Məlumat

Nə üçün COVID-19 RT-PCR-də mənfi nümunə üçün Cp/Ct (keçid nöqtəsi) dəyəri var?

Nə üçün COVID-19 RT-PCR-də mənfi nümunə üçün Cp/Ct (keçid nöqtəsi) dəyəri var?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən İT/Mühəndislik sahəsindənəm və RT-PCR-də bəzi çaşqınlıqlarım var. İndiyə qədər mənim başa düşdüyüm kimi, biz test nümunələrindən RNT çıxarırıq və onu tamamlayıcı DNT-yə (cDNA) köçürür və PCR DNT-nin içərisində ikiqat spiral ayrılır. Sonra hədəf ardıcıllıqla DNT sintezi üçün başlanğıc nöqtəsini təmin edən və hədəf DNT-ni çoxaldan qısa bir nuklein turşusu ardıcıllığını primer edin.

Daha yüksək cp dəyəri mənfi nəticəni göstərdiyinə görə, lakin niyə mənfi nəticələrdə cp dəyəri var? Hər hansı bir hədəf ardıcıllığı (viral DNT) olduqda o, niyə eşikdən keçir? Floresensiya hədəf DNT-nin ölçüsüdür?

Ekstraksiya zamanı RNT çıxarılır, yalnız COVID viral RNT çıxılır? Digər viral və insan RNT ilə nə baş verir?

Nəticəni gördüm ki, aşağı cp dəyərimiz var və test nəticəsi mənfidir, bunun səbəbi əyrinin Sigmoid funksiyasının olmaması idi. Bununla bağlı daha çox izahata ehtiyacım var.


  1. PCR yüksək spesifikdir (yalnız primerlərin bağladığı DNT-ni gücləndirir), buna görə də ümumilikdə nəticələr yaxşıdır. Lakin: Gücləndirmənin eksponensial təbiətinə görə, hətta çox kiçik səhvlər çox az miqdarda DNT-nin gücləndirilməsinə və sonradan flüoresan siqnala səbəb ola bilər. Bu gücləndirməni əldə etməyin əsasən iki yolu var (istəniləndən başqa): Çirklənmələr və primerin özünü gücləndirməsi. Birincisi aydın olmalıdır, ikincisi, primerlər özlərinə (və ya əlavə) bağlana bildikdə baş verir. Bu, adətən PCR-də gec görünür, buna görə də ona Ct-dəyəri təyin edirsiniz və bundan sonra heç bir mənalı gücləndirmə nəticəsini gözləmirsiniz.

  2. Metoddan asılı olaraq, siz nümunənizdən bütün RNT-ni çıxarır və cDNA-ya çevirirsiniz. Bununla belə, PCR-də gücləndirmə üçün bu cDNA-ya uyğun olan primerlər lazımdır. Və bu primerlərin yüksək spesifik olduğu sübut olunduğundan (məna: onlar heç bir başqa ardıcıllığı, hətta yaxın qohum olan virus növlərini də bağlamırlar) biz əmin ola bilərik ki, 1.-də qeyd olunan meyarlara aid olan hər hansı siqnal viral RNT və infeksiya göstərir. Tez-tez istifadə olunan PCR testlərindən biri üçün istinada baxın.

  3. Əyri görmədən bu barədə konkret heç nə deyə bilmərəm. Ümumiyyətlə real vaxtda PCR əyrisi sigmoid formanı izləyir. Bu, reaksiyanın zamanla irəliləməsi haqqında bəzi məlumatlar verir. Fərqli görünürsə, ya reaksiyada, ya da nümunədə nəsə baş vermiş ola bilər. Tərkibində PCR inhibitoru ola bilər, nümunə çirklənmiş və ya başqa bir şey ola bilər. Mən belə bir nəticəyə etibar etməzdim və onu yeni bir nümunə ilə təkrarlamazdım.

İstinad

Real vaxt rejimində RT-PCR ilə 2019-cu ilin yeni koronavirusunun (2019-nCoV) aşkarlanması


@ Chris-in cavabı düzgün olsa da, bir mürəkkəblik var:

Kəmiyyətli PCR (qPCR) prinsipi ondan ibarətdir ki, sizin reaksiyanız 100% effektiv olarsa, hər dövrədə yaranan DNT zəncirlərinin sayını ikiqat artıran bir reaksiyaya sahibsiniz. Teorik olaraq, bir ipdən başlaya bilərsiniz və 2-də 2, sonra 4, sonra 8-i əldə edə bilərsiniz.n üslub tənliyi, haradandövr nömrəsidir.

Lakin, reallıqda bu nadir hallarda baş verir, əksər reaksiyalar 100% effektiv deyil; ümumiyyətlə 90% diapazonunda məqbul hesab olunur, buna görə də riyaziyyatla məşğul olsanız, hər bir dövrədə ikiqat artımla nəticələnmir.

COVID-19 nümunələri üzərində aparılan qPCR testləri ümumiyyətlə 45 dövrə qədər başa çatır ki, bu da riyaziyyatla məşğul olsanız, o deməkdir ki, əgər nümunə bu nöqtədə müəyyən gücləndirmə göstərirsə, deməli, RNT-nin 1 nüsxəsindən azdır (əslində cDNA) hər reaksiyada olur, buna görə də siqnalın qeyri-spesifik gücləndirmə və ya reaksiyadakı digər məhsullardan, məsələn, primer-dimerlərdən gələn saxta siqnallar ola bilər (bu testlərdə belə olmamalı olsa da, onlar bütün -lakin bu problemi aradan qaldırır).

Qeyri-spesifik gücləndirmə reaksiyaya baxmaq və PCR məhsullarının ərimə əyrilərini müqayisə etməklə aşkar edilə bilər. Xüsusi məhsulların müəyyən meyarlara cavab verən ərimə əyriləri (hamısı eyni nöqtədə zirvə ilə), qeyri-spesifik məhsulların isə fərqli ərimə nöqtələri/əyriləri olacaq.


Real-Time PCR: Anlaşma C t

Kəmiyyət PCR və ya qPCR olaraq da adlandırılan real vaxt PCR, nümunədə mövcud olan hədəf ardıcıllığının və ya genin miqdarını müəyyən etmək üçün sadə və zərif bir üsul təmin edə bilər. Onun çox sadəliyi bəzən onun işləməsini təmin edən bəzi kritik amilləri nəzərdən qaçırmaqla problemlərə səbəb ola bilər. Bu baxış real vaxt PCR reaksiyasını qurarkən və qiymətləndirərkən nəzərə alınmalı olan bu amilləri vurğulayacaqdır.

C-yə təsir edən amillərt

Ct (ərəfəsində dövr) gücləndirmə əyrisi ilə eşik xəttinin kəsişməsidir (Şəkil 1B). Bu, PCR reaksiyasında hədəfin konsentrasiyasının nisbi ölçüsüdür. C-nin mütləq dəyərinə bir çox amillər təsir göstərirt hədəfin konsentrasiyası ilə yanaşı. Biz C-yə təsir edə biləcək ən ümumi şablondan asılı olmayan amilləri müzakirə edəcəyikt və real vaxt PCR reaksiyasının performansını necə qiymətləndirməyi təsvir edin.

Yuxarıdakı Şəkil 1, real vaxt reaksiyasının gücləndirilməsi planının bir neçə parametrlərini göstərir. Şəkil 1B-dəki eksponensial faza Şəkil 1C-dəki xətti fazaya uyğundur. Həddi Şəkil 1C-də gücləndirmə planının xətti fazasında təyin etmək lazımdır. Ct dəyər şablonun miqdarının azalması ilə artır. Bununla belə, reaksiya qarışığından və ya alətdən C. ilə əlaqəli flüoresans ölçmələrini dəyişən artefaktlart hesablama C-də şablondan asılı olmayan dəyişikliklərlə nəticələnəcəkt dəyər. Buna görə də Ct Fərqli şəraitdə və ya müxtəlif reagentlərlə aparılan PCR reaksiyalarından alınan dəyərlər birbaşa müqayisə edilə bilməz.


Mücərrəd

Histoplazmoz bütün dünyada ən mühüm endemik və sistemli mikozlardan biri hesab olunur. İndiyə qədər onun diaqnozu üçün bir neçə molekulyar üsul hazırlanmışdır. Bu tədqiqatın məqsədi heyvan modelindən istifadə edərək müxtəlif zülal kodlayan genlər (100-kDa, H və M antigenləri) üçün üç real vaxt PCR (qPCR) protokolunu hazırlamaq və qiymətləndirmək idi. BALB/c siçanlarından təzə və formalinlə bərkidilmiş və parafinə daxil edilmiş (FFPE) ağciyər toxumaları i.n. 2.5x10 6 ilə Histoplasma capsulatum maya və ya PBS infeksiyadan 1, 2, 3, 4, 8, 12 və 16 həftə sonra əldə edilmişdir. Müxtəlif təbəqələri təmsil edən mədəniyyətlərin DNT toplusu H. kapsulat (30 suş) və digər tibbi cəhətdən müvafiq patogenlər (36 əlaqəli göbələk ştamı və Mycobacterium tuberculosis) həssaslıq və spesifikliyi təhlil etmək üçün istifadə edilmişdir. Müxtəlif suşların DNT-ləri sınaqdan keçirildikdə analitik həssaslıq və spesifiklik 100% idi. Ən yüksək göbələk yükü infeksiyadan sonrakı ilk həftədə baş verdi və tam göbələk təmizlənməsi üçüncü həftədən sonra müşahidə edildi. H. kapsulat maya hüceyrələri histopatoloji analizdə nümayiş etdirildi. İnfeksiyadan sonrakı ilk həftədə bütün təzə və FFPE ağciyər toxumalarından H. kapsulat-Təzə ağciyər toxuması nümunələrinin təhlili zamanı dəyişkən nəticələr verən M antigen protokolu istisna olmaqla, yoluxmuş heyvanlar sınaqdan keçirilmiş qPCR protokolları üçün müsbət olmuşdur. İkinci həftədə bütün qPCR protokolları həm təzə, həm də FFPE toxumaları üçün dəyişkən nəticələr göstərdi. İnfeksiyadan sonrakı qalan vaxtlarda yoluxmuş siçanlardan və yoluxmamış siçanlardan (nəzarətlər) alınan nümunələr bütün protokollar üçün mənfi olmuşdur. 100-kDa və H antigen protokolları üçün CFU, histopatoloji analiz və qPCR nəticələri arasında yaxşı uyğunluq müşahidə edildi. Biz aşkar etmək üçün üç qPCR analizini uğurla standartlaşdırdıq və təsdiq etdik H. kapsulat Təzə və FFPE toxumalarında DNT və 100 kDa və H antigen molekulyar analizlərinin bu mikozun diaqnozu üçün perspektivli testlər olduğu qənaətinə gəlin.

Sitat: López LF, Muñoz CO, Cáceres DH, Tobón ÁM, Loparev V, Clay O, et al. (2017) Heyvan modelində üç molekulyar hədəfdən istifadə edərək histoplazmozun diaqnozu üçün real vaxtda PCR analizlərinin standartlaşdırılması və təsdiqi. PLoS ONE 12(12): e0190311. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0190311

Redaktor: Ulrich Melcher, Oklahoma Dövlət Universiteti, Amerika Birləşmiş Ştatları

Qəbul edildi: 19 sentyabr 2017-ci il Qəbul edildi: 12 dekabr 2017-ci il Nəşr olundu: 29 dekabr 2017-ci il

Bu, bütün müəllif hüquqlarına malik olmayan açıq girişli məqalədir və hər kəs tərəfindən hər hansı qanuni məqsədlə sərbəst şəkildə təkrar istehsal oluna, yayıla, ötürülə, dəyişdirilə, üzərində qurula və ya başqa şəkildə istifadə edilə bilər. Əsər Creative Commons CC0 ictimai domeninə həsr olunmuş qaydada təqdim olunur.

Məlumatın mövcudluğu: Bütün müvafiq məlumatlar kağızdadır.

Maliyyələşdirmə: Bu tədqiqat Colciencias (Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación), Boqota, Kolumbiya, Layihə kodu nömrəsi 221356933625 tərəfindən BLG Fondo de Investigaciones de la Universidad del Rosario (FIUR, CoBLG1, CoBLG1) tərəfindən dəstəklənib. Davamlılıq Strategiya Proqramı 2016-2017 və Mikotik Xəstəliklər Şöbəsi, CDC, Atlanta, ABŞ və IMMY şirkəti, Norman, Oklahoma, ABŞ vasitəsilə Antioquia Universitetinin Desarrollo de la Araşdırması (CODI) bizim dəstəkləyən tələbə üçün səyahət qrantı üçün layihə. Tədqiqatın dizaynında, məlumatların toplanmasında və təhlilində, nəşr etmək qərarında və ya əlyazmanın hazırlanmasında maliyyəçilərin heç bir rolu olmayıb.

Rəqabətli maraqlar: Müəlliflər heç bir rəqabət aparan maraqların olmadığını bəyan ediblər.


2 Cavab 2

NIST-in İnformasiya Təhlükəsizliyi kateqoriyalarını və alt kateqoriyalarını əhatə edən iki sənədi var.

CyberSecurity Framework (NIST CSF - bax https://www.nist.gov/cyberframework) ikisindən daha sadədir, lakin şübhəsiz ki, yüksək səviyyədə axtardığınızı təmin edir. Əsas kateqoriyalar müəyyən et, qoru, aşkar et, cavab ver, bərpa et və bunların hər birinin bir neçə alt kateqoriyası var. CSF 100-dən çox elementi əhatə edir ki, bu da onu çox əlçatan edir.

Digər sənəd Federal İnformasiya Sistemləri və Təşkilatları üçün Təhlükəsizlik və Məxfiliyə Nəzarətdir (bax: http://nvlpubs.nist.gov/nistpubs/SpecialPublications/NIST.SP.800-53r4.pdf). Təhlükəsizlik nəzarətləri Əlavə F-də sadalanır.

Yuxarıdakı kateqoriyalara uyğun gəlməyən tapıntılarınız varsa, siz öz müxtəlif bölmənizi yarada bilərsiniz. Bununla belə, NIST-ə riayət etməklə, ən azı müxtəlif müştərilər üçün istifadə oluna bilən tanınmış sənaye çərçivəsindən istifadə edərək tapıntıları təqdim edirsiniz və standart dildə danışdığınızdan əmin olursunuz.


2 Cavab 2

Bölgəniz üçün 30 m SRTM endirməyə və konturları özünüz əldə etməyə cəhd edə bilərsiniz. EarthExplorer vasitəsilə pulsuz olaraq mövcuddur. QGIS-də Raster > Ekstraksiya > Kontur aləti ilə konturlar yaradıla bilər.

Rob Skelly-nin təklifinə bənzər, mən ikinci dəfə 30 m SRTM məlumatından istifadə edərdim.

Bilirəm ki, Whitebox-da bunun üçün SRTM fayllarını endirəcək və ərazinizdən asılı olaraq bir çəkilişdə DEM-i emal edəcək əla alət var.


1 Cavab 1

Çimdik, şifrələmə metodunun sizə təqdim etdiyi xidmətdir. Bunun sizə imkan verdiyi şey eyni açardan istifadə edərək müxtəlif şifrələmələr üçün kontekst ayırmağı təmin etməkdir.

Onun kömək etməyə çalışdığı problem budur: tutaq ki, bir sıra elementləri şifrələmək üçün eyni açardan istifadə edirsiniz, məsələn, verilənlər bazasının bir sütunundakı bütün elementləri bu açarla şifrələyirsiniz.

Bu, problemə gətirib çıxarır: əgər Aliceyə uyğun olan məlumat qeydinin bu sahədə 5, Bob-a uyğun gələndə də bu sahədə 5 varsa, onda hər iki qeyd eyni şifrələnmiş dəyərə malik olacaq. Şifrələnmiş qeydlərə baxan kimsə bu ümumi dəyərin nə olduğunu deyə bilməyəcək, lakin onların eyni olduğunu bilirlər. Və əgər Bob onun dəyərinin nə olduğunu bilirsə, o zaman Alisin dəyərinin nə olduğunu bilir.

Bunu idarə etməyin açıq bir yolu, hər qeyd üçün fərqli bir açardan istifadə etməkdir. Bu işləyə bilər, lakin idarə etmək və saxlamaq üçün çoxlu açarlar var.

Çimdik onu idarə etmək üçün alternativ bir yol təqdim edir, açıq mətn və şifrəli mətn arasındakı xəritəni dəyişir, lakin (açardan fərqli olaraq) təcavüzkarın bunun nə olduğunu bilməyəcəyini düşünmürük. Verilənlər bazası nümunəmizdə istifadəçinin adını ("Alice" və "Bob") düzəldə bilərik, hətta Alice və Bobun şifrələnmiş qeydləri eyni şifrələnmiş dəyərə malik olsa belə, heç kim bundan heç nə çıxara bilməz (çünki xəritələr şifrəli mətndən düz mətnə ​​qədər müstəqildirlər, onlar eyni dəyərə uyğunlaşa bilər, olmaya da bilər).

Bu sizin üçün nə deməkdir? Bu, FE1-dən nə üçün istifadə etdiyinizdən asılıdır. Əgər açarla hərfi mənada bir dəyəri şifrələyirsinizsə, buna həqiqətən ehtiyacınız yoxdur - onu sabit bir dəyərə (məsələn, boş sətir) təyin edə bilərsiniz. Bununla belə, eyni açarla birdən çox dəyəri şifrələyirsinizsə, ondan faydalana bilərsiniz.

Son bir qeyd: bu çimdik niyə Format Qoruyucu Şifrələmə üçün xüsusilə vacibdir? Yaxşı, standart şifrələmə rejimləri ilə biz şifrələmə zamanı təsadüfiləşdirmə faktoru (IV) əlavə edirik (belə ki, eyni dəyəri iki dəfə şifrələsəniz belə, fərqli IV-ləri seçəcəyik) və beləliklə, şifrələnmiş mətn fərqli görünəcək. Bununla belə, bu təsadüfiləşdirmə mütləq şifrəli mətni açıq mətndən daha böyük edir. Format Qoruyucu Şifrələmə ilə bizim bu seçimimiz yoxdur, ona görə də bunu həll etmək üçün başqa yola ehtiyacımız var.


Nə üçün COVID-19 RT-PCR-də mənfi nümunə üçün Cp/Ct (keçid nöqtəsi) dəyəri var? - Biologiya

Həyat və Qida Elmləri Fakültəsi Mərkəzinə təqdim edilən Habilitasiya,
Technische Universität München - Weihenstephan 2003-cü ilin yanvarında
Müəllif: Dr. Michael W. Pfaffl
Fiziologiya İnstitutu, Həyat və Qida Elmləri Mərkəzi, Weihenstephaner Berg 3, 85354 Freising, Almaniya

  • mücərrəd
  • Giriş
  • Mal-qara transkriptomu
    • RNT çıxarılması
    • Əks transkripsiya
    • Mütləq kəmiyyətləşdirmə
    • Xarici standartların üstünlükləri və mənfi cəhətləri
    • Mütləq kəmiyyətin tətbiqi
    • Nisbi kəmiyyət
    • Nisbi kəmiyyətin tətbiqi
    • Məlumatların qiymətləndirilməsi
    • Kəmiyyətləşdirmə prosedurunun avtomatlaşdırılması
    • Statistik müqayisə

    C) Xüsusi hibridləşmə zondlarından istifadə etməklə onlayn aşkarlama ilə xaricdən standartlaşdırılmış RT-PCR (18-20): Bu aşkarlama formatı müxtəlif flüoresan aşkarlama formatlarına əsaslanır, məs. flüoresan rezonans enerji ötürülməsi (FRET).


    Mal-qara transkriptomu

    Şəkil 1: Çoxsaylı mal-qara toxuma nümunələrindən təcrid olunmuş transkriptomun xarakteristikası (29, 30).

    İzolyasiya edilmiş RNT-də RT və PCR reaksiyalarının effektivliyinin azalması ilə nəticələnən və etibarsız və yanlış kəmiyyət nəticələrini yaradan toxuma fermenti inhibitorları ola bilər (25, 26). Əksər RNT preparatları çox aşağı səviyyədə DNT və zülalla çirklənmişdir. Hətta yüksək keyfiyyətli kommersiya yolu ilə əldə edilmiş RNT-də aşkar edilə bilən miqdarda DNT var (26). Bəzi tətbiqlər üçün bu problem olmasa da, kinetik PCR-in böyük gücləndirmə gücü hətta ən kiçik miqdarda DNT çirklənməsi ilə nəticələnə bilər ki, istənilən “xüsusi gücləndirmə”. Qalıq DNT-nin olmamasını təsdiq etmək üçün həmişə eksperimental dizayna “minus-RT” və ya „su nəzarəti“ daxil edilməlidir. Qalıq DNT-dən xilas olmaq üçün RNT nümunəsini kommersiyada mövcud olan RNTazsız DNTaz ilə müalicə etmək lazım ola bilər.


    Əks transkripsiya

    təsadüfi heksamer primerləri > poly-dt primer > gen spesifik primer


    Real vaxt rejimində RT-PCR-nin son nöqtə aşkarlama metodu ilə müqayisəsi

    Şəkil 2: Real vaxtda PCR flüoresansının əldə edilməsi ilə qiymətləndirilən PCR-nin dörd xarakterik mərhələsi (59, 60).


    Kimya tərəfindən hazırlanmış və real vaxt rejimində RT-PCR platformaları


    Kinetik RT-PZR-də kəmiyyət strategiyaları

    Mütləq kəmiyyətləşdirmə

    80% və transfer RNT (tRNA, 10-15%), Şəkil 1-də göstərilmişdir. Bu çatışmayan RNT alt fraksiyaları cDNT sintez sürətinə təsir göstərə bilər və nəticədə RT effektivliyi yüksəlir və kalibrləmə əyriləri genlərin kəmiyyət müəyyənləşdirilməsində həddindən artıq qiymətləndirilir (3, 4, 85, 86). Fon effektlərini kompensasiya etmək və yerli ümumi RNT kimi təbii RNT paylanmasını təqlid etmək üçün bakterial və ya həşərat hüceyrə xəttindən təcrid olunmuş ümumi RNT istifadə edilə bilər. Alternativ olaraq kommersiya baxımından mövcud olan RNT mənbələri RNT fonu kimi istifadə edilə bilər, məs. poli-A RNT və ya tRNT, lakin onlar bütün RNT alt fraksiyaları üzərində yerli RNT paylanmasını təmsil etmirlər (3, 4, 42). Əvvəlki nəticələr, minimum RNT fonunun ümumiyyətlə tələb olunduğunu və RT sintezinin effektivliyini artırdığını göstərir. Kalibrləmə əyrilərində istifadə edilən recRNA-nın aşağı konsentrasiyası həmişə qeyri-spesifik fon və ya daşıyıcı RNT-nin orta konsentrasiyası ilə buferlənməlidir, əks halda aşağı miqdarlar RNTaz tərəfindən asanlıqla parçalana bilər. Çox yüksək fon konsentrasiyaları RT sintez sürətində və sonrakı real vaxtda PCR səmərəliliyində daha əhəmiyyətli yatırıcı təsir göstərmişdir (4).


    Xarici standartların üstünlükləri və mənfi cəhətləri

    Şəkil 5: Xarici olaraq standartlaşdırılmış recDNA kalibrləmə əyrisindən (73-75, 83) istifadə edərək estrogen reseptorunun (ER) alfa real vaxt rejimində RT-PCR analizinin ortadaxili təhlili (n = 7x3) və testlərarası variasiyası (n = 7x7).


    Mütləq kəmiyyətin tətbiqi

    Şəkil 7: Orta PrPc mRNA mq toxuma əsasında müxtəlif iribuynuzlu heyvanların toxumalarında ədədləri kopyalayır (76). Səhv xətləri SD-ni göstərir.


    Nisbi kəmiyyət

    tənlik 1

    tənlik 2

    tənlik 3

    tənlik 4

    tənlik 5

    tənlik 6


    Nisbi kəmiyyətin tətbiqi

    Mikroarrayda mövcud olan 1001 gendən qaraciyərdə 457 genin və jejunumda 566 genin mənfi nəzarətdən iki dəfə çox olan Cy3 və ya Cy5 üçün iki kanaldan ən azı birində siqnal intensivliyi ilə ifadə edildiyi aşkar edilmişdir. Genlər siniflərdə (0,1-qat ifadə eni), 1-qat və 2-qat ifadə nisbəti arasında və daha geniş diapazonlarda 2-dən çox ifadədə birləşdirildi. Hər bir sinifin median ifadə nisbətlərinin loqarifmik çevrilməsi (10 log) əsasında hər toxuma üçün üç parametrik Qauss reqresiyası hesablanmışdır (şəkil 10). Bu, yüksək reqressiya əmsalı (rliver = 0.854, p < 0.0001 rjejunum = 0.853, p < 0.0001) və hər iki tezlik məlumat dəstinin normal paylanması ilə nəticələndi. Qauss paylanmasına (&mikro - 1,96 x standart kənarlaşma < &mikro < &mikro + 1,96 x standart yayınma) uyğun olaraq ortadan (&mikro) iki tərəfli x-qat ifadə nisbəti (x) üçün 95% məxfi interval hesablanmışdır. iki tərəfli 2,5% əhəmiyyətlilik səviyyəsi sərhədləri müəyyən edilmişdir (p < 0,05). Qaraciyər və jejunum üçün aşağıdakı 95% etimad intervalları hesablanmışdır: müvafiq olaraq -1,82 dəfə < x < +1,74 dəfə, -1,71 dəfə < x < +1,61 dəfə. Əldə edilmiş kəsiklərə əsasən ümumilikdə 85 namizəd gen seçilmişdir (şəkil 10).


    Qeyri-spesifik real vaxt PCR artefaktlarından necə qurtulmaq olar

    95°C-də denaturasiya ilə 1-ci seqment
    55-65°C-də primer tavlanması ilə 2-ci seqment
    72°C-də uzanma ilə 3-cü seqment
    Yüksək temperaturda flüoresan qəbulu ilə 4-cü seqment (51, 64, 103).

    Gücləndirmə zamanı yüksək temperaturlu flüoresan almanın üstünlükləri daha geniş kəmiyyət diapazonunda daha az dəyişmə ilə daha etibarlı kəmiyyət göstəricisidir (60, 72, 83). 4-cü seqmentdə flüoresan qəbulu əsasən 80-87°C diapazonunda həyata keçirilir, primer dimerləri və ya qeyri-spesifik kiçik məhsullar tərəfindən əldə edilən qeyri-spesifik flüoresan siqnallarını aradan qaldırır və istənilən məhsulun dəqiq miqdarını təmin edir. Yüksək temperaturun ölçülməsi fon flüoresansını və "şablonla idarə olunan" floresansı yaylada maksimal flüoresansın 2-3%-i altında saxlayır (58, 60, 72). Xüsusilə SYBR ® Green I-də səkkiz miqyaslı (102-109 RNT başlanğıc molekulları) üzərində yüksək xətti (korrelyasiya əmsalı r = 0.99) ilə həssas transkript kəmiyyət təyini əldə edilə bilər (şəkil 12 B). Bunun əksinə olaraq, 72°C-də şərti təyinetmə yalnız dörd böyüklük sırası (105-109 RNT başlanğıc molekulu, şəkil 12 A) üzərində kəsilmiş kəmiyyət diapazonu (r = 0.99) ilə nəticələnir.


    Real vaxtda PCR gücləndirmə səmərəliliyi

    Şəkil 13: Tənliyə uyğun olaraq kalibrləmə əyrisinin yamaclarından real vaxtda PCR effektivliyinin təyini (metod A): E = 10 [𔂿/slope] (5, 53, 65) “referans gen” glutatyon transferaz (Gst) və iki "hədəf gen": triptofan operon (TyrA) və aspartat transkarbamilaza (PyrB) (99). Yamacın hesablanması üçün cDNA (əks transkripsiya edilmiş ümumi RNT) konsentrasiyasına (log miqyasına) qarşı CP dövrləri planlaşdırılmışdır (ortalama ± SD n = 3).


    İfadə nəticələrinin normallaşdırılması

    Burada mərkəzi suallar yaranır: “Eksperimental müalicə və tədqiq olunan toxuma üçün uyğun istinad geni nədir?” (3, 42, 133).

    jvdesomp/genorm/). Microsoft Excel üçün GeNorm VBA tətbiqi verilmiş cDNA nümunə panelində 10 sınaqdan keçmiş gen dəstindən ən stabil təmizlik genlərini müəyyən edir və istifadəçi tərəfindən müəyyən edilmiş ev təsərrüfatlarının sayının həndəsi ortasına əsaslanaraq hər bir toxuma nümunəsi üçün gen ifadəsinin normallaşma faktorunu hesablayır. genlər. GeNorm-da istifadə edilən normallaşdırma strategiyası kiçik ifadə fərqlərinin bioloji uyğunluğunun öyrənilməsi imkanını açan dəqiq kinetik RT-PCR ifadə profilinin yaradılması üçün ilkin şərtdir (40).


    Real vaxtda PCR məlumatların emalı


    Kəmiyyətləşdirmə prosedurunun avtomatlaşdırılması

    Buna baxmayaraq, real vaxt rejimində RT-PCR və REST-in uğurlu tətbiqi praktiki problemlərin aydın şəkildə başa düşülməsindən asılıdır. Buna görə də, mRNT transkriptlərinin dəqiq və tam kəmiyyət ölçülməsi üçün fərdi real vaxt rejimində RT-PCR analizinin ardıcıl eksperimental dizaynı, tətbiqi və təsdiqi vacib olaraq qalır (http://www.wzw.tum.de/gene-quantification/rest.html ).


    Statistik müqayisə

    Yalnız iki pulsuz mövcud proqram paketi ifadə nəticələrinin statistik təhlilini dəstəkləyir: Q-Gene (102) və REST (100). Q-Gene Statistika Əlavəsi tez-tez istifadə olunan parametrik və qeyri-parametrik statistik testlərin sürətli və menyu ilə idarə olunması üçün bir neçə VBA proqramlarının toplusudur. İstənilən iki qrup ifadə dəyərləri arasındakı əhəmiyyət səviyyəsi fərqini qiymətləndirmək üçün qoşalaşmış və ya qoşalaşdırılmamış Tələbə testi, Mann-Whitney U-testi və ya Wilcoxon imzalı dərəcə testi (137) yerinə yetirmək mümkündür. Bundan əlavə, Pearson korrelyasiya təhlili iki uyğunlaşdırılmış ifadə dəyəri qrupu arasında tətbiq oluna bilər. Bundan əlavə, bütün statistik proqramlar təhlil edilən hər iki qrupun orta dəyərlərini və onların faiz fərqini hesablayır.

    Texniki yardıma görə D. Tetzlaff və A. Zaksenhauzerə və yaxşı iş mühitinə görə bütün digər laboratoriya üzvlərinə təşəkkür etmək istərdim.

    1. Orlando, C., Pinzani, P. və Pazzagli, M., Kəmiyyət PCR-də inkişaflar, Clin. Kimya. Laboratoriya Med., 36: 255-269, 1998.

    2. Lockey, C., Otto E. və Long, Z., Tək bir DNT molekulunun real vaxtda flüoresan aşkarlanması. Biotechniques, 24: 744-746, 1998.

    3. Bustin, S.A., Real-vaxt tərs transkripsiya polimeraza zəncirvari reaksiya analizlərindən istifadə edərək mRNT-nin mütləq kəmiyyətinin müəyyən edilməsi. J Mol Endocrinol., 25: 169-193, 2000.

    5. Bustin, S.A., Dorudi S., Molekulyar diaqnostikada kəmiyyət gen profilinin yaradılması üçün mikroarray üsullarının dəyəri. Trendlər Mol Med 8(6): 269-272, 2002.

    6. Harrington, C.A., Rosenow, C. və Retief, J., DNT mikroarraylarından istifadə edərək gen ifadəsinin monitorinqi. Curr Opin Microbiol. 3(3), 285-291, 2000.

    7. Schena, M., Shalon, D., Davis, R.W. və Brown, P.O., tamamlayıcı DNT mikroarray ilə gen ifadə nümunələrinin kəmiyyət monitorinqi. Elm. 270(5235), 368-371, 1995-ci il.

    8. DeRisi, J.L və Iyer, V.R., (1999) Genomika və massiv texnologiyası. Curr Opin Oncol. 11(1), 76-79.

    9. DeRisi, J.L., Iyer, V.R. və Brown P.O., Gen ifadəsinin metabolik və genetik nəzarətinin genomik miqyasda araşdırılması. Elm. 278(5338), 680-686, 1997-ci il.

    11. Pfaffl, MW Schwarz, F. və Sauerwein, H., İnsulin kimi böyümə faktoru-1 (IGF-1) mRNT-nin miqdarı: Qidalanma yolu ilə böyümə intensivliyinin modulyasiyası IGF-nin toxumalararası və toxumadaxili spesifik fərqlərinə səbəb olur. Sükanlarda -1 mRNT ifadəsi. Eksperimental və Klinik Endokrinologiya və Diabet 106(6): 513-520, 1998.

    14. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. və Watson, R., Kinetik PCR analizi: DNT gücləndirmə reaksiyalarının real vaxt rejimində monitorinqi. Biotexnologiya, 11(9): 1026-1030, 1993.

    15. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K.J. və Williams, P.M., Real time kəmiyyət PCR, Genome Res., 6: 986-993, 1996.

    16. Gibson, U.E., Heid, C.A,. Və Williams, P.M., Real vaxt kəmiyyət RT-PCR üçün yeni bir üsul. Genom Res, 6: 1095-1001, 1996.

    17. Mackay, I. M., Arden, K. E. və Nitsche, A., Real-time PCR in virology, Nucleic Acids Res., 30: 1292-1305, 2002.

    18. Wittwer, C.T. və Garling, D.J., Rapid cycle DNT amplification: Time and temperatur optimallaşdırılması. Biotexnika, 10: 76-83, 1991.

    19. Freeman, W.M., Walker, S.J. və Vrana, K,E., Kəmiyyət RT-PCR: tələlər və potensial. Biotechniques., 26(1): 112-125, 1999.

    20. Winer, J., Jung, C.K., Shacke, l I., and Williams, P.M., In vitro ürək miyositlərində gen ifadəsinin monitorinqi üçün real vaxt kəmiyyətli əks transkriptaza-polimeraza zəncirvari reaksiyasının inkişafı və təsdiqi. Anal Biochem., 270(1): 41-49, 1999.

    21. Rajeevan, M.S., Ranamukhaarachchi, D.G., Vernon, S.D., and Unger, E.R., cDNA massivi və diferensial ekran PCR texnologiyalarının nəticələrini təsdiqləmək üçün real vaxt kəmiyyət PCR-dən istifadə. Metodlar. 25(4), 443-451, 2001.

    22. Rajeevan, M,S,, Vernon, S,D,, Taysavang, N, and Unger, E,R, Real-time (kinetik) RT-PCR ilə massiv əsaslı gen ifadə profillərinin təsdiqi. J Mol Diaqn. 3(1), 36-31, 2001.

    23. Steuerwald, N., Cohen, J., Herrera, R.J., and Brenner C.A., real-vaxt sürətli sikl flüoresansı ilə monitorinq edilən RT-PCR ilə tək oositlərdə və embrionlarda gen ifadəsinin təhlili. Mol Hum Reprod., 5: 1034-1039, 1999.

    24. Schmittgen, T.D., Zakrajsek, B.A., Mills, A.G., Gorn, V., Singer, M.J. və Reed, M.W., mRNA çürüməsini öyrənmək üçün kəmiyyət tərs transkripsiya-polimeraza zəncirvari reaksiya: son nöqtə və real vaxt metodlarının müqayisəsi. Anal Biochem., 285(2): 194-204, 2000.

    25. Swift, G.H., Peyton, M.J. və macDonald, R.J., Uzun yerdə olan mRNT-nin çoxsaylı bölgələrinin yarı kəmiyyətli RT-PCR ilə RNT keyfiyyətinin qiymətləndirilməsi. Biotexnika., 28(3): 524-531, 2000.

    26. Mannhalter, C., Koizar, D. və Mitterbauer, G., RNT təcrid üsullarının və nadir hədəf RNT-nin RT-PCR analizləri üçün istinad genlərinin qiymətləndirilməsi. Clin Chem Lab Med, 38: 171-177, 2000.

    27. Freeman, T.C., Lee, K. və Richardson, P.J., Tək hüceyrələrdə gen ifadəsinin təhlili. Curr Opin Biotechnol., 10(6): 579-582, 1999.

    28. Dixon, A.K., Richardson, P.J., Pinnock, R.D. və Lee, K., tək hüceyrə səviyyəsində gen ifadə analizi. Trends Pharmacol Sci., 21(2): 65-70, 2000.

    31. Moss, M. və Gallwitz, D., Biri sadə təkrarlanan ardıcıllığın yanında yerləşən iki insan beta-aktinlə əlaqəli işlənmiş genlərin strukturu. EMBO, 2: 757�, 1983.

    32. Mutimer, H., Deacon, N., Crowe, S. və Sonza, S., RT-PCR-də işlənmiş psevdogenlərin tələləri. Biotechniques., 24(4): 585-588, 1998.

    33. Neumaier, M., Gerhard, M. və Wagener, C., toxuma spesifik genlərin gücləndirilməsi ilə mikrometastazların diaqnozu. Gene., 159(1): 43-47, 1995.

    34. Tschentscher, P., Wagener, C. və Neumaier, M., Həssas və spesifik sitokeratin 18 əks transkripsiya-polimeraza zəncirvari reaksiya, emal edilmiş psevdogenlərin gücləndirilməsini genomik DNT-nin çirklənməsindən istisna edir. Clin Chem., 43(12): 2244-2250, 1997.

    35. Dirnhofer, S., Berger, C., Untergasser, G., Geley, S. və Berger, P., İnsan beta-aktin retro pseudogenes RT-PCR ilə müdaxilə edir. Trends Genet., 11(10): 380-381, 1995.

    36. Ercolani, L., Florence, B., Denaro, M. və Alexander, M., Təcrid və funksional insan qliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz geninin tam ardıcıllığı. J Biol Chem., 263(30): 15335-15341, 1988.

    37. Garcia-Meunier, P., Etien-Julan, M., Fort, P., Piechaczyk, M. və Bonhomme, F., GAPDH ailəsində retrotransposed pseudogenes ilə əlaqəli təkamül. Mamm Genome., 4(12): 695-703, 1993.

    38. Watzinger, F. və Lion, T., RT-PCR analizlərində şablon RNT/cDNA-nın keyfiyyətinə nəzarət üçün Multipleks PCR. Leykemiya, 12: 1983�, 1998.

    39. Burkardt, H.J., PCR analizlərinin standartlaşdırılması və keyfiyyətinə nəzarət. Clin Chem Lab Med., 38(2): 87-91, 2000.

    40. Vandesompele, J., De Preter, K., Pattyn, F., Poppe, B., Van Roy, N., De Paepe, A. və Speleman, F., Real-time kəmiyyət RT-nin dəqiq normallaşdırılması Çoxlu daxili nəzarət genlərinin həndəsi ortalaması ilə PCR məlumatları. Genom Biologiyası, 3(7): 0034.1-0034.11, 2002.

    41. Bustin, S.A., Real vaxt rejimində RT-PCR istifadə edərək mRNA-nın mənalı kəmiyyəti. (təqdim edilmişdir), 2002.

    42. Bustin, S.A., Real vaxt rejimində RT-PCR istifadə edərək mRNA-nın miqdarı. Trendlər və problemlər. J Mol Endocrinol, 29(1): 23-39, 2002.

    43. Glasel, J.A., 260nm/280nm absorbans nisbətləri ilə nəzarət edilən nuklein turşusu təmizliklərinin etibarlılığı. Biotechniques., 18(1): 62-63, 1994.

    44. Wong, L., Pearson, H., Fletcher, A., Marquis, CP, and Mahler, S., Efficiency of Moloney Murine Leukemia Virus (M-mulv) Reverse Transscriptase, rnase H--M- mulv Əks Transkriptaza və İnsan İmmunoqlobulin Genlərinin Gücləndirilməsi üçün Quş Miyeloblastoma Leykemiya Virusu (AMV) Əks Transkriptaza. Biotexnologiya Texnikaları, 12(6): 485-489, 1998.

    45. Fuchs, B,. Zhang, K., Rock, M.G., Bolander, M.E. və Sarkar, G., AMV əks transkriptaza ilə yüksək temperaturda cDNT sintezi PCR-in spesifikliyini yaxşılaşdırır. Mol Biotechnol., 12(3): 237-240, 1999.

    46. ​​Fuchs, B., Zhang, K., Rock, M.G., Bolander, M.E., and Sarkar, G., Repeat cDNA sintezi və RNT-nin eyni mənbəyi ilə RT-PCR. Mol Biotechnol., 12(3): 231-235, 1999.

    47. Schwabe, H., Stein, U., and Walther W., Gen ifadə analizləri üçün minimal ümumi RNT kəmiyyətlərinin yüksək surətli cDNA gücləndirilməsi. Mol Biotechnol., 14(2): 165-172, 2000.

    48. Hayward, A.L., Oefner, P.J., Sabatini, S., Kainer, D.B., Hinojos, C.A. və Doris, P.A., Rəqabətli RT-PCR-nin modelləşdirilməsi və təhlili. Nuklein turşuları Res., 26(11): 2511-2518, 1998.

    49. Freeman, W.M., Vrana, S.L. və Vrana, K.E., RT-PCR-də yüksəlmiş əks transkripsiya reaksiya temperaturlarının istifadəsi. Biotexnika., 20(5): 782-783, 1996.

    50. Raja, S., Luketich, J.D., Kelly, L.A., Ruff, D.W. və Godfrey, T.E., bir boru, kəmiyyət RT-PCR həssaslığının artması. Biotexnika, 29: 702-708, 2000.

    51. Sugita, M., Haney, J.L., Gemmill, R.M. və Franklin, W.A., RNT deqradasiyasının kəmiyyət qiymətləndirilməsi üçün bir addımlı dupleks tərs transkripsiya-polimeraza zəncirvari reaksiya. Analitik Biokimya, 295: 113-116, 2001.

    52. Marten, N.W., Burke, E.J., Hayden, J.M. və Straus, D.S., Siçovulların hepatoma hüceyrələrində 19 genin ifadəsinə amin turşusu məhdudiyyətinin təsiri. FASEB J, 8: 538-544, 1994.

    53. Foss, D.L., Baarsch, M.J. və Murtaugh, M.P., Donuz immun hüceyrələrində və toxumalarında hipoksantin fosforibosil transferaz, qliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz və beta-aktin mRNA ifadəsinin tənzimlənməsi. Anim Biotechnol., 9: 67-78, 1998.

    54. Thellin, O., Zorzi, W., Lakaye, B., De Borman, B., Coumans, B., Hennen, G., Grisar, T., Igout, A., and Heinen, E., Housekeeping genlər daxili standartlar kimi: istifadə və məhdudiyyətlər. J Biotechnol., 75: 291-295, 1999.

    55. Qoidin, D., Mamessier, A., Staquet, MJ, Schmitt, D. və Berthier-Vergnes, O., Ribosomal 18S RNT kəmiyyət üçün daxili standart olaraq qliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz və beta-aktin genlərindən üstündür. invaziv və qeyri-invaziv insan melanoma hüceyrə subpopulyasiyalarında mRNT səviyyələrinin müqayisəsi. Anal Biochem., 295(1): 17-21, 2001.

    56. Şmittgen, T.D. və Zakrajsek, B.A. Eksperimental müalicənin ev təsərrüfatı geninin ifadəsinə təsiri: real vaxt, kəmiyyət RT-PCR ilə qiymətləndirmə. J Biochem Biophys Methods., 46(1-2): 69-81, 2000.

    57. Cha, R.S., Thilly, W.G., Specificity, efficiency, and fidelity of PCR. PCR Methods Appl. 3(3): 18-29, 1993.

    58. Kainz, P., The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations. Biochim Biophys Acta., 1494: 23-27, 2000.

    61. Wittwer, C.T., Ririe, K.M., Andrew, R.V., David, D.A., Gundry, R.A., and Balis U.J., The LightCycler: a microvolume multi sample fluorimeter with rapid temperature control. Biotechniques, 22: 176-181, 1997.

    62. Rasmussen, R., Quantification on the LightCycler. In: Meuer, S, Wittwer, C, and Nakagawara, K, eds. Rapid Cycle Real-time PCR, Methods and Applications Springer Press, Heidelberg ISBN 3-540-66736-9, 21-34, 2001.

    63. Tichopad, A., Didier, A., and Pfaffl, M.W., Tissue-specific influence on real-time RT-PCR amplification kinetics. Molecular and Cellular Probes (in press - 2003)

    65. Foy, C.A., and Parkes, H.C., Emerging Homogeneous DNA-based Technologies in the Clinical Laboratory. Clinical Chemistry., 47: 990-1000, 2001.

    66. Ginzinger, D.G., Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream. Exp Hematol., 30(6): 503-512, 2002.

    70. Reischl, U., and Kochanowski, B., Quantitative PCR. A survey of the present technology. Mol Biotechnol., 3(1): 55-71, 1995.

    71. Ferre, F., Quantitative or semi-quantitative PCR: reality versus myth. PCR Methods Appl., 2(1): 1-9, 1992.

    73. Morrison, T.B., Weis, J.J., and Wittwer, C.T., Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques., 24(6): 954-962, 1998.

    74. Wittwer, C.T., Herrmann, M.G., Gundry, C.N., and Elenitoba-Johnson, K.S., Real-time multiplex PCR assays. Methods., 25(4): 430-42, 2001.

    75. Holland, P.M., Abramson, R.D., Watson, R., and Gelfand, D.H., Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A, 88(16): 7276-7280, 1991.

    76. Livak, K.J., ABI Prism 7700 Sequence detection System User Bulletin #2 Relative quantification of gene expression 1997 & 2001. h ttp://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf

    77. Förster, V.T., Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluorescence. Annals of Physics, Leipzig, 1948.

    78. Lakowicz, J.R., Energy transfer. In: Principles of Fluorescent Spectroscopy, New York: Plenum Press, pp. 303-339, 1983.

    79. Nitsche, A., Steuer, N., Schmidt, C.A., Landt, O., and Siegert, W., Different real-time PCR formats compared for the quantitative detection of human cytomegalovirus DNA. Clin Chem., 45(11): 1932-1937, 1999.

    81. LightCycler Software ®, Version 3.5 Roche Molecular Biochemicals, 2001.

    82. LightCycler Relative Quantification Software ®, Version 1.0, Roche Molecular Biochemicals, 2001.

    84. Fronhoffs, S., Totzke, G., Stier, S., Wernert, N., Rothe, M., Bruning, T., Koch, B., Sachinidis, A., Vetter, H., and Ko, Y., A method for the rapid construction of cRNA standard curves in quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Mol Cell Probes., 16(2): 99-110, 2002.

    85. Zimmermann, K., and Mannhalter, JW., Technical aspects of quantitative competitive PCR. Biotechniques., 21(2): 268-279, 1996.

    86. Souaze, F., Ntodou-Thome, A., Tran, C.Y., Rostene, W., and Forgez, P., Quantitative RT-PCR: limits and accuracy. Biotechniques., 21(2): 280-285, 1996.

    90. Livak, K.J., and Schmittgen, T.D., Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^[-delta delta C(T)] Method. Methods., 25(4): 402-408, 2001.

    91. Gentle, A., Anastasopoulos, F., and Mc Brien, N.A., High-resolution semi-quantitative real-time PCR without the use of a standard curve. Biotechniques., 31(3): 502-508, 2001.

    92. Rosenfeld, C.S., Yuan, X., Manikkam, M., Calder, M.D., Garverick, H.A. and Lubahn, D.B., Cloning, sequencing, and localization of bovine estrogen receptor-beta within the ovarian follicle. Biol Reprod. 60, 691-697, 1999.

    93. Walther, N., Lioutas, C., Tillmann, G., and Ivell, R., Cloning of bovine estrogen receptor beta (ER-beta): expression of novel deleted isoforms in reproductive tissues. Mol Cell Endocrinol. 152, 37-45, 1999.

    94. Hileman, S.M., Handa, R.J. and Jackson, G.L., Distribution of estrogen receptor-beta messenger ribonucleic acid in the male sheep hypothalamus. Biol Reprod. 60, 1279-1284, 1999.

    95. Scott, C.J., Pereira, A.M., Rawson, J.A., Simmons, D.M., Rossmanith, W.G., Ing, N.H., Clarke, I.J., The distribution of progesterone receptor immunoreactivity and mRNA in the preoptic area and hypothalamus of the ewe: up-regulation of progesterone receptor mRNA in the mediobasal hypothalamus by oestrogen. J Neuroendocrinol. 12: 565-575, 2000.

    96. Schütz, G., Tenth Adolf Butenandt lecture. Control of gene expression by steroid hormones. Biol Chem. 369, 77-86, 1988.

    97. Jungblut, P.W., Gaues, J., Hughes, A., Kallweit, E., Sierralta, W., Szendro, P., and Wagner, R.K., Activation of transcription-regulating proteins by steroids. J Steroid Biochem. 7, 1109-1116, 1976.

    98. Meijerink, J., Mandigers, C., van de Locht, L., Tonnissen, E., Goodsaid, F., and Raemaekers, J., A novel method to compensate for different amplification efficiencies between patient DNA samples in quantitative real-time PCR. J Mol Diagn., 3(2): 55-61, 2001.

    101. oong, R., Ruschoff, J., and Tabiti, K., Detection of colorectal micrometastasis by quantitative RT-PCR of cytokeratin 20 mRNA. Roche Molecular Biochemicals internal Publication, 2000.

    102. Muller, P.Y., Janovjak, H., Miserez, A.R., and Dobbie, Z., Processing of gene expression data generated by quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques, 32(6): 1372-1378, 2002.

    103. Bhatia, P., Taylor, W.R., Greenberg, A.H., and Wright, J.A., Comparison of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and 28S-ribosomal RNA gene expression as RNA loading controls for northern blot analysis of cell lines of varying malignant potential. Anal Biochem., 216: 223-226, 1994.

    104. Bereta, J., and Bereta, M., Stimulation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase mRNA levels by endogenous nitric oxide in cytokine-activated endothelium. Biochem Biophys Res Commun. 217: 363-369, 1995.

    105. Chang, T.J., Juan, C.C., Yin, P.H., Chi, C.W., and Tsay, H.J., Up-regulation of beta-actin, cyclophilin and GAPDH in N1S1 rat hepatoma. Oncol Rep., 5: 469-471, 1998.

    106. Zhang, J., and Snyder, S.H., Nitric oxide stimulates auto-ADP-ribosylation of glyceraldehydes 3 phosphate dehydrogenase. PNAS, 89: 9382-9385, 1992.

    108. Silva, J.J.R., Williams, R.J.P., (eds) The biological Chemistry of the elements: The inorganic chemistry of life. Clarendon Press, Oxford, 1991.

    109. Oestreicher, P., Cousins, R.J., Zinc uptake by basolateral membrane vesicles from rat small intestine. J Nutr. 119: 639-646, 1989.

    110. Reyes, J.G., Zinc transport in mammalian cells. Am J Physiol 270, C401-410, 1996.

    111. Cousins, R.J., Zinc. In: Present knowledge in nutrition, Seventh edition (Filer LJ & Ziegler EE, eds), Internat. Həyat Elmi. Inst. Nutr. Foundation, Washington DC., 263-306, 1996.

    112. acnet, F., Watkins, D.W., Ripoche, P., Studies of zinc transport into brush-border membrane vesicles isolated from pig small intestine. Biochim Biophys Acta. 1024: 323-330, 1990.

    113. Brady, F.O., The physiological function of Metallothionein. Trendlər Biochem. Sci. 7: 143-145, 1982.

    116. Das, S., Mohapatra, S.C., and Hsu, J.C., Studies on primer-dimer formation in polymerase chain reaction (PCR). Biotechnology Techniques, 13(10): 643-646, 1999.

    117. Ririe, K.M., Rasmussen, R.P., and Wittwer, C.T., Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem., 245(2): 154-160, 1997.

    119. Vandesompele, J., De Paepe, A., and Speleman, F., Elimination of Primer-Dimer Artifacts and Genomic Coamplification Using a Two-Step SYBR Green I Real-Time RT-PCR. Anal Biochem., 303(1): 95-98, 2002.

    120. Brownie, J., Shawcross, S., Theaker, J., Whitcombe, D., Ferrie, R., Newton, C., and Little, S., The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res., 25(16): 3235-3241, 1997.

    121. Sturzenbaum, S.R., Transfer RNA reduces the formation of primer artifacts during quantitative PCR. Biotechniques., 27(1): 50-52, 1999.

    122. How to Reduce Primer Dimers in a LightCycler PCR, Roche Diagnostics Technical Note No. 1, 1999.

    123. Peccoud, J., and Jacob, C., Theoretical uncertainty of measurements using quantitative polymerase chain reaction. Biophys J., 71(1): 101-108, 1996.

    124. Liu, W., and Saint, D.A., Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics. Biochem Biophys Res Commun., 294(2): 347-353, 2002.

    125. Liu, W., and Saint, D.A., A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics. Anal Biochem., 302(1): 52-59, 2002.

    126. Raeymaekers, L., Basic principles of quantitative PCR. Mol Biotechnol., 15(2): 115-122, 2000.

    127. Chelly, J., Kaplan, J.C., Maire, P., Gautron, S., and Kahn, A., Transcription of the dystrophin gene in human muscle and non-muscle tissue. Nature., 333(6176): 858-860, 1988.

    128. Schnell, S., and Mendoza, C., Theoretical description of the polymerase chain reaction. J Theor Biol., 188(3): 313-318, 1997.

    129. Jung, R., Soondrum, K., Neumaier, M., Quantitative PCR. Clin Chem Lab Med., 38(9): 833-836, 2000.

    130. Karge, W.H., Schaefer, E.J., and Ordovas J.M., Quantification of mRNA by polymerase chain reaction (PCR) using an internal standard and a non-radioactive detection method. Methods Mol Biol, 110: 43-61, 1998.

    131. Zhong, H., and Simons, J.W., Direct comparison of GAPDH, beta-actin, cyclophilin, and 28S rRNA as internal standards for quantifying RNA levels under hypoxia. Biochem Biophys Res Commun., 259(3): 523-526, 1999.

    132. Solanas, M., Moral, R., and Escrich, E., Unsuitability of using ribosomal RNA as loading control for Northern blot analyses related to the imbalance between messenger and ribosomal RNA content in rat mammary tumors. Anal Biochem., 288(1): 99-102, 2001.

    133. Haberhausen, G., Pinsl, J., Kuhn, C.C., and Markert-Hahn C., Comparative study of different standardization concepts in quantitative competitive reverse transcription-PCR assays. J Clin Microbiol, 3: 628-633, 1988.

    134. Zhu G, Chang Y, Zuo J, Dong X, Zhang M, Hu G, and Fang F., Fudenine, a C-terminal truncated rat homologue of mouse prominin, is blood glucose-regulated and can up-regulate the expression of GAPDH. Biochem Biophys Res Commun., 281(4): 951-956, 2001.

    135. eist, M., Pfaffl, M.W., Steiner, A., and Blum, JW, Quantitative mRNA analysis of bovine 5-HT receptor subtypes in brain, abomasum, and intestine by real-time PCR. Journal of Receptors and Signal Transduction 23(4): 271-287

    137. Sheskin, D., Handbook of Parametric & Nonparametric Statistical Procedures. CRC Press LLC, Boca Raton, FL, 2000.

    138. Manly, B., Randomization, Bootstrap and Monte Carlo Methods in Biology. Chapman & Hall, 1997.


    2 Answers 2

    Question 1) Is this a good idea in general?

    Solving this problem as a supervised learning regression problem is a fantastic idea and is the type of solution that will greatly benefit your company since it will translate to other similar and dissimilar problems much more easily than deterministic methods.

    However using a neural network to solve this supervised learning regression problem is probably a very bad idea. Neural networks can add great value to certain problems, are among the very best algorithms for complex problems where computing power is not an issue, and have fascinating implications for the future of machine learning and artificial intelligence. Amma. they can be very tricky to train, require a lot of computing power, require a lot of data, and perform poorly in many cases.

    I suggest you scope the problem using linear regression and then try a support vector regressor (SVM, SVR) or naive Bayes regressor. The analogue methods in SVR work very well with limited data and provide surprisingly accurate results.

    Question 2) If yes, what type of NN would be most suited for such a problem?

    If you must use a neural network then try playing with the problem. Start with a feed forward neural network. Note that it will likely underperform an SVR. Then think about moving toward a convolution neural network. Again, this is probably a very bad way to go. Try linear regression followed by other methods first.

    Moving forward

    The documentation for either Scikit-Learn in python, H20 in Java, or Weka provide very shallow learning curves to jump on the merry-go-round and take a spin or two. Please make sure that you thoroughly understand cross validation and scoring metrics as this is essential to continued, adequate progress.


    Products

    Hot Start PCR is a technique that inhibits Hot Start Taq polymerase activity or the incorporation of modified dNTPs during reaction set up until a heat activation step occurs. Hot Start PCR allows for reaction set up at room temperature without non-specific amplification and primer dimer formation. Discover our wide selection of Hot Start PCR enzymes including KOD, FastStart™, JumpStart™, and KAPA Biosystems reagents. Additionally, our Extract-N-AMP™ PCR kits integrate DNA extraction and amplification using a hot start PCR ReadyMix™ reagent and are suitable for blood, tissue, and plant samples. For additional information on Hot Start PCR reagents and product information, please navigate the product selection table to meet your Hot Start PCR needs.


    Mücərrəd

    Parthenogenetic activation of the mammalian oocyte constitutes an essential step to a number of oocyte- or embryo-related technologies. Mammalian parthenotes are useful tools for studying the roles of paternal and maternal genomes in early mammalian development and are considered potential candidates for an ethical source of embryonic stem cells.

    We investigated the in vitro developmental competence of pre-implantation ovine embryos derived from in vitro fertilization (IVF) and parthenogenetic activation (PA) together with the expression of a panel of fourteen genes at different times of development. IVF and PA embryos showed similar developmental competence. No differences in gene expression were observed between PA and IVF two cell-stage embryos, while PA morulae showed a significantly higher expression of IGF2. At the blastocyst stage, parthenotes exhibited up-regulation of TP-1, CDC2, və IGF2 transcripts and significantly lower levels of AQP3, ATP1A1, H2A.Z, hsp90beta, və OCT4, while NANOG, BAX, CCNB1, CDH1, GAPDH, və IGF2R displayed similar expression patterns in the two groups.

    Our study indicates that oocyte parthenogenetic activation does not impair in vitro pre-implantation development to the blastocyst stage, but affects the gene expression status of the embryo after the activation of its own genome.


    Videoya baxın: What is RT-PCR Test for Covid-19. What is CT Value in RT PCR Test. CT Value vs Severity. Covid-19 (Avqust 2022).