Məlumat

DH5alpha və BL21-də pET28a və Protein İfadəsindən istifadə edərək klonlama

DH5alpha və BL21-də pET28a və Protein İfadəsindən istifadə edərək klonlama



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kimsə məni elektron mənbəyə və ya kitaba yönləndirə bilər ki, bu mənim kimi yeni başlayanlara DH5alpha və BL21-də pET28a və Protein İfadəsindən istifadə edərək Klonlaşdırma haqqında dərindən öyrənməyə kömək etsin. TA vektorlarından istifadə edərək klonlaşdırma aparsam da, pET28a mənim üçün çox yenidir. GOI-ni pET28a-ya daxil etmək üçün məhdudiyyət saytları olan primerləri tərtib etməliyəm, ona görə də bu saytları necə seçməyi öyrənmək istərdim.


Bölgə Y: Klonlaşdırma, Optimallaşdırılmış İfadə və Təmizləmə

Cinsiyyəti təyin edən bölgə Y geni (SRY) Y xromosomunda yerləşir və 229 amin turşusu olan bir zülalı kodlayır. Bu tədqiqatda SRY-nin 690 bp uzunluğunda ORF bölgəsi PCR istifadə edərək sintez edilmiş və pET28a (+) ilə bağlanmış, sonra E.coli DH5α-da transformasiya edilmişdir. E.coli BL21 (DE3) ştammı rekombinant iribuynuzlu SRY proteinini ifadə etmək üçün seçilmişdir. İnduksiyadan sonra fərqli inkubasiya müddətlərində müxtəlif IPTG konsentrasiyaları, qlükoza və temperatur daxil olmaqla bir sıra optimallaşdırma addımları atıldı. Nəticələr göstərdi ki, temperatur nöqtələri və IPTG və qlükozanın müxtəlif konsentrasiyaları ümumi zülal və rekombinant iribuynuzlu heyvan SRY-yə əhəmiyyətli təsir göstərmişdir (p < 0.01). Təmizləmədən sonra İPTG-nin müxtəlif temperaturları və konsentrasiyaları ifadə olunmuş rekombinant SRY-nin həllolma qabiliyyətinə mənalı təsir göstərmişdir (p< 0.01). Ən yüksək həll olunan rSRY protein miqdarı, induksiya zamanı 20°C-də 0,5 mM IPTG və 0,5% qlükoza istifadə edildiyi yerdə əldə edilmişdir. Qlükoza olmadıqda, həll olunan rekombinant SRY səviyyələrinin ən yüksək miqdarı 16, 24 və 8-də induksiya zamanı 28°C, 20°C-də 0.8 mM IPTG və 37°C-də 1.5 mM IPTG konsentrasiyalarında əldə edilmişdir. müvafiq olaraq saat. Bu işdə əldə edilən nəticələrə gəlincə, temperaturun və induktorun konsentrasiyasının azalması ilə həll olunan iribuynuzlu heyvan SRY protein ifadəsinin artdığını qeyd etmək olar.

Açar sözlər: Klonlama ifadəsinin təmizlənməsi rekombinant iribuynuzlu SRY zülalının cinsi determinant bölgəsi Y xromosomu.


[E.coli-də insan interleykin-21 cDNA-nın klonlanması və ifadəsi]

Məqsəd: İnsan interleykin-21-in (IL-21) tam uzunluqlu cDNT-sini klonlaşdırmaq və onu E.coli-də ifadə etmək.

Metodlar: Total RNT anti-CD3 antikoru ilə stimullaşdırılan periferik limfositdən təcrid olundu. IL-21 geninin 5' və 3' terminal fraqmentləri (müvafiq olaraq 242 bp və 425 bp fraqmentləri) RT-PCR istifadə edərək gücləndirildi. Tam uzunluqlu IL-21 cDNT RT-PZR məhsullarından rekombinasiya edilmiş PCR ilə gücləndirildi. İfadə plazmidi pET28a(+)-IL21 IL-21 cDNA-nı pET28a(+)-a daxil etməklə quruldu və sonra BL21(DE3)-ə çevrildi. hIL-21-in ifadəsi 5 saat ərzində 37 dərəcə Selsidə IPTG tərəfindən induksiya edilmişdir. Hədəf zülal Ni(2+)-xelatlaşdırıcı Sepharose Fast Flow vasitəsilə təmizləndi. Təmizlənmiş rhIL-21 dializ üsulu ilə yenidən qatlanmışdır. Və bioaktivlik anti-CD3 ilə T hüceyrə proliferasiyasını stimullaşdırmaq üçün MTT tərəfindən aşkar edilmişdir.

Nəticələr: IL-21 klonlaşdırıldı və E.coli-də uğurla ifadə edildi. SDS-PAGE təhlili göstərdi ki, IL-21 həll olunmayan inklüziv cisim şəklində ifadə olunub. Yenidən qatlanmış rhIL-21, anti-CD3 varlığında yetkin insan T-hüceyrələrinin yayılmasını stimullaşdıra bilər.

Nəticə: Onun funksiyasının öyrənilməsinə əsas verən bioaktivliyə malik rhIL-21 əldə edilmişdir.


II. İfadə problemlərinin aradan qaldırılması

Bu bölmədə rekombinant protein istehsalını optimallaşdırmaq üçün müxtəlif strategiyaları təqdim edirik E. coli ifadə maneələri ilə qarşılaşdıqda. Hər bir vəziyyətdə mümkün səbəblər və həll yolları aşağıdakı cədvəllərdə müzakirə olunur.

Maraqlanan zülal həssas bir üsulla (məsələn, Westernblot) aşkar edilə bilmədikdə və ya çox aşağı səviyyədə aşkar edildikdə (kulturanın litri üçün mikroqramdan az), problem çox vaxt heteroloji zülalın zərərli təsirində olur. hüceyrə.

  • Aşağı induksiya temperaturu
  • Zəif mediada böyüyün
  • Daha sərt tənzimləmə ilə promouterlərdən istifadə edin
  • Aşağı plazmid nüsxə nömrəsi
  • T7 əsaslı sistemlərdə pLysS/pLysE daşıyıcı deformasiyalardan istifadə edin
  • Zəhərli zülalların ifadəsi üçün daha yaxşı olan suşlardan istifadə edin (C41 və ya C43)
  • Yüksək OD-də induksiyaya başlayın
  • İnduksiya müddətini qısaltın
  • Tərkibində lak əsaslı promotorlar olan ifadə vektorlarından istifadə edərkən qlükoza əlavə edin
  • Karbon mənbəyi kimi qlükoza ilə müəyyən edilmiş mühitdən istifadə edin

2) Zülalların yığılması

Zülal aqreqatlarının yığılması inklüzyon cisimləri (IBs) kimi tanınır. IB əmələ gəlməsi zülalların yığılması və həll edilməsi arasında balanssız tarazlığın nəticəsidir. Beləliklə, IB meydana gəlməsinə səbəb olan amilləri yaxşılaşdıran strategiyalarla həll olunan rekombinant zülal əldə etmək mümkündür.

  • Tioredoksin, DsbA, DsbC daxil olmaqla füzyon tərəfdaşları əlavə edin
  • Hüceyrə periplazmasına ifraz siqnalı olan vektorda klon
  • Aşağı induktor konsentrasiyası
  • Aşağı induksiya temperaturu
  • Bir həlledici tərəfdaşdan istifadə edin
  • Molekulyar şaperonlarla birgə ifadə edin
  • Medianı kimyəvi şaperonlar və kofaktorlarla əlavə edin
  • İnduktoru çıxarın və təzə media əlavə edin
  • Aşağı induktor konsentrasiyası
  • Aşağı temperatur
  • GST, MBP, SUMO və s. daxil olmaqla birləşmə teqləri əlavə edin.
  • Zülalın kəsilmiş formalarını yaradın
  • Aşağı induksiya temperaturu
  • İnduksiya müddətini qısaltın
  • Zəif mühitdə böyüyün
  • İstilik şoku şaperonları əlavə edin

Bəzən tam bir yabanı zülal deyil, zülalın kəsilmiş forması ifadə edilir. Bu fenomenin səbəbləri və mümkün həll yolları aşağıda verilmişdir.

  • Aşağı induksiya temperaturu
  • Zəif mediada böyüyün
  • Yüksək OD-də induksiya edin
  • Aşağı temperaturda induksiya edin
  • İnduksiya müddətini qısaltın
  • Hüceyrələri qırarkən proteaz inhibitorlarından istifadə edin
  • Başqa bir füzyon proteinini dəyişdirin
  • Fusion proteinini C-terminalına köçürün
  • Aşağı temperaturda induksiya edin
  • İnduksiya müddətini qısaltın
  • Zəif mediaya keçin

Gözəl miqdarda həll olunan protein əldə etmək yolun sonu deyil. Protein hələ də keyfiyyətsiz ola bilər, yəni lazım olan aktivliyə malik deyil.

  • Bir həlledici tərəfdaşdan istifadə edin
  • Molekulyar şaperonlarla birlikdə ifadə edin
  • Disulfid bağının əmələ gəlməsinə nəzarət edin və in vitro daha da qatlanmasına icazə verin
  • Aşağı temperatur

İstinadlar:

Fəkruddin M və b (2012). Rekombinant tərəfindən fermentlərin klonlaşdırılması, ifadəsi və kütləvi istehsalının müvəffəqiyyətinə təsir edən kritik amillər E. coli. ISRN biotexnologiyası, 132013:590587.

Francis DM, Səhifə R (2010). Protein ifadəsini optimallaşdırmaq üçün strategiyalar E. coli. Protein Elmində Mövcud Protokollar, Fəsil 5: Vahid 5.24.1-29.


Mendeley
Zotero
JabRef
Qrammatik

E. Coli BL21-də hGAD65 geninin klonlanması və ifadəsi

https://doi.org/10.22146/ijbiotech.7868

Rista Nikmatu Rohmah (1*) , Soraya Vidyasari (2) , A. Aulanni’am (3) , F. Fatchiyah (4)

(1)  Biologiya Departamenti, Riyaziyyat və Təbiət Elmləri Fakültəsi, Universitas Brawijaya, Malang
(2) Biologiya şöbəsi, Riyaziyyat və Təbiət Elmləri Fakültəsi, Universitas Brawijaya, Malang
(3)  Kimya Departamenti, Riyaziyyat və Təbiət Elmləri Fakültəsi, Universitas Brawijaya, Malang
(4) Biologiya şöbəsi, Riyaziyyat və Təbiət Elmləri Fakültəsi, Universitas Brawijaya, Malang
(*) Müəllif

Mücərrəd

Açar sözlər

Tam mətn:


DOI: https://doi.org/10.22146/ijbiotech.7868

Məqalə Metrikləri

Abstrakt baxılıb : 1255 | Baxışlar: 1143

Refbacks

Müəllif hüququ (c) 2015 İndoneziya Biotexnologiya Jurnalı

Keçmiş məsələlər

The İndoneziya Biotexnologiya Jurnalı (çap ISSN 0853-8654 onlayn ISSN 2089-2241) Biotexnologiya Tədqiqat Mərkəzi tərəfindən Universitas Gadjah Mada Lisansüstü Məktəbi ilə əməkdaşlıqda nəşr edilmişdir. Bu vebsaytın məzmunu Creative Commons Attribution-ShareAlike 4.0 Beynəlxalq Lisenziyasına əsasən lisenziyalaşdırılıb və Siti Nurleily Marliana və Joaquim Baetaya aid edilə bilər. İctimai Bilik Layihəsinin ASC 2.4.8.1 əsasında qurulmuş və Joaquim Baeta tərəfindən hazırlanmışdır. Veb sayt statistikasına baxın.


NƏTİCƏLƏR

RNT çıxarılması -

Hər bir preparatdan təxminən 20 μg ümumi RNT əldə edilmişdir. RNT keyfiyyəti 18S və 28S ribosomal RNT-yə uyğun gələn zolaqların olması ilə təmin edilmişdir (Şəkil 1).A).

OcI ORF-nin izolyasiyası və gücləndirilməsi -

The ocI ORF RT-PCR ilə əldə edildi, nəticədə təxminən 300 bp olan bir məhsul əldə edildi. ocI ORF (yalnız cücərmiş toxumların RNT-sindən). PCR məhsulu Şəkil 1-də göstərilmişdirB.

PET28a-da klonlama-

çevrildikdən sonra E. coli BL21 (DE3), PCR vasitəsilə skrininq üçün 60 klon seçildi. Onların bəzilərində təxminən 300 bp ölçüsündə əlavənin olduğu aşkar edildi (Şəkil 1C). Sonra bu klonlardan üçünün plazmid DNT-si çıxarıldı və ardıcıllıqla sıralandı. Bir klon düzgün ardıcıllığa malik idi, lakin digər ikisi keyfiyyətli ardıcıllığı göstərə bilmədi.

Ekspressiyanın induksiyası, həllolma testi və zülalın təmizlənməsi—

Protein ifadəsi 3 saat ərzində 0,4 m M IPTG ilə induksiya edilmişdir. 15% SDS-PAGE-də göstərildiyi kimi (Şəkil 2A), protein ifadəsi 1 saat sonra induksiya edildi və sonrakı 2 saat ərzində yəqin ki, artmadı.

Rekombinant OCI həm həll olunan, həm də həll olunmayan fraksiyalarda əldə edilmişdir (Şəkil 2).A). Doğma formada təmizləmək üçün həll olunan fraksiyada kifayət qədər protein var idi. Təmizləmə nikel qatranı ilə aparıldı və zülal elüsyonu 50 m M imidazol ilə başladı. Bununla belə, ən yaxşı elüsyon 100 və 250 m M imidazol ilə yuyulma zamanı əldə edilmişdir (şək. 2).B). Beləliklə, toplanmış nümunələr bir yerə yığıldı və kulturanın hər litrinə cəmi 10 mq protein əldə edildi. Artıq imidazolun çıxarılması üçün dializ aparıldı.

Antifungal Fəaliyyət Təhlili -

Rekombinant zülalın göbələk əleyhinə fəaliyyəti filamentli göbələklərə qarşı sınaqdan keçirilmişdir T. reesei. Test edilmiş hər iki konsentrasiyada (50 və 100 μg/ml) göbələk artımı uğurla inhibə edilmişdir (Şəkil 3).

Əlyazmanın yazılması -

Nəticələr tərtib edildi və müzakirə edildi, bundan sonra tələbələr kurs koordinatorlarının nəzarəti altında bu məqaləni yazdılar.


Vektor seçimi

E. coli ifadə vektorunun əsas arxitekturası aşağıdakı şəkildə göstərilmişdir və aşağıdakı xüsusiyyətləri ehtiva edir:

Seçilə bilən marker. Seçici təzyiq olmadıqda plazmidlər ev sahibi tərəfindən itirilir. Xüsusilə çox yüksək nüsxə sayı olan plazmidlər və plazmid daşıyan genlər ev sahibi üçün zəhərli olduqda və ya onun böyümə sürətini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır. Bu problemi həll etməyin ən sadə yolu eyni plazmiddən antibiotikə davamlılıq markerini ifadə etmək və plazmidsiz hüceyrələri öldürmək üçün mühiti müvafiq antibiotiklə əlavə etməkdir. Ən çox istifadə edilən antibiotiklər və onların effektiv konsentrasiyaları cədvəl 1-də verilmişdir.

Ampisilinin istifadəsi xüsusi diqqət tələb edir. Seçilə bilən marker, b-laktamaz, bütün ampisillini hidroliz etdiyi mühitə ifraz olunur. Mədəniyyət çətin ki, bulanıq olduqda bu nöqtəyə çatır. Bundan sonra, plazmid olmayan hüceyrələr öldürülməyəcək və mədəniyyəti böyüdə bilər. Bəzi mümkün həll yolları bunlardır:

  • 30 ° C və ya daha az bir gecədə mədəniyyət yetişdirin.
  • bir gecəlik kulturaları fırladın və hasil edilən b-laktamazanı çıxarmaq üçün qranulları təzə mühitdə yenidən dayandırın.
  • ampisilin əvəzinə daha stabil karbenisilin istifadə edin.

Tənzimləyici gen (repressor). Bir çox promouterlər ifadələrində sızıntı göstərirlər yəni. gen məhsulları induktor əlavə edilməzdən əvvəl aşağı səviyyədə ifadə edilir. Gen məhsulu ev sahibi üçün zəhərli olduqda bu problemə çevrilir. Bunun qarşısını repressor zülalının konstitutiv ifadəsi ilə almaq olar.

The lak-gələn promouterlər xüsusilə sızdırılır. Bu promotorlar a-nın daxil edilməsi ilə idarə oluna bilər lak-promotorun aşağı axınında operator ardıcıllığı və ifadəsi lak- daşıyan host suşları tərəfindən repressor lacI q allel (orta nüsxə nömrəli plazmidlər üçün) və ya eyni və ya köməkçi plazmiddən (daha yüksək nüsxə sayı plazmidləri üçün). Alternativ olaraq, repressiya mədəniyyət mühitinə 1% qlükoza əlavə etməklə əldə edilə bilər.

Replikasiyanın mənşəyi. Replikasiyanın mənşəyi plazmid nüsxə nömrəsinə nəzarət edir.

Promoter. Promotor transkripsiyaya başlayır və ribosomun bağlanma yerindən 10-100 nukleotid yuxarıda yerləşdirilir. İdeal promouter bir neçə arzuolunan xüsusiyyətləri nümayiş etdirir:

  • Ümumi hüceyrə zülalının 50% -ə qədər məhsulun yığılmasına imkan verəcək qədər güclüdür.
  • Aşağı bazal ifadə səviyyəsinə malikdir (yəni. məhsulun toksikliyinin qarşısını almaq üçün ciddi şəkildə tənzimlənir).
  • İnduksiya etmək asandır.

Mümkün promotorların geniş siyahısı cədvəl 2-də verilmişdir. Ən çox istifadə edilən promotorlar qırmızı rənglə göstərilmişdir.

Transkripsiya terminatoru. Transkripsiya terminatoru arzuolunmaz transkripsiyanı azaldır və plazmid və mRNT sabitliyini artırır.

Shine-Delgarno ardıcıllığı. Shine-Dalgarno (SD) ardıcıllığı tərcümənin başlanması üçün tələb olunur və 16S ribosomal RNT-nin 3' ucunu tamamlayır. Başlanğıc kodonunda tərcümənin başlanmasının effektivliyi faktiki ardıcıllıqdan asılıdır. Konsensus ardıcıllığı: 5'- TAAGGAGG -3'. Başlanğıc kodonundan 4-14 nukleotid yuxarıda yerləşir, optimal məsafə 8 nukleotiddir. İkinci dərəcəli strukturların yaranmasının qarşısını almaq üçün (bu, ifadə səviyyələrini azaldır) bu bölgə A qalıqları ilə zəngin olmalıdır.

Kodon başlayın. Tərcümənin başlanğıc nöqtəsi. In E. coli ən çox istifadə edilən başlanğıc kodonudur ATG. GTG 8% hallarda istifadə olunur. TTGTAA az istifadə olunur.

Etiketlər və birləşmə zülalları. Heteroloji zülalların qısa peptidlərə (etiketlərə) və ya digər zülallara (füzyon tərəfdaşları) N- və ya C-terminal birləşmələri bir sıra potensial üstünlüklər təklif edir:

  • Təkmilləşdirilmiş ifadə. Heteroloji zülalın N-terminusunun yüksək ifadəli birləşmə partnyorunun C-terminusuna birləşməsi çox vaxt füzyon zülalının yüksək səviyyəli ifadəsi ilə nəticələnir.
  • Təkmilləşdirilmiş həllolma. Heteroloji zülalın N-terminalının həll olunan birləşmə partnyorunun C-terminusuna birləşməsi çox vaxt birləşmə zülalının həllolma qabiliyyətini yaxşılaşdırır.
  • Təkmilləşdirilmiş aşkarlama. Qısa peptidin (epitop etiketi) və ya antikor və ya bağlayıcı zülal (Western blot analizi) və ya biofiziki üsullarla tanınan zülalın zülalının birləşməsi (məs. Floresensiya ilə GFP) ifadə və təmizlənmə zamanı zülalın aşkarlanmasına imkan verir.
  • Təkmilləşdirilmiş təmizləmə. Hər iki ucunda birləşdirilmiş zülallar və ya xüsusi olaraq yaxınlıq qatranlarına bağlanan zülallar üçün sadə təmizləmə sxemləri hazırlanmışdır (cədvəl 3 və oradakı istinadlara baxın).

Proteaz parçalanma yeri. Proteaz parçalanma yerləri tez-tez ifadədən sonra birləşmə zülalından bir etiket və ya birləşmə partnyorunu çıxara bilmək üçün əlavə edilir. Ən çox istifadə olunan proteazlar cədvəl 4-də verilmişdir. Bununla belə, parçalanma nadir hallarda tamamlanır və çox vaxt əlavə təmizləmə addımları tələb olunur.

Çoxlu klonlama saytı. Maraqlanan geninizi vektora klonlamağa imkan verən bir sıra unikal məhdudiyyət saytları.

Kodon dayandırın. Tərcümənin dayandırılması. 3 mümkün stop kodonu var, lakin TAA ilə müqayisədə oxumağa daha az meylli olduğu üçün üstünlük verilir TAGTGA. Ardıcıl olaraq 2 və ya 3 dayanma kodonundan istifadə etməklə bitirmənin effektivliyi artır.


Rekombinant lizostafinin klonlaşdırılması, ifadəsi və təmizlənməsi Staphylococcus simulans

Necə sitat gətirmək olar: Farhangnia L, Ghaznavi- Rad E, Mollaee N, Abtahi H. Rekombinant lizostafinin klonlanması, ifadəsi və təmizlənməsi Staphylococcus simulans, Jundishapur J Microbiol. 2014 7(5):e10009. doi: 10.5812/jjm.10009.

Mücərrəd

Fon: Staphylococcus aureus nozokomial infeksiyaların ən çox yayılmış səbəblərindən biridir və onun antibiotiklərə qarşı müqaviməti qlobal narahatlıq doğurur. Lizostafin bakteriosinlər kimi tanınan antimikrobiyal peptidlərin və zülalların əsas sinfinə aid olan antimikrobiyal agentdir. Yüksək dərəcədə anti-stafilokok bakteriolitik fəaliyyət göstərir.

Məqsədlər: Bu işdə yüksək səviyyədə rekombinant yetişmiş lizostafin Escherichia coli pET32a ifadə vektorundan istifadə etməklə istehsal edilmişdir.

Materiallar və metodlar: The S. simulanlar lizostafin kodlayan gen çıxarıldı, polimeraza zəncirvari reaksiya (PCR) ilə gücləndirildi və prokaryotik ifadə vektor pET32a-da subklonlaşdırıldı. E. coli BL21 (DE3) plysS pET32a-lys ilə çevrildi və gen ifadəsi IPTG tərəfindən induksiya edildi. İfadə edilmiş zülal (Ni-NTA) qatranından istifadə edərək yaxınlıq-xromatoqrafiya ilə təmizlənmişdir.

Nəticələr: PCR və ardıcıllıq nəticələri hədəf genin vektora uğurlu klonlanmasını təsdiqlədi. Zülalın ifadəsi IPTG tərəfindən induksiya edilmiş və yaxınlıq-xromatoqrafiya ilə təmizlənmə prosesi ilə rekombinant zülalın yüksək konsentrasiyası əldə edilmişdir.

Nəticələr: Məlumatlarımız göstərdi ki, pET32a vektoru tərəfindən istehsal olunan rekombinant yetkin lizostafin proteini E. coli sistem çox səmərəli idi.

1. Fon

Staphylococcus aureus endokardit, osteomielit, pnevmoniya, toksik-şok sindromu, qida zəhərlənməsi, karbunkullar və çibanlar da daxil olmaqla geniş spektrli xəstəliklərə səbəb olan bütün dünyada həm nozokomial, həm də cəmiyyətdən əldə edilən infeksiyaların əsas səbəbidir (1). Metisillinə davamlı olanlar arasında çoxlu dərman müqavimətinin artması S. aureus (MRSA) ştammları xəstəxana mühitində böyük bir narahatlığa çevrilmişdir, çünki o, çox böyük maliyyə yükü yaradır və müalicəsi çətin olan sistem infeksiyaları səbəbindən xəstələnmə və ölüm hallarını artırır (2).

Hal-hazırda vankomisin MRSA-nın müalicəsi üçün seçilən antibiotikdir, lakin mutasiyalar toplanır. S. aureus vankomisinə (VISA) qarşı ara müqavimətə səbəb olmuşdur (3). Bu, bizi müalicə etmək üçün mövcud olan çox az təsirli antibiotik spektri ilə tərk etdi S. aureus infeksiyalar və qalan antibiotiklərə qarşı müqavimətin baş vermə ehtimalı ilə. Buna görə də, bu qrup patogenlərdə dərmanlara qarşı müqavimət məsələsi mövcud dərmanların düzgün istifadəsi, eləcə də yeni agentlərin inkişafı yolu ilə həll edilməlidir (4, 5). Stafilokoklar lizostafin də daxil olmaqla bakteriosinlər üçün potensial hədəflərdir.

Lizostafinlər tərəfindən istehsal olunan qlisin-glisin endopeptidazdır S. simulanlar peptidlər arası körpüyə xas olan qlisin-qlisin bağını xüsusi olaraq ayırır. S. aureus hüceyrə divarı. Unikal spesifikliyinə görə lizostafin antibiotiklərə davamlı Stafilokok infeksiyalarının müalicəsi üçün yüksək potensiala malikdir (1). Lizostafinin ikincil zülal strukturu ilə bağlı tədqiqatlar prekursor zülalında üç fərqli bölgəni aşkar etdi: tipik bir siqnal peptidi (təxminən 38 amin turşusu), 14 təkrarlanan ardıcıllıqla (296 amin turşusu) hidrofilik və yüksək nizamlı bir protein sahəsi və hidrofobik. yetkin lizostafin (6). Yetkin lizostafin molekulyar çəkisi 27 KDa (7) olan tək polipeptid zənciridir.

Lizostafin MRSA da daxil olmaqla müxtəlif stafilokok suşlarına qarşı son dərəcə yüksək aktivliyə malik olmaqla unikaldır. S. aureus əsasən yara, dəri və yumşaq toxuma infeksiyalarından təcrid olunmuş yetkinlərin dəri florasının və kodlaşdırma ardıcıllığının ən çox yayılmış mikroorqanizmlərindən biridir. Beləliklə, saf və effektiv rekombinant lizostafin (r-lizostafin) zülalının istehsalı in vitro üçün potensial müalicəyə səbəb ola bilər S. aureus. Əvvəllər lizostafin klonlanmış və heteroloji şəkildə ifadə edilmişdir Escherichia coli (8), simian böyrək hüceyrə xəttində (9) və in Lactococcus lactis (10). Hazırda bir neçə lizostafinin həddindən artıq ekspressiya sistemi təsvir edilmişdir (9-11). Tədqiqatçılar bu tədqiqatlarda lizostafin istehsalının miqdarını yaxşılaşdırmağa çalışsalar da, məhsul qeyri-qənaətbəxş qalmışdır və təmizləmə üsulları mürəkkəbdir.

2. Məqsədlər

Bu işdə biz r-lizostafin istehsalı üçün yeni bir ifadə sistemini təsvir etdik E. coli, sənaye miqyasında potensialı olan laboratoriya miqyasında təhlükəsiz qeyri-patogen ev sahibi. Bundan əlavə, böyük miqdarda saf lizostafin əldə etmək üçün yüksək tutumlu Ni-NTA qatranının təmizlənməsi prosedurundan istifadə edilmişdir.

3. Materiallar və Metodlar

3.1. Bakterial ştammlar, vektorlar və digər regentlər

S. simulanlar PTCC 1442 (İran) və pET32a vektoru (Novagene, ABŞ) alınıb. Bu vektor trombin yerində 6-histidin etiketi və N-terminusunda T7 etiketi olan bir birləşmə zülalını ifadə edə bilir. Bu əlavə amin turşuları ifadə olunan proteinin ölçüsünü 15 KDa-ya yaxın artırır. Məhdudiyyət fermentləri, DNT liqaz (Fermentas, Litva) əldə edilmişdir. E. coli ilkin klonlaşdırma üçün DH5α ştammı (f-gyr A96 Nalr, recA1 relA1 Thi-1 hsdR17 r-k m+k, Stratagene, ABŞ) istifadə edilmişdir. Rekombinant pET32a (pET32a-lizostafin) çevrildi. E. coli, BL21 (DE3) pLysS (f–ompthsdB, rB- mB-, dcm gal, DE3, pLYsScmr) (Novagene, ABŞ) ana ştammı kimi.

Protein Təmizləmə Kiti (Qiagene, Almaniya) təmin edildi. MHB (Muller Hinton Broth, Sigma, ABŞ) və LB bulyonu (Luria Bertani Broth, Sigma, ABŞ) müntəzəm bakteriya kulturası üçün istifadə edilmişdir. Tələb olunan antibiotiklər, ampisilin (100 μg/mL) və xloramfenikol (34 μg/mL) (Sigma, ABŞ) istinad tövsiyəsinə uyğun olaraq LB mediasına əlavə edilmişdir (12). Bütün kimyəvi maddələr Merck (Almaniya), fermentlər isə Fermentas (Litva) və ya Cinagene Tehran (İran) şirkətlərindən alınmışdır.

3.2. Plazmid DNT-nin izolyasiyası

Gecədə inkubasiya edildikdən sonra S. simulanlar MHB-də 37°C-də bakteriya hüceyrələri 4000 rpm-də 5 dəqiqə sentrifuqa edildi və qranul 100 μL SET tamponunda (saxaroza 50 mM, EDTA 10 mM, Tris-HCl 25 mM, pH = 8) dayandırıldı. Plazmid DNT standart mini-preparat plazmid Metoduna uyğun olaraq hazırlanmışdır. Qısaca olaraq, bakteriya qranulları SET tamponunda dayandırılmış və otaq temperaturunda 5 dəqiqə saxlanmış 1,5 mL gecə ərzində bakteriya mədəniyyətindən əldə edilmişdir. Daha sonra bakteriya hüceyrələri təzə, soyuq lizis tamponu (NaOH5N, SDS 10%, DDW) ilə parçalandı, sonra KAC (KAC 5M, Sirkə turşusu, DDW) əlavə edildi.

Hüceyrə qalıqları, zülallar və xromosom DNT iki dəfə fenol/xloroform/izoamil spirti (25:24:1) qarışığı ilə çıxarıldı. DNT etanol (100%) ilə çökdürüldü və etanolda (70%) yuyuldu, sonra pellet havada qurudulub TE tamponunda yenidən suspenziya edildi. Təmizlənmiş plazmid DNT-nin keyfiyyəti və miqdarı müvafiq olaraq 1X TBE tamponunda 0,8% Agarose gel elektroforezi və spektrofotometriyada (260/280 nm) yoxlanıldı (12).

3.3. Polimeraza Zəncirvari Reaksiya və Rekombinant Plazmid pET-lysin qurulması

Primerlər lizostafin gen ardıcıllığının tam uzunluğuna uyğun olaraq hazırlanmışdır (Gen Bankının giriş nömrəsi: X06121). Yetkin peptidin kodlaşdırma ardıcıllığı (738 bp) aşağıdakı primerlərdən istifadə edərək polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) ilə gücləndirildi: 5´-AGA GGA TCC GCT GCA ACA CAT GAA -3´ (endonukleaza sahəsi ilə irəli primer). BamHI) və 5´-CGC CTC GAG TCA CTT TAT AGT TCC-3´ (endonükleaz yeri olan tərs primer) XoI). Endonükleaz saytlarının məhdudlaşdırılması Bamsalam və XoMən subklonlaşdırma məqsədləri üçün müvafiq olaraq yetkin genin 5´ və 3´ ucuna daxil edildim. Lizostafin geninin gen gücləndirilməsi 20 ng şablon DNT, hər bir primerdən 0,5 μM, hər bir deoksinukleotid trifosfatdan 2 mM Mg2+, 200 mΜ, 1X PCR tamponu və 2,5 vahid Taq polimerazdan ibarət ümumi həcmdə həyata keçirilmişdir.

Gücləndirmə üçün aşağıdakı proqramdan (Eppendorf PCR) istifadə edilmişdir: 94°C-də beş dəqiqə isti başlanğıc, ardınca bir dəqiqə ərzində 94°C-də 30 denatürasiya dövrü, 56°C-də bir dəqiqə yumşalma və 72°C-də uzadılma bir dəqiqə. Proqramın ardınca 72°C-də beş dəqiqəlik son uzadılma aparıldı. PCR məhsulları 1X TBE buferində 0,8% agaroza geldə təhlil edildi və istehsalçının göstərişinə uyğun olaraq High Pure PCR məhsulunun təmizlənməsi dəsti (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Almaniya) ilə geldən təmizləndi.

PCR məhsulu ilə həzm olundu Bamsalam və XoI və T4 DNT liqazından istifadə edərək rekombinant plazmid pET32a-lys (pET-lys) yaratmaq üçün eyni məhdudlaşdırıcı fermentlər tərəfindən həzm olunan pET32a ilə bağlandı (12). The E. coli DH5α pET32a-lys plazmidinin çevrilməsi üçün istifadə edilmişdir. Transformasiya edilmiş bakteriyalar koloniyaları ampisilin (100 μg/mL) və plazmid təmizləyicisi olan skrininq yolu ilə seçilmişdir. Sonra koloniyalar məhdudlaşdırıcı ferment həzm və PCR ilə daha da təhlil edildi. Rekombinant plazmidin lizostafin geni Sanger üsulu ilə ardıcıllıqla müəyyən edilmişdir.

3.4. Rekombinant Yetkin Lizostafinin İfadəsi və Təmizlənməsi

İfadə sahibi E. coli BL21 (DE3) pLysS, pET-lys vektoru üçün transformasiya sahibi kimi istifadə edilmişdir. lacUV5 promotorunun nəzarəti altında T7 RNT polimeraza genini ehtiva edən bu ştam pET-lys ilə transformasiya edilmişdir. Transformasiya edilmiş tək koloniya E. coli PET-lys ilə BL21 (DE3) 37°C-də daimi çalkalama ilə (200) ampisilin (100 mkq/mL) və xloramfenikol (34 mkq/mL) olan 2 ml Luria-Bertani bulyonunda (LB) bir gecədə silkələnən inkubatorda inkubasiya edilmişdir. rpm). Ertəsi gün 500 mkL kultivasiya materialı çıxarıldı və 25 mL LB bulyona vuruldu (hər litr üçün: 14 q maya ekstraktı, 12 q Baktotripton, 10 q NaCl, 1 q KCl, 0,5 q MgCl, 0,5 q CaCl).

Mədəniyyət 37°C-də güclü silkələnmə (200 rpm) ilə 0,6 OD600nm-də yetişdirildi. İzopropil-β-D-tioqalaktopiranosid (IPTG) yetkin lizostafinin ifadəsi üçün 1 mM yekun konsentrasiyaya əlavə edildi. E. coli. İnkubasiya dövrü 200 rpm-də silkələnmə ilə 37°C-də daha dörd saat davam etdi. İfadə zülalını istehsal etmək üçün bakterial suspenziya iki və dörd saatlıq fasilələrlə sınaqdan keçirilmiş və 12% SDS-PAGE-də təhlil edilmişdir (13). İfadə edilmiş zülal istehsalçının göstərişinə uyğun olaraq Ni-NTA agaroz sütunundan istifadə edərək təmizləndi (Qiagene, Hilden, Almaniya). Təmizlənmiş zülal dializ edildi və gecə ərzində 4°C-də PBS (tərkibində PMSF 0.2mM, pH = 7.2) ilə yenidən qatlandı. Təmizlənmiş rekombinant yetkin lizostafinin keyfiyyəti və kəmiyyəti Bradford üsulları ilə 12% SDS-PAGE gel elektroforezində təhlil edilmişdir (14).

4. Nəticələr

4.1. Plazmidin izolyasiyası

Plazmid DNT-si S. simulanlar ekstraksiya edilmiş və konsentrasiya 4 μg/μL-ə düzəldilmişdir ki, bu da genin kodlaşdırılmış lizostafinin gücləndirilməsi üçün şablon kimi istifadə edilmişdir.

4.2. Rekombinant Plazmid pET-lysin qurulması

Ardıcıllıq nəticəsi əsas yerli uyğunlaşdırma axtarış alətindən (BLAST) istifadə edərək verilənlər bazası ilə müqayisə edilərək təsdiq edilmişdir. Ferment həzm proseduru, PCR analizi və ardıcıllıq nəticəsi göstərdi ki, hədəf genin rekombinant plazmid pET-lys-ə düzgün daxil edilib (məlumatlar göstərilmir).

4.3. Rekombinant Yetkin Lizostafinin İfadəsi və Təmizlənməsi

Müsbət rekombinant plazmid ev sahibinə çevrildi, E. coli BL21 (DE3). IPTG-nin əlavə edilməsi təxminən 42 kDa molekulyar çəkidə rekombinant zülalın həddindən artıq ekspressiyasına səbəb oldu. İfadə edilmiş zülal Ni-NTA qatranından istifadə edərək yaxınlıq xromatoqrafiyası vasitəsilə uğurla təmizləndi (Şəkil 1). Təmizləmə və dializ prosesi 1 l məhsuldan təxminən 30 mq təmizlənmiş zülal alınması ilə nəticələndi. E. coli BL21 (DE3) + pET-lys mədəniyyəti.

SDS-PAGE gelləri induksiya olunmamış hüceyrə ekstraktı göstərir E. coli BL21(DE3)+PET-lys bir saat (1-ci zolaq) və iki saat (2-ci zolaq), iki saat (zolaq 3) və dörd saat (zolaq 4) induksiya edilmiş hüceyrə ekstraktı və Ni-NTA yaxınlıq xromatoqrafiyasından sonra çıxarılan zülallar ( zolaq 5). Solda (M zolağında) yüksək diapazonlu molekulyar çəki Markeri göstərilir.

5. Müzakirə

Bu işdə, yetkin lizostafin rekombinant zülaldan S. simulanlar klonlaşdırıldı, T7 promotorunun nəzarəti altında ifadə edildi və Ni-NTA qatranı ilə təmizləndi. Əldə edilən nəticələr pET 32a sisteminin çox səmərəli olduğunu göstərdi.

Bakterial böyüməyə mane olan bir antibiotikdən fərqli olaraq, lizostafin lizinqdə yüksək təsirlidir. S. aureus metabolik mərhələdə hüceyrələr. Lizostafin endopeptidazanın istehsalının əvvəlki üsulları onu xam ekstraktdan təmizləmək məqsədi daşıyırdı. S. simulanlar (15, 16), az miqdarda piogenlər/allergenlərlə çirklənmiş ola bilər. Bundan əlavə, yetkin lizostafin istifadə edərək yenidən propeptiddən ayrılır S. simulanlar çıxarış (9, 17). Lakin yabanı tipli lizostafinin təmizlənməsi çox çətindir. Lizostafin istehsalının bir neçə üsulu bildirilsə də, məhsuldarlıq və təmizlik çox məhdud idi (11, 17, 18).

Lizostafin endopeptidazanın ifadəsi ilə bağlı bir sıra hesabatlar var E. coli lizostafin endopeptidaza promotorundan istifadə etməklə (6, 8). Proendopeptidaza həmçinin Sitomeqalovirus (CMV) promotorunun transkripsiya nəzarəti altında eukaryotik sistemdə ifadə edilmişdir (9). Rekombinant prolizostafinin ifadəsi Bacillus subtilisB.sphaericus onların mədəniyyət mühitinə böyük miqdarda lizostafin ifraz etmək qabiliyyətini ortaya qoyduğu bildirildi. B. sphaericus təbii mənbəyindən təxminən beş dəfə çox lizostafin istehsal edir (19).

Lizostafin, siçanlarda da ifadə edildi, burada Bovine β-laktoglobulin geninin 5′-flanking bölgəsi lizostafin ifrazını südə yönəltdi (20). Əczaçılıq/terapevtikaya gəldikdə, E. coli təhlükəsiz ifadə sahibi hesab olunur. Çoxlu zülallar ifadə edilmişdir E. coli buna görə də, E. coli həm tədqiqatda, həm də sənayedə ifadə sahibi kimi geniş istifadə olunur.

Bir neçə tədqiqatda, r-lizostafin müxtəlif pET vektorları, o cümlədən 22 mq məhsuldarlıq ilə pET28a, 20 mq məhsuldarlıqla pET 23b və 1 L məhsuldan 11 mq təmizlənmiş zülal əldə edən pET15b vasitəsilə istehsal edilmişdir. E. coli BL21(DE3) + pET-lys mədəniyyəti (7, 21, 22). Lizostafin də həddindən artıq ifadə edildi və 6 mq/L (11) məhsuldarlığı ilə sintez zülalı kimi intein-xitin bağlayan domendən (intein-CBD) istifadə edilərək təmizləndi. r-lizostafin ilə ifadə edilir E. coli Sigma-Aldrich tərəfindən kommersiya olaraq satılır və Stafilokokal genetik tədqiqatlar üçün əvəzolunmazdır, DNT izolyasiyası (23), protoplastların əmələ gəlməsi və Stafilokok suşlarının differensasiyası (24) üçün istifadə olunur.

Terapevtik agent kimi lizostafinin anti-stafilokok potensialının sonrakı qiymətləndirilməsi və onun laboratoriya reagenti kimi istifadəsi təhlükəsiz və patogen olmayan mənbədən böyük miqdarda yüksək təmizlənmiş zülalın mövcudluğundan asılıdır. Buna görə də lizostafin istehsalında əldə edilən aşağı məhsuldarlıq (7, 21, 22), patogenezi və çoxlu dərmanlara davamlılıq xüsusiyyətləri S. aureus (2) həmçinin lizostafinin yüksək qiymətli sənaye məhsulu bu terapevtik agent üçün rekombinant mənbə axtarışının əsas səbəbi olmuşdur. Bu, İrandan rekombinant yetkin lizostafinin ilk hesabatıdır.

Bu işdə r-lizostafini ifadə etmək üçün pET32a sistemi istifadə edilmişdir E. coli. Bu təmizləmə metodundan istifadə edərək, biz pET 32a sistemində böyümə mühitinin hər litrinə təxminən 30 mq r-lizostafin əldə etdik. Bu analizdə r-lizostafin istehsalçının göstərişinə uyğun olaraq Ni-NTA sütunundan istifadə edərək təmizləndi (Qiagene, Almaniya). Bu təmizləmə üsulu çox sadədir və ənənəvi zülalların təmizlənməsi sxemləri üçün lazım olan təcrübəyə və avadanlıqlara malik olmayan laboratoriyalarda həyata keçirilib. R-lizostafin istehsalı proseduru olduqca rahat və səmərəlidir və laboratoriyaya böyük miqdarda r-lizostafin istehsal etməyə imkan verəcəkdir. Bu işdə füzyon zülallarının yüksək səviyyədə ifadəsini əldə etmək üçün, E. coli BL21(DE3) plys S, məlum sitoplazmik proteaz gen məhsullarında çatışmazlıq olan ifadəli ev sahibi kimi istifadə edilmişdir (25). Buna görə də lizostafinin ən yüksək ifadəsi E. coli BL21 (DE3) qat S bu gərginlikdə proteaz çatışmazlığı ilə bağlı ola bilər. PET sistemi rekombinant zülalların istehsalı üçün ən güclü üsullardan biri kimi tanınıb E. coli və bu sistemin mühüm üstünlükləri geniş müzakirə edilmişdir.

Buna görə də, təqdim olunan prosedurla yetkin r-lizostafin istehsal etdik E. coli struktur funksiyalarının öyrənilməsi və terapiyada klinik potensialının qiymətləndirilməsi, eləcə də stafilokok infeksiyalarına qarşı profilaktika üçün böyük miqdarda r-lizostafinin hazırlanması üçün. Məlumatlarımız lizostafin geninin yetkin lizostafin bölgəsinin pET32a vektoru ilə ifadə edilə biləcəyini göstərdi. E. coli, və T7 lak promotoru inducingr-lizostafin istehsalında digər promotorlardan daha güclü ola bilər.

Təşəkkürlər

Bu araşdırma İranın Arak Tibb Elmləri Universitetinin maliyyə yardımı ilə aparılıb və biz bu tədqiqata əvəzsiz töhfələrinə görə minnətdarıq. Bu tədqiqat İranın Arak Tibb Elmləri Universitetinin Biotexnologiya fakültəsinin magistr tələbəsi xanım Leyla Fərhəngniyanın (No: 772) tezisi idi.

Haşiyələr

  • Səhiyyə siyasəti/təcrübə/tədqiqat/tibbi təhsil üçün təsir: Recombinant lysostaphin protein was produced in this study through cloning and expression method can be further implemented for clinical and molecular biology works.
  • Authors’ Contribution: All authors had equal contribution.
  • Financial Disclosure: There is no Financial Disclosure.
  • Funding/Support: Funding for this work was provided by the Arak University of Medical Sciences.

İstinadlar

Kumar JK. Lysostaphin: an antistaphylococcal agent. Microbiol Biotechnol tətbiq edin. 2008 80(4) : 555 -61 [DOI][PubMed]

van Saene HK, Weir WI, de la Cal MA, Silvestri L, Petros AJ, Barrett SP. MRSA--time for a more pragmatic approach? J Hosp Infect. 2004 56(3) : 170 -4 [PubMed]

Smith TL, Pearson ML, Wilcox KR, Cruz C, Lancaster MV, Robinson-Dunn B, et al. Emergence of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. Glycopeptide-Intermediate Staphylococcus aureus Working Group. N Engl J Med. 1999 340(7) : 493 -501 [DOI][PubMed]

Bannerman TL, Peacock SJ, Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, et al. Staphylococcus, Micrococcus, and other catalase-positive cocci. Manual of clinical microbiology. 2007

Rogers KL, Fey PD, Rupp ME. Coagulase-negative staphylococcal infections. Infect Dis Clin North Am. 2009 23(1) : 73 -98 [DOI][PubMed]

Heinrich P, Rosenstein R, Bohmer M, Sonner P, Gotz F. The molecular organization of the lysostaphin gene and its sequences repeated in tandem. Mol Gen Genet. 1987 209(3) : 563 -9 [PubMed]

Sharma R, Sharma PR, Choudhary ML, Pande A, Khatri GS. Cytoplasmic expression of mature glycylglycine endopeptidase lysostaphin with an amino terminal hexa-histidine in a soluble and catalytically active form in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2006 45(1) : 206 -15 [DOI][PubMed]

Recsei PA, Gruss AD, Novick RP. Cloning, sequence, and expression of the lysostaphin gene from Staphylococcus simulans. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 84(5) : 1127 -31 [PubMed]

Williamson CM, Bramley AJ, Lax AJ. Expression of the lysostaphin gene of Staphylococcus simulans in a eukaryotic system. Appl Environ Microbiol. 1994 60(3) : 771 -6 [PubMed]

Mierau I, Leij P, van Swam I, Blommestein B, Floris E, Mond J, et al. Industrial-scale production and purification of a heterologous protein in Lactococcus lactis using the nisin-controlled gene expression system NICE: the case of lysostaphin. Microb Cell Fact. 2005 4 : 15 [DOI][PubMed]

Szweda P, Pladzyk R, Kotlowski R, Kur J. Cloning, expression, and purification of the Staphylococcus simulans lysostaphin using the intein-chitin-binding domain (CBD) system. Protein Expr Purif. 2001 22(3) : 467 -71 [DOI][PubMed]

Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2001

Mahmoudi S, Abtahi H, Bahador A, Mosayebi G, Salmanian AH. Production of recombinant streptokinase in E. coli and reactivity with immunized mice. Pak J Biol Sci. 2010 13(8) : 380 -4 [PubMed]

Kiaie S, Abtahi H, Alikhani M, Mosayebi G. Expression,Purification and antigenic evaluation toxin-coregulated pilus B protein of vibrio cholera. Afr J Microbiol Res. 2012 6(24) : 5188 -99

Iversen OJ, Grov A. Studies on lysostaphin. Separation and characterization of three enzymes. Eur J Biochem. 1973 38(2) : 293 -300 [PubMed]

Schindler CA, Schuhardt VT. Purification and Properties of Lysostaphin--a Lytic Agent for Staphylococcus Aureus. Biochim Biophys Acta. 1965 97 : 242 -50 [PubMed]

Marova I, Dadak V. Modified simplified method for isolation of lysostaphin from the culture filtrate of Staphylococcus staphylolyticus. Folia Microbiol (Praha). 1993 38(3) : 245 -52 [PubMed]

Sugai M, Akiyama T, Miyake Y, Ishida E, Suginaka H. Rapid purification method of lysostaphin for analysis of cell-wall proteins. J Microbiol Meth. 1990 12(2) : 133 -8 [DOI]

Recsei PA. Expression of the cloned lysostaphin gene 1990

Kerr DE, Plaut K, Bramley AJ, Williamson CM, Lax AJ, Moore K, et al. Lysostaphin expression in mammary glands confers protection against staphylococcal infection in transgenic mice. Nat Biotexnol. 2001 19(1) : 66 -70 [DOI][PubMed]

Zhang B, Shangguan T, Ma H, Huang X, Zhang Y. Lysis of mastitis pathogens isolated from dairy cow milk samples by purified recombinant lysostaphin. Afr J Biotechnol. 2012 11 : 4649 -59

Szweda P, Kotlowski R, Kur J. New effective sources of the Staphylococcus simulans lysostaphin. J Biotexnol. 2005 117(2) : 203 -13 [DOI][PubMed]

Klesius PH, Schuhardt VT. Use of lysostaphin in the isolation of highly polymerized deoxyribonucleic acid and in the taxonomy of aerobic Micrococcaceae. J Bakteriol. 1968 95(3) : 739 -43 [PubMed]

Geary C, Stevens M. Rapid lysostaphin test to differentiate Staphylococcus and Micrococcus species. J Clin Microbiol. 1986 23(6) : 1044 -5 [PubMed]

Sugimura K, Higashi N. A novel outer-membrane-associated protease in Escherichia coli. J Bakteriol. 1988 170(8) : 3650 -4


Cloning, expression and purification of binding domains of lethal factor and protective antigen of Bacillus anthracis in Escherichia coli and evaluation of their related murine antibody

Anthrax is common disease between human and animals caused by Bacillus anthracis. The cell binding domain of protective antigen (PAD4) and the binding domain of lethal factor (LFD1) have high immunogenicity potential and always were considered as a vaccine candidate against anthrax. The aims of this study are cloning and expressing of PAD4 and LFD1 in Escherichia coli, purification of the recombinant proteins and determination of their immunogenicity through evaluating of the relative produced polyclonal antibodies in mice. PAD4 and LFD1 genes were cloned in pET28a(+) vector and expressed in E. coli Bl21(DE3)PlysS. Expression and purification of the two recombinant proteins were confirmed by SDS-PAGE and Western blotting techniques. The PAD4 and LFD1 were purified using Ni + -NTA affinity chromatography (95–98 %), yielding 37.5 and 45 mg/l of culture, respectively. The antigens were injected three times into mice and production of relative antibodies was evaluated by ELISA test. The results showed that both PAD4 and LFD1 are immunogenic, but LFD1 has higher potential to stimulate Murine immune system. With regard to the high level of LFD1 and PAD4 expression and also significant increment in produced polyclonal antibodies, these recombinant proteins can be considered as a recombinant vaccine candidate against anthrax.


Trouble transforming pET28a in E. coli BL21(DE3) - (Feb/04/2020 )

We  are  facing  issues  while  transforming  pET28a  vectors  in  expression  strains.  Please  refer  to  the  image  attached  and  suggest  improvements.

The quality of vector DNA and transformation efficiency in Top10 is good. All the suggestions will be appreciated

How many times have you observed this phenomenon and which plasmid extraction system are you using? If you are doing manual minipreps (i.e. not kit) it is possible that the DNA is not clean enough to get a good transformation and resulting in no plasmids coming out the final step.

bob1 on Wed Feb 5 02:10:39 2020 said:

How many times have you observed this phenomenon and which plasmid extraction system are you using? If you are doing manual minipreps (i.e. not kit) it is possible that the DNA is not clean enough to get a good transformation and resulting in no plasmids coming out the final step.

we have observed this particular phenomenon 3 times. The plasmid isolation method is manual and the plasmid quantity and quality is good (Verified by nanodrop and quantus). The same plasmid can be transformed in Top10 but not in expression strain. Other plasmids are also isolated by this same method and they are getting transformed properly. This problem is only seen in case of pET28a vector.

Based on your flowchart it seems you have done most of the appropriate experimental controls to eliminate bad plasmid preps and “incompetent” BL21(DE3) competent cells as the problem.  When you say transformation failed, do you mean that you get no colonies at all?  Or you get colonies but they have incorrect (deleted) plasmids?

I’m not an expert with this Novagen plasmid/host system.  I’d revisit the Novagen manual and make sure you have the correct Vector/Expression host pairing.  I took a quick look and BL21(DE3) is indeed the most commonly used strain, but there is one called BLR (DE3) that is a recA- derivative of BL21(DE3) that may stabilize some target genes with repeats.  You also have to consider the possible toxicity of the expressed protein on the bacterial cells. Though that would not explain why you can’t get empty vector into the expression host. Also, when you get stuff from other labs (part A of your chart), you do have to consider the possibility something was not labeled correctly and what you got was not what you think it is.  So I’d do some RE digests and make sure the plasmid you are using is what it is supposed to be.

I am baffled, as are you, at experiment B with the commercial construct- 1 st generation transformation successful with both hosts, 2 nd gen transformation not (but only for the DE3 strain).  Did you try the TOP10 cells for that 2 nd transformation? That would have been an important comparison.

I hope you figure this out and if you do, let us know!

OldCloner on Thu Feb 6 19:59:20 2020 said:

Based on your flowchart it seems you have done most of the appropriate experimental controls to eliminate bad plasmid preps and “incompetent” BL21(DE3) competent cells as the problem.  When you say transformation failed, do you mean that you get no colonies at all?  Or you get colonies but they have incorrect (deleted) plasmids?

 

I’m not an expert with this Novagen plasmid/host system.  I’d revisit the Novagen manual and make sure you have the correct Vector/Expression host pairing.  I took a quick look and BL21(DE3) is indeed the most commonly used strain, but there is one called BLR (DE3) that is a recA- derivative of BL21(DE3) that may stabilize some target genes with repeats.  You also have to consider the possible toxicity of the expressed protein on the bacterial cells. Though that would not explain why you can’t get empty vector into the expression host. Also, when you get stuff from other labs (part A of your chart), you do have to consider the possibility something was not labeled correctly and what you got was not what you think it is.  So I’d do some RE digests and make sure the plasmid you are using is what it is supposed to be.

 

I am baffled, as are you, at experiment B with the commercial construct- 1 st generation transformation successful with both hosts, 2 nd gen transformation not (but only for the DE3 strain).  Did you try the TOP10 cells for that 2 nd transformation? That would have been an important comparison.

 

I hope you figure this out and if you do, let us know!

Failed transformation means no colonies observed. Also, I tried TOP10 cells for the 2 nd transformation and it was successful. I am also puzzled on how to proceed with this problem. I will keep posting on this thread regarding the progress.