Məlumat

Fon bağlaması nədir?

Fon bağlaması nədir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən mitoxondrial zülal idxalı haqqında bir jurnal məqaləsini oxuyuram və orada sınaqdan keçirilmiş mutant zülallardan birinin başqa bir zülalla arxa planda əlaqə göstərdiyi qeyd olunur. Fon bağlayıcı nədir?


Bu vəziyyətdə arxa plan bağlanması iki zülalın təsadüfən bir-birinə bağlanma dərəcəsidir.

Hipotetik bir nümunə: mitoxondrial protein idxal kompleksiniz ola bilər. Adətən idxal kompleksinin bağlandığı xüsusi peptid ardıcıllığı olur, lakin idxal peptid ardıcıllığı olmayan zülallar bəzən idxal kompleksinə bağlanır. Buna zülal kompleksi üçün fon bağlanması deyilir. Təcrübəçilər bunu, məsələn, mitoxondrial zülaldan idxal peptid ardıcıllığını kəsməklə ölçə bilərdilər.

Hər hansı bir namizəd mitoxondrial idxal üçün hədəf sayılmaq üçün arxa plandan daha çox kompleksə bağlanmalıdır.


R geni

Müqavimət genləri (R-Genlər) R zülalları istehsal edərək patogenlərə qarşı bitki xəstəliklərinə qarşı müqavimət göstərən bitki genomlarında olan genlərdir. R-genlərin əsas sinfi nukleotid bağlayan domendən (NB) və lösinlə zəngin təkrar (LRR) domen(lər)dən ibarətdir və tez-tez (NB-LRR) R-genləri və ya NLR-lər adlanır. [1] Ümumiyyətlə, NB domeni ya ATP/ADP, ya da GTP/GDP-ni birləşdirir. LRR domeni tez-tez zülal-zülal qarşılıqlı təsirində, eləcə də liqand bağlanmasında iştirak edir. NB-LRR R-genləri əlavə olaraq pullu interleykin 1 reseptoruna (TIR-NB-LRR) və qıvrımlı sarmallara (CC-NB-LRR) bölünə bilər. [2]

Lösinlə zəngin təkrar reseptor kimi protein kinaz
İdentifikatorlar
SimvolLRRK
Membranom737
Lösinlə zəngin təkrar reseptor kimi zülal
İdentifikatorlar
SimvolLRRP
Membranom605
TIR-NBS-LRR xəstəlik müqavimət zülalları
İdentifikatorlar
SimvolTIR-NBS-LRR
Membranom1343
TIR domeni bitki zülalları
İdentifikatorlar
SimvolTIRP
Membranom1344

Müqavimət bir sıra mexanizmlərlə ötürülə bilər, o cümlədən:

  • R zülalı birbaşa patogenin [[Avr geni]] (Avirulent geni)[3] məhsulu ilə qarşılıqlı təsir göstərir (bax: Gen üçün Gen əlaqəsi).
  • R zülalı Avr geni tərəfindən deqradasiyanı aşkar edən başqa bir proteini qoruyur (bax. Mühafizə fərziyyəsi).
  • R zülalı Patogenlə Əlaqəli Molekulyar Nümunə və ya PAMP (alternativ olaraq mikrobla əlaqəli molekulyar model üçün MAMP adlanır) aşkar edə bilər.
  • R zülalı patogenin yaratdığı toksini parçalayan fermenti kodlayır.

R zülalı patogenin varlığını aşkar etdikdən sonra, bitki patogenə qarşı müdafiə qura bilər. R genləri spesifik patogenlərə qarşı müqavimət göstərdiyi üçün R genini bir bitkidən digərinə köçürmək və bitkini müəyyən bir patogenə qarşı davamlı etmək mümkündür.

Bir çox bitki müqavimət zülalları reseptor kinazalarına və Toll-bənzər reseptorlara aid olan tək keçidli transmembran zülallardır. R genləri əkinçilik patosistemləri tərəfindən tələb olunan toxunulmazlığın böyük bir hissəsini təmin edən məhsuldarlıqda böyük maraq doğurur. [1]


14.1: Fon

  • Clare M. O&rsquoConnor tərəfindən töhfə
  • Boston Kollecində fəxri dosent (biologiya).

SDS-PAGE kompleks ekstraktlardakı zülalları təhlil etmək üçün geniş istifadə olunur. Ən çox istifadə edilən üsullar ilk dəfə Laemmli (1970) tərəfindən təsvir edilən kəsikli SDS-PAGE sistemindən əldə edilir. Sistem əslində iki geldən ibarətdir - zülalların molekulyar çəkiləri (MWs) əsasında həll edildiyi həlledici (aka işləyən) gel və həlledici gelə daxil olmamışdan əvvəl zülalların cəmləşdiyi yığma gel. İstifləmə geli, həlledici gel və elektroforez tamponunun tərkiblərindəki fərqlər zülalları MW-lərinə uyğun olaraq incə həll etməyə qadir olan sistem yaradır.

Makromolekulların gel elektroforezi

Gel elektroforezində yüklü molekulları hərəkət etdirmək üçün elektrik sahəsindən istifadə olunur
agaroza və ya poliakrilamid kimi polimerləşdirilmiş maddənin matrisi. Ayrı-ayrı molekulların geldən keçmə sürətləri həm ayırma sisteminin, həm də molekulların özlərinin xüsusiyyətlərindən asılıdır. Gel matrisləri molekulların hərəkət etdiyi məsamə şəbəkələri ilə nüfuz edir. Matrisin molekulun hərəkətinə göstərdiyi müqavimətin miqdarı məsamənin diametrindən, həmçinin molekulun ölçüsündən və həndəsəsindən asılıdır. Tədqiqatçılar gel monomerinin konsentrasiyasını müəyyən diapazonda tənzimləyərək məsamələrin ölçüsünü idarə edə bilərlər. Ümumiyyətlə, daha kiçik, daha yüksək yüklü molekullar, daha böyük və ya daha az yüklü molekullara nisbətən jellər vasitəsilə daha sürətli miqrasiya edirlər. Molekulun hərəkətliliyinə bufer sistemi və ayrılması üçün istifadə olunan elektroforetik sahənin gücü də təsir edir.

Siz artıq DNT molekullarını ayırmaq üçün agaroz gel elektroforezindən istifadə etmisiniz. Xatırladaq ki, xətti DNT molekulunun ölçüsü onun agaroz geldən keçdiyi sürətdən təxmin edilə bilər, çünki DNT molekulları vahid yükə kütlə nisbətinə malikdir. Protein elektroforezi DNT elektroforezindən bir qədər mürəkkəbdir. Zülallar DNT molekullarından çox kiçikdir, buna görə də onların ayrılması üçün poliakrilamid gellərdən istifadə olunur. Bundan əlavə, zülallar struktur olaraq DNT-dən daha müxtəlifdir, buna görə də zülallara vahid həndəsə və yük/kütlə nisbəti vermək üçün kimyəvi müalicələrdən (aşağıya bax) istifadə olunur.

Akrilamid polimerləşməsinin kimyası

Zülalları ayırmaq üçün istifadə edilən poliakrilamid gelləri akrilamidin kimyəvi polimerləşməsi və N,N&rsquomethylenebisakrilamid olan çarpaz əlaqə reagentinin (qarşıdakı səhifədə) əmələ gəlir. Tədqiqatçılar akrilamidin konsentrasiyasını, həmçinin akrilamidin bisakrilamid nisbətini tənzimləməklə geldəki məsamələrin ölçüsünü idarə edə bilirlər. Akrilamid və ya bisakrilamid konsentrasiyasını artırmaq, digər konsentrasiyanı sabit saxlamaqla gelin məsamə ölçüsünü azaldacaq. Polimerləşmə, aşağıdakı şəkildə göstərildiyi kimi, akrilamid və bisakrilamiddəki vinil qrupları ilə reaksiya verən sərbəst oksigen radikalları səbəbindən baş verir. Oksigen radikalları katalizatordan, ammonium persulfatdan (APS) ikinci katalizator, N, N, N&rsquo, N&rsquo-tetrametiletilendiamin (TEMED) ilə reaksiya verdikdə əmələ gəlir.

Akrilamid gel polimerləşməsi.

Ammonium persulfat və TEMED akrilamid və bis-akrilamid monomerlərinin çapraz bağlı şəbəkəyə polimerləşməsini katalizləyir.

Proteinlər elektroforezdən əvvəl denatürasiya olunur

DNT molekulları ilə müqayisədə zülallar struktur olaraq çox müxtəlifdir. Zülallar amin turşularının tərkibində və amin turşularının paylanmasında böyük dəyişiklik göstərirlər
onların bükülmüş strukturlarında elektroforez üçün mühüm təsirləri olan xüsusiyyətlər. Xatırladaq ki, zülallar hidrofobik və hidrofilik amin turşularının qarışığıdır və zülalın ilkin ardıcıllığı onun son qatlanmış formasını müəyyən edir. Hidrofobik təsirə görə səthlər
zülalların zülallarında hidrofobik qalıqların üstünlük təşkil etdiyi interyerlərə nisbətən qütb və yüklü amin turşularının tezliyi daha yüksəkdir. Qatlanmış zülallar çoxlu müxtəlif həndəsələrə malikdir və onların səthləri müxtəlif kimyəvi tərkibli R qruplarının paylanması baxımından mozaikadır. Zülallar səth yüklərinə və həndəsələrinə görə çox müxtəlif olduğundan, molekulyar çəkilər qatlanmışzülalların elektrik sahəsində miqrasiya sürəti ilə sadəcə müəyyən edilə bilməz. Postiv və mənfi yüklü zülallar müxtəlif istiqamətlərdə miqrasiya edərdi!

Nümunədəki zülalları ölçülərinə görə həll etmək üçün tədqiqatçılar zülalları vahid həndəsəyə çevirməli və zülallara vahid yük/kütlə nisbəti verməlidirlər. SDS-PAGE-də həll yolu zülalları anion yuyucu vasitə, natrium dodesil sulfat (SDS) və 2-merkaptoetanol ilə qaynatmaqla denatürasiya etməkdir. İstilik və yuyucu vasitənin birləşməsi zülal qatlarını sabitləşdirən çoxlu qeyri-kovalent bağları qırmaq üçün kifayətdir və 2-merkaptoetanol sistein qalıqları arasında istənilən kovalent bağları qırır. Digər yuyucu vasitələr kimi, SDS hidrofobik 12 karbon zəncirindən və hidrofilik sulfat qrupundan ibarət amfipatik molekuldur. SDS karbohidrogen zənciri zülalın içərisinə nüfuz edir və hidrofobik qruplara bağlanır, zülalı bütün uzunluğu boyunca mənfi yüklü deterjan molekulları ilə örtülmüş təsadüfi bir rulona endirir. Denatürləşdirilmiş zülallar kifayət qədər çox SDS bağlayır

hər iki amin turşusu üçün bir SDS molekulu.

Yığma və işləyən gellər arasındakı fasilələr SDS-PAGE gellərinin həlledici gücünün əsasını təşkil edir.

Laemmli (1970) SDS-PAGE sistemini 3 komponentli sistem hesab etmək olar. Yığma və işləyən (həll edən) gellərin müxtəlif məsamə ölçüləri, ion gücü və pH-ları var. Üçüncü komponent elektroforez tamponudur (25 mM Tris, 192 mM glisin,, 0,1% SDS, pH)

8.3), tərkibində çoxlu miqdarda qlisin var. Glisinin ionlaşma vəziyyəti ayrılması üçün vacibdir. Neytral pH-da qlisin mənfi yüklü karboksil qrupu və müsbət yüklü amin qrupu olan zvitteriondur. pKa amin qrupunun 9,6-dır, bu, kamera tamponunun pH-dan xeyli yüksəkdir. Nəticə etibarilə, kamera tamponunda və ya yığma geldə çox az qlisinin mənfi yükü var və qlisin işləyən gelin daha qələvi pH 8.8 mühitinə daxil olana qədər əhəmiyyətli ionlaşma baş vermir. Bu üç komponentin tərkibindəki fərqlərin SDS-PAGE gellərinin yüksək həlletmə qabiliyyətini necə yaratdığını görmək üçün SDS-PAGE zamanı zülal nümunələrinin gedişatını izləyək.

SDS-PAGE üçün istifadə edilən nümunə buferində gel üzərində ayrılan zülalların qabaqcıl kənarı ilə miqrasiya edəcək izləmə boyası, bromofenol mavisi (BPB) var. The nümunə tamponunda həmçinin protein nümunələrinin gel quyularının dibinə yerləşməsinə imkan verən qliserol var. Gel elektroforez aparatında şaquli şəkildə yerləşdirilir və glisin olan kamera tamponu ilə örtülür (sağda, kölgədə).

Gərginlik tətbiq edildikdən sonra nümunə tamponunda və yığma geldə olan xlorid ionları sürətlə müsbət qütbə doğru hərəkət edərək, hərəkət edən ion cəbhəsinin aparıcı kənarını təşkil edir. Glisin molekulların yığma geldə çox az yükü var, ona görə də onlar hərəkət edən ion cəbhəsinin arxa tərəfində miqrasiya edirlər. Xlorid və qlisinin hərəkətliliyindəki bu fərq, mənfi yüklü protein-SDS kompleksləri boyunca süpürülən yığma geldə kəskin bir gərginlik gradienti yaradır. Yığma gelinin böyük məsamələri zülal-SDS komplekslərinin hərəkətinə çox az müqavimət göstərir, onlar daha sonra çalışan və yığılan gellər (sağda) arasındakı interfeysdə çox konsentrasiya olunmuş bölgəyə &ldquosta yığılır&rdquo. Protein-SDS kompleksləri yavaş-yavaş miqrasiya edən qlisin molekulları iki gel arasındakı sərhədə çatana qədər interfeysdə cəmlənmiş vəziyyətdə qalır.

Glisin ionları işləyən gelə daxil olduqda dramatik dəyişikliklər baş verir. Çalışan gelin pH-ı qlisin amin qruplarının pKa-ya daha yaxındır, buna görə də qlisinin əhəmiyyətli bir hissəsi molekullar mənfi yük alır. Mənfi yüklü qlisin molekulları xlorid ionları ilə eyni sürətlə hərəkət etməyə başlayır və bununla da yığma gel vasitəsilə zülalların hərəkətliliyinə nəzarət edən gərginlik fərqini aradan qaldırır. Çalışan geldəki məsamələr yığma geldən çox kiçikdir, ona görə də məsamələr zülalların miqrasiyasına sürtünmə müqaviməti göstərir. Zülallar jelin süzmə xüsusiyyətlərinə görə müxtəlif sürətlə köç etməyə başlayır. Daha kiçik protein-SDS kompleksləri daha böyük protein-SDS komplekslərinə nisbətən daha tez miqrasiya edir (sağda). Gelin məsaməliliyi ilə müəyyən edilən müəyyən diapazon daxilində, işləyən geldə zülalın miqrasiya sürəti onun MW-nin loqarifmi ilə tərs mütənasibdir.

Zülallar ləkələrlə vizuallaşdırılır.

Bir neçə istisna olmaqla, təbii olaraq meydana gələn zülallar SDS-PAGE gellərində görünməzdir. Nəticədə, tədqiqatçılar elektroforez zamanı zülalların təxmini mövqelərini izləmək üçün tez-tez əvvəlcədən ləkələnmiş protein standartlarından istifadə edirlər. Əvvəlcədən boyanmış standartlar bir zülala çox sayda xromoforun kovalent şəkildə bağlanması ilə hazırlanır. Xromoforların əlavə edilməsi zülalın MW-ni artırır və həmçinin daha çox diffuz zolaqlar əmələ gətirir.
gel. Bantların diffuzluğu fərdi zülal molekullarına yapışan boya molekullarının sayındakı dəyişkənliyi əks etdirir. Biz gellərimizdə standart zülal nərdivanlarından istifadə edəcəyik, beləliklə siz baş verən zülalın ayrılmasını vizual olaraq görə biləcəksiniz. Maya zülalları görünməyəcək, çünki onlar xromoforlarla dəyişdirilməyiblər.

Elektroforez başa çatdıqdan sonra zülalların mövqelərini vizuallaşdırmaq üçün tədqiqatçılar gelləri qeyri-kovalent şəkildə və zülallara çox az spesifikliklə bağlayan müxtəlif boyalarla boyayırlar. Ləkələmə prosesi zamanı zülallar da geldə &ldqufiks&rdquo olur, yəni zülallar həll olunmayan hala gəlir və geldən yayıla bilmir. Təcrübələrimizdə Coomassie Brilliant Blue G-250-nin koloidal asqısı olan Simply Blue istifadə edəcəyik. Brilliant Blue G-250 çox sayda ion və Van der Waals qarşılıqlı əlaqəsi vasitəsilə zülalları qeyri-spesifik şəkildə bağlayır. Bu prosedurda gellər elektroforez üçün istifadə olunan tampon duzlarını çıxarmaq üçün su ilə yuyulur və sonra koloidal G-250 suspenziyası ilə müalicə olunur. Zülal zolaqları sürətlə görünür və lazım olduqda gel fonunu aşağı salmaq üçün gellər deionlaşdırılmış su ilə ləkələnə bilər. Brilliant Blue boyanma intensivliyi kəmiyyət proseduru hesab olunur, çünki bəzi istisnalarla ləkələnmiş bandın intensivliyi bantdakı zülalın miqdarı ilə düz mütənasibdir.

Zülalların molekulyar çəkiləri onların jellər üzərində miqrasiyasından hesablana bilər

Ekstraktdakı zülalların ölçüləri onların miqrasiyasını eyni gel üzərində işləyən standart zülallar dəsti ilə müqayisə etməklə hesablana bilər. Tədqiqatçılar işlədikləri xüsusi geldə yaxşı həll olunacaq standart zülalları seçirlər. Məsələn, 7,5% geldən istifadə edən tədqiqatçı kiçik zülalların təhlili üçün daha uyğun olan 15% geldən istifadə edən tədqiqatçıdan daha yüksək molekulyar çəkilərə (MWs) malik olan standartları seçəcək. MW-ləri qiymətləndirmək üçün istifadə olunan prinsiplər agaroz gel elektroforezi üçün istifadə olunanlarla eynidir. Günlük süjeti10Standart zülalların MW-i geldə keçdiyi məsafəyə qarşı hər bir zülal gelin yaxşı həll etmə gücünə malik olduğu bölgədə düz xətt verəcəkdir. (Qeyd: MW zülalın kütləsi ilə eyni deyil. MW ölçüsüz termindir. Məsələn, miyoqlobinin kütləsi 16,7 kDa və 16,700 MVt təşkil edir.) Naməlum zülalların ölçüləri eksperimental qiymətləri interpolyasiya etməklə təxmin edilə bilər. standart zülalların qrafikində. Molekulyar çəkiləri bu diapazondan kənara düşən zülallar geldə yaxşı həll olunmayacaq.

Aşağıdakı rəqəm yuxarıda müzakirə olunan bir neçə məqamı göstərir. Ləkələnməmiş və əvvəlcədən ləkələnmiş protein standartlarının eyni dəstləri ya 12%, ya da 15% SDS-PAGE gellərində ayrılmışdır. 1-5-ci zolaqlardakı qabaqcıl standartlar ləkələnmədən görünür, lakin boyandıqdan sonra daha qabarıq şəkildə ifadə olunur. 6-cı zolaqdakı ləkələnməmiş standart görünən olmaq üçün rənglənməni tələb edir, lakin zolaqlar daha diskretdir və naməlum zülalların MW-lərini hesablayarkən daha etibarlı dəyərlər verəcəkdir, çünki xromoforlar zülallara yapışdırılmamışdır. 2-5-ci zolaqlardakı məlumatlar da göstərir ki, Brilliant Blue rənglənməsi kəmiyyət prosedurudur, çünki hər bir zolaqdakı zolaqların intensivliyi zolağındakı zülalın miqdarı ilə birbaşa mütənasib olaraq artır.

Eksperimental məlumatlarınızı təhlil edərkən, klonlaşdırma proseduru zamanı əlavə edilmiş əlavə amin turşularını nəzərə almağı unutmayın. İşlədiyiniz Met zülalları Met zülallarının C-terminalında əlavə amin turşuları ilə birləşmə zülallarıdır. BG1805 plazmidi HA və His6 epitoplarını, həmçinin ZZ immunoqlobin bağlayan domenini kodlayır. Birlikdə bu ardıcıllıqlar bir walloping əlavə edin

Gözlənilən kütləyə 19 kDa S. cerevisiaeMet proteinləri (Gelperin et al., 2005). pYES2.1 plazmidi klonlanmış ORF-lərə əlavə edilən 33 amin turşusunu kodlayır. Əlavə ardıcıllıqlara V5 epitop etiketi və (Onun)6 həddindən artıq ifadə edilmiş zülalların C-terminalında təmizlənmə etiketi. Bu amin turşuları birlikdə əlavə olunur

zülalın ölçüsünə 5 kDa.

V5 epitopu olmayan LacZ nəzarət zülalının MW-i

120 kDa. Bu, belə böyük bir zülal olduğundan, onun MW-ni dəqiq qiymətləndirmək çox çətin olacaq.


Nəticələr

OR annotasiya, ifadə səviyyələri və filogenetik analiz

Təkmilləşdirilmiş ItypOR ardıcıllıq dəstini əldə etmək və heteroloji in vitro sistemlərdə funksional xarakteristikalar üçün lazım olan Orco-nu müəyyən etmək üçün biz antenal transkriptomu ardıcıllaşdırdıq, yığdıq və şərh etdik. I. tipoqrafiya. Annotasiya 73 ItypOR (ItypOrco daxil olmaqla) aşkar etdi, onlardan 52 OR tam uzunluqlu zülallara uyğundur. Orijinal 43 OR-dan beşi [43] əvvəlki montaj izoformları kimi atıldı. Beləliklə, 35 OR yeni ardıcıllıq idi. Əvvəllər qismən OR ardıcıllıqlarının əksəriyyəti tam uzunluğa qədər uzadıldı və məsələn, əvvəllər nəzərə alınmamış çərçivə sürüşmələri və ya 5′/3′ intron ardıcıllığı olan ardıcıllıqlar düzəldildi (Əlavə Cədvəl 1, Əlavə fayl 1). Hal-hazırda qismən ItypOR ardıcıllığı 76-377 amin turşusu olan zülalları kodlayır. cDNA-dan molekulyar klonlaşdırma və ardınca ardıcıllığın yoxlanılması bizə səkkiz transkript tərəfindən kodlaşdırılmış qısa qismən VEYA ardıcıllığı dörd unikal daha uzun, lakin yenə də qismən genlərdə birləşdirməyə imkan verdi (ItypOR57NTE, ItypOR61NTE, ItypOR70FN və ItypOR71NTE gen şəkilçiləri "M bölməsində izah olunur") .

Ardıcıl oxunuşlar antenal transkriptomda onların ifadə səviyyələrini (milyonda transkriptlə, TPM) qiymətləndirmək üçün şərh edilmiş OR gen ardıcıllığı ilə əlaqələndirildi. Gözlənildiyi kimi, ItypOrco geni ən yüksək ifadəni göstərdi (Əlavə Cədvəl 1, Əlavə fayl 1). Kanonik OR genləri arasında funksional olaraq xarakterizə edilən ItypOR46 üçüncü ən çox ifadə olunan reseptor geni idi, ItypOR49-un ifadəsi isə daha aşağı idi (ItypOR46-nın təqribən 1/3 hissəsi və OR genləri arasında 16-cı yerdədir).

Bu yaxınlarda aparılan bir araşdırma koleopteran OR-ların doqquz əsas sinfini müəyyən etdi [44]. Curculionidae və Cerambycidae ailələrindən olan OR-ların filogenetik təhlilimiz göstərdi ki, ən çox ItypOR-lar 7-ci qrupda (29 OR), ardınca 5A (21 OR), 1-ci (11 OR), 2A (7 OR) qruplarında tapılıb. , və qrup 2B (4 ORs), təhlildə digər qabıq böcəyi növlərində OR paylanmasına oxşardır, Dendroctonus ponderosae (şək. 1). ItypOR-ların ən böyük nəsil genişlənməsi 5A (on OR, lakin aşağı dəstək ilə) və 7-ci qrupda (ItypOR46 və ItypOR49 daxil olmaqla, 100% dəstəyi olan yeddi OR) mövcud idi. Əlavə olaraq, I. tipoqrafiya 3, 4, 5B və 6-cı qruplarda OR yox idi, bu, üçün də doğrudur D. ponderosae. Əvvəlki tədqiqatlardan [44, 45] fərqli olaraq, ağacımız OR qrupunun 2-nin monofiliyasını, serambisiddən olan iki qrup 4 OR üzvü ilə təkrarlamadı. Anoplophora glabripennis 2B qrupu ilə əlaqələndirilir. Bu uyğunsuzluq, ehtimal ki, əvvəllər müşahidə edilən 2A/2B fərqi üçün nisbətən aşağı qovşaq dəstəyi ilə birlikdə təhlildə 4-cü qrup OR-ların məhdud sayı ilə izah olunur [44]. Təhlilimiz həmçinin ItypOR və DponOR arasında 19 sadə 1:1 ortoloji əlaqənin olduğunu göstərdi ki, onlardan 17 cütü yüksək yükləmə dəstəyinə malikdir (≥ 90% Şəkil 1). Orkodan başqa arasında heç bir sadə orfoloji əlaqələr müşahidə edilməmişdir I. tipoqrafiyaA. glabripennis.

Böcək odorant reseptorlarının (OR) maksimum ehtimal ağacı. Ağac, RaXML istifadə edərək qurulan və Orco nəsli ilə köklənmiş amin turşusu ardıcıllığının MAFFT uyğunlaşmasına əsaslanır. OR-lar daxildir Ips tipoqrafiyası (Mavi tip), Dendroctonus ponderosae (Dpon qırmızı), Anoplophora glabripennis (Agla yaşıl) və üç funksional olaraq xarakterizə edilən OR-dan Meqasillen karya (Mcar qara). Böyük koleopteran OR cinsləri qırmızı qövslərlə işarələnir və [44]-ə uyğun olaraq nömrələnir. Qeyd edək ki, ağacda OR qrupu 6 yoxdur, çünki bu nəsil Cerambycidae və Curculionidae ailələrinin növlərində itmişdir. Düyünlərdəki nömrələr açılış dəstəyini təmsil edir (n = 100), RaXML istifadə edərək hesablanır və yalnız əsas nəsillər üçün və ≥ 70 olduqda göstərilir. Qovşaqlardakı qırmızı dairələr on yeddi yüksək dəstəklənən (bootstrap ≥ 90) sadə ItypOR/DponOR ortoloqlarını göstərir. Ağacda göstərilən funksional xarakterli OR-lar üçün əsas liqandlar ([39]-dan McarOR-lar üçün məlumatlar): A = (2)S,3R)-2,3-heksandiol (McarOR20) B = (S)-2-metilbutan-1-ol (McarOR3) C = 2-feniletanol (McarOR5) IE = (S)-(−)-ipsenol (ItypOR46) (ItypOR49). Ardıcıllıq məlumatlarının mənbələri və reseptor şəkilçilərinin izahı “Metodlar” bölməsində ətraflı verilmişdir.

ItypOrco, ItypOR46 və ItypOR49-un funksional xarakteristikası

Funksional səciyyələndirmə üçün ItypOrco və OR-lər induksiya olunan TREx/HEK293 hüceyrələrinə transfeksiya edilib. ItypOrco-nu sabit şəkildə ifadə edən hüceyrələr, Orco böcəyi zülalında VUAA1 reaksiyalarının ilk nümunəsini təmsil edən Orco agonisti VUAA1-ə dozadan asılı olaraq cavab verdilər (Şəkil 2). Bu hüceyrə xətti ItypOR46 və ItypOR49-un hər biri ilə transfeksiya edilmişdir. Bu iki OR 43,4% amin turşusu eyniliyini bölüşür və OR qrupu 7 daxilində eyni şüalanmanın bir hissəsidir və buna görə də səciyyələnən feromon reseptorları ilə təkamül əlaqəsi yoxdur. M. caryae (şək. 1). Stabil ifadə edən ItypOrco/ItypOR46 və ItypOrco/ItypOR49 hüceyrə xətləri Western blot ilə təhlil edildi, bu, myc etiketli ItypOrco və iki V5 işarəli ItypOR-un hər birinin protein ifadəsini göstərdi. Proteinlər repressiya sistemi tərəfindən düzgün tənzimləməni nümayiş etdirərək, induksiya olunmayan nəzarət hüceyrələrində deyil, ekzogen Orco və OR genlərini ifadə etmək üçün induksiya edilmiş hüceyrələrdə aşkar edilmişdir (Əlavə Şəkil 1, Əlavə fayl 2). The I. tipoqrafiya-ItypOR46 və ItypOR49-u əhatə edən spesifik OR şüalanması beş əlavə ItypOR ehtiva edir (ItypOR23, 25, 27, 28 və 29 Şəkil 1). Bu, yüksək yükləmə dəstəyi və yalnız tam uzunluqlu OR-lara malik ən böyük növə xas OR sinfi olduğundan, bizim ilkin məqsədimiz bu qrupdakı bütün OR-ları funksional olaraq xarakterizə etmək idi. Bununla belə, yuxarıda göstərilən beş OR HEK hüceyrələrində ifadə etməmişdir. Buna görə də biz bu OR-ları hazırkı araşdırmadan çıxardıq və diqqəti ItypOR46 və ItypOR49-un dərin tədqiqinə yönəltdik.

Yalnız ItypOrco ifadə edən TREx/HEK293 hüceyrələrində Orco agonist VUAA1-ə dozadan asılı cavab. Data orta cavabları təmsil edir ± SEM (n = 3 bioloji təkrar, hər biri 3 texniki təkrar daxil olmaqla, yəni, nümumi = 9). EC50 VUAA1 = 24,46 μM. (+)-İnduksiya: ItypOrco-nu ifadə etmək üçün induksiya edilmiş hüceyrələrin cavabı (−)-İnduksiya: induksiya olunmayan nəzarət hüceyrələrinin cavabı

ItypOrco/ItypOR46 və ItypOrco/ItypOR49-u ifadə edən hüceyrələr, 30 μM konsentrasiyada 68 ekoloji cəhətdən uyğun birləşmədən ibarət panelə (Əlavə Cədvəl 2, Əlavə fayl 2) qarşı boşqab oxuyucusu əsaslı kalsium flüoresan analizində [46] cavablar üçün yoxlanıldı. Bu təcrübədə ItypOR46 xüsusi olaraq feromon birləşməsinə (±)-ipsenola cavab verdi, cavablar yalnız ItypOrco və ItypOR46-nı ifadə etmək üçün induksiya edilmiş hüceyrələrdən qeydə alınıb (Ümumi Xətti Model: F1,14 = 786 səh < 0.001 Şəkil 3a Əlavə Şəkil 2, Əlavə fayl 2). Rasemik ipsdienol üçün ikincili reaksiya tendensiyası müşahidə edildi, lakin induksiya edilmiş hüceyrələrdə reaksiya qeyri-induksiya edilmiş hüceyrələrdən (F) yüksək deyildi.1,14 = 1.17 səh = 0,297). Hazırkı işdə sintez edilmiş rasemik ipsenol və onun iki saf enantiomeri ilə doza cavab sınaqları (Əlavə üsullar, Əlavə fayl 2) göstərdi ki, ItypOR46 təbii enantiomer üçün yüksək spesifikdir (S)-(−)-ipsenol, ( tərəfindən verilən cavablarla)R)-(+)-ipsenol yalnız daha yüksək konsentrasiyalarda baş verir (Şəkil 3b). Cavab (R)-(+)-ipsenol çox güman ki, (S)-(-)-də mövcud olan enantiomerR)-(+)-stimul (Əlavə Cədvəl 2, Əlavə fayl 2).

ItypOR46-nın funksional xarakteristikası. a Skrininq təcrübəsində stimulları (30 μM) və nəqliyyat vasitəsinə nəzarəti seçmək üçün ItypOR46 və ItypOrco ifadə edən TREx/HEK293 hüceyrələrinin cavabı (bütün 68 qoxu stimuluna cavablar Əlavə Şəkil 2, Əlavə fayl 2-də göstərilmişdir). (+)-İnduksiya: ItypOrco və ItypOR46 (-) ifadə etmək üçün induksiya edilmiş hüceyrələrin cavabı (-)-İnduksiya: qeyri-induksiya edilmiş nəzarət hüceyrələrinin cavabı. Ulduz işarələri (***) əhəmiyyətli fərqi göstərir (at səh < 0,001) induksiya edilmiş və qeyri-induksiya edilmiş hüceyrələr arasında ns = əhəmiyyətli deyil (n = 3 bioloji təkrar, hər biri 3 texniki təkrar daxil olmaqla, yəni, nümumi = 9). b Eyni TREx/HEK293 hüceyrə xəttinin ipsenol və rasematın saf enantiomerlərinə dozadan asılı cavabları (n = 4 bioloji təkrar, hər biri 3 texniki təkrar daxil olmaqla, yəni, nümumi = 12). EC50 dəyərlər: (S)-(−)-ipsenol 1,98 μM (±)-ipsenol 9,06 μM. c Cari cavablar Ksenop skrininq təcrübəsində ItypOR46 və ItypOrco-nu ifadə edən oositlər aşağıda göstərildiyi kimi eyni stimullara (30 μM) a (n = 5). d Skrininq təcrübəsində ItypOR46 və ItypOrco ifadə edən oositdən cari iz reaksiyalarının nümunəsi (30 μM stimul konsentrasiyası). e ItypOR46 və ItypOrco ifadə edən oositlərin rasemik ipsenola dozadan asılı cari reaksiyası (n = 6) və rasemik ipsdienol (n = 5). f ItypOR46 və ItypOrco ifadə edən oositlərin ipsenolun saf enantiomerlərinə dozadan asılı cari reaksiyası (n = 4-5) və ipsdienol (n = 4). g Doza-cavab təcrübələrində ItypOR46 və ItypOrco ifadə edən oositlərdən cari iz reaksiyalarının nümunələri (S)-(−)-ipsenol (sol iz) və (R)-(+)-ipsenol (sağ iz). Məlumatlar orta cavabları təmsil edir ± SEM (panellər ac, ef)

Böcəklərin OR cavabları bəzən funksional xarakteristikalar üçün istifadə olunan sistemdən asılı olduğundan [47], OR-lər də sınaqdan keçirilmişdir. Ksenop altı birləşmədən (30 μM) ibarət azaldılmış qoxu panelindən istifadə edərək oositlər. İpsenol hələ də ItypOR46 üçün ən aktiv liqand idi, lakin ipsdienol bu sistemdə ikinci dərəcəli cavab verdi (Şəkil 3c, d). Struktur olaraq oxşar birləşmə amitinol tərəfindən də kiçik bir reaksiya meydana çıxdı, lakin bu cavab, qaz xromatoqrafiyası-kütləvi spektrometriya (GC-MS) ilə müəyyən edilmiş qıcıqlandırıcıda ipsdienolun (3%) olması ilə əlaqələndirilə bilər. Oosit sistemində doza-cavab sınaqları rasemik ipsdienolla müqayisədə ItypOR46-nın rasemik ipsenola qarşı daha yüksək həssaslığını göstərdi (Şəkil 3e). İpsenol və ipsdienolun saf enantiomerlərini sınaqdan keçirən əlavə doza-cavab təcrübələri təsdiqlədi ki, (S)-(−)-ipsenol bu OR üçün əsas liqanddır, baxmayaraq ki, HEK hüceyrələri ilə müqayisədə oositlərdə enantio-spesifiklik daha aşağı görünür (Şəkil 3f, g). Bu təcrübələr də göstərdi ki, ItypOR46-nın rasemik ipsdienola ikincili reaksiyası əsasən (R)-(−)-enantiomer (şəkil 3f).

Oositlərdə zülal etiketlərinin olmamasının HEK hüceyrələrindəki (həm ItypOrco, həm də ItypOR46 ilə işarələnmiş) ilə müqayisədə fərqli reaksiya spesifikliyinə cavabdeh olub-olmadığını araşdırmaq üçün oositlərdə V5 işarəli ItypOR46 ilə birlikdə myc etiketli ItypOrco-nu ifadə etdik. ItypOR46-nın rasemik ipsdienola ikincili cavabı və amitinola kiçik reaksiyası qaldı, etiketlərin ItypOR46-nın sistemdən asılı cavab spesifikliyinin əsasını qoymadığını nümayiş etdirdi (Əlavə Şəkil 4, Əlavə fayl 2).

ItypOrco/ItypOR49 ifadə edən HEK hüceyrələri skrininq təcrübəsində yalnız rasemik ipsdienola cavab verdi (F1,14 = 28.02 səh < 0.001 Şəkil 4a, Əlavə Şəkil 3, Əlavə fayl 2), baxmayaraq ki, cavab ItypOrco/ItypOR46-nı ifadə edən hüceyrələrin ipsenola reaksiyası ilə müqayisədə daha kiçik idi. Rasemik ipsenola ikincili reaksiya tendensiyası müşahidə edildi, lakin bu, induksiya olunmayan hüceyrələrlə müqayisədə daha yüksək deyildi (F).1,14 = 1.61 səh = 0,225). Rasemik ipsdienol və onun iki saf enantiomerini əhatə edən doza-cavab təcrübələri (hazırkı işdə sintez edilmişdir Əlavə Metodlar, Əlavə fayl 2 [48,49,50,51,52]) ItypOR49-un xüsusi olaraq (R)-(−)-ipsdienol, cavabları ilə ((S)-(+)-enantiomer yalnız daha yüksək stimul konsentrasiyalarında baş verir. ItypOR46 ilə olduğu kimi, bu cavablar çox güman ki, aşağı faizlə bağlı idi (R(-də )-(−)-ipsdienolS)-(+)-enantiomer stimulu (Əlavə Cədvəl 2, Əlavə fayl 2). ItypOR49, təsadüfi oositlərdə cərəyandakı dəqiqəlik ipsdienolun yaratdığı dəyişikliklərdən (təxminən 5 nA) başqa, oositlərdə ümumiyyətlə cavab vermirdi (Əlavə Şəkil 4, Əlavə fayl 2).

ItypOR49-un funksional xarakteristikası. a Skrininq təcrübəsində stimulları (30 μM) və nəqliyyat vasitəsinə nəzarəti seçmək üçün ItypOR49 və ItypOrco ifadə edən TREx/HEK293 hüceyrələrinin cavabı (bütün 68 qoxu stimuluna cavablar Əlavə Şəkil 3, Əlavə fayl 2-də göstərilmişdir). (+)-İnduksiya: ItypOrco və ItypOR49 (-) ifadə etmək üçün induksiya edilmiş hüceyrələrin cavabı (-)-İnduksiya: qeyri-induksiya edilmiş nəzarət hüceyrələrinin cavabı. Ulduz işarələri (***) əhəmiyyətli fərqi göstərir (at səh < 0.001) induksiya edilmiş və qeyri-induksiya edilmiş hüceyrələr arasında ns = əhəmiyyətli deyil (n = 3 bioloji təkrar, hər biri 3 texniki təkrar daxil olmaqla, yəni, nümumi = 9). b Eyni TREx/HEK293 hüceyrə xəttinin ipsdienol və rasematın saf enantiomerlərinə dozadan asılı cavabları (n = 6 bioloji təkrar, hər biri 3 texniki təkrar daxil olmaqla, yəni, nümumi = 18). EC50 dəyərlər: (R)-(−)-ipsdienol 9.47 μM (±)-ipsdienol 5.34 μM. Məlumatlar orta cavabları təmsil edir ± SEM

Gözlənildiyi kimi, Orco agonisti VUAA1-ə əhəmiyyətli cavablar ItypOrco/ItypOR46 (F) ifadə edən HEK hüceyrələrindən qeydə alınıb.1,14 = 792 səh < 0,001 Şəkil 3a) və ItypOrco/ItypOR49 (F)1,14 = 469 səh < 0.001 Şəkil 4a), funksional Orco ifadəsini nümayiş etdirir. VUAA1 cavabları, həmçinin ItypOrco və iki OR-un hər biri ilə birgə vurulmuş oositlərdən qeydə alınıb (Şəkil 3c, d Əlavə Şəkil 4, Əlavə fayl 2). ItypOrco/ItypOR46 ifadə edən HEK hüceyrələrində 30 μM konsentrasiyada VUAA1 reaksiya miqyası rasemik ipsenolun yaratdığı reaksiyaya bənzəyirdi (Şəkil 3a), halbuki oositlərdə Orco-nun VUAA1 reaksiyası cavabdan 7 dəfə aşağı idi. ipsenol (şəkil 3c). Bu variasiya müxtəlif sistemlərdə OR-un Orco-ya qarşı nisbi ifadəsindəki fərqlər və ya VUAA1 üçün bağlanma yerinin əlçatanlığına təsir edən reseptor kompleksinin yığılmasına sistemdən asılı təsirlərlə bağlı ola bilər.

Protein modelləşdirilməsi və molekulyar birləşmə

ItypOR46 və ItypOR49-un liqand bağlama mexanizmləri haqqında fikir əldə etmək üçün zülal homologiyasının modelləşdirilməsi və molekulyar dok simulyasiyaları aparılmışdır. Birincisi, cəmi 3185 OR və Orco ardıcıllığı [53, 54] olan iki ItypOR-un uyğunlaşdırılması yaradıldı (Əlavə Məlumat 1, Əlavə fayl 3). OR və Orco zülalları arasında yüksək konservasiyaya malik əsas qalıqlar modelləşdirilmiş OR-ların düzgün düzülməsini və yivlənməsini qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir. ItypOR46 və ItypOR49 modelləri Orco strukturunda müşahidə edilən hüceyrədənkənar boşluğun mövcudluğunu təsdiqlədi və bağlayıcı yarıq əmələ gətirməyi təklif etdi [10]. Hüceyrədənkənar döngənin 2-nin nəşr olunmuş Orco strukturuna daxil olmayan hissəsi (qalıqlar 156-170) başlanğıcda modelləşdirilmişdir və bağlayıcı yarığı açıq qoyan uzadılmış qat Orco strukturunun kriyo-EM sıxlıq xəritəsi [10] ilə dəstəklənmişdir. Əlavə Şəkil 5, Əlavə fayl 2). Müxtəlif OR-lərdə ([54]-də nəzərdən keçirilir) liqand spesifikliyinə təsir göstərdiyi nəzərdə tutulan bir neçə qalıq bu yarıqda (Şəkil 5) və ItypOR46 və ItypOR49 arasında əhəmiyyətli fərqlər müşahidə edilmişdir (aşağıda təsvir edilmişdir), bu da onların fərqliliklərini izah edə bilər. ligand spesifikliyi. Residues that when mutated were shown to affect inhibition of odor detection of OR59b by DEET in Drosophila melanogaster (“Dmel”) are located on transmembrane helix 2 [55], and residues affecting 2-heptanone specificity of DmelOR85b and pheromone response of OR3 in Ostrinia moths [56, 57] are located on transmembrane helix 3, extra cellular loop 2, and transmembrane helix 4. The locations of these residues indicate that they possibly affect ligand binding (Fig. 5), both at the extracellular entrance and at the deep end of the cleft, approximately at the center of the transmembrane domain. Hence, the docking site was defined to explore OR-ligand interaction possibilities throughout this confined region.

Protein model of ItypOR49. Left image: overview model indicating the predicted binding cavity in red mesh. Residues lining this cavity which in previous studies have been shown to affect ligand binding are shown in stick representation. Transmembrane (TM) helix 7 that forms the ion channel in the tetrameric Orco complex is located to the right. The expected extension of the lipid bilayer is indicated by gray lines. Right image: closer view of the cavity in the transmembrane region. Predicted binding site I and II as well as TM domains 2–4 and extracellular loop (EL) 2 are indicated

Molecular docking simulations included both enantiomers of ipsenol and ipsdienol, as well as the structurally similar but inactive compounds amitinol and myrcene, and the unrelated compound 1-hexanol (Supplementary Figure 6, Additional file 2). Ipsenol and ipsdienol docked to two distinct locations in ItypOR46 and ItypOR49, respectively, directed by OR-specific residues that line the cleft. One deep site (site I) is located where mutational studies identified residues important for inhibition of odor detection of Drosophila OR59b by DEET [55], and one site is closer to the extracellular opening of the cleft (site II Fig. 5). Most of the residues that have been shown to affect OR responses are concentrated at these two sites, or in their vicinity (reviewed in [54]).

In ItypOR46, both enantiomers of ipsenol interacted via their conjugated double bonds in a π-π electron interaction with Tyr84, while being able to form a hydrogen bond to Thr205 as well as to Tyr84 at site I (Fig. 6a). Hence, their poses were not sufficiently different to account for the enantiomer discrimination of the OR. The corresponding residues in ItypOR49 are Phe87 and Gly203. Therefore, both of these hydrogen bond interactions are absent in ItypOR49, and ipsenol was consequently instead found at site II, contacting transmembrane helices 3 and 5 lined by Phe313 and hydrogen bonded to Tyr175 and Ser181 ((R)-(+)-ipsenol) or hydrogen bonded to Gln153 and lined by Phe313 and in a π-π interaction with Tyr175 ((S)-(−)-ipsenol) (Fig. 6b).

Results from molecular docking analysis. Predicted binding of (R)-(+)-ipsenol (purple) and (S)-(−)-ipsenol (yellow) to a ItypOR46 (site I) and b ItypOR49 (site II). Predicted binding of (R)-(−)-ipsdienol (rose) and (S)-(+)-ipsdienol (green) to c ItypOR46 (site I) and d ItypOR49 (site II). Binding site I is located approximately midway in the transmembrane region in relation to the plasma membrane. The shallower predicted binding site II is near the extracellular opening of the binding cavity. Potential hydrogen bonds are indicated with dashed lines. Residues in ORs that adopt a new position upon docking of a ligand are colored according to the corresponding ligand

The same distribution between sites holds true for the ipsdienol enantiomers. In ItypOR46, the π-π interactions resulting from the docking simulations were similar to ipsenol π-π stacking to Tyr84, but no hydrogen bond to Thr205 at site I was observed. Instead, a hydrogen bond between the hydroxy group and Gln150 was favored (Fig. 6c). Noteworthy, none of the 20 top poses of the ipsdienol enantiomers featured both a π-π stacking to the Tyr84 and a hydrogen bond to Thr205 in ItypOR46, substantially diminishing the favorable interaction as compared to the ipsenol enantiomers. Docking of the ipsdienol enantiomers into the ItypOR49 cleft resulted in binding to site II, involving π-π interactions with Phe313 for both enantiomers, hydrogen bond interactions to Tyr175 from extracellular loop 2 as well as to the backbone amine of Ser181 (Fig. 6d). The favorable hydrogen bonds to the hydroxy group at the stereogenic center resulted in differing side chain rotamers and spatial occupancy of the ligand. As for ItypOR46, elucidating the enantiomer-specific activation of ItypOR49 is likely to require knowledge of the conformation of the open ion pore state.

Poses of the inactive compound 1-hexanol did not cluster into any one specific site, but instead offered hydrogen bond donation to backbone carbonyls and hydrophilic side chains, while the extended hydrocarbon chain engaged in unspecific hydrophobic interactions. Myrcene engaged in unspecific hydrophobic interactions and in π-π electron stacking with either an aromatic moiety at the bottom of the cleft (Tyr84 in ItypOR46 and Phe87 in Ityp49) or with a pair of phenylalanines in transmembrane helix 5 (ItypOR46: Phe316/Phe319 ItypOR49: Phe313/Phe317). Likewise, amitinol with its three double bonds, two of which are conjugated as in the myrcene structure, also interacted with the same aromatic residues in π-π stacking with the aforementioned residues. Having a tertiary alcohol group, amitinol is available for hydrogen bonding interactions, but in the confines of the binding cleft they are not equivalent to those available to the ipsenol and ipsdienol enantiomers.

Site-directed mutagenesis of predicted ligand-binding residues

To gain support for the docking analysis, we introduced mutations to the two predicted key residues (Tyr84 and Thr205) at site I in ItypOR46 and used the HEK cell assay to test the responses of mutated versions of the OR to the enantiomers of ipsenol. Because ipsenol was predicted to form a hydrogen bond with the hydroxy group present on the aromatic moiety of the tyrosine, we introduced two mutations to Tyr84: Tyr84Phe and Tyr84Ala. The former mutation removed the hydroxy group but retained the aromatic structure, whereas the latter mutation removed both features. Responses to (S)-(−)-ipsenol in cells expressing ItypOR46 Tyr84Phe were highly reduced as compared to responses in the wildtype receptor (included as control) and only observed at the highest concentrations (Fig. 7a). In fact, the responses to (S)-(−)-ipsenol in this mutated OR were lower than the responses to (R)-(+)-ipsenol in the wildtype receptor. Cells expressing ItypOR46 Tyr84Ala did not respond to (S)-(−)-ipsenol at any concentration (Fig. 7b), supporting the prediction of hydrogen bonding between the tyrosine and ipsenol at this site, but also suggesting that the presence of an aromatic residue has some importance. To investigate the functional importance of residue 205, we mutated this residue from Thr to Ala. Again, responses to (S)-(−)-ipsenol of cells expressing ItypOR46 Thr205Ala were completely abolished (Fig. 7b). None of the mutated versions of ItypOR46 responded to (R)-(+)-ipsenol. To investigate whether any of the point mutations had resulted in a shift in ligand specificity, the three mutated versions of ItypOR46 were also tested for responses to all screening compounds at 30 μM concentration. Whereas ItypOR46 Tyr84Phe and ItypOR46 Thr205Ala did not respond to any of these additional compounds, small but significant responses were elicited in ItypOR46 Tyr84Ala by (+)-α-pinene (Δ fluorescence = 2.5% F1,9 = 10.94 səh = 0.009) and (−)-limonene (Δ fluorescence = 2.0% F1,9 = 7.46 səh = 0.023), suggesting a shift in specificity as these compounds did not activate wildtype ItypOR46 (Supplementary Figure 7, Additional file 2). Proteins of all mutated versions of ItypOR46 were detected by Western blot at equivalent or higher band intensities as the wildtype receptor, indicating sufficient levels of mutated proteins in the cells (Supplementary Figure 1, Additional file 2). Moreover, cell lines expressing mutated versions of ItypOR46 displayed normal VUAA1 responses (Supplementary Figure 7, Additional file 2). The low response of ItypOR49 rendered this receptor unsuitable for mutagenesis experiments.

Response to ipsenol enantiomers of cells expressing wildtype (WT) ItypOR46 and mutated versions of this receptor. Data are split between two panels for clarity. a ItypOR46 WT (positive control n = 3 biological replicates, each including 3 technical replicates, i.e., nümumi = 9) and ItypOR46 Tyr84Phe (n = 4 biological replicates, i.e., nümumi = 12). b ItypOR46 Tyr84Ala and ItypOR46 Thr205Ala (n = 3 biological replicates, nümumi = 9 for both cell lines). For clarity, data for (R)-(+)-ipsenol are only shown for ItypOR46 WT , since this compound did not activate mutated versions of the receptor. Data represent mean responses ± SEM

Whole mount fluorescence in situ hybridization

Antennal olfactory sensilla in I. typographus are localized in two bands, labeled “A” and “B” (proximal and medial, respectively), that transverse the ventral surface of the antennae, and a distal “C” area [58]. OSN classes tuned to ipsenol and ipsdienol, respectively, are in both sexes found inside single-walled sensillum type 1 (SW1) in the A and B bands of sensilla, but not in area C where the longer SW2 is most abundant [2, 29, 58]. Hence, we performed whole mount in situ hybridizations with digoxigenin-labeled probes against ItypOR46 and ItypOR49 to investigate whether the antennal localization of these receptors corresponds to the distribution of the ipsenol and ipsdienol OSN classes. As expected, signals for ItypOR46 were detected underneath SW1 in the A and B bands of sensilla, but not in area C (Fig. 8a). The sparse and defined signals only in these antennal areas and sensillum type suggest a high specificity of the hybridization. ItypOR49 could not be detected from any of the included antennae using this method.

In situ hybridizations and responses of olfactory sensory neurons putatively associated with ItypOR46 and ItypOR49. a Detection of ItypOR46 in single-walled sensillum type 1 in antennal areas “A” and “B” in a male (left) and female (right) I. typographus as shown by whole mount in situ hybridization using a digoxigenin-labeled probe (magenta sensilla also highlighted with yellow arrowheads). White capital letters (A, B, and C) a, indicate the three areas of sensilla [58], and ipsenol-specific olfactory sensory neurons (OSNs) are found in areas A and B [2, 29]. Electrophysiological responses of the two OSN classes tuned to b ipsenol (n = 10 6 from males, 4 from females) and c ipsdienol (n = 4 2 from each sex) to OR and/or OSN-active compounds and solvent blank, with representative excitatory response traces shown in de, müvafiq olaraq. Compounds were diluted in paraffin oil and presented at a high dose of 10 μg on filter paper inside standard Pasteur pipette stimulus cartridges. The black horizontal bars indicate the 0.5 s odor stimulation. OSN data in b–e originally collected by Andersson et al. [29], but re-analyzed for the purpose of the present study. For data showing the enantio-selectivity of these OSN classes, see original publications [30, 32, 33]


What is background binding? - Biologiya

Tutorial developed by Ross Feldberg, Dept. of Biology, Tufts University

Lysozyme with trisaccharide inhibitor bound
The Lysozyme Binding Cleft

Lysozyme has six subsites that bind the oligosaccharide
The binding residues

The Environment around asp52 and glu35
The catalytic site

Background on Lysozyme

Lysozyme is an enzyme found in tears, nasal secretions and the white of avian eggs which hydrolyzes the polysaccharides found in many bacterial cell walls. As such, it has mild antibacterial action and indeed was one of the first antibiotics studied by Sir Fleming, the discover of penicillin. Hen egg white lysozyme has been studied in great detail. Because the enzyme is a very effective catalyst, it has been impossible to obtain a stable crystal between enzyme and substrate. However, it has been possible to obtain crystals of the enzyme complexed to trisaccharide inihibitors. The structure shown here contains a trisaccharide of N-acetylglucosamine (NAG3) and is from the pdb file 1HEW.

NAG-3 bound to lysozyme in substrate goove

Lysozyme is a compact protein of 129 amino acids which folds into a compact globular structure. Note as the protein rotates that there is a rather deep cleft in the protein surface into which six carbohydrates can bind. It is possible to crystallize the protein in the presence of a trisaccharide which is a competitive inhibitor of the substrate. That trisaccharide, (NAG)3 is shown here in blue.

Secondary Structure in Lysozyme

Lysozyme has five helical regions. Three are standard alpha helices but one (residues 109- 115) is closer to the pi helix in character while two (80-84 and 120-124) are intermediate in structure between the 3-10 helix and the alpha helix. There are also five regions of beta sheet and a large amount of random coil and beta turns. Although this representation shows secondary structure, the openness of it makes it impossible to identify the cleft.

Binding of the Substrate

This button selects a series of residues in the protein that have been identified as taking part in binding of the oligosaccharide substrate. Although these residues make up the surface of a deep groove in the protein, they can be quite far apart in the primary structure. The residues selected are, in order: asp101 (partially buried) trp62, trp63, asn59, ala107 val109 and gln57. The next residues (asp52 and glu35) are colored magenta since they are particularly important in the catalytic mechanism gln57, asn44 phe34 and arg114. Finally, the trisaccharide inhibitor is shown bound to the initial residues.

The Active Site Environment

Two carboxylic acid residues play an important role in catalyzing the hydrolysis of the oligosaccharide substrate. A key factor (not shown here) is that the protein distorts the sugar at the fourth subsite along the protein surface into a half chair conformation which is similar to the transition state. In addition, glu35 transfers a proton to the O1 position while the negative charge on asp52 stabilizes the positively charged oxonium ion intermediate. However, for glu35 to be protonated at neutral pH, its dissociation must have been suppressed. This is accomplished by placing it in a very hydrophobic environment. In this view, asp 52 and glu35 are initially shown and then hydrophobic groups within 4.5A of each residue are selected and colored green. It is clear that the glu35 carboxylic acid side chain is surrounded by hydrophobic groups while that of asp52 is in a polar environment.


Metodlar

Zülallar

Seven proteins are analyzed in this study to test the suitability of the method. The crystal structures of both the unbound and bound conformations of these proteins are available in the Protein Data Bank (PDB) [41]. Table 1 lists the proteins analyzed. The unbound and bound form PDB codes are given in the first column. The names of the corresponding proteins, number of residues, root mean square deviations (rmsd) between the unbound and bound forms of the proteins are listed in the following columns of the table. The ligands bound are given in the fourth column of the table. Three antibodies investigated are also listed in the same table.

Metod

The details of the analytical model (ANM) have been given in the Additional file 1 and elsewhere [6, 42]. ANM is equivalent to a normal mode analysis. In the model, C α atoms are taken as the interaction sites for residues which are connected by virtual bonds (linear springs between the beads) to form the protein backbone. This model assumes that the protein in the folded state is equivalent to a three dimensional elastic network. Therefore, the molecule is modeled as a chain of N beads (residues) connected by N-1 springs. The bond lengths and bond angles are not constrained, which yields 3N degrees of freedom. The beads are subject to harmonic potentials from all neighboring beads regardless of backbone connections. In the calculations, only interactions between pairwise beads is considered if they are in contact, thus decreasing the spring number from N × (N - 1)/2 to a much smaller number. If the distance between two residues i and j is less than a cutoff distance then these two residues are assumed to be in contact. The cutoff distance includes all residue pairs within a first interaction shell of 15 Å and defines the range of interaction of bonded and non-bonded α carbons. The potential energy equation can be expressed in the matrix representation in terms of the 1 × 3N fluctuation vector (Δ R) and the 3N × 3N Hessian matrix (H) composed of inter-residue force constants as

where the Hessian matrix (H) is defined as

The equilibrium cross-correlations between residue fluctuations is given by<ΔR i• ΔR j> = (kBT)[H -1 ] ij

where kB is the Boltzmann constant, T is the absolute temperature. The angular brackets designate the vibrations of Cα atoms over all modes of motion, [H -1 ]ij is the trace of the 3 × 3 matrix enclosed in the inverse of the 3N × 3N Hessian matrix for residue types i and j. In parallel with normal mode analysis (NMA), the equality in the above equation follows from the fact that the mean square displacements in mode space are inversely proportional to the eigenvalues [34, 43–45]. In NMA, the Hessian matrix is mass-weighted, here specificity of the beads is not considered and all residues are assumed to have the same weight. Associated with the normal or fundamental modes of vibration, the inverse of the Hessian matrix can be written as follows over the range of modes 1 ≤ m ≤ 3N-6,

where λm are the eigenvalues of H and um are eigenvectors of H for the mth mode. The six modes with zero eigenvalues correspond to purely translational and purely rotational motion modes. Vibrational modes give the directions and relative amplitudes of the atomic displacements in each mode. [umum T ] is an 3N × 3N matrix, representing the contribution of each of the mth eigenvectors to H. This equation provides a simple means of decomposing the dynamics into a series of modes. In other words, the mean square fluctuation of residue type i associated with the m th mode of motion is found from:

The motions from individual modes are compared with the experimentally known conformational changes for the list of proteins given in Table 1. C α coordinates for the unbound and bound structures are obtained from the PDB. The two structures (unbound and bound) are superimposed to calculate the individual residue displacementsΔRtheor = Ro - Rc

harada Ro - Rc are the crystallographic coordinates of the unbound and bound structures, respectively. The theoretical atomic fluctuations of the unbound structures are obtained with Eq. 5. In previous similar studies, conformational changes have been compared to normal modes through the measure of scalar products. In this study Pearson correlation coefficients are used to have a consistent measure.


Mastering Biology Chapter 37

Diagram showing an action potential moving from left to right along an axon membrane. The axon membrane is labeled from left to right: a, b, c, d, e, f, g. The action potential starts at the leading edge, labeled (f), and ends at the trailing edge, labeled (a). Label g is at the right of the leading edge. Labels b, c, d, and e are within the action potential. At resting, the charge outside the cell is positive and the charge inside the cell is negative. As the action potential moves left to right, it temporarily reverses the charges inside and outside the cell.

5. At location g, the axon membrane is at resting potential.

2. At location f , the axon membrane reaches threshold and the voltage-gated Na+ channels open.

7. At location e, the membrane potential changes sign (from a negative value to a positive value) and the voltage-gated Na+ channels are open.

4. At location d, the voltage-gated Na+ channels are inactivating and the voltage-gated K+ channels are opening.

1. At location c , the membrane potential changes sign (from a positive value to a negative value) and the voltage-gated K+ channels are open.

6. At location b, the voltage-gated K+ channels are closing.

d. plasma membrane of cell body

1. Voltage-gated Ca2+ channels in the presynaptic membrane open briefly, allowing Ca2+ ions to enter the cell.

2. This higher cytosolic Ca2+ concentration in the synaptic terminal causes some synaptic vesicles to fuse with the presynaptic membrane.

3. By fusing with the presynaptic membrane, the synaptic vesicles release neurotransmitter into the synaptic cleft.

4. The increased concentration of neurotransmitter in the synaptic cleft causes it to bind to ligand-gated ion channels in the postsynaptic membrane. As a result, the channels open. Ions may then diffuse through the channels, causing a change in the membrane potential of the postsynaptic cell.

brings the postsynaptic membrane potential closer to the threshold

depolarizes the postsynaptic membrane

results from the movement of Na+ ions
into the postsynaptic cell

INHIBITORY POSTSYNAPTIC POTENTIAL (IPSP)

moves the postsynaptic membrane potential farther away from the threshold

hyperpolarizes the postsynaptic membrane

results from the movement of K+ ions out of the postsynaptic cell

By analyzing each change in the membrane potential at the axon hillock of the postsynaptic neuron, you can tell which presynaptic neuron produced the change. For example, when the membrane potential at the axon hillock becomes more negative (hyperpolarizes), you know that an inhibitory postsynaptic potential (IPSP) was produced at the synapse. Conversely, when the membrane potential at the axon hillock becomes less negative (depolarizes), you know that an excitatory postsynaptic potential (EPSP) was produced at the synapse.

Because postsynaptic potentials decrease in magnitude with distance from the synapse, a smaller change in the axon hillock's membrane potential indicates that the presynaptic neuron that produced that potential is farther away. Conversely, a presynaptic neuron nearer the axon hillock will produce a larger change in the axon hillock's membrane potential.

Morphine , Yes, 6 × 10-9 M
Methadone, Yes, 2 × 10-8 M
Levorphanol, Yes, 2 × 10-9 M
Phenobarbital, No, No effect at 10-4 M
Atropine, No, No effect at 10-4 M
Serotonin, No, No effect at 10-4 M

A team of researchers was looking for opiate receptors in the mammalian brain. Knowing that the drug naloxone blocks the analgesic effect of opiates, they hypothesized that naloxone acts by binding tightly to brain opiate receptors without activating them. In this exercise, you will interpret the results of an experiment that the researchers conducted to test their hypothesis.

The researchers added radioactive naloxone to a protein mixture prepared from rodent brains. If the mixture contained opiate receptors or other proteins that could bind naloxone, the radioactivity would stably associate with the mixture. To determine whether the binding was due to specific opiate receptors, they tested other drugs, opiate and non-opiate, for their ability to block naloxone binding.

Diagram showing the steps of the experiment. Step 1: Radioactive naloxone and a test drug are incubated with a protein mixture. Step 2: Proteins are trapped on a filter. Bound naloxone is detected by measuring radioactivity.


Abstract

A practical class experiment is described to show the students an application of fluorescence spectroscopy in the study of protein-ligand binding. This class is part of an undergraduate physical biochemistry course for life science students. The major aim is to introduce the students to the basic concepts of fluorescence emission (intrinsic and extrinsic), the effect of environment on fluorescence parameters, and how this could be applied to the study of ligand binding to proteins. In particular, binding of the fluorescent probe 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate to albumin (native and oxidized) is described. From the obtained results, the stoichiometry of complex formation, the binding equilibrium constants, and alterations of the environment of the binding sites are determined and discussed with the students.

The lifetime of the fluorophore in the excited state is in the nanosecond range but is sufficiently long to interact with the environment. Interactions of the fluorophore with the surrounding solvent molecules may affect the fluorescence parameters such as maximum λem, quantum yield, and lifetime. In general, an increase in the polarity of the solvent (or environment) will lead to (a) a decrease in the fluorescence intensity, and (b) a red shift in the λmaks of emission. These effects of environment on fluorescence parameters have been utilized extensively in monitoring ligand binding to proteins, provided there is a change in the surroundings of the fluorophore after complex formation [ 3 , 5 ].

Proteins have natural or intrinsic fluorescence because of their aromatic amino acid residues (mainly tryptophan). In addition, in biochemistry, an external fluorescent probe or labeling reagent (extrinsic fluorescence) is used frequently. 1-Anilino-8-naphthalene sulfonate (ANS) 11 1 The abbreviations used are: ANS, 1-anilino-8-naphthalene sulfonate BSA, bovine serum albumin. is a fluorescent probe that is extremely sensitive to the polarity of the solvent. Its spectrum in ethanol is shown in Fig. 1. It is practically not fluorescent in water (quantum yield 0.004), and its emission increases significantly in hydrophobic environments (see Fig. 2) [ 6 ].

When ANS binds to a hydrophobic patch at the surface of BSA the quantum yield increases significantly (from 0.004 to 0.12) [ 6 ]. In addition, using ANS as a model ligand, the microenvironment of the binding sites can also be ascertained, because the binding of ANS is considered a suitable probe of protein surface hydrophobicity [ 7 ]. There are several factors that can alter protein surface hydrophobicity, e. g. it changes upon denaturation and folding [ 8 ], it can be altered by the binding of some ligand, and it has also been observed that oxidative modifications considerably alter surface hydrophobicity [ 9 , 10 ].

Herein, we describe to biochemistry students with a basic knowledge of fluorescence spectroscopy, easy and inexpensive experiments that can be used to illustrate solvent polarity effects on fluorescence, as well as how this effect can be utilized to determine ligand binding parameters.


Non-specific binding in ELISA assays - Reducing background with human serum (Sep/23/2003 )

Does anyone know how I can eliminate non-specific binding in a Sandwich ELISA to assay for protein in human serum? I tried traditional blocking methods (BSA, PBS, Tween-20) but they didn't help to reduce background.

It's your mistake to add tween-20 in your blocking buffer ! Try calf serum instead of BSA to block the non-specific sites.

All the traditional blocking methods are good since if you work at a optimum concentration of these reagents. To eliminate the background you could increase the concentration of the BSA (up to 5%) or Tween-20 (up to 3-5%). For sandwich ELISA you could try the blocking buffer with 5% of sucrose, 1% BSA and 0.01% of sodium azide. It work well for me.

Calf serum, casein, powder milk, and other can be used also to block the plates.

Try to increase the time with the blocking solution.

On the other hand, the background could be related with the specificity of your coating (is it a monoclonal or policlonal antibody? Which concentration?)

Maybe you can check your solution in those way.Firstly,to adjust concentraction of antigen and antibody you used.Secondly,best to choose the monoclone antibody as enzyme labelled one.Besides, as Fujiwara said,you may change your blocking methods.
By the way,Tween-20 maynot have any bad effects on your test,and avoid adding sodium azide in your buffer if you use HRP labelled antibody.

I am also doing sandwich ELISA and encountering high background. However I am using polyclonal antibody.

Currently I am using 1% BSA, 0.05% Tween 20 and EDTA. I have even tried 1% FBS v/v - decreased background by a mere 0.3.

I have difficulty establishing the dynamic range now. Could it be due to the polyclonal antibody? My blank can read 0.8 while the lesser serial dilutions could register negative readings.

because you are assaying protein of human serum you must not use BSA for blocking. for any serum protein you must use 1% or 0.1% casein.

ya i too have come across similar problem- in a Sandwich ELISA to assay for protein in human serum.
my captrure is monoclonal--blocking with TBS-Tween 20--sample(serum)--primary Ab(polysera-not purified)--detection Ab conjugated to HRP. except the coationg all reactions are at RT.

what i am trying to understand is the efficiency of tween-20 in blocking a well with hydrophilic and hydrophobic sites [maxisorp plates]

You can use top-block as alternative to BSA

Hi there,
I am trying to detect anti-bodies against Tat protein (HIV-1) from human serum.
I am coating 100ng of the protein in carbonate buffer, blocking with 2% BSA followed by 10% sheep serum.

The wash contains 0.2% Tween20, 50mM Tris and 100mM NaCl. The human serum is diluted (1:100) in sheep serum.

I still see a high back ground of 0.4 even in "no antigen" control. however, the no antobody control is fine (0.04).

how do I reduce this back ground? One more point is that the normal serum too is behaving similarly.

Are you sure it is background and not heterophilic abs?
Proteins, bsa, fbs, fish, etc work well for blocking unbound sites on the plastic. Detergents only for washing. Sugars or dextrins to protect the ab or ag coated on the wells (storage).

If it is heterophilic rx then investigate removal of Fc portion of ab or Other possibilities include preincubation of sample with blocking reagents such as non-specific IgG of class similar to abs in the sytem. or commercial heterophilic blocking reagents.


Why milk is used in Western blotting? - (Oct/05/2006 )

Milk contains a lot of proteins which bind to the membrane to reduce background, non specific binding. Antibodies are proteins, so they can bind to the membrane inespecifically, this is, they bind to any site in the membrane (only due to being proteins) apart from binding to their antigen.

So, after transfer, proteins contained in the milk bind to the membrane and, thus, fill a a lot of sites ("potential background sites") there. After this, when you incubate with your antibody, it binds to the antigen (the "perfect" situation is when your antibody only binds only to your antigen and not any other site in the membrane) and has less possibilities of inespecific binding.

Some people instead of milk use a BSA solution and there are available some commercial background reducing powders, but for me milk has always worked fine. Furthermore, I dilute my secondary Ab in 3% dry milk in TBS 1x and this also has helped me to reduce background.

Well, I hope I´ve been clear, if not, I´ll try to explain it again. Sorry for my english.

there are situations where milk is not appropriate. milk contains phosphoproteins (eg-casein) and biotin. if you are working with anti-phosphoprotein or with biotinylated antibodies then your backgrounds may be too high.

I think the main reason to use milk protein was still not answered: It is the low immunogeneity of its proteins which should reduce unspecific background in Wb the same is true for serum albumine reduction of fat enhances binding of proteins not disturbed by triglycerides

and I would say, at least in our lab, the reason milk is preferred where possible is because it is so much cheaper than BSA. BSA would be the ideal for us in all applications, but it's very expensive compared to milk, which works for most applications

pumuki, mdfenko, kosmodrom, and aimikins

thanx alot for your replies

what i understand from your posts is that milk is used to prevent non-specific binding of antibodies to the membrane. sağ?

causes:
- its proteins bind to the membrane thus not giving antibodies the opportunity for non-specific binding
- immunity: milk proteins have low immunogenity

mdfenko: can u explain your post more, PLZ

and one more basic wondering that i don't know: what do u mean by "membrane background" ?

Membrane background are signals caused by inespecific bindings of the antibodies, when they bind other sites in the membrane different from the antigen. This difficults the analysis, because the band is not clear.
I´m a beginner in WB, but if I can help you more, here I am.

sure, first, let me retract the statement about biotin. i had been told, years ago, that there was significant amounts of biotin in milk but i found that is not the case (unless the milk is supplemented). so disregard that part of my post.

however, milk does contain phosphoproteins, more specifically, casein. casein is a major protein component of milk and will bind to the membrane when blocking (this is what you want to happen). a problem arises if you want to probe your blot for a phosphoprotein with an antibody specific for the phosphorylated site on the protein (usually a specific phosphoamino acid). many of these antibodies will bind to the casein as well and will give rise to high background on the blot. in those cases you would need to switch to a more neutral (in the sense that it won't react with or be recognized by your antibodies and/or substrates and/or reagents) blocking agent (eg-bsa or some of the non-proteinaceous blocking agents).

hope this explanation is clear. don't hesitate to ask more if it isn't.

once again, thanx pumuki and mdfenko very much

"blocking"= covering the membrane to avoid non-specific binding. sağ?
and "dark background" means too much non-specific binding!?

mdfenko: u mean that casein is a phosphorus protein, right?

what other blocking agents one could use (proteinaceous and non-proteinaceous)?

once again, thanx pumuki and mdfenko very much

"blocking"= covering the membrane to avoid non-specific binding. sağ?
and "dark background" means too much non-specific binding!?

Yes, I think it´s right

mdfenko: u mean that casein is a phosphorus protein, right?

what other blocking agents one could use (proteinaceous and non-proteinaceous)?

As Aimikins said, other possibility is using a BSA solution, and also some brands have available blocking "secret" solutions or powders.


Videoya baxın: Fon Perde Montajı Nasıl Yapılır? (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Migar

    Bravo, əla cavabdır.

  2. Mele

    Elə saniyələr var ki, dəqiqələr hər şeyi həll edir. Və saatlarla davam edir. Maliyyə və cinsi böhran: cüzdanını açırsan və orada səni sevdim - ağaclar əyildi. Oyunçu var, sallanır ... "Döş qadının üzüdür!" Soyun və qalib gəl!

  3. Tojaramar

    Üzr istəyirəm, amma mənim fikrimcə, səhv edirsən. Bunu sübut edə bilərəm.

  4. Tristin

    Düşünürəm ki, səhv edirsən. PM-ə yazın, danışarıq.

  5. Xochipepe

    Üzr istəyirəm, amma mənim fikrimcə səhv edirsən. PM-də mənə yaz.

  6. Jopie

    And, what here ridiculous?

  7. Aguistin

    İnanıram ki, yanılmısınız. Biz müzakirə etməliyik. Mənə PM-də yazın, sizinlə danışır.



Mesaj yazmaq