Məlumat

Kök hüceyrə xətləri kriogen yolla qorunub saxlanılır və ya HeLa hüceyrələri kimi kommersiya baxımından mövcuddur?

Kök hüceyrə xətləri kriogen yolla qorunub saxlanılır və ya HeLa hüceyrələri kimi kommersiya baxımından mövcuddur?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Xərçəng xəstəsi olan xəstədən götürülmüş HeLa hüceyrələri var və hazırda təcrübələr üçün müxtəlif laboratoriyalarda dünyada böyüyür. HeLa hüceyrələri ölümsüz olduqları üçün saxlanıla bilər və buna görə də ölməz hüceyrə xəttinin bir nümunəsidir.

Bəs kök hüceyrələr? Onlar da ölməzdirlər. Belə hüceyrələr normal sağlam insandan götürülə və əbədi olaraq saxlanıla bilər. Alimlər bunu edirmi? Niyə biz bu barədə eşitmirik? Məsələn, yuxarıda göstərilən Vikipediya məqaləsində fərqlənirlər.

Kök hüceyrə xətlərinin onları fərqli edən bəzi xüsusi xüsusiyyətləri varmı? Məsələn, aşağı diferensial olduqları üçün təcrübələr üçün yararsız ola bilərlər.


Bu şərh üçün çox uzundur, ona görə də bunu burada yazmalıyam:

Əsasən bu, digər hüceyrə xətlərinin laboratoriyada daha praktik olmasıdır.

Kök hüceyrələri qorumaq daha çətindir - xüsusən də onların kök hüceyrə xüsusiyyətlərini saxlamaq istəyirsinizsə. Onlar yalnız çox yavaş böyüyürlər, həddindən artıq stress, mobil siqnallar və s. aldıqda fərqlənməyə meyllidirlər və xüsusi mediaya ehtiyac duyurlar (bunları müəyyən etmək lazımdır ki, məsələn, differensiasiyanı təşviq edən amilləri ehtiva etməsin).

Gündəlik təcrübələr üçün (məsələn, ifadə profilləri, müəyyən maddələrin böyüməyə, gen ifadəsinə və ya hüceyrələrin hər hansı digərinə təsiri ilə bağlı təcrübələr) "normal" hüceyrə xətləri daha uyğundur, çünki standart mühitdən istifadə edərək laboratoriyada saxlamaq daha asandır. Bundan əlavə, təcrübələr daha asan təkrarlana və çoxalda bilər, çünki bu hüceyrələr həmişə eyni davranmalıdır.


Məqsəd

Embrion kök (ES) hüceyrələrinin diploid hüceyrələrin tetraploid embrionlarla birləşməsindən əldə edilə biləcəyini qiymətləndirmək üçün.

Dizayn

Təsadüfi, perspektivli tədqiqat.

Parametr

Universitet embriologiya və gamet biotexnologiya laboratoriyası.

Heyvan(lar)

Müdaxilə(lər)

Dörd-səkkiz hüceyrəli F1 tetraploid embrionları 10-15 donor E14 ES hüceyrələri ilə birləşdirildi.

Əsas Nəticə Ölçüsü(lər)i

Embriogenez və ES hüceyrələrinin qurulması.

Nəticələr)

Birləşdirilmiş tetraploid və nəzarət diploid embrionları arasında blastosist formalaşmasında heç bir fərq (78%-89%) aşkar edilməmişdir. Ümumilikdə 27 köçürmədə üç tetraploid (23,1%) və beş diploid (35,7%) halda hamiləlik aşkar edilib və yığılmış tetraploid embrionlardan üç diri doğulmuş doğulmuşdur. Aqreqasiyasız tetraploid blastokistlər örtüldü, lakin ES hüceyrəsinə bənzər koloniya əmələ gəlmədi. Səkkiz yığılmış blastokistdən altısı yaxşı proliferasiya olunmuş koloniyalar törədib, bu koloniyalar anti-mərhələ spesifik embrion antigen (SSEA)-1 antikoru, Okt-4 və qələvi fosfataz üçün müsbət olub. Mikrosatellit analizi donor E14 hüceyrələri və E14-cüllü, tetraploid embriondan əldə edilən canlı doğuş və ES-yə bənzər hüceyrələr arasında homogen tərkibi təsdiqlədi.

Nəticə(lər)

Pluripotent diploid hüceyrələrin tetraploid embrionlarla birləşməsi donor diploid hüceyrələrinə homogen olan canlı doğuşlar və ES-yə bənzər hüceyrələr verdi.


Kök hüceyrə xətləri kriogen şəkildə qorunur və ya HeLa hüceyrələri kimi kommersiya baxımından mövcuddur? - Biologiya

Peyvəndlər və heyvan hüceyrəsi texnologiyası

Giriş

Peyvənd ən uğurlu və sərfəli ictimai sağlamlıq müdaxilələrindən biridir. O, çiçək xəstəliyini aradan qaldırıb, 1988-ci ildən bəri poliomielit xəstəliyinin qlobal hallarını 99% azaldıb və qızılca, difteriya, göy öskürək (göyöskürək), tetanus və hepatit B kimi xəstəliklərin kəskin azalmasına nail olub. “Təmiz, təhlükəsiz içməli suya çıxış yaxşılaşdıqdan sonra peyvənd 20-ci əsrin ən böyük ictimai səhiyyə zəfəridir”. (1)

Hüceyrə mədəniyyətinin yaranmasından əvvəl viruslar yalnız bütün orqanizmlərdə, heyvanlarda və ya bitkilərdə çoxalırdı. Bütöv orqanizmlərə təbii ev sahibi və laboratoriya heyvanları, məsələn, toyuq embrionlanmış yumurtaları, dovşanlar, siçanlar, siçovullar və başqaları daxil ola bilər. 1950-ci illərdə hüceyrə mədəniyyəti texnikasının inkişafı sənaye miqyasında geniş çeşiddə bioloji əczaçılıq məhsullarının istehsalına qapı açdı.

Təriflər

Doku mədəniyyəti heyvan və ya bitkidən hüceyrələrin, toxumaların və ya orqanların çıxarılması və sonra onların hüceyrə canlılığını saxlamaq üçün süni mühit mühitinə yerləşdirilməsi üçün ümumi termindir.

Hüceyrələrdən bioloji istehsal etmək üçün mexanizm kimi istifadə etmək məqsədi ilə bütün orqanların və ya bütöv orqan fraqmentlərinin kulturasına deyilir. Orqan Mədəniyyəti.

Hüceyrələr becərmədən əvvəl və ya becərmə zamanı orqan fraqmentlərindən çıxarıldıqda və beləliklə onların qonşu hüceyrə ilə normal münasibətləri pozulduqda, texnologiya adlanır. Hüceyrə Mədəniyyəti.

Hüceyrələr ayrı-ayrılıqda orqanizmdən ayrıldıqda və uyğun bir mühitə və dəstək mədəniyyət mühitinə yerləşdirildikdə, onlar yapışacaq, bölünəcək və böyüyəcəkdir. Bu hüceyrə mədəniyyəti adlanır İbtidai Mədəniyyət. Hüceyrə mədəniyyəti normal, embrion və ya bədxassəli toxumadan başlaya bilər. Birincili mədəniyyət qabındakı hüceyrələr böyüdükdə və bütün mövcud mədəniyyət substratını doldurduqda, onlar subkulturalaşdırıla və davamlı böyümə üçün yer verə bilərlər.

İlkin hüceyrələrin ardıcıl subkulturasından sonra böyüməyə davam edən hüceyrələr genetik reorqanizasiyaya məruz qalır və yeni sintetik mühitə uyğunlaşır və ardıcıl olaraq çoxalır, nəticədə ölümsüzləşmə hadisəsi əmələ gəlir. Davamlı Hüceyrə Xətti bir neçə keçid və ya mütləq ölməz hüceyrələr üzərində.

Tarixi fon

İngilis fiziki Robert Huk (1635-1703) 50x böyüdücü mikroskop vasitəsilə mantarın nazik kəsilməsinə baxdı və divarların içərisində olan boş yerləri kəşf etdi və onu təsvir etmək üçün ilk dəfə "hüceyrə" terminindən istifadə etdi. 1670-ci ildə Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) mikroskopdan istifadə edərək bir damla gölməçə suyunda hüceyrələri təsvir etdi və mikroskopla təkhüceyrəli heyvanları (protozoa) müşahidə edən ilk insan oldu.

1839-cu ildə alman bioloqu Teodor Şvann Matias Şleydenlə razılaşaraq heyvan toxumasının hüceyrələrdən ibarət olduğu qənaətinə gəldi və bitki və heyvanların quruluşca əsaslı şəkildə fərqli olduğuna dair fərziyyələrə son verdi. Hüceyrənin həyatın əsas vahidi olduğu ifadəsi hüceyrələrlə bağlı ikinci ümumiləşdirmə idi və biologiyanın inkişafında ən əhəmiyyətlidir. O, “hüceyrə nəzəriyyəsi” kimi tanındı.

Müxtəlif ölkələrdə bir neçə empirik təcrübədən sonra Edvard Cenner inək çiçəyi infeksiyasının insanı çiçək infeksiyasından qoruya biləcəyini nümayiş etdirdi. Peyvəndlərin qol-qola ötürülməsini qadağan etmək üçün buzovlarda istehsal olunan peyvənd materialı Avropa və Şimali Amerikanın müxtəlif yerlərində geniş şəkildə istifadə olunmağa başladı. 1800-cü illərin sonlarında danalardan dana çiçəyi virusunu yığmaq üçün peyvənd təsərrüfatları yaradılandan bəri heyvanlar insan peyvəndlərinin istehsalı üçün istifadə edilmişdir. Bu andan 20-ci əsrin birinci yarısına qədər peyvəndlərin əksəriyyəti ya canlı heyvanlarda patogenlər yetişdirməklə, ya da embrionlaşdırılmış toyuq yumurtalarından istifadə etməklə heyvanların istifadəsi ilə hazırlanmışdır.

1800-cü illərin sonlarında, bakteriologiya özünü təsdiqlədikcə, Paster quduzluğa qarşı ilk canlı zəiflədilmiş viral peyvəndi hazırladı. Virus yetişdirilə bilməsə də, Paster dovşanın yoluxmuş onurğa beynini götürə, başqa bir dovşana peyvənd edə, onun onurğa beynini götürüb başqa bir dovşanı aşılaya bildi və s. iki həftəlik qurumadan sonra bir neçə keçid üçün belə davam etdi. virus zəifləmiş, lakin hələ də peyvənd kimi xidmət etmək üçün kifayət qədər immunogen idi. İlk dəfə 1885-ci ildə quduz it tərəfindən şiddətli dişlənmiş 9 yaşlı uşaq üzərində uğurla istifadə edilmişdir.

Heyvan hüceyrə mədəniyyəti ilk dəfə 1907-ci ildə Ross Harrison tərəfindən qurbağanın embrion sinir toxuması ilə uğurla həyata keçirilmişdir. O, öz işini Wilheim Roux (1885) təcrübələrinin davamı kimi təsvir etdi. Hər iki alim embrionun inkişafı zamanı hüceyrə diferensiasiyasının xüsusi formalarını öyrənməkdə maraqlı idi. Yalnız 1940-cı illərin sonu - 1950-ci illərin əvvəllərində hüceyrə mədəniyyətini elmi vasitə kimi geniş şəkildə əlçatan edən bir sıra inkişaflar baş verdi.

Hüceyrə mədəniyyəti və peyvəndin inkişafı tarixində 1931-ci ildə Goodpasture tərəfindən embrionlaşdırılmış toyuq yumurtalarının virus böyüməsi üçün istifadəsi böyük bir irəliləyiş oldu. Bundan, Theilerin sarı qızdırmaya qarşı təhlükəsiz və effektiv doğranmış cücə toxuması peyvəndi 17D virusu çıxdı. tropik ölkələrdə böyük tətbiq tapdı.

İnəklərdə və donuzlarda ayaq və ağız xəstəliyinə (FMD) səbəb olan viral agent, 1897-ci ildə, bitkilərin tütün mozaika virusunun kəşfindən qısa müddət sonra aşkar edilən onurğalıların ilk virusu idi. Yalnız 1920-ci ilə qədər Waldmann və Pape tərəfindən qvineya donuzlarından istifadə edərək, şap virusunun öyrənilməsi üçün əlverişli heyvan modeli yaradıldı. Daha sonra vigil iribuynuzlu heyvanlar baytarlıq üçün virusun çoxaldılması və 1938-ci ildə effektiv və təhlükəsiz olduğunu sübut edən təsirsizləşdirilmiş peyvəndin hazırlanması üçün istifadə edildi.

1947-ci ildə Frenkel tərəfindən əldə edilən şap virusunun böyüməsi üçün in vitro üsulların inkişafı, dilin sağ qalan epitelində böyük miqdarda virusun istehsal oluna biləcəyini nümayiş etdirən və peyvənd proqramının əsasını təşkil edən vaksinlərin geniş miqyaslı istehsalı üçün kritik rol oynamışdır. 1950-ci illərdə Avropada başlamışdır.

İlkin hüceyrə üsulları 1949-cu ildə bütöv heyvan toxumaları və cücə embrion toxumalarından illərlə istifadə etdikdən sonra virusun yayılması üçün ilkin hüceyrələrin istifadəsi ilə bağlı araşdırmalarına görə Nobel mükafatına layiq görülən Enders, Weller və Robins ilə başladı. İlk nümunələrə müxtəlif hüceyrə istehsal sistemlərində Kabakulak virusu və Poliovirusun yayılması daxildir (1949).

1943-cü ildə Earle L-hüceyrəli siçan fibroblast hüceyrə xəttini ilk davamlı hüceyrə xətti kimi qurdu. Bundan əlavə, 1951-ci ildə Gey tərəfindən ilk insan hüceyrə xətti yaradılmışdır ki, bu da uğurlu in vitro model və bəlkə də ən məşhur insan hüceyrə xətti olan HeLa və ya Henrietta uşaqlıq boynu xərçəngindən olan hüceyrə xəttinin olmamasıdır. Hüceyrə xətti tibbi tədqiqatlar üçün dərin gələcək faydası olan elmi nailiyyət idi və tədqiqatda istifadə edilən bir çox digər hüceyrə xətlərinin çirklənməsi ilə göstərildiyi kimi, olduqca davamlı və məhsuldar olduğu aşkar edilmişdir. Eyni zamanda, Dulbecco replikat subkulturalar yaratmaq üçün tripsindən istifadə etdi.

Peyvənd və hüceyrə mədəniyyətinin tarixi 1950-ci illərdə M. Hillemanın canlı adenovirus peyvəndini hazırlamaq üçün hansı hüceyrə substratının istifadə edilməsi ilə bağlı sualı ilə başlamışdır. Əsasən iki seçim var idi: adenovirusun yüksək titrlərə qədər böyüdüyü insan karsinomasından əldə edilən HeLa hüceyrələri və virusun yaxşı inkişaf etmədiyi ilkin meymun böyrək hüceyrələri. Hüceyrə substratının bu variantlarını nəzərdən keçirən hökumət komitəsi müəyyən etdi ki, HeLa hüceyrələri qəbuledilməzdir və peyvənd istehsalı üçün normal hüceyrələrdən istifadə edilməlidir. Əsasən standart olaraq, normallıq ilkin hüceyrələrlə əlaqələndirilirdi, daha sonra peyvəndin inkişafı üçün geniş istifadə olunurdu.

Hüceyrə substratlarında əsas inkişaf Salk inaktivləşdirilmiş poliomielit peyvəndinin (IPV) istehsalı üçün əsas meymun böyrək hüceyrələrindən istifadə edilmişdir. Trivalent öldürülmüş Salk poliomielit peyvəndi ilkin Makakus meymunlarının böyrək hüceyrə kulturalarında yetişdirilən virusdan istifadə etməklə hazırlanmışdır və 1955-ci ildə lisenziyalaşdırılmışdır. Bu peyvənd aşağıdakılarla bağlı üç təcili problemlə üzləşmişdi: poliovirus inaktivasiyasının natamamlığı, yüksək dəyişkən immunizasiya potensialı və aşkarlanması. yeni endogen çirkləndirici meymun poliomavirusu SV40. Daha sonra bu problemi aradan qaldırmaq üçün endogen SV40 virusundan təmizlənmiş Afrika Cercopithecus meymunu təqdim edildi.

SV40-a məruz qalan uşaqlar tibbi nəzarət üçün təqib edildi və 30 ildən çox müşahidədən sonra xərçəngin tezliyinin artmasına dair heç bir dəlil olmadığı qənaətinə gəldi. Buna baxmayaraq, daha gizli viruslar müəyyən edildiyi üçün qeyri-insan primatlarda endogen viruslarla bağlı narahatlıqlar davam etdi. Nəticə heyvanların qapalı və diqqətlə izlənilən koloniyalarının və bəzi hallarda ilkin hüceyrə mədəniyyətinin əldə oluna biləcəyi xüsusi patogensiz koloniyaların yaradılması idi.

Hüceyrə substratları son 60 il ərzində təkrarlanan diqqət mərkəzində olmuşdur və çox vaxt böyük narahatlıq yaranmışdır. Bu gün də diqqət mərkəzində olmaqda davam edən iki əsas məsələ yoluxucu xəstəliklərin və/və ya xərçəngin ötürülməsi potensialıdır. Hüceyrə substratı ilə bağlı ilk əsas qərar, əslində, məqbul istehsal hüceyrələrinin növlərini ilkin toxumalardan olanlarla məhdudlaşdırmaqla və insan şişlərindən əldə edilən hüceyrələrin istifadəsini qadağan etməklə, canlı viral peyvəndlər vasitəsilə xərçəngin ötürülməsinin nəzəri riskindən qaçmaq idi. HeLa kimi, bu məqsədlə.

Peyvəndin istehsalı üçün istifadə edilən hüceyrələr və məqbul

İlkin hüceyrələr
İlkin hüceyrə mədəniyyətləri (PCC) təhlükəsiz heyvanlardan və ya embrionlardan və ya embrionlardan, yeni doğulmuş heyvanlardan və ya demək olar ki, hər hansı bir növün yetkin heyvanlarından seçilmiş toxumalardan yaradıla bilər. İlkin hüceyrələr çox genişlənmir, lakin proteaz ilə dissosiasiya edilə və çoxalma üçün yeni bir qabda genişləndirilə bilər. Hüceyrə substratları üçün ilk tələblər Ümumdünya Səhiyyə Təşkilatı (ÜST) tərəfindən 1959-cu ildə klinik cəhətdən sağlam meymunların böyrəyindən əldə edilən İPV peyvəndinin istehsalı üçün dərc edilmişdir. Bu tələblər 1966-cı ildə yenidən işlənmiş və yenidən nəşr edilmişdir. Diqqətlə idarə olunan koloniyada yetişdirilən heyvanların, xüsusən də xüsusi patogendən azad olan heyvanların istifadəsi şiddətlə tövsiyə olunur.

Diploid hüceyrə xətləri
Hüceyrə substratı sahəsində növbəti böyük hadisə 1960-cı illərdə ilkin meymun böyrək hüceyrələrinə alternativ olaraq təklif edilən insan diploid hüceyrəsinin (HDC) inkişafı idi. Doktor Leonard Hayflick normal insan embrion toxumalarından bir sıra hüceyrə ştammlarını inkişaf etdirdi. HDC-lərin qəbulu normal xromosom konstitusiyasını, krio-konservləşdirilmiş banklar yaratmaq qabiliyyətini, məhdud ömrünü və heyvan modellərində şiş əmələ gətirə bilməməsini göstərən əhəmiyyətli miqdarda xarakteristika məlumatlarına əsaslanırdı. Belə xarakteristikası və liderliyi ilə diploid hüceyrə ştammı konsepsiyası Avropada qəbul edildi və bir neçə Milli Səhiyyə Orqanları vaksinlərin istifadəsi üçün Hayflick’s WI-38 hüceyrə xəttini və bir neçə il sonra MRC-5 hüceyrə xəttini təsdiqlədi.

HDC-lərlə əldə edilmiş təcrübəyə əsaslanaraq, hüceyrələrin xarakteristikası bütün yeni hüceyrə növlərinin qiymətləndirilməsində mərkəzi xüsusiyyətə çevrildi. Birləşmiş Ştatlar əvvəlcə diploid hüceyrə suşlarının insan lösemi virusu daşıya biləcəyinə dair spekulyativ qorxuya əsaslanaraq müxalifətini davam etdirdi, lakin yalnız 1972-ci ilə qədər, ABŞ Tənzimləmə Agentliyi şifahi olaraq canlı poliomielit peyvəndi istehsalı üçün WI-38 hüceyrə xəttinin istifadəsini təsdiqləyənə qədər. və 1977-ci ildə məxmərək virusuna qarşı canlı peyvənd üçün lisenziya verildi.

Davamlı hüceyrə xətləri
Normal onurğalı hüceyrələri mədəniyyətdə qeyri-müəyyən müddətə keçə bilməz. İlkin toxumanın yaşından və növündən asılı olaraq məhdud sayda hüceyrə ikiqat artdıqdan sonra, mədəni hüceyrələr bölünməyi dayandırır və sonra degenerasiyaya uğrayır və “böhran” və ya qocalma adlanan bir hadisə ilə ölürlər. Kultura zamanı istənilən vaxt hüceyrələr çevrilə bilər, yəni onlar artıq böhrana və qocalmaya məruz qalmırlar, lakin qeyri-müəyyən bir müddət ərzində subkulturasiya edilə bilərlər. Transformasiya, hüceyrələrin ölümsüzləşdiyi və “hüceyrə xətti” və ya “davamlı hüceyrə xətti” adlandığı mürəkkəb bir hadisədir, bu halda hüceyrələr subkulturasiya yolu ilə qeyri-müəyyən müddətə yayıla bilər.

Birincil hüceyrələrdən ölümsüzləşdirilmiş hüceyrə nəslini əldə etmək üçün bir neçə üsuldan istifadə edilə bilər:

  1. Normal hüceyrə mədəniyyətinin keçidlərini davam etdirin və tez-tez spontan transformasiya kimi təsvir olunan davamlı hüceyrə xəttini əldə edin (məsələn, Vero, BHK-21, CHO, MDCK)
  2. Ölümsüzləşmə kimyəvi mutagenlərlə (məsələn, QT35, LMH) müalicə ilə induksiya edilə bilər.
  3. Ölümsüzləşdirilmiş hüceyrə xətti ilə ev sahibi hüceyrə arasında hibridləşmə (məsələn, hibridoma),
  4. E1 adenovirusu (məsələn, HEK-293, PER-C6) kimi hüceyrə siklində iştirak edən ektopik ifadəli genlərlə transfeksiya;
  5. Normal hüceyrələrin qeyri-müəyyən replikasiyasını təmin etmək üçün hTERT telomeraz geni ilə transfeksiya.

Xüsusi şəraitdə müəyyən hüceyrələr kortəbii olaraq ölməz hüceyrə xətlərinə çevrilə bilirlər. İnsan papillomavirusu E6 və E7 kimi onkoproteinlər üçün ümumi tələb p53 və Rb yollarının hədəfləndiyini irəli sürsə də, hüceyrələrin ölümsüzləşməsinin mexanizmləri tam başa düşülmür. Ölümsüzləşmə prosesi zamanı törədilən genetik modifikasiyalar karyotipə təsir göstərə bilər ki, bu da hüceyrələrin aneuploid halına gəlməsi və xromosomların sayı və strukturunda anormallıqların olması ilə nəticələnə bilər.

Davamlı hüceyrə xətləri (CCL) 1970-ci illərdən bəri təhlükəsiz və effektiv bioterapevtiklərin və peyvəndlərin istehsalı üçün istifadə edilmişdir. Bu günə qədər məhdud sayda hüceyrə xəttinə Səhiyyə Orqanları tərəfindən normal toxumalardan əldə edilən CCL-lərlə məhdudlaşan vaksinlər istehsal etmək icazəsi verilmişdir.

1962-ci ildə Afrika yaşıl meymunlarından yaradılmış ilk davamlı məməli hüceyrə xətti olan Vero hüceyrə xətti hazırda peyvənd istehsalı üçün tənzimləyici orqanlar tərəfindən ən çox qəbul ediləndir. Bu, Vero mənşəli insan peyvəndlərinin 40 ilə yaxındır istifadə edilməsi ilə bağlıdır. Vero hüceyrələri mikrodaşıyıcı muncuqlarda böyük miqyaslı fermentatorlarda və serumsuz mühitdə məhsuldarlıq itkisi olmadan yetişdirilə və yoluxa bilər.

Daha sonra, 1987-ci ildə ÜST-nin Bioloji Tədqiqat Qrupunun hesabatı davamlı hüceyrə xətləri üçün şiş törətməməsi tələbini ləğv etdi. Qrup risk qiymətləndirməsində belə qənaətə gəlib "Daimi hüceyrə xətləri bioloji istehsal üçün substratlar kimi məqbuldur, lakin müəyyən bir məhsulun məqbulluğu barədə qərar qəbul edərkən məhsulların təbiətindəki və istehsal proseslərindəki fərqlər nəzərə alınmalıdır."

ÜST-nin Ekspert Komitəsi və Bioloji Standartlaşdırma üzrə Beynəlxalq Alyans (IABS) 1996-cı ildə bir məhsulun hər dozasında 10 ng şişogen olmayan CCL-nin heterojen DNT-nin olmasının təhlükəsizlik üçün əhəmiyyətsiz risk yaratdığı və “istehsal zamanı məhsulların nüvə müalicəsinin çox güman ki, mümkün olacağı” qənaətinə gəliblər. aradan qaldıracağından daha çox narahatlıq əlavə edin." Qrup belə nəticəyə gəldi ki, hər bir məhsul təhlükəsizlik və effektivlik baxımından öz üstünlükləri üzərində dayanmalıdır və davamlı hüceyrə xətlərinin istifadəsini əhatə etməyən alternativ istehsal üsullarının istifadəsi davamlı hüceyrə xəttindən əldə edilən məhsulun qəbulu və ya rədd edilməsi ilə əhəmiyyətsiz olacaqdır.

Terapevtik dərman üçün hüceyrənin qəbul edilməsinin növbəti addımı 1970-ci illərdə maraqlı bir terapevtik potensiala malik olduğu aşkar edilən interferonun (IFN) geniş miqyasda istehsal edilməli olduğu vaxt idi. O dövrdə IFN-nin yeganə mənbəyi çox məhdud məhsuldarlığa malik olan ilkin insan limfositlərindən idi. Bu problem insan lenfoma hüceyrələrinin (Namalva hüceyrə xətti) istifadəsi ilə həll edilə bilər. Bununla belə, Namalva hüceyrələrində inteqrasiya olunmuş Epstein Barr virusu və əlaqəli olmayan xərçəng ardıcıllığı var.Əhəmiyyətli müzakirələrdən sonra IFN istehsalı üçün Namalva hüceyrələrindən istifadəyə icazə vermək üçün ABŞ və Avropadakı tənzimləyici qurumlar arasında razılıq əldə edildi. Buna baxmayaraq, istehsal prosesi zamanı DNT-lərin müalicəsi və təmizlənməsi mərhələləri ilə bioloji məhsuldan bütün mümkün funksional DNT-nin xaric edilməsi lazımdır.

Monoklonal antikor texnologiyası, rekombinant DNT-nin inkişafı vasitəsilə müəyyən spesifikliyə malik antikor ifraz edə bilən davamlı hüceyrə xətlərinin inkişafına kömək etdi.

Canlı viral vaksinlərin istehsalında istifadə üçün nəzərdə tutulan ilk şiş törədən hüceyrə xətti PER.C6 hüceyrə xətti idi. O, replikasiya qüsurlu adenovirus vektorlu HİV-1 peyvəndinin hazırlanması və istehsalı üçün istifadə edilmişdir (VRBPAC 2001). Təsadüfi agentlər və qalıq hüceyrə-substrat DNT bütün yeni hüceyrə substratları üçün potensial narahatlıqlar olsa da, hüceyrə substratı şiş törətdikdə və ya şişdən törədikdə narahatlıq artır. Xüsusilə, təsadüfi agentlə çirklənmə (PER.C6 hüceyrələri sinir mənşəli olduğundan TSE ilə çirklənmə daxil olmaqla), qalıq hüceyrə-substrat DNT-nin və bütün hüceyrələrin potensial riski nəzərdən keçirilmişdir.

Nəzərdən keçirilən növbəti şiş törədən hüceyrə xətti, təsirsizləşdirilmiş qrip virusu peyvəndlərinin istehsalı üçün təklif edilən Madin-Darby it böyrəyi (MDCK) hüceyrə xətti idi (VRBPAC 2005). Bundan əlavə, canlı, zəiflədilmiş qrip virusu peyvəndinin istehsalı üçün şiş törətməyən MDCK hüceyrə xətti nəzərdən keçirilmişdir (VRBPAC 2008).
Hüceyrə DNT böyük bir təhlükəsizlik problemi olaraq ortaya çıxdı. Beləliklə, istehsal prosesi zamanı DNT-lərin müalicəsi və təmizlənməsi mərhələləri ilə bütün mümkün funksional DNT-nin bioloji məhsuldan xaric edilməsi lazımdır.

Hüceyrə substratlarının hazırkı repertuarı müəyyən növ yeni vaksinlərin istehsalı üçün qeyri-adekvatdır. Bu problemi həll etmək üçün VRBPAC (2) 2012-ci ildə qəbul etdi ki, insan şişindən əldə edilən hüceyrə xətləri viral peyvəndlərin istehsalı üçün hüceyrə substratlarının repertuarına əhəmiyyətli bir əlavə ola bilər və apriorinin istifadəsinə mane olan heç bir şey yox idi. belə hüceyrələr. Bu mövqe Avropa Dərman Agentliyi (EMA) tərəfindən təsdiqlənməyib.

İstənilən halda, xüsusi bir şiş törədən hüceyrə substratının istifadəsi klinik sınaq başlamazdan əvvəl ümumiyyətlə vaksinlər üzrə məsləhət komitəsi ilə müzakirə olunur. Xüsusilə, üç əsas təhlükəsizlik problemi həll edilməlidir: 1) peyvənddə insanlarda şiş törətmə potensialına malik qalıq canlı hüceyrələrin olması 2) hüceyrə substratından qalıq DNT-nin olması və 3) potensial mövcudluğu Adventitiv agentlərin, o cümlədən şişin fenotipinə töhfə vermiş ola biləcək əlavə virusların.

Həşərat və quş hüceyrələri
İlk davamlı böyüyən həşərat hüceyrə kulturları təxminən 1960-cı ildə lepidoptera həşəratlarından yaradılmışdır. O vaxtdan bəri Spodoptera frugiperda Sf9 və Trichoplusia ni Hi-5 hüceyrə xətləri ən çox istifadə olunur. Son ikisi bakulovirusa həssasdır Autographa californica çox kapsidli nukleopolihedrovirus və xarici genlərin ifadəsi üçün, məsələn, məməlilərin hüceyrələri üçün gen çatdırma vektorları üçün zülallar istehsal etmək üçün subunit vaksinlərin istehsalı üçün istifadə olunur. Tez-tez BEVS olaraq adlandırılan bakulovirus-həşərat hüceyrə ifadə sistemi, bioloji aktiv zülallara sürətli çıxışı təmin edən kompleks zülallar və virusa bənzər hissəciklər (VLPs) antigenləri istehsal etmək üçün tanınmış bir vasitədir.

Həşərat hüceyrələrində istehsal olunan ilk kommersiya peyvəndi donuz taunu virusu (CSFV) peyvəndi idi və insanlar üçün tibb üçün Avropa Dərman Agentliyi 2007-ci ildə uşaqlıq boynu xərçənginin qarşısının alınması üçün göstərilən ikivalent insan papilloma virusu peyvəndini lisenziyalaşdırdı.

Quş hüceyrələrinə gəldikdə, spontan ölümsüzləşmə yolu ilə embrion gövdə (ES) hüceyrələrindən sabit ördək hüceyrə xətti EB66 yaradılmışdır. Xüsusi bir mədəniyyət mühitində sabitləşdikdən sonra, bu hüceyrələrin digər ES hüceyrələrinə bənzər ultra quruluşa, böyük nüvəyə, hüceyrə səthində ES-ə məxsus markerlərin ifadəsinə, stabil karyotipə və gözlənilən telomeraz aktivliyini ifadə etməyə imkan verdiyi aşkar edilmişdir. ES hüceyrələrindən əldə edilən hüceyrə xətti. Ördək hüceyrə xəttinin ikinci kateqoriyası adenovirus tip 5-in E1 genindən istifadə edilməklə ölümsüzləşdirilmiş və zərdabsız mühitlərdə süspansiyon kulturalarında yetişdirilən AGE1.CR1-dir.

Kök hüceyrələri
Kök Hüceyrələr (KH) demək olar ki, bütün insan toxumalarının differensiallaşdırılmış hüceyrə tiplərinin hüceyrə progenitorlarını istehsal etmək qabiliyyətini saxlayan üstünlük təşkil edən kök hüceyrə populyasiyasını saxlamaqla digər hüceyrə növlərindən fərqlənir.

Pluripotent SC-lər yaxşı xarakterizə olunur və virus məhsuldarlığı üçün çox maraqlı xüsusiyyətlər göstərən müxtəlif toxuma spesifik hüceyrələrində fərqlənə bilər.

Fərqlənmiş hüceyrə xətlərinə gəldikdə isə, transformasiya olunmamış təbiət vaksin istehsalı üçün ilkin şərt kimi qəbul edilməlidir.

Peyvənd istehsalı üçün hüceyrə mədəniyyəti texnologiyasının gələcəyi

Peyvəndlər əsasən profilaktik, bəzən isə terapevtik xarakter daşıyır, onların inkişafını və kommersiyalaşdırılmasını kompleks edən bio-farmasötik məhsulları təmsil edir. ÜST peyvənd alan əhalinin təhlükəsizliyini təmin etmək üçün hesabat araşdırmalarını tələb edir.

Hal-hazırda təxminən 20 peyvənd istifadə olunur ki, bu da Jenner tərəfindən 1796-cı ildə hazırlanmış ilk insan peyvəndindən bu günə qədər bildirilən az sayda məhsulu əks etdirir. Bu, yeni peyvəndlərin hazırlanmasında qarşıya çıxan əsas çətinlikləri və xəstələrə maksimum təhlükəsizlik və effektivliyi təmin etmək üçün lazım olan çoxlu sayda sınaq və klinik analizləri göstərir. Molekulyar biologiya, biotexnologiya, DNT rekombinasiyası və genomikadan istifadə yoluxucu agentlər üçün yeni vaksinlərin hazırlanmasında böyük rol oynaya bilər.

Poliomielit, qızılca, parotit, məxmərək, suçiçəyi və son zamanlarda Rotavirus, HPV üçün peyvəndlər hazırda hüceyrə kulturalarından istifadə etməklə istehsal olunur. H5N1 pandemiya təhlükəsi ilə əlaqədar olaraq, qripə qarşı peyvəndlər üçün hüceyrə mədəniyyətindən istifadə üzrə tədqiqatlar hazırda məməlilər, quşlar və həşərat hüceyrələrinə əsaslanan proseslərin, həmçinin bitki hüceyrə xəttinin və bitkilərin istifadəsi də daxil olmaqla, Birləşmiş Ştatlar hökuməti tərəfindən maliyyələşdirilir. Nəticədə, hazırda bütün yollar açıqdır, o cümlədən yeni vektorlarla hazırlanmış rekombinant DNT əsaslı vaksinlər və yeni köməkçi maddələrin istifadəsi sahələrindən gələn yeni anlayışlar.

Nəticədə, peyvəndin işlənib hazırlanmasını və istehsalını sadələşdirmək üçün ən müasir texnologiyalar getdikcə mühüm əhəmiyyət kəsb edir. Peyvəndlərin istehsalı ilə digər biofarmasötiklər arasındakı mühüm fərq patogenlər və patogen antigenlərlə işləmək üçün risk-təhlükəsizlik məsələsidir. Xam bioloji materialdan təmizlənmiş bütün biomolekullarda olduğu kimi, çirkləndiricilərin (məsələn, DNT, zülal və ya süzülən kimi ana hüceyrədən törəmələr) çıxarılması sənədləşdirilməlidir. Bununla belə, təsadüfi virusların aradan qaldırılması və ya təsirsiz hala salınması unikal problem olaraq qalır. Hüceyrə mədəniyyəti üsullarının istifadəsi ilə bağlı risklərin qiymətləndirilməsi 1950-ci illərdə müəyyən edilmiş risklərlə eynidir: ötürülən agentlər (məsələn, virus) və hüceyrə komponentləri (məsələn, DNT, HCP).

Buna baxmayaraq, inkişaf prosedurlarında elmi biliklər və mürəkkəb təhlillə prosesin səciyyələndirilməsi təkcə məhsuldarlığı artırmaq üçün deyil, həm də son məhsulun keyfiyyətini müəyyən etmək üçün vacibdir. Tənzimləmə nöqteyi-nəzərindən, Dizayn üzrə Keyfiyyət (QbD) və Proses Analitik Testi (PAT) bir çox peyvənd prosesinə effektiv şəkildə tətbiq oluna bilən mühüm təşəbbüslərdir.

Hüceyrə substratlarının qəbulu onların hər bir hal üzrə qiymətləndirilməsi və səciyyələndirilməsi, həmçinin istehsala nəzarət yolu ilə riskin azaldılması kimi müxtəlif amilləri nəzərə almaqla risk və fayda təhlili əsasında məhsulun məqbulluğunu nəzərə almaqla əldə edilə bilər. istehsal prosesi, xəstəliyin ciddiliyi və digər müalicə vasitələrinin mövcudluğu.

Qeydlər:
1 . S. Plotkin Vaksinlərin beşinci nəşrində
2 . Peyvəndlər və Əlaqədar Bioloji Məhsullar Məsləhət Komitəsi


Genetik qorunma üçün Jining Qara Boz keçidən əldə edilən fibroblast hüceyrə xəttinin yaradılması və xarakteristikası

Qoşma mədəniyyəti və dondurma biotexnikalarından istifadə edərək Jining Qara Boz (JBG) keçisindən qulaq marjinal fibroblast hüceyrə bankı yaradılmışdır. Bu banka 32 qulaq nümunəsi (15 kişi və 17 qadın) daxil idi və 168 kriogen yolla qorunmuş flakon ehtiyatına malikdir, hər flakonda millilitrdə 4,0 × 10 6 hüceyrə var. Keyfiyyəti və bioloji xüsusiyyətləri yoxlanılan bankın hüceyrələri in vitroda becərildikdə tipik fibroblast morfologiyası göstərmişdir. Böyümə əyrisi gizli fazadan, loqarifmik artım fazasından və stasionar fazadan, hüceyrə populyasiyasının ikiqat artma vaxtından (PDT) 48 saat ibarət böyümə əyrisindən ibarət idi. Xromosom analizi göstərdi ki, diploid xromosom sayına (60) malik hüceyrələrin tezliyi 98,65 ± 2,89% təşkil edib və mikrob çirklənməsi (bakteriya, epifit, virus və ya mikoplazma) aşkar edilməyib. Bundan əlavə, laktat dehidrogenaz (LDH) və malat dehidrogenaz (MDH) zimoqrafiyası bu hüceyrə bankının çarpaz çirklənmədən azad olduğunu göstərdi. Transfeksiyadan sonra 24, 48 və 72 saatda pEGFP-C1, pEGFP-N3, pEYFP-N1, pECFP-N1, pECFP-mito və pDsRed1-N1-in ifadə effektivliyi 11,8% ilə 56,3% arasında idi. Transfeksiyadan 24 saat sonra bəzi kriptomer vezikülləri istisna olmaqla, flüoresan sitoplazmada və nüvədə yaxşı paylanmış müşahidə edilə bilər. Bu yeni yaradılmış hüceyrə xətləri American Type Culture Collection tərəfindən müəyyən edilmiş bütün keyfiyyətə nəzarət standartlarına cavab verir. Biz mühüm və nəsli kəsilməkdə olan heyvan cinsinin genetik ehtiyatlarının qorunması üçün yeni üsul tətbiq etdik. JBG keçisindən qurduğumuz fibroblast bankı həmçinin molekulyar və hüceyrə biologiyası tətbiqlərindən istifadə edəcək gələcək tədqiqatlar üçün əvəzolunmaz maddi mənbə təmin edir.


Layihə iş axını

Bu və digər çətinliklərə baxmayaraq, CIRM Human iPSC Initiative layihəsi 2013-cü il dekabrın 1-də başladı və ilk donor nümunəsi 2014-cü ilin martında gəldi. Layihənin iş prosesinin icmalı Şəkil 1-də göstərilmişdir.

Qısacası, Toxuma Kollektorları nümunələri gecələməzdən əvvəl Coriell-ə ​​Nümunə Göndərmə Formaları göndərirlər ki, Coriell donorları layihə məlumat bazasına daxil edə bilsin. Qan (nümunələrin 80%-i) periferik qanın mononükleer hüceyrələrinin (PBMC) təcrid olunması üçün AllCells, Inc (Alameda, CA) şirkətinə göndərilir. Tək laboratoriyanın təcrid olunmuş PBMC-lərin olması dəyişkənliyi azaldacağı hiss olunurdu.

Əlaqədar serum və plazma nümunələri HBV, HCV və HİV üçün yoxlanılır. Müsbət nümunələr məhv edilir və donorlara əyalət və mahal qanunlarına uyğun olaraq məlumat verilir. Dəri zərbələri emal üçün CDI-yə təhvil vermək üçün birbaşa Novatodakı Coriell-ə ​​göndərilir. Onların tərkibində çox az qan olduğundan, dəri zərbələri yoluxucu xəstəlik testinə (IDT) məruz qalmır (qeyd edək ki, Ceki Maherin laboratoriyasından alınan bütün HCV müsbət donor nümunələri dəri zərbələri kimi göndərilir). Coriell, CDI onları yenidən proqramlaşdırma üçün tələb edənə qədər AllCells tərəfindən təcrid olunmuş PBMC-lərlə birlikdə dəri zərbələrindən əmələ gələn fibroblastları saxlayır. 24 və ya 48 nümunədən ibarət kohortlar CDI-nin patentli inteqrasiya olunmayan epizomal vektor sistemindən istifadə edərək paralel olaraq yenidən proqramlaşdırılır.

iPSC klonları əl ilə seçilir və 5-ci keçidə qədər robot üsulla işlənir, üç-altı klon QC analizləri panelinə məruz qalır, kriogen yolla qorunur və Repozitoriyaya köçürülür. Tələb olunduqda, Coriell 10-cu keçidə genişlənmək üçün CDI-yə bir keçid 5 klon təqdim edir. Keçid 10 xanası daha sonra Paylama Xətləri kimi dondurulur. Məhz bu Dağıtım Xətləri (hər donor üçün bir klon) Repozitoriya satışa təqdim edəcəkdir.

Başlandıqdan bəri layihə əhəmiyyətli irəliləyiş əldə edir və ilk 300 iPSC klonu 1 sentyabr 2015-ci ildə təqdim edildi. Daha 450 xətt 1 mart 2016-cı il tarixinədək yerləşdiriləcək. Xətləri Coriell saytından (15) sifariş etmək olar. sətirlər üçün demoqrafik və xəstəlik məlumatlarını siyahıya salmaqla yanaşı, qiymət məlumatlarını və müvafiq Material Transfer Müqaviləsinə (bütün istifadəçilər tərəfindən tələb olunur) və patent lisenziyalarına (yalnız kommersiya istifadəçiləri üçün) keçidlər təqdim edəcəkdir.


Nəticələr

Nisbi yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyinin daha yaxşı ölçülməsini təşviq etmək üçün yenidən proqramlaşdırma prosesində xarici dəyişənlərə nəzarət etməyə çalışdıq. Bu konsepsiyaya uyğun olaraq, bütün prosedurlar və təhlillər bir qrup daxilində bütün hüceyrə xətlərində və ən azı üç ayrı təcrübədə paralel olaraq həyata keçirildi. Fibroblastlar giriş hüceyrə növü olaraq seçilmişdir, çünki onlar əksər yenidən proqramlaşdırma tədqiqatları üçün xammal kimi geniş şəkildə istifadə edilmişdir, asanlıqla qurulur və bir çox keçidlər üçün genişləndirilir (hüceyrə transformasiyasına ehtiyac olmadan), yapışdırılır və kriogen olaraq effektiv şəkildə qorunur. . Fibroblast xətləri iki növ insan və siçandan əldə edilmişdir. Tədqiqat üçün insan fibroblastları seçilmişdir, çünki onlar ən birbaşa klinik əhəmiyyətə malikdirlər və siçan fibroblastları seçilmişdir, çünki onların bir neçə çıxış hüceyrə tipinə yenidən proqramlaşdırma qabiliyyəti göstərilmişdir və biz birdən çox izogen fibroblast xətləri qura bilmişik. yüksək nəzarət şəraitində donor heyvan. Hər iki hüceyrə qrupundan istifadə edərək, dəyişkən morfologiyaya və mənşə toxumasına malik fibroblast xətləri olan, lakin tək bir subyektdən olan bir çox fərddən oxşar morfoloji xüsusiyyətlərə malik fibroblast xətlərini müqayisə edə bildik. Nəticələrimizi insan və ya baytarlıq təbabətindəki tətbiqlərlə daha yaxşı əlaqələndirmək üçün ilk növbədə qeyri-embrion hüceyrələrlə işləməyi seçdik, çünki yaşlı subyektlər hüceyrə dəyişdirmə və ya transplantasiya üçün yenidən proqramlaşdırma əsaslı terapiyanın əsas hədəfi olma ehtimalı daha yüksəkdir.

Giriş xətlərinin qurulması

Təhlil üçün istifadə edilən insan fibroblast xətləri Cədvəl 1-də (üst panel) göstərilmişdir. Təhlil üçün xətlər bir neçə ümumi meyar əsasında seçilmişdir. Mədəniyyətdə güclü böyüməni nümayiş etdirmək üçün lazım olan xətlər yaxşı qurulmalıdır (#x0003keçid 8 (P8)), homogen morfologiya nümayiş etdirməlidir (Əlavə Şəkil S1A) və mitotik qocalmadan ən azı dörd keçid olmalıdır. Xətlərin əksəriyyəti məlum xəstəliyi olmayan donor subyektlərindən idi, lakin ikisi Rett sindromu və şizofreniya diaqnozu qoyulmuş nevroloji pozğunluqları olan şəxslərdən daxil edilmişdir. Yeddi insan fibroblast xətti yalnız qismən təhlilə məruz qalan iki əlavə xətt ilə tam xarakteristikaya və təhlilə məruz qaldı, çünki onlar daxil olmaq üçün bütün meyarlara cavab vermirdilər.

Genetik homojenliyin yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyinə təsirini araşdırmaq üçün bir donor heyvandan siçan fibroblast xətləri yaradıldı (Cədvəl 1, alt panel). Ayrı-ayrı siçan xətlərinin funksional olaraq bütün xətlər bir eksplantdan əldə edildiyi təqdirdə baş verə biləcək ikinci dərəcəli xətlərə və ya subklonlara yaxınlaşmamasını təmin etmək üçün fibroblast xətlərinin yaradılması üçün səkkiz müxtəlif siçan orqanını yığdıq (Əlavə Şəkil S1B) və sonra yalnız onları seçdik. açıq-aydın qeyri-fibroblastik hüceyrələr və ardıcıl olaraq vahid fibroblastik morfologiya nümayiş etdirməyən xətlər (Əlavə Şəkil S1C). Xətlər həmçinin böyümə, keçid və donma/ərimə zamanı sağ qalma qabiliyyətini nümayiş etdirməli idi ki, bu da onları digər xətlərlə yan-yana saxlamağa imkan verdi. Beləliklə, təxminən 50 sətir tədricən böyümə xüsusiyyətlərinə və morfologiyasına görə ən tipik olan 12 sətirə çevrildi. İnsan cizgilərindən fərqli olaraq, siçan xətləri mədəniyyətdə ilk gündən etibarən eyni şəkildə yaradılıb və qorunub saxlanılıb, keçib, qidalanıb, dondurulub, əriyib və hər cəhətdən yan-yana becərilib. Nəhayət, yeddi müxtəlif toxuma mənbəyindən əldə edilən bu xətlər (beyin toxuması möhkəm fibroblast mədəniyyətlərinə səbəb olmadı) təcrübələrdə istifadə üçün P8-də çoxlu alikotlarda donduruldu.

İnsan və siçan fibroblast xətlərinin fenotipi fibroblastla əlaqəli mRNA-ların bolluğunu və digər diferensiallaşdırılmış və ya törəmə hüceyrə növlərinin göstəriciləri üçün əhəmiyyətli siqnalın olmamasını təsdiqləmək üçün kəmiyyət real vaxt rejimində polimeraza zəncirvari reaksiya (RT-PCR) analizi ilə daha da müəyyən edilmişdir. Bütün fibroblast xətləri iki istisna olmaqla, fibroblastla əlaqəli kollagen tip 1㬒, vimentin, fibronektin, fibrillin I və fibulin V bolluğunu nümayiş etdirdi: siçan xətləri HE4 və KI3 siçan kollagen növü 1; üçün dəfələrlə mənfi sınaqdan keçirilmişdir. HE4 də zəif vimentin immunopozitivliyini nümayiş etdirdi (aşağıya bax), lakin hər iki xətt bəzi fibroblast markerləri üçün müsbət və kök hüceyrə növlərinin göstəriciləri üçün mənfi olduğundan, hər iki xətt bu xəbərdarlıq nəzərə alınmaqla tədqiqatda saxlanıldı. Digər ümumi çirkləndirici hüceyrə növləri (yəni, keratinositlər (keratin 14) və endotel hüceyrələri (PECAM)) və ya miogen və ya neyrojenik progenitor tipli hüceyrələr (yəni, müvafiq olaraq MyoD, Myf5 və FoxG1, Sox2) üçün mRNA-lar aşkar edilməmişdir (Əlavə Şəkil S2, Cədvəl 1-də ümumiləşdirilmişdir).

Fərdi hüceyrələr səviyyəsində xətlərimizi daha da xarakterizə etmək üçün hər bir xətt flüoresan immunositokimya ilə fibroblastla əlaqəli markerlərin və ya kök hüceyrə növlərinin markerlərinin ifadəsi üçün araşdırıldı. Sox-2 və nestin kök hüceyrə markerləri olaraq seçildi, çünki bu markerlər pluripotent kök hüceyrələr, sinir kök hüceyrələri və mezenximal kök hüceyrələr və peyk hüceyrələr kimi əzələ prekursorları daxil olmaqla kök hüceyrənin bir çox siniflərini etiketləyir, lakin əhəmiyyətli səviyyələrdə ifadə olunmur. fibroblastlarda [17�]. Nəticələr (həmçinin Cədvəl 1-də ümumiləşdirilmişdir) göstərdi ki, mahiyyətcə bütün hüceyrələr fibroblastla əlaqəli markerlər vimentin və fibronektin üçün immunopozitiv görünür və insan sinirinin nəzarət mədəniyyətlərində asanlıqla müşahidə edilən kök hüceyrə markerləri nestin və Sox-2 üçün heç bir hüceyrə müsbət görünmür. kök hüceyrələr (Əlavə Şəkil S3A, B). Seçilmiş siçan xətlərinin paralel təhlili (Əlavə Şəkil S3C, D) zəif vimentin boyanmasını göstərən HE4 istisna olmaqla, insan xətlərinə bənzər bir nəticə göstərdi. Əlavə RT-PZR və ADF və AUT kimi xətlərin immunsitokimyəvi analizi, kök və əcdad hüceyrə növlərinin digər markerlərini, o cümlədən sinir uclarından əmələ gələn hüceyrələr və pluripotent hüceyrə növlərini tədqiq edərək, fibroblast xətlərimizdə digər progenitor hüceyrə növlərinin heç bir əlamətini aşkar etmədi.

INC-lərə çevrilmə

iNC-lər bir neçə səbəbə görə müqayisəli birbaşa yenidən proqramlaşdırmanın effektivliyini yoxlamaq üçün konversiya hüceyrə növü kimi seçilmişdir. Birincisi, bir neçə müstəqil laboratoriyanın oxşar metodologiyalardan istifadə edərək iNC-lərin istehsalını təsdiqləməsi idi [7,24�]. İkincisi, iNC-lərin neyron fenotipinin və hüceyrə morfologiyasındakı dəyişikliklərin fərqli markerlər dəstini göstərməsi idi ki, bu da onları giriş fibroblastlarından asanlıqla fərqləndirməyə imkan verəcəkdir. Üçüncüsü, bu günə qədər olan dəlillər göstərirdi ki, onlar aralıq hüceyrə növü yaratmadan və ya hüceyrə bölünməsi və progenitor koloniyanın formalaşması tələbi olmadan birbaşa giriş hüceyrələrindən istehsal olunduğundan, hər bir iNC fərdi yenidən proqramlaşdırma hadisəsini təmsil edir.

iNC çevrilməsi üçün insan və siçan fibroblast mədəniyyətləri YFP-də sxematik şəkildə göstərildiyi kimi insan mənşəli ASCL1, POU3F2, ZIC1, MYT1L və ya NeuroD1 [7,25] nörogen faktorlarını kodlayan MMLV əsaslı retroviral vektorun birləşmələri ilə yoluxmuşdur. Şəkil S4. Proqnozlaşdırıldığı kimi, YFP-füzyon zülallarının hamısı ilk növbədə nüvədə lokallaşdırılmış, bəziləri ləkəli görünüş, digərləri isə daha diffuz görünür (Şəkil 1A). ASCL1-YFP ümumiyyətlə bir və ya iki parlaq punktuasiya gövdəsi olan zəif diffuz nüvə flüoresansı kimi təqdim olunur. Pilot tədqiqatlar göstərdi ki, ASCL1 və POU3F2 ya ZIC1, ya da MYT1L/ND ilə birləşərək, həm insan, həm də siçan mədəniyyətlərində ya fetal, həm də yetkin fibroblastlardan istifadə edərək çoxlu TUJ1-müsbət iNCs əmələ gətirir, halbuki hər bir nörogen faktorla yoluxmuş hüceyrələr tək başına çox az iNC əmələ gətirir (Şəkil 1B). ). Sınaq yoluxmuş hüceyrələr və ya yalnız YFP vektoru ilə yoluxmuş və eyni şəraitdə yetişdirilmiş hüceyrələr neyron kimi morfologiyaya malik güclü immunoreaktiv TUJ1-müsbət hüceyrələr yaratmadı (Əlavə Şəkil S5A). Daha əvvəl təsvir edildiyi kimi, siçan və insan iNC-lərinin nəsli arasındakı əsas fərq yetkinlik dərəcəsi idi [7,24�]. Nisbətən yetkin morfologiyaya malik siçan iNC-ləri bəzən 4-cü gündə müşahidə edilsə də və infeksiyadan sonrakı 10-cu gündə maksimal differensiasiyaya çatsa da, insan iNC yetkinliyi daha mütərəqqi görünür, 8-ci günlərdə hüceyrələr çox qısa bir hüceyrə və yuvarlaqlaşdırılmış soma nümayiş etdirir. 7� μm proseslər, 18-ci gündə daha uzun proseslər və 24-cü günə qədər daha mürəkkəb budaqlanma və onurğaya bənzər proyeksiyalarla uzun proseslər (Əlavə Şəkil S5B, C). Uzadılmış prosesləri göstərən yetkin iNC-lər (soma uzunluqları) TUJ1-ə əlavə olaraq, MAP2a/b, sinapsin 1, doublekortin, neyrofilament 300 kDa və digərləri də daxil olmaqla, yetkin neyronların çoxsaylı markerləri üçün müsbət idi. D . iNC-lər həmçinin TTX-ə həssas Na+ cərəyanları və fəaliyyət potensialları kimi elektrofizioloji xüsusiyyətlər nümayiş etdirdilər ki, bunlar insan ES hüceyrəsindən əldə edilən insan sinir progenitor hüceyrələrindən (NPC) eyni şəraitdə yaradılan insan neyronlarından mahiyyətcə fərqlənmir (Əlavə Şəkil S5D).

Siçan və insan fibroblast xətlərinin induksiya edilmiş sinir hüceyrəsinə (iNC) çevrilməsi. (A) HEK hüceyrələri etiketləndiyi kimi iNC çevrilməsi üçün YFP füzyon zülalı ilə transfeksiya edilmişdir. Faza-kontrast təsvirlər yuxarı panellərdə, müvafiq flüoresan təsvirlər isə panellərdədir aşağı panellər. (B) Siçan embrion fibroblastları fərdi amillərlə (etiketləndiyi kimi) yoluxmuş və β-III-tubulin/TUJ1 üçün boyanmışdır. qırmızı (yuxarı panellər). Zic1/Ascl1/Pou3f2 (ZAP) və ya Myt1L/Ascl1/Pou3f2 (MAP)+NeuroD1 (MAPN) birləşmələri ilə yoluxmuş siçan (MEFs) və ya insan fibroblastları (FET) (aşağı panellər). Yaşıl floresans yenidən proqramlaşdırma amil(lər)inin ifadəsini göstərir. Mavi rəng DNT-nin bis-benzimid nüvə boyanmasıdır. Daxildir var mavi kanal çıxarıldı və yaşıl kanal bütün iNC-lərin nüvəsində YFP-amil ifadəsini göstərmək üçün intensivləşdi. (C) Çox sinir markerləri üçün infeksiyadan sonrakı 10-cu gündə MEF-lərdən istehsal olunan siçan iNC-ləri (qırmızı), o cümlədən MAP2, pan-neyrofilament (NF), doublecortin (DCX) və ya sinapsin I (SYN). β-III-tubulin/TUJ1() üçün immuno-boyanmış tipik iNC morfologiyası ilə yetkin siçan fibroblast xətlərindən (etiketləndiyi kimi) istehsal edilən iNC-lər.qırmızı). (D) İnfeksiyadan sonrakı 24-cü gündə tipik morfologiyaya malik insan iNC-ləri və bir çox neyronal markerlər üçün immuno-boyanmışdır. (C) PSD95-ə əlavə olaraq, GABA reseptoru β 3 (GABAR-B3) və GAD1 (etiketli). GABAR-B3 və GAD1 iNC-lər DAB boyanması ilə birləşdirilmiş immunoperoksidaza ikincili antikorundan istifadə edərək etiketlənmişdir. Əgər başqa cür etiketlənməyibsə, miqyas çubuqları 10 μm-dir. (E) Siçan fibroblast xətlərinin iNC-lərə nisbi çevrilməsi məhsul yığımı zamanı hüceyrə sayının funksiyası kimi hesablanır. Hər qrup daxilində konversiyanın ən yüksək effektivliyi 100 dəyərinə təyin edilmişdir. Barlar orta göstəricinin standart xətasını göstərir (SEM). (F) E-də olduğu kimi, insan fibroblast xətləri üçün. (G) E-də olduğu kimi, lakin erkən (FEE) və ya gec (FEL) faktor ifadəsi faktoru olan siçan fibroblast xətlərinin nisbi çevrilməsini göstərir. Pearson məhsul-moment korrelyasiyası (r) və P-dəyər (P) iki üsul üçün göstərilir. ANOVA (INF) xətlərin iNC çevrilməsi üçün median dəyər fərqlərinin (MVD) təsadüfən baş verməsi ehtimalını göstərir. (H) kimi G, insan fibroblast xətləri üçün. Rəngli şəkilləri onlayn olaraq www.liebertpub.com/scd saytından əldə etmək olar

İlkin fibroblast xətlərinin sinir hüceyrələrinə yenidən proqramlaşdırılmasında variasiyanın olub-olmadığını və hansı dərəcədə dəyişdiyini müəyyən etmək üçün bütün xətlər yan-yana infeksiya və mədəniyyət üçün eyni sıxlıqda əridilmiş, keçilmiş və örtülmüşdür. Siçan hüceyrələri üçün 12-ci gündə və insan hüceyrələri üçün 24-cü gündə, çevrilmiş hüceyrələrin immunokimyəvi boyanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün paralel olaraq transduksiya edilmiş və nəzarət mədəniyyətləri yığılmışdır. Morfoloji xüsusiyyətlərinə və insan ES-dən əldə edilən NPC-lərdən yan-yana yaradılan neyronlardan mahiyyətcə fərqlənməyən proseslərə malik olan iNC-lər sınaqdan keçirilmiş bütün siçan və insan fibroblast xətlərində müşahidə edildi (Əlavə Şəkil S6A, B), baxmayaraq ki, bəzi sətirlərdə onlar nadir və ya bəzən daha qısa şəkildə göstərilirdi. , daha az yetkin proseslər (yəni, SAF, LU6, TE5). Çıxış hüceyrələrinin çevrilməmiş xanalara qarşı sadə faizi kimi hesablanan konversiya effektivliyi bu hesabatda olanlara oxşar üsullardan istifadə etməklə iNC çevrilməsinin dərc edilmiş hesabatlarına uyğun idi [7,10,25]. iNC-lərə maksimum çevrilmə səmərəliliyi böyüklər üçün siçan fibroblastları (TA4) üçün 0,72% ଐ,08% və insan hüceyrələri üçün (RET) 1,07% ଐ,18% idi. Çıxış hüceyrələrinin çevrilməmiş hüceyrələrə qarşı sadə faizi kimi hesablanan bu çevrilmə səmərəliliyi, eyni və ya fərqli amillər kombinasiyasından istifadə edərək 2% dönüşüm hesabat verən dərc edilmiş tədqiqatlardan az idi [7,24�]. Yenidən proqramlaşdırmanın səmərəliliyinin azalması faktorların çatdırılmasının qiymətləndirilməsini asanlaşdırmaq üçün YFP füzyon zülallarından istifadə etmək üçün mübadilə ola bilər. Hər halda, təcrübələrimizdə geri qaytarılan hüceyrələrin sayı və onların induksiya edilmiş neyronların markerlərini və xüsusiyyətlərini göstərmə dərəcəsi fibroblast xətlərimiz arasında iNC çevrilməsini müqayisə etmək üçün kifayət qədər idi.

Şəkil 1E və F-də göstərildiyi kimi, nisbi yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyi hər sətirdə yenidən proqramlaşdırılmış hüceyrələrin göstəricisi olan qırmızı flüoresan dəyərini məhsul yığımı zamanı mövcud olan ümumi hüceyrələrin göstəricisi olan Hoechst 33342 flüoresans dəyərinə bölmək yolu ilə hesablana bilər. Bu şəkildə hesablanmış nisbi yenidən proqramlaşdırma həm siçan, həm də insan mənşəli hüceyrə xətləri arasında dramatik fərqləri göstərir və bu, əksər nəşr olunan hesabatlarda yenidən proqramlaşdırmanın səmərəliliyini ölçmək üçün istifadə edilən üsuldur. Dönüşüm səmərəliliyinin müəyyən edilməsinin bu metodunun məhdudiyyəti ondan ibarətdir ki, qeyri-bərabərliyin naməlum dərəcəsi amilin çatdırılması və istehsalındakı fərqlərdən qaynaqlana bilər. Viral ötürülmə və amil ifadəsi iki şəkildə yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyinin hesablanmasına daxil edilmişdir. �” adlandırılan birincisi, mahiyyətcə nisbi infeksiya effektivliyinin müəyyən edilməsi idi. Təhlildə istifadə edilən hər bir xətt təxminən 0,5 MOI-də nüvə lokallaşdırılmış YFP virusu ilə yoluxmuş və sonra infeksiyadan sonrakı 4-cü gündə bütün hüceyrələrin bir hissəsi kimi sarı flüoresan nüvəli hüceyrələrin sayını müəyyən etmək üçün hesablanmışdır. Hər bir xəttin virusu qəbul etmək və infeksiyadan sonra nisbətən erkən müsbət kimi qiymətləndirilməsi üçün kifayət qədər səviyyələrdə ifadə etmək üçün nisbi tutumu, yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyinin hesablanmasına amil ötürülməsinin effektivliyini daxil etmək üçün bir vasitə kimi istifadə edilə bilər.

Faktor ifadəsinin gec olması (FEL) məhsul yığımı zamanı transgenlər tərəfindən istehsal olunan YFP flüoresansının səviyyəsi ilə müəyyən edilən amil ifadəsini ölçmək üçün alternativ üsul idi. Bu mərhələdə flüoresan siqnal FEE-nin hesablanmasında istifadə edilən hüceyrələrə nisbətən daha az vahid idi. Məhsul yığımı zamanı iNC mədəniyyətlərində YFP siqnalı tez-tez nöqtəli və ya zəif idi və müsbət hüceyrələrin faizi kimi dəqiq ölçülə bilməzdi, buna görə də FEL məhsul yığımı zamanı YFP siqnalının ümumi intensivliyi kimi ölçüldü. müsbət hüceyrələrin faizi. Həm FEE, həm də FEL-in öz fərdi üstünlükləri var, lakin hər ikisi yenidən proqramlaşdırma prosesinin müxtəlif mərhələlərində ölçülən amil ifadəsinin yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyinin yekun müəyyən edilməsinə təsir göstərə bilməsi ehtimalını həll etmək üçün təhlilimizə daxil edilmişdir.

1G və H-də göstərildiyi kimi, amil ifadəsini yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyinin hesablanmasına faktorinq etdikdən sonra, transgen ifadəsinin necə faktorlaşdırılmasından asılı olmayaraq, həm siçan, həm də insan mənşəli hüceyrələrin yenidən proqramlaşdırma imkanlarında aydın xəttdən xəttə dəyişiklik hələ də müşahidə edilmişdir. səmərəliliyin hesablanmasında. Siçan hüceyrə xəttlərində hər iki standartdan istifadə etməklə hesablanmış iNC yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyi arasında güclü və əhəmiyyətli bir əlaqə var idi (r=0.975, Pπ.0001) və oxşar tendensiya insan xətlərində müşahidə edildi (r=0.664, P=0,104). Daha da əhəmiyyətlisi, insan iNC mədəniyyətləri daxilində variasiyanın təhlili FEE və ya FEL-dən istifadə edən xətlər arasında median yenidən proqramlaşdırma fərqlərinin təsadüfən gözləniləndən əhəmiyyətli dərəcədə böyük olduğunu ortaya qoydu (FEE). P=0,005, FEL P=0,006). Siçan xətlərində iNC yenidən proqramlaşdırma effektivliyi arasındakı fərqlər yalnız əhəmiyyətli idi P=0,150 (FEE) və P=0,108 (FEL), lakin eyni istiqamətdə trend olduğu ortaya çıxdı. Qeyd edilib ki, amil ifadəsinin yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyinin hesablanmasına daxil edilməsi ən yaxşı və ən pis çeviricilər üçün dəyərləri kəskin şəkildə dəyişməsə də, paketin ortasındakı xətlər daha kəskin şəkildə təsirlənib. Eyni şəkildə, aralıq konvertasiya effektivliyi olan xətlər də FEE və ya FEL-in istifadəsindən asılı olaraq daha çox variasiya nümayiş etdirdi.

İnduksiya edilmiş skelet əzələsinə çevrilmə

İkinci yenidən proqramlaşdırma rejimi, iNC yenidən proqramlaşdırma ilə müşahidə olunan xəttdən xəttə dəyişkənliyin alternativ rejimdən istifadə etməklə müşahidə edilib-edilməyəcəyini müəyyən etmək və iNC-nin spesifikasiyasına ən uyğun olan eyni xətlərin ikinci taleyi üçün ən çox proqramlaşdırıla bilənlər olub-olmadığını müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir. ISMC-lərə yenidən proqramlaşdırma skelet əzələsinin şəxsiyyətini təşviq edən və neyrojenik amillərlə olduğu kimi YFP füzyon zülalları kimi ifadə edilən dörd miyogen faktordan istifadə etməklə həyata keçirilmişdir (Şəkil 2A). Bir amil, fibroblastik hüceyrələrin miyotubəbənzər hüceyrələrə çevrilməsinə təkan vermək üçün çoxsaylı tədqiqatlarda göstərilən MyoD1 idi [5,10]. İkinci amil miogen transkripsiya amili miogenin idi [28] ki, bizim pilot tədqiqatlarımızda da əzələ markerinin ifadəsini və miyotubəbənzər morfologiyaya keçidi induksiya etmək qabiliyyətini nümayiş etdirdi. MyoD (Şəkil 2B). Biz iki əlavə faktoru da daxil etdik—MYF6 [29] və MYF5 [30] –sözlüyündə konversiyaya təkan vermək üçün minimal qabiliyyət nümayiş etdirən, lakin skelet əzələlərinin yetişməsini dəstəklədiyi bilinir. Bu dörd miyogen faktorun hər biri üçün rekombinant virus ehtiyatları bərabər miqdarda birləşdirildi və iSMC çevrilməsi üçün çoxfaktorlu qarışıq kimi istifadə edildi.

Induksiya edilmiş skelet əzələ hüceyrələri (iSMC) amilləri və siçan və insan fibroblast xətlərində iSMC fenotipinin induksiyası. (A) HEK hüceyrələri etiketləndiyi kimi iSMC çevrilməsi üçün YFP füzyon protein vektorları ilə transfeksiya edilmişdir. Yaşıl flüoresan nüvə lokallaşdırılmış miogen amillərdir və mavi bis-benzimide boyanmasıdır. (B) KI6 siçan fibroblastları dörd ayrı miyogen faktor virusu (etiketləndiyi kimi) ilə yoluxmuş və sarkomerik α-aktinin üçün immunolənglənmişdir. (C) İnfeksiyadan və iSMC faktorlarının ifadəsindən sonra insan NWB və ya siçan KI6 fibroblastlarında müşahidə olunan morfoloji dəyişikliyə misal (etiketləndiyi kimi). (D) Faza kontrastının böyüdülmüş təsviri (400°x000d7)yuxarı) və floresan (aşağı) bis-benzimidlə boyanmış KI6 iSMC miyotublarının şəkli. Oxlar lif daxilində çoxlu nüvələri göstərir. (E) Nəzarət və ya iSMC faktoru ilə yoluxmuş siçan və insan hüceyrələri skelet əzələsi antigenləri sarkomerik α-aktinin (α-ACT) və ya sarkomerik miyozin (SMYO) üçün boyanmışdır. Siçan hüceyrələri 12-ci gündə, insan hüceyrələri isə infeksiyadan sonrakı 24-cü gündə işlənmişdir. Ölçək çubuqları 10 μm-dir. (F–I) Siçan və insan fibroblast xətlərinin etiketləndiyi kimi iSMC-lərə nisbi çevrilməsi (Şəkil 1E–H-dən sonra). Rəngli şəkilləri onlayn olaraq www.liebertpub.com/scd saytından əldə etmək olar

İnfeksiyadan 3 gün sonra virusla ötürülən kulturaların fibroblast böyümə mühitindən iSMC mühitinə (DMEM+0,1% FBS) keçidinin iSMC fenotipinin konversiyasını və saxlanmasını ən yaxşı şəkildə dəstəklədiyi aşkar edilmişdir. İnfeksiya edilməmiş fibroblastlar (və ya yalnız YFP ilə yoluxmuş hüceyrələr) iSMC böyüməsi şəraitində hüceyrələrin miyotub kimi morfologiyaya çevrilməsinə dair heç bir əlamət göstərməsə də, iSMC virus kokteyli ilə ötürülən həm siçan, həm də insan hüceyrələri hüceyrə birləşməsinin və miotubun əmələ gəlməsinin çoxlu sübutlarını göstərdi. İnfeksiyadan 6 gün sonra və morfoloji yetişməni siçan hüceyrələri üçün 10 gün, insan mədəniyyətləri üçün isə təqribən 18-1320 gün ərzində tamamladığı ortaya çıxdı (Şəkil 2C, D). Nəzarət və miogen faktorla yoluxmuş fibroblastların immunositokimyəvi təhlili təsdiq etdi ki, skelet əzələsi miyotublarının markerləri üçün immunopozitiv olan hüceyrələr nəzarət kulturalarında müşahidə olunmayıb (Şəkil 2E), bəzi test xətlərində faktorla ötürülən kulturalar isə çoxlu uzunsov, boruya bənzər hüceyrələr nümayiş etdirib. əzələ markerləri sarkomerik miyozin və α-aktinin üçün müsbət olan hüceyrələr (Şəkil 2E). Bu məlumatlar göstərirdi ki, iSMC-nin yenidən proqramlaşdırılması üçün istifadə etdiyimiz viral reagentlər və mədəniyyət rejimi əvvəllər bildirilmiş mədəni mioblastlardan istehsal edilən induksiya edilmiş skelet əzələ miyotubları və ya miyotubları ilə mahiyyətcə eyni olan çoxlu güclü konversiya hüceyrəsi fenotip göstəricilərinə malik hüceyrələr istehsal etmişdir [5,10,31, 32].

iSMC-lərin təhlili üçün eksperimental dizayn əvvəllər iNC-lər üçün istifadə edilən proseslə mahiyyətcə eyni idi. iSMC-lərin çevrilməmiş hüceyrələrə faizi kimi hesablanan maksimum çevrilmə səmərəliliyi siçan və insan fibroblastlarının iSMC-lərə dərc edilmiş digər çevrilmə nisbətlərinə oxşar idi [5,7,10,25]. Yetkin siçan fibroblastları üçün maksimum iSMC çevrilməsi 20,3% ଓ% (KI6) və insan fibroblastları (FET) üçün 60,4%ଖ% təşkil etmişdir.

Güclü 'aktinin immunopozitiv flüoresansı olan uzanmış hüceyrələr kimi müəyyən edilən iSMC-lər sınaqdan keçirilmiş on iki siçan fibroblast xəttindən onunda müşahidə edilmişdir. KI6 və TA6 kimi xətlər çoxlu iSMC istehsal etdi, HE4, SM1 və LU6 kimi xətlər isə yalnız nadir hüceyrələr və LI6 və TE4 xətləri çıxış fenotipinə uyğun morfologiya və marker ifadəsi olan heç bir hüceyrə istehsal etmədi (Əlavə Şəkil S7A) . iSMC-lər bütün transduksiya edilmiş insan mədəniyyətlərində (tam təhlilə daxil edilməyən AUT və HSK xətləri daxil olmaqla) müşahidə edildi, baxmayaraq ki, yaşlı donor subyektlərindən əldə edilən EAF və E2F xətlərində immunopozitiv iSMC-lər nadir idi (Əlavə Şəkil S7B).

iNC-lərdə olduğu kimi, iSMC reprogramming səmərəliliyi yalnız məhsul yığımı zamanı bütün hüceyrələrə nisbətən çevrilmiş hüceyrələrin funksiyası kimi hesablanır (Şəkil 2F, G) və ya FEE və ya FEL (Şəkil 2H, I) kimi faktorinq-in transgen ifadəsi aşkar edilmişdir. hər iki növün hüceyrə xətləri arasında əhəmiyyətli fərqlər. Siçan xətləri üçün həm FEE, həm də FEL istifadə edərək hesablanmış yenidən proqramlaşdırma effektivliyi arasında güclü və əhəmiyyətli müsbət əlaqə var idi (r=0.969, P=<𠂐.001) və insan xətləri (r=0.837, P=0,019). Daha da əhəmiyyətlisi, variasiya təhlili median iSMC yenidən proqramlaşdırma effektivliyində hər iki siçan üçün təsadüfən gözləniləndən əhəmiyyətli dərəcədə böyük fərqlər göstərdi (Pπ.001) və insan fibroblast hüceyrə xətləri (Pπ.05) ( Şəkil 2H, I ). Bu nəticələr təsdiq edir ki, faktorun ötürülməsi səviyyələrinin necə və ya nə vaxt ölçülməsindən asılı olaraq hesablanmış yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyində bəzi fərqlər olsa da, ümumi nəticələr oxşardır və hətta eyni xətlərin təkrar proqramlaşdırma imkanlarında əsaslı fərqlərin olması fikrini dəstəkləyir. ümumi növü.

INC qarşı iSMC yenidən proqramlaşdırma və yenidən proqramlaşdırma səmərəliliyinə nəzarət edən amillər

Bütün hüceyrə xətləri və konversiya rejimləri üçün yenidən proqramlaşdırma effektivliyi Şəkil 3A𠄽-də birləşdirilib. FEE və ya FEL ilə normallaşan iNC və iSMC çevrilməsi arasında korrelyasiyanın təhlili heç bir əhəmiyyətli korrelyasiya aşkar etmədi ki, bu da bir fenotipə çevrilmənin effektivliyinin başqa bir şəxsiyyətə yenidən proqramlaşdırmanın proqnozlaşdırıcı olmadığını göstərir.

Siçan və insan fibroblastlarının iNC və iSMC-lərə müqayisəli çevrilməsi. (A) İnsan fibroblast xətlərinin iNC-lərə müqayisəli çevrilməsi (qara çubuqlar) və iSMC-lər (ağ çubuqlar) FEE və ya funksiyası kimi hesablanır (B) FEL funksiyası kimi. (C) kimi (A) siçan fibroblast xətləri üçün. (D) kimi (B) siçan fibroblast xətləri üçün. iNC və iSMC çevrilməsi arasında korrelyasiya və bu dəyərin əhəmiyyəti hər qrup üçün göstərilir. (E) İnsan fibroblast xətlərinin hər biri üçün orta nisbi iNC çevrilməsinin (iNC), iSMC çevrilməsinin (iSMC), mitotik sürətin (ARTIMA) və infeksiya effektivliyinin (İNFEKSİYA) sətir qrafiki infeksiya effektivliyini artırmaqla sıralanır. Sağda trend xətlərinin süjeti var. Əlaqələr (r) əhəmiyyəti ilə (P) 𢙀.05 yuxarıda göstərilmişdir. (F) kimi (E), siçan hüceyrə xətləri üçün.

MMLV-əsaslı vektorlarla uğurlu infeksiya aktiv hüceyrə bölünməsini tələb etdiyindən və hər iki yenidən proqramlaşdırma rejimi bölünməyən, böyüməsi dayandırılmış hüceyrə fenotipi əmələ gətirdiyindən, biz böyümə ilə əlaqəli hüceyrə xüsusiyyətlərinin “infektivliyi” və mitotik indeksin çevrilmə effektivliyi ilə əlaqəli olub olmadığını müəyyən etməyə çalışdıq. Şəkil 3E və F-də göstərildiyi kimi, FEE və ya FEL tərəfindən düzəliş edilmədən yenidən proqramlaşdırma dəyərlərinin nisbi artım və yoluxuculuq ilə müqayisəsi iNC konversiya effektivliyi ilə heç bir əlaqəni aşkar etmədi, lakin hər iki sistemdə yoluxuculuq/böyümə və iSMC-lərə çevrilmə arasında əhəmiyyətli müsbət korrelyasiya var idi. insan və siçan xətləri. Bu korrelyasiyaya baxmayaraq, müxtəlif xətlərin yenidən proqramlaşdırma effektivliyində hələ də təəccüblü dəyişkənlik var idi ki, bu da hüceyrə dövrünü tənzimləyənlərə əlavə olaraq bir çox amillərin yenidən proqramlaşdırma prosesinə təsir göstərdiyini göstərir.


Kök hüceyrələri

11.3 Kök Hüceyrə Kulturası Metodları

Hüceyrə mədəniyyəti üsulları toxuma və molekulyar səviyyədə kök hüceyrələrin fizioloji, farmakoloji və bioloji qiymətləndirilməsi üçün vacibdir. Kök hüceyrələr adətən 5% CO ilə 37 °C-də inkubatorda yetişdirilir2 və 95% O2. Hüceyrə mədəniyyət mühitinin tərkibi kök hüceyrələrin fərqlənməmiş vəziyyətdə saxlanılması üçün vacibdir. Kök hüceyrə mədəniyyətində ən çox istifadə edilən komponentlərdən biri fetal bovine serumdur (FBS).Bununla belə, bunun bir sıra problemləri var: partiyadan partiyaya dəyişkənlik, hormonlar və böyümə faktorları kimi müəyyən edilməmiş komponentlərin olması (hüceyrə mədəniyyətində problemlər yarada bilər) və s. Digər əsas narahatlıq heyvan mənşəli zülalların xəstəyə ötürülməsi riskidir. Beləliklə, elm adamları kök hüceyrə mədəniyyətini klinik istifadə üçün daha uyğun etmək üçün zərdabsız mədəniyyət şəraitindən istifadə etməyə keçdilər [36].

Kök hüceyrələrin saxlanması və saxlanması üçün müxtəlif mədəniyyət sistemləri mövcuddur. Məsələn, MSC-ləri BM stromasından ayırmaq üçün təklif olunan üsullardan biri 10% FBS olan 20 ml DMEM-ə (Dulbecco-nun dəyişdirilmiş əsas mühiti) 10 ml BM suspenziyasının əlavə edilməsidir, bu məhlul yağ təbəqəsini ayırmaq üçün sentrifuqa edilə bilər və hüceyrə qranulları daha sonra 70% Percoll məhlulundan istifadə edərək 13000 q-da 20 dəqiqə sıxlıq qradiyenti sentrifuqasına məruz qala bilər. MSC ilə zənginləşdirilmiş aşağı fraksiya 10% FBS ilə əlavə edilmiş DMEM-də, 37 °C-də nəmləndirilmiş inkubatorda və 5% CO-da yetişdirilə bilər.2 və 95% O2. Sonrakı keçid üçün hüceyrələr 0,25% tripsin və 1 mM EDTA (etilendiamintetraasetik turşu) istifadə edərək tək hüceyrələrə enzimatik olaraq dispersiya edilə bilər və sonrakı baxım üçün FBS ilə əlavə edilmiş DMEM-də yenidən örtülə bilər [37]. Krio-mühafizə üçün, MSC-lər 90% FBS və 10% DMSO (dimetilsülfoksid) içərisində yavaş dondurulmaqla və daha sonra uzunmüddətli saxlama üçün maye azotda saxlanılmaqla yenidən dayandırıla bilər [38]. Regenerativ tibbdə tətbiqlər üçün MSC-lər serumsuz MesenCult-XF™, TC-protector™ və rekombinant tripsin (TrypLESelect™) kimi kseno-sərbəst materiallardan istifadə etməklə təcrid oluna, saxlanıla və becərilə bilər [39].

Dölün kök hüceyrələri üçün mədəniyyət üsulları hüceyrə növünə görə fərqlənir. Məsələn, kordon qanı normal tam müddətli hamiləliklərin neonatal göbək kordonundan toplana bilər. Daha sonra 40-60 dəqiqə ərzində hidroksietil nişasta ilə çökdürülə bilər. Mononükleositlər 30 dəqiqə ərzində 400 q-da sıxlıq qradiyenti sentrifuqalanması, fosfat tampon şoran məhlulunda daha sonra yuyulması və tampon məhlulunda yenidən suspenziya ilə təcrid oluna bilər. CD34+ hüceyrələri kommersiyada mövcud olan immunomaqnit ayırma sistemlərindən istifadə etməklə müsbət seçim yolu ilə daha da təcrid oluna bilər. Bu təcrid olunmuş hüceyrələr 10% FBS [40] ilə əlavə edilmiş Iscove's Modified Dulbecco's Medium-da (IMDM) daha da hesablana və becərilə bilər. MSC-lərin göbək qanından ayrılması üçün göbək kordonu fosfat tampon şoran məhlulu ilə yuyula, 75% etanolda dezinfeksiya oluna və daha sonra doğranıb həzm oluna bilər. Hüceyrələr daha sonra 10% FBS və 10 ng/ml epidermal böyümə faktoru (EGF) əlavə edilmiş DMEM/F-12 mühitində yetişdirilə və tripsinlə keçə bilər. Krio-konservasiya üçün hüceyrələr 90% FBS və 10% DMSO-dan ibarət olan adi krio-qoruyucu məhlulda yenidən dayandırıla bilər [41].

ES hüceyrələrinin vəziyyətində baxım, mədəniyyət və kriokonservasiya üçün bir neçə üsul mövcuddur. ES hüceyrə mədəniyyəti üçün istifadə olunanlar adətən iPS hüceyrələrinin mədəniyyətinə də tətbiq oluna bilər. Əvvəlcə insan ES hüceyrələri əldə edilmiş və bazal mühitdə saxlanılmışdır ki, bu da fetal dana serumu ilə əlavə edilə və siçan embrion fibroblast qidalandırıcı təbəqəsində (MEF) yetişdirilə bilər. Bununla belə, serumdakı bir çox amillər müəyyən edilməmişdir və istehsal zamanı serumun keyfiyyəti partiyalar arasında dəyişə bilər. Bundan əlavə, mədəniyyət mühitində heyvan komponentlərinin istifadəsi bu hüceyrələrin klinik tətbiqlər üçün potensial istifadəsi üçün maneə yarada bilər.

Bu problemlərin öhdəsindən gəlmək üçün tədqiqatçılar kök hüceyrə mədəniyyəti və saxlanması üçün daha dəqiqləşdirilmiş orta şərait hazırlamışlar. Bu şərtlərə hESF9 (FGF-2 (fibroblast böyümə faktoru 2) və heparin sulfat ilə əlavə edilmiş bazal mühitdən ibarətdir), mTeSR1™ və STEMPRO™ daxildir, bunlar kommersiyada mövcuddur və onların təşviqində siqnalın verilməsini asanlaşdırmaq üçün bir neçə kimyəvi maddələrdən və böyümə faktorlarından istifadə edir. insan ES hüceyrələrinin böyüməsi. Media tez-tez FGF, transferrin, albumin, xolesterin və lipid qarışıqları kimi bir neçə komponentlə tamamlanır [42]. ES hüceyrələri dispase, accutase, kollagenaz və tripsin kimi fermentativ yolla və ya mexaniki yolla, məsələn, STEMPRO ® EZPassage™ birdəfəlik kök hüceyrə keçid aləti, Life Technologies) keçə bilər. İnsan ES hüceyrələri əsasən adi yavaş dondurma və sürətli ərimə və sonra ROCK inhibitorunun (Y-27632) əlavə edilməsi ilə dondurulur və əriyir, bu da krio-konservləşdirilmiş hüceyrələrin bərpasını əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırır [43]. Hüceyrələr 60% KOSR (nokaut serumunun dəyişdirilməsi), 20% DMSO və 20% DMEM maye azotda dondurula bilər.

Partenogenetik ES hüceyrələri üçün təcrid olunmuş İCM-lər mitomisin-C ilə müalicə olunmuş siçan embrion fibroblast hüceyrələrində (MEFs) təxminən 5-9 gün ərzində becərilə bilər, sonra ilkin ES hüceyrə koloniyaları mexaniki olaraq ayrıla və 80-dən ibarət insan ES hüceyrə mədəniyyət mühitində yetişdirilə bilər. % nokaut-DMEM, 20% serum əvəzedicisi, 1 mM qlutamin, 1% qeyri-əsas amin turşusu, 0.1 mM 2-merkaptoetanal, 50 UI/ml penisilin və 50 UI/ml streptomisin [25].

İnsan mikrob hüceyrələri, yüksək qlükoza ilə DMEM-də jelatinlə örtülmüş qablarda yetişdirilə bilər, 15% nokaut serum əvəzedicisi, 2 mM L-qlutamin, 0,1 μM β-merkaptoetanol, 100 × qeyri-vacib amin turşuları, 1-10 penisilin, 1-10 penisill. ng/ml bFGF (əsas fibroblast böyümə faktoru) və 0,12 ng/ml TGF-β (transformasiya edən böyümə faktoru-β). Bu şərtlər 4 günlük kulturadan sonra pluripotent olan kiçik ES hüceyrəsinə bənzər koloniyaların əmələ gəlməsinə səbəb olur [44]. pES, gPS və iPS hüceyrələri insan ES hüceyrələrinə bənzər üsullarla krio-mühafizə oluna bilər.


Kriyokonservasiyanın cari tətbiqləri

Orqan mühafizəsi və bankçılıq

“Orqan və toxumaların mühafizəsi” bölməsində qeyd olunduğu kimi, orqan və toxumaların tələb olunan şəkildə dəyişdirilməsi reallığa çevrilsə, bütün dünyada minlərlə insanın həyatı fayda görəcək [25]. Orqan ömrünü uzatmaq üçün yanaşmalardan bəziləri normatermik temperaturda (35-37 °C) ex vivo davamlı perfuziya və böyrək transplantasiyası üçün müntəzəm olaraq istifadə edilən və ağciyəri uzata bilən hipotermik temperaturda (4-10 °C) perfuziya kombinasiyasıdır. sağ qalma müddəti 8 ilə 21 saat arasındadır [117]. CPA-ların əlavə edilməsi və siçovulların qaraciyərlərində buz əmələ gəlməsinin qarşısının alınması (supersoyutma) daha da aşağı temperaturlarda (− 6 °C) perfuziyaya imkan verdi və saxlama müddətini 4 günə qədər uzatdı [118]. Bununla belə, indiyə qədər bərk orqanları 3-12 saatdan sonra etibarlı şəkildə qorumaq üçün effektiv üsullar mövcud deyil [119,120,121]. Nəinki günlər və ya həftələr, hətta saatlarla əlavə mühafizə müddəti mümkün transplantasiyaların sayını xeyli artıracaq.

Böyrəklər və ürəklər ən çox tədqiq edilən orqanlar olub, lakin -45 °C-dən aşağı temperaturda soyuduqdan sonra heç biri ardıcıl olaraq bərpa olunmayıb. Buna baxmayaraq, aşağı temperaturlara qədər soyuduqdan sonra böyrəklərin sporadik sağ qaldığı iddia edilmişdir [95, 113]. Bu xətlərlə yanaşı, Fahy et al. dovşan böyrəyinin − 130 °C-də şüşələnməsində müvəffəqiyyət əldə edildiyini bildirdi və bu, perfuziya ilə birlikdə xüsusi keçirici istiləşmə texnikasından istifadə edərək yenidən isidildi. Qızdırıldıqdan sonra böyrək, qurban verilməzdən əvvəl işləyən böyrəyi ilə 48 gün yaşayan alıcı dovşana köçürüldü [95]. Bu yaxınlarda Marco-Jimenez et al. transplantasiya üçün potensial olaraq qeyri-məhdud orqan mənbəyi kimi böyrək prekursorlarının uzunmüddətli biobankını yaratmağa nail olurlar [122], həmçinin istiləşmə və allotransplantasiyadan sonra morfoloji cəhətdən normal glomeruli inkişaf etdirə bilən böyrək primordialarını donduraraq qoruyurlar [123].

Toxuma və hüceyrə bankçılığı

Kornea toxuması

ÜST-nin məlumatına görə, dünyada 10 milyon insan traxoma nəticəsində buynuz qişa korluğunun qarşısını almaq üçün cərrahiyyə əməliyyatına ehtiyac duyur, daha 4,9 milyon insan buynuz qişanın çapıqlanması səbəbindən tam korluqdan əziyyət çəkir [124]. Transplantasiya edilə bilən buynuz qişaların tələb və təklifi arasında əhəmiyyətli uyğunsuzluq var [125]. Baxmayaraq ki, hazırda əksər ölkələrdə əsas problem transplantasiya edilə bilən buynuz qişaların kifayət qədər mövcud olmamasıdır, buynuz qişanın kriokonservasiyası vəziyyətin yaxşılaşdırılmasına kömək edəcəkdir. Üstəlik, kornea toxuması mühəndisliyi çox araşdırılan bir mövzudur və təchizatı artırmaq potensialına malikdir. Buynuz qişanın dondurulması qeyri-məhdud saxlama müddəti təklif edəcək və zamandan asılı olan pisləşməni aradan qaldıracaq [126]. Transplantasiya üçün insan buynuz qişaları adətən 2-8 °C temperaturda 14 günə qədər və ya orqan kulturası ilə saxlanılır ki, bu da 4 həftəyə qədər saxlamağa imkan verir [127]. Dovşan, pişik və insan buynuz qişaları üçün hazırlanmış ilk dondurma texnikasında 7,5% DMSO və 10% saxaroza istifadə edilmişdir. Dondurulmuş buynuz qişaların müvəffəqiyyətlə köçürülməsinə baxmayaraq, donma nəticəsində əhəmiyyətli endotel zədələnmişdir [128]. Kornea endoteliyası kimi monolaylardakı hüceyrələr, süspansiyonda dondurulmuş təcrid olunmuş hüceyrələrlə müqayisədə donma zədələnməsinə daha çox həssasdırlar. İnsan buynuz qişalarında endotel hüceyrələri çox məhdud proliferativ qabiliyyətə malikdir və kriokonservasiya zamanı itirilən hüceyrələr sonradan mitoz bölünmə ilə əvəzlənmir. Yaxşı qorunan buynuz qişa endoteliyası tam qalınlıqda buynuz qişa transplantasiyasının uğurlu nəticəsi üçün çox vacibdir. Buynuz qişanın kriokonservasiyasının etibarlılığını artırmaq üçün bir sıra cəhdlər edilmişdir. Dovşan və insan buynuz qişası 6,8 M propan-1,2-diol istifadə edərək vitrifikasiya edilmiş və endotel funksiyasını saxladığı göstərilmişdir [128]. Bu texnika müəyyən uğur qazansa da, çox yüksək konsentrasiyalarda həll olunan maddələrə məruz qalmağı tələb edir və çox vaxt aparır. Bu yaxınlarda, LN-də saxlanmazdan əvvəl 1 °C/dəq-də sıfırdan aşağı temperatura (donuz üçün - 35 °C və insan üçün - 45 °C) yavaş soyutmanın dayandırılmasını nəzərdə tutan bir dondurma protokolu2və pCPA (5% DMSO) və npCPA (6% HES) birləşməsindən istifadə edərək buynuz qişanın endotel hüceyrələrini krioserverasiya etmək üçün uğurla tətbiq edilmişdir [126]. Bununla belə, indiyədək dondurulmuş insan buynuz qişaları təzə buynuz qişalarla müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə aşağı performans göstərdiyinə görə göz bankları tərəfindən gündəlik istifadə üçün qəbul edilməmişdir.

Retinal piqmentli epiteli (RPE)

RPE-nin transplantasiyası yaşa bağlı makula degenerasiyası (AMD) kimi RPE-ə xas retinal degenerasiyanın müalicəsi üçün potensial klinik tətbiqə malik ola bilər. AMD inkişaf etmiş dünyada korluğun ən çox yayılmış səbəbidir, 75 yaşa qədər hər üç nəfərdən birini təsir edir [129] Böyük Britaniyada təxminən 600.000 və dünya üzrə 8 milyondan çox görmə qabiliyyəti zəif olan insan [130, 131] . Gələcək RPE əvəzedici terapiyanın qurulması üçün RPE üçün uyğun saxlama metodunun hazırlanması zəruridir [132]. RPE saxlama bankının mümkünlüyü Durlu və Tamai tərəfindən araşdırılmışdır, onlar həyat qabiliyyətli kriopservasiya edilmiş RPE hüceyrələrinin yetkin albinos dovşanların və 23 günlük siçovulların subretinal boşluqlarına transplantasiyasını həyata keçirmişlər [133]. Uğurlu transplantasiya əməliyyatdan sonra işıq və elektron mikroskopiyası ilə təsdiqləndi. Dovşanlarda, ev sahibi retinanın Bruch membranında yerləşən ksenoqrastlanmış RPE hüceyrələri transplantasiyadan sonra 25-ci gündə in situ təzə və dondurulmuş RPE hüceyrələri arasında heç bir morfoloji fərq olmadan aşkar edilmişdir [133]. Siçovullarda, əməliyyatdan 3 ay sonra müşahidə edildiyi kimi, kriyoprezervasiya edilmiş RPE hüceyrələrinin subretinal inyeksiyası transplantasiya edilmiş ərazidə lokal olaraq fotoreseptor hüceyrələrini qismən xilas etdi [133]. Birlikdə, onların məlumatları təsdiq etdi ki, kriyoprezervasiya edilmiş RPE hüceyrələri RPE transplantasiyası üçün istifadə edilə bilər.

Yaşayış qabiliyyətinin dəyişməsi, hüceyrə funksiyalarının dəyişməsi və kriokonservasiya nəticəsində yaranan pozulmuş bioloji fəaliyyətlər adətən keçici olsa da və hüceyrələr zamanla və ya təkrar keçiddən sonra öz fəaliyyətlərini bərpa etsə də, bəzi geri dönməz dəyişikliklər də bildirilmişdir. Məsələn, Basu et al. dondurulduqdan sonra becərilmiş iribuynuzlu RPE hüceyrələrində anormal xromosomlarda artım tapdı, bu da hüceyrə keçidindən sonra daha da artdı [134]. RPE hüceyrə xətlərini araşdıran başqa bir araşdırma, uyğun olmayan dondurma şəraitinin yalnız hüceyrənin canlılığını azaltmaqla yanaşı, replikativ yaşlanmaya da səbəb ola biləcəyini irəli sürdü [135]. Valtink və başqaları. həmçinin RPE hüceyrələrinin kriogen şəkildə saxlanıla və transplantasiya üçün uzun müddət saxlanıla biləcəyini nümayiş etdirdi [136].

Retinal Müller glial hüceyrələrinin dondurulması

Müller hüceyrələri onurğalıların tor qişasının dominant makroqliyasıdır [137]. Retinal fiziologiyada müxtəlif mühüm funksional rollarına əlavə olaraq, onlar retinal patologiyada da iştirak edirlər, məsələn, hüceyrələr proliferativ vitreoretinopatiya hallarında dəyişdirilmiş membran xüsusiyyətlərini nümayiş etdirirlər [137, 138]. İnsan toxumasının istifadəsi mövcudluq səbəbləri ilə məhdudlaşır, buna görə də bu hüceyrələrin uzunmüddətli saxlanması üçün bir metodun hazırlanması arzu edilir. Biedermann və başqaları. dissosiasiya olunmuş Müller hüceyrələrinin 10% DMSO-da saxlandığı bir dondurma üsulunu təsvir etmişdir. Onlar göstərdilər ki, əsas elektrofizioloji xassələr bu üsulla dəyişdirilməyib və hətta 2 il saxlandıqdan sonra da gərginlik və liqand qapalı cərəyanlar dondurulmuş hüceyrələrdən qeydə alına bilər [139].

Sinir və beyin toxuması

Zədələnmiş və ya itkin hüceyrələrin dəyişdirilməsi bir sıra nevroloji xəstəliklər üçün inkişaf etməkdə olan bir müalicə strategiyasıdır. Sinir hüceyrələrinin və toxumalarının kriokonservasiyası onun adi klinik praktikaya daxil edilməsini təmin etmək üçün kifayət qədər müvəffəqiyyətlə tətbiq edilməmişdir. İzolyasiya edilmiş beyin toxuması qısa bir raf ömrünə malikdir və hüceyrələr adətən təcrid olunduqdan dərhal sonra təcrübələr üçün istifadə olunur və ya istifadə etməzdən əvvəl qısa müddət ərzində soyuducuda saxlanılır. 4 °C-də saxlama sinir toxumasının maksimum 8 günə qədər yaxşı yaşamasına imkan verir [140,141,142], buna görə də uzunmüddətli saxlama prosedurlarının hazırlanması həyati əhəmiyyət kəsb edir. Birincil sinir hüceyrələrinin dondurulması əsas nevrologiya tədqiqatlarını da xeyli asanlaşdıracaq [143]. Beyin toxumasının dondurulması qabiliyyəti, həmçinin çoxlu donorlardan toxumaların yığılmasını asanlaşdıraraq, transplantasiyadan əvvəl hüceyrələrin təhlükəsizliyini və funksiyasını təmin etmək üçün lazımi testlər üçün çox vaxt ayırmağa imkan verəcəkdir. Uğurlu kriokonservasiya sinir toxumasının mühəndisliyi üçün də faydalı olardı, inventar nəzarəti, keyfiyyətə nəzarət və məhsulun paylanması məqsədləri üçün uzunmüddətli saxlamağa imkan verir [144].

Sinir toxumasının kriokonservasiyasına nail olmaq üçün ilk cəhdlər 1953-cü ildə Luyet və Gonzales tərəfindən nəşr olundu, onlar toyuq beyin toxumasının EG-yə məruz qaldıqdan və sürətli soyutmadan sonra -196 °C-ə qədər donmadan sağ qaldığını nümayiş etdirdilər [145]. O vaxtdan bəri müxtəlif tədqiqatlar Paynter [147] tərəfindən ümumiləşdirildiyi kimi neyronları və sinir kök hüceyrələrini [146,147,148,149,150,151,152,153,154] dondurmaq üçün metodologiyalar təklif etmişdir.

Bir çox tədqiqatlar canlılığın [149, 150, 154] və ya hüceyrə membranının bütövlüyünün [152] keyfiyyət nəticəsini ölçmüşdür, lakin yalnız bir neçə müəllif dondurulmuş kulturaları daha ətraflı şəkildə xarakterizə etmişdir. Ərimədən sonrakı həyat qabiliyyəti (membran bütövlüyünün təhlili əsasında) mütləq kriokonservasiya prosedurunun keyfiyyətini əks etdirmir və müvafiq funksionallıq testləri aparılmalıdır. Məsələn, Higgins et al. nevritik ağac əmələ gəlməsinin keyfiyyətcə qiymətləndirilməsini təmin etdi [151] isə Quasthoff et al. mədəniyyətlərin morfoloji və funksional inkişafının parametrik təhlilini daxil etmişdir [153].

Bundan əlavə, mütəşəkkil yetkin beyin toxumasının dilimlərinin kriokonservasiyası əczaçılıq nöropsikiyatrik dərmanların qiymətləndirilməsi və inkişafı üçün potensial maraq doğurur. Pichugin və b. Vitrifikasiya yolu ilə yetkin mütəşəkkil və mürəkkəb neyron şəbəkələrin həyat qabiliyyətini və strukturunu yaxşı saxlamaq mümkün olduğunu göstərdi [29].

Tək neyron hüceyrə suspenziyasının kriokonservasiyası da təsvir edilmişdir, məsələn, neyron progenitor hüceyrələr [151, 154,155,156,157] və sinir cəhətdən fərqlənmiş pluripotent kök hüceyrələr [158]. Üstəlik, beyin sferoid mədəniyyətlərinin kriokonservasiyası yeni ortaya çıxan başqa bir mövzudur [148, 159, 160]. Məsələn, Ma et al. sinir kök hüceyrələrinin (NSC) üç müxtəlif vəziyyəti arasında kriokonservasiyadan sonra sağ qalma dərəcəsini və canlılığını müqayisə etdi: tək hüceyrəli asma, 30-50 μm və 80-100 μm diametrli NSC sferaları. Diametri 80-100 μm olan MTK kürələri 82,9%-lik ən yaxşı sağ qalma dərəcəsinə nail oldu və MTŞ-lər hələ də çox diferensiallaşma potensialını qoruyur [148].

Bütövlükdə, sinir toxumasının səmərəli kriokonservasiyası təkcə potensial klinik istifadə üçün deyil, həm də əsas elm və farmako-toksikologiya tədqiqatları üçün faydalı olardı.

Toxuma mühəndisliyi bankçılıq qurur

Toxuma mühəndisliyi ilə hazırlanmış məhsulların strukturunu və funksiyasını qorumaqla dondurulmuş konservasiya geniş miqyaslı klinik tətbiqlər üçün ilkin şərtdir. Mühəndis toxuma əvəzediciləri klinik sınaqlardan keçirildiyindən və becərilmiş hüceyrə və toxumalara artan tələbatın olduğunu nəzərə alaraq, toxuma mühəndisliyi icması bu məhsulların kifayət qədər miqdarını bazara təqdim etmək problemindən getdikcə daha çox narahat olur [161]. Kriokonservasiya hüceyrələrin, toxumaların və orqanların, eləcə də mühəndis toxumalarının uzunmüddətli qorunması üçün yeganə qurulmuş mexanizmdir, buna görə də toxuma mühəndisliyinin təkmilləşdirilməsi üçün əsas addımdır.

Retinal orqanoidlərin dondurulması

Nakano və başqaları. göstərdi ki, optimallaşdırılmış vitrifikasiya metodu insan mənşəli təbəqəli sinir tor qişasının (NR) blokda dondurulmasına imkan verir [162]. Onlar insan ESC-lərindən əldə edilən təbəqəli NR epiteliyasının saxlanması üçün səmərəli kriokonservasiya metodunu işləyib hazırladılar və aşkar etdilər ki, 10% DMSO + 5% EG + 10% saxaroza ilə əvvəlcədən müalicə ilə vitrifikasiya metodu NR-nin dondurulması üçün kifayət qədər effektivdir. Daha yeni tapıntılar göstərir ki, həm insan iPSC-dən əldə edilən retinal orqanoidlər, həm də dissosiasiya olunmuş retinal hüceyrələr öz fenotipik xüsusiyyətlərini və fotoreseptor prekursorlarını qoruyub saxlamaqla asanlıqla dondurula bilər [163].

Biosüni qaraciyərin kriokonservasiyası

Hepatosit mikromuncuqları kəskin qaraciyər çatışmazlığında zədələnmiş hepatositlərin funksiyasını müvəqqəti olaraq əvəz edə bilər. Beləliklə, hepatosit mikromuncuqlarının intraperitoneal transplantasiyası kəskin qaraciyər çatışmazlığının müalicəsi üçün cəlbedici seçimdir. Maraqlıdır ki, alginat-kapsullaşdırılmış hepatosit sferoidləri Massie et al. [164]. Bu yaxınlarda Jitraruç et al. Gələcək klinik istifadə üçün kriomühafizə olunan hepatosit mikromuncuqlarının nəticələrini yaxşılaşdıra bilən optimallaşdırılmış kriokonservasiya protokolunu işləyib hazırlamışdır [165].

Toxuma mühəndisliyi üçün hüceyrəsizləşdirilmiş özofaginin dondurulması

Effektiv saxlama özofagus toxumasının mühəndisliyi və klinik tərcüməsi üçün vacib olan hüceyrəsizləşdirilmiş özofagusların vaxtında istifadəsinə imkan verə bilər. Bu yaxınlarda Urbani et al. LN-də krioprotektor məhlulu ilə yavaş soyutma daxil olmaqla toxuma mühəndisliyi məqsədləri üçün hüceyrəsizləşdirilmiş özofagus iskelelərinin uzunmüddətli saxlanması üçün protokol nəşr etdi.2 buxar [166].

Toxuma mühəndisliyi skelet əzələsinin dondurulması

Toxuma mühəndisliyi ilə yaradılmış skelet əzələsi regenerativ tibb sahəsində və yumşaq robototexnika, çip üzərində orqan xəstəlik modelləri və dərman testi kimi inkişaf etməkdə olan sahələrdə mühüm rol oynayır [167]. Qrant və başqaları.toxuma mühəndisliyi ilə yaradılmış skelet əzələsinin differensiallaşdırılmış miyotublardan və ya onların fərqlənməmiş mioblast prekursorlarından hazırlanmış dondurulmuş toxuma olduğu optimallaşdırılmış protokol nəşr etdi. Toxumanın əriməsindən sonra hüceyrə canlılığını qorudu və üstəlik, skelet əzələsinin fərqlənmədən dondurulduğu optimallaşdırılmış protokol, donmamış əzələ ilə müqayisədə güc istehsalında üç dəfə artım göstərdi [167].

Mühəndisləşdirilmiş sinir toxumasının dondurulması

Hüceyrə və hüceyrədənkənar komponentləri və strukturları pozmadan mühəndis sinir toxumasını qorumaq qabiliyyəti klinik tərcümə və kommersiyalaşdırma üçün vacibdir. Qeyd edək ki, Day et al. kriogen konservasiyanın mühəndis sinir toxumasına təsirini öyrənmişdir [168].

Toxuma mühəndisliyi ilə hazırlanmış mədəaltı vəzi əvəzedicisinin kriokonservasiyası

Kapsullaşdırılmış insulin ifraz edən hüceyrələrin istifadəsi insulindən asılı diabetin müalicəsində perspektivli bir yanaşmadır. Mukherjee və b. ənənəvi dondurma protokolu ilə müqayisədə iki buzsuz kriokonservasiya (vitrifikasiya) məhlulu ilə toxuma mühəndisliyi ilə hazırlanmış model pankreas əvəzedicisinin dondurulmasını tədqiq etmiş və vitrifikasiyanı bu kapsullaşdırılmış hüceyrə sistemi üçün perspektivli qorunma proseduru hesab etmişdir [169].

Toxuma ilə işlənmiş sümüyün dondurulması

Yin və başqaları. Osteo-induksiya edilmiş köpək sümük iliyinin mezenximal kök hüceyrələrindən və qismən demineralizasiya olunmuş sümük matrisi iskelesindən ibarət toxuma mühəndisliyi ilə hazırlanmış sümüyün vitrifikasiyası yolu ilə kriokonservasiyanın məqsədəuyğunluğunu araşdırmış və kriokonservasiyadan sonra hüceyrə canlılığının və osteogen funksiyanın saxlanmasını göstərmişdir [170]. Bu yaxınlarda Tam et al. iki potensial qorunma üsulunun iPSC-lərdən insan toxuması ilə işlənmiş sümük greftlərinin sağ qalmasına, keyfiyyətinə və funksiyasına təsirlərini müqayisə etdi. Onlar aşkar etdilər ki, -80 °C-də saxlama hüceyrə ölümü və hüceyrədənkənar matrisin struktur dəyişikliyi ilə nəticələnir, halbuki 4 °C-də hipotermik saxlama toxumanın canlılığına və bütövlüyünə əhəmiyyətli dərəcədə təsir etmir [171].

Toxuma ilə işlənmiş dərinin dondurulması

Toxuma ilə işlənmiş epidermal membranlar yaraların kliniki sağalması üçün faydalıdır. Chen və başqaları. Göstərdi ki, çılpaq siçanlara köçürüldükdə, trehalozla kriyoprezervasiya edilmiş süni dəri, dondurulmamış nəzarətə bənzər şəkildə dəri qüsurlarını bərpa etdi [172]. Bundan əlavə, onlar göstərdilər ki, trehaloza ilə dondurulmuş süni dəri DMSO-kriopreservasiya edilmiş epidermal membranlarla müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşan oyma və yaranın bağlanması ilə nəticələnir, bu da trehalozanın istifadəsinin toxuma mühəndisliyi ilə işlənmiş epiteliya təbəqələrinin kriomühafizəsini yaxşılaşdırdığını göstərir [172].

Doku mühəndisliyi ilə insan dərisinin dəyişdirilməsinin kriokonservasiyası da dəri toxuması mühəndisliyində və dəri bankçılığında mühüm rol oynayır. 10% DMSO-da 1 °C/dəq soyutma sürətindən ibarət optimal dondurulmuş konservasiya protokolu, bu protokolla müalicə olunan tədqiq edilmiş dermal ekvivalentin canlılığı təzə nəzarətin 75% -i Wang və digərləri tərəfindən hazırlanmışdır. [173].

Fertilliyin dondurulması

Məhsuldarlığın qorunması (FP) reproduktiv tibbin mühüm və sürətlə inkişaf edən sahəsidir. 1978-ci ildən, in vitro gübrələmədən (IVF) sonra ilk doğuşun bildirildiyi vaxtdan bəri, tibbi yardımlı reproduksiyanın köməyi ilə ən azı 8 milyon körpə doğulmuşdur [174]. Kriokonservasiya üsulları bu müalicə inqilabında mühüm rol oynayır, gametlərin və embrionların sonrakı istifadə üçün keyfiyyətinin pozulması olmadan uzunmüddətli saxlanmasına imkan verir [174]. Uşaq doğuşunu otuz yaşın ortalarına və daha sonraya təxirə salan qadınların sayının artması ilə AP müalicəsinə ehtiyac heç vaxt bu qədər böyük olmamışdır.

Sağlam fərdlər üçün mövcud olan seçmə FP ilə yanaşı, məhsuldarlığı pozan çoxsaylı tibbi vəziyyətlər FP baxımından xüsusi diqqət tələb edir. Xərçəng xəstələrində FP-yə ehtiyac xüsusilə vacibdir. Kimyaterapiya, radioterapiya və ya hər ikisinin kombinasiyası kimi əksər xərçəng müalicəsi cinsi vəzilər üçün çox zəhərlidir və həm kişi, həm də qadın xəstələrdə sonsuzluğa səbəb ola bilər. Bədxassəli olmayan patologiyalar, məsələn, otoimmün xəstəliklər və onların müalicəsi, xoşxassəli hematoloji xəstəliklər (ən çox β-talassemiya), hormon terapiyasına başlamazdan əvvəl cinsiyyət disforiyası, ginekoloji və ya uroloji və bəzi genetik pozğunluqlar (Törner sindromu, Kövrək X sindromu, Klaynfelter sindromu) həm də məhsuldarlığın pozulmasına səbəb olur [175,176,177,178,179].

Xərçəng müalicəsində və erkən diaqnozda davamlı təkmilləşdirmələr xərçəng xəstələrinin uzunmüddətli sağ qalma nisbətlərini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı. Xərçəngdən sağ qalma statistikası uşaqlarda xüsusilə təsir edicidir, prepubertal xərçəng xəstələrinin 80%-nin (0-14 yaş) xəstəlikdən sağ çıxma ehtimalı var [180, 181]. Yeniyetmə və gənc yetkin xərçəng xəstələrində (15-39 yaş) sağ qalma nisbətləri də son bir neçə onillikdə dramatik şəkildə yaxşılaşdı [182]. Xərçəng xəstələrinin sağ qalma nisbətlərinin bu cür yaxşılaşması köməkçi reproduktiv texnologiyaların inkişafı ilə birlikdə uşaqlıq, yeniyetmə və gənc yetkin xəstələr üçün FP-yə tələbatı xeyli artırdı [183].

Kişilərin məhsuldarlığının qorunması üsulları

Spermanın uğurlu dondurulması ilk dəfə 1950-ci illərdə təcrübə üçün nisbi bolluğu və kiçik ölçüsü sayəsində əldə edilmişdir [174]. Yavaş soyutma protokolları əhəmiyyətli genetik ziyana səbəb ola bilsə də, ərimədən sonra aşağı hərəkətlilik dərəcəsinə səbəb ola bilər [184], spermanın dondurulması üçün dondurma üsulları dünyada ən çox istifadə edilən üsul olaraq qalır [174]. Yavaş soyutma və vitrifikasiya arasındakı müqayisəli tədqiqatlar göstərdi ki, vitrifikasiya üsullarından istifadə DNT-yə daha az zərər verir, istidən sonrakı hərəkətlilik dərəcələrini bir qədər yaxşılaşdırır və daha çox xərc və vaxta qənaət edir [185,186,187]. Bir sıra tədqiqatlar sperma nümunələrinin uzunmüddətli saxlanmasının (40 ilədək) spermanın istidən sonrakı mayalanmasına təsir etmədiyini təsdiqlədi [188,189,190]. Bununla belə, xüsusi kriyokonservasiya protokollarının təsiri və donorların uyğunluğu ilə bağlı bir sıra suallar həll edilməmişdir və tədqiqat mövzusu çox aktiv və klinik cəhətdən aktual olaraq qalır [191].

Hələ spermatogenezdən keçməmiş və buna görə də yetkin sperma istehsal etməyən prepubertal oğlanlar üçün, xaya toxumasının biopsiyası və spermatoqonial kök hüceyrənin kriokonservasiyası kimyaterapiya kimi məhsuldarlığı azaldan müalicə alan oğlanlar üçün məhsuldarlığın qorunması üçün yeganə mövcud seçimdir. Müalicədən əvvəl cinsi hüceyrələr çıxarılır və dondurulur və spermatogenezi bərpa etmək üçün müalicədən sonra yenidən xayalara köçürülür [192].

Qadın məhsuldarlığının qorunması üsulları

Embrion və oositlərin kriokonservasiyası yaxşı qurulmuş FP üsullarıdır. Embrionun dondurulması embrionların parçalanma və ya blastosist mərhələsində dondurulması və saxlanması prosesidir. Bu texnika son dörd onillikdə FP-nin təhlükəsiz və effektiv texnologiyası kimi sübut edilmişdir. 1983-cü ildə bildirilən embrionların kriokonservasiyasından sonra ilk doğuşdan bəri bu texnikadan istifadə etməklə yarım milyondan çox diri doğuşa nail olunub. Embrionun kriokonservasiyası yüksək hamiləlik nisbətlərinə görə FP üçün qızıl standartı təmsil edir [193, 194]. Əhəmiyyətli odur ki, vitrifikasiya ilə qorunan insan embrionları, yavaş soyutma ilə qorunan embrionlara nisbətən istidən sonra daha yüksək sağ qalma nisbətləri göstərdi [195, 196].

Oositlərin kriokonservasiyası doğuşun gecikdirilməsi üçün dünyada ən çox istifadə edilən FP üsuludur [197]. Oositlərin kriokonservasiyası embrionun kriokonservasiyası ilə müqayisədə texniki cəhətdən daha çətin olur, çünki oositdə yüksək su miqdarı onu krio zədələnməyə daha çox meylli edir. Buna görə də, oositlərin kriokonservasiyası konservasiya prosesi zamanı daha yüksək zədələnmə riskini ehtiva edir və embrionun kriomühafizəsi [198] ilə müqayisədə ümumi hamiləlik nisbətlərinin aşağı olması ilə nəticələnir. Anqarita və digərləri tərəfindən ümumiləşdirildiyi kimi, oositlərin kriokonservasiyasının bəzi mənfi təsirləri. [193] zona pellucidanın [199] sərtləşməsi, yumurtanın meyotik mili, sitoskeleton və buz kristallarının kortikal dənəvər zədələnməsi [200]. Oositlərin dondurulmasından sonra vitrifikasiya ilə müqayisədə daha aşağı sağ qalma nisbətləri, eləcə də aşağı mayalanma nisbətləri bildirilmişdir [201]. Təbii konsepsiya ilə müqayisədə doğulan uşaqlarda anadangəlmə anomaliyaların tezliyi kriokonservasiyadan sonra əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmir [202].

Yumurtalıq toxumasının kriokonservasiyası ənənəvi FP üsulu deyil, lakin xərçəng müalicəsinin başlanmasını gecikdirə bilməyən prepubertal qızlar və qadınlar üçün yeganə mövcud seçimdir [203]. Bu, yumurtalıqların qabığında təqdim olunan ibtidai follikullarda oositlərin kriopservasiyasına imkan verən yumurtalıq toxumasının yığılmasını və dondurulmasını əhatə edir [193]. Əridikdən sonra yumurtalıq toxuması ya xərçəngdən xilas olan şəxsə köçürülə bilər, ya da yetişməmiş oositlər yığılıb in vitro yetişdirilə bilər [194].

Əvvəllər dondurulmuş insan yumurtalıq toxumasının avtotransplantasiyasından sonra ilk diri doğuş 2004-cü ildə [204] bildirilmişdir və diri doğulanların sayı 2017-ci ilin iyununa [203] 130-u keçmişdir. Bu hamiləliklərin əksəriyyəti təbii konsepsiyadan sonra baş vermişdir ki, bu da yumurtalıq toxumasının kriokonservasiyasının oosit və embrionun kriokonservasiyası ilə müqayisədə əsas üstünlüyüdür [205]. Məhsuldarlığın bərpası ilə yanaşı, yumurtalıq toxumasının endokrin funksiyası da transplantasiyadan sonra təqribən 4-5 il davam edən əsas müddətlə uğurla bərpa edildi, greft bir neçə ilə qədər fəaliyyət göstərdi [206], bu proseduru menopozu gecikdirmək üçün bir seçim etdi [207]. ].

Kök hüceyrənin dondurulması

Kök hüceyrələrin kommersiya və klinik tətbiqi yeganə uzunmüddətli saxlama variantı kimi kriokonservasiyaya əsaslanır. Kök hüceyrələr hüceyrə terapiyası və regenerativ təbabətdə, dərmanların kəşfində, toksikologiyada və inkişaf biologiyası tədqiqatlarında tətbiq üçün yüksək perspektivli resursları təmsil edir [208]. Kök hüceyrə bankçılığı, kök hüceyrələri daha sonra istifadə etmək üçün ən güclü vəziyyətdə kriogen şəkildə qorumaq imkanı təklif edir [209]. Bir çox kök hüceyrələr, göbək qanı (bax 5.5.1.) kimi ömür boyu bir dəfə olan toxumalardan gəlir, buna görə də bütün dünyada bu hüceyrələrin potensial klinik tətbiqi və ya gələcək fəaliyyəti üçün qorumaq üçün kök hüceyrə bankları yaradılır. əsas və ya tərcümə tədqiqatlarında istifadə [208].

Göbək qanının (UCB) dondurulması

UCB keçmişdə tibbi tullantı kimi müalicə olunsa da, bu gün qiymətli hematopoetik kök hüceyrə mənbəyi kimi qan xərçəngi kimi müxtəlif xəstəliklərin müalicəsində istifadə olunur. 1988-ci ildə Fankoni anemiyası olan bir körpənin müalicəsi üçün dondurulmuş UCB-nin ilk uğurlu transplantasiyası həyata keçirildiyindən [210], UCB bankçılığı və transplantasiyası sahəsi eksponent olaraq böyüdü və UCB-nin dövlət və özəl biobanklarının qlobal şəbəkəsi yaradıldı [211]. 2013-cü ilə qədər bütün dünyada transplantasiya üçün 600.000-dən çox UCB vahidi saxlanılıb və 30.000-dən çox UCB transplantasiyası həyata keçirilib [212].

İnsan pluripotent kök hüceyrələrinin dondurulması

Limitsiz yayılma və differensiasiya qabiliyyətlərinə görə, ESC və iPSC-lər də daxil olmaqla insan pluripotent kök hüceyrələri də bank işi üçün cəlbedici kök hüceyrə növləridir. Bundan əlavə, iPSC-lər fərdiləşdirilmiş hüceyrə terapiyası üçün potensial açdı və son on ildə elmi tədqiqatlar üçün insan iPSC-lərinin böyük miqdarda toplanması və yaradılması üçün bir neçə təşəbbüs yaradıldı [213]. Dünyada bir çox iPSC bankları yaradılmışdır, o cümlədən Avropa İnduksiya edilmiş pluripotent Kök Hüceyrələr Bankı (EBiSC).

Bankçılıq üçün digər mövcud kök hüceyrə mənbələrinə sümük iliyi, göbək toxuması və yağ toxuması daxildir. Diş kök hüceyrələri həm də çox potensiallı yetkin kök hüceyrələrin asanlıqla əldə edilə bilən mənbəyidir [214] ki, bu da onları sümük iliyindən əldə edilən mezenximal kök hüceyrələr [215] üçün uyğun alternativ edir. Bu səbəbdən diş toxumaları mezenximal kök hüceyrələrin cəlbedici mənbəyinə çevrilib və bütün dünyada diş kök hüceyrə bankları formalaşır.

Hematopoetik kök hüceyrələrin kriokonservasiyası

Hematopoetik progenitor hüceyrələr (HPC) klinik baxımdan çox aktualdır. Xüsusilə, allogenik hematopoetik kök hüceyrə transplantasiyası (HSCT) bir çox qan xəstəliklərinin yeganə müalicəvi müalicəsi olaraq qalır və bu günə qədər ən köklü kök hüceyrə müalicəsidir [216] Həqiqətən də, son 50 il ərzində 400.000-dən çox insanda HSCT əməliyyatı aparılmışdır. Bu xətlərlə yanaşı, sümük iliyindən, periferik qandan və göbək qanından alınan hematopoetik progenitor hüceyrələrin (HPC) banklaşdırılması HPC transplantasiyasına ehtiyacı olan xəstələr üçün uyğun donorların tapılmasını asanlaşdırmaq üçün çox vacibdir. HPC-lərin kriokonservasiyası HSCT üçün standart işləmə üsuludur, lakin dondurulmamış HPC-lərin istifadəsi ilə müqayisədə müəyyən çatışmazlıqlara malikdir [217]. Beləliklə, bu tip kök hüceyrələrin kriokonservasiyasını yaxşılaşdırmaq üçün əlavə tədqiqatlara ehtiyac var.


Kimyəvi transfeksiya

Kimyəvi transfeksiya, yükü hədəf hüceyrələrə daxil etmək üçün lipid vezikülləri və polimer əsaslı kimyəvi maddələr kimi kimyəvi vektorlardan istifadə edir [43]. Kimyəvi vektor genetik redaktə plazmid DNT və mRNT-ni əhatə edən çatdırılma vasitəsi kimi çıxış edir [44,45]. Qızıl nanohissəcikləri, karbon nanoborucuqları və qrafen kimi qeyri-üzvi strukturlar da nuklein turşusunun çatdırılmasında ümidverici nəticələr göstərir [46-48]. Kimyəvi transfeksiya zülal və digər biomolekulları da çatdıra bilir. ThermoFisher Scientific Cas9 RNP komplekslərini çatdırmaq üçün optimallaşdırılmış lipid əsaslı kimyəvi transfeksiya reagentini buraxmışdır [49]. Viral transduksiyadan fərqli olaraq, kimyəvi vektorlardan istifadə edərkən yükün ölçüsü adətən narahatlıq doğurmur. Lipidlə örtülmüş yük endositoz yolu ilə hüceyrəyə daxil olur. Lipid vezikül endositozu asanlaşdırır və yükü sitozolda enzimatik parçalanmadan qoruyur. Lipofection istifadə edərkən, yük yalnız sitoplazmaya çatır, bu, işləmək üçün nüvəyə çatması lazım olan plazmid DNT kimi yüklər üçün uğursuzdur. Kimyəvi transfeksiya immun hüceyrələri və kök hüceyrələr kimi transfeksiyası çətin olan hüceyrələr üçün çox vaxt təsirsiz olur. Bu tip hüceyrələr üçün kimyəvi üsul ya yükü çatdıra bilmir, ya da həddindən artıq hüceyrə ölümü ilə nəticələnir [50-52]. Bu yaxınlarda vektorsuz kimyəvi əsaslı üsullar da bildirilmişdir. D'Astolfo və b. Cas9 RNP komplekslərinin siçan embrionunun sinir kök hüceyrələri və dendritik hüceyrələr daxil olmaqla müxtəlif hüceyrələrə effektiv çatdırılması üçün osmositoz və propanebetain (iTOP) ilə induksiya edilmiş transduksiyadan istifadəni nümayiş etdirdi [53]. Soluporasiya texnikası zülalları və mRNT-ni mezenximal kök hüceyrələrə və Jurkat hüceyrələrinə çatdırmaq üçün keçirici agent kimi tərkibində etanol olan məhlullardan istifadə edir [54]. Digər nəzərdən keçirilən məqalələrdə transfeksiya üsullarının bu yeni sinfi müzakirə edilmişdir [55,56].


Materiallar və metodlar

Sintez.

M ilə lPEIsn 2.6, 3.1 və 4.6 kDa 2-etil-2-oksazolin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Almaniya) və müvafiq poli(2-etil-2-oksazolinin) turşu-katalizli hidrolizi ilə halqa açma polimerləşməsi ilə sintez edilmişdir. təsvir edildiyi kimi (36).

LRx-lPEIy.

Susuz lPEI 12 ml diklormetanda (DCM) həll edildi və 50 ° C-yə qədər qızdırıldı. 3,3′-ditiopropion turşusu di-(N-suksinimidil esteri) (Lomant reagenti, LR) (Fluka, Buchs, İsveçrə) 5 ml DCM-də həll edildi (Xüsusi miqdarlar SI Cədvəl 2-də verilmişdir). Şəffaf məhlul güclü qarışdırma altında lPEI məhluluna damla-damla əlavə edildi və qarışıq bir gecədə 50°C-də saxlanıldı.

BCx-lPEIy.

Susuz lPEI, 4-(4,6-dimetoksi [1.3.5] triazin-2-il) 4-metilmorfoliniumxlorid hidrat (DMT-MM) (Acros Organics, Geel, Belçika) və N, N'-bis-(tert-butoksikarbonil) sistin (boc-cystine, BC) (Advanced Chem Tech, Louisville, KY) hər biri müvafiq olaraq 10 ml, 6 ml və 4 ml etanolda həll edilmişdir (xüsusi miqdarlar SI Cədvəl 3-də verilmişdir). lPEI və BC məhlulları paralel sintez blokunun şüşə borusuna köçürüldü və güclü silkələnmə ilə qarışdırıldı. Sonra DMT-MM məhlulu şəffaf qarışığa əlavə edildi və qarışıq bir gecədə otaq temperaturunda güclü şəkildə çalxalandı.

Hər iki polimer növü üçün uçucu maddələr daha sonra azaldılmış təzyiq altında çıxarıldı, sarı mum qalığı 2 M HCl-də həll edildi və çarpaz bağlı lPEI konsentratlaşdırılmış sulu natrium hidroksid ilə çökdürüldü. Ağ geləbənzər qalıq supernatant neytrallaşana qədər su ilə yuyuldu. Təhlil üçün təmizlənmiş amin əsasları azaldılmış təzyiq altında 70°C-də qurudulmuşdur. Amin bazası suda həllolma qabiliyyətini asanlaşdırmaq üçün 2 M HCl ilə müvafiq hidroxloridə çevrildi.

Poliplekslərin əmələ gəlməsi.

Poliplekslər 6, 12, 18, 24 və 30 NP nisbətlərində hazırlanmışdır. Poliplekslər 2 μg plazmid DNT (pEGFP-N1) (Clontech, Almaniya) hər biri 150-də seyreltilmiş müvafiq miqdarda polimer məhlulu ilə qarışdırılaraq yaradılmışdır. mM NaCl. Yaranan poliplekslər istifadə etməzdən əvvəl otaq temperaturunda 20 dəqiqə inkubasiya edilmişdir. Kommersiyada mövcud olan transfeksiya reagentləri olan komplekslər təchizatçının protokoluna uyğun olaraq hazırlanmışdır.

Polimerlərin funksionallığı in Vitro: Transfeksiya və Sitotoksiklik Təcrübələri.

Gen transferi tədqiqatları üçün müxtəlif hüceyrə xətləri (CHO-K1, COS-7, NIH/3T3, HepG2, HCT116, HeLa və HEK-293) hər quyu üçün 38,000-50,000 hüceyrə ilkin sıxlığında 24 quyu boşqablarında yetişdirildi. . Təcrübələr əvvəllər təsvir edildiyi kimi aparıldı və FACSCalibur (Becton-Dickinson, Heidelberg, Almaniya) istifadə edərək axın sitometriyası ilə qiymətləndirildi (37). Hüceyrə populyasiyası, hüceyrə zibilindən fərqli olaraq, transfeksiya prosesindən sonra bütün hüceyrələrin (ölü və ya canlı) sayına istinad etdi. EGFP-müsbət hüceyrələr 515-dən 545-nm-ə qədər diapazon keçirici filtrdən istifadə edilməklə, propidium iyodid (Sigma-Aldrich) emissiyası isə 670-nm uzun keçid filtri ilə ölçüldü. Orta floresans intensivliyi EGFP-müsbət hüceyrələrdən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir. Transfeksiyanın effektivliyi və hüceyrə canlılığı aşağıdakı kimi hesablanmışdır: Birincisi, nümunələrin hüceyrə populyasiyası müalicə olunmamış hüceyrələrin hüceyrə populyasiyasına, eləcə də hüceyrənin canlılığına normallaşdırılmışdır. Növbəti addımda EGFP-müsbət və ya propidium yodid-mənfi hüceyrələrin sayı müvafiq olaraq transfeksiya səmərəliliyini və ya hüceyrə canlılığını ifadə edən hesablanmış hüceyrə populyasiyasına aid edilmişdir.

Poliplekslərin hüceyrə və nüvə qəbulu.

YOYO-1 (Molecular Probes, Eugene, OR) - etiketli nuklein turşusu təsvir edildiyi kimi polipleks çatdırılmasını izləmək üçün istifadə edilmişdir (37, 38). Hüceyrələr 6 saat ərzində poliplekslərlə inkubasiya edildi, sonra bütün hüceyrələrin və nüvələrin axın-sitometriya analizi aparıldı. Qısaca, nüvələr aşağıdakı kimi təcrid edilmişdir: hüceyrələr aşağı duz konsentrasiyası (Tris·HCl 10 mmol/litr, KCl 60 mmol/litr və EDTA 1 mmol/litr) olan tamponda 5 dəqiqə inkubasiya edilmişdir. Bundan sonra hüceyrələr qeyri-ion yuyucu vasitə (Tergitol Tipi Nonidet P-40, 0,5%) (Sigma-Aldrich) və proteaz inhibitorları (Roche, Mannheim, Almaniya) olan eyni tamponla müalicə olundu. Nüvələr 600 × ölçüdə qranullandı g, Tergitol Tipi Nonidet P-40 olmadan nüvə təcrid tamponu ilə üç dəfə yuyuldu və sonra PBS-də yenidən dayandırıldı.Polipleksləri tutmuş hüceyrələrin və nüvələrin faizi və onların orta flüoresans intensivliyi 488 nm arqon lazeri ilə həyəcanlandıqdan və 515-dən 545 nm-ə qədər diapazon keçirici filtrlə aşkar edildikdən sonra axın sitometriyası ilə müəyyən edilmişdir.

Hüceyrədaxili İnsan Alveri: Konfokal Lazer Tarama Mikroskopiyası (CLSM).

CLSM təcrübələri üçün Zeiss Axiovert 200 M mikroskopu Zeiss LSM 510 skaner cihazı ilə birləşdirilmiş (Zeiss, Oberkochen, Almaniya) istifadə edilmişdir. Ters çevrilmiş mikroskop Plan-Apochromat ×63 obyektiv ilə təchiz edilmişdir. Hüceyrələr səkkiz quyudan ibarət Lab-Tek kameralı örtük şüşəsinə (Nunc, Wiesbaden, Almaniya) taxılmış və ölçmələr birbaşa olaraq hər bir quyuda 37°C-də aparılmışdır. Optik kəsiklərin qalınlığı 0,7 ilə 1,2 mkm arasında idi.

Poliplekslərin tutulmasının tədqiqi üçün YOYO-1 etiketli plazmid DNT istifadə edilmiş və yaşıl rəngdə təsvir edilmişdir. Floresan boya 488 nm arqon lazeri ilə həyəcanlandı və şəkillər poliplekslərin əlavə edilməsindən sonra göstərilən vaxtda tək yol rejimində 505-530 nm diapazon keçirici filtrdən istifadə edilərək götürüldü.

Hüceyrənin turşu bölmələrində poliplekslərin aşkar edilməsi üçün Alexa Fluor 546 etiketli plazmid DNT tətbiq edilmişdir. Hüceyrələrə eyni vaxtda 10-6 M konsentrasiyada poliplekslər və quinacrine xardal (Sigma-Aldrich) əlavə edildi. Quinacrine xardal 458 nm-də həyəcanlandı, flüoresan 475-525 nm bant keçirici filtrdən istifadə edərək təsvir edildi və firuzəyi rəngdə təsvir edilmişdir. Alexa Fluor (Molekulyar Zondlar) etiketli DNT 543 nm-də həyəcanlandı və flüoresan 560 nm uzun keçid filtri ilə qeydə alınıb və qırmızı rənglə göstərilib. Hər iki rəngin qarışığı yaxınlığı və buna görə də qarşılıqlı əlaqəni göstərir. Şəkillər multitracking rejimində çəkilib.

Statistik təhlil.

Bütün ölçmələr toplandı (n = 3–6) və ± SD kimi ifadə edilir. Tək ANOVA statistik əhəmiyyəti qiymətləndirmək üçün çoxsaylı müqayisə testi (Tukey testi) ilə birlikdə istifadə edilmişdir.


Videoya baxın: Kök hüceyrə əməliyyatımız (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Akinozahn

    is the special case.

  2. Reuel

    Cavab müqayisə olunmayan cavab ... :)

  3. Kiramar

    Great article! Can I post it on my blog?

  4. Kazemde

    Etməkdənsə demək daha asandır.

  5. Faur

    Məncə, siz haqlı deyilsiniz. Mən əminəm. Gəlin bunu müzakirə edək. Mənə pm-də yazın.

  6. Charleston

    parlaq



Mesaj yazmaq