Məlumat

Kütləvi spektrometriya ilə zülalın ardıcıllığını təyin etmək üçün həm B, həm də Y ionları tələb olunurmu?

Kütləvi spektrometriya ilə zülalın ardıcıllığını təyin etmək üçün həm B, həm də Y ionları tələb olunurmu?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bir peptiddəki amin turşularının sırasını təyin etmək üçün həm bütün b, həm də y ionlarının tələb olunduğunu merak etdim.

Fikrimcə, peptiddəki amin turşularının ardıcıllığını təyin etmək üçün yalnız BÜTÜN B ionlarını və ya BÜTÜN y-ionlarını bilmək kifayətdir. Mən də maraqlandım ki, bu b və y ionları bir spektrdə necə fərqlənir?


MS/MS spektrində b və ya y ion seriyasının ardıcıl zirvələri arasındakı fərq seriya/peptidi yaradan amin turşularını təyin etməyə imkan verir. Onlardan hər hansı biri sizə ardıcıllığı vermək üçün kifayət etməlidir. Bununla belə, kütləvi spektr alətindən əldə edilən MS/MS spektri fraqment növlərini bildirmir. Buna görə də y və ya b ion seriyalarını tapmaq üçün bəzi təcrübə və fəndlər tələb olunur. Məsələn: tripsin tərəfindən həzm olunan nümunəni təhlil edirsinizsə, C-müddət qalığınız ya K, ya da R olacaq. Beləliklə, K-ni göstərən 147 və ya R-i göstərən 175 varsa, Y1 ionunu axtara bilərsiniz. Həmçinin, Y ionları spektrdə ən yüksək intensivlik zirvələri olsun. Bununla bağlı daha faydalı məsləhətlər üçün əla dərslik var: http://www.ionsource.com/tutorial/DeNovo/DeNovoTOC.htm.

Həmçinin, praktikada siz nadir hallarda b və ya y ion zirvələrinin hamısını əldə edirsiniz və çox vaxt çatışmayan zirvələr olur. Bu səbəbdən birində boşluqlar digəri tərəfindən doldurula bilməsi üçün həm b, həm də y ionları seriyasının olması faydalıdır. Bu, yalnız denovo ardıcıllığı ilə məşğul olduqda deyil, həm də daha tipik ov tüfəngi proteomikası təcrübəsində faydalıdır. Tipik ov tüfəngi proteomik təcrübəsində peptid axtarış motorları ilə onların kütləvi spesifikasiya məlumatları axtarılır. Bunlar, eksperimentdə istifadə olunan proteazın spesifikliyinə əsaslanaraq, silisiumda həzm olunan zülal ardıcıllığı verilənlər bazasından istifadə edən proqramlardır və nəticədə peptid ardıcıllığından axtarış motorları proqnozlaşdırılan MS/MS spektrlərinin kitabxanasını yaradır (bu, parçalanma yolu ilə həyata keçirilir). peptid onurğası boyunca və bütün mümkün b və y ionlarının siyahısı). Sonra bu proqnozlaşdırılan spektrlər müşahidə olunan spektrlərlə nəticələnə biləcək peptid ardıcıllıqlarını proqnozlaşdırmaq üçün müşahidə olunan spektrlərlə uyğunlaşdırılır. Yenə də proqnozlaşdırılan spektrlərdə mövcud olan zirvələrin hamısı müşahidə olunan spektrlərdə tapılmayacaq. Beləliklə, həm b, həm də y ion seriyasından ionlara sahib olmaq daha yaxşıdır. Müşahidə olunan və proqnozlaşdırılan spektrlər arasında daha çox ion uyğun gəlsə, identifikasiyada xal və inam daha yaxşıdır.


Zülal ionlarının tandem kütlə spektrometriyası ilə membran zülallarının identifikasiyası

Proteomik analizlərdə zülalların müəyyən edilməsinin ən çox yayılmış yolu proteolitik fraqmentlərin kütləvi spektrometrik analizi ilə müəyyən edilmiş qısa ardıcıllıq seqmentlərindən (“etiketlər”) istifadə etməkdir. Bu yanaşma qlobulyar zülallar və membranı əhatə edən α-spirallar arasında əhəmiyyətli qütb seqmentləri olan membran zülalları ilə effektivdir, lakin proteazın parçalanma yerlərinin nadir və ya olmadığı yerlərdə digər hidrofobik zülallar üçün təsirsizdir. Üzvi həlledicilərdə hidrofobik zülalların təmizlənməsi üsullarını inkişaf etdirməklə və bu zülalların ionlarını arqonla toqquşma nəticəsində yaranan dissosiasiya yolu ilə parçalamaqla, bir çox membran zülallarının qismən ardıcıllığının əl ilə yoxlama ilə asanlıqla çıxarıla biləcəyini göstərdik. Kiçik proteolipidlərdən (1-4 transmembran α-sarmal) spektrlərdə adətən daxili amid parçalanmalarından yaranan fraqment ionları üstünlük təşkil edir, onlardan daxili ardıcıllıqlar əldə edilə bilər, daha böyük membran zülallarından (5-18 transmembran α-sarmal) spektrlər isə üstünlük təşkil edir. tez-tez N- və/və ya C-terminal hissələrinin fraqment ionlarını ehtiva edir və bu bölgələrdə ardıcıllıq verir. Bu üsullarla biz, məsələn, mitoxondrilərin daxili membranlarından proteomik tədqiqatlarda aşkarlana bildiyimiz qədər naməlum funksiyaya malik bol zülal müəyyən etdik və mitoxondrial DNT-də kodlanmış 13 zülaldan 10-dan ardıcıllıq yaratdıq. Onlara kompleks I-nin ND6 alt bölməsi, onun təhlil ediləcək 45 alt bölməsindən sonuncusu daxildir. Prosedurların, məsələn, qaz fazasında qismən qatlanmış qala bilən iri membran zülallarının daxili bölgələrinin parçalanmasına səbəb olmaq üçün zülal ionlarının dissosiasiyası üçün yeni tətbiq edilmiş metodlardan istifadə etməklə, daha da inkişaf etdirmək potensialı var.

Genomlarda kodlanmış zülalların üçdə biri hidrofobik membran zülallarıdır və onların kütləvi spektrometrik üsullarla təhlili hidrofilik zülalların analizindən daha çətindir. Çətinliklərin çoxu onların hidrofobikliyi və bununla əlaqədar olaraq membran zülallarının kütləvi spektrometrik analiz üçün uyğun formada təmizlənməsi üçün prosedurların olmamasından irəli gəlir. Adətən, yuyucu vasitələr membran zülallarını çıxarmaq və təmizləmək üçün istifadə olunur, lakin onlar MS-də istifadə edilən zülalın ionlaşması üsulları ilə uyğun gəlmir və buna görə də analizə başlamazdan əvvəl təmizlənmiş zülaldan (çox vaxt üzvi həlledicilərdə xromatoqrafiya ilə) xaric edilməlidir ( 1–3). Alternativ yanaşma, membran zülallarını birbaşa üzvi həlledicilərdə çıxarmaq və fraksiyalaşdırmaqdır (3-5).

Zülalın kütləsinin ölçülməsi hər hansı posttranslational modifikasiyaların mövcudluğunu aşkar etməyə imkan verir, lakin onun yerini müəyyən etməyə imkan verir, lakin bu, proteomik analizlərdə tələb olunduğu kimi, ardıcıl məlumat bazalarında zülalın müəyyən edilməsi üçün etibarlı vasitə təmin etmir. Adətən, bu məqsədlə proteolitik peptidlərin kütləvi spektrometrik analizi ilə alınan zülal ardıcıllığının qısa seqmentlərindən (ardıcıllıq etiketləri) istifadə olunur (6). Bu üsul qlobulyar zülallardan və spirallar arasında və onların ucunda əhəmiyyətli qütb seqmentləri olan membranı əhatə edən zülallardan qismən ardıcıllıq yaratmaq üçün yüksək effektiv vasitə təmin edir, lakin proteazların parçalanma yerlərinin ola biləcəyi daha çox hidrofobik membran zülalları ilə çox vaxt səmərəsizdir. ya nadirdir, ya da tamamilə yoxdur. Qlobular zülallara tətbiq edilən “yuxarıdan aşağı” ardıcıllıq kimi tanınan başqa bir yanaşma arqon ilə toqquşma nəticəsində yaranan dissosiasiya (CID) yolu ilə bütöv protein ionlarını parçalamaq və fraqment ion spektrlərindən qismən ardıcıllıq çıxarmaqdır (7-9). Bu spektrlər mürəkkəbdir və çox vaxt onların şərhi fraqment ion izotoplarını ayırmaq və izotopdan əlaqəli yüklərin sayını müəyyən etmək üçün ion siklotron rezonansı və Furye çevirmə qabiliyyətinə malik xətti ion tələsi kütlə spektrometrləri kimi yüksək ayırdetməli alətlərin istifadəsini tələb edir. boşluqlar (9, 10). Bu alətin qiyməti bu texnikalara çıxışı məhdudlaşdırır.

Yuxarıdan-aşağı ardıcıllıq yanaşması 3-8 kDa molekulyar kütlə diapazonunda olan bir neçə kiçik membran zülallarına, yəni iribuynuzlu heyvan mitoxondrial sitoxrom oksidazının VIIc və VIII alt bölmələrinə (4), ATP sintazasının c alt bölməsinə (11-13) tətbiq edilmişdir. , və sitoxromun alt bölmələri b 6f xloroplastlardan və siyanobakteriyalardan (3). Tandem kütlə spektrləri dördqütblü və ya uçuş vaxtı analizatorları olan alətlərdə zülal ionlarının CID tərəfindən parçalanması yolu ilə hazırlanmışdır. Onlar olduqca sadə idi və əl ilə şərh edilə bilərdi. Bununla belə, bütöv ion spektrlərinin yaranmasına uyğun formada təmizlənmiş bir sıra membran zülallarına giriş məhdud olduğundan, indiyədək membran zülallarının tandem kütlə analizinin sistematik tədqiqi aparılmamışdır. Burada təsvir olunduğu kimi, biz xromatoqrafiya ilə hidrofobik membran zülallarının həll edilməsi və fraksiyalaşdırılması prosedurlarını təkmilləşdirmişik. Biz bütöv protein ionlarını CID ilə parçalayaraq, membran zülallarının molekulyar kütlələrinin ölçülməsini genişləndirdik. Göstərdik ki, qlobular zülalların (7) CID-dən yaranan mürəkkəb fraqment ion spektrlərindən fərqli olaraq, 1-dən 18-ə qədər transmembran α-sarmalları (TMHs) olan bir çox membran zülallarının fraqment ion spektrləri nisbətən sadədir və əl ilə yoxlama ilə asanlıqla şərh edilə bilər. Beləliklə, naməlum membran zülallarını müəyyən etmək üçün uyğun etiketlər təqdim edirlər.


Əlaqədar Məlumat

Yuxarıdan aşağıya və aşağıdan yuxarıya kütləvi spektrometriya üsulları qaz fazasının fraqmentlərini yarada və onlardan zülalları müəyyən etmək üçün istifadə edə bilər. Yuxarıdan aşağı üsullar, əlavə olaraq, zülalın özünün kütləsini və buna görə də əlavə struktur məlumatlarını təmin edə bilər. Yuxarıdan aşağıya metodların konseptual üstünlüyünə baxmayaraq, bazar payı üstünlüyü onların daha möhkəm nümunə hazırlamaq, parçalamaq və məlumatların işlənməsi üsulları nəticəsində aşağıdan yuxarı metodlara aiddir. Burada yuxarıdan aşağıya kütləvi spektrometriya üçün təkmilləşdirilmiş parçalanma və məlumatların işlənməsi üsulları haqqında məlumat veririk. Xüsusilə biz nozzle-skimmer dissosiasiyasının bir variantı olan huni-skimmer dissosiasiyasının istifadəsini bildiririk və onun performansını elektron tutma dissosiasiyası ilə müqayisə edirik. Biz həmçinin yuxarıdan aşağıya MS 2 axtarış qabiliyyətinə malik Mascotun genişləndirilmiş versiyası və həm aşağıdan yuxarıya, həm də yuxarıdan aşağıya axtarışları yerinə yetirə bilən ilk axtarış sistemi olan BIG Mascot-u debüt edirik. BIG Mascot istifadə edərək, biz zülalları müəyyən etmək qabiliyyətini nümayiş etdirdik 1) yalnız bütöv protein MS 1, 2) yalnız MS 2 və 3) MS 1 və MS 2 birləşməsindən istifadə etməklə. Protein Cu/Zn-superoksid dismutazının 13 amiotrofik yanal sklerozla əlaqəli variantı da daxil olmaqla geniş kütlə diapazonuna malik zülalları düzgün müəyyən etdik və tiroqlobulini müəyyən etməklə yuxarıdan aşağıya protein identifikasiyasının yuxarı kütlə həddini 669 kDa-a qədər genişləndirdik.

İntakt zülalların ionlaşması və aşkarlanması 20 il ərzində mümkün olmuşdur (1, 2). Bu sıçrayış, bütöv zülalların parçalanması (3) və verilənlər bazası axtarışı (10) üsullarının inkişafı ilə birlikdə zülal analizinin yuxarıdan aşağıya kütləvi spektrometrik yanaşmalarına (13'ə) səbəb oldu. Yuxarıdan aşağıya proteomika zülal variantı və post-translational modifikasiya (PTM) 1 xarakteristikası (14, 20, 21) sahəsində üstün olsa da, hərtərəfli zülal identifikasiyası təkmilləşdirmə üçün sahədir (22�). Yuxarıdan aşağıya proteomikaya ümumiyyətlə geldə həzm kimi tətbiq oluna bilən nümunə hazırlama texnikasının olmaması (25), peptidlərin toqquşma ilə aktivləşdirilmiş dissosiasiyası (CAD) qədər möhkəm parçalanma texnikasının olmaması (26) və çatışmazlıq mane olur. Mascot (28), Sequest (29), Protein Prospector (30) və Peptid Axtarış (31) daxil olmaqla, yuxarıdan aşağıya MS məlumatlarının bütün populyar aşağıdan yuxarı proqram təminatı (27) ilə uyğunluğu. Bu sahələrdə son təkmilləşdirmələrə aşağıdakılar daxildir: 1) yuxarıdan aşağıya analizlə uyğun gələn ayırma üsulları (18, 32) 2) parçalanma üsulları, o cümlədən nozzle-skimmer dissosiasiyası (3, 33�), elektron ötürmə dissosiasiyası (7, 8) , qabaqcadan qatlama dissosiasiyası (9) və aktivləşdirilmiş ion elektron tutma dissosiasiyası (ECD) (5), yuxarıdan aşağıya metodlar (9) və 3) üçün zülal kütləsinin yuxarı həddini 229 kDa-a qədər genişləndirdi. up proqram təminatı ProSight PTM (11, 12, 36) hazırlanmış və Xcalibur proqram dəsti (Thermo Finnigan, San José, CA) daxilində hərtərəfli MS verilənlər bazası ilə inteqrasiya edilmişdir.

Buradakı məqsədlərimiz (i) yuxarıdan aşağıya MS 2 axtarış qabiliyyətini özündə birləşdirən Mascot-un genişləndirilmiş versiyasını inkişaf etdirməyə kömək etmək və (ii) onun axtarış həssaslığını və seçiciliyini çıxarmaqdır. Burada həm aşağıdan yuxarıya, həm də yuxarıdan aşağıya MS 2 axtarışlarını həyata keçirə bilən ilk ümumi istifadə axtarış sistemi olan BIG Mascot-u təqdim edirik. Mascot, ehtimala əsaslanan qiymətləndirmə metodu (28), üstün performansı (37, 38) və sürətli işləmə alqoritmi səbəbindən ən çox istifadə edilən verilənlər bazası axtarış sistemlərindən biri olmuşdur. Bununla belə, Mascot-un yuxarıdan-aşağıya iş axınlarına tətbiqi ciddi şəkildə məhduddur, çünki kommersiya baxımından mövcud versiyada 16 kDa prekursor ion kütləsi həddi var. 110 kDa-a qədər prekursor ionlarına imkan vermək üçün dəyişdirilmiş BIG Mascot adlanan Mascot versiyasından istifadə edərək, ya bütöv protein MS 1 və ya MS 2-nin öz-özünə bir çox zülalın identifikasiyası üçün kifayət qədər məlumat verdiyini nümayiş etdiririk. Bununla belə, mutasiyalar və ya PTM-lər də daxil olmaqla tək bir zülalın variantlarını müəyyən etmək üçün həm bütöv zülalın, həm də fraqmentlərin kütlələri tələb olunur. Nəhayət, bir addımlı analizdən istifadə edərək zülal tiroqlobulini müəyyən etməklə, biz bütöv zülal identifikasiyasının kütləsini əvvəlki 229 kDa (9) limitindən 669 kDa-ya qədər genişləndiririk.


Kütləvi spektrometriya ilə zülalın ardıcıllığını təyin etmək üçün həm B, həm də Y ionları tələb olunurmu? - Biologiya

Kimya Departamenti, Ostindəki Texas Universiteti, Austin, TX 78712, ABŞ
E-poçt: [email protected]

b Kimyəvi Biologiya və Dərman Kimyası Bölməsi, Əczaçılıq Kolleci, Ostin, Texas Universiteti, Ostin, TX 78712, ABŞ
E-poçt: [email protected]

c Kimya və Biokimya Departamenti, Mayami Universiteti, Oksford, OH 45056, ABŞ

d Kimya Departamenti, Wesleyan Universiteti, Middletown, CT 06459, ABŞ

Mücərrəd

Yeni Delhi metallo-β-laktamazada (NDM) ligandlar və ya mutasiyalar tərəfindən pozulma zamanı struktur dəyişikliklərini xarakterizə etmək üçün ultrabənövşəyi fotodissosiasiya (UVPD) ilə birlikdə denaturasiya edən və denaturasiya etməyən məhlul şəraitində kütləvi spektrometriyadan (MS) istifadə edirik. Fraqment ionlarının bolluğunda və paylanmasında dəyişikliklərin xəritələşdirilməsi zülal boyunca struktur dəyişikliklərini həssas şəkildə aşkar etməyə imkan verir. Üç kovalent inhibitorun bağlanması xarakterizə edildi: bir pentafluorfenil esteri, an O-ariloksikarbonil hidroksamat və ebselen. İlk iki inhibitor Lys211-i dəyişdirir və dizinc bağlanmasını qoruyur, baxmayaraq ki, pentafluorofenil esteri seçici deyil (Lys214 və Lys216 da dəyişdirilir). Ebselen tək Cys (Cys208) ilə reaksiya verir və Zn2-ni aktiv sahədən çıxarır. Hər bir inhibitor üçün yerli UVPD-MS eyni vaxtda substratı bağlayan beta-saç tıxacının bağlanmasının aşkarlanmasına, kovalent modifikasiya olunmuş qalıqların (qalıqların) identifikasiyasına, fermentin metallaşma vəziyyətinin bildirilməsinə və ebselen vəziyyətində, zülalın C-terminusunda qismən pozğunluğun induksiyasının müşahidəsi. Doğma UVPD-MS-nin yüksək həssaslıqla struktur dəyişikliklərini və metallaşma vəziyyətini izləmək qabiliyyəti sayəsində biz NDM klinik variantlarında aşkar edilən mutasiyaların təsirini qiymətləndirmək üçün bu metoddan daha sonra istifadə etdik. NDM-4 (M154L) və NDM-6 (A233V) tərəfindən təqdim edilən dəyişikliklərin ayrı-ayrı qarşılıqlı əlaqə şəbəkələri vasitəsilə birbaşa sink ligandlarına yayılması aşkar edilir və NDM-15-də (M154L, A233V) bu iki mutasiyanın birləşməsi əlavə kimi nəticələnir. eləcə də əlavə struktur dəyişiklikləri. UVPD-MS-dən əldə edilən fikir uzaq mutasiyaların bu antibiotik müqavimət determinantının təkamülündə sink yaxınlığına necə təsir etdiyini aydınlaşdırmağa kömək edir. UVPD-MS liqand bağlanması, konformasiya dəyişiklikləri və NDM-nin metallaşma vəziyyəti haqqında eyni vaxtda hesabat verməyə qadir olan güclü alətdir, liqandın tanınmasının struktur aspektlərini və tədqiqi çətin olan klinik variantları aşkar edir.


NƏTİCƏLƏR VƏ MÜZAKİRƏ

Mobil proton fərziyyəsində deyilir ki, qaz fazasının ionlaşması zamanı peptidlərin protonlaşması əsasən analitin əsas yerləri ilə idarə olunur. Beləliklə, tək əsas amin turşusunu ehtiva edən tipik bir triptik peptid ikiqat yüklənir (ikinci proton N-terminusun əsas aminində sabitlənmişdir). Biz birbaşa kimyəvi sintez edilmiş peptid EPGLCTWQSLR-ni ESI-MS istifadə edərək hibrid ion tələsi-Orbitrap kütlə spektrometrinə daxil etdik və Şəkil 1(A)-da göründüyü kimi ikiqat yüklənmiş prekursoru müşahidə etdik. Mobil proton fərziyyəsinə uyğun olaraq, triptik peptidin N-terminusuna əlavə Arg əlavə etmək ikiqat və üçqat yüklənmiş prekursorlarla nəticələnə bilər. [M+2H + ] 2+ ionunun əmələ gəlməsi protonların hər iki əsas amin turşusunda sekvestrləşdirilməsi ilə, [M+3H + ] 3+ ionu isə N-terminusun ilkin amin vasitəsilə protonu əlavə olaraq təmin etməklə rasionallaşdırılır. . Həqiqətən, REPGLCTWQSLR-nin hibrid ion tələsi-Orbitrap kütlə spektrometrinə birbaşa infuziya edilməsi Şəkil 1(B)-də göründüyü kimi [M+2H + ] 2+ və [M+3H + ] 3+ ionları ilə nəticələnir. Bundan əlavə, üçlü yüklənmiş prekursor ionu sonrakı ETD üçün seçilə bilər. Peptid ardıcıllığında Pro qalığının olmasına baxmayaraq, nəticədə yaranan MS/MS spektrində tam c-fraqment ion nərdivanı, tam y fraqmenti ion nərdivanı və bir neçə digər məhsul ionları ilə müşahidə edildi (bax. Şəkil 1(C)) . Beləliklə, arginilasiya nisbətən qısa peptidlərin ETD parçalanmasına imkan verir və nəticədə yaranan MS/MS spektrləri peptidlərin birmənalı təyin edilməsi üçün ən azı 2x ardıcıl əhatə edir. Bu nəticələrə əsasən, proteomika üçün arginilasiyanın tətbiqini daha da davam etdirmək və yATE1 fermentinin möhkəmliyini müəyyən etmək qərarına gəldik.

YATE1-in ferment kinetikası

Arginilasiya iki substratı əhatə edən enzimatik reaksiyadır: aminoasilatlanmış tRNA Arg və N-terminal turşulu amin turşuları ilə (poli-)peptidlər (bax. Şəkil 2(A)). 10 Michaelis-Menten sürət sabitlərini təyin etmək Saccharomyces cerevisiae arginil-tRNA protein transferaz 1 (yATE1), biz matrislə dəstəklənən lazer desorbsiya/ionlaşma vaxtının uçuş kütlə spektrometriyasına (MALDI-TOFMS) və etil (-D5) etiketli peptid standartlarına (qısa) əsaslanan multipleksləşdirilmiş kəmiyyət metodundan istifadə etdik. pentadeutero metodu əlyazmanın qalan hissəsi üçün). 11, 13, 14 MALDI-MS mahiyyət etibarilə kəmiyyət xarakteri daşımadığından, yəni analitdən müşahidə olunan siqnal nümunədəki analitin miqdarı ilə zəif əlaqəlidir, onun kəmiyyəti pentadeutero metodu daxili Cys ehtiva edən substrat və məhsul peptidlərinin diferensial etiketlənməsinə əsaslanır. 13, 14 Substrat peptid EPGLCTWQSLR bromoetan-D5 istifadə edərək etiketləndi, nəticədə deuterasiya S-etilsistein (ağır substrat, m/z 1323). Ardıcıllıqla məhsul peptidi REPGLCTWQSLR izotopik olaraq yüngül brometan istifadə edərək etiketlənmiş və istinad standartı kimi xidmət etmişdir (yüngül məhsul, m/z 1474). Həm də ağır substratyüngül məhsul arginilləşmə reaksiyasına əlavə edildi və alikvotlar zaman funksiyası kimi götürüldü, TFA ilə söndürüldü və kütləvi spektral analiz üçün birbaşa t-plitəsinə qeyd edildi. Məlum substrat və məhsul peptidi ilə aşağı mürəkkəblik peptid qarışığına görə m/z dəyərlər, MALDI aşkarlanmasından əvvəl heç bir xromatoqrafik ayırma tələb olunmur. Şəkil 2(B) əsas MALDI məlumatlarının nümunəsini göstərir: the yüngül məhsul (m/z 1474) isə 1-də sabit saxlanılır ağır məhsul (m/z 1479) zamandan asılı olaraq artır.

YATE1 üçün Michaelis-Menten sürət sabitlərini təyin etmək üçün arqinilləşmə reaksiyası üç nüsxədə aparıldı. yerində aminoasilatlanmış Arg-tRNA Arg-ni bərpa etmək üçün aminoasilyasiya reaksiyası (ətraflı məlumat üçün Eksperimental bölməyə baxın). Peptid məhsulunun görünüşünün ölçülməsi 15 4,48 μM ilə 51,5 μM arasında dəyişən bir sıra peptid substrat konsentrasiyaları üzərində aparıldı, yATE1 və tRNA Arg konsentrasiyaları isə sabit saxlanıldı. Məhsulun görünüşü, başlanğıcın funksiyası kimi qurulmuşdur ağır substrat konsentrasiyası və ilkin sürət sabitləri müəyyən edilmişdir. İlkin xətti sürətin son nöqtəsi 6 dəqiqə olaraq təyin olundu. Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, ABŞ) bütün kinetik əyriləri çəkmək və kinetik parametrləri hesablamaq üçün istifadə edilmişdir. Bu vmaks 2,2 μM · min –1 , K olaraq hesablanmışdırm = 39,3 μM və kpişik İlkin yATE1 təmizləməmizdə = 16,1 dəq –1 (Cədvəl 1 və Şəkil 2(C)-ə baxın). Bu təcrübədə dəqiqədə 220 pmol EPGLCTWQSLR (MW 1289.49) və ya 7 dəqiqədə 2 µg çevrilir. Hər LC/MS təcrübəsi üçün təhlil edilən peptid qarışığının tipik miqdarı 2-5 µg olduğundan, bu fermentativ parametrlərin ümumi proteomik iş axınlarına uyğun olan miqyasda arginilasiyanın tətbiqini davam etdirmək üçün uyğun olduğu qənaətinə gəlirik.

Substrat peptid konsentrasiyası (μM) İlkin sürət (μM min –1 ) Məzənnə sabitləri
yATE1
4.48 0.243 ± 0.037 Vmaks 2.238
11.2 0.496 ± 0.170 Km 39.34
22.4 0.805 ± 0.210 kpişik 16.08
51.5 1.271 ± 0.455 kpişik/Km 0.408

Arginilasyonun 13 kimyəvi sintez edilmiş və kalibrlənmiş peptidlərə qədər genişləndirilməsi

The pentadeutero metodu MS1-ə əsaslanır m/z MALDI-MS istifadə edərək dəyər ölçmələri və etiketləmə üçün daxili Cys tələb edir. Daha mürəkkəb peptid qarışıqları üçün MS1 m/z dəyərlər peptid substratlarını və məhsulları birmənalı şəkildə müəyyən etmək üçün kifayət deyil. Bundan əlavə, bütün peptidlər daxili Cys ehtiva etmir. Beləliklə, bir peptid substratından kənar arginilasiya tətbiq etmək üçün N-terminal aspartat və ya glutamat ilə kimyəvi sintez edilmiş və amin turşusu analizi ilə kalibrlənmiş 13 peptidi seçdik. Bu 13 substrat peptidləri ferment reaksiyasına görə 5 ilə 405 pmol arasında dəyişən müxtəlif konsentrasiyalarda arginilləşdi və tək 90 dəqiqəlik son nöqtə ESI-LC/MS ilə təhlil edildi (bax Eksperimental bölmə və Yardımçı Məlumat, 13-substrat-peptidlər 28). Arginil hissəsinin substrat peptidinin N-terminusuna konjuqasiyası ilə əlaqədar olaraq, substrat peptidi ilə arginilləşdirilmiş məhsul peptidi arasında əks faza C18-də xətti qradiyentdə orta hesabla 10% əvvəl aydın tutma vaxtının dəyişməsi baş verdi. sütun. Ümumilikdə, 13 substrat peptidinin arginilləşmə reaksiyası 5 və 45 pmol substrat peptidində kəmiyyətə yaxın idi. Arginilləşmə reaksiyasına hər reaksiya üçün 405 pmol peptid ilə etiraz edildikdən sonra 90 dəqiqədən sonra arginilləşmənin effektivliyi artıq kəmiyyət deyildi (bax. Şəkil 3(A) və 3(B)). Məsələn, DAGVVCTDETR peptidi 13,3 dəqiqədə, onun arginilləşdirilmiş versiyası isə 11,7 dəqiqədə süzülür. Ümumilikdə, peptid çox yüksək arginilləşmə dərəcəsinə malikdir (Şəkil 3(A)). Bu substrat peptid EAQISSAIVSSVQSK fərqlidir, substrat peptid böyük bir hissəsinin (23.3 dəq elüsyon) hələ də reaksiya vermədiyi eyni şəraitdə reaksiya, (Şəkil. 3(B)). Daha mürəkkəb nümunədən istifadə edərək bu substratın meylini daha da araşdırmaq üçün biz ekvimolyar nisbətdə 50 zülaldan (hər flakona 5 pmol) ibarət Universal Protein Standard 1 (UPS1) proteolitik həzmindən istifadə edərək arginilləşmə reaksiyasını həyata keçirdik.

Proteaz həzminin optimallaşdırılması və etiketləmə qərəzinin araşdırılması

Arginilasiya üçün uyğun substrat peptidlərini əldə etmək üçün UPS1 zülalları Asp-N istifadə edərək həzm olundu, nəticədə N-terminal aspartat və ya glutamat, lakin qeyri-spesifik C-terminalları yarandı. Proteolitik peptidlər 90 dəqiqə ərzində arginilləşdirildi və sonra standart C18 təmizləmə proseduru ilə duzsuzlaşdırıldı. LC/MS istifadə edərək, N-terminal aspartat və ya glutamat olan 149 peptidlərin arginilləşdiyi aşkar edilmişdir. Bəzi hallarda, peptidlərin turşu amin turşuları ilə arginilasiyası aşkar edilmədikdə, Skyline 16 istifadə edərək MS1 ion xromatoqramlarının əl ilə yoxlanılması nəzəri dəyərlərə uyğun gələn çoxlu cüt substrat və məhsul peptid prekursor ion kütlələrini aşkar etdi (bax. Köməkçi Məlumat, UPS1_AspN2_dig) . Bəzi hallarda, yalnız substrat peptidləri LC gradientində çox erkən süzülür. Arginilasiya xromatoqrafik yerdəyişmə ilə nəticələnəcəyindən (bax. Şəkil 3), biz güman edirik ki, bəzi arginilləşdirilmiş peptidlər istifadə olunan C18 sütun materialına bağlanmaq üçün çox qütblü ola bilər. Beləliklə, bütün substrat peptidlərinin arginilləşdiyi və ov tüfənginin MS/MS və ya xromatoqrafik performansının stokastik nümunə götürmə yanaşması, yəqin ki, bəzi substrat peptidlərinin arginilləşdirilmiş versiyası üçün MS/MS spektrlərinin olmamasının səbəbi olduğu qənaətinə gəlirik. 50 UPS1 peptidinin Asp-N həzminin araşdırılması yalnız 35 zülalın aşkar edildiyini göstərir.

Aşkar edilə bilən zülalların sayını artırmaq üçün tək Asp-N proteaz həzmi ikiqat həzmdən istifadə etməklə daha da optimallaşdırıldı, məs. Lys-C. Lys-C və Asp-N-nin ikiqat həzmi arginilasiya üçün substrat peptidləri və C-terminal Lys ilə peptidlərlə nəticələnir. Bundan əlavə, bu peptidlər arginilləşməmiş və arginilləşdirilmiş peptidlərin MS/MS parçalanması arasında birbaşa müqayisə aparmağa imkan verəcəkdir. Beləliklə, UPS1 zülal standartı əvvəlcə Lys-C, sonra Asp-N həzmindən istifadə edərək həzm olundu. Nəticədə yaranan peptid qarışığı arginilləşdirildi və peptidlər LC/MS ilə təhlil edildi. Sonrakı silisiumda MS/MS spektrlərinin annotasiyası 45 zülal üçün eksperimental sübutlarla nəticələndi, mono Asp-N həzminə nisbətən 20% artım. Peptid səviyyəsində N-terminal turşulu amin turşusu olan 156 peptid aşkar edilmişdir. Bu peptidlərin əksəriyyəti kəmiyyətcə arginilləşmiş və ya həm arginillənmiş, həm də qeyri-arginilləşdirilmiş formalar aşkar edilmişdir (bax Dəstəkləyici Məlumat, UPS1_LysC_AspN_digest 28).

Arginilasyonun peptid parçalanmasına təsirini daha ətraflı göstərmək üçün biz UPS1 Lys-C/Asp-N ikiqat həzmindən peptidləri seçdik. Şəkil 4(A)-da göründüyü kimi, peptid DDHFLF prekursoru [M+2H + ] 2+ ion fraqmentləri altı şərhli məhsul ionuna bölünür. Bununla belə, peptidin arginilasiyası zamanı [M+2H+] 2+ prekursor ion fraqmentləri və annotasiya edilmiş ionların sayı ikiqat artır (Şəkil 4(B)), baxmayaraq ki, peptidin N-terminusuna yalnız bir amin turşusu əlavə edilmişdir. peptid. Şəkil 4(C) [DDTVCLAK+2H + ] 2+-nin MS/MS spektrini iki Asp qalığına qədər genişləndirilmiş C-terminal ilə göstərir. Bu gücləndirilmiş parçalanma arginilasiya zamanı aradan qaldırılır, nəticədə [RDDTVCLAK+2H+] 2+ ionunun daha balanslı parçalanması baş verir. Nəticədə yaranan MS/MS spektri b- və y-fraqment ion nərdivanlarından ibarətdir (Şəkil 4(D)). Arginilasyonun prekursor ion parçalanmasına töhfəsini göstərən üçüncü nümunə EGVVGAVEK peptididir. [EGVVGAVEK+2H + ] 2+ prekursor ionunun parçalanması çox az annotasiya edilmiş məhsul ionları ilə nəticələnir (Şəkil 4(E)), arginilasiyadan sonra tam b- və y-fraqment ion nərdivanları şərh edilmişdir (Şəkil 4(F)) ). Bütün MS/MS spektrləri yük vəziyyətinə uyğun olduğundan, arginilasyonun peptid parçalanmasına təsirini öyrənmək mümkündür. Arginilləşməmiş peptidlər (şək. 4(A), 4(C) və 4(E)) iki protonu, biri N-terminusun əsas amininə, ikincisi isə əsas amin turşusunun yan zəncirinə bağlayır. peptid ardıcıllığı. Bu, hər ikisinin əsas amin turşularının yan zəncirində yerləşdiyi iki protonu təmin edən arginilləşdirilmiş peptidlərdən (şək. 4(B), 4(D) və 4(F)) fərqlidir. Yan zəncirlə təcrid olunmuş protonlar, parça ion nərdivanlarını yaratmaq üçün peptid onurğasının daha stokastik parçalanmasına imkan verir. Əlavə protonun, ehtimal ki, peptidin N-terminusunun əsas amininə daxil olması ilə məhsul ionları yenidən qeyri-bərabər paylanır. Peptid EPISVSSEQVLK UPS1 ikiqat həzm məlumat dəstində üç dəfə aşkar edilmişdir: arginillənməmiş [M+2H + ] 2+ (Şəkil 5(A)), arginilləşdirilmiş [M+2H + ] 2+ (Şəkil 5(B)) və arginilləşdirilmiş [M+3H + ] 3+ (şək. 5(C)). [EPISVSSEQVLK+2H + ] 2+ (Şəkil 5(A)) ən dominant məhsul ionu Val arasında peptid onurğasının parçalanması ilə yaranan y7 +-dır.5 və Ser6. Arginilasiyadan sonra [REPISVSSEQVLK+2H + ] 2+ ionunun əmələ gəlməsində (Şəkil 5(B)) Arg və Lys-in hər bir amin turşusu yan zənciri protonu sekvestr edir, nəticədə b fraqmentinin və y-nin bərabər paylanmış parçalanma nümunəsi yaranır. -ion ​​tələsi CID zamanı ionların parçalanması. Bununla belə, peptidin N-terminalının əsas amininə əlavə proton əlavə edildikdən sonra [REPISVSSEQVLK+3H + ] 3+ ionu (Şəkil 5(C)) üstünlük verilən yerlərdə yenidən parçalanır, məs. Glu və Gln arasında. Bu nəticələrdən (və digərləri Dəstəkləyici Məlumatda, UPS1_LysC_AspN_digest 28) biz belə nəticəyə gəlirik ki, arginilasiya peptidlərin parçalanmasını gücləndirir və nisbətən qısa peptidlərin aşkarlanmasına imkan verir.

Peptid səviyyəsində orta zəncirli arginilasiya aşkar edilmir

Yalnız N-terminal turşulu amin turşularının ATE1-in substratları olduğu deyil, həm də orta zəncirli Asp və ya Glu-nun yan zəncirli karboksil qrupları vasitəsilə arginilləşə biləcəyi barədə məlumatlar var. 17, 18 Peptidlərin orta zəncirli arginilasiyasını sınamaq üçün biz UPS1 təcrübələrinin 90 dəqiqəlik son nöqtə reaksiyalarını aşkar etmək üçün xüsusilə faydalı olan Mascot səhvə dözümlü axtarış seçimindən (Matrix Science, London, UK) istifadə edərək yenidən təhlil etdik. gözlənilməz kimyəvi və ya post-translational dəyişikliklər. Gözlənildiyi kimi, əlavə +156.10 kütləsi (Arg hissəsinə ekvivalent) yalnız N-terminal qalıqlarında aşkar edilmişdir, lakin orta zəncir qalıqlarında deyil (bax. Köməkçi Məlumat, error-tolerant-search.csv 28). Zülal səviyyəsində ATE1-in orta zəncirli turşu amin turşularını arginilləşdirə biləcəyini istisna edə bilmərik, lakin peptid səviyyəli təcrübələrimizdə yATE1 yalnız arginillənmiş N-terminal qalıqlarını göstərir.


MALDI-TOF Kütləvi Spektrometriya

Kütləvi spektrometriya nümunələrin yüklü molekullara ionlaşdığı və onların kütləsinin yükə nisbətinin (m/z) ölçülə biləcəyi analitik üsuldur. MALDI-TOF kütlə spektrometriyasında ion mənbəyi matrislə dəstəklənən lazer desorbsiya/ionlaşdırma (MALDI), kütlə analizatoru isə uçuş vaxtı (TOF) analizatorudur.

MALDI, analit molekullarını parçalamadan və ya parçalamadan qaz fazasına çevirmək üçün kiçik molekullardan ibarət matrisa lazerin vurulmasını əhatə edən yumşaq ionlaşmadır. Bəzi biomolekullar çox böyükdür və qızdırıldıqda parçalana bilər və ənənəvi üsullar makromolekulları parçalayacaq və ya məhv edəcək. MALDI peptidlər, lipidlər, saxaridlər və ya digər üzvi makromolekullar kimi biomolekulları təhlil etmək üçün uyğundur.

Şəkil 1. Analitlərin MALDI ilə ionlaşması

Şəkil 1-də analit, adətən keçirici metaldan hazırlanmış və tətbiq olunacaq bir neçə müxtəlif nümunələr üçün ləkələrə malik olan, hədəf adlanan bərk səthdə çökdürülmüş matriks birləşməsinin çox böyük hissəsinə yerləşdirilmişdir. Çox qısa bir lazer nəbzindən sonra şüalanmış nöqtə sürətlə qızdırılır və vibrasiya ilə həyəcanlanır. Nümunənin səthindən enerjili şəkildə ayrılan matris molekulları lazer enerjisini udur və analit molekullarını qaz fazasına da aparır. Ablasiya prosesi zamanı analit molekulları adətən yaxınlıqdakı matris molekulları ilə protonlaşdırılaraq və ya deprotonlaşdırılaraq ionlaşdırılır. Ən çox yayılmış MALDI ionlaşma formatı analit molekullarının tək müsbət yük daşımasıdır.

Həm ultrabənövşəyi (UV) və həm də infraqırmızı (İQ) dalğa uzunluqlu lazerlər istifadə olunur, lakin UV lazerlər analitik MALDI-də ən vacib işıq mənbələridir. Bunlar arasında azot lazerləri və tezliyi üç və ya dörd dəfə artırılmış Nd: Yag lazerləri əksər hallarda tətbiqlərin əksəriyyətinə xidmət edir. IR-MALDI-də Er:Yag lazerləri üstünlük təşkil edir, TEA-CO2 lazerləri isə nadir hallarda istifadə olunur.

Hesab edilir ki, matrisin ilk funksiyası mahiyyət etibarilə analit molekullarını bir-birindən sulandırmaq və təcrid etməkdir. Bu, həlledicinin buxarlanması və bərk məhlulun eyni vaxtda formalaşması zamanı baş verir. Sonra lazer şüalanması zamanı enerjinin udulması üçün vasitəçi rolunu oynayır. Düzgün matrisin seçimi MALDI-da uğurun açarıdır. Ümumiyyətlə, yüksək qütblü analitlər yüksək qütblü matrislərlə daha yaxşı işləyir və qeyri-qütblü analitlər qeyri-polyar matrislərlə birləşdirilmişdir. Cədvəl 1-də göstərildiyi kimi, müxtəlif matrislər axtarılmış və geniş şəkildə istifadə edilmişdir. Hal-hazırda ən çox istifadə olunan matrislər α-siyano-4-hidroksisinnamik turşu, 2,5-dihidroksibenzoy turşusu, 3,5-dimetoksi-4-hidroksisinnamik turşu və 2,6-dihidroksiasetofenondur.

Cədvəl 1. UV-MALDI matrisləri (Gross J. H., 2006)

Qarışıq Akronim üçün müraciət
Nikotin turşusuNAPeptidlər, zülallar
Pikolin turşusuPAOliqonukleotidlər, DNT
3-Hidroksipikolin turşusuHPA, 3-HPAOliqonukleotidlər, DNT
3-aminopikolin turşusu3-APAOliqonukleotidlər, DNT
6-Aza-2-tiotiminATTOliqonukleotidlər, DNT
2,5-dihidroksibenzoy turşusuDHBZülallar, oliqosakaridlər
DHB əsaslı qarışıqlarDHB/XY və super-DHBZülallar, oliqosakaridlər
3-aminokinolin3-AQOliqosakaridlər
α-Siyano-4-hidroksisinnamik turşuα-CHC, α-CHCA, 4-HCCA, CHCAPeptidlər, daha kiçik zülallar, triaçilqliserinlər, çoxsaylı digər birləşmələr
4-Xloro-α-siyano-sinnamik turşuClCCAPeptidlər
3,5-Dimetoksi-4-hidroksisinnamik turşuSAZülallar
2-(4-Hidroksifenilazo) benzoy turşusuHABAPeptidlər, zülallar, qlikoproteinlər, polistirol
2-merkaptobenzotiazolMBTPeptidlər, zülallar, sintetik polimerlər
5-xloro-2-merkaptobenzotiazolCMBTQlikopeptidlər, fosfopeptidlər və zülallar
2,6-DihidroksiasetofenonDHAPQlikopeptidlər, fosfopeptidlər, zülallar
2,4,6-TrihidroksiasetofenonTHAPBərk dəstəkli oliqonukleotidlər
Ditranol (1,8,9-antrasentriol)Heç biriSintetik polimerlər
9-Nitroantraken9-NAFullerenlər və törəmələr
Benzo[a]pirenHeç biriFullerenlər və törəmələr
2-[(2E)-3-(4-tert-Butilfenil)-2-metilprop-2-eniliden]malonitrilDCTBOliqomerlər, polimerlər, dendrimerlər, kiçik molekullar

Uçuş vaxtı (TOF) analizatoru

Şəkil 2. TOF analizatorunun ümumi sxemi. (A) Layner TOF analizatoru (B) Reflektor TOF analizatoru (C) Layner TOF analizatorunda ionların sahədən azad bölgədən keçdiyi vaxtın törəmə prosesi.

Şəkil 2-də göstərildiyi kimi, TOF-un əsas prinsipi ondan ibarətdir ki, müxtəlif m/z ionları məlum uzunluqda sahəsiz sürüşmə yolu boyunca uçuş zamanı zamanla dağılır. Bir şərtlə ki, bütün ionlar səyahətə eyni vaxtda və ya heç olmasa kifayət qədər qısa zaman intervalında başlasalar, yüngül olanlar daha ağır olanlardan daha tez detektora çatacaqlar.

Nəzəri olaraq, bütün ionlara eyni ilkin kinetik enerji verilir, belə ki, sahədən azad bölgə boyunca sürükləndikdən sonra eyni m/z ionları həmin anda detektorda olur. Bununla belə, praktikada nəbz bütün ionlar tərəfindən eyni intensivlikdə hiss olunmur və buna görə də eyni m/z dəyərlərinin bütün ionları ideal sürətlərinə çatmır. Bu problemi düzəltmək üçün tez-tez sürüşmə zonasının sonuna bir əks tətbiq olunur. Yansıtıcı yüksək gərginliyə malik bir sıra halqa elektrodlarından ibarətdir ki, bu da ionları adətən bir az yerdəyişmiş bucaq altında uçuş borusu boyunca geri qaytara bilir.

Fərqli kinetik enerjili ionlar reflektordan əks istiqamətə atılmadan əvvəl reflektora müxtəlif dərinliklərə nüfuz edir. Daha çox kinetik enerji daşıyan daha sürətli ionlar daha yavaş olanlardan daha uzun yol qət edəcək və beləliklə, daha az enerji daşıyan daha yavaş ionlara nisbətən reflektorda daha çox vaxt keçirəcəklər. Beləliklə, detektor eyni kütləyə malik ionları (təxminən) eyni vaxtda alır. Beləliklə, TOF kütlə analizatoru üçün bu dizayn onların ayırdetmə qabiliyyətini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı. Bununla belə, reflekron TOF analizatoru elektrik sahəsinə dözmək üçün kifayət qədər sabit olmayan analitlər üçün uyğun deyil.

MALDI-TOF kütləvi spektrometriya prosesi

Şəkil 3. MALDI-TOF kütləvi spektrometriya prosesi (Clark A. E., və b. 2013)

Analit bəzi həlledicilərdə ən azı 0,1 mq/ml qədər həll olmalıdır. Və matris ya doymuş məhlul, ya da təxminən 10 mq/ml konsentrasiya əldə etmək üçün həll edilir. Sonra analitin məhlulu matrisin məhlulu ilə qarışdırılır. Optimallaşdırılmış MALDI spektrləri üçün molar matris-analitə nisbəti normal olaraq 1000: 1-dən 100.000: 1-ə qədər olan diapazona uyğunlaşdırılır. Sonra qarışıq analiz üçün metal hədəf plitə üzərində ləkələnir. Quruduqdan sonra nümunə və matrisin qarışığı birlikdə kristallaşır və matrisə daxil edilmiş nümunənin bərk çöküntüsünü əmələ gətirir. Plitə sonradan MALDI-TOF alətinə yüklənir və müvafiq sistemlə əlaqəli proqram təminatı ilə təhlil edilir. MALDI həm nümunənin, həm də matrisin sublimasiyasına və ionlaşmasına gətirib çıxarır. Bu yaranan ionlar TOF analizatoru vasitəsilə m/z-dən asılı olaraq ayrılır və bu ionların spektral təsviri yaradılır və MS profili yaradan MS proqramı tərəfindən təhlil edilir.

MALDI-TOF kütlə spektrometriyasının tətbiqi

Bütöv kütlənin təyini zülalın xarakteristikası üçün əsas və vacibdir, çünki zülalın düzgün molekulyar çəkisi bütöv strukturu göstərə bilər. MALDI, yumşaq ionlaşdırma texnikası, digər ionlaşdırma üsulları ilə ionlaşdıqda kövrək və parçalanan zülallar üçün uyğundur. MALDI-TOF MS məhsuldarlığına tampon komponentləri, yuyucu vasitələr və çirkləndiricilər daha az təsir edir. Bundan əlavə, ardıcıllığın yoxlanılması üçün kifayət qədər dəqiqliklə (≤ 500 ppm) bütöv protein kütləsinin təyin edilməsinə imkan verir. Protein həzmindən sonra MALDI-TOF MS, peptid kütləsinin barmaq izi ilə sonrakı ilkin ardıcıllığın təsdiqi üçün əldə edilmiş peptidləri təhlil etmək üçün də istifadə edilə bilər.

MALDI-TOF kütlə spektrometriyası sadə işləməyə, yaxşı kütlə dəqiqliyinə, həmçinin yüksək ayırdetmə qabiliyyətinə və həssaslığa malikdir. Buna görə də, iki ölçülü gel elektroforezi (2-DE) ilə tez-tez istifadə olunan peptid kütləsi barmaq izi adlanan üsulla sadə qarışıqlardan zülalları müəyyən etmək üçün proteomikada geniş istifadə olunur. Bu yanaşmada peptidlər maraq doğuran zülalları tripsin kimi ardıcıllıqla xüsusi fermentlə həzm etməklə əmələ gəlir. Sonra peptid kütlələrini əldə etmək üçün MALDI-TOF kütlə spektrometriyası ilə peptidlər təhlil edilir. Eksperimental kütlələr eyni ardıcıllıqla spesifik proteaz ilə verilmiş orqanizmin nəzəri peptid kütlələrini ehtiva edən verilənlər bazası ilə müqayisə edilir.

Reflektorlarla təchiz olunmuş MALDI-TOF kütlə spektrometrləri uçuş zamanı kortəbii olaraq parçalanan prekursor ionlarından yaranan fraqment ionlarını təhlil edə bilir. Bu cür ionlar ümumiyyətlə metastabil ionlar adlanır və ion mənbəyi ilə reflektor arasındakı sahədə sərbəst bölgədə parçalanma prosesi adətən PSD adlanır. PSD fraqment ionları refletrona girməzdən əvvəl sahədən azad bölgədə əmələ gəlir. PSD fraqment ionları peptidlərin və zülalların ilkin strukturu üçün çox zəngin və effektiv struktur məlumatı təmin edən PSD kütlə spektrini yaratmaq üçün reflektor gərginliyini davamlı olaraq dəyişdirərək detektorda ayrıla, toplana və qeydə alına bilər. Proteomika tədqiqatında bəzi 2DE ilə ayrılmış zülal nümunələri PMF tərəfindən müəyyən edilə bilməz və ya identifikasiya nəticələri aydın deyil. PSD ardıcıllığı funksiyası bu zülalların identifikasiyası üçün tətbiq oluna bilər. PSD spektroskopiyasından istifadə etməklə, verilənlər bazası axtarışı ilə birlikdə zülalları tez və yüksək spesifikliklə müəyyən etmək olar.

Molekulyar biologiya texnikalarının və antisens nuklein turşusu dərman texnologiyalarının inkişafı ilə primerlər, zondlar və antisens dərmanları kimi istifadə edilmək üçün getdikcə daha çox oliqonukleotid fraqmentləri sintez edilmişdir. Sintezin tam olub-olmadığını və sintez edilmiş ardıcıllığın düzgün olub olmadığını müəyyən etmək üçün bu fraqmentləri tez bir zamanda aşkar etmək tamamilə lazımdır. Kütləvi spektrometriya, o cümlədən MALDI-TOF-MS, bunun üçün ən yaxşı vasitədir. MALDI-TOF-MS istifadə edərək oliqonukleotid analizi sadə, sürətli, dəqiq və həssas idi, oliqonukleotidlərin tam ardıcıllığını müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər.

MALDI-TOF, MALDI görüntüləmə kütlə spektrometriyası (MALDI-IMS) kimi tanınan nazik toxuma kəsiklərindən birbaşa zülalların profilləşdirilməsi və təsvirində istifadə edilə bilər. Təhlil olunan bölmədə peptidlərin və zülalların yerli molekulyar tərkibi, nisbi bolluğu və məkan paylanması haqqında xüsusi məlumat verir. MALDI-IMS, toxumalardakı hüceyrələrin və molekulların bütövlüyünü qoruyarkən toxumanın molekul görüntüsünü əldə edə bilən bir ölçmə vasitəsilə bioloji toxuma bölmələrində eyni vaxtda çoxlu naməlum birləşmələri təhlil edə bilər.

MALDI-TOF kütlə spektrometriyası peptidlər, zülallar, karbohidratlar, oliqonukleotidlər və s. kimi müxtəlif biomolekulları təhlil edə bilər. Yaranan ionların aşağı daxili enerjiyə malik olması səbəbindən MALDI-TOF-un böyük üstünlüyü ondan ibarətdir ki, yumşaq ionlaşma prosesi ionlaşmış molekulları az miqdarda analitlərin parçalanması ilə müşahidə etməyə imkan verir, hətta analitlərin molekulyar ionlarını müəyyən etməyə imkan verir. qarışıqlar daxilində. Sürətli məlumatların əldə edilməsi ilə istifadəsi və saxlanması asandır. Uğurlu MALDI-TOF kütlə spektrometriyası üçün uyğun matris maddəsinin seçilməsi vacibdir.

Creative Proteomics-də biz qabaqcıl MALDI-TOF kütləvi spektrometriya platformalarımız əsasında müxtəlif xidmətlər təqdim edə bilərik, o cümlədən:

1. Ümumi J H. Kütləvi spektrometriya: dərslik. Springer Elm və Biznes Media, 2006.
2. Boesl U. Uçuş vaxtı kütlə spektrometriyası: Əsaslara giriş. Kütləvi spektrometriya rəyləri, 2017, 36(1): 86-109.
3. Guerrera I C, Kleiner O. Kütləvi spektrometriyanın proteomikada tətbiqi. Bioscience Reports, 2005, 25(1-2): 71-93.
4. Fuchs B, Schiller J. MALD - TOF kütlə spektrometriyasının lipidomikada tətbiqi. Avropa Lipid Elmi və Texnologiyası Jurnalı, 2009, 111(1): 83-98.
5. Duncan M W, Roder H, Hunsucker S W. Kəmiyyət matrisli lazer desorbsiya/ionlaşma kütlə spektrometriyası. Funksional genomika və proteomika üzrə brifinqlər, 2008, 7(5): 355-370.
6. Kenny DJ, Brown JM, Palmer M E, və b. Mənbədən sonrakı çürümə MALDI-TOF təhlilinə paralel yanaşma. Amerika Kütləvi Spektrometriya Cəmiyyətinin jurnalı, 2006, 17(1): 60-66.

Zəhmət olmasa layihənizin ətraflı təsvirini təqdim edin. Tədqiqat istəklərinizi qarşılamaq üçün sizə fərdiləşdirilmiş layihə planı təqdim edəcəyik. Siz həmçinin sorğular üçün birbaşa e-poçt ünvanına göndərə bilərsiniz.


Nəticələr

Sperma ümumi protein həzmində peptid səviyyələrinin müqayisəsi

Bu tədqiqatın məqsədi sperma kapasitasiyası nəticəsində baş verən fosforlaşma dəyişikliklərini təhlil etmək idi. Bu məqsədlə kauda epididimal siçan sperması (+BSA, +HCO) dəstəkləyən şəraitdə inkubasiya edilmişdir.3 − ) və ya dəstəkləmir (𢄫SA, −HCO3 − ) tutum. Zülalın fosforilləşməsinin diferensial təhlili üçün hər hansı bir cəhd üçün zəruri tələb eyni miqdarda zülalın fərqli nümunə növləri arasında müqayisə edilməsidir. Tutumlu (qapaq) və tutumsuz (NCap) alikotlarında eyni miqdarda zülalın olub olmadığını müəyyən etmək və hər iki nümunənin eyni həzm şərtlərinə məruz qaldığını təsdiqləmək üçün həzmlərin hər birinin ayrıca təhlili (Fisher esterifikasiyasına məruz qalmamışdır). (Cap5 və NCap5)) LTQ-FT kütlə spektrometrində aparılmışdır. Nüvə zülalının triptik peptidinə uyğun gələn pik sahələri siçan testisində (RDGFVTSKRKK) konstruktiv şəkildə ifadə olunur. m/z = 441.28) və tripsinin (VATVSLPR) avtomatik həzm edilməsi nəticəsində yaranan bir peptid m/z = 421,76) müqayisə edildi və müvafiq olaraq 0,92 və 1,26 nisbətinə malik olduğu müəyyən edildi (Şəkil 1), oxşar protein səviyyələrini və həzm dərəcəsini nümayiş etdirir.

Tutumsuz (A) və tutumlu (B) sperma ümumi protein həzmlərində müəyyən edilmiş peptidlərin müqayisəsi. Zirvədə m/z = 421.76, MS/MS analizi vasitəsilə tripsinin avtomatik həzmindən yaranan triptik peptid VATVSLPR olduğu müəyyən edildi, pik isə m/z = 441.28, MS/MS analizi vasitəsilə sperma nüvə zülalından olan RDGFVTSKRKK triptik peptid olduğu müəyyən edildi. Tutumsuz və tutumlu həzmlər arasında pik sahələrin nisbəti müvafiq olaraq 1,26 və 0,92-dir.

Protein həzmlərində fosfopeptid səviyyələrinin nümunədaxili müqayisəsi

Yüksək mürəkkəb tutumlu və tutumsuz məhlul həzmlərindən fosforlanmış peptidlərin selektiv IMAC zənginləşdirilməsinin problemli olacağı gözlənilirdi, çünki turşu qalıqlarının (yəni, glutamik və aspartik turşunun) hərəkətsizləşdirilmiş dəmir atomlarına bağlanması göstərilmişdir. 15 Fosforlaşdırılmamış, turşu qalıq tərkibli peptidlərin analizə müdaxiləsinin qarşısını almaq üçün hər bir nümunədəki peptid karboksilik turşuları iki ayrı reaksiya dəstində reagent kimi etiketlənməmiş və ya deyterium ilə işarələnmiş metanoldan istifadə edərək müvafiq metil efirlərinə çevrilmişdir. Bu, hər bir nümunədə diferensial fosfopeptid ifadəsinin sonrakı kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün çox vacib olsa da, bu ayrı reaksiyalar diferensial analiz aparılmazdan əvvəl nəzərə alınmalı olan başqa dəyişəni əlavə etdi. Hər bir reaksiyanın eyni dərəcədə davam edib-etmədiyini müəyyən etmək üçün hər bir nümunənin bərabər miqdarda Fisher esterifikasiyası hər iki reaksiyadan istifadə etməklə aparılmışdır. d0- və d4-reagent. Eyni nümunə növlərindən diferensial şəkildə dəyişdirilmiş peptidlər, tutumlu və ya tutumsuz (NCap (d0 efirləri) və NCap (d3 efirlər) və ya qapaq (d0 efirlər) və qapaq (d3 esterlər)), daha sonra yuxarıda təsvir edilən IMAC-nRPLC-MS/MS analizindən istifadə edərək birləşdirildi və təhlil edildi. Kalsium bağlayan tirozin fosforlaşma ilə tənzimlənən zülaldan (CABYR) (TKIpSIepSLK) triptik fosfopeptidinə uyğun gələn pik sahələri m/z = 603.79 (d0 etiketli) və 606.81 (d3 etiketlənmiş)) hər iki nümunə tipində müqayisə edilmiş və tutumu olmayan nümunələrdə 0,99, tutumlu nümunələrdə isə 0,95 nisbətində aşkar edilmişdir (Şəkil 2). Bu nəticələr diferensial etiketləmənin hər bir modifikasiya reaksiyasında eyni dərəcədə davam etdiyini təsdiqlədi. Əhəmiyyətli olan odur ki, bu eksperimentlər həm də diferensial şəkildə etiketlənmiş, fərqli nümunə növlərinin (NCap ()d0 efirləri) qapaqla (d3 efirləri) və ya NCap (d3 efirləri) qapaqla (d0 efirləri)) müqayisə edilmişdir.

Tutumsuz və tutumlu həzmlərin nümunədaxili müqayisəsi. Bərabər miqdarda CH3 və CD3 Fisher esterifikasiya olunmuş tutumsuz (A) və tutumlu (B) sperma ümumi zülal həzmlərinin birləşməsinin IMAC analizində müəyyən edilmiş diferensial etiketli fosfopeptid pik sahələrinin müqayisəsi. The d0/d3 pik nisbəti tutumsuz nümunədə 0,99 və tutumlu nümunədə 0,95 olub, bu peptidin CH3 və CD3 Fisher esterləşmiş nümunələrində oxşar tutum səviyyəsinə bərabər olduğunu təsdiqləyir.

Fosfopeptidlərin İdentifikasiyası üçün Diferensial İzotopik Etiketləmənin Dəyəri

Peptid ardıcıllığının fosfopeptid spektrlərinə təyin edilməsinə tez-tez fosfoserin və fosfotreonin qalıqlarının fosfor turşusunun neytral itkisini nümayiş etdirməsi mane olur, təkcə bütöv peptiddən deyil, həm də fosfat tərkibli peptidlərin əmələ gəldiyi peptid fraqmentlərindən də. ion tələsinin içərisində inert vanna qazı ilə toqquşmalar nəticəsində onurğa sütunu boyunca parçalanmışdır. 16 Bu, ardıcıl məlumatlandırıcı ionlara uyğun gəlməyən və saxta peptid ardıcıllığı təyinatları ilə nəticələnən zirvələrin üstünlük təşkil etdiyi izdihamlı MS/MS spektri ilə nəticələnir. Bu tədqiqatda izlənilən Fisher esterifikasiya protokolunun əlverişli nəticəsi ondan ibarətdir ki, eyni, lakin differensial olaraq etiketlənmiş fosfopeptidlər üçün əldə edilmiş MS və MS/MS məlumatlarının müqayisəsi onların düzgün ardıcıllığının təyin edilməsində çox faydalıdır. Birincisi, hər bir fosfopeptiddən olan izotopik nümunələrin vizual təftişi onların yük vəziyyətini aşkar edir və iki müxtəlif izotopik zərf arasında kütləvi yerdəyişməni müqayisə edərək, peptiddə turşu qalıqlarının sayını təyin etməyə imkan verir. Məsələn, Şəkil 3-də göstərildiyi kimi, 12 C və 13 C izotopları arasında 0,5 amu fərq m/z = 603.79 və m/z = 606.81 göstərir ki, bu peptidlərin hər ikisi +2 yüklüdür. Bundan əlavə, 3.02 amu arasında kütləvi sürüşmə m/z = 603.79 və m/z = 606.81 göstərir ki, bu peptidin biri C-terminusunda (həmişə mövcuddur) və biri də glutamik və ya aspartik turşu qalıqlarında olmaqla 2 modifikasiyadan ibarətdir. Hər iki müşahidə TKIpSIepSLK-nın təyin edilmiş ardıcıllığı ilə razılaşır və bu, hər bir peptiddən MS/MS spektrlərinin müqayisəsi ilə daha da təsdiqlənə bilər. Şəkil 4-də göstərildiyi kimi, b- və y-tipli ionlar müvafiq kütləvi yerdəyişmələri əsasında hər bir spektrdən asanlıqla seçilir: y-ionları karboksidin mövcudluğuna görə deyterium etiketli peptiddə həmişə ən azı 3 amu yerdəyişəcəkdir. -terminus, b-ionları isə yalnız dəyişdirilmiş turşu qalığını ehtiva etdikdə yerdəyişməni aşkar edəcək. Bu şəkildə FT-ICR analizi ilə əldə edilən məlumat (dəqiq kütlə və karboksil qruplarının sayı) MS/MS analizləri tərəfindən verilən tamamlayıcı məlumatla (fraqment ionları, ardıcıllıq etiketləri və neytral itkilərdən fosforlanmış qalıqların minimum sayı) birləşdirilə bilər. fosfor turşusu) düzgün peptid ardıcıllığını tez müəyyən etmək üçün.

Tək bir skandan ikiqat yüklənmiş deuterasiya edilmiş və qeyri-deuterasiya edilmiş TKIpSIepSLK peptidlərinin izotopik paylanması, burada hər iki peptidin HPLC sütunundan süzülməsi. LTQ-FT alətində detektor kimi FT-ICR hüceyrəsindən istifadə etməklə təmin edilən dəqiq kütlə ölçmələri (bu halda 5 ppm) bu peptidlərin ikiqat yükləndiyini (fərdi izotopik zərflərdə 0,5 amu kütlə fərqi) və əlaqəli (kütləvi) aşkar etdi. izotopik zərflər arasında 3.020 amu fərq). Peptidlərin tərkibində olan karboksil qruplarının sayı Şəkil 3-də göstərilən tənlikdən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir. Kütləvi fərq, əlaqəli deyterləşdirilmiş və qeyri-deuterasiya edilmiş peptidlərin monoizotop kütlələri arasındakı fərqə, yük vəziyyəti isə 12 C arasındakı kütlə fərqinin əksinə aiddir. və eyni yük zərfində 13 C zirvələri.

Triptik deuterasiya edilmiş (A) və qeyri-deuterasiya edilmiş (B) fosfopeptid TKIpSIepSLK-nın MS/MS spektrləri. B və y tipli ionlar üçün proqnozlaşdırılan monoizotop kütlələr müvafiq olaraq ardıcıllığın yuxarısında və altında göstərilmişdir. Spektrdə müşahidə olunan ionların altı çizilir və fosfor turşusunu itirənlər qalın şriftlə göstərilir. Etiket, Δ, b və ya y tipli müvafiq iondan fosfor turşusunun itirilməsini bildirir. K-OMe Fisher esterləşdirilmiş C-terminal lizini, 𠇎” isə Fisher esterləşmiş qlutamik turşusunu təmsil edir. Deuterasiya edilmiş spektrlərdə +3 amu yerdəyişən b və y ionları üçün kütlələr mavi, +6 amu sürüşən ionlar isə qırmızı rənglə təqdim olunur.

Sperma Ümumi Protein Həzmlərindən Fosfopeptidlərin Müəyyənləşdirilməsi

Hər bir nümunə növünün eyni miqdarda zülal ehtiva etdiyi və alternativ etiketləmə təcrübələrinin bu nisbəti pozmadığı müəyyən edildikdən sonra, iki oxşar, lakin eyni olmayan təcrübədən istifadə edərək fosfopeptid ifadəsinin diferensial təhlili aparıldı. Birinci təcrübədə ağır izotop etiketli tutumlu zülal həzmi yüngül izotop etiketli tutumsuz həzm ilə birləşdirildi (Cap (d3 efirləri) vs NCap (d0 efirləri)), ikinci təcrübədə isə d3 dəyişdirilmiş tutumsuz nümunə ilə birləşdirildi d0 dəyişdirilmiş tutumlu nümunə (Cap (d0 efirləri) vs NCap (d3 efirlər)). Bu birləşdirilmiş nümunələr daha sonra fosfopeptid zənginləşdirilməsi üçün IMAC-a məruz qaldı və müstəqil olaraq LTQ-FT hibrid xətti ion tələsi-Fourier Transform kütlə spektrometrində təhlil edildi. Hər bir analiz üçün ümumi ion xromatoqramları (TIC) gözlənildiyi kimi olduqca oxşar olsa da, pik cütlərinin nisbi intensivliyi təhlillər arasında tərsinə çevrildi (Şəkil 5). Hər bir xromatoqrafik qradient zamanı əldə edilən MS spektrlərinin vizual müqayisəsi yüzlərlə fosfopeptid cütünü müəyyən etdi, lakin bu cütləri təhlil etmək və fərqləri avtomatik müəyyən etmək üçün nəzərdə tutulmuş proqram təminatı hələ tamamlanmayıb. Bunun əvəzinə, bütün MS/MS spektrləri müvafiq MS/MS ardıcıllıq(lar)ının əl ilə təfsiri ilə təsdiq edilmişdir. Əhəmiyyətli odur ki, hər müəyyən edilmiş fosfopeptiddə karboksilik turşusu olan hər bir qalıq dəyişdirilmişdir ki, bu da bizim törəmə üsulumuzun sona çatdığını və karboksilik turşusu olan peptidlərin IMAC sütununa bağlanmasının qarşısını effektiv şəkildə aldığını göstərir.

TKIpSIepSLK və YLpYAMR-dan fərqli olaraq etiketlənmiş triptik fosfopeptidlər üçün ümumi ion xromatoqrammaları və tək ion xromatoqramları d0 qabiliyyətsiz/d3 tutumlu analiz (A) və d0 tutumlu/d3 tutumsuz analiz (B). Nəzərə alın ki, tutumlu nümunədən peptidlər üçün pik sahələri hər analizdə daha böyükdür və bu fenomenin nümunəyə xas olduğunu və diferensial etiketləmə artefaktı olmadığını nümayiş etdirir.

Protein həzmlərində fosfopeptid səviyyələrinin nümunələrarası müqayisəsi

Müvafiq nümunələrdə hər bir peptidin nisbi səviyyələrini əldə etmək üçün müvafiq deuterasiya edilmiş və qeyri-deuterasiya edilmiş fosfopeptidlərin pik nisbətlərindən istifadə edilmişdir. İlk növbədə, tutumlu nümunədə müəyyən edilmiş fosfopeptidlərin qeyri-kapasiteli nümunələrdə müəyyən edilmiş fosfopeptidlərə nisbətən səviyyəsi ilə maraqlandığımız üçün, tutumlu pik sahəsi hər analizdə hər bir peptid üçün tutumlu olmayan pik sahəsinə bölündü (Şəkil 6). Ümumi eksperimental sxemin dizaynı (Cap (d0 efirləri) vs NCap (d3 efirlər) və qapaq (d3 efirləri) vs NCap (d0 esterlər)) eyni zamanda hər bir peptid cütü üçün odds nisbətinin kvadratının və ya nisbətlərin nisbətinin hesablanmasına icazə verdi, bu da onların yaradılması və ya aşkarlanmasındakı fərqləri kompensasiya etdi. d0 ilə əlaqədar olaraq etiketlənmiş peptidlər d3 etiketli peptidlər. Bu texnikanın istifadəsi ilə yuxarıda müəyyən edilmiş 44 fosfopeptiddən 42-nin nisbi bolluğu müəyyən edilmiş və bir sıra dəyərləri təmsil etmişdir (Cədvəl 1). Bu peptidlərin bir neçəsi əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməsə də, digərlərinin tutumlu nümunədə artan təmsili tapıldı və bu, kapasitasiya prosesi nəticəsində bu ardıcıllıqların fosforlaşmasını güclü şəkildə göstərir. Məsələn, PERF15, 17 kimi tanınan yağ turşusunu bağlayan zülal 9-dan olan fosfopeptid LIpSSeNFeNYVR yalnız tutumlu nümunədə aşkar edilmişdir. Bəzi hallarda müşahidə edilən artan təmsildən fərqli olaraq, tutumsuz nümunədə digər fosfopeptidlərin daha çox olduğu aşkar edilmişdir ki, bu da bu ardıcıllıqların sperma tutumu zamanı defosforilasiyaya məruz qaldığını göstərir. Bunun bir nümunəsi, tutumu olmayan nümunədə yüksək səviyyədə tənzimləndiyi müəyyən edilmiş fosforlanmış peptid AIVpSPPVeMVeeIpSK-dır. Məlumatlarımız həmçinin göstərir ki, bir neçə peptidin proline yönümlü fosforilasiyaya məruz qalması bu tapıntının laboratoriyamızın əvvəlki nəticələri ilə üst-üstə düşür ki, bu da kapasitasiya prosesi nəticəsində siçan spermasında proline yönümlü fosforlaşmanın yuxarı tənzimləndiyini nümayiş etdirir. 11 Bundan əlavə, alternativ biokimyəvi üsullardan istifadə etməklə həm tutumsuz, həm də tutumlu siçan spermasında eyni dərəcədə tirozin-fosforilləşdiyi nümayiş etdirilən çox bol sperma zülalı olan heksokinazın bu işdə Tyr31-də fosforilləşdiyi göstərildi və Bu sahədə tutumlu və tutumlu olmayan sperma arasında fosforlaşmanın nisbi dərəcəsi 1,15 olaraq müəyyən edilmişdir. Bu müşahidə, müəyyən bir stimula məruz qalan hüceyrədə fosforlaşmanın nisbi kəmiyyəti üçün diferensial izotopik etiketləmənin faydalılığını daha da təsdiqləyir.

Diferensial etiketli triptik fosfopeptidlər üçün tək ionlu xromatoqramlar TKIpSIepSLK və YLpYAMR d0 qabiliyyətsiz/d3 tutumlu analiz (müvafiq olaraq A və C) və d0 tutumlu/d3 qeyri-kapasitetsiz analiz (müvafiq olaraq B və D). nisbətinin kvadrat kökü d3/d0 Deuterasiya edilmiş və qeyri-deuterasiya edilmiş peptid növlərinin müqayisəsi ilə bağlı potensial səhvləri aradan qaldırmaq üçün hər bir peptid üçün nisbətlər (bahis nisbəti) göstərildiyi kimi hesablanmışdır.

Cədvəl 1

Tutumlu (qapaqlı) və tutumsuz (NCap) siçan spermasının ümumi zülal həzmlərində müəyyən edilmiş fosfopeptidlər və onların nisbət nisbətinin (OR) kvadratına əsaslanaraq nisbi kəmiyyəti

fosfopeptid ardıcıllığıdoldurmaqexp. m/zhesablama. m/zfosfositlərNCBI qoşulma nömrəsiprotein adıVEYA Cap/Ncap
K.NIdLTAIIpSdLR.S2733.39733.391 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAH57001","term_id":"34784205","term_text":"AAH57001">> AAH57001Xarici Sıx lif 2 (Odf2) ​​zülalıYalnız Ncap-da
K.AIVpSPPVeMVeeIpSK.D2922.44922.432 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"XP_139384","term_id":"38077031","term_text":"XP_139384">> XP_139384Bu yaxınlarda NCBI verilənlər bazasından silindi0.04
K.TSAPTeIQSeLSSMR.Y3554.58554.591 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_080569","term_id":"21312846","term_text":"NP_080569">> NP_080569Sperma akrozomu ilə əlaqəli 10.56
K.(pTpS)ATeIQSeLSSMR.C2831.38831.381 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_080569","term_id":"21312846","term_text":"NP_080569">> NP_080569Sperma akrozomu ilə əlaqəli 10.62
K.(pTpS)ATEIQpSeLSpSMR.Y2911.35911.343 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_080569","term_id":"21312846","term_text":"NP_080569">> NP_080569Sperma akrozomu ilə əlaqəli 10.74
R.deMVAGpSQepSIK.V2755.30755.302 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_780347","term_id":"227330593","term_text":"NP_780347">> NP_780347Dynein, aksonemal, ara zəncir 10.74
R.TLpSdYNIQK.E2595.28595.281 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"CAI24672","term_id":"220808512","term_text":"CAI24672">> CAI24672Ubiquitin B1.12
K.YLpYAMR.L2455.69455.701 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAB57760","term_id":"1850119","term_text":"AAB57760">> AAB57760Heksokinaza1.16
R.TTpSMSHVGpSAIMVdLPR.T3663.95663.962 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"XP_355541","term_id":"82896089","term_text":"XP_355541">> XP_355541Hipotetik Protein LOC3815801.27
K.TLKPGPGAHpSPeK.V3476.24476.241 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_081295","term_id":"153791370","term_text":"NP_081295">> NP_081295SHIPPO-11.34
R.VPpSPR.R2325.16325.161 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"BAC26111","term_id":"26324714","term_text":"BAC26111">> BAC26111Naməlum1.36
R.LpSPdYK.R2415.69415.691 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"BAB24132","term_id":"12838224","term_text":"BAB24132">> BAB24132Naməlum1.37
K.eIeQpSPPGpSPK.A2685.79685.792 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAK49990","term_id":"13936908","term_text":"AAK49990">> AAK49990Kalsium bağlayan zülal CBP86𠄶1.39
K.(pTpS)ATeIQpSeLpSpSMR.C2951.33951.334 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_080569","term_id":"21312846","term_text":"NP_080569">> NP_080569Sperma akrozomu ilə əlaqəli 11.44
K.(pTpS)AQVVVGPVSeAePPK.A2908.97908.961 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAK49990","term_id":"13936908","term_text":"AAK49990">> AAK49990Kalsium bağlayan zülal CBP86𠄶1.58
K.SepSLQALQdK.V2620.80620.801 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAH50799","term_id":"29747766","term_text":"AAH50799">> AAH50799Spata18 protein1.60
R.pSPSHpSPATSApSYIGPIR.N2991.40991.403 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 1.61
R.SIpSQTGpSR.Q2505.19505.192 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_001074565","term_id":"124487360","term_text":"NP_001074565">> NP_001074565Hipotetik Zülal LOC758111.63
K.pSMVLGYWdIR.G2674.32674.311 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_742035","term_id":"25282395","term_text":"NP_742035">> NP_742035Glutatyon-S-transferaza1.66
K.TKIpSIepSLK.T2603.79603.792 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAK49990","term_id":"13936908","term_text":"AAK49990">> AAK49990Kalsium bağlayan zülal CBP86𠄶1.73
R.pSPSHpSPATpSASYIGPIR.N2991.40991.403 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 1.77
K.ApSLLpSNPIPeVK.T2728.35728.352 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"CAB57454","term_id":"6015589","term_text":"CAB57454">> CAB57454Testiküler haploid ifadəli gen (THEG) zülalı1.91
K.SPpSQTGLK.N2456.22456.221 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"CB273841","term_id":"28464164","term_text":"CB273841">> CB273841McCarry Eddy dəyirmi spermatid cDNA1.91
R.SPpSHpSPATSApSYIGPIR.N2991.40991.403 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 1.96
R.ASpSQpSPpSPHVQHVPR.G2934.37934.373 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 1.99
R.ApSpSQpSPSPHVQHVPR.G2934.37934.373 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 1.99
R.dLLpSIpSdGR.G2589.25589.252 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAH27526","term_id":"20380318","term_text":"AAH27526">> AAH27526Miyeloid Lösemi Faktor 1 (Mlf1)2.06
R.(pYpS)KepSLdAeK.R2693.29693.292 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAK39109","term_id":"13774963","term_text":"AAK39109">> AAK39109Otoimmün Sonsuzluqla əlaqəli Protein2.09
R.pSPSHpSPATSASYIGPIR.N2951.42951.412 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 2.19
R.(pSpY)epSpSIdeNeGYQK.S2979.85979.843 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAH06583","term_id":"13879232","term_text":"AAH06583">> AAH06583Ccdc136 zülalı2.28
K.GYpSVGdLLQeVMK.F2780.88780.871 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAM18540","term_id":"20271174","term_text":"AAM18540">> AAM18540Kinaz Ankraj Proteini 4 (AKAP4)2.29
R.SPpSHpSPATpSASYIGPIR.N2991.40991.403 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 2.49
R.SPpSHpSPATSASYIGPIR.N2951.41951.412 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 3.13
R.pSeGeLNLeTLeeK.E2827.90827.901 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAM18540","term_id":"20271174","term_text":"AAM18540">> AAM18540Kinaz Ankraj Proteini 4 (AKAP4)3.27
R.pSPpSHpSPATSASYIGPIR.N2991.40991.403 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 3.30
R.KKpSPTpSAeLLLIdPR.Y2935.49935.482 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_083218","term_id":"58037373","term_text":"NP_083218">> NP_083218Üzvi anion daşıyıcısı, üzv 6c13.34
R.SRpSPpSPIR.C2537.23537.232 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAH50799","term_id":"29747766","term_text":"AAH50799">> AAH50799Spata18 protein3.81
K.IRpSPpSPNR.S2550.74550.742 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAH50799","term_id":"29747766","term_text":"AAH50799">> AAH50799Spata18 protein3.86
R.ASpSQpSPPSPHVQHVPR.G2894.39894.392 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 3.98
K.TPTGQTHQpSPVSK.R2731.86731.341 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAA40413","term_id":"201923","term_text":"AAA40413">> AAA40413Testisə spesifik protein4.01
R.LSpSLVIQMAR.K2606.31606.321 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAM18540","term_id":"20271174","term_text":"AAM18540">> AAM18540Kinaz Ankraj Proteini 4 (AKAP4)4.62
K.KMpSpSMSLLFK.R2673.29673.292 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"XP_573518","term_id":"62659784","term_text":"XP_573518">> XP_573518Bu yaxınlarda NCBI verilənlər bazasından silindi6.03
R.RLTLPpSLSLQYdGAGR.S3618.99618.991 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"EU937514","term_id":"218931545","term_text":"EU937514">> EU937514Testisə spesifik serin/prolinlə zəngin zülal b 14.93
K.LIpSSeNFeNYVR.E2796.88796.871 <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAH48437","term_id":"28913395","term_text":"AAH48437">> AAH48437Yağ turşusu bağlayan protein 9 (testis)Yalnız Cap

Kəşf və hədəflənmiş proteomika

Proteomik analizin həssaslığını və əhatə dairəsini yaxşılaşdırmaq üçün strategiyalar ümumiyyətlə böyük nümunə miqdarını və ötürmə qabiliyyətini qurban verən çoxölçülü fraksiyaları tələb edir. Alternativ olaraq, zülalın miqdarının təyin edilməsinin həssaslığını və ötürmə qabiliyyətini yaxşılaşdırmaq səyləri izlənilə bilən xüsusiyyətlərin sayını məhdudlaşdırır.

Bu səbəbdən proteomik tədqiqatlar adətən iki kateqoriyaya bölünür: kəşf proteomikası və hədəf proteomikası. Kəşf proteomikası hər nümunə üçün daha çox vaxt və səy sərf etməklə və təhlil edilən nümunələrin sayını azaltmaqla zülalın identifikasiyasını optimallaşdırır. Bunun əksinə olaraq, hədəflənmiş proteomik strategiyalar izləniləcək xüsusiyyətlərin sayını məhdudlaşdırır və daha sonra yüzlərlə və ya minlərlə nümunə üçün ən yüksək həssaslığa və ötürmə qabiliyyətinə nail olmaq üçün xromatoqrafiya, alətin tənzimlənməsi və əldəetmə üsullarını optimallaşdırır.

Kəşf və hədəf proteomikanın əhatə dairəsi, həssaslığı və miqyası arasında tarazlıq. Kəşf proteomikasının geniş miqyaslı təbiəti və həssaslığı səbəbindən yüzlərlə və ya minlərlə nümunənin hərtərəfli təhlilini aparmaq imkanı məhduddur. Əksinə, məqsədyönlü proteomik analiz peptidlərin diskret alt dəstlərinin kəmiyyətini müəyyən edir ki, bu da tədqiqatçılara bu peptidləri ən yüksək həssaslıq səviyyəsinə malik minlərlə nümunədə təhlil etməyə imkan verir.

Kəşf proteomik təcrübələri geniş dinamik diapazonda mümkün qədər çox zülal müəyyən etmək üçün nəzərdə tutulub və çox vaxt yüksək bol zülalların tükənməsini, müvafiq komponentlərin zənginləşdirilməsini (məsələn, hüceyrəaltı bölmələr və ya zülal kompleksləri) və nümunənin mürəkkəbliyini azaltmaq üçün fraksiyalaşdırmanı (məsələn, SDS) tələb edir. -PAGE və ya xromatoqrafiya). Bu strategiyalar fraksiyadakı komponentlər arasındakı dinamik diapazonu azalda bilər və ionlaşma və MS iş dövrü üçün zülallar və ya peptidlər arasında rəqabəti azalda bilər. Kəmiyyət kəşfi proteomik təcrübələri daha bir problem əlavə edir, çünki onlar çoxlu fraksiyalaşdırılmış nümunələrdə zülal səviyyələrini müəyyən etməyə və kəmiyyətcələşdirməyə çalışırlar.

Hədəflənmiş proteomik təcrübələr adətən çox yüksək dəqiqlik, həssaslıq, spesifiklik və ötürmə qabiliyyəti ilə 100-dən az zülalın kəmiyyətini müəyyən etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. Həqiqətən də, bu yanaşma dəqiqliyi və məhsuldarlığı yaxşılaşdırmaq üçün adətən nümunənin hazırlanmasının miqdarını minimuma endirir. Məqsədli MS kəmiyyət strategiyaları daxiletmə siyahıları və seçilmiş (və ya çoxlu) reaksiya monitorinqi (müvafiq olaraq SRM və ya MRM) ilə istiqamətləndirilmiş ardıcıllıq daxil olmaqla, yüzlərlə və ya minlərlə nümunədə məhdud sayda xüsusiyyətlərin spesifikliyini və kəmiyyətini təkmilləşdirmək üçün xüsusi iş axınlarından və alətlərdən istifadə edir.

Kəşf proteomik analizi ən çox nümunədə zülalları inventarlaşdırmaq və ya çoxsaylı nümunələr arasında zülalların bolluğunda fərqləri aşkar etmək üçün istifadə edilsə də, kompleks nümunələrdə zülalların və metabolitlərin kəmiyyətini müəyyən etmək üçün məqsədyönlü kəmiyyət proteomik təcrübələr farmasevtik və diaqnostik tətbiqlərdə getdikcə daha çox istifadə olunur. Bundan əlavə, hədəflənmiş proteomika, kəşf skrininqi zamanı tapılan xüsusi zülalların miqdarını təyin etmək üçün tez-tez kəşf proteomikasını izləyir.

Xüsusi kütlə spektrometrlərinin xüsusiyyətləri onları kəşf və ya hədəflənmiş proteomik analizlə istifadə etmək üçün daha əlverişli edir. Məsələn, kəşf proteomikası məhdud sayda nümunələrdə bütün peptidlərin identifikasiyasını vurğuladığına görə, dəqiqə kütləsi-yük nisbəti ilə peptidlərin aşkarlanmasını maksimum dərəcədə artırmaq üçün Thermo Scientific Orbitrap kütlə analizatorları da daxil olmaqla yüksək ayırdetmə qabiliyyətinə malik alətlərdən istifadə olunur.m/z) fərqlər. Əksinə, hədəflənmiş proteomika həssaslığı vurğuladığına görə üçlü dördqütblü və ion tələləri də daxil olmaqla alətlər istifadə olunur.

Daha ətraflı

Məhsullara baxın


Mücərrəd

Şəkil 1. Hipofiz vəzinin SIMS-dən sonrakı ölçmələrinin optik şəkilləri. (a) H&E ilə boyanmış ön, ara və arxa loblarla etiketlənmiş hipofiz vəzi. (b–d) 100× (b), 8000× (c) və 10 000× (d) böyütmədə SEM şəkilləri. Matris kristallarının ölçüləri ∼2 μm toxuma üzərində (c) və 0,5-1 μm toxuma xaricində (d) idi.


Proteomika

  1. GİRİŞ
    Koch İnstitutu Proteomika Əsas Mexanizmi aşağıdakılardan biri və ya bir neçəsinin tələb olunduğu zülal nümunələrinin kütlə spektrometriyasına əsaslanan təhlillərini təmin edir: Zülalın identifikasiyası, zülal xarakteristikası (o cümlədən modifikasiyalar), bütöv protein MW-nin təyini, zülalın miqdarı. Struktur və ya MV məlumat tələb olunan zülal və ya peptid olmayan nümunələr də, hazırda mövcud olan alətlər və metodlarla təhlil edilə bildiyi müddətcə təqdim edilə bilər.
  2. ZÜLLƏLƏRİN MÜƏYYƏNİLMƏSİ
    Gel elektroforezi ilə ayrılan zülallar
    Gel bantlarından zülalın identifikasiyası ümumiyyətlə rutindir və kifayət qədər protein olduğu və keratinlə çirklənməsi nəzarət altında saxlanıldığı müddətcə nəticə verir. Ümumiyyətlə Coomassie ilə boyanmış lentlər, keratin çirklənməsi çox yüksək olmadığı təqdirdə, onu müəyyən etmək üçün kifayət qədər protein ehtiva edir. Zəif ləkələnmiş Coomassie zolağında 200-300 fmol protein (10s ng), güclü ləkələnmiş Coomassie zolağı isə pmol miqdarında protein (100s ng) ehtiva edə bilər. Nə qədər çox zülal olsa da, zülal identifikasiyaları bir o qədər inamlı olacaq, nəzərə alın ki, geli həddən artıq yükləməklə siz zəif zolaqların bəzilərini gizlədə bilərsiniz, xüsusən də bunlar əsas zülalların lentlərinə yaxındırsa.
    Gümüşlə boyanmış gel lentləri daha az protein ehtiva edir, adətən 100 fmol və ya daha azdır (aşağı ng diapazonu) və flüoresan ləkələrin həssaslığı Coomassie və gümüşün həssaslığı arasındadır.
    Böyük biokimyəvi tədarükçülərdən kütləvi spektrometrik analizə uyğun gələn bir neçə boyama dəsti var (bütün gel boyama üsulları belə deyil). Əgər siz (və ya laboratoriyanızdakı başqaları) əvvəllər nümunələr təqdim etmisinizsə və faydalı nəticələr əldə etmisinizsə, şübhəsiz ki, sizin (və ya həmkarlarınızın) əvvəllər etdiklərini etməyə davam edin. Əks halda, zəhmət olmasa nümunələri təqdim etməzdən əvvəl bizimlə danışın ki, sizə uğur şansını artırmağa və vaxt, səy və pul sərf etməməyə kömək edək.
    Nəzərə alınacaq məsələlər keratinlə çirklənmə və onun minimuma endirilməsi və kütləvi spektrometrik analizə uyğun olan boyanma protokollarının istifadəsidir. Keratin əsasən dəri, yun paltar və tozdan gəlir. Nümunələr və gellərlə işləyərkən laboratoriya paltarı və əlcək geyin (nitrilin lateksdən daha yaxşı olduğu deyilir) və çılpaq əllərlə nümunələrə, gellərə və s. toxunmaqdan çəkinin. Bütün qabları, boruları HPLC dərəcəli metanol və HPLC dərəcəli su ilə yuyun. Mövcuddursa, geli toxuma mədəniyyəti başlığı kimi laminar axın başlığında işlədin, mövcud deyilsə, tozsuz ərazidə təmiz səthdən istifadə edin (məsələn, hava çıxışından uzaq). Geli işlətdikdən və rənglədikdən sonra onu 1-2% sirkə turşusunda yaxalanmış Petri qabına qoyun (bloklu torbalardan qaçın), üzərini örtün və laboratoriyamıza gətirin ki, laminarımızda maraqlı gel band(lar)ı kəsək. axın başlığı (vaxt işləməsə, gel bir gecədə soyuducuda örtülmüş Petridə saxlanıla bilər və bu, onun sonrakı analizində problem yaratmamalıdır). Əgər geli skan etmək lazımdırsa, skaner səthlərinin təmiz metanol və su ilə yuyulduğundan və təmiz silindiyindən əmin olun. Yeri gəlmişkən, &ldquoold stil&rdquo gel fiksasiyasından (məsələn, qlutaraldehid və ya formaldehid və ya oxşar protein çarpaz bağlayan agentlərdən istifadə etməklə) çəkinmək lazımdır, çünki bu, gellərdə zülalları həzm etməyi və proteolitik peptidləri bərpa etməyi qeyri-mümkün edir.
    Ləkələmək üçün bir neçə satıcı tərəfindən satılan "kütləvi spektrometriyaya uyğun" ləkələrindən istifadə edə bilərsiniz. Boyanma dəstləri ilə gələn təlimatlara əməl etsəniz, Commassie üçün Gel Code Blue (Pierce/ThermoFisher) və ya Commassie Brilliant Blue R-250 və G-250 (Pierce və ya Bio-Rad) yaxşıdır. Gümüş üçün Invitrogen-dən SilverQuest və ya Pierce-dən Silver Snap yaxşıdır. Floresan gel ləkələri (məsələn, SYPRO Ruby, SYPRO Mandarin) həmçinin kütlə spektrometriyasına uyğundur. Ləkədən istifadə etməyi planlaşdırırsınızsa və onun kütlə spektrometriyasına uyğun olub-olmadığını müəyyən edə bilmirsinizsə (məsələn, məhsulun təsvirindən), lütfən, bizə bildirin və biz sorğu verə bilərik.
    Gel bantlarının kəsilməsi düz irəli getsə də, bunu laminar axın başlığı kimi təmiz ərazidə etmək vacibdir. Əgər əvvəllər bunu etməmisinizsə, lütfən, analiz üçün gel lentlərini kəsməzdən əvvəl bizimlə danışın. Biz sizin gellərinizi laboratoriyamıza gətirməyinizi təşkil edə bilərik və müəyyən etmək istədiyiniz gel bantlarını kəsə bilərik.
    Biz minlərlə nümunəyə uğurla tətbiq edilmiş protokollardan istifadə edərək nümunənin çirklənməsini azaldan və peptidlərin həzmini və bərpasını optimallaşdıran şəraitdə geldaxili həzmləri həyata keçirməyə üstünlük veririk. Bununla belə, biz artıq həzm olunmuş nümunələri qəbul edəcəyik, lakin siz əvvəllər həzm olunmuş nümunəni təqdim etməmisinizsə, bunu ilk dəfə etməzdən əvvəl bizimlə danışın, çünki biz bəzi faydalı təkliflər verə bilərik. Əgər zülalınızın başqa bir fermentlə həzm olunmasına ehtiyacınız varsa, həzm üçün tripsindən istifadə edirik, zəhmət olmasa bunu bizimlə müzakirə edin.

Məhluldakı zülallar
Biz müntəzəm olaraq məhlullarda bir neçə yüzdən bir neçə yüzə qədər zülalları müəyyən edirik. Eyni xəbərdarlıqlar çirklənmə ilə bağlı geldə həzm zamanı tətbiq olunur (keratin məhlul nümunələrində də problemdir, çünki keratindən olan proteolitik peptidlər tez-tez az miqdarda olan zülalların peptidlərindən gələn siqnalları gizlədir və ya sıxışdırır). Həddindən artıq miqdarda duzlar da problem yarada bilər, ona görə də zülal nümunələri hazırlamaq üçün aseton çöküntüsü kimi üsuldan istifadə etmək lazım ola bilər, əgər əvvəllər belə bir şey etməmisinizsə, bu barədə bizimlə danışın. Bundan əlavə, yuyucu vasitələr və polimerlər kimi bəzi digər materiallar və kimyəvi maddələr var ki, bunlar gel bantları ilə müqayisədə həll nümunələri ilə daha problemlidir. Bunun səbəbi, aksizləşdirilmiş gel bantlarının həzmdən əvvəl geniş şəkildə yuyulmasıdır ki, bir çox tamponlar və yuyucu vasitələr zülal itkisi olmadan çıxarılsın, lakin məhlul nümunələrinin yuyulması asan deyil. MW filtrasiyası və ya dializ kimi üsullar istifadə oluna bilsə də, bəzi zülal itkisi ilə nəticələnir, həmçinin bəzi yuyucu vasitələr və polimerlər hər halda zülalda qalır. Zəhmət olmasa, yuyucu vasitələrin istifadəsi ilə bağlı bizimlə danışın, çünki biz nümunələrin hazırlanmasının alternativ yollarını, həmçinin bəzi &ldqumass spektrometriyaya uyğun&rdquo yuyucu vasitələr tövsiyə edə bilərik.
On-gel zülal nümunəsi üçün istifadə edərək gümüş ləkəli gel işlətmək faydalı olardı

Nümunənin 10-15% -i zolaqlar, hətta zəif olanları görsəniz, bu o deməkdir ki, nümunədə bəzi zülalları müəyyən etmək üçün çox güman ki, kifayət qədər material qalıb.


Videoya baxın: Xərçəng hüceyrələrini 10 saniyədə təyin edən Qələm. #xərçəng xəstələri #kanser #masspecpen (Iyun 2022).


Şərhlər:

  1. Kiramar

    and another variant is?

  2. Addy

    Mübahisəsiz mövzu, məni sevindirir :)

  3. Dozragore

    News. Give Where can I find more information on this topic?

  4. Hoben

    Yeah, now it's clear ... Otherwise I didn't immediately understand where the connection with the name is ...

  5. Arnaldo

    Üzr istəyirəm, bu tam lazım olan şey deyil. Başqa kim təklif edə bilər?

  6. Yateem

    Məncə səhv edirsən. Mən mövqeyi müdafiə edə bilərəm. PM-də mənə yaz.



Mesaj yazmaq