Məlumat

Gözlənilməz ligasyon məhsullarının ümumi səbəbləri hansılardır?

Gözlənilməz ligasyon məhsullarının ümumi səbəbləri hansılardır?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən biri EcoRI və AgeI, digəri isə EcoRI və XmaI ilə iki plazmid həzm etdim. Həzmlər gözlənildiyi kimi göründü, ona görə də mən müvafiq fraqmentləri təmizlədim və T4 DNT liqasiyasını qurdum (AgeI və XmaI saytları uyğun gəlir).

Yaranan kulturaların 12-dən E.coli transformasiyasından, kulturundan və miniprepindən sonra düzgün məhsula malik olduğumu təsdiqləmək üçün minipreplərdən təcrid olunmuş izolatı BclI ilə həzm etdim (çünki əlavədə bir BclI sahəsi, digəri isə 1,4kb məsafədə idi. onurğa sütunu). Bu həzmin nəticələri açıq şəkildə göstərir ki, iki müxtəlif bağlama məhsulu var: dörd zolaq bir bantlama nümunəsini, digər səkkiz isə ondan fərqli bir nümunəni bölüşür.

Mən hər iki plazmiddə istifadə edilən fermentlərin digər məhdudlaşdırıcı yerləri üçün yoxladım, lakin əvvəllər nəzərdən qaçırdığım, lakin heç birini tapmadım. EcoRI və XmaI/AgeI yerləri kökündən fərqli olduğundan (AATT vs. CCGG), mən əlavənin tərs oriyentasiyada bağlanma ehtimalını istisna edərdim.

Gözlənilməz məhdudlaşdırma yerləri və əks ligasiyadan başqa gözlənilməz ligasiya variantlarının ümumi səbəbləri varmı?


Daxil polimerləşmə ola bilər. Əgər sizdə belə bir DNT uzantısı varsa:

(5')-AATTagctagcatcgtgatcgacg-(3') ||||||||||||||||||| (3')-tcgatcgtagcactagcagcGGCC-(5')

Və siz onu götürün, çevirin, o, öz-özünə bağlanacaq, belə ki:

(5')-AATTagctagcatcgtgatcgacg-(3')(5')-CCGGcgacgatcacgatgctagct-(3') ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| (3')-tcgatcgtagcactagcagcGGCC-(5')(3')-gctgctagtgctacgatcgaTTAA-(5')

Bunu yoxlamaq kifayət qədər asandır. Sadəcə iki əlavə ilə vektordan gözlədiyiniz ölçü fraqmentlərini hesablayın (indi əlavə BcII kəsimi olacaq və əlavə fraqment, ehtimal ki, əlavənin ölçüsü olacaq). Əgər bu, sadəcə olaraq maraqdan irəli gəlirsə və əşyalarınızdan biri düzgün ölçüdədirsə, işləməyənlərə məhəl qoymuram və sizinlə davam edərdim.

Əgər bununla bağlı probleminiz varsa və ya bütün klonlarınızın polimerləşməsini əldə edirsinizsə, insertinizi qələvi fosfataza ilə müalicə edə bilərsiniz. Bu, ligazanın (3') hidroksil üzərində yapışması üçün lazım olan (5') fosfatı yeyəcək. Nəticə odur ki, əlavə digər əlavəyə bağlana bilməz, lakin vektor tapdıqdan sonra o, bağlana biləcək:

daxil etmək üçün daxil edin: AATTagctagcatcgtgatcgacg-(3') :( CCGGcgacgatcacgatgctagct-(3') |||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| (3')-tcgatcgtagcactagcagcGGCC :( (3')-gctgctagtgctacgatcgaTTAA vektora daxil edin:… ctagct-(3') AATTagctagcatcgtgatcgacg-(3')(5')|c…gG | |||||| ||||||||||||||||||||||||||||… gatcgaTTAA-(5')(3')-tcgatcgtagcactagcagcGGCC (3) ')-gctgc...

Yuxarı solda və aşağı sağda nicklər olacaq, lakin onu daxil etdiyiniz səhv onları sizin üçün təmizləməlidir. Qələvi fosfatazanı bir çox yerdən olduqca ucuz qiymətə əldə edə bilərsiniz, NEB həmişə etibarlı bir bahisdir.


İkinci araşdırma göstərdi ki, sözügedən bağlama məhsulu həqiqətən vektor olub, bağlayıcı əlavə olmadan!

Vektor həmçinin XmaI saytına yaxın bir BamHI saytını ehtiva edirdi, ona görə də EcoRI və BamHI ilə sonrakı həzmdə mən ilk növbədə birləşdirdiyim eyni lent ölçülərini görməyi gözləyirdim.

Bütün koloniyalarda uzun (vektor) zolağı yaradan plazmidlər və əvvəlki kimi eyni səkkiz daha qısa (insert) bandı əmələ gətirdi. Ancaq əvvəlki təcrübədə anormal olan dördün bu dəfə daha qısa bandı yox idi.

Bu o deməkdir ki, iki zolaqlı səkkiz koloniyada istənilən bağlama məhsulu var, digər dörd koloniyada isə bir yerdə məhdudlaşdırılmış plazmid var idi (həzm olunmasa, nəzarət kimi üç zolaq meydana gətirərdi).

BamHI saytı vektorda olduğundan və bütün proses boyu toxunulmamış olduğundan, mən belə qənaətə gəlirəm ki, bu dörddə EcoRI sahəsi yoxdur, ligasiya zamanı bərpa edilməli idi və buna görə də EcoRI saytı və XmaI yeri bağlanmadan bağlanmalı idi. bir şəkildə daxil edin.

Uzun sözün qısası

Bu o deməkdir ki, ya

  • Bir ekzonükleaz vektorun yapışqan uclarını həzm etdi və ya
  • Yapışqan uclar təsadüfən məhv olur

vektorun daxil edilmədən kəskin şəkildə yenidən bağlanması və nəticədə EcoRI sahəsinin itirilməsi ilə nəticələnir.

Hesab edirəm ki, bunlar klonlaşdırma zamanı nəzərə alınmalı olduqca vacib şeylərdir - sonrakı təcrübələrdə məndə mənfi nəzarət lövhələrində böyüyən bir neçə koloniya (yəni heç bir əlavə olmayan nəzarət ligasiyası ilə transformasiya edilmiş koloniyalar) oldu, bunların hamısı çox güman ki, yapışqan itkisi ilə əlaqədar idi. ucları və küt ligasiyalar, nəticədə arzuolunmaz plazmidə malik olmasına baxmayaraq, ampisillinə qarşı müqavimət göstərən funksional plazmidlər yaranır.