIH (HL114453, AI156924, AI156923, CA165065, CA243142, AI145406, NS076511, NS061817, P41GM103712, R21NS094854, PA30DA035778 və P01DK096990), Çin Təbii Elm Fondu (81873209, 81622050, 81903821), Milli Elmlər dəstəkləyib Mərkəz, Polşa (qrant 2019/35/D/ST4/02203), Çin TN-nin 111 Layihəsi (B13038), Guangdong Pearl River İstedadlar Proqramının Yerli İnnovativ və Tədqiqat Qrupları Layihəsi (2017BT01Y036), GDUPS (2019) və Mart ayı Pensilvaniya Universitetində Dimes Prematüre Araşdırma Mərkəzi. Biz J. Guererro-Santoro-ya texniki yardıma görə minnətdarıq PNPLA9 KO BeWo hüceyrələri.


MATERİALLAR VƏ METODLAR

DNT konstruksiyaları

Capu-NT (aa 1�) və Capu-NT-nin kəsilmələri tam uzunluqlu Capu şablonundan (CG3399, Capu-PA) PCR gücləndirilməsi ilə yaradılmışdır. Capu-NT kəsikləri pGEX-6P-2-yə (GE Healthcare, Piscataway, NJ) subklonlaşdırıldı. Bamsalam və yoxI saytlar. QuikChange Site Directed Mutogenesis (Stratagene, Santa Clara, CA) istifadə edərək Capu-CT-yə nöqtə mutasiyaları daxil edilmişdir.

Protein ifadəsi və təmizlənməsi

Acanthamoeba castellani aktin, Capu-tail və Capu-CT konstruksiyaları nəşr edilmiş protokollara uyğun olaraq təmizlənmişdir (MacLean-Fletcher və Pollard, 1980 Vizcarra). etਊl., 2011). Qısaca olaraq, Capu-quyruq GST birləşməsi kimi ifadə edildi və sonra etiketdən ayrıldı (başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə) Capu-CT histidin etiketli konstruksiya kimi ifadə edildi. Rosetta (DE3) pLysS-ə uyğun hüceyrələrdə Capu-NT::pGEX-6P-2-ni ifadə etdik. Hüceyrələr 600 nm 0,6 nm optik sıxlığa çatana qədər 37ºC-də Terrific Broth-da böyüdüldü və bu nöqtədə temperatur 1 saat ərzində 20ºC-ə endirildi. Sonra hüceyrələr 0,25 mM izopropil-d-tioqalaktozid ilə induksiya edildi və 13 saat sonra yığıldı. Hüceyrə qranulları maye azotla dondurulmuş və �ଌ-də saxlanılmışdır.

Ərimiş hüceyrə qranulları 1,7 mM fenilmetansülfonil/MSF10mlF və fenilmetansülfonil/MS0ml0 ilə əlavə edilmiş lizis tamponunda (50 mM Tris, pH 7, 150 mM NaCl, 0,2% Triton X-100, 1 mM ditiotreitol [DTT]) yenidən dayandırıldı. DNaseI. Bütün sonrakı addımlar 4ºC-də və ya buz üzərində aparıldı. Hüceyrələr mikrofluidizerdən (Microfluidics, Newton, MA) iki keçidlə parçalandı. Lizat 20.000 ° C-də sentrifuqa edilmişdir g 20 dəqiqə, və supernatant 1 saat ərzində 1,5 ml glutatyon Sepharose 4b muncuqları (GE Healthcare) ilə nutated edilmişdir. Capu-NT, PreScission Protease (GE Healthcare) ilə bir gecədə 4°C-də inkubasiya edilərək bağlı GST-dən ayrıldı. Eluat Amicon 10-kDa'molekulyar çəki kəsici mərkəzdənqaçma filtr qurğusunda cəmlənmiş və sonra Superdex 200 10/300 GL sütunundan istifadə edərək gel süzülmüşdür (GE Healthcare sütun tamponu: 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl, Ml. -arginin, 1 mM DTT). Fraksiyalar SDS–PAGE analizi əsasında birləşdi, saxlama buferinə dializ edildi (10 mM Tris, pH 7, 1 mM DTT) və sonra bir gecədə 1:1 qliserol:saxlama buferinə yerləşdirildi. Zülal alikotları maye azotda dondurulmuş və º221280ºC-də saxlanılmışdır. Nəticədə Capu-NT nümunələri 㺘% təmiz idi (Şəkil 1B).

Capu-NT-ni təmizləyərkən iki problem yarandı: 1) proteinin parçalanması, nəticədə gellərdə dublet və 2) DnaK şaperon çirklənməsi. Birincisi, glutatyon qatranı üçün tövsiyə olunan standart fosfat tamponlu şoran məhluldan fərqli olaraq əvvəllər təsvir edilən lizis tamponundan istifadə etməklə aradan qaldırıldı. Proteazın parçalanmasından əvvəl, 5 mM ATP və 10 mM MgCl ilə əlavə edilmiş lizis tamponundan istifadə edərək əlavə bir yuma mərhələsi2 DnaK-nın çoxunu çıxardı ( Pastorino etਊl., 2008). Capu-NT-nin kəsilməsi eyni üsulla təmizləndi.

Qarşılıqlı təsirlərin təhlilini asanlaşdırmaq üçün bütün zülalların konsentrasiyaları onların monomer (alt bölmə) konsentrasiyaları baxımından bildirilir. Beləliklə, 20 nM Capu-CT 10 nM funksional nüvələşmə vahidinə bərabərdir. Eynilə, burada bildirilən yeni sönmə əmsalları monomer konsentrasiyası baxımındandır. Capu-NT-nin (204,855 sm 𢄡 M 𢄡) sönmə əmsalını təyin etmək üçün Los-Anceles Biopolimer Laboratoriyasında Kaliforniya Universitetində amin turşusu analizi (AAA) ilə təmizlənmiş nümunənin konsentrasiyasını ölçdük. Sönmə əmsalı Beer qanunundan istifadə etməklə hesablanmışdır (Abs = c*ε*b), harada c AAA ilə ölçülən zülalın konsentrasiyası, Abs AAA tərəfindən təhlil edilən nümunə üçün ölçülən 280 nm-də absorbansdır və b yolun uzunluğu (1 sm). Capu(50º2013321) (41,758 sm x022121 M x022121) sönmə əmsalı da eyni şəkildə müəyyən edilmişdir. Capu(1�) (99,582 sm 𢄡 M 𢄡) sönmə əmsalını təyin etmək üçün biz SDS–PAGE geli ilə boyanmış) Capu(1�)-nin beş müxtəlif konsentrasiyasından olan zolaqları kəmiyyətləşdirdik. . Gellər Pharos FX-də (Bio-Rad, Hercules, CA) təsvir edilmişdir. Capu(1�) konsentrasiyası standart olaraq Capu(50�) istifadə edilməklə ölçüldü. Capu(1�)-da triptofan və tirozin qalıqları olmadığı üçün biz onun konsentrasiyasını standart olaraq Capu(1�) ilə kəmiyyətcə SyproRed boyama üsulu ilə təyin etdik.

Cücə (Drosophila profilin) ​​BL21 (DE3) pLysS-ə uyğun hüceyrələrdə pET17b plazmidində yaxınlıq etiketi olmadan ifadə edildi (gecədə 18ºC). Hüceyrə qranulları ekstraksiya tamponunda (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF) yenidən dayandırıldı və mikrofluidizer ilə parçalandı. Lizat 20.000 ° C-də sentrifuqa edilmişdir g 20 dəqiqə, supernatant isə DE52 qatranı ilə 30 dəqiqə 4°C-də inkubasiya edilmişdir. Həm axın, həm də ekstraksiya tamponunun yuyulması toplandı. Ammonium sulfat 4°C-də 15 dəqiqə ərzində qarışdırmaqla 35% doyma səviyyəsinə əlavə edildi. Nümunə 30.000 ° C-də sentrifuqa edilmişdir g 30 dəq. Supernatant 61% ammonium sulfat saturasiyasına gətirildi və yenidən sentrifuqa edildi və qranul gecə ərzində 5 mM kalium fosfat, pH 7.5, 1 mM DTT ilə dializ edildi. Nümunə hidroksiapatit sütunundan (Bio-Rad) süzüldü və sonra 150 mM NaCl, 10 mM 4-(2-hidroksietil)-1-də HiLoad 26/60 Superdex 75 sütununda (GE Healthcare) gel filtrasiyası ilə daha da təmizləndi. piperazineetansülfonik turşu (HEPES), pH 7 və 0,5 mM Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP). Təmizlənmiş zülal 50% qliserin, 50% 10 mM HEPES, pH 7 və 0.5 mM TCEP-də dondurulmuş və º221280ºC-də saxlanılmışdır. Chic konsentrasiyası kəmiyyətcə SyproRed boyanması ilə hesablanmışdır Schizosaccharomyces pombe standart olaraq profilin (1.63 OD/mq/ml) (Lu və Pollard, 2001).

Təmizlənmiş Acanthamoeba castellani aktin sistein 374 üzərində Oregon yaşıl 488 iyodoasetamid (Life Technologies, Carlsbad, CA) ilə etiketlənmişdir. Filamentli aktin 100 mM KCl, 2 mM MgCl ilə 3 saat dializ edilmişdir.2, 25 mM imidazol, pH 7.5 və 0.2 mM ATP azaldıcı reagentləri çıxarmaq üçün. Aktin bir gecədə 4°C-də 5-10 qat molar artıq boya ilə sarsıldı. Reaksiya 10 mM DTT ilə söndürüldü və 195.000 ×-də fırlandı. g. Qranul aktin G tamponunda (2 mM Tris, 0.1 mM CaCl) yenidən dayandırıldı.2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04% natrium azid) və Superdex 200 10/300 GL sütununda gel filtrasiyasından əvvəl 3 gün dializ edilir. Aktin konsentrasiyası və boya etiketləmə faizi Kovara uyğun olaraq hesablanmışdır etਊl. (2003) .

Piren-aktin polimerləşmə analizləri

Piren-aktin montaj analizləri əsasən təsvir edildiyi kimi aparılmışdır (Zalevski etਊl., 2001). Qısaca, 4 μM A. Castellani aktin (5% piren etiketli) ME tamponu (son konsentrasiya, 200 μM etilen qlikol tetraasetik turşu [EGTA] və 50 μM MgCl) ilə 25°C-də 2 dəqiqə inkubasiya edilmişdir.2) Ca-G-aktini Mg-G-aktinə çevirmək. KMEH polimerləşmə tamponunun (son konsentrasiya, 10 mM Na-HEPES, pH 7.0, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1 mM MgCl) əlavə edilməsi ilə polimerləşmə başlandı.2) Mg-G-aktinə. Capu-CT, Capu-tail və Capu-NT kimi əlavə komponentlər Mg-G-aktinə əlavə edilməzdən əvvəl polimerləşmə tamponunda birləşdirildi. Floresensiya spektrofluorometrdə (Photon Technology, Birmingham, NJ) və ya TECAN F200-də λ ilə izlənildi.həyəcan = 365 nm və λemissiya = 407 nm.

Tikanlı uc konsentrasiyaları t1/2 aşağıdakı tənlikdən istifadə edərək toplu piren analizləri üçün hesablanmışdır: [tikanlı uc] = uzanma dərəcəsi/(k+ × [aktin monomerləri] − k), harada k+ = 11,6 μM 𢄡 s 𢄡 və k = 1,4 s 𢄡 (Pollard, 1986). Uzatma sürəti yarı-maksimum polimerləşmədə xam məlumatlara ən uyğun xəttin yamacı ilə müəyyən edilmişdir. Yaxınlıqdakı məlumatları təhlil edərkən aktin monomer konsentrasiyasının 2 μM olduğunu güman etdik. t1/2. Capu-NT varlığında Capu-CT-nin nüvələşmə sürətlərinin hesablanması əvvəllər təsvir edildiyi kimi edildi (Quinlan etਊl., 2007). Qısaca olaraq, xüsusi dalğa analizinə əsaslanan alqoritmdən istifadə edərək, biz flüoresan intensivliyi məlumatlarını hamarladıq. İlk 30 s-dən əldə edilən məlumatlar zamana qarşı tərtib edilmiş və bu xətlərin yamacları tikanlı ucların əmələ gəlmə sürəti (yəni, nüvələşmə dərəcəsi) kimi qəbul edilmişdir.

Rəqabət piren polimerləşməsi təcrübələri Vinson-da təsvir olunduğu kimi rəqabət bağlama modelindən istifadə etməklə təhlil edilmişdir etਊl. (1998). Hesablamaq üçün Kd Capu-tail/Capu-NT qarşılıqlı əlaqəsi üçün aşağıdakı tənlikdən istifadə etdik:

harada L = [Kapu quyruğu], R0 = [Capu-NT], Kd Capu-CT-nin Capu-NT üçün yaxınlığıdır və Kd2 Capu-NT üçün Capu-quyruğun yaxınlığıdır. EC-də50 = 3 μM, f = 0,5 və L = 3 μM. Bu şərtlər altında və nə vaxt Kd 10 nM olduğu güman edilir (Ki Capu-CT/Capu-NT), Kd2 333 nM-dir.

Proteoliz

Capu-NT 10 mM Tris, 50 mM KCl və 1 mM DTT-də dializ edildi və son konsentrasiyası 3 º003bcM qədər seyreltildi. 0 dəqiqədə Capu-NT-yə 6 nM tripsin əlavə edildi. 1, 2, 5, 10, 15, 30, 60, 90 və 120 dəqiqə vaxt nöqtələrində reaksiyadan nümunələr götürüldü və proteolizi dayandırmaq üçün 4 mM PMSF əlavə edildi. Nümunələr qaynadılmış və vizuallaşdırma üçün SDS–PAGE gelində işlədilmişdir. İkinci vəziyyətdə, tripsin əlavə etməzdən əvvəl Capu-NT-yə 50 μM Capu-tail əlavə edildi.

Triptik həzmdən sonra stabil zolaqların sərhədlərini müəyyən etmək üçün proteolizə edilmiş Capu-NT SDS–PAGE geli üzərində işlədilmiş və Immobilon-P membranına (Millipore, Billerica, MA) köçürülmüşdür. Bantlar Coomassie boyanması ilə vizuallaşdırıldı və membrandan kəsildi. Nevada Proteomika Mərkəzi (Reno, NV) N-terminusunu müəyyən etmək üçün Edman zülal ardıcıllığını həyata keçirdi. Həzm olunan zolaqların molekulyar çəkilərini müəyyən etmək üçün həm təmizlənməmiş, həm də həzm olunmuş (5 dəq) Capu-NT MALDI kütlə spektrometriyası ilə təhlil edilmişdir (Əlavə Şəkil S3B). Capu-NT (0,5 € 3,2 € x003bcM) 0,5 μl doymuş sinapin turşusu ilə qarışdırılmış və Voyager-DE STR MALDI-TOF Kütləvi Spektrometrdə (Applied Biosystems, Foster City, CA) təhlil edilmişdir.

Floresans anizotropiyası

20 nM Capu-tail𠄺lexa Fluor 488 (40% etiketli) flüoresan qütbləşmə anizotropiyası, artan miqdarda Capu-NT, Capu(1�) və ya Capu(1�) spektrofluorometr ilə ölçüldü. Bütün analizlər 10 mM HEPES, pH 7.0, 1 mM EGTA, 1 mM TCEP, 0.5 mM Thesit, 50 mM KCl və 1 mM MgCl-də 25ºC-də aparılmışdır.2. Flüorofor 488 nm-də müstəvi qütblü işıqla həyəcanlandı və emissiya düşmə bucağına paralel və perpendikulyar bucaqlarda 520 nm-də ölçüldü. Emissiya yoluna 520 ± 5 nm-də bir bant keçirici filtr yerləşdirildi. Məlumatlar əvvəllər təsvir edildiyi kimi təhlil edildi (Vizcarra etਊl., 2011 ).

TIRF mikroskopiya analizləri

TIRF uzanma analizləri üçün örtüklər əsasən təsvir edildiyi kimi hazırlanmışdır (Hansen etਊl., 2010). Qısaca, örtüklər etanol, 1 M kalium hidroksid və etanol ilə sonikasiya ilə yuyulur, hər addımdan sonra Milli-Q suyu ilə yuyulur. Sonra örtüklər izopropanol (15 dəq), sonra izopropanolda (30 dəq) 5% 3-aminopropiltrietoksisilan (Sigma-Aldrich, Sent-Luis, MO) ilə sonikasiya edildi. Silanlaşdırılmış örtüklər 90°C-də bişirilmiş və 1 aya qədər 100% etanolda saxlanılmışdır. PEGylation əvvəl, örtüklər Milli-Q su ilə yuyulur. 30 mq/ml damcı N-hydroxylsuccinimide𠄿unctionalized polyethylene glycol (PEG-NHS 97% methoxy-PEG-NHS and 3% biotin-PEG-NHS JenKem Technology, Allen, TX) in N,N-dimethyl formamide was placed on half of the silanized coverslips. Another coverslip was placed over each drop to create a sandwich. The PEGylation reaction was carried out by incubating the sandwiches at 75ଌ for at least 2 h, followed by multiple washes with Milli-Q water. PEGylated coverslips were stored in a sealed container at 4ଌ for up to 1 mo before use.

Heavy meromyosin (HMM a gift of the Reisler lab, University of California at Los Angeles) was biotinylated using maleimide-PEG11-biotin (Thermo Scientific, Waltham, MA). HMM (0.5 mg/ml) was incubated with 0.5 mM TCEP for 30 min at room temperature. TCEP was removed using a PD10 column (GE Healthcare), and HMM was eluted in 50 mM sodium phosphate, pH 7, and 100 mM sodium chloride. A 40-fold molar excess of maleimide-PEG11-biotin was incubated with the HMM for 2 h at room temperature, followed by dialysis with 25 mM Tris, pH 8, 30 mM KCl, and 1 mM DTT, and then the same buffer was mixed with equal volume of glycerol. The biotinylated-HMM was flash frozen and stored at �ଌ. Streptavidin (VWR, Radnor, PA) was diluted to 30 μM tetramer in Milli-Q water, flash frozen, and stored at �ଌ.

Flow cells with volumes of �� μl were assembled using double-stick tape. Immediately before imaging, 25 μl of 40 nM streptavidin was applied to the flow cell for 30 s, followed by a wash with 25 μl of 1× TIRF buffer (50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7, 0.2 mM ATP, 50 mM DTT, 0.2% methylcellulose), 30 s of incubation with 25 μl of 20 nM biotinylated-HMM, and a wash with 25 μl of 1× TIRF buffer. Profilin/actin (final concentration, 1 μM actin, 16% Oregon green labeled, and 5 μM Drosophila profilin) was incubated with ME buffer for 2 min at room temperature. A solution containing 2× TIRF buffer, glucose oxidase (final concentration 0.25 mg/ml), catalase (final concentration 0.05 mg/ml), and any additional proteins (1 nM Capu-CT and/or 100 nM Capu(1�) final concentrations) was mixed with the Mg-G-actin solution. Filament elongation was visualized on a DMI6000 TIRF microscope (Leica, Wetzlar, Germany) for at least 10 min, capturing images at 10-s intervals. Filament lengths and elongation rates were analyzed with JFilament incorporated in FIJI ( Smith etਊl., 2010 ).

Bulk elongation assay

Actin (5 μM) was polymerized in 1× KMEH buffer at 25ଌ for 1 h and aliquoted into 5-μl volumes of 5 μM 1 d before an experiment. To initiate polymerization at the barbed end, we added 20% labeled 0.5 μM Mg-G-actin to the seeds. Filament assembly was tracked for 700 s. Elongation rates were calculated from the slopes between 200 and 700 s. Final concentrations of proteins were 0.25 μM actin seeds, 0.5 μM Mg-G-actin, 100 nM Capu-CT, 500 nM Capu(1�), and 0.375 nM recombinant mouse capping protein 㬑㬢. Capu-CT was mixed with buffer or Capu(1�) and incubated for 60 s at 25ଌ. Subsequently, this mix was added to the seeds and incubated for another 30 s. At this time, Mg-G-actin was added to the ME buffer (see earlier description) and incubated for 2 min at 25ଌ. After 2 min, seeds, Mg-G-actin, and 1× KMEH buffer containing either buffer blank or CP were combined and analyzed in the fluorometer. To minimize filament shearing, cut pipette tips were used to transfer the polymerization reaction to the cuvette. For the “mid-assay” addition of protein, instead of adding Capu(1�) or Spir-KIND in the beginning of the assay, we added one or the other after recording elongation for 200 s. Each condition was repeated three times.

Circular dichroism

Proteins were dialyzed into 50 mM potassium phosphate, 1 mM DTT (pH 7). Circular dichroism spectra were measured on a J-715 spectropolarimeter (Jasco, Tokyo, Japan) by averaging three wavelength scans from 195 to 280 nm. The data were analyzed using a previously described method within the Jasco and Sofsec1 software packages ( Sreerama and Woody, 1993 ). The latter compares the input data with a database of spectra from proteins with known secondary structure.

Analytical ultracentrifugation

Sedimentation velocity analytical ultracentrifugation was performed on Capu-NT and Capu(1�) essentially as described ( Chen etਊl., 2012). Both proteins were dialyzed into 10 mM Tris, 150 mM NaCl, and 0.5 mM TCEP (pH 7.5) and diluted to a final concentration of 2.4 μM Capu-NT or 5.0 μM Capu(1�). Proteins were spun at 50,000 rpm at 4ଌ for 3 h in an Optima XL-A Analytical Ultracentrifugation system (Beckman Coulter, Brea, CA). Data were acquired every 3 min for 50 scans. Data were analyzed with Beckman Origin-based software, version 3.01. Capu(1�) was unstable over the course of an experiment at 20ଌ. This breakdown is apparent in the analysis (Supplemental Figure S6A), where we see a clear peak at 2.7S and then trailing shoulders from that peak. Data acquired at 4ଌ were corrected for the viscosity change.

Sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation was performed at two speeds (11,000 and 13,000 rpm) with three different concentrations of Capu-NT (0.6, 1.8, and 2.8 μM). Scans collected between 24 and 28 h after speed was attained were analyzed. The same buffer conditions, centrifuge, and analysis software were used as in the velocity sedimentation experiments.

Size-exclusion column with multiangle light scattering

To analyze Capu(1�), Capu(1�), and Capu-NT with SEC-MALS, the proteins were dialyzed into 10 mM Tris, 150 mM NaCl, and 0.5 mM TCEP overnight and spin concentrated using an Amicon 10-kDa–molecular weight cutoff centrifugal filter unit. An analytical size-exclusion column (5 μm, 300 Å, 7.8 × 300 mm Wyatt Technology, Goleta, CA) was equilibrated with phosphate-buffered saline (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4). In each case a 100-μl sample was loaded: 43.5 μM Capu(1�), 18.3 μM Capu(1�), or 5.8 μM Capu-NT. The smaller the size of the protein, the more protein was needed to detect light scattering signals. During elution, light scattering was measured with a miniDAWN TREOS and the refractive index (n) was measured with an Optilab T-rEX system (Wyatt Technology). The data were analyzed by ASTRA 6 software to obtain average molecular weights ( Table 1 ). The dn/DC (harada c is concentration) for the calculation was set to 0.185 ml/g, a typical value for proteins.


Prominent Changes in Hematology and Coagulation

Since a hyperinflammatory profile consistent with cytokine storm has been robustly associated with COVID-19 severity and suggested as the predominant cause of patient mortality, most initial literature has focused on the dysregulation of immune response in COVID-19 patients and the potential value of immune modulating treatments. However, evidence of alarming coagulation abnormalities and high incidence of thrombotic events in COVID-19 patients is prevalent (70). Early reports from Wuhan, China demonstrated prolonged activated partial thromboplastin time (aPTT) and prothrombin time, and elevated D-dimer as well as thrombocytopenia (20, 139, 155). In a more in-depth study of 183 patients by Tang et al., 71.4% of non-survivors and 0.6% of recovered cases met the criteria for disseminated intravascular coagulation during hospitalization (128). In addition to prolonged prothrombin time, studies in other cohorts have reported high prevalence of lupus anticoagulant in the circulation (13). Recent autopsy data from Italy also observed fibrin thrombi in pulmonary small arterial vessels in 87% of fatal cases examined, suggesting the contribution of coagulation in diffuse alveolar and endothelial damage (15). These data clearly suggest a state of hypercoagulability in severe COVID-19.

Although prominent changes in blood coagulation may be a contributing mechanism to COVID-19 mortality, its pathogenesis is estimated to be tightly linked to inflammation and cytokine release. Specifically, immunothrombosis is a phenomenon known to occur as a result of host defense against various pathogens, including viral infection (30). For example, the activation of complement pathways can lead to initiation of the coagulation cascade (30, 127). Complement-mediated pulmonary tissue damage and microvascular injury have been observed in small cohorts with severe COVID-19 (85). Procoagulant response is also associated with the inflammatory effects of cytokines in the vascular endothelium, including increased vascular permeability and damage as a result of immune-cell infiltration (62). Given the correlation of IL-6 levels with increased fibrinogen and D-dimer in severe COVID-19 patients, it is likely that cytokine-mediated procoagulant changes are partially responsible for the specific thrombosis profile observed in critically ill patients (41, 110). Presence of neutrophil extracellular traps (NETs) are also possibly linked to COVID-19 thrombosis via activation of intrinsic coagulation (8, 50, 162). Overall, the predominant mechanism seems that encompassing SARS-CoV-2-induced endothelial damage fosters monocyte recruitment and activation, along with tissue factor exposure, which then activates blood coagulation. Recruitment of neutrophils by activated endothelial cells can also synthesize and release multiple cytokines into the circulation, further accelerating this process (93). In addition to the coagulopathy observed in COVID-19, severe bleeding in patients is rare in comparison to other RNA-type viruses with hemorrhagic manifestations (30). However, a recent report in Blood characterized bleeding as a significant cause of morbidity in COVID-19 patients, emphasizing the need for randomized trials on the benefit of escalated prophylaxis (1). By taking these data into consideration, a close connection between the inflammatory and coagulation response of COVID-19 patients appears to exist, wherein treatment options for both contributing factors should be explored.


Əlavə informasiya

Rəqabət edən maraqlar

No competing interests declared.

Müəllif töhfələri

Conceptualization, Resources, Data curation, Formal analysis, Visualization, Methodology, Writing - original draft, Writing - review and editing.

Conceptualization, Resources, Data curation, Formal analysis, Visualization, Methodology, Writing - original draft, Writing - review and editing.

Conceptualization, Data curation, Formal analysis, Visualization, Methodology, Writing - original draft.



Şərhlər:

  1. Jedd

    Bu, mütləq, ideallar yoxdur

  2. Sagami

    Və çox yaxşı fikriniz olmadan nə edək

  3. Finbar

    Thanks for the information, now I will know.

  4. Bond

    Aşağıda deyin

  5. Yozshugor

    Axşamınız xeyir . ;) Bu gün İdman TV kanalında UEFA matçlarında göstəriləcək - onu qaçırmayın!



Mesaj yazmaq