Məlumat

T7 promotorunun sızması

T7 promotorunun sızması


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Genomunda kodlanmış T7 polimeraza geni olmayan E. coli ştamında (məsələn, DH5 alfa) T7 promotoru altında gen ifadə oluna bilərmi? Başqa sözlə, T7 promouteri sızdırırmı?

Daha konkret desək, T7 polimerazasını kodlaşdırmayan adi E. coli ştammı, T7 promotoru altında kanR geninə malik plazmid ilə transformasiya olunarsa, kan selektiv mühitdə necə inkişaf edə bilər?


Göründüyü kimi, sızma T7 polimerazını sıx bir promotorla (bu halda lacUV5) sıx şəkildə tənzimləməklə idarə oluna bilər.


PET və pBAD ifadə sistemləri

Bu sistem hibrid promotorlar, müxtəlif füzyon tərəfdaşlarının birləşdirilməsi üçün çoxsaylı klonlama saytları və proteaz parçalanma sahələri daxil olmaqla, müxtəlif ifadə tətbiqləri üçün hazırlanmışdır. Şəkil 1-də göstərilən pET plazmidi aşağıdakı elementləri olan 5,4 kb konstruksiyadır:

  • lac repressor protein üçün lacI kodları
  • ampisilin müqaviməti üçün ampR kodları
  • ori col E1 replikasiya mənşəyi
  • lac operon üçün lacO kodları
  • PT7 yalnız T7 RNT polimerazasına xas olan T7 promotorunu kodlayır
  • T7 terminatoru üçün TT7 kodları
  • MCS çoxlu klonlama saytı maraq zülalını kodlayan ardıcıllığa malikdir.

E-nin tanımadığı 20-nükleotid ardıcıllığı olan PT7-nin istifadəsi əsas xüsusiyyətdir. Prokaryotik genom ardıcıllığında coli RNT polimeraza əmələ gəlmir, nə də T7 RNT polimeraza buna görə də T7 RNT polimeraza olmadıqda PT7 aktivləşmir və maraq doğuran zülal istehsal olunmur. Aşağıda təsvir olunduğu kimi, PT7 virus promotoru kimi aktivləşdirildikdə, o, saniyədə təxminən 230 nukleotid maksimum sürətlə, E. Coli Polimeraz RNT-dən təxminən beş dəfə daha sürətli transkripsiya edir. İfadə T7 RNT polimerazasını kodlayan DE3 faq fraqmenti ilə lizogenləşdirilmiş IPTG induksiya olunan lacUV5 promotorunun nəzarəti altında ana ştamm tələb edir və prosesin sxemi Şəkil 2-də göstərilmişdir.

Şəkil 2

coli və pET-in E. Genomunda tapılan lacI geninin surəti var. LacI zəif ifadə olunmuş gendir və həddindən artıq ifadə edən promotor mutant LacIq istifadə edildikdə repressiyanın 10 qat artması əldə edilir.35 Lac repressor zülalı, LacI, host hüceyrənin lacUV5 promotorunu və kodlanmış T7/lac hibrid promotorunu repressiya edir. plazmid ifadəsi ilə. LacI tetrameri həm ana hüceyrənin genomunda, həm də plazmiddə induktor olmadıqda lak operatoruna bağlanır. Bu, ev sahibi hüceyrənin RNT polimeraz T7 istehsal etməsinə mane olur və maraq doğuran zülalın plazmid tərəfindən istehsal olunmasının qarşısını alır. O, ana hüceyrədə T7 RNT polimerazanın ifadəsini tetikleyen induktor, adətən IPTG tətbiq edildikdə, həm genomda, həm də plazmiddə lak operatorundan tetramerik lacI-ni bağlayır və buraxmağa səbəb olur. Bu şəkildə, T7 / lac hibrid promotorundan hədəf genin transkripsiyasına başlanır.

PET ifadə plazmidlərindən aşağı fon ifadəsi baş verə bilər, bu, təbii T7 RNT polimeraz inhibitoru olan T7 lizoziminin ya plazmid pLysS, ya da pLysE ilə birgə ifadəsi ilə azaldıla bilər. Qohum tetrasiklinə cavab verən (Tc) promotora gəldikdə, bu plazmidlər səssiz (pLysS) və ifadəli (pLysE) oriyentasiyalarda T7 lizozim genini saxlayır.
lacUV5 promotoru cAMP-CRP (cAMP reseptor zülalı) kompleksinin tənzimlənməsinə lak promouterindən daha az həssas olsa da, mədəniyyət mühitinə 1% qlükozanın daxil edilməsi cAMP səviyyəsini azaldır və promotorun repressiyasını əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırır. Hədəf zülal ifadəsinə nəzarət laktoza permeazını kodlayan lacY genində çatışmayan host suşları tərəfindən yaxşılaşdırılır.

PBAD ifadə sistemi

E.coli-də arabinoza operonunun tənzimlənməsi arabinozanın sorulması üçün tələb olunan AraE, AraF və AraG zülallarının, həmçinin tələb olunan AraB, AraA və AraD fermentlərinin sintez sürətinə nəzarət edən arabinoza gen məhsulu38 tərəfindən idarə olunur. onun katabolizminə görə. Bu o deməkdir ki, ara-spesifik promotorların daxili vəziyyəti sönür və AraC onları işə salır, lak operon promotorunun təyin edilmiş vəziyyəti aktivdir və lak repressor onu söndürür. Üstəlik, pBAD katabolitlər tərəfindən repressiya olunur, Bu, mədəniyyətin böyüməsinin qlükoza varlığında ifadəni daha da sıxışdıracağını nəzərdə tutur. AraBAD promotorunu ehtiva edən klonlanmış plazmid geninin ekspressiyası bir neçə böyüklükdə subsaturasiya edən arabinoza konsentrasiyalarının iştirakı ilə yetişdirilən mədəniyyətlərdə modullaşdırıla bilsə də, ayrı-ayrı hüceyrələr ya tam induksiya olunur, ya da induksiya olunmur.

Doğma olaraq idarə olunan arabinoz daşıma geninə (araE) malik hüceyrələr ya induksiya edilmiş, ya da induksiya olunmamış olur, onların nisbi hissəsi arabinoza konsentrasiyası ilə idarə olunur. İnduktor konsentrasiyasının bir funksiyası olaraq, pBAD ifadəsindəki populyasiyanın orta hesabla dəyişməsi, ayrı-ayrı hüceyrələrdə ifadə səviyyəsinə deyil, tam induksiya edilmiş hüceyrələrin faizinə (induksiya olunmayanlara qarşı) mütənasibdir. E.coli-də heteroloji gen ifadəsinə arzuolunmaz təsir göstərə bilən bu tamamilə yaxalanmış fenomen arabinozadan asılı olmayan promotorlardan araE ifadəsi ilə aradan qaldırıla bilər.

Populyasiyadakı bütün hüceyrələr arabinoza daşıyan bu hüceyrələrdə təxminən eyni induksiya səviyyəsinə malikdir.40 Buna görə də, recA, endA ştammı kimi L-arabinozunu daşıya bilən, lakin onu metabolizə etməyən suşlar ən uyğundur.
AraBAD promotor əsaslı ifadə plazmidləri arxa fon ifadəsinə sıx nəzarət və hədəf zülalın ifadə səviyyələrinə dəqiq nəzarət üçün nəzərdə tutulmuşdur. Bu, əksər bakterial ifadə sistemlərinin əldə etdiyi hərtərəfli induksiya ilə ziddiyyət təşkil edir. pBR322-dən alınan və Şəkil 3-də göstərilən pBAD plazmidi 4,1 kb-lik konstruksiyadır və aşağıdakı elementlərə malikdir:

  • araC zülalını kodlayan araC ORF
  • ampisilin müqaviməti üçün ampR kodları
  • ori col E1 replikasiya mənşəyi
  • pBAD araBAD promouteri
  • rrnB transkripsiyasının bitmə bölgəsi
  • MCS çoxlu klonlama saytı maraq zülalını kodlayan ardıcıllığa malikdir.

Arabinoz operonda AraC dimer üç yeri, I1, I2 və O2-ni birləşdirir. 210 baza cütü pBAD-dan yuxarı axan arabinoza olmadıqda, AraC dimer araC genində yerləşən O2 sahəsi ilə əlaqə saxlayır. Göstərildiyi kimi, araC dimerinin digər yarısı DNT döngəsini meydana gətirən promotor bölgədəki I1 sahəsi ilə əlaqə qurur. Buna görə də, pBAD-dən və araC-nin promotorundan (pC) transkripsiya döngə tərəfindən maneə törədilir. AraC dimer, arabinozun bağlanması ilə öz konformasiyasını dəyişdirir ki, O2 yerinə pBAD I2 sahəsinə bağlanır. Bu, RNT polimerazın işə salınması ilə döngə quruluşunu və transkripsiyanı aradan qaldırır. cAMP reseptor zülalı (CRP) araC dimerinin I1 və I2 sahələrinə bağlanmasını stimullaşdırır, bu o deməkdir ki, qlükoza vasitəçiliyi ilə katabolit repressiyası araBAD-ın fon ifadəsini azalda bilər.


RNT polimerazlar

(a) Xromosom ifadə sistemləri.

Bir fag RNT Pol geni sabit şəkildə inteqrasiya oluna bilər E. coli λ lizogen vasitəsilə xromosom və İPTG-induksiya olunan nəzarəti altında ifadə edilir. lacUV5 təşviqatçı. Xromosom T7 RNT Pol geninin vaxtında ifadəsi daha sonra ayrıca vektorda klonlanmış T7 promotorla əlaqəli xarici genin ifadəsini idarə edəcək.

Eukaryotik hüceyrələr ev sahibi kimi istifadə edildikdə, fag Pol geninin oxşar xromosom ifadəsi hüceyrələrin müvafiq DNT ilə transformasiyası ilə hazırlana bilər. Alternativ olaraq, sitoplazmadakı RNT polimeraza ifadəsi, xromosomda yerləşən xarici genin ifadəsini idarə etmək üçün nüvəyə yönəldilə bilər. Belə tərs xromosom ifadə sistemlərində plazmid vektoru (54) və ya vaksiniya virusu vektoru (55) üzərində daşınan faj RNT Pol geni siçan metallotionein promotorundan və ya vaksin promotorundan eukaryotik hüceyrələrdə (məsələn, siçan L və NIH 3T3 hüceyrələri) ifadə edilir. , müvafiq olaraq. RNT Pol daha sonra SV40 böyük T antigeninin polimeraza bağlı nüvə lokalizasiya siqnalı (Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val) vasitəsilə maya və ya məməli hüceyrələrinin nüvəsinə nəql olunur (50, 54, 56) . Dəyişdirilməmiş T7 RNT Pol əsasən sitoplazmikdir və nüvədə aşkar edilə bilən T7 promotorla əlaqəli gen ifadəsini idarə edə bilmir. Polimeraza 0,5-1,5% ümumi hüceyrə zülalı səviyyəsinə həddindən artıq ekspressiya edildikdə, bəzi T7 RNT Pol nüvəyə passiv daxil ola bilər. Belə T7 konstruksiyalarından alınan ifadənin məməli hüceyrələrində məlum olan ən güclülərdən biri hesab edilən RSV-LTR promotorundan yönəldilmiş analoji ifadədən ən azı altı dəfə daha effektiv olduğu göstərilmişdir.

Qeyd edək ki, bir sıra məməli hüceyrə xətləri T7 RNT Pol olmadıqda belə T7 promotorundan əhəmiyyətli dərəcədə ifadə nümayiş etdirir. T7 RNT Pol tərəfindən həyata keçirilən transkripsiyaya faktiki müdaxilə edən bu fon ifadəsi bəzi nüvə faktorlarının T7 promotoruna bağlanması ilə əlaqədardır və bununla da RNT Pol II tərəfindən transkripsiyaya icazə verilir. Məsələn, mutant T7 promotorlarının -13 (A-dan T) və +1-dən (G-dən C-yə qədər) eyni vaxtda dəyişməsi ilə istifadəsi nüvə amilinin bağlanmasını əhəmiyyətli dərəcədə azaldır və nəticədə məməli hüceyrələrində T7 RNT Pol-dan asılı transkripsiyanın spesifikliyini artırır. 10 qat qədər (117).


T7 promotorunun sızması - Biologiya

F. William Studier, Brookhaven Milli Laboratoriyasında Baş Elm işçisi, 2004-cü ildə. 1980-ci illərdə Studier və əməkdaşlar qrupu T7 bakteriofaqının əsas təfərrüatlarını deşifrə etdilər və öyrəndiklərini çoxlu miqdarda arzu olunan zülalları istehsal etmək üçün bir sistemə çevirdilər. Bugünkü mRNA COVID-19 peyvəndlərinin istehsalı bu təməl kəşflərə əsaslanır.

Siz yəqin ki, eşitmisiniz ki, ABŞ-da COVID-19 ilə mübarizə üçün təsdiqlənmiş ilk iki peyvənd hüceyrələrimizə koronavirus sünbül zülalları yaratmağı öyrədən genetik material olan mRNA-dan ibarət sadə paketlərin nisbətən yeni inyeksiya üsulundan istifadə edir. Lakin bu mRNA paketlərinin kifayət qədər miqdarını yaratmaq texnologiyası 1980-ci illərə, o zaman ABŞ Enerji Departamentinin Brookhaven Milli Laboratoriyasının baş biofiziki F. William Studierin çox fərqli bir virusun molekulyar mexanizmindən istifadə etmək üçün bir üsul hazırladığı vaxta təsadüf edir. .

&ldquoOnilliklər əvvəl hazırlanmış elmi biliklərin və vasitələrin bu gün COVID-19 üçün həyat qurtaran mRNA vaksinlərinin istehsalı üçün istifadə edilməsi faktı, Enerji Departamentinin Milli Laboratoriyalarımızda fundamental tədqiqatlara uzunmüddətli investisiyalarının bu gün Amerika həyatını necə yaxşılaşdıra biləcəyinin gözəl nümunəsidir. və gələcəyə,&rdquo DOE-nin Elmlər Ofisinin Direktoru vəzifəsini icra edən Dr. Steve Binkley dedi.

1980-ci illərdə Studier, mərhum Con Dann və onların Brookhaven Laboratoriyasının Biologiya Departamentindəki qrupu T7 bakteriofaqının genomunun ardıcıllığını və şərhini tamamladı. T7 yoluxduran bir virusdur E. coli bakteriya və bu hüceyrələrə virusun surətlərini çıxarmağa əmr verir. Tam genom ardıcıllığına sahib olmaq alimlərə T7 genlərinin və digər elementlərin virusun bir çox nüsxəsini çoxaltmaq üçün necə birlikdə işlədiyini anlamağa kömək etdi.

Qısa müddətdən sonra Studier və komandası T7-nin məhsuldar surət çıxarma qabiliyyətini daha çox T7-dən başqa şeylər yaratmağa yönəltmək üçün bir yol tapdı. Onlar DNT genlərini messenger RNT-yə (mRNA) köçürən T7 RNT polimeraz fermentini klonladılar, hansı ki, amin turşuları olan hüceyrələrə müəyyən bir zülal yaratmaq üçün birləşməyə göstəriş verir. Komanda daha sonra bu T7 RNT polimerazını güclü T7 promotoru (genin transkripsiyası üçün &ldquostart&rdquo siqnalı kimi xidmət edən genetik element) ilə birlikdə demək olar ki, istənilən gendən böyük miqdarda RNT istehsal etmək üçün istifadə etdi. Bu RNT-lər, məsələn, mRNT əsaslı vaksinlərdə olduğu kimi birbaşa istifadə edilə bilər və ya T7 ifadə sistemində olduğu kimi zülallara çevrilmək üçün ribosomlara (hüceyrələrin zülal istehsal edən fabriklərə) çatdırıla bilər.

&ldquoDünyadakı elm adamları, son dörd onillikdə böyük miqdarda zülal və ya RNT yaratmaq üçün Billin &lsquoT7 ifadə sistemindən istifadə etdilər&rdquo, Tibb Tədqiqat Şurasının Molekulyar Biologiya Laboratoriyasından Nobel mükafatlı struktur bioloqu Venki Ramakrişnan dedi. Kembric, Böyük Britaniya. &ldquoYeni mRNA COVID-19 peyvəndləri məhz bu sistemdən istifadə edir&rdquo dedi.

Pfizer/BioNTech və Moderna tərəfindən idarə olunan istehsal zavodlarında, T7-dən əldə edilən promotorlar və fermentlər qollarımıza bir doz təlimat yeridildikdən sonra zülal əmələ gətirən hissəni yerinə yetirmək üçün öz hüceyrələrimizi tərk edərək bir anda kiloqram sünbül-protein mRNT-ni çıxarır. .

&ldquoBill-in əsas işi həyat qurtaran mRNT peyvəndlərini mümkün etdi&rdquo Ramakrishnan dedi.

Əsaslara qayıt

Bu sadələşdirilmiş qrafik T7 bakteriofaq infeksiyasını 1980-ci illərdə Brookhaven Laboratoriyasında hazırlanmış T7 ifadə sistemi ilə və bugünkü mRNA COVID-19 vaksinlərini hazırlamaq üçün T7 genetik elementlərinin istifadəsini müqayisə edir. Hər üçü T7 promotorundan gen transkripsiyasına başlamaq üçün siqnal kimi istifadə edir və DNT kodunu ribosomlara zülalların necə qurulacağını "deyən" mRNA təlimatlarına transkripsiya etmək üçün T7-dən əldə edilən RNT polimerazı. T7 infeksiyasında məhsul yeni viruslardır (T7 DNT və digər viral zülalların nüsxələrini əhatə edən zülal örtükləri). İfadə sistemi xüsusi bir arzu olunan protein istehsal edir. Peyvənd üçün mRNA-lar qollarımıza yeridilir bizim ribosomlar onlardan COVID-19 sünbül zülallarını hazırlamaq üçün istifadə edirlər. Bu virussuz sünbüllər, həqiqi virusla mübarizə aparmalı olsaq, immunitet sistemimizi hazır olmağa öyrədir.

William Studier T7 virusu ilə bağlı fundamental tədqiqatlarına Kaliforniya Texnologiya İnstitutunda biofizika üzrə aspirant kimi başlayanda və ya Brookhaven Laboratoriyasına qoşulduqdan sonra bu tədqiqatı davam etdirərkən peyvənd hazırlamaq barədə heç bir təsəvvürə malik deyildi.

&ldquoT7 1964-cü ildə Brukhavenə gələndə yaxşı öyrənilmiş bakteriofaq deyildi&rdquo dedi. &ldquoMən ondan DNT-nin xassələrini öyrənmək üçün istifadə edirdim və həmçinin onun molekulyar genetikasını və fiziologiyasını öyrənməyə qərar verdim. Mənim məqsədim, əlbəttə ki, T7 və onun necə işlədiyini mümkün qədər başa düşmək idi.&rdquo

Studier qeyd etdi ki, 1983-cü ildə T7 RNT polimeraza üçün genin klonlaşdırılması xüsusilə çətin idi.

&ldquoBaşqaları cəhd etdi və uğursuz oldu. Şirkətlər məndən soruşmuşdular ki, bizdə varmı,&rdquo dedi. &ldquoO zaman bizdə DNT ardıcıllığı var idi və düşündüm ki, klonlaşdırmanın niyə uğursuz olduğunu və problemi necə həll edəcəyimi başa düşdüm.&rdquo

Studier problemin öhdəsindən gəlmək üçün sonra doktoranturada çalışan Parichehre Davanloo və baş laboratoriya üzvü Alan Rosenberg ilə işləmişdir. John Dunn T7 RNT polimerazını təmizlədi və onun böyük miqdarda RNT istehsal etdiyini göstərdi. O zaman aspirant olan Barbara Moffatt Studier ilə birlikdə bu kəşfləri T7 ifadə sisteminə çevirmək üçün çalışdı.

&ldquoThe Brookhaven Lab patent müvəkkili bizim nə etdiyimizi bilirdi və məncə, Brookhaven-də Bayh-Dole Aktı çərçivəsində ilk patenti təqdim etdik&rdquo 1980-ci ildə Konqres tərəfindən qəbul edilmiş qanunla institutlara və qrant alanlara ixtiralara patent və lisenziya hüququ verir. hökumət tərəfindən maliyyələşdirilən tədqiqatdan, Studier izah etdi.

Qalanı tarixdir. T7 ifadə sistemi daha sonra Brookhaven Lab-ın ən müvəffəqiyyətli texnologiyasına çevrildi, dünyada tədqiqat laboratoriyaları ondan istifadə edir və yüzlərlə şirkət məhsul istehsal etmək üçün texnologiyaya lisenziya verir. Patentlərin müddəti bitsə də, T7 hələ də hər yerdə biokimyaçılar üçün əsas sistemdir.

&ldquoT7 RNT polimeraza güclü T7 promotoruna bitişik istənilən DNT-dən böyük miqdarda RNT sintez edə bilir. Mən müqayisə edilə bilən bir şeyin olub-olmadığını bilmirəm” dedi Studier.

Brookhaven Laboratoriyasının Biologiya Departamentinin sədri Con Şenklin də bu fikirdədir. &ldquoT7 polimeraza və promotor o qədər effektivdir ki, onlar eyni anda milyonlarla vaksin dozası üçün kifayət qədər mRNT istehsal etməyə imkan verir. Bill-in kəşfləri bütün dünyada insanları COVID-19-dan qorumaq üçün istehsalın sürətlə genişləndirilməsini mümkün etməkdə böyük rol oynadı.&rdquo

Bu yaxınlarda peyvənd olunanlardan ikisi Bill Studier və həyat yoldaşı Sue.

&ldquoT7 RNT polimerazanın RNT peyvəndlərinin hazırlanmasında iştirak edə biləcəyini təsadüfən maraqlandırırdım&rdquo indi yüksək dərəcəli biofizik Emeritus Studier haqqında fikirləşdi. &ldquoƏsas tədqiqatlar demək olar ki, həmişə faydalıdır və işimin bu pandemiyaya qarşı güclü peyvəndlərin əldə edilməsində faydalı olmasından məmnunam.&rdquo

1970, 1972 (Poli Uinston ilə), 1978 və 1984-cü illərdə (Con Dann ilə) çəkilmiş William Studierin tarixi şəkillərinin slayd şousu. Slayd şou idarəetmələrini aşkar etmək üçün şəklin üzərinə sürüşdürün.

F. William Studier B.S. 1958-ci ildə Yaledən biofizika üzrə fəlsəfə doktoru, sonra isə Ph.D. 1963-cü ildə Kaliforniya Texnologiya İnstitutundan. O, Stenford Universiteti Tibb Fakültəsinin Biokimya Departamentində doktoranturadan sonrakı tədqiqatçı kimi çalışıb, sonra 1964-cü ildə Brookhaven Laboratoriyasının Biologiya Departamentinə biofizik köməkçisi kimi qoşulub. İllər keçdikcə Studier kafedranın rəhbər vəzifələrində yüksəldi, 1971-ci ildə vəzifə aldı və 1974-cü ildə baş biofizik oldu. O, 1990-1999-cu illərdə Biologiya kafedrasının müdiri vəzifəsində çalışdı və sonra yenidən tədqiqata qayıtdı. O, həmçinin Stony Brook Universitetində biokimya üzrə köməkçi professor vəzifəsində çalışıb. Onun nailiyyətləri 1990-cı ildə Amerika İncəsənət və Elmlər Akademiyasına, 1992-ci ildə Milli Elmlər Akademiyasına və 2007-ci ildə Elmin İnkişafı üzrə Amerika Assosiasiyasının üzvü seçilməklə tanınıb. 2015-ci ildə Baş Elm Xadimi adına layiq görülüb. Brookhaven Laboratoriyasında təhsil almış və 2018-ci ildə Milli İxtiraçılar Akademiyasının üzvü seçilmişdir. O, T7 sistemində olanlar da daxil olmaqla 9-u lisenziyalaşdırılmış və kommersiyalaşdırılmış 15 patentə malikdir.

Studierin Brookhaven Laboratoriyasında apardığı tədqiqat DOE of Science (BER) tərəfindən dəstəklənib.


Çəkilişin arxasındakı elm: Brookhaven laboratoriyasında hazırlanmış biotexnoloji alətlər COVID-19 vaksinlərinin hazırlanması üçün əsasdır

25 may 2021-ci il 13:16 ET | Mənbə: Brookhaven Milli Laboratoriyası Brookhaven Milli Laboratoriyası

Upton, Nyu-York, Amerika Birləşmiş Ştatları

Upton, NY, 25 may 2021-ci il (GLOBE NEWSWIRE) -- Yəqin eşitmisiniz ki, ABŞ-da COVID-19 ilə mübarizə üçün təsdiqlənmiş ilk iki peyvənd nisbətən yeni bir yanaşmadan istifadə edir - genetik material olan mRNA olan sadə paketlərin inyeksiyasından istifadə edir. hüceyrələrimizə koronavirus sünbül zülalları yaratmağı tapşırır. Lakin həmin mRNA paketlərinin kifayət qədər miqdarını yaratmaq texnologiyası 1980-ci illərə, o zaman ABŞ Enerji Departamentinin Brookhaven Milli Laboratoriyasının baş biofiziki F. William Studierin çox fərqli bir virusun molekulyar mexanizmindən istifadə etmək üçün bir üsul hazırladığı vaxta təsadüf edir. .

“Onilliklər əvvəl hazırlanmış elmi biliklərin və vasitələrin hazırda COVID-19 üçün həyat qurtaran mRNA vaksinlərinin istehsalı üçün istifadə edilməsi faktı, Enerji Departamentinin Milli Laboratoriyalarımızda fundamental tədqiqatlara uzunmüddətli investisiyalarının Amerikanın həyatını necə yaxşılaşdıra biləcəyinə gözəl bir nümunədir. bu gün və gələcəyə,” DOE-nin Elm Ofisinin Direktoru vəzifəsini icra edən Dr. Stiv Binkli bildirib.

1980-ci illərdə Studier, mərhum Con Dann və onların Brookhaven Laboratoriyasının Biologiya Departamentindəki qrupu T7 bakteriofaqının genomunun ardıcıllığını və şərhini tamamladı. T7 yoluxduran bir virusdur E. coli bakteriya və bu hüceyrələrə virusun surətini çıxarmağa əmr verir. Tam genom ardıcıllığına sahib olmaq alimlərə T7 genlərinin və digər elementlərin virusun bir çox nüsxəsini çoxaltmaq üçün necə birlikdə işlədiyini anlamağa kömək etdi.

Qısa müddətdən sonra Studier və onun komandası T7-nin məhsuldar surət çıxarma qabiliyyətini daha çox T7-dən başqa şeylər yaratmağa yönəltmək üçün bir yol tapdı. Onlar T7 RNT polimerazını klonladılar - DNT genlərini messencer RNT-yə (mRNA) köçürən ferment, amin turşularının müəyyən bir zülal yaratmaq üçün birləşdiyi hüceyrələrə göstəriş verir. Komanda daha sonra bu T7 RNT polimerazını güclü T7 promotoru (genin transkripsiyası üçün “başlanğıc” siqnalı kimi xidmət edən genetik element) ilə birlikdə demək olar ki, istənilən gendən böyük miqdarda RNT istehsal etmək üçün istifadə etdi. Bu RNT-lər mRNT əsaslı vaksinlərdə olduğu kimi birbaşa istifadə edilə bilər və ya T7 ifadə sistemində olduğu kimi zülallara çevrilmək üçün ribosomlara (hüceyrələrin zülal istehsal edən fabriklərinə) çatdırıla bilər.

Tibb Tədqiqat Şurasının Molekulyar Laboratoriyasından Nobel mükafatlı struktur bioloq Venki Ramakrişnan deyir: “Dünyadakı elm adamları son dörd onillikdə böyük miqdarda zülal və ya RNT yaratmaq üçün Billin “T7 ifadə sistemindən” istifadə ediblər. Biologiya, Kembric, Böyük Britaniya. "Yeni mRNA COVID-19 peyvəndləri məhz bu sistemdən istifadə edir" dedi.

Pfizer/BioNTech və Moderna tərəfindən idarə olunan istehsal zavodlarında, T7-dən əldə edilən promotorlar və fermentlər bir anda kiloqram sünbül-protein mRNT-ni çıxarır - qollarımıza bir doz təlimat yeridildikdən sonra protein istehsal hissəsini yerinə yetirmək üçün öz hüceyrələrimizi tərk edirlər. .

"Billin fundamental işi həyat qurtaran mRNT vaksinlərini mümkün etdi" dedi Ramakrishnan.

Uilyam Studier T7 virusu ilə bağlı fundamental tədqiqatlarına Kaliforniya Texnologiya İnstitutunda biofizika üzrə aspirant kimi başlayanda və ya Brookhaven Laboratoriyasına qoşulduqdan sonra bu tədqiqatı davam etdirərkən peyvənd hazırlamaq barədə heç bir təsəvvürə malik deyildi.

"Mən 1964-cü ildə Brukhavenə gələndə T7 yaxşı öyrənilmiş bakteriofaq deyildi" dedi. “Mən ondan DNT-nin xüsusiyyətlərini öyrənmək üçün istifadə edirdim və onun molekulyar genetikası və fiziologiyasını da öyrənməyə qərar verdim. Məqsədim, əlbəttə ki, T7 və onun necə işlədiyini mümkün qədər anlamaq idi”.

Studier qeyd etdi ki, 1983-cü ildə T7 RNT polimeraza üçün genin klonlanması xüsusilə çətin idi.

“Başqaları cəhd etdi və uğursuz oldu. Şirkətlər məndən bunun bizdə olub-olmadığını soruşdular” dedi. "O zaman bizdə DNT ardıcıllığı var idi və düşündüm ki, klonlaşdırmanın niyə uğursuz olduğunu və problemi necə həll edəcəyimi başa düşdüm."

Studier problemin öhdəsindən gəlmək üçün sonra doktoranturada çalışan Parichehre Davanloo və baş laboratoriya üzvü Alan Rosenberg ilə işləmişdir. John Dunn T7 RNT polimerazını təmizlədi və onun böyük miqdarda RNT istehsal etdiyini göstərdi. O zaman aspirant olan Barbara Moffatt Studier ilə birlikdə bu kəşfləri T7 ifadə sisteminə çevirmək üçün çalışdı.

“Brukhaven Laboratoriyasının patent müvəkkili nə etdiyimizi bilirdi və mən hesab edirəm ki, Bayh-Dole Qanununa əsasən Brookhaven-də ilk patenti təqdim etdik” – Konqres tərəfindən 1980-ci ildə qəbul edilmiş və institutlara və qrant alanlara patent və lisenziya hüquqlarına icazə verən qanun. ixtiralar hökumət tərəfindən maliyyələşdirilən tədqiqatlardan qaynaqlanır, Studier izah etdi.

Qalanı tarixdir. T7 ifadə sistemi daha sonra Brookhaven Laboratoriyasının ən uğurlu texnologiyasına çevrildi, dünyada tədqiqat laboratoriyaları ondan istifadə edir və yüzlərlə şirkət məhsul istehsal etmək üçün texnologiyaya lisenziya verir. Patentlərin müddəti bitsə də, T7 hələ də hər yerdə biokimyaçılar üçün əsas sistemdir.

“T7 RNT polimerazı güclü T7 promotoruna bitişik hər hansı DNT-dən böyük miqdarda RNT sintez edə bilər. Müqayisə edilə bilən bir şey olub olmadığını bilmirəm "dedi Studier.

Brookhaven Laboratoriyasının Biologiya Departamentinin sədri Con Şenklin bununla razılaşır. “T7 polimeraza və promotor o qədər effektivdir ki, onlar eyni anda milyonlarla vaksin dozası üçün kifayət qədər mRNT istehsal etməyə imkan verir. Billin kəşfləri bütün dünyada insanları COVID-19-dan qorumaq üçün istehsalın sürətlə genişləndirilməsini mümkün etməkdə böyük rol oynadı.

Bu yaxınlarda peyvənd olunanlardan ikisi Bill Studier və həyat yoldaşı Sue.

"T7 RNT polimerazının RNT peyvəndlərinin hazırlanmasında iştirak edə biləcəyini təsadüfən merak etdim" dedi indi baş biofizik Emeritus Studier. "Əsas tədqiqatlar demək olar ki, həmişə faydalıdır və işimin bu pandemiyaya qarşı güclü peyvəndlərin əldə edilməsində faydalı olmasından məmnunam."

F. William Studier B.S. 1958-ci ildə Yaledən biofizika üzrə fəlsəfə doktoru, sonra isə Ph.D. 1963-cü ildə Kaliforniya Texnologiya İnstitutundan. O, Stenford Universiteti Tibb Fakültəsinin Biokimya Departamentində doktoranturadan sonrakı tədqiqatçı kimi çalışıb, sonra 1964-cü ildə Brookhaven Laboratoriyasının Biologiya şöbəsinə biofizik köməkçisi kimi qoşulub. İllər keçdikcə Studier kafedranın sıralarında yüksəldi, 1971-ci ildə vəzifə aldı və 1974-cü ildə baş biofizik oldu. O, 1990-1999-cu illərdə Biologiya kafedrasının müdiri vəzifəsində çalışdı və sonra tədqiqata qayıtdı. O, həmçinin Stony Brook Universitetində biokimya üzrə köməkçi professor vəzifəsində çalışıb. Onun nailiyyətləri 1990-cı ildə Amerika İncəsənət və Elmlər Akademiyasına, 1992-ci ildə Milli Elmlər Akademiyasına və 2007-ci ildə Elmin İnkişafı üzrə Amerika Assosiasiyasının üzvü seçilməklə tanınıb. 2015-ci ildə Baş Elm Xadimi adına layiq görülüb. Brookhaven Laboratoriyasında təhsil almış və 2018-ci ildə Milli İxtiraçılar Akademiyasının üzvü seçilmişdir. O, T7 sistemində olanlar da daxil olmaqla 9-u lisenziyalaşdırılmış və kommersiyalaşdırılmış 15 patentə malikdir.

Studier-in Brookhaven Lab-da apardığı tədqiqat DOE of Science (BER) tərəfindən dəstəklənib.


Biokimya və Molekulyar Biologiya

4.14.3.3.1.2 Bombyx mori sitoplazmik aktin promotoru

Güclü lepidopteran ifadə kaseti, pIE1/153A, bu yaxınlarda Kalqari Universitetində Dr Kostas Iatrounun laboratoriyasında hazırlanmışdır. Kaset ipək güvəsindən istifadə edir ( B. mori) sitoplazmik aktin gen promotoru (Mounier və Prudhomme, 1986 Johnson və b., 1992), müxtəlif transfeksiya edilmiş lepidopteran hüceyrə xətlərində də aktiv olan daha güclü konstitutiv hüceyrə promotorlarından biridir. Bu hüceyrə promotorundan transkripsiyanın dərhal erkən gen məhsulu tərəfindən stimullaşdırıldığı aşkar edilmişdir (yəni-1) of BmNPV, IE-1, stimullaşdıra bilən transkripsiya faktoru in vitro aktin promotorundan transkripsiya sürəti trans 100 dəfəyə qədər (Lu və b., 1996). Aktin promotorunun iki böyüklük sırasına qədər stimullaşdırılması da bağlanmaqla əldə edilmişdir cis aktin promotoruna nisbətən müxtəlif istiqamətlərdə BmNPV-nin homoloji təkrar 3 (HR3) bölgəsi (Lu). və b., 1997). Əlaqəsi yəni-1 gen və pIE1/153A ifadə kasetində aktin gen promotoru ilə HR3 gücləndirici element iki reportyor zülal üçün keçici ekspressiya analizlərində aktin promotoru tərəfindən yönəldilmiş xarici gen ifadəsinin təxminən 5000 dəfə stimullaşdırılması ilə nəticələndi (Lu). və b., 1997). Hüceyrələri ekspressiya kaseti və hiqromisin B, puromisin və ya G418-ə qarşı müqavimət göstərən ikinci plazmidlə kotransfektsiya etməklə sabit hüceyrə xətləri yaradılmışdır. Bu sistemlə transformasiya edilmiş sabit hüceyrə xətlərindən ifraz olunan zülalların bildirilmiş ifadə səviyyələri, bakulovirus ifadə sistemi ilə əldə edilənləri çox ötüb keçib (Farrell). və b., 1998 Farrell və b., 1999). Bundan əlavə, plazmid ifadəsi müxtəlif lepidopteran hüceyrə xətlərində, o cümlədən onlardan əldə edilənlər də fəaliyyət göstərir. B. mori, T. ni, Plodia interpuntella, L. dispar, Mamestra brassicae, C. fumiferana, və S. frugiperda (Keyt və b., 1999). İfadə kaseti, həmçinin transfeksiyadan sonra 5 gün ərzində litr başına onlarla milliqram rekombinant zülal verə bilən (Farrel və Iatrou, 2004) (Şəkil 5), bununla da vaxt aparan və zəhmət tələb edən prosesdən qaçan genişləndirilmiş keçici ifadə protokolları üçün uyğundur. stabil antibiotik seçimi və yüksək ekspressorların klonlaşdırılması. pIE1/153A ifadə kasetinin törəmələrini Dr Iatrou-dan əldə etmək olar.

Şəkil 5. pIE1/ istifadə edərək asma kulturasında High Five™ hüceyrələrinin lipofektin vasitəçiliyi ilə transfeksiyasından histidinlə işarələnmiş insan ifraz olunan qələvi fosfatazanın (SEAP lütfən Eric Carpentier və Amine Kamen, Biotexnologiya Tədqiqat İnstitutu, Monreal, Kanada tərəfindən təmin edilib) keçici ekspressiyası və yaxınlığının təmizlənməsi. 153A ifadə kaseti. Coomassie mavi rəngə boyanmış gel üzərində bir sıra iribuynuzlu heyvanların serum albumin kütlə standartları ilə müqayisədə, transfeksiyadan və zülalsız ESF-921 mühitində istehsal edildikdən 5 gün sonra kultura supernatantında təxminən 50 μg ml −1 SEAP mövcud olmuşdur (zolağı işarələnmişdir). “-” işarəli nəzarətlə müqayisədə “+”). 50 ml kultura supernatantından Ni-ion yaxınlığının təmizlənməsindən sonra bir elüsiya fraksiyasından (E) iki milliqram SEAP götürüldü.


T7 promotorunun sızması - Biologiya

Şəkil: PNG formatında təsvir edilmiş plazmid xəritəsi

GenBank Faylı: Plazmid ardıcıllığı və annotasiyalar. Ardıcıllığa baxmaq üçün mətn redaktoru və ya plazmid xəritəçəkmə proqramından istifadə edin.

SnapGene Faylı: Plazmid ardıcıllığı və SnapGene təkmilləşdirilmiş annotasiyalar. Əlavə məlumatları vizuallaşdırmaq və digər ardıcıllığı uyğunlaşdırmaq üçün SnapGene proqramı və ya pulsuz Viewer ilə istifadə edin.

PCMV-T7-EGFP üçün Addgene Tam Ardıcıllıq Xəritəsi (BPK1098)

PCMV-T7-EGFP (BPK1098) üçün xəritə şəkli

Əmanətçi tərəfindən yüklənmiş xəritə.

Nəzərə alın: Brauzeriniz Addgene saytında istifadə olunan funksiyaları dəstəkləmir. Brauzerinizi təkmilləşdirənə qədər siz bu vebsayt vasitəsilə hesab yarada və ya plazmid tələb edə bilməyəcəksiniz. Daha ətraflı

Nəzərə alın: Brauzeriniz Addgene saytında istifadə olunan bəzi funksiyaları tam dəstəkləmir. Qeydiyyatdan keçmək, depozit qoymaq və ya sifariş verməklə hər hansı problemlə üzləşsəniz, [email protected] vasitəsilə bizimlə əlaqə saxlayın Ətraflı məlumat əldə edin


Promotor T7 ifadəsi - (19 iyun 2011)

Hər kəslə müzakirə edəcəyim bir salfetim var və hamınızın köməyini bölüşməyi səbirsizliklə gözləyirəm. Hazırda mən E.coli-də likopen fermentinin biosintezini kodlayan genlərin dizayn ifadə vektorunun tədqiqini aparıram. Burada istifadə etdiyim vektor ifadəsi pRSET-A və ana hüceyrə kimi alfa ştammları DH5 alfadır. pRSET-A, gen T7 promotoru tərəfindən idarə olunan sistemə qoşulacaq, bu promotor T7 RNT polimeraz fermentinin transkripsiyasının baş verməsini tələb edir. Bu ferment olmadan DH5 alfa gərginliyində. Bununla belə, likopen koloniyalarının ifadəsini əldə etdik. Bəs niyə bu baş verir?

"Toxuma" varmı? hahaha. bağışlayın, sadəcə zarafat edirəm

Əvvəlcə DH5 alfa fermentinin likopen biosintezini kodlayan genlərin olmadığını təsdiqlədinizmi? DH5 alfanın bu geni ehtiva etdiyini təxmin edirdim. buna görə ifadəni yoxlayanda təbii ki, zülal alacaqsan. Host-plazmid arasında uyğunluq əldə etmək çox vacibdir.. Əgər siz e.coli-də hansısa geni ifadə etmək istəyirsinizsə, əmin olun ki, həmin hostda belə gen var. Əgər DH5alpha-nın həmin geni ehtiva etdiyinə əmin deyilsinizsə, əvvəlcə hüceyrəni yetişdirməyə çalışın

1. Plazmidsiz DH5alpha ifadəsini yoxlayın.
2.pRSET-A plazmidi ilə DH5 alfa ifadəsini yoxlayın (IPTG əlavə edilmir)
3. PRSER-A plazmidi ilə DH5 alfa ifadəsini yaradın və bir az IPTG konsentrasiyası əlavə edin.

Yaxşı, bundan nə gözləyirik:
bütün zolaqlar üçün zolaq əldə etsəniz, eyni ifadə səviyyəsi deməkdir.. vəhşi DH5alpha növü fermenti kodlayan geni ehtiva edir,
Əgər (3.) daha qalın ifadə əldə etsəniz, T7 promouterinin həqiqətən işlədiyi deməkdir, çünki hamımız bilirik ki, T7 IPTG-nin olması ilə induksiya edilə bilər. (2) və (3) arasında heç bir fərq olmadığını görürsünüzsə.. o deməkdir ki, burada T7 polimeraza problem deyil (hətta salfet də deyil. Yalnız zarafat etmək lazımdır). ev sahibindən gəldi. geni ifadə edə bilən ev sahibi (çünki gen orijinal promotoru olan genomda var).

belə halda, bu geni itirən başqa bir E.coli-dən istifadə etməyə çalışın. Mən sizə aydın dedim? düzgün host sizə IPTG ilə induksiya etmədən əvvəl və sonra fərqli göstərəcək

Beynimdən keçən bu idi

Düşünürəm ki, E. coli likopeni təbii olaraq yaradır, amma səhv edə bilərəm. Çox güman ki, transkripsiya sizdə tanımadığınız promouterdən baş verir. This could be a cryptic promoter in your operon, or read-through transcription from a promoter on the plasmid. You might try putting your operon in the reverse orientation in your plasmid. Or changing plasmids to one that reduces this read-through (Lucigen makes some, I believe).

I don't understand. how can putting the operon in reverse orientation in the plasmid can help?

p/s: hmn. lucigen. lately I heard people talked about it quite frequently. a new company?

If you have transcription activity arising from the plasmid, then the direction of the insert can determine if the transcript is in the sense or anti-sense direction. Lucigen is a U. Wisconsin Madison spinout that has been around for about 5-7 years, I think. They make a series of interesting cloning vectors.


Optimization of a T7-RNA polymerase system in Synechococcus sp. PCC 7002 mirrors the protein overproduction phenotype from E. coli BL21(DE3)

With the goal of expanding the diversity of tools available for controlling gene expression in cyanobacteria, the T7-RNA polymerase gene expression system from E. coli BL21(DE3) was adapted and systematically engineered for robust function Sinekokokk sp. PCC 7002, a fast-growing saltwater strain. Expression of T7-RNA polymerase was controlled via LacI regulation, while functionality was optimized by both further tuning its expression level along with optimizing the translation initiation region of the expressed gene, in this case an enhanced YFP reporter. Under high CO2 conditions, the resulting system displayed a 60-fold dynamic range in expression levels. Furthermore, when maximally induced, T7-RNA polymerase-dependent protein production constituted up to two-thirds of total cellular protein content in Sinekokokk sp. PCC 7002. Ultimately, however, this came at the cost of 40% reductions in both biomass and pigmentation levels. Taken together, the developed T7-RNA polymerase gene expression system is effective for controlling and achieving high-level expression of heterologous genes in Sinekokokk sp. PCC 7002, making it a valuable tool for cyanobacterial research.

Əsas Nöqtələr

• Promoter driving T7-RNA polymerase was optimized.

• Up to 60-fold dynamic range in expression, depending on CO 2 şərtlər.


MÜZAKİRƏ

The conditional lethal system presented here consists of the streptavidin gene as a key suicide element. The biotin-binding ability of streptavidin in P. putida is notable because it requires not only proper peptide folding but also formation of the correct tetrameric structure. So far, there are only several genes that have been proven to be bactericidal upon expression in the members of genus Pseudomonas. These are genes encoding cell membrane destabilizing peptides Hok (E. coli plasmid R1) (22) and Gef (E. coli) (23), lysis genes of bacteriophages λ and φX174 (24), and the colE3 gene encoding an RNase (E. coli) (25). It is also worth mentioning that the T7 lysozyme maintains its T7 RNA polymerase inhibition ability in a heterologous P. putida sistemi.

The rate of inactivation, a basic determinant of the efficiency of suicide designs, in our stv-based system is 10 −7 –10 −8 per cell per generation. This value is lower than those already reported for constructs based on single toxic functions (10 −2 –10 −6 ), even in E. coli, which is easier to contain (9, 23, 26, 27). It apparently reflects the very low basal level of streptavidin in cells. Despite the fact that the coupled T7 transcription/LacI-Olak system is less leaky than the lak system alone (Table 1), an additional explanation of the better protection of cells against uninduced expression of the stv gene is synthesis of the antisense RNA originating from the Pm təşviqatçı. The lack of such protection, especially without a transcription terminator (e.g., LacI-Olak complex) upstream of φ10 as in pVLTΔ-s02, resulted in a remarkably higher mutation frequency of 10 −4 –10 −5 per cell per generation. The LacI-Olak complex formed upstream of the φ10 in pCC-s04 apparently interferes also with binding of bacteriophage RNA polymerase to the φ10 promoter (slower induction of the stv gene expression upon removal of 3MB) and further decreases the frequency of appearance of killing-resistant clones by reducing uninduced transcription of the stv gen. Preliminary data on the killing of E. coli by IPTG-induced expression of the stv gene suggest that, as expected, this system should be effective also in enteric bacteria.

A temperature shift from 30°C to 20°C alters the kinetics of the culture decay. This effect was more pronounced in a bacterial population depleted of 3MB in the absence of IPTG, indicating a contribution of both weaker interaction of T7 RNA polymerase with φ10 and the longer lifetime of the LacI repressor and/or its mRNA within a cell. Continuing decline of the culture after the addition of IPTG indicates a lower rate of mutational inactivation of the construct at 20°C than at 30°C.

The suicide design was tested under rich nutrient conditions—i.e., in LB medium containing some biotin. The growth conditions were favorable for cell survival, since killing occurs by depletion of biotin. In fact, slightly higher levels of IPTG-induced cell death were observed in minimal M9 medium (not shown). Under mostly starving conditions in, for instance, soil or seawater, this system may perform even more effectively. A SmaI fragment of pCC-s05 containing xylS2, lacI, və stv genes (Fig. 2B) has been already stably integrated into P. putida chromosome via mini-Tn5-mediated transposition (data not shown). Other known killing genes will be placed under control of φ10 promoter and integrated into the chromosome of P. putida <hsdR1 stv lacI xylS2 Kan r > to create multiple back up systems following incorporation of the T7 RNA polymerase-lysozyme regulatory module. Alternatively, stability of pRO-ilp upon induction of suicide in the absence of selection for plasmid maintenance can be achieved, for instance, by inserting into it the parB (hok/sok) locus of R1.

To summarize, additional regulatory circuits arranged to reduce the basal level of the expression of killing gene can remarkably increase the effectiveness of cell suicide machinery. Because of the general demand of biotin as a carboxyl carrier in the living world, the stv gene can serve as a universal cassette for programmed cell death. The stv-based system in combination with, for example, biotinylated solid supports and biotinylated fluorescent probes could also allow very sensitive monitoring of the presence of recombinant microorganisms.


Videoya baxın: مريم الدباغ ساخن (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Reid

    Sən haqlısan.

  2. Faujora

    A good option

  3. Wynter

    İş axtarışınıza başlamazdan əvvəl resursumuzda işçilərin iş yerləri ilə bağlı tövsiyələrini oxuyun. Və yalnız bundan sonra öz təklifinizi bu və ya digər şirkətə təqdim edib-etməyəcəyinə qərar verin. Müxtəlif tövsiyələri nəzərdən keçirin və düzgün seçim edin.

  4. Golkree

    Belə bir şey tərk etmir

  5. Tauk

    I am sorry, it not absolutely that is necessary for me. There are other variants?

  6. Howie

    Əvvəllər fərqli düşünürdüm, məlumat üçün çox sağ olun.



Mesaj yazmaq