Məlumat

Bu immunoqrasiyada sitokimyəvi reaksiyaların substratları

Bu immunoqrasiyada sitokimyəvi reaksiyaların substratları



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

İnsan skelet əzələsində hüceyrədənkənar protein Laminin 9 alfa-4 zəncirinin ifadəsi. HRP immunostaktor markeri ilə dolayı immun boyama. Ob.x40.

Cavab üçün NCBI-verilənlər bazası, JSTOR və digər əsas Biologiya verilənlər bazalarında uğursuz axtarış apardım. Bu, mənə nə baş verdiyini başa düşmədiyimi göstərir.

1. Yuxarıda verilmiş immunoqrama üçün yuxarıda göstərilən sitokimyəvi reaksiyaların substratları hansılardır?


Mən yəqin reaksiyanı dəqiq bildiyim yerdə daha sadə bir sual verməliyəm, çünki insanların yuxarıdakı suala cavab verə bilməməsi mümkündür.

Hep-2 hüceyrə xətti hüceyrələrində mitoxondriya. Mitoxondriyə xüsusi ferment NAHD dehidrogenaz üçün sitokimyəvi test. Ob.x40.

2. Sitokimyəvi reaksiyanın substratı hansıdır?

Mənim cavabım:

NADH dehidrogenazın reaksiyası:

NADH + H+ + CoQ → NAD+ + CoQH2

Substrat: CoQ


Sualı başa düşmək çətindir, lakin yuxarıdakı kimi hər hansı bir immunositokimyəvi boyama zamanı iki fərqli reaksiya növü var:

  • hədəfə bağlanan antikor (bu vəziyyətdə bəzi laminin)
  • DAB ilə peroksidaza əsaslı kolorimetrik reaksiya. DAB (3,3'-diaminobenzidin tetrahidroxlorid) hidrogen peroksidin iştirakı ilə oksidləşərək qəhvəyi çöküntü əmələ gətirir və bu, ləkəyə çevrilir.

Dolayı immuno-boyanma faktı o deməkdir ki, sizdə lamininə qarşı qeyri-konyuqasiya olunmuş birincili antikor və ilk antikorun yetişdirildiyi növün immunoqlobulinlərinin Fc hissəsinə qarşı ikincili antikor var. Bu ikincil antikor HRP (horseradish peroksidaza, DAB-ni oksidləşdirəcək peroksidlərin əmələ gəlməsinə cavabdeh olan ferment) ilə konjuge olacaq.

İmmunositokimyəvi ləkələrə dair daha dolğun məlumat üçün oxuya bilərsiniz: http://www.ihcworld.com/_books/Dako_Handbook.pdf


20.4: Enzim İmmunoanalizləri (EIA) və Fermentlə Bağlı İmmunosorbent Təhlilləri (ELISA)

  • OpenStax tərəfindən töhfə
  • OpenStax CNX-də Ümumi Biologiya
  • ƏMTQ, FEIA və ELISA arasındakı fərqləri və oxşarlıqları izah edin
  • İmmunohistokimya və immunositokimya arasındakı fərq və oxşarlıqları təsvir edin
  • Birbaşa və dolayı ELISA-nın müxtəlif məqsədlərini təsvir edin

Western blot kimi, ferment immunoassayları (EIA) antigenlərin mövcudluğunu aşkar etmək üçün antikorlardan istifadə edir. Bununla belə, EIA-lar qərb blotlarından onunla fərqlənir ki, təhlillər mikrotiter plitələrdə və ya in vivo emici membranda deyil. EIA-nın bir çox müxtəlif növləri var, lakin onların hamısı sabit bölgəsi bir fermenti bağlayan və dəyişən bölgəni spesifik antigenini bağlamaq üçün sərbəst buraxan bir antikor molekulunu ehtiva edir. Ferment üçün substratın əlavə edilməsi antigenin vizuallaşdırılmasına və ya miqdarının müəyyən edilməsinə imkan verir (Şəkil (PageIndex<1>)).

EIA-larda ferment üçün substrat çox vaxt rəngli son məhsula çevrilən rəngsiz bir molekul olan xromogendir. Ən çox istifadə edilən fermentlər qələvi fosfataz və yaban turpu peroksidazasıdır ki, onlar üçün müvafiq substratlar hazırdır. Bəzi EIA-larda substrat flüorogendir, flüoresan olmayan molekuldur və ferment onu flüoresan formaya çevirir. Flüorogendən istifadə edən EIA-lara flüoresan ferment immunoanalizi (FEIAs) deyilir. Floresensiya ya flüoresan mikroskop, ya da spektrofotometr ilə aşkar edilə bilər.

Şəkil (PageIndex<1>): Burada göstərilən birbaşa ELISA kimi ferment immunoassayları, aşkar edilə bilən substratı antigenin yerinə çatdırmaq üçün ferment-antikor konjuqatından istifadə edir. Substrat rəngli son məhsula çevrilən rəngsiz bir molekul və ya fermentin aktivləşdirilməsindən sonra flüoresanlaşan qeyri-aktiv floresan molekul ola bilər. (kredit: &ldquoCavitri&rdquo/Wikimedia Commons tərəfindən işin dəyişdirilməsi)

MMR peyvəndi qızılca, parotit və məxmərəkdən (Alman qızılcası) qorunma təmin edən birləşmiş vaksindir. Əksər insanlar MMR peyvəndini uşaq ikən alırlar və beləliklə, bu xəstəliklərə qarşı antitellərə malikdirlər. Bununla belə, müxtəlif səbəblərdən hətta peyvənd olunmuş şəxslər də sonrakı yaşlarda bu xəstəliklərə yenidən həssas ola bilərlər. Məsələn, bəzi uşaqlar tövsiyə olunan iki peyvəndin əvəzinə yalnız bir dövrə MMR peyvəndi ala bilərlər. Bundan əlavə, fərdin bədənində qoruyucu antikorların titri yaşla və ya bəzi tibbi şərtlər nəticəsində azalmağa başlaya bilər.

Fərdi qan dövranında antikor titrinin qorunma təmin etmək üçün kifayət olub olmadığını müəyyən etmək üçün MMR titr testi aparıla bilər. Test qan nümunəsi ilə tez bir zamanda edilə bilən sadə bir immunoanalizdir. Testin nəticələri fərdin hələ də toxunulmazlığının olub olmadığını və ya MMR peyvəndinin başqa bir dozasına ehtiyacı olduğunu göstərəcək.

MMR titrinin təqdim edilməsi tibb işçiləri, xüsusən də tez-tez gənc uşaqlar və ya immuniteti zəif olan xəstələrlə təmasda olanlar üçün işə qəbuldan əvvəl tələb olunur. Bir tibb işçisi qızılca, parotit və ya məxmərəklə yoluxmuş olsaydı, fərd bu xəstəlikləri asanlıqla həssas xəstələrə ötürə bilər və bu, epidemiyaya səbəb ola bilər. MMR titrinin nəticələrindən asılı olaraq, işə başlamazdan əvvəl tibb işçilərinin təkrar peyvənd edilməsi tələb oluna bilər.

İmmun boyama

EIA-nın güclü istifadələrindən biri, antikor-ferment konjugatlarının mikroskopiyanı gücləndirdiyi immun boyamadır. İmmunohistokimya (IHC) bütün toxumaları araşdırmaq üçün istifadə olunur. Şəkil (PageIndex<2>)-də göründüyü kimi, müxtəlif hüceyrə növlərini görmək üçün toxumanın bir hissəsi rənglənə bilər. Bu nümunədə badamcıq toxumasının bir hissəsində CD8 hüceyrələrini rəngləmək üçün CD8-ə qarşı mAb istifadə edilmişdir. İndi CD8 hüceyrələrinin sayını saymaq, onların mövcud olan digər hüceyrə növlərinə nisbətən nisbi sayını müəyyən etmək və bu hüceyrələrin bu toxuma daxilində yerləşdiyini müəyyən etmək mümkündür. Bu cür məlumatlar CD8 hüceyrələrinin normal fəaliyyətinin xəstəliyin inkişafını yavaşlatmaq üçün çox vacib olduğu QİÇS kimi xəstəliklərin öyrənilməsi üçün faydalı olardı.

İmmunositokimya (ICC) immunostimulyasiyanın başqa qiymətli formasıdır. IHC-yə bənzər olsa da, ICC-də hüceyrədənkənar matris materialı soyulur və hüceyrə membranı antikorlara keçirici etmək üçün spirtlə işlənir. Bu, antikorların hüceyrə membranından keçməsinə və hüceyrə daxilində xüsusi hədəflərə bağlanmasına imkan verir. Orqanoidlər, sitoskeletal komponentlər və digər hüceyrədaxili strukturlar bu şəkildə görüntülənə bilər. Bəzi ICC üsulları EIA-dan istifadə edərkən, ferment flüoresan bir molekulla əvəz edilə bilər, bu da onu flüoresan immunoassay edir.

Şəkil (PageIndex<2>): CD8-ə qarşı fermentlə əlaqəli antikorlar, xromogendən istifadə edərək sümük iliyinin bu hazırlanmasında CD8 hüceyrələrini ləkələmək üçün istifadə edilmişdir. (Kredit: Yamashita M, Fujii Y, Ozaki K, Urano Y, Iwasa M, Nakamura S, Fujii S, Abe M, Sato Y, Yoshino T tərəfindən işin dəyişdirilməsi)

  1. İmmunohistokimya ilə immunositokimya arasındakı fərq nədir?
  2. İmmunohistokimyada istifadə olunan enzimatik reaksiyanın məhsulu üçün nə doğru olmalıdır?

Fermentlə əlaqəli İmmunosorbent Təhlilləri (ELISAs)

Fermentlə əlaqəli immunosorbent analizləri (ELISAs) geniş istifadə olunan EIA-lardır. Birbaşa ELISA-da antigenlər mikrotitr plitəsinin quyusunda immobilizasiya edilir. Müəyyən bir antigen üçün spesifik olan və bir fermentlə birləşən bir antikor hər bir quyuya əlavə edilir. Antigen varsa, antikor bağlanacaq. Hər hansı bağlanmamış antikorları çıxarmaq üçün yuyulduqdan sonra rəngsiz bir substrat (xromogen) əlavə edilir. Fermentin mövcudluğu substratı rəngli son məhsula çevirir (Şəkil (PageIndex<1>)). Bu texnika daha sürətli olsa da, yalnız bir antikorun istifadəsini tələb edir, onun dezavantajı birbaşa ELISA-dan gələn siqnalın daha aşağı olmasıdır (aşağı həssaslıq).

Bir sendviç ELISA-da məqsəd, bir neçə nümunəni sadalamaq üçün patogendən, serum zülalından və ya qan və ya sidikdən gələn bir hormondan antigen kimi məhlulda mövcud olan spesifik antigeni dəqiq ölçmək üçün antikorlardan istifadə etməkdir. Sendviç ELISA-nın ilk addımı mikrotitr plitəsinin bütün quyularına əsas antikor əlavə etməkdir (Şəkil (PageIndex<3>)). Antikor hidrofobik qarşılıqlı təsirlərlə plastikə yapışır. Müvafiq inkubasiya müddətindən sonra hər hansı bağlanmamış antikor yuyulur. Yalnız xüsusi olaraq bağlanmış molekulların lövhəyə bağlı qalmasını təmin etmək üçün sonrakı addımların hər biri arasında müqayisə edilə bilən yumalardan istifadə edilir. Sonra quyuda qalan qeyri-spesifik zülal bağlayan yerləri bağlamaq üçün bloklayıcı zülal əlavə edilir (məsələn, albumin və ya süd zülalı kazein). Quyuların bəziləri standart əyrinin qurulmasına imkan vermək üçün məlum miqdarda antigen alacaq və digər quyulara naməlum antigen məhlulları əlavə edilir. Birincil antikor antigeni tutur və yuyulduqdan sonra ikincili antikor əlavə olunur, bu da fermentə birləşmiş poliklonal antikordur. Son yuyulmadan sonra rəngsiz substrat (xromogen) əlavə edilir və ferment onu rəngli son məhsula çevirir. Son məhsulun yaratdığı nümunənin rəng intensivliyi spektrofotometr ilə ölçülür. İstehsal olunan rəngin miqdarı (udma kimi ölçülür) fermentin miqdarı ilə birbaşa mütənasibdir, bu da öz növbəsində tutulan antigenlə birbaşa mütənasibdir. ELISA-lar son dərəcə həssasdır və antigenin hər ml diapazonunda nanoqramda (10 &ndash9 q) ölçülməsinə imkan verir.

Dolayı ELISA-da biz antigendən daha çox antigenə xas antikorun miqdarını təyin edirik. Biz, o cümlədən bir çox növ patogenlərə qarşı antikorları aşkar etmək üçün dolayı ELISA-dan istifadə edə bilərik Borrelia burgdorferi (Lyme xəstəliyi) və HİV. Şəkil (PageIndex<4>)-də göstərildiyi kimi dolayı və birbaşa ELISA-lar arasında üç mühüm fərq var. Antigen tutmaq üçün antikordan istifadə etmək əvəzinə, dolayı ELISA məlum antigeni (məsələn, HİV-dən peptidlər) mikrotiter boşqablarının dibinə yapışdırmaqla başlayır. Plitədəki bağlanmamış yerləri blokladıqdan sonra, antikorlar (ilkin antikor) varsa, antigeni bağlayacaqlarsa, xəstə serumu əlavə olunur. Hər hansı bağlanmamış zülalları yuduqdan sonra ikincili antikor onun birləşmiş fermenti ilə əsas antikora (məsələn, antiinsan immunoqlobulin) qarşı yönəldilir. İkinci dərəcəli antikor, birləşmiş ferment-xromogen reaksiyasından yaranan rəngin intensivliyi ilə xəstənin zərdabında nə qədər antigenə spesifik antikorun olduğunu kəmiyyətlə müəyyən etməyə imkan verir.

Bu fəsildə müzakirə edilən antikorlar üçün bir sıra digər testlərdə olduğu kimi, hər zaman bəzi digər antigenə qarşı yönəlmiş antikorlarla çarpaz reaktivliyə dair narahatlıq var ki, bu da yanlış müsbət nəticələrə səbəb ola bilər. Beləliklə, biz İİV infeksiyasına (və ya hər hansı digər infeksiya növünə) bir dolayı ELISA analizi əsasında qəti diaqnoz qoya bilmərik. Biz hər hansı şübhəli müsbət testi təsdiq etməliyik ki, bu da əksər hallarda ya patogendən spesifik peptidlərin mövcudluğunu müəyyən edən immunoblotdan, ya da əks transkriptaz PCR (RT-PCR) kimi patogenlə əlaqəli nuklein turşularını müəyyən etmək üçün bir testdən istifadə etməklə aparılır. ) və ya nuklein turşusu antigen testi.

Şəkil (PageIndex<3>): (a) sendviç ELISA-da ilkin antikor ilkin antikorla antigeni tutmaq üçün istifadə olunur. Antigen üzərində epitopları da tanıyan bir fermentə birləşdirilən ikincil antikor əlavə edilir. Xromogen əlavə edildikdən sonra spektrofotometr son məhsulun udulmasını ölçür ki, bu da tutulan antigenin miqdarı ilə birbaşa mütənasibdir. (b) ELISA lövhəsi antikorların (solda) və antigenlərin (aşağıda) qatılmalarını göstərir. Daha yüksək konsentrasiyalar daha tünd son rəngə səbəb olur. (kredit b: ABŞ Balıq və Vəhşi Təbiət Xidmətinin Sakit Okean Bölgəsi tərəfindən işin dəyişdirilməsi) Şəkil (PageIndex<4>): dolayı ELISA xəstəliyin diaqnozu üçün xəstə serumunda antigen-spesifik antikorların miqdarını təyin etmək üçün istifadə olunur. Şübhəli xəstəlik agentindən olan antigen mikrotiter plitələrə yapışdırılır. Birincili antikor xəstənin zərdabından gəlir, sonradan fermentlə birləşmiş ikincili antikorla bağlanır. Son məhsulun istehsalının ölçülməsi xəstənin zərdabında mövcud olan antigen-spesifik antikorun miqdarını aşkarlamağa və ya kəmiyyətini təyin etməyə imkan verir.

  1. Birbaşa ELISA-da ikincili antikorun məqsədi nədir?
  2. Birbaşa və dolayı ELISA-lar nəyi ölçür?

Baxmayaraq ki, 1300 xəstə ilə əlaqə saxlamaq və HİV-ə görə sınaqdan keçirmək çox vaxt aparan və bahalı olsa da, idarəçilər yaramaz işçilərin cinayətinin potensial qurbanlarını fəal şəkildə axtarmaq və müalicə etməklə xəstəxananın məsuliyyətini minimuma endirməyə ümid edirdilər. İİV-in erkən aşkarlanması vacibdir və vaxtında müalicə xəstəliyin gedişatını ləngidə bilər.

İİV üçün müxtəlif skrininq testləri var, lakin ən çox istifadə ediləni dolayı ELISA testidir. Digər dolayı ELISA-larda olduğu kimi, test antigeni (bu halda HİV peptidləri) 96 quyuluq boşqabdakı quyuya əlavə etməklə işləyir. Əgər xəstə İİV-ə yoluxmuşdursa, anti-HİV antikorları antigenə bağlanacaq və ikinci antikor-ferment konjugatı ilə müəyyən ediləcək.

  1. HİV üçün dolayı ELISA testi nə dərəcədə dəqiqdir və hansı amillər testin düzgünlüyünə təsir edə bilər?
  2. Xəstəxana dolayı ELISA-nın nəticələrini təsdiqləmək üçün hər hansı digər testlərdən istifadə etməlidirmi?

İmmunofiltrasiya və İmmunoxromatoqrafik Təhlillər

Bəzi hallarda, məhlulda çox aşağı konsentrasiyada mövcud olan antigenləri və ya antikorları aşkar etmək və ya kəmiyyətini təyin etmək lazım ola bilər. Bunu mümkün etmək üçün immunofiltrasiya üsulları hazırlanmışdır. İmmunofiltrasiya zamanı böyük həcmdə maye məsaməli membrandan hopdurucu yastığa keçir. Məsaməli membrana yapışdırılmış bir antigen alternativ olaraq keçərkən antikor tutacaq, antigeni tutmaq üçün membrana antikor da əlavə edə bilərik.

İmmunofiltrasiya üsulu adətən yanal axın testləri və ya zolaq testləri kimi tanınan immunoxromatoqrafik analizlərin işlənib hazırlanmasında uyğunlaşdırılmışdır. Bu testlər tez və asan yerinə yetirilir, bu da onları qayğı nöqtəsində (yəni, həkimin ofisində) və ya evdə istifadə üçün məşhur edir. Bir nümunə, həkimlərə hamilə qadınları və ya yeni doğulmuş uşaqları bir sıra viruslar və digər patogenlər tərəfindən infeksiyaya qarşı yoxlamağa imkan verən TORCH testidir (Toksoplazma, digər viruslar, məxmərək, sitomeqalovirus, herpes simplex). Evdə hamiləlik testləri yanal axın testinin geniş istifadə edilən başqa bir nümunəsidir (Şəkil (PageIndex<5>)). İmmunofiltrasiya testləri inkişaf etməkdə olan ölkələrdə də populyardır, çünki onlar ucuzdur və qurudulmuş reagentlərin daimi soyuducuda saxlanmasını tələb etmir. Bununla belə, texnologiya bəzi mürəkkəb laboratoriya avadanlıqlarına da daxil edilmişdir.

Yanal axın testlərində (Şəkil (PageIndex<6>)), sidik kimi mayelər test zolağındakı uducu yastığa tətbiq edilir. Maye kapilyar hərəkətlə axır və səthlərinə antikorları olan muncuq zolağından keçir. Nümunədəki maye əslində zolaqda qurudulmuş vəziyyətdə olan reagentləri nəmləndirir. Lateksdən və ya kiçik qızıl hissəciklərindən hazırlanmış antikorla örtülmüş muncuqlar test mayesində antigenləri bağlayacaqdır. Antikor-antigen kompleksləri daha sonra antigenə qarşı antikoru hərəkətsizləşdirmiş ikinci bir zolaq üzərində axır, bu zolaq antigeni bağlamış muncuqları saxlayacaq. Üçüncü nəzarət zolağı istənilən muncuqları bağlayır. Test xəttində inkişaf edən qırmızı rəng (qızıl hissəciklərdən) və ya mavi (lateks muncuqlarından) müsbət testi göstərir. Rəng yalnız nəzarət xəttində inkişaf edərsə, test mənfi olur.

ELISA üsulları kimi, yanal axın testləri də həssaslıq və spesifiklik təmin edən antikor sendviçlərindən istifadə edir. ELISA kimi kəmiyyət baxımından olmasa da, bu testlərin üstünlüyü sürətli, ucuz və xüsusi avadanlıqdan asılı deyildir. Beləliklə, onlar istənilən yerdə hər kəs tərəfindən ifa edilə bilər. Testlərin məhdudiyyətlərini başa düşməyən insanların əlinə belə güclü diaqnostik testlərin verilməsi ilə bağlı bəzi narahatlıqlar var, məsələn, yalan-müsbət nəticələrin olma ehtimalı. Evdə hamiləlik testləri geniş şəkildə qəbul edilsə də, HİV kimi xəstəliklər üçün evdə antikor aşkarlama testləri tibb ictimaiyyətində bəzi narahatlıqlara səbəb oldu. Bəziləri test nəticələrini izah edə bilən və müvafiq təsdiqedici testlər sifariş edə bilən tibb işçilərinin olmadığı halda belə testlərin öz-özünə aparılmasına icazə verilib-verilməməsi ilə bağlı sual verdilər. Bununla belə, artan sayda yanal axın testlərinin mövcud olması və lab-on-a-a-chip texnologiyasının sürətli inkişafı ([bağlantı]), evdə tibbi testlərin gələcəkdə daha da adi hala çevriləcəyi ehtimal olunur.

Şəkil (PageIndex<5>): Sidikdə hamiləliklə bağlı hormonları aşkar edən yanal axın testi. Nəzarət zolağı testin etibarlılığını yoxlayır və test xətti sidikdə hamiləliklə bağlı hormonların mövcudluğunu müəyyən edir. (Kredit: Klaus Hoffmeier tərəfindən işin dəyişdirilməsi) Şəkil (PageIndex<6>): İmmunoxromatoqrafik analizlər və ya yanal axın testləri antigenin seyreltilmiş məhlulda sınanmasına imkan verir. Sınaq zolağından maye axdıqca reagentləri nəmləndirir. Kiçik hissəciklərə birləşmiş antikorlar antigeni birinci zolaqda bağlayır və sonra ikinci zolağa axır, burada onlar ikinci sabit antikorla bağlanır. Bu, muncuqların rəngindən asılı olaraq bir rəng xətti yaradır. Üçüncü, nəzarət zolağı testin düzgün işlədiyini göstərmək üçün muncuqları da bağlayır. (Kredit: Yeh CH, Zhao ZQ, Shen PL, Lin YC tərəfindən işin dəyişdirilməsi)

  1. Yanal axın metodunun işləməsi üçün hansı fiziki proses tələb olunur?
  2. Yanal axın analizində üçüncü zolağın məqsədini izah edin.

Cədvəl (PageIndex<1>) bu bölmədə müzakirə edilən bəzi ƏMTQ-lərin bəzi əsas mexanizmlərini və nümunələrini, eləcə də Antigen-Antikor Komplekslərinin Aşkarlanması bölməsində müzakirə edilən immunoblotları müqayisə edir.

Cədvəl (PageIndex<1>): İmmunoblotlar və Ferment İmmunoanalizləri
Təhlilin növü Mexanizm Xüsusi Prosedurlar Nümunələr
İmmunoblotlar Emici membrana köçürülmüş xüsusi zülalları müəyyən etmək üçün ferment-antikor konjugatlarından istifadə edir. Western blot: Müəyyən bir zülalın varlığını aşkar edir Xəstə serumunda HİV peptidlərinin (və ya digər yoluxucu agentlərin peptidlərinin) varlığının aşkar edilməsi
İmmun boyama Hüceyrələrdə və ya hüceyrələrdə xüsusi molekulları ləkələmək üçün ferment-antikor konjugatlarından istifadə edir İmmunohistokimya: Bir toxumada xüsusi hüceyrələri ləkələmək üçün istifadə olunur Ev sahibi toxumasında CD8 hüceyrələrinin olması üçün ləkə
Fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi (ELISA) Hədəf molekullarının miqdarını təyin etmək üçün ferment-antikor konjugatlarından istifadə edir Birbaşa ELISA: Bir antigenin varlığını aşkar etmək üçün tək antikordan istifadə edir HİV antigeni p24-ün yoluxduqdan bir aya qədər aşkarlanması
Dolayı ELISA: Bir antigenə qarşı istehsal olunan antikor miqdarını ölçür Serumda HİV antikorlarının aşkarlanması
İmmunoxromatoqrafik (yan axın) analizləri Texnikalar xəstəliyin diaqnozu üçün sabit antikor tərəfindən axan, rəngli etiketli antigen-antikor komplekslərinin tutulmasından istifadə edir. Sandviç ELISA: Antikor tərəfindən bağlanan antigenin miqdarını ölçür Xəstə zərdabında müxtəlif patogenlər üçün antikorların aşkarlanması (məsələn, sürətli strep, malyariya dipstick)
Sidikdə insan xorionik gonadotropini aşkar edən hamiləlik testi

HİV üçün dolayı ELISA həssas bir analiz olsa da, bir neçə çətinləşdirən mülahizələr var. Birincisi, əgər yoluxmuş şəxs yoluxduqdan sonra çox tez sınaqdan keçirilirsə, test yalan-mənfi nəticələr verə bilər. Serokonversiya pəncərəsi ümumiyyətlə təxminən üç həftədir, lakin bəzi hallarda iki aydan çox ola bilər.

Yanlış neqativlərə əlavə olaraq, adətən çarpaz reaksiya verən antikorları induksiya edən digər viruslarla əvvəlki infeksiyalar səbəbindən yalançı pozitivlər də baş verə bilər. Yanlış-müsbət nisbət istifadə olunan testin xüsusi markasından asılıdır, lakin 0,5% qeyri-adi deyil. 1 Yanlış pozitiv olma ehtimalına görə, bütün müsbət testlər təsdiqedici testlə izlənilir. Bu təsdiqləyici test tez-tez immunoblotdur (qərb ləkəsi) burada xəstənin qanından HİV peptidləri HİV-ə xüsusi mAb-ferment konjugatı ilə müəyyən edilir. Müsbət vestern ləkə HİV infeksiyasını, mənfi ləkə isə müsbət ELISA-ya baxmayaraq HİV-in olmadığını təsdiq edəcək.

Təəssüf ki, HİV antigenləri üçün qərb ləkələri çox vaxt qeyri-müəyyən nəticələr verir, bu halda onlar dolayı ELISA-nın nəticələrini nə təsdiqləyir, nə də etibarsız edir. Əslində, qeyri-müəyyənlik dərəcəsi 10&ndash49% ola bilər (buna görə də onların dəyəri ilə birlikdə qərb ləkələri skrininq üçün istifadə edilmir). Dolayı ELISA kimi, qeyri-müəyyən qərb ləkəsi çarpaz reaktivlik və ya əvvəlki viral infeksiyalar, peyvəndlər və ya otoimmün xəstəliklər səbəbindən baş verə bilər.

  1. Test edilən 1300 xəstədən neçəsinin yanlış müsbət ELISA testi gözləniləcək?
  2. Yanlış pozitivlərdən neçə qeyri-müəyyən qərb ləkəsi gözləmək olar?
  3. Xəstəxana pasiyentin qərb ləkəsinin qeyri-müəyyən olduğu hər hansı bir halı necə həll edərdi?

Dehidrogenazlar üçün sitokimyəvi reaksiyaların kompüterləşdirilmiş təhlili və siçovulların spermatozoalarında mitoxondrial qabığın funksiyasını qiymətləndirmək üçün üsullar kimi oksiqrafik tədqiqatlar

Siçovulların spermatozoidlərində mitoxondrial NADH-dən asılı dehidrogenazlar (flavoproteinlə əlaqəli diafora/NADH), NAD-dan asılı dehidrogenazlar (izositrat, malat) və suksinat dehidrogenaz üçün sitokimyəvi reaksiyalar aparılmışdır. Morfoloji qiymətləndirməyə əlavə olaraq, reaksiyaların intensivliyi kompüter görüntü analizi sistemindən (Quantimet 600 S) istifadə edilərək qiymətləndirilmişdir. Reaksiyaların intensivliyi sperma orta hissələrində inteqrasiya olunmuş optik sıxlıq (IOD) və orta optik sıxlıq (MOD) ölçülməklə araşdırıldı. Mitoxondrial tənəffüs zənciri komplekslərinin fəaliyyəti də polaroqrafik üsulla təhlil edilmişdir.

Tədqiq olunan spermatozoidlərin populyasiyasında bütün spermatozoidlərin bütün orta hissələri sitokimyəvi reaksiyanın məhsulu olan formazanlarla tam doldu. Bu morfoloji tapıntılar verilmiş fermentlər üçün IOD və MOD üçün alınan qiymətlərə uyğundur. Oksiqrafik tədqiqatlarda spermatozoidlər I, II və IV komplekslər üçün substratların iştirakı ilə oksigen istehlakını nümayiş etdirdi və onların mitoxondrilərində substratlara və inhibitorlara qarşı normal bütövlüyü və həssaslığı aşkar edildi. Bununla belə, oksiqrafik tədqiqatlar sperma və somatik hüceyrələr arasında fərqlər aşkar etdi. Bu fərqlər piruvat oksidləşməsinin malat tərəfindən stimullaşdırılması, malon turşusunun fenazin metosülfat (elektronların qəbuledicisi) oksidləşməsinə təsirinin olmaması və sitoxrom c-nin askorbat oksidləşməsinə təsirinin olmaması ilə əlaqədardır.

Sitokimyəvi metod, densitometrik ölçmələrlə birlikdə aşağıdakıları təmin edir: (1) reaksiya intensivliyini obyektiv olaraq müəyyən etməyə (2) intensivliyin morfoloji qiymətləndirilməsi zamanı fərqlənməyən spermatozoa arasında reaksiya intensivliyində incə və dramatik fərqləri aşkar etməyə (3) mümkün çox sayda spermatozoiddə yerləşəcək və qiymətləndiriləcək mitoxondrial qabıq daxilində qüsurlar. Bu üsul spermatozoidlərin adi morfoloji müayinəsi ilə yanaşı skrininq üsulu kimi istifadə edilə bilər. Digər tərəfdən, mitoxondriyanın daxili membranında oksiqrafik üsul tənəffüs zənciri komplekslərinin fəaliyyəti ilə bağlı olan funksional dəyişiklikləri aşkar edə və mitoxondriyanın enerji mübadiləsinin xarakterik xüsusiyyətlərini göstərə bilər. İstifadə olunan üsullar bir-birini tamamlayır və spermatozoidlərdə mitoxondrilərin kompleks qiymətləndirilməsinə imkan verir. Hər iki üsul eksperimental və klinik tədqiqatlarda istifadə edilə bilər.


Endokrinologiya

3.7.9.1.2 Kinetik parametrlər və spesifiklik

JHE kinetikası və substratın spesifikliyi bu məlumatın aşkar kənd təsərrüfatı potensialı sayəsində uzun müddətdir JHE tədqiqatlarının mərkəzi diqqət mərkəzində olmuşdur. JHE kinetik sabitlərinin aydınlaşdırılması həmçinin JH metabolizmasının sürət hədlərini proqnozlaşdırmağa imkan verir, həmçinin periferik JH səviyyələrinin necə tənzimləndiyinə dair dəyərli məlumat verir. 1980-ci illərə aid bir sıra hesabatlar göstərir ki, lepidopteranlar arasında görünən Michaelis sabiti (Km) təbii olaraq meydana gələn JHs üçün 10 −8 ilə 10 −6 M arasında dəyişdi (Roe və Venkatesh, 1990). Test edilmiş növlərdə JH titrləri təxmin ediləndən ən azı 10-100 dəfə aşağıdır Km konsentrasiyası, fermentin JH konsentrasiyasındakı dəyişikliklərə çox həssas olduğunu göstərir, lakin onun katalitik potensialının boşa getdiyini göstərir. ildən Km dəyərlər substrat konsentrasiyası ilə bağlı hədsiz yüksək görünür, müstəntiqlər daha yaxşı müşahidə data (Sparks və Rose, 1983 Hammock, 1985 Abdel-Aal və Hammock, 1986) izah etmək üçün fermentativ reaksiya fərdi dərəcəsi komponentləri tədqiq.

Ən sadə dillə desək, JHE və ya hər hansı enzimatik reaksiyanın sürətinə müxtəlif sürət komponentlərinin və reaktivlərin konsentrasiyasının cəmi kimi baxmaq olar və beləliklə, tanış tənliklə müəyyən edilə bilər:

harada E fermenti təmsil edir, S substratı təmsil edir, ES Michaelis kompleksini təmsil edir və P Məhsul. Fizioloji şəraitdə, burada JH konsentrasiyası bir neçə dəfə aşağıdır Km, JH turşusunun əmələ gəlmə sürəti JH-nin JHE ilə qarşılıqlı təsirindən asılıdır (k1k−1) və məhsulun əmələ gəlmə sürəti (k2). JHE üçün kinetik məlumatlardan bir neçə mühüm dərs çıxarmaq olar. Birincisi, JHE-nin JH-yə çox yüksək yaxınlığı var. İkincisi, nisbətən aşağı dövriyyə sayına malikdir və ya kpişik, harada kpişik vahid vaxtda aktiv sahə üzrə məhsula (JH turşusu) çevrilən substrat molekullarının (JH) maksimum sayıdır. Bu amillər fermenti fizioloji konsentrasiyalarda JH-ni “tapmaq” və onu JH turşusuna çevirə bilən çox təsirli bir təmizləyici halına gətirir (Abdel-Aal və Hammock, 1986).

JHE-nin substrat spesifikliyi əks-intuitiv görünən başqa bir xüsusiyyəti təmsil edir. The KmVmaks α-naftil asetat kimi digər substratlarla müqayisədə JHE-lərin JH homoloqlarına qarşı nümayiş etdirilməsi təəccüblü dərəcədə aşağıdır. Məsələn, rekombinant M. sexta JHE göstərir a Km (410 μM) və Vmaks α-naftil asetat üçün (21 μmol min −1 mq zülal −1 ) təbii substratdan xeyli yüksəkdir, JH III (Km = 0,052 μM, Vmaks = 1,4 μmol min -1 mg protein -1) (Hinton və Hammock, 2003). Fersht (1985) tərəfindən qeyd edildiyi kimi, spesifiklik iki rəqabətli birləşmə arasında ayrı-seçkilik etmək üçün istifadə edildikdə, o, kpişik/Km nisbətlər, yox Km tək. The kpişik/Km JH III və α-naftil asetat üçün nisbət müvafiq olaraq 27 və 0.04-dür, bu da JH III üçün JHE-nin yüksək spesifikliyini vurğulayır (Hinton və Hammock, 2003). Bu kinetik parametrlər fermentin yüksək spesifikliyə malik olduğunu göstərsə də, belə görünür ki, bir neçə növdən olan JHE-lər də çox oxşar sürətlə JH I və III-ün metil və etil efirlərini hidroliz edir (Grieneisen və b., 1997). Üstəlik, hətta n-propil və n-bu homoloqların butil efirləri daha az hidroliz sürətində olsa da, substrat kimi effektiv şəkildə xidmət edə bilir. Gözlənildiyi kimi, qeyri-təbii (2Z,6E)-JH I etil ester izomeri JHE-lər tərəfindən metabolizə olunmur M. sexta və ya H. virescens.

HJHBP-lərin substratın mövcudluğuna əhəmiyyətli təsiri olduğundan (Peter və b., 1979 Peter, 1990 King and Tobe, 1993), JHE spesifikliyi üzrə tədqiqatlar fermentin nisbətən təmiz preparatları ilə aparılmalıdır. Yüksək təmizlənmiş və ya rekombinantdan istifadə edilən bir neçə tədqiqatda T. ni JHE, JHE-nin JH I-i JH II və ya III-dən daha sürətli hidroliz etdiyi və təbii olaraq meydana gələn enantiomer üçün daha sürətli katalitik sürət nümayiş etdirdiyi müəyyən edilmişdir (10).R,11S)-JH II, (10S,11R)-JH II forması (Hanzlik and Hammock, 1987). Bununla belə, bir müqayisə kpişik/Km enantiomerlər üçün nisbətlər iki formanın hidrolizinin ekvivalent olduğunu göstərdi (Hanzlik və Hammock, 1987). Eyni şey qaraçı güvəsi üçün də keçərlidir. Lymantria dispar, burada JHE heç bir enantiomerik seçicilik göstərmir və homologlar arasında ayrı-seçkilik edə bilmir (Valaitis, 1991). JHE substratlarının ən gözlənilməz qruplarından biri naftil və səh-nitrofenil seriyası. Əvvəlcə hemolimf JHE-nin bəzi növlərdən olduğu qənaətinə gəlinsə də, məsələn M. sexta, substrat kimi α-naftil asetatdan istifadə edə bilmədi (Coudron, 1981), digər növlərin JHE-ləri naftil seriyasının üzvlərini tanıya bilər (Rudnicka və Kochman, 1984 Hanzlik and Hammock, 1987). Bu yaxınlarda rekombinant JHE-dən nümayiş etdirildi M. sexta, H. virescens, və T. molitor səkkiz karbon uzunluğunda zəncir törəmələri ilə naftil birləşmələrini hidrolize edə bilər, beləliklə, JHE-nin M. sexta naftil törəmələrini substrat kimi istifadə edə bilmir ( Kamita və b., 2003 ).

Başqa bir əks-intuitiv müşahidə ondan ibarətdir ki, JHE-nin əsas rolu JH-nin JH turşusuna çevrilməsi olsa da, bir neçə növdən olan həm yerli, həm də rekombinant JHE-lər, uyğun şərtlərdə, daha yüksək ester homoloqları, yəni JH etil, JH yaratmaq üçün JH-ni transesterifikasiya edə bilər. n-propil və JH n-butil efirləri (Grieneisen və b., 1997). JHE vasitəçiliyi ilə JH transesterifikasiyası sınaq borusu ilə məhdudlaşsa da, Debernard və b. (1995) etanolda (10 μl) həll edilən JH III-ün içəriyə yeridildiyini nümayiş etdirdi. L. migratoria , həm JH III turşusuna çevrildi, həm də JH III etil esterinə transesterifikasiya olundu. Bu xüsusi araşdırma ilə əlaqədar qeyd etmək lazımdır ki, JHE analizlərində hormon üçün daşıyıcı həlledici kimi spirtlər istifadə edildikdə, artefaktların qarşısını almaq üçün diqqətli olmaq lazımdır. Buna baxmayaraq, bioloji mühitdə JHE açıq şəkildə esteraza kimi xidmət etsə də, bu yeni tapıntılar fermentin başqa fizioloji rollara malik ola biləcəyini göstərir (bax: Anspaugh və b. (1995) JHE üçün digər mümkün rollar üçün).


V. Esterazın lokalizasiyası üçün indiqogen reaksiyaların qiymətləndirilməsi

Nəticələr formalinlə sabitlənmiş toxumalarda esterazların sitokimyəvi boyanma proseslərində indiqogen substratlar kimi istifadə edilən indoksilasetatların müqayisəli tədqiqatlarının təsviridir. İstehsal edilən boyanma nümunələri, substratların və əldə edilən boyaların molekulyar strukturları, boyaların həllolma qabiliyyəti və mahiyyəti və fermentləşdirilmiş indoksillərin oksidləşmə dərəcələri arasında korrelyasiya müşahidə edilmişdir. Bu, ən dəqiq boyama sistemləri arasında obyektiv seçim etməyə imkan verdi və esterazları təxminən 0⋅5 dəqiqliklə yerləşdirməyə imkan verən təkmilləşdirilmiş substrat olan 5-bromo-4-xloroindoksil asetatın sistematik inkişafına səbəb oldu. μ. Toxumalarda indoksil oksidləşmənin kinetikası boyanma proseslərinin əhəmiyyətli kəmiyyət potensialına malik olduğunu göstərir.


IHC üçün substratlar və xromogenlər

İstifadə olunan xromogenin seçimi eksperimentdə istifadə olunan ferment, eləcə də bir sıra digər amillər tərəfindən idarə olunur. Burada xromogen aşkarlanması üçün uyğun ferment substratının seçilməsi üçün təlimatları nəzərdən keçiririk.

Montaj mediası

Üstünlüklər (+) və çatışmazlıqlar (-)

Horseradish peroksidaza (HRP)

+ Güclü rəng, ikiqat boyanmada mavi ilə yaxşı ziddiyyət təşkil edir.

Horseradish peroksidaza (HRP)

Horseradish peroksidaza (HRP)

Horseradish peroksidaza (HRP)

Horseradish peroksidaza (HRP)

+ Çoxrəngli xromogen IHC-də faydalı alternativ rəng

+ Daha az intensiv, ikiqat ləkə üçün yaxşıdır.

- Fast Blue BB solmağa meyllidir.

+ Daha az intensiv, ikiqat ləkə üçün yaxşıdır.

- Sürətli Qırmızı TR solmağa meyllidir.

Naftol AS-MX fosfat + yeni fuksin

+ Çox rəngli xromogen IHC-də faydalı alternativ rəng

+ Endogen ferment aktivliyi yoxdur, ona görə də yalançı pozitiv boyanmaya səbəb olan endogen peroksidazalardan əziyyət çəkmir.


MtDNA proto-Hinduları digərindən fərqləndirən ilk məlum markeri təmin edir

neyron itkisi və ya mitoxondrial disfunksiya üçün bir marker. PMID: 9778562

Succinate Dehydrogenase (SDH)

mitochondrial marker enzyme. Cytochemical localization of SDH was between the outer and the inner mitochondrial membranes. PMID: 2138522

transiently expressed mitochondrial protein. PMID: 10336016

Magnesium Dependent Adenosine Triphosphatase (Mg-ATPase)

mitochondrial marker enzyme. Mg-ATPase was on the inner surface or matrix side of the inner membrane. PMID: 2138522

an enzyme marker for the outer membrane of rat liver mitochondria. PMID: 5460462, PMID: 4291912

a subunit of yeast mitochondrial ATP synthase. PMID: 9247150

a highly conserved, 30- to 32-kDa mitochondrial membrane protein, occurs in a number of unexpected isoforms, ranging from 64 to greater than 185 kDa in the mammalian sperm mitochondria, which are the ubiquitinated substrates. PMID: 12646488

an antiproliferative protein, is localized to mitochondria. PMID: 7843414

Electrophoretical visualization of SOD patterns provided evidence for possible migration of cytosolic Cu/Zn SOD to mitochondria. The characteristic Cu/Zn SOD profile in mitochondria of all tested strains suggested its ubiquity within the fermentative and respiratory yeasts. PMID: 14734161

UCP-3 protein (mitochondrial uncoupling protein-3)

is present in mitochondria isolated from rat thymus and mitochondria isolated from reticulocytes, monocytes and lymphocytes of rat spleen. PMID: 15262223

UCP-3 is predominantly overexpressed in skeletal muscle. PMID: 12630934

VDAC (voltage-dependent anion channel)

Immunogold labeling and EM analysis of the cerebellar molecular layer showed specific VDAC immunostaining of the mitochondrial outer membrane, highly enhanced in contact sites between mitochondria or between mitochondria and associated ER. PMID: 15238267

Other Mitochondria Markers

A cytochemical marker for epidermal differentiation, Langerhans cells, skin resident macrophages and mitochondria. PMID: 7138784

Diaminobenzidine cytochemistry in unfixed human epidermis: a marker for epidermal differentiation and for mitochondria. PMID: 6177799

Mitochondria DNA markers and genetic demographic processes in neolithic Europe. PMID: 9749344

Two- and three-point extranuclear crosses have been carried out via heterokaryons involving the three extranuclear mitochondrial markers of Aspergillus nidulans: (oliA1), (cs67) and (camA112). All three markers appear to be located on a single functional mitochondrial genome. PMID: 765725

Cobalt as a mitochondrial density marker in a study of cytoplasmic exchange during mating of Schizophyllum commune. PMID: 4127537

On the use of glutamate dehydrogenase as a mitochondrial marker enzyme for the determination of the intracellular distribution of rat liver pyruvate carboxylase. PMID: 11945602


Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs)

The enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) are widely used EIAs. İçində direct ELISA, antigens are immobilized in the well of a microtiter plate. An antibody that is specific for a particular antigen and is conjugated to an enzyme is added to each well. If the antigen is present, then the antibody will bind. After washing to remove any unbound antibodies, a colorless substrate (xromogen) is added. The presence of the enzyme converts the substrate into a colored end product (Figure 1). While this technique is faster because it only requires the use of one antibody, it has the disadvantage that the signal from a direct ELISA is lower (lower sensitivity).

In a sandwich ELISA, the goal is to use antibodies to precisely quantify specific antigen present in a solution, such as antigen from a pathogen, a serum protein, or a hormone from the blood or urine to list just a few examples. The first step of a sandwich ELISA is to add the əsas antikor to all the wells of a microtiter plate (Figure 3). The antibody sticks to the plastic by hydrophobic interactions. After an appropriate incubation time, any unbound antibody is washed away. Comparable washes are used between each of the subsequent steps to ensure that only specifically bound molecules remain attached to the plate. A blocking protein is then added (e.g., albumin or the milk protein casein) to bind the remaining nonspecific protein-binding sites in the well. Some of the wells will receive known amounts of antigen to allow the construction of a standard curve, and unknown antigen solutions are added to the other wells. The primary antibody captures the antigen and, following a wash, the ikincil antikor is added, which is a poliklonal antikor that is conjugated to an enzyme. After a final wash, a colorless substrate (chromogen) is added, and the enzyme converts it into a colored end product. The color intensity of the sample caused by the end product is measured with a spectrophotometer. The amount of color produced (measured as absorbance) is directly proportional to the amount of enzyme, which in turn is directly proportional to the captured antigen. ELISAs are extremely sensitive, allowing antigen to be quantified in the nanogram (10 –9 g) per mL range.

Figure 3. Click for a larger image. (a) In a sandwich ELISA, a primary antibody is used to first capture an antigen with the primary antibody. A secondary antibody conjugated to an enzyme that also recognizes epitopes on the antigen is added. After the addition of the chromogen, a spectrophotometer measures the absorbance of end product, which is directly proportional to the amount of captured antigen. (b) An ELISA plate shows dilutions of antibodies (left) and antigens (bottom). Higher concentrations result in a darker final color. (credit b: modification of work by U.S. Fish and Wildlife Service Pacific Region)

bir indirect ELISA, we quantify antigen-specific antibody rather than antigen. We can use indirect ELISA to detect antibodies against many types of pathogens, including Borrelia burgdorferi (Lyme xəstəliyi) və HİV. There are three important differences between indirect and direct ELISAs as shown in Figure 4. Rather than using antibody to capture antigen, the indirect ELISA starts with attaching known antigen (e.g., peptides from HIV) to the bottom of the microtiter plate wells. After blocking the unbound sites on the plate, patient serum is added if antibodies are present (əsas antikor), they will bind the antigen. After washing away any unbound proteins, the secondary antibody with its conjugated enzyme is directed against the primary antibody (e.g., antihuman immunoglobulin). The ikincil antikor allows us to quantify how much antigen-specific antibody is present in the patient’s serum by the intensity of the color produced from the conjugated enzyme-chromogen reaction.

As with several other tests for antibodies discussed in this chapter, there is always concern about cross-reactivity with antibodies directed against some other antigen, which can lead to false-positive results. Thus, we cannot definitively diagnose an HIV infection (or any other type of infection) based on a single indirect ELISA assay. We must confirm any suspected positive test, which is most often done using either an immunoblot that actually identifies the presence of specific peptides from the pathogen or a test to identify the nucleic acids associated with the pathogen, such as reverse transcriptase PCR (RT-PCR) or a nucleic acid antigen test.

Figure 4. Click for a larger image. The indirect ELISA is used to quantify antigen-specific antibodies in patient serum for disease diagnosis. Antigen from the suspected disease agent is attached to microtiter plates. The primary antibody comes from the patient’s serum, which is subsequently bound by the enzyme-conjugated secondary antibody. Measuring the production of end product allows us to detect or quantify the amount of antigen-specific antibody present in the patient’s serum.

Bu haqda düşünün

  • What is the purpose of the secondary antibody in a direct ELISA?
  • What do the direct and indirect ELISAs quantify?

Clinical Focus: HIV Part 2

This example continues the story that started in Polyclonal and Monoclonal Antibody Production.

Although contacting and testing the 1300 patients for HIV would be time consuming and expensive, administrators hoped to minimize the hospital’s liability by proactively seeking out and treating potential victims of the rogue employee’s crime. Early detection of HIV is important, and prompt treatment can slow the progression of the disease.

There are a variety of screening tests for HIV, but the most widely used is the indirect ELISA. As with other indirect ELISAs, the test works by attaching antigen (in this case, HIV peptides) to a well in a 96-well plate. If the patient is HIV positive, anti-HIV antibodies will bind to the antigen and be identified by the second antibody-enzyme conjugate.

  • How accurate is an indirect ELISA test for HIV, and what factors could impact the test’s accuracy?
  • Should the hospital use any other tests to confirm the results of the indirect ELISA?

We’ll return to this example later on this page.


Order Details

To use as substrate/chromogen in conjunction with peroxidase based immunostaining systems.
Note: The working chromogen solution is stable for 6 hours. Any solution not used after this period should be discarded.
1. Take 5 ml of distilled or de-ionized water in a test tube.
2. Add two drops of concentrated buffer and mix.
3. Add two drops of concentrated AEC Chromogen and mix.
4. Add two drops of 3% H2O2 substrate solution and mix.

Prosedur:
1. Once tissue sections have been incubated with peroxidase, wash them with buffer thoroughly.
2. Wipe the class to remove excess buffer and add enough drops of the working AEC solution to cover the tissue sections.
3. Incubate for 10-20 mintues at room temperature. For the best results, look under the microscope for the signal development. Once desired signal to noise ratio is achieved, stop the reaction by washing slides in wash buffer.


Materiallar və metodlar

DNA constructs and transfections

pEGFP-HA-KAP1wt (wild type) and pEGFP-HA-KAP1S824A were a gift from Y Shiloh (Tel Aviv University, Israel). pEGFP-HA-KAP1S473A and pEGFP-HA-KAP1S473D were made by site-directed mutagenesis of pEGFP-HA-KAP1wt using the primers: KAP1-S473A-F, 5'-GAAACGGTCCCGCGCAGGTGAGGGCGAG-3' KAP1-S473A-R, 5'-CTCGCCCTCACCTGCGCGGGACCGTTTC-3' KAP1-S473D-F, 5'-GGTGTGAAACGGTCCCGCGACGGTGAGGGCGAGGTGAGC-3' KAP1-S473D-R, 5'-GCTCACCTCGCCCTCACCGTCGCGGGACCGTTTCACACC-3'.

Plasmid DNA was transfected with FuGENE 6 reagent (Roche Diagnostics Ltd., Burgess Hill, UK)) following the manufacturer's instructions.

Expression and purification of recombinant proteins

pFastBac-TEV-SBP-Chk1wt was prepared by amplifying Chk1 from pCIneo-FLAG-Chk1 (provided by J Bartek, Institute of Cancer Biology, Copenhagen, Denmark) and cloning it into pFastBac1-TEV-SBP (gift from P Marco-Casanova, Gurdon Institute, Cambridge, UK) via EcoRI and XbaI restriction sites. Bacmids were prepared in DH10Bac™ Escherichia coli cells (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)) following the manufacturer's protocol. Primers for site-directed mutagenesis of Chk1 Leu84 were: Chk1L84G-F, 5'-GCAATATCCAATATTTATTTGGGGAGTACTGTAGTGGAGGAGAGC-3' Chk1L84G-R, 5'-GCTCTCCTCCACTACAGTACTCCCCAAATAAATATTGGATATTGC-3' Chk1L84A-F, 5'-GCAATATCCAATATTTATTTGCGGAGTACTGTAGTGGAGGAGAGC-3' and Chk1L84A-R, 5'-GCTCTCCTCCACTACAGTACTCCGCAAATAAATATTGGATATTGC-3'. SBP-tagged wild type and mutated Chk1 proteins were expressed in Sf9 insect cells and purified to homogeneity as described for SBP-tag purification [53]. pGEX20T-Cdc25A was a gift from J Bartek (Institute of Cancer Biology, Copenhagen, Denmark). GST-Cdc25A was expressed in BL21 E. coli cells and purified with glutathione sepharose beads following the manufacturer's instructions.

Protein kinase assays

Hamısı in vitro kinase assays were done in Chk1 kinase buffer (50 mM HEPES, pH 7.4 13.5 mM MgCl2 and 1 mM dithiothreitol) in the presence of 1 mM Na3VO4 and 1 mM ATP or ATP analogue. Reactions were incubated for 30 minutes at 30°C and stopped by addition of 10 mM EDTA, pH 8. For western blotting, proteins were mixed with Laemmli buffer and separated on 9% SDS-polyacrylamide gels.

Qərb ləkəsi

Proteins were separated by SDS-PAGE. Antibodies used were: Chk1 (1:100 mouse G4 Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), Chk1 phospho-Ser317 (1:1,000 rabbit Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), Chk1 phospho-Ser345 (1:5,000 rabbit Cell Signaling), Chk2 phospho-Thr-68 (1:1,000 rabbit Cell Signaling), Cdc25A (1:100 mouse Santa Cruz), Cdc25A phospho-Ser123 was provided by E Appella (National Cancer Institute, Bethesda, US), GFP (1:1,000 mouse Roche), histone H3 phospho-Ser10 (1:5,000 mouse Abcam, Cambridge, UK), KAP1 (1:500 rabbit Santa Cruz), KAP1 phospho-Ser824 (1:1,000 rabbit Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX, USA), KAP1 phospho-Ser473 (1:1,000 rabbit BioLegend), tubulin (1:5,000 mouse Sigma Aldrich Company, Ltd., Dorset, UK), thiophosphate-ester-specific antibody (1:5,000 Epitomics, Inc., Burlingame, CA, USA) according to the manufacturers' instructions.

Large-scale kinase assay, purification of phospho-peptides and mass spectrometry

Large-scale Chk1 kinase assay and subsequent peptide enrichment was as previously described [54]. Briefly, 1 mg of HeLa nuclear extract (Cil Biotech, Mons, Belgium) was incubated with 10 μg of SBP-Chk1L84G in the presence of 1 mM Na3VO4 and 1 mM N6B-ATPγS in 1× Chk1 kinase buffer for 30 minutes at 30°C. Reactions were stopped by addition of EDTA. Trypsin digestion was done in denaturing buffer following a standard protocol. Phosphopeptides were enriched using a previously described method [16]. Briefly, 100 μl of iodoacetyl-agarose beads (SulfoLink gel, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, USA) in 100 μl of 50% acetonitrile were added to trypsin-digested peptides. The beads were extensively washed with 2 ml each of water, 5 M NaCl, 50% acetonitrile, and 5% formic acid in water, sequentially. Phosphopeptides were eluted using 200 μl of a 1 mg/ml solution of Oxone, and purified on C18 StageTips [55]. Phosphopeptides were analyzed on a linear ion trap/Orbitrap mass spectrometer (LTQ-Orbitrap XL), as described previously [56]. Raw MS data were processed using MaxQuant [57]. Data were searched using the Mascot search engine (Matrix Science Ltd., London, UK), and peptides were identified using MaxQuant at a false discovery rate of 1% for peptides and proteins. Cysteine carbamidomethylation was searched as a fixed modification, whereas amino-terminal protein acetylation, phosphorylation of Ser, Thr, and Tyr, and oxidation of Met were searched as variable modifications. Raw MS data are available at the PeptideAtlas repository [58].

Cell culture and reagents

U2OS cells were used throughout and grown in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin, and glutamine. Stable clones expressing GFP-KAP1 were selected adding G-418 (0.5 mg/ml) to the medium. Aphidicolin, caffeine, etoposide, hydroxyurea and camptothecin were from Sigma-Aldrich phleomycin was from Melford Laboratories Ltd., Ipswich, UK. IR was applied with a Faxitron X-ray cabinet. UV irradiation was done on cells covered in 1× PBS at a rate of 0.7 J/m 2 per second. AZD7762 was provided by AstraZeneca and used at 50 nM. KU55933 [36] was used at 20 μM. Caffeine was used at 4 mM. All incubations with inhibitors started 1 h before any other treatment was applied. N-6-Benzyladenosine-5'-O-triphosphate (N6B-ATP) and N-6-benzyladenosine-5'-O-(3-thiotriphosphate) (N6B-ATPγS) were from BIOLOG Life Science Institute Forschungslabor und Biochemica-Vertrieb GmbH, Bremen, Germany.

SiRNAs and transfections

siChk1 and siChk2 were with siGENOME SMARTpool siRNA (Thermo Fisher Scientific Dharmacon Products, Lafayette, CO, USA) siLuc (5'-cguacgcggaauacuucgatt-3') and siKAP1 [31] were from Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany. Transfections were done with Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Cells were treated 12 h (siChk1 and siChk2) or 48 h (siKAP1) afterwards.

İmmunofluoressensiya

Cells were grown on poly-L-lysine-coated coverslips, fixed with 2% paraformaldehyde for 10 minutes and permeabilized with 1× PBS containing 0.2% (v/v) Triton X-100 for 5 minutes. Primary antibody staining was for 1 h in 5% fetal bovine serum in 1× PBS with KAP1 phospho-Ser473 (1:100 rabbit BioLegend) and γH2AX (1:1,000 mouse Millipore, Billerica, MA, USA). Secondary antibody staining was with goat anti-mouse Alexa Fluor 488 or goat anti-rabbit Alexa Fluor 594 (1:1,000 Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for 30 minutes. Coverslips were washed three times with 1× PBS and mounted on slides with Vectashield solution (Vector Laboratories Ltd., Peterborough, UK) containing 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to stain DNA. All incubations were done at room temperature.