Məlumat

Illumina ardıcıllığında Y-formalı adapterlərin məqsədi nədir?

Illumina ardıcıllığında Y-formalı adapterlərin məqsədi nədir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Y kitabxanadakı hər bir molekulun 5' və 3' uclarına tavlanacaq müxtəlif ardıcıllıqları adapterlər.

Y-nin qolları unikaldır və DNT parçası ilə əlaqəli orta hissə tamamlayıcıdır.

Bunun üstünlükləri nələrdir?

Tam tamamlayıcı adapterlərə (ADAPTER1 - - - - - ADAPTER1) malik olmağımla bağlı fikrim budur:

-Praymerin tavlanmasından sonra primer öz növbəsində DNT fraqmentinin başlanğıcı VƏ sonuna bağlanacaq və beləliklə sintezin sonuna qədər davam etməsinə imkan verməyəcək. Buna görə də, növbəti primerin fraqmentin başlanğıcında bağlamaq üçün şablonu olmayacaq...

Y-formalı adapterlər də qoşalaşmış uc ardıcıllığına imkan verir. Fraqmentlərin hər iki ucunda unikal ardıcıllığı var ki, bu da ilk "qaçış"a bütün molekulların bir tərəfini ardıcıllıqla sıralamağa, sonra tərsini sintez etməyə və ardıcıllığı sintez etməyə imkan verir.

Mən doğru yoldayam?


Normalda, iki unikal adapterə ehtiyacınız olduqda, deyək ki, A və B, naməlum daxiletmə ardıcıllığının hər iki ucunda, birləşdirici ucun ligasyonu çətindir, çünki daxiletmə ardıcıllığı "naməlum"dur. Beləliklə, siz Naməlum Əlavələr + adapter A + adapter B ehtiva edən reaksiyada küt uclu adapter bağlaması etməlisiniz. Bu, əlavə ilə bağlanmış məhsulun 3 mümkün versiyası ilə nəticələnə bilər: A-insert-A, B-insert-B və A-insert-B, bunların arasında yalnız A-insert-B tək arzu olunan məhsuldur.

1) A-quyruqlu əlavələrin Y-adapterləri ilə bağlanması sizə 100% verir A-insert-B.

2) İndi əlavəyə istiqamət təyin edək - deyək ki, 1-ci bazadan 400-cü bazaya qədər. Y-adapter liqasiyasından sonra hər bir daxiletmə üçün 2 növ insertlə bağlanmış məhsulunuz olacaq: A-Daxil edin (1-->400)-BA-Daxil et(400-->1)-B, hər ikisi çox faydalıdır. Hər biri ayrıca klonal klaster yaradacaq və siz daxiletmənin həm 1-ci bazasından, həm də 400-cü bazasından başlayaraq ardıcıllıq məlumatı alacaqsınız, çünki tək oxunan ardıcıllıqda alət həmişə Adapter A-dan ardıcıllıq verir. Bununla belə, hər iki ardıcıllığın aşağıdakılara aid olduğunu bilmək üçün eyni insert, biri qoşalaşmış son ardıcıllığı etmək lazımdır.


NGS Adapterləri

NGS oliqoslarınızdakı çirklənmə sizi çaşdırırmı?

NGS təcrübənizdə kitabxana tikintisinin səmərəliliyindən narahatsınız?

NGS oliqosunun yüksək keyfiyyət standartlarından xəbəriniz varmı?

Yeni Nəsil Sıralama (NGS) yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı, yüksək dəqiqlik və toplanmış məlumat bolluğu səbəbindən genetik xəstəliklər və xərçəng, qeyri-invaziv prenatal test (NIPT) və dəqiq tibb də daxil olmaqla bir çox klinik diaqnostika sahələrində geniş istifadə edilmişdir. Müvafiq olaraq, NGS oliqoslarının yüksək keyfiyyət standartları adətən standart oliqolara tətbiq edilən təmizlik və dəqiqlikdən kənara çıxır. Bundan əlavə, NGS nəticələrinə təsir edəcək digər standartlar da nəzərə alınmalıdır, məsələn, çarpaz çirklənmə və dəqiq kəmiyyət müəyyənləşdirmə.

GenScript, Illumina Truseq və Nextera ilə uyğun gələn həm bağlama, həm də etiketləmə kitabxanasının hazırlanması üçün NGS adapterləri təqdim edir. Biz rəfdəki unikal ikili indeksli (UDI) adapter cütləri və ardıcıllıq platformanıza uyğun fərdi adapterlər təklif edirik. Bizim ciddi QC sənaye standartından daha aşağı çarpaz çirklənmə dərəcəsinə zəmanət verir.


Başlayanlar üçün növbəti nəsil ardıcıllığı

Bu resurslar yeni başlayanlar üçün nəzərdə tutulmuş növbəti nəsil ardıcıllığın (NGS) əsas mövzularını əhatə edir. Biz sizə iş prosesi, dərsliklər və ilk təcrübənizi planlaşdırarkən bələdçilik edəcəyik.

NGS-nin Ümumdünya Təsiri

Gələcək nəsil ardıcıllığı tədqiqatda inqilab edir və əvvəllər mümkün olmayan təcrübələrə imkan verir.

NGS-nin Ümumdünya Təsiri

Gələcək nəsil ardıcıllığının üstünlükləri

NGS-ni digər texnologiyalarla müqayisə edin və bunun sizə və tədqiqat məqsədlərinizə uyğun olub-olmadığına baxın.

NGS və Sanger Sequencing

Texnologiyalar arasındakı əsas fərqləri öyrənin və NGS-nin nə vaxt daha effektiv seçim ola biləcəyinə baxın.

NGS və qPCR

NGS-nin qPCR ilə müqayisədə necə daha yüksək kəşf gücü təklif etdiyini kəşf edin və bu, variasiyanın kəmiyyətini müəyyən etmək üçün faydalı üsuldur.

NGS və mikroarraylar

NGS ilə RNT ardıcıllığının niyə yeni transkriptləri aşkar etmək üçün geniş dinamik diapazon və yüksək həssaslıq təklif etdiyini öyrənin.

NGS necə işləyir

Əsas növbəti nəsil ardıcıllıq prosesi DNT/RNT-nin bir neçə hissəyə parçalanmasını, adapterlərin əlavə edilməsini, kitabxanaların ardıcıllığını və genomik ardıcıllıq yaratmaq üçün onların yenidən yığılmasını əhatə edir. Prinsipcə, konsepsiya kapilyar elektroforezə bənzəyir. Kritik fərq ondan ibarətdir ki, NGS milyonlarla fraqmentləri kütləvi şəkildə paralel şəkildə ardıcıllıqla sıralayır, sürəti və dəqiqliyi artırır, eyni zamanda ardıcıllığın dəyərini azaldır.

NGS necə işləyir

NGS İş Aktınız

Hazırlayın
Ardıcıllıq
Təhlil edin

Növbəti nəsil ardıcıllığı üç əsas addımı əhatə edir: kitabxananın hazırlanması, ardıcıllıq və məlumatların təhlili. Hər bir addıma hazırlaşmağınıza kömək edəcək resursları tapın və ümumi NGS tətbiqi olan mikrobların bütün genom ardıcıllığı üçün iş axını nümunəsinə baxın.

Başlayanlar üçün NGS Dərslikləri

NGS ilə işə başlamaq gözlədiyinizdən daha asan ola bilər. İş prosesində əsas addımların hər biri üçün pulsuz dərsliklərimizə baxın. Laboratoriyanız üçün üz-üzə və ya virtual olaraq fərdiləşdirilmiş təlim istəyirsiniz? Biz də bunu təklif edirik.

NGS Büdcəsinin Planlaşdırılması

Son illərdə NGS-nin qiyməti kəskin şəkildə azaldı və bu, bütün ölçülü laboratoriyalara öz tədqiqatlarında ardıcıllığı tətbiq etməyə imkan verdi. Büdcənizi planlaşdırarkən nəzərə alınmalı olan bir neçə amil var, məsələn, laboratoriya avadanlığı və nümunənin həcmi.

NGS Basics ilə başlayın

Gəlin növbəti nəsil ardıcıllıq iş prosesində əsas addımların ətraflı icmalı ilə başlayaq.

İllumina İcması

Illumina Onlayn İcmasında digər Illumina müştərilərinə qoşulun. Illumina moderatorları, müştəriləri və tərtibatçıları ilə əməkdaşlıq edin. Ən yaxşı təcrübələri müzakirə edin, problemləri həll edin və başqalarının tədqiqatlarını gücləndirmək üçün Illumina ardıcıllıqlarından, kitabxana hazırlama dəstlərindən və avtomatlaşdırılmış məlumat təhlilindən necə istifadə etdiklərini öyrənin.

Əlavə Resurslar

NGS şirkətinin seçilməsi

İstifadəçi dostu bioinformatika alətləri və sənayedə aparıcı dəstək və xidmət ilə öz sinfində ən yaxşı yeni nəsil ardıcıllıq şirkəti axtarın.

Növbəti Nəsil Sequencing Glossary

Ümumi terminlər üçün tərifləri və NGS-də vacib anlayışların təsvirlərini tapın.

NGS Workflow Consulting

Eksperimental dizayn mütəxəssislərimizlə daha sürətli başlayın.* Biz sizə uyğun olan NGS iş prosesini tərtib etməyə kömək edəcəyik.

Illumina İcmasına qoşulun

Açıq forumumuzda tədqiqatçılar bir-birini dəstəkləmək, suallar vermək və böyük elm üzərində əməkdaşlıq etmək üçün bir araya gələ bilərlər.

Bizimlə əlaqə saxlayın

*Asiya və ya Cənubi Sakit Okean ölkələrində mövcud deyil.

Yalnız Tədqiqat İstifadəsi Üçün

Xüsusi qeyd edildiyi hallar istisna olmaqla, diaqnostik prosedurlarda istifadə olunmur.

İnnovativ texnologiyalar

Illumina-da məqsədimiz genetik dəyişkənliyin və funksiyanın təhlilinə innovativ texnologiyalar tətbiq etməkdir ki, bu da bir neçə il əvvəl təsəvvür belə olmayan tədqiqatları mümkün edir. Müştərilərimizin ehtiyaclarını ödəmək üçün yenilikçi, çevik və miqyaslana bilən həllər təqdim etmək bizim üçün vacib vəzifədir. Birgə qarşılıqlı əlaqələrə, həllərin sürətli çatdırılmasına və ən yüksək keyfiyyəti təmin etməyə yüksək dəyər verən qlobal şirkət olaraq biz bu çağırışa cavab verməyə çalışırıq. Illumina innovativ ardıcıllıq və massiv texnologiyaları həyat elminin tədqiqatı, tərcümə və istehlakçı genomikası və molekulyar diaqnostikada əsaslı irəliləyişlərə təkan verir.


Obezitenin DNT Metilom Analizi üçün Bioinformatika və Biostatistik Metodlar

Sarah Amandine Caroline Voisin, Hesablama Epigenetikası və Xəstəlikləri, 2019

Obezite kontekstində DNT metilasiya məlumatlarını təhlil etmək üçün hansı proqram və məlumat dəstlərindən istifadə etməliyəm?

Seçilmiş DNT metilasiyası texnikasından (RRBS, Illumina massivləri, MeDIP-seq, Me-DIP çipi və s.) asılı olmayaraq, bioinformatika icmasının son koordinasiyalı səyləri bütün növ statistik məlumatları əvvəlcədən emal etməyə, süzməyə, normallaşdırmağa və yerinə yetirməyə imkan verdi. R statistik proqramı ilə DNT metilasiyası məlumatlarını təhlil edir. 2003-cü ildə R proqramlaşdırma dilindən istifadə edərək yüksək məhsuldarlıqlı genomik məlumatların təhlili və başa düşülməsi üçün alətlər təmin etmək məqsədi ilə açıq mənbəli, açıq inkişaf etdirmə Biokeçirici layihəsi işə salındı. O, son dərəcə uğurlu olduğunu sübut etdi və indi istər piylənmə kontekstində, istərsə də digər xəstəlik kontekstlərində DNT metilasiyası məlumatlarının təhlili üçün aparıcı platformadır [15]. İndi veb-saytda [16] olan 1473 paket arasında 68-i DNT metilasiyası məlumatlarını əvvəlcədən emal etmək və təhlil etmək üçün alqoritmləri ehtiva edir. Teschendorff və Relton tərəfindən hazırlanmış mükəmməl icmalda hüceyrə tipinin dekonvolyusiya alqoritmləri, xüsusiyyət seçimi, həmçinin yol, inteqrativ və sistem səviyyəsində analiz [17] daxil olmaqla, DNT metilasiyası məlumatlarının aşağı axını təhlili üçün bu alqoritmlər və proqram paketləri ətraflı təsvir edilmişdir.

Illumina muncuq çiplərindən DNT metilasiyası məlumatlarının əvvəlcədən işlənməsi üçün qızıl standartın olmadığını söyləmək ədalətlidir, lakin nəticələrin etibarlılığını artırmaq üçün həyata keçirilməli olan bir neçə vacib addım var. Birincisi, verilmiş CpG-də metilləşmə faizini təmsil edən β dəyərlərinin M dəyərlərinə logit çevrilməsini həyata keçirmək vacibdir. β dəyərləri 0-dan (heç bir allel metilləşmir) 1-ə qədər dəyişir (bütün allellər metilləşir) və onlar 0 və 1-ə yaxın olduqda heteroskedastikdir. Bu, homosedastikliyi qəbul edən əksər statistik testlər üçün problemdir, lakin bunun qarşısını almaq olar. M = log 2 ( β 1 − β ) kimi təyin olunan M qiymətlərindən istifadə etməklə, çünki M dəyərləri təxminən homosedastikdir [18]. Əksər tədqiqatlar öz analizlərini M dəyərləri ilə aparır və nəticələrini bu göstərici ilə bildirir β dəyərlər, ildən β dəyərlər daha sadə bioloji şərhə malikdir. İkincisi, tip I və II tip dizaynlar adlanan Illumina HumanMethylation 450k və EPIC çiplərindəki iki fərqli zond dizaynını nəzərə almaq çox vacibdir. Konkret olaraq, β II tip zondlardan alınan qiymətlər I tip zondlardan daha az dəqiq və təkrarlana bilir və müxtəlif paylanmaları göstərir [19]. Zond dizaynındakı bu fərqi ya iki növ zondları ayrı-ayrılıqda təhlil etməklə, ya da metilasiya dəyərlərini birbaşa pik əsaslı korreksiya (PBC) [19], Beta-Qarışma Kəmiyyəti (BMIQ) normallaşdırması [20] ilə normallaşdırmaqla hesablamaq mümkündür. ] , və ya Əlaqəli Zondlarda Reqressiya (RCP) [21] . Bu üsullar arasında yalnız kiçik performans fərqləri var, lakin RCP onların hamısını üstələyir və hesablama baxımından effektivdir [21]. Nəhayət, nümunələr tez-tez müxtəlif plitələrdə və plitələrin müxtəlif yerlərində aparılır və plitələrdə nümunə paylanması qruplar arasında qeyri-bərabər olarsa, aşağı axın analizində dramatik nəticələrə səbəb ola biləcək məlum partiya effektlərini təqdim edir. Ya statistik analizdə həm boşqab nömrəsini, həm də lövhədəki yeri kovariat kimi əlavə etməklə və ya empirik Bayes metodlarından (ComBat) [22], surroqat dəyişən analizindən istifadə edərək metilasiya məlumatlarını normallaşdırmaqla bu partiya effektini tənzimləmək mümkündür. SVA) [23] , funksional normallaşdırma [24] , İstenmeyen Variasiyanı Sil (RUVm) [25] və BEclear [26] . ComBat tətbiqi asan olan çox məşhur metoddur, lakin RUVm çoxlu laboratoriya/tədqiqatlardan nümunələri birləşdirməyə çalışanlar kimi çox “qarışıq” məlumat dəstlərinin təhlili üçün xüsusilə faydalıdır [25].

Elm adamları müxtəlif tədqiqatlardan çoxlu məlumat dəstlərini birləşdirməyə və ya tapıntılarını gücləndirmək üçün nəticələrini müxtəlif kohortlarda təkrarlamağa çalışmalıdırlar. DNT metilasiyası məlumatları genetik məlumatlar qədər həssas deyil və elmi ictimaiyyətdə daha asan paylaşılır. Getdikcə daha çox jurnal müəlliflərdən öz xam və işlənmiş DNT metilasiya məlumatlarını dərc edilməzdən əvvəl açıq girişli anbarlara saxlamağı xahiş edir. Gene Expression Omnibus (GEO) [27] və ArrayExpress [28] platformaları insanlarda bir neçə min DNT metilasiyası məlumat dəstini ehtiva edir ki, bu da DNT metilasiyası məlumatları üzərində işləyən tədqiqat qrupları üçün dəyərli və kifayət qədər istifadə olunmamış xəzinə təşkil edir. Məsələn, bədən kütləsi indeksinin [14] geniş bir epigenom miqyaslı assosiasiya tədqiqatı (EWAS) toxumalararası korrelyasiya analizlərini yerinə yetirmək üçün GEO verilənlər bazasından məlumat dəstindən istifadə etdi, bu da metilasiya yerlərinin funksional genomik xüsusiyyətlər üçün zənginləşdiyini kəşf etdi. çoxlu toxumalarda. Bununla belə, bu cür açıq platformalara yerləşdirilən nümunələr üzrə fenotipik məlumat əldə etmək çətin ola bilər, çünki müəlliflər məlumat dəstlərini yükləyərkən minimum miqdarda fenotipik məlumat paylaşmağa meyllidirlər. Sonra hər bir məlumat dəstinin hər bir müəllifi ilə əlaqə saxlamaq çətin bir işə çevrilir və bu fenotipik məlumatı daha əlçatan etmək üçün səy göstərilməlidir.


NGS İş Akışı Addımları

Növbəti nəsil ardıcıllıq iş axını üç əsas addımdan ibarətdir: kitabxananın hazırlanması, ardıcıllıq və məlumatların təhlili. Hər bir addımın əsaslarını öyrənin və NGS iş axınınızı necə planlaşdıracağınızı kəşf edin.

NGS İş axınına hazırlıq

Növbəti nəsil ardıcıllıq işinə başlamazdan əvvəl nuklein turşusunu təcrid edin və təmizləyin. Bəzi DNT çıxarılması üsulları NGS iş prosesində baş verən enzimatik reaksiyalara mənfi təsir göstərə bilən inhibitorları təqdim edə bilər. Ən yaxşı nəticələr üçün nümunə növünüz üçün optimallaşdırılmış çıxarma protokolundan istifadə edin. RNT ardıcıllığı təcrübələri üçün əks transkripsiya ilə RNT-ni cDNA-ya çevirin.

Çıxardıqdan sonra əksər NGS iş axınları QC addımını tələb edir. Saflığın qiymətləndirilməsi üçün UV spektrofotometriyasından və nuklein turşusunun miqdarının təyini üçün flüorometrik metodlardan istifadə etməyi tövsiyə edirik.

NGS iş prosesində 1-ci addım: Kitabxanaya hazırlıq

Kitabxana hazırlığı NGS iş axınınızın uğuru üçün çox vacibdir. Bu addım DNT və ya RNT nümunələrini sekvenserlə uyğunlaşdırmaq üçün hazırlayır. Sequencing kitabxanaları adətən DNT-nin parçalanması və hər iki uca xüsusi adapterlərin əlavə edilməsi ilə yaradılır. Illumina sıralama iş prosesində bu adapterlər DNT fraqmentlərinin axın hüceyrəsinə bağlanmasına imkan verən tamamlayıcı ardıcıllıqları ehtiva edir. Fraqmentlər daha sonra gücləndirilə və təmizlənə bilər.

Resurslara qənaət etmək üçün bir neçə kitabxana bir araya toplana və eyni işdə ardıcıllıqla sıralana bilər - bu, multipleksləşdirmə kimi tanınan prosesdir. Adapterin bağlanması zamanı hər bir kitabxanaya unikal indeks ardıcıllığı və ya “barkodlar” əlavə edilir. Bu barkodlar verilənlərin təhlili zamanı kitabxanaları ayırd etmək üçün istifadə olunur.

Kitabxana Hazırlıq Resursları

Kitabxananın kəmiyyətləşdirilməsi və keyfiyyətə nəzarət üçün təlimat tapın.

DNT/RNT-ni təmizləyərkən çirklənmənin qarşısını almaq yollarını öyrənin.

NGS iş prosesində 2-ci addım: Sıralama

NGS iş axınının ardıcıllıq mərhələsi zamanı kitabxanalar axın hücrəsinə yüklənir və sekvenserə yerləşdirilir. DNT fraqmentlərinin klasterləri klaster generasiyası adlanan prosesdə gücləndirilir və nəticədə tək zəncirli DNT-nin milyonlarla nüsxəsi yaranır. Əksər Illumina sıralama alətlərində qruplaşma avtomatik olaraq baş verir.

Sintezlə ardıcıllıq (SBS) adlanan prosesdə kimyəvi cəhətdən dəyişdirilmiş nukleotidlər təbii tamamlayıcılıq vasitəsilə DNT şablon zəncirinə bağlanır. Hər bir nukleotid flüoresan etiketi və növbəti bazanın birləşməsini bloklayan geri çevrilən bir terminatordan ibarətdir. Floresan siqnalı hansı nukleotidin əlavə olunduğunu göstərir və terminator növbəti bazanın bağlana bilməsi üçün parçalanır.

İrəli DNT zəncirini oxuduqdan sonra oxunanlar yuyulur və proses tərs zəncir üçün təkrarlanır. Bu üsul qoşalaşmış uc ardıcıllığı adlanır.

Sintez Texnologiyası ilə ardıcıllıq

NGS iş axınında 3-cü addım: Məlumatların təhlili

Ardıcıllıqdan sonra alət proqramı nukleotidləri (əsas çağırış adlanan proses) və həmin əsas çağırışların proqnozlaşdırılan dəqiqliyini müəyyən edir. Məlumatların təhlili zamanı siz ardıcıllıq məlumatlarınızı standart analiz alətinə idxal edə və ya öz boru kəmərinizi qura bilərsiniz.

Bu gün siz bioinformatika təlimi və ya əlavə laboratoriya işçiləri olmadan NGS məlumatlarını təhlil etmək üçün intuitiv məlumat təhlili proqramlarından istifadə edə bilərsiniz. Bu alətlər ardıcıllığın uyğunlaşdırılmasını, variant çağırışını, məlumatların vizuallaşdırılmasını və ya şərhini təmin edir.

Məlumatların Təhlili Haqqında Ətraflı Məlumat

NGS İş Aktınızı Başlatın

Daha sürətli başlamaq istəyirsiniz? İş Akışının Dizaynı və Qiymətləndirilməsi Xidmətimiz vasitəsilə eksperimental dizayn mütəxəssisləri ilə məsləhətləşin.* Biz sizə uyğun olan NGS iş axını dizayn etməyə, nümunələrinizi emal etməyə və ilk NGS məlumat dəstinizi yaratmağa kömək edəcəyik.

*Asiya və Cənubi Sakit Okean ölkələrində mövcud deyil.

Bizimlə əlaqə saxlayın

Mikrob Bütün Genom ardıcıllığı

Mikrob tam genom ardıcıllığı patogenləri müəyyən etmək, genomları müqayisə etmək və antimikrob müqavimətini təhlil etmək üçün istifadə edilə bilər. Bu proqram üçün təqdim olunan NGS iş axını tövsiyə olunan addımları təsvir edir. Bütün iş axını 24 saatdan az müddətdə DNT-dən məlumatlara keçir.

DNT izolyasiyası

DNT-ni inhibitorlar tətbiq etmədən mikrob koloniyalarından təcrid etmək üçün ekstraksiya dəstindən istifadə edin. Şüşə boncuklardan istifadə etməyi məsləhət görürük. UV spektrofotometriyadan istifadə edərək təmizliyi qiymətləndirin və florometrik üsullardan istifadə edərək DNT-ni kəmiyyətcə ölçün.

Kitabxana Hazırlığı

Illumina DNT Hazırlama Təlimatında sadalanan protokola uyğun olaraq kitabxanaları hazırlayın və kəmiyyətini müəyyənləşdirin. Siz həmçinin Agilent 2100 Bioanalyzer və ya Advanced Analytical Fragment Analyzer-dən istifadə edərək isteğe bağlı kitabxana keyfiyyətinin yoxlanılmasını həyata keçirə bilərsiniz. Sizə lazım olacaq:

2,5 saat
Təxmini DNT girişi: 1–500 ng

Sıralama

Kitabxanaları iSeq 100 Sistem Təlimatında sadalanan protokola uyğun olaraq 2 × 150 bp-də ardıcıllıqla sıralayın. Sizə lazım olacaq:

19.5 saat
Təxmini çıxış: 2 × 150 bp qaçış üçün 1,2 Gb
İş başına nümunələr: 50× əhatə dairəsində 5 Mb qəbul edilməklə 4-5 nümunə

Məlumatların təhlili

BWA Aligner proqramından istifadə edərək məlumatları təhlil edin və BaseSpace Sequence Hub-da İnteqrativ Genomics Viewer proqramından istifadə edərək məlumatları vizuallaşdırın. Sizə lazım olacaq:


CD Genomics Blog

Genomik təhsil, genomik texnologiyalar, genomik irəliləyişlər və genomik xəbərlər və baxışlar daxil olmaqla, inkişaf etdirdiyimiz bloqu araşdırın.

Illumina növbəti nəsil ardıcıllığının prinsipi və iş axını

1998-ci ildə Kaliforniya ştatının San Dieqo şəhərində yaradılmış Illumina sekvensiya sahəsində aparıcı şirkətdir. 2006-cı ildə Illumina Solexa-nı əldə etdi, yeni nəsil yüksək məhsuldarlıqlı ardıcıllıq texnologiyasını əldə etdi və onu bazarda əsas texnologiyaya çevirdi. Hal-hazırda MiSeq, HiSeq 2500, HiSeq 3000, HiSeq 4000, HiSeq X Ten, HiSeq X beş, NextSeq 550 kimi ardıcıllıq sistemlərini təmin edir.

Illumina NGS tətbiqləri

Illumina NGS-nin əsas prinsipi

Illumina növbəti nəsil sıralama (NGS) metodu, DNT zəncirlərinə daxil olan tək əsasların müəyyən edilməsinə imkan verən sekvensiya-sintez (SBS) və geri çevrilən boya-terminatorlara əsaslanır.

Illumina NGS-nin iş axını

Addım 1. Kitabxananın hazırlanması

Ultrasonik parçalanma yolu ilə genomik DNT 200-500bp uzunluğunda DNT fraqmentinə çevrilir. 5' və 3' adapter bu kiçik seqmentlərin iki ucuna əlavə edilir, "tagmentation" parçalanma və bağlama reaksiyalarını bir addımda birləşdirir ki, bu da kitabxananın hazırlanması prosesinin səmərəliliyini xeyli artırır. Adapterlə bağlanmış fraqmentlər daha sonra PCR ilə gücləndirilir və gel təmizlənir. Ardıcıllıq kitabxanası qurulur.

Şəkil 1. 1-ci addım: kitabxananın hazırlanması

Addım 2. Klaster yaradılması

Axın hüceyrəsi mobil DNT fraqmentlərini adsorbsiya etmək üçün bir kanaldır və o, eyni zamanda əsas ardıcıllıq reaktoru gəmisidir —, bütün ardıcıllıq burada baş verir. Ardıcıllıq kitabxanasındakı DNT fraqmentləri axın hüceyrəsindən keçərkən onun səthindəki zolaqlara təsadüfi şəkildə yapışacaqlar. Hər bir axın hüceyrəsində 8 zolaq var, hər bir zolağın səthə bərkidilmiş bir sıra adapterləri var ki, bu da tikinti prosesində DNT fraqmentinin uclarına əlavə edilən adapterlərə uyğun ola bilər, buna görə də axın hüceyrəsi binadan sonra DNT-ni adsorbsiya edə bilir, və DNT səthində körpü PCR-in gücləndirilməsini dəstəkləyə bilər. Nəzəri olaraq, bu zolaqlar arasında qarşılıqlı təsir yoxdur.

Körpü PCR şablon kimi axın hüceyrəsi səthindəki adapterlərdən istifadə edilməklə həyata keçirilmişdir, davamlı gücləndirmə və mutasiya dövrlərindən sonra hər bir DNT fraqmenti nəhayət, hər biri bir DNT şablonunun çoxlu nüsxəsini ehtiva edən müvafiq yerlərdə paketlər şəklində qruplaşdırılacaqdır.

Bu prosesin məqsədi ardıcıllıq üçün siqnal tələblərinə cavab vermək üçün bazanın siqnal intensivliyini gücləndirməkdir. Klaster generasiyası tamamlandıqda, həmin şablonlar ardıcıllığa hazırdır.

Şəkil 2. 2-ci addım: klaster generasiyası

Addım 3. Ardıcıllıq

Ardıcıllıq metodu ardıcıllıqla sintezə (SBS) əsaslanır. Reaksiya sisteminə DNT polimeraza, birləşdirici primerlər və bazaya xas flüoresan markerləri olan 4 dNTP əlavə edilmişdir. Bu dNTP-nin 3′-OH kimyəvi üsullarla qorunur ki, bu da ardıcıllıq prosesi zamanı bir anda yalnız bir baza əlavə olunmasını təmin edir. Bütün istifadə olunmamış sərbəst dNTP və DNT polimeraza sintez reaksiyası bitdikdən sonra elüt edilir.

Sonra flüoresan həyəcanlandırma üçün lazım olan bufer məhlulu əlavə edilir, flüoresan siqnalı lazerlə həyəcanlanır və flüoresan siqnalı optik avadanlıqla qeydə alınır.

Nəhayət, kompüter analizi ilə optik siqnal ardıcıllıq bazasına çevrilir. Floresans siqnalı qeydə alındıqda, flüoresan siqnalını söndürmək və dNTP 3′-OH qoruyucu qrupunu çıxarmaq üçün kimyəvi reagent əlavə edilir, beləliklə, ardıcıllıq reaksiyasının növbəti mərhələsi həyata keçirilə bilər.

Şəkil 3. 3-cü addım: ardıcıllıq

Addım 4. Alignment & Data analizi

Yeni müəyyən edilmiş ardıcıllığın oxunuşları bir istinad genomuna uyğunlaşdırılır, sonra SNP/InDel/SV/CNV çağırışı, annotasiya və statistika, yolun zənginləşdirilməsi təhlili, populyasiya genetik analizi və s. kimi bioinformatika analizinin bir çox variantı mümkündür.

Şəkil 4. 4-cü addım: uyğunlaşdırma və məlumatların təhlili.

Yuxarıdakılar Illumina NGS kimyasına baxışdır, SBS texnologiyası tək və iki uclu ardıcıllığa imkan verir, istənilən genomu tam müəyyən etmək qabiliyyətini təkmilləşdirir.


İçindəkilər

Illumina sıralama texnologiyası üç əsas addımda işləyir: gücləndirmə, ardıcıllıq və təhlil. Proses təmizlənmiş DNT ilə başlayır. DNT parçalanır və gücləndirmə, ardıcıllıq və təhlil zamanı istinad nöqtələri kimi çıxış edən seqmentləri ehtiva edən adapterlər əlavə olunur. Dəyişdirilmiş DNT, gücləndirmə və ardıcıllığın baş verəcəyi bir axın hüceyrəsinə yüklənir. Axın hüceyrəsində fraqmentləri yerləşdirən və həddindən artıq sıxlığa kömək edən nanoquyucular var. [6] Hər bir nanoquyuğun özündə adapterlərin qoşulması üçün anker nöqtəsini təmin edən oliqonukleotidlər var. Fraqmentlər birləşdikdən sonra klaster generasiyası adlanan mərhələ başlayır. Bu addım DNT-nin hər bir fraqmentinin min nüsxəsini çıxarır və körpü gücləndirici PCR ilə həyata keçirilir. Sonra primerlər və dəyişdirilmiş nukleotidlər çipin üzərinə yuyulur. Bu nukleotidlər geri çevrilə bilən 3' flüoresan blokerə malikdir, belə ki, DNT polimeraza DNT fraqmentinə hər dəfə yalnız bir nukleotid əlavə edə bilər. [6] Hər sintezdən sonra kamera çipin şəklini çəkir. Kompüter floresan etiketin dalğa uzunluğu ilə hansı bazanın əlavə olunduğunu müəyyənləşdirir və onu çipdəki hər bir nöqtə üçün qeyd edir. Hər turdan sonra daxil olmayan molekullar yuyulur. Daha sonra 3' flüoresan terminal bloklama qrupunu çıxarmaq üçün kimyəvi bloklama addımından istifadə olunur. Proses tam DNT molekulunun ardıcıllığına qədər davam edir. [5] Bu texnologiya ilə genomda minlərlə yer eyni anda kütləvi paralel ardıcıllıqla ardıcıllıqla sıralanır.

Genomik Kitabxana Redaktəsi

DNT təmizləndikdən sonra DNT kitabxanası, genomik kitabxana yaradılmalıdır. Genomik kitabxananın yaradılmasının iki yolu var, sonlandırma və etiketləmə. Taqmentasiya ilə transposazlar təsadüfi olaraq DNT-ni 50-500 bp fraqmentləri arasında ölçülərə ayırır və eyni zamanda adapterlər əlavə edir. [6] Genetik kitabxana genomik DNT-ni parçalamaq üçün sonifikasiyadan istifadə etməklə də yaradıla bilər. Sonifikasiya ultrasəs səs dalğalarından istifadə edərək DNT-ni oxşar ölçülərə bölür. Sağ və sol adapterlər sonfikasiyadan sonra T7 DNT Polimeraz və T4 DNT liqaza ilə birləşdirilməlidir. Adapterləri bağlaya bilməyən iplər yuyulur. [7]

Adapterlərin redaktəsi

Adapterlər üç fərqli seqmentdən ibarətdir: bərk dəstəyi tamamlayan ardıcıllıq (axın hüceyrəsindəki oliqonukleotidlər), barkod ardıcıllığı (indekslər) və sekvensiya primeri üçün bağlama yeri. [6] İndekslər adətən altı əsas cüt uzunluğunda olur və nümunələri müəyyən etmək üçün DNT ardıcıllığının təhlili zamanı istifadə olunur. İndekslər 96-ya qədər müxtəlif nümunəni birlikdə işlətməyə imkan verir, bu da multipleksləmə kimi tanınır. Təhlil zamanı kompüter eyni indekslə bütün oxunuşları qruplaşdıracaq. [8] [9] Illumina "sintez üzrə ardıcıllıq" yanaşmasından istifadə edir. [9] Bu proses akrilamidlə örtülmüş şüşə axın hüceyrəsinin içərisində baş verir. [10] Axın hüceyrəsində hüceyrənin altını örtən oliqonukleotidlər (qısa nukleotid ardıcıllıqları) var və onlar ardıcıllıq zamanı DNT zəncirlərini yerində saxlamaq üçün möhkəm dayaq rolunu oynayır. Parçalanmış DNT axın hüceyrəsi üzərində yuyulduqca, uyğun adapter tamamlayıcı bərk dayağa bağlanır.

Körpünün gücləndirilməsi Redaktə edin

Qoşulduqdan sonra klaster generasiyası başlaya bilər. Məqsəd yüzlərlə eyni DNT zəncirini yaratmaqdır. Bəziləri irəli, qalanları isə tərs olacaq. Buna görə sağ və sol adapterlərdən istifadə olunur. Klasterlər körpünün gücləndirilməsi yolu ilə yaradılır. DNT polimeraza DNT-nin zəncirində hərəkət edərək onun tamamlayıcı zəncirini yaradır. Orijinal ip yuyulur, yalnız tərs ip qalır. Əks ipin yuxarı hissəsində adapter ardıcıllığı var. DNT ipi əyilir və yuxarı adapter ardıcıllığını tamamlayan oliqoya bağlanır. Polimerazlar tərs ipə bağlanır və onun tamamlayıcı tel (orijinal ilə eynidir) hazırlanır. İndi ikiqat zəncirli DNT denaturasiya olunur ki, hər bir zəncir ayrı-ayrılıqda axın hüceyrəsinə lövbərlənmiş oliqonukleotid ardıcıllığına qoşula bilsin. Biri tərs ip, digəri irəli olacaq. Bu proses körpünün gücləndirilməsi adlanır və bu, eyni anda bütün axın hüceyrəsi üzərində minlərlə klaster üçün baş verir. [11]

Klonal gücləndirmə Edit

DNT zəncirləri dönə-dönə əyiləcək və bərk dəstəyə yapışacaq. DNT polimeraza ikiqat zəncirli seqment yaratmaq üçün yeni bir zəncir sintez edəcək və o, denatürasiya ediləcək ki, bir sahədəki bütün DNT zəncirləri bir mənbədən olsun (klonal gücləndirmə). Klonal gücləndirmə keyfiyyətə nəzarət məqsədləri üçün vacibdir. Bir ipin qəribə ardıcıllığa malik olduğu aşkar edilərsə, elm adamları eyni qəribəliyin tamamlayıcısına sahib olduğundan əmin olmaq üçün əks ipi yoxlaya bilərlər. İrəli və arxa iplər artefaktlardan qorunmaq üçün yoxlama rolunu oynayır. Illumina ardıcıllığı DNT polimerazdan istifadə etdiyinə görə əsas əvəzetmə xətaları [12] xüsusilə 3' sonunda müşahidə edilmişdir. [13] Cütlənmiş son oxunuşlar klaster generasiyası ilə birlikdə xətanın baş verdiyini təsdiqləyə bilər. Ters və irəli iplər bir-birini tamamlayıcı olmalıdır, bütün tərs oxunuşlar bir-birinə uyğun olmalıdır və bütün irəli oxunuşlar bir-birinə uyğun olmalıdır. Əgər oxunuş həmkarlarına kifayət qədər bənzəmirsə (onunla klon olmalıdır), xəta baş vermiş ola bilər. Bəzi laboratoriyaların analizlərində minimum 97% oxşarlıq həddi istifadə edilmişdir. [13]

Sintezlə ardıcıllıq Redaktə edin

Klonal gücləndirmənin sonunda bütün tərs tellər axın hüceyrəsindən yuyulur və yalnız irəli iplər qalır. Bir primer irəli tellərin adapterinin primer bağlanma yerinə yapışdırılır və polimeraza DNT zəncirinə flüoresan işarəli dNTP əlavə edir. Bloklama qrupu rolunu oynayan flüorofor sayəsində dövrəyə yalnız bir baza əlavə edilə bilər, lakin bloklama qrupu geri çevrilə bilər. [6] Dörd rəngli kimyadan istifadə edərək, dörd əsasın hər birinin unikal emissiyası var və hər turdan sonra maşın hansı bazanın əlavə olunduğunu qeyd edir. Rəng qeydə alındıqdan sonra flüorofor yuyulur və başqa bir dNTP axın hüceyrəsi üzərində yuyulur və proses təkrarlanır. dATP-lər, dTTP-lər, dGTP-lər və dCTP-lər hüceyrə üzərində ayrıca yuyulur ki, hər bir nukleotidin müəyyən edilməsi mümkün olsun.

NextSeq və daha sonra MiniSeq-in işə salınmasından başlayaraq, Illumina yeni iki rəngli ardıcıllıq kimyasını təqdim etdi. Nukleotidlər ya iki rəngdən biri (qırmızı və ya yaşıl), rəngsiz ("qara") və ya hər iki rəngin birləşməsi (qırmızı və yaşıl arasında qarışıq kimi narıncı görünən) ilə fərqlənir.

DNT zəncirinin oxunmasından sonra yeni əlavə edilmiş zəncir yuyulur. Sonra, indeks 1 primeri yapışdırılır, indeks 1 ardıcıllığını polimerləşdirir və yuyulur. Tel yenidən körpü əmələ gətirir və DNT zəncirinin 3' ucu axın hüceyrəsindəki oliqoya bağlanır. İndeks 2 primeri yapışdırılır, ardıcıllığı polimerləşdirir və yuyulur.

Bir polimeraza, tamamlayıcı ipi qövslü ipin üstünə düzür. Onlar ayrılır və hər bir ipin 3' ucu bloklanır. İrəli ip yuyulur və sintez yolu ilə ardıcıllıq prosesi əks tel üçün təkrarlanır.

Məlumatların təhlili Redaktə edin

Ardıcıllıq eyni anda milyonlarla klaster üçün baş verir və hər bir çoxluq var

DNT əlavəsinin 1000 eyni nüsxəsi. [12] Ardıcıllıq məlumatları contigs adlanan üst-üstə düşən sahələri olan fraqmentləri tapmaq və onları sıralamaqla təhlil edilir. İstinad ardıcıllığı məlumdursa, variantın identifikasiyası üçün kontiglər onunla müqayisə edilir.

Bu hissə-hissə proses elm adamlarına tam ardıcıllığı görməyə imkan verir, baxmayaraq ki, parçalanmamış ardıcıllıq heç vaxt işlənməyib, çünki Illumina oxu uzunluqları çox da uzun deyil [13] (HiSeq ardıcıllığı təxminən 90 bp uzunluğunda oxumaq uzunluqları yarada bilər [8]), qısa tandem təkrar sahələrini həll etmək üçün mübarizə. [8] [12] Həmçinin, əgər ardıcıllıq de novo olarsa və istinad mövcud deyilsə, təkrarlanan sahələr ardıcıllığın yığılmasında bir çox çətinlik yarada bilər. [12] Əlavə çətinliklərə qeyri-dəqiq polimerazlar, kimerik ardıcıllıqlar və PCR-bias tərəfindən əsas əvəzetmələri (xüsusilə oxunuşların 3' sonunda [13]) daxildir, bunların hamısı yanlış ardıcıllığın yaranmasına kömək edə bilər. [13]

Bu texnika Sanger ardıcıllığı kimi ənənəvi ardıcıllıq metodlarına nisbətən bir sıra üstünlüklər təklif edir. Sanger ardıcıllığı iki reaksiya tələb edir, biri irəli primer üçün, digəri isə əks astar üçün. Illumina-dan fərqli olaraq, Sanger ardıcıllığı DNT fraqmentinin ardıcıllığını təyin etmək üçün flüoresan etiketli dideoksinukleozid trifosfatlardan (ddNTP) istifadə edir. ddNTP-lərdə 3' OH qrupu yoxdur və DNT sintezini daimi olaraq dayandırır. [6] Hər reaksiya borusuna DNT polimeraza və primerlərlə birlikdə dNTP və ddNTP əlavə olunur. Şablon DNT-nin tamamilə sintez edilməli olduğu üçün ddNTP-lərin dNTP-lərə nisbəti vacibdir və ddNTP-lərin çoxluğu DNT şablonunun eyni ölçüdə və mövqedə çoxlu fraqmentləri yaradacaq. DNT polimeraza ddNTP əlavə etdikdə fraqment dayandırılır və yeni fraqment sintez olunur. Sintez edilən hər bir fraqment sonuncudan bir nukleotid daha uzundur. DNT şablonu tam sintez edildikdən sonra fraqmentlər kapilyar elektroforezlə ayrılır. Kapilyar borunun altındakı lazer flüoresan etiketli ddNTP-ləri həyəcanlandırır və kamera yayılan rəngi çəkir.

Illumina boya ardıcıllığının avtomatlaşdırılmış təbiətinə görə, eyni anda birdən çox ipi ardıcıllaşdırmaq və faktiki ardıcıllıq məlumatlarını tez əldə etmək mümkündür. Sanger ardıcıllığı ilə bir anda yalnız bir tel ardıcıllıqla sıralana bilir və nisbətən yavaşdır. Illumina, digər ardıcıllıq üsulları (yəni pirosekvensiya) tərəfindən tələb olunan çoxsaylı, bahalı fermentlərdən fərqli olaraq yalnız DNT polimerazından istifadə edir. [14]

Illumina ardıcıllığı şirin kartof [15] və gimnosperm cinsinin transkriptomlarını araşdırmaq üçün istifadə edilmişdir. Vergilər. [16]


Yoluxucu Xəstəliklərdə Mikrobiom

Məqsədli metagenomik ardıcıllıq

Məqsədli metagenomik ardıcıllıq genomun xüsusi olaraq gücləndirilmiş bölgəsinin DNT ardıcıllığıdır. 16S rRNA və 18S rRNA genləri müvafiq olaraq bakteriya/arxeya və eukariotlar üçün ən çox istifadə edilən hədəflərdir. Ribosomal RNT ardıcıllığının müxtəlifliyinə əsaslanaraq, mikrobiomun strukturunu mövcudluğu və nisbi bolluğu baxımından araşdırmaq olar. Ənənəvi yanaşma, PCR-dən sonra tam uzunluqlu genlərin klonlaşdırılmasını (geniş mikroorqanizmlərdən hədəf geni gücləndirən primerlərlə) və ardınca ardıcıllığı əhatə edir. Tarixən istifadə edilən Sanger (kapilyar əsaslı) ardıcıllıq yanaşması yeni nəsil ardıcıllıq (NGS) texnologiyaları ilə əvəz edilmişdir. 16

16S rRNA geni

16S rRNA genləri qorunmuş və dəyişkən bölgələrə malikdir (Şəkil 8-3ai), burada qorunan ərazilər növlər arasında filogenetik əlaqəni əks etdirir (və PCR üçün əsas yer kimi istifadə olunur) və növlər arasındakı fərqləri əks etdirən yüksək dəyişkən bölgələr. Kapilyar əsaslı ardıcıllıq (yaradıcı

750 bp oxumaq uzunluğu) bütün geni əhatə etmək üçün 2-3 oxu tələb edir (

1,6 kb). Çox dəqiq olsa da (16S rRNA geninin tam uzunluğunu tutmaq qabiliyyətinə görə), bu yanaşma baha başa gəlir, vaxt aparır, material baxımından səmərəsizdir və əmək tələb edir. NGS platformaları (məsələn, 454/Roche, Ion-Torrent və Illumina) məlumatların yaradılması üçün tələb olunan xərcləri azaltmaqla yanaşı, mikrob icmalarının daha dərindən nümunə götürməsini təmin edir. 454/Roche platformasının 400-500 bp oxunma uzunluğu çox aşağı xəta dərəcəsinə malikdir və həmçinin doqquz hiperdəyişən bölgədən üçünə qədərini əhatə edə bilər (məsələn, V1-dən V3-ə və ya V3-dən V5-ə qədər). Bölgə üzrə cəmi 96 nümunə profilləşdirilə bilər, hər bir qaçış üçün cəmi 192 nümunə və

Hər nümunə üçün 5000 oxunuş. Bu yanaşmanın həssaslığı (taksonları ən aşağı taksonomik səviyyəyə təyin etmək qabiliyyəti ilə bağlı) tam uzunluqlu 16S rRNA gen ardıcıllığı qədər yüksək olmasa da, pirosekvensləmə mikrobiom haqqında anlayışımızı xeyli inkişaf etdirdi. Mikrob icmalarından nümunə götürmək üçün aşağı qiymətli, genişlənə bilən və yüksək məhsuldarlıqlı yanaşma həm Ion-Torrent sequencerləri (Ion PGM TM Sequencer və Ion Proton ™) sayəsində mümkün olur ki, bu da 400 bp-ə qədər ardıcıl oxunuş, 17,18 və Cütlənmiş 250-300 bp oxunu yarada bilən Illumina MiSeq platforması, 19. MiSeq platforması eyni zamanda bir oxunuşun əhatə etdiyi bir bölgəni və ya cütləşdirilmiş oxuların yığılmasını tələb edən üç bölgəyə qədər nümunə götürə bilir. Tək bir MiSeq işində cəmi 384 nümunə profillənə bilər

Nümunə başına 20 000 oxunuş (orta hesabla, cəmi 7 milyon yığılmış oxunuş). Qeyd etmək lazımdır ki, müəyyən dəyişən bölgələri tutmaq üçün nəzərdə tutulmuş primerlər (Şəkil 8-3) müəyyən taksonomik təbəqələri az təmsil edə bilər. Primer cütlüklərdən bu qərəzliyi kəmiyyətləndirmək və xarakterizə etmək üçün tədqiqatlar bakteriya növlərinin tərkibinin və onların təmsilçiliyinin məlum olduğu qondarma "istehzalı" icmalar qurmuşdur. 20

16S ardıcıllığının təhlilinə analitik emal (kəsmə, skrininq və düzülmə ardıcıllığı), ardınca ictimai verilənlər bazalarında 16S rRNA ardıcıllığı ilə müqayisələr yolu ilə mikrob profilinin yaradılması və ya ardıcıllıqların tezlik paylanmasından istifadə edərək əməliyyat taksonomik vahidlərindən (OTU) (bax Şəkil 8-2) daxildir. zibil qutularında aşkar edilmişdir (növlər üçün 3% və cins üçün 5% fərqlilik səviyyəsinin qəbul edilmiş həddi istifadə etməklə). Seçilmiş taksonomik dərinlik çox vaxt vəziyyətdən asılıdır. İcmaları müəyyən edən ekoloji parametrlərə zənginlik, müxtəliflik və bərabərlik daxildir. Zənginlik icmadakı unikal bakteriyaların sayını nəzərə alır və müxtəliflik populyasiyadakı bakteriyaların zənginliyini və nisbi bolluğunu əks etdirir (məsələn, Şennon müxtəliflik indeksi), növlər arasında bölünmə daha az bərabər olduqda, bir növ digərləri üzərində üstünlük təşkil etdikdə azalır. Düzgünlük icma ədalətliliyini təmsil edir və zənginlik və müxtəlifliyin qiymətləndirilməsinə əsaslanır (məsələn, Şennon bərabərlik indeksi). After determining ecological parameters, comparisons within and between groups (α and β diversity, respectively) are performed, and the level of saturation within the studied cohort per microbiome is determined (γ diversity) ( Figure 8-2 ).

18S rRNA Gene

Similar to the bacterial 16S rRNA genes, the eukaryotic 18S rRNA gene has conserved and variable regions. 18S rRNA gene sequences and their associated transcribed spacers (internal transcribed spacer ITS) 21,22 are used to classify fungi and eukaryotes. 23,24 ITS includes ITS1 (located between 18S and 5.8S rDNA) and ITS2 (between 5.8S and 28S rDNA Figure 8-3aii ). The variability in ITS1 and ITS2 is greater than 18S rDNA gene variability, so it is used to identify fungi and lower eukaryotes at species and subspecies levels. Co-sequencing of both 18S rDNA and ITS (e.g. ITS1-5.8S-ITS2) can provide more comprehensive classification of the eukaryotic components of the human microbiome. Selection for the amplification of the target region must be performed carefully because of primer biases (e.g., reference 25 ).

There is no current agreement as to the optimal regions to be amplified and sequenced. It is often a balance between finding primers that best amplify a determinative region, at the risk of losing the ability to more broadly characterize a bacterial and fungal/eukaryotic biomass. Targeted co-sequencing of the bacterial 16s rRNA and eukaryotic 18S rRNA genes 26–28 has been shown to efficiently characterize the microbiota on different habitats of the human body.


Nəticələr

We used five methods that take advantage of iTru or iNext indexing primers developed in Adapterama I in six exemplar amplicon sequencing projects. These projects illustrate the range of methodological approaches that can be used to overcome challenges of amplicon library preparation and fulfill most of the characteristics of an ideal amplicon library preparation system.

In all but one project (Table 4, project 1), we designed fusion primers to generate amplicons that can be amplified by iTru5 and iTru7 (or iNext5 and iNext7) primers to create full-length Illumina TruSeq (or Nextera) libraries. The indexed fusion primers utilize 20 (i.e., 8 + 12) internal identifying sequences with an edit distance ≥ 3 (Table 1) to create up to 96 internally dual-indexed amplicon libraries which were used individually or pooled for additional outer indexing by iTru5 and iTru7 (or iNext5 and iNext7) primers. Sequential PCRs that start with internally indexed primers create quadruple-indexed amplicon libraries that achieve our design goals of cost reduction, facilitation of large-scale multiplexing, increased base-diversity for Illumina sequencing, and maximization of efficiency of library preparation.

In our project characterizing the blood meals of kissing bugs (Table 4, project 1), we obtained an average of 116,902 reads for each sample and identified a total of five unique vertebrate species as the source of the blood meals. In our project identifying fungal pathogens in tree tissues (Table 4, project 2), we obtained an average of 436,825 reads per pool (i.e., 96 samples) and characterized the diverse fungal communities found in these samples. In our project characterizing plethodontid salamander communities from environmental DNA samples (Table 4, project 3), we obtained an average of 163,555 reads for each PCR replicate and identified reads matching 6/7 species expected to be present in the streams. In our project comparing basal DNA methylation of p21 (Table 4, project 4), we obtained approximately 10,000 reads per sample and detected differences in methylation of CpG sites between embryonic kidney cells and human proximal tubule cell (Kolli et al., 2019). In our project characterizing bacterial gut microbiomes (Table 4, project 5), we rarified to 15,000 quality-filtered reads per sample and identified an average of 3,847 OTUs per sample. In our project focused on the fine-scale population genetic analysis of Wisteria (Table 4, project 6), we obtained an average of 1,697 reads per sample and discovered little evidence of population structure among samples. Variation in the average number of reads among projects reflects the intentional allocation of reads when pooling with genomic libraries for sequencing for example, we pooled plates of libraries for the fungal pathogen project in relative quantities intended to generate approximately 4,000 reads per sample. Variation in the number of reads among samples within a given project likely reflects quantification error and variation in input DNA quantity and quality. Full results and associated figures for each project are detailed in File S3.

Figure 4: Total cost of experiments across the five methods given a number of samples.

(A) Metod 1 Metod 2 Metod 3 Metod 4 Metod 5
iTru buy-in $500 $500 $500 $500 $500
Oligo buy-in $103 $460 $290 $40 $445
Library Cost per sample $18.86 dəyişən dəyişən $4.44 dəyişən
Fixed cost $18.86 $3.12 $1.39 $4.44 $1.39
Variable cost $4.07 $17.52 $4.07
(B) Library Cost per Sample for the given # of samples
# samples 1 $18.86 $7.19 $18.91 $4.44 $5.46
2 $18.86 $5.16 $10.15 $4.44 $3.43
8 $18.86 $3.63 $3.58 $4.44 $1.90
12 $18.86 $3.46 $2.85 $4.44 $1.73
24 $18.86 $3.29 $2.12 $4.44 $1.56
48 $18.86 $3.20 $1.75 $4.44 $1.47
96 $18.86 $3.16 $1.57 $4.44 $1.43
(C) Total experiment cost for given # of samples or plates (96 samples per plate)
# samples 1 $621.86 $967.19 $808.91 $544.44 $950.46
2 $640.72 $970.31 $810.30 $548.87 $951.85
8 $753.87 $989.03 $818.64 $575.48 $960.19
12 $829.31 $1,001.50 $824.20 $593.22 $965.75
24 $1,055.62 $1,038.94 $840.87 $646.45 $982.43
48 $1,508.24 $1,113.80 $874.23 $752.90 $1,015.78
96 $2,413.48 $1,263.53 $940.94 $965.80 $1,082.49
# plates 2 $4,223.96 $1,567.06 $1,091.87 $1,391.60 $1,219.98
3 $6,034.44 $1,870.59 $1,242.81 $1,817.40 $1,357.47
4 $7,844.92 $2,174.12 $1,393.74 $2,243.20 $1,494.95
5 $9,655.40 $2,477.66 $1,544.68 $2,669.00 $1,632.44

The costs associated with each method vary significantly, and which approach has the lowest cost depends on the number of samples processed (Fig. 4: note axis scales are not linear Table 5 File S6). In all cases, we present the costs associated with targeting a single locus for projects targeting multiple loci, these numbers can be adjusted to estimate the costs of purchasing necessary primers (i.e., locus-specific primers or fusion primers) and for more complicated pooling schemes. Methods 1 and 4 have the lowest buy-in cost, but the cost of library preparations are fixed, rather than decreasing as the number of samples increases. The constant cost per sample is due to the need for individual second round PCRs (e.g., iTru5/7). The other methods allow pooling of samples prior to second round PCR, which reduces costs. Because Method 1, with no use of fusion primers (non-indexed/indexed), has the highest library preparation costs per sample, it quickly becomes the most expensive method, more than doubling the cost of most other methods with as few as 96 samples. Method 4 remains economically reasonable for processing one or two plates of samples but becomes less reasonable as more plates of samples are used. Method 2 is never economically best, but it is sometimes necessary to achieve sufficient amplification to construct the desired libraries. Thus, Method 2 is only viable when the other methods fail. Method 3 has a moderate buy-in cost and the second-lowest cost per sample for large numbers of samples. Also, Method 3 has the lowest cost when ≤11 plates of samples will be processed, though the cost is very similar to Method 5 after ≥2 plates of samples are processed. Method 5 has the second highest buy-in costs, but the lowest costs per sample when large numbers of samples are processed. Method 5 is optimal when >12 plates of samples are processed. Because Methods 3 and 5 are similar in cost after a few plates of samples are processed, other considerations, such as workflow and personnel costs, are likely to drive decisions about the optimal method rather than the costs of reagents.


Supplementary Figure 1

Sequences of adapters, amplification and sequencing primers. Adapter sequences of a regular single-indexed Illumina multiplex library (as obtained using Illumina's TruSeq DNA sample preparation kit, cat. no. FC-121-2001/2002, or following the protocol provided in ref. 21 of the main text) are shown on top. Libraries prepared from single-stranded DNA differ by a deletion of 5 bp in the P5 adapter. Both library types are compatible with double-indexed sequencing (see ref. 22 of the main text for details). Amplification and sequencing primers are indicated by arrows. Primers with prefix 'IS' are further described in ref. 21 of the main text. (PDF 364 kb)

Supplementary Figure 2

Characterization of two DNA libraries prepared with and without uracil removal from a Neanderthal DNA extract (panels on the right and left, respectively). A) Fragment length distributions of the amplified libraries obtained from chip electrophoresis using the Bioanalyzer 2100. B) Fragment size distributions obtained from sequencing (the fraction of mapped sequences is indicated by a dotted line). C) Frequency of C to T substitutions around 5′and 3′ends of Neanderthal sequences. D) Average GC-content of Neanderthal sequences as a function of fragment size. (PDF 397 kb)

Supplementary Figure 3

Quality control of single-stranded adapter oligonucleotide CL78. From two independently synthesized batches of the oligonucleotide, 10 pmol were loaded onto a 10% denaturing polyacrylamide gel, next to a size marker (lane 1 20/100 ladder). The gel was run for 35 min at 200V and stained with SybrGold dye. While no impurities were detected in the first batch (lane 2), the second batch (lane 3) is dominated by a double-length artifact, representing an extreme example of poor oligonucleotide synthesis quality. (PDF 197 kb)

Supplementary Figure 4

Determining the optimal cycle number for indexing PCR using the qPCR amplification plots. Shown are the amplification plots obtained from quantifying the libraries prepared in the experiment described in 'Anticipated results'. The saturation phase of PCR starts after cycle 18 (sample libraries, red and blue) and cycle 23 (blank library, green), respectively. Assuming full amplification efficiency (i.e. a doubling of library molecules in each cycle), the optimal cycle number for indexing PCR can be determined as follows by correcting for differences in reaction volumes and the amount of template DNA: (i) qPCR was performed in 25 μl reactions, whereas indexing PCR is performed in 100 μl volume. Thus, 2 cycles should be added to allow for 4 times more end product. (ii) One microliter of a 1:20 library dilution was used for measurement, whereas 24 μl of the library are used for indexing PCR (480 times as much). This corresponds to 8.9 (rounded 9) cycles that should be deducted. Thus, 11 and 16 were estimated to be the optimal cycle numbers for indexing PCR. (PDF 278 kb)

Supplementary Table 1

Program settings of Cooling-ThermoMixer MKR13 recommended for single-stranded library preparation. The device may also be used to replace the vortexer in bead resuspension steps (use 'short mix' button). (PDF 255 kb)

Supplementary Table 2

P5 and P7 indexing primers. An identical set of P7 indexing primers was published before in ref. 21 of the main text. (PDF 331 kb)


Videoya baxın: Transformers-المحولات مبدأ العمل والأنواع والأعطال (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Mojar

    Düşünürəm ki, haqlı deyilsən. PM-də mənə yazın, ünsiyyət quracağıq.

  2. Peredwus

    I'm afraid I don't know.

  3. Atkinsone

    Düşünürəm ki, haqlı deyilsən. Müzakirə edəcəyik. PM-də mənə yazın, biz onu idarə edəcəyik.

  4. Addison

    Ona demək lazımdır - ciddi günah.

  5. Rollie

    otlaq

  6. Gardazshura

    Düşünürəm ki, səhvə yol verəcəksiniz. Mən öz mövqeyimi müdafiə edə bilərəm. PM-ə yazın, danışarıq.

  7. Finn

    çox faydalı otaq



Mesaj yazmaq