Məlumat

Hi-C ardıcıllığında təmizlənmə addımından sonra nə baş verir?


Mən Hi-C haqqında məqalə oxuyan bir statistikəm və DNT-nin təcrid edilməsi və ardıcıllığı prosesindəki addımlardan birini daha yaxşı başa düşməyə çalışıram.

Mən a statistik, lütfən, cavablarınızda çox jarqondan qaçmağa çalışın və əgər jarqondan istifadə etməlisinizsə, lütfən, onu müəyyənləşdirin/izah edin.
Xüsusilə, izolyasiya və kəsmə addımı ilə bağlı çaşqınlıq içindəyəm. Özümü izah etmək üçün aşağıdakılara istinad edəcəyəm 1-dən 4-ə qədər etiketlənmiş şəkillər.

Şəkil 1)
Şəkil 2)
(mənbə: nature.com)
Şəkil 3)
(mənbə: babraham.ac.uk)
Şəkil 4)
(mənbə: nature.com)
Mən başa düşürəm ki, DNT məhdudlaşdırıcı fermentlərlə parçalanır, DNT fraqmentləri buludu yaradır, bəziləri çarpaz bağlıdır, digərləri isə yox. Bu parçalar biotinlə bağlandıqda və a seyreltmək qarışıq, bu parçaların öz-özünə bağlanması ehtimalı yüksəkdir, nəticədə ya; 1) çarpaz bağlanmamış iplərdən bir üzük (üçüncü rəsmdə olduğu kimi). Şəkil 3 işarələnmiş "özünü bağlama") və ya 2) çarpaz bağlanmış iplərdən səkkizlik rəqəmlər (dördüncü rəsmdə olduğu kimi) Şəkil 1).

İndi çaşqınlıq gətirənlər aşağıdakılardır:

  1. Açılan addım biotin ehtiva edən üzükləri aşağı çəkir, lakin Şəkil 1Şəkil 4 solo halqalar deyil, yalnız çarpaz bağlanmış bitlər aşağı çəkilmiş kimi görünsün. Hər ikisində biotin yoxdur? Beləliklə, hər ikisi açılmış nümunəyə çəkiləcəkmi? Yoxsa aşağı açılma prosesi malik olan bir molekula əsaslanır 2 biotinlər? Əgər belə deyilsə, kəsilmiş DNT parçasının çarpaz bağlı və ya tək DNT parçasının nəticəsi olduğunu müəyyən etmək olarmı?

  2. Niyə DNT-nin bütün boş ucları bağlanmır? Şəkil 2? Natamam həzm? Bu biotin əlaqəsinə təsir edirmi?

  3. Növbəti sualım. Fərz edək ki, açılan proses yalnız çarpaz bağlanmış səkkizlik rəqəmləri seçir təmizlənmiş (yəni. çarpaz bağlayan zülal və ya formaldehid çıxarılır) iki zəncirlənmiş DNT zəncirindən ibarət halqa əmələ gətirir (yuxarı sağ küncdə olduğu kimi). Şəkil 4). Proses daha sonra genom boyu qeydə alınır əlaqə matrisi $m_{ij}$, lokuslar arasında "liqasiya məhsulları" sayı $i$ və yer $j$. a nədir "bağlama məhsulu"?

Bağışlayın, yuxarıdakıların çox olduğunu bilirəm, amma başa düşmək istəyirəm təbiət Mən təhlil etməzdən əvvəl məlumatların. yardımınız üçün təşəkkür edirik.


Beləliklə, həzm məhdudlaşdırıldıqdan sonra nümunə 5' çıxıntılı DNT fraqmentlərindən ibarətdir. Bunlar Klenow DNT polimerazı tərəfindən doldurulur və hər bir fraqmentin hər iki ucuna biotin-dCTP əlavə edilir. Sonra fraqmentlər elə şəraitdə (yəni aşağı DNT konsentrasiyası) bağlanır ki, çarpaz bağlanmamış DNT arasında bağlanma ehtimalı az olsun. Bu azaldılmış bağlama səmərəliliyi (bu, küt uc fraqmentlərinin istifadəsi ilə artıq azalıb) o deməkdir ki, bütün çarpaz bağlanmış fraqmentlər bağlanmaya bilər, məncə, Şəkil 2-də göstərdikləri şeydir. Bu reaksiya ilə birləşən hər hansı iki molekul deyilir. ligasiya məhsulları (yəni onlar bağlanma reaksiyasının məhsullarıdır).

Bu addımdan sonra nümunə T4 DNT polimeraza ilə müalicə olunur ki, bu da polimeraza aktivliyi ilə yanaşı (açıq-aydın) 3'->5' eksonükleaza aktivliyinə malikdir. Beləliklə, bağlanmamış istənilən sərbəst DNT ucları biotin çıxarılaraq kəsiləcək. Bu addımdan sonra biotin əsasən bağlama qovşaqlarında olacaq və bu molekullar muncuqlar tərəfindən seçici şəkildə aşağı çəkilə bilər. Mən əsasən deyirəm ki, bu sallanan ucların bəziləri hələ də biotin saxlayacaq, lakin xəritəçəkmə zamanı bunları ayırd etmək olar (aşağıdakı şəkilə baxın).

Öz-özünə dairələrə gəldikdə: onlar bağlandıqları üçün biotin ehtiva edəcək və çarpaz bağlanmış DNT ilə aşağı çəkiləcəklər. Bununla belə, bu DNT eyni genomik lokusdan olduğuna görə, onları xəritələşdirmə zamanı etibarlı qarşılıqlı əlaqədə olan cütlərdən də ayırmaq olar:

[mənbə]

Nəhayət, aşağı açılan mexanizm haqqında qısa bir qeyd. Muncuqlar streptavidin (və ya avidin) adlı bir zülal ilə örtülmüşdür, bu da biotinə çox möhkəm bağlanır. Hər hansı bir molekula (məsələn, DNT) yalnız bir biotinin tutulması lazımdır.


DNT liqasiyası

DNT-nin bağlanması bir çox müasir molekulyar biologiya iş axınlarında kritik bir addımdır. İki zəncirli substratda bir zəncirli qırılmanın bitişik qalıqları arasında nicklərin möhürlənməsi və iki zəncirli qırılmaların birləşməsi DNT ligazaları tərəfindən enzimatik olaraq kataliz edilir. Qonşu DNT qalıqlarının 3' hidroksil və 5' fosfat arasında fosfodiester bağının əmələ gəlməsi üç mərhələdə baş verir: İlkin olaraq, liqaz sərbəst ATP ilə reaksiya ilə öz-özünə adenilləşir. Sonra adenil qrupu "donor" zəncirinin 5'-fosforilləşmiş ucuna köçürülür. Nəhayət, fosfodiester bağının əmələ gəlməsi adenilatlanmış donor ucun bitişik 3' hidroksil qəbuledicisi ilə reaksiyasından və AMP-nin sərbəst buraxılmasından sonra davam edir. Canlı orqanizmlərdə DNT ligazaları DNT replikasiyası və təmirində mühüm rolu olan vacib fermentlərdir. Laboratoriyada DNT liqasiyası həm klonlama, həm də klonlanmayan tətbiqlər üçün həyata keçirilir.

DNT Ligase Fidelity: Nə vaxt vacibdir?

Yüksək sədaqətli polimerazalar hər yerdədir&mdash, lakin niyə sizə yüksək sədaqətli liqaza lazımdır? Və biz ligasiya haqqında danışarkən &ldqufidelity&rdquo ilə nəyi nəzərdə tuturuq? Bu vebinarda NEB Elmi və liqaza mütəxəssisi Greg Lohman DNT liqazaları tərəfindən uyğunsuzluq ligasiyası və NEB&rsquos HiFi kimi yüksək dəqiqlikli DNT ligazalarının istifadəsindən asılı olan molekulyar diaqnostika tətbiqlərini müzakirə edir. Taq DNT-də tək əsas fərqləri aşkar etmək üçün DNT Ligase.

DNT liqasiyası

DNT fraqmentlərinin bir DNT liqaza ilə birləşmə prosesi olan liqasiya üç mərhələdə davam edir. Sürətli təlimat animasiyamızla bağlama funksiyası haqqında daha çox məlumat əldə edin.

DNT liqasiyası üçün hansı molar nisbətlərdən istifadə etməliyəm?

Optimal reaktiv nisbəti aşağı axın tətbiqindən asılıdır.

Niyə DNT ligasiyasına PEG əlavə etməliyəm?

Polietilen qlikol (PEG) bağlama reaksiyalarında mühüm reagentdir, bunun səbəbini öyrənin.

DNT ligasyonu üçün ən yaxşı şərtlər hansılardır?

Aşağı axın tətbiqinin bağlama üçün ən yaxşı reaksiya şərtlərini necə diktə etdiyini öyrənin.

Bəzi ligations digərlərindən daha çətindir?

Küt ucların və tək əsaslı çıxıntıların bağlanması optimallaşdırılmış reaksiya şəraitini tələb edir.


Öyrənmə Məqsədləri

  • Mümkün patogenləri müəyyən etmək üçün hansı xəstə nümunələri istifadə olunur?
  • PCR nə edir, necə işləyir və nə üçün faydalıdır?
  • İstədiyiniz DNT-ni digərlərindən necə ayırırsınız?
  • Avtomatik DNT sequencer necə işləyir?
  • Nə üçün bakteriyaları müəyyən etmək üçün DNT ardıcıllığından istifadə etmək mümkündür?

Təlimatlar: Virtual laboratoriya sizə daxil olan prosedurlar vasitəsilə sizə yol göstərən altı hissəyə bölünür. Nə etdiyinizi və niyə etdiyinizi izah edən notebook bölməsini də oxumağı unutmayın. Hər bölməni tamamlayarkən müvafiq suallara cavab verin.

Hazırlıq nümunəsi

1. Çıxarma prosesində ilk addım nə etmək üçün məftildən istifadə edir?

2. DNT-nin çıxarılması üçün həzm fermentləri nə üçün lazımdır?

3. Sentrifuqa hüceyrə tərkibini iki fərqli təbəqəyə ayırır. Bu təbəqələri və onların içərisində olanları təsvir edin.

PCR gücləndirilməsi

4. PCR _________________________________ deməkdir

6. 3 dövr ərzində nə baş verdiyini təsvir edin

7. 30 sikldən sonra ilkin DNT zəncirinin neçə nüsxəsi istehsal edilmişdir?
Niyə bu mərhələ "amplifikasiya" adlanır?

PCR Təmizləmə

8. PCR-nin işlədiyini təsdiqləmək üçün 3 materialdan ibarət üç zolaq işə salınır. 3 zolaqda hansı materiallar var?

1-ci zolaq _______________________ 2-ci zolaq ____________________ 3-cü zolaq _______________________

9. Təmizləmə mərhələsinin ümumi məqsədi nədir?

Sıralama Hazırlığı

10. Təmizlənmiş PCR-ni əlavə etdiyiniz “sequencing dəmləməni” təsvir edin.

11. İkinci PCR-nin məqsədi işlətdiyiniz ilk PCR kimi eyni nüsxələri yaratmaq deyil. Bu PCR-in məqsədi nədir?

DNT ardıcıllığı

12. Son PCR məhsulu nədir, 12 boruda olan maddələr?

13. Gel elektroforezi nədir?

Ardıcıllıq təhlili

15. Nümunənizdəki bakteriyaların eyniliyi nədir? Səhifədə sadalanan addımları izləyin və səbirli olun. BLAST datasının axtarışı bir qədər çəkə bilər.

Genişləndirmə və Formativ Qiymətləndirmə

**Bu vərəqin əvvəlindəki təlim məqsədlərinə baxın. Bu məqsədlərə nail oldunuzmu? Daxil olan addımları gücləndirmək üçün simulyasiyanı yenidən edin. Qısa bir esse yazın Bu laboratoriyada öyrənmə məqsədlərini müzakirə edərək onlara nail olduğunuzu göstərir.**


Modul 1: Amin turşusu ardıcıllığının və peptid sintezinin təyini metodu

peptid Edman deqradasiyası adlanır, burada reagent fenil izotiosiyanatdır.

Və, fenil izotiosiyanta onun ətrafında inkişaf etmiş gözəl bir kimyaya malikdir və budur

olan fenil izotiosiyanat üçün N-terminus amin turşusunun hücumundan sonra

elektrofil. Bu, nəticədə ilk peptid bağının parçalanmasına səbəb olur və nəticədə

peptid başlanğıcdan bir amin turşusu azdır. Və bunu təcrid edə bilərsiniz

peptid və həmçinin hansı amin turşusunun fenillə reaksiya verdiyini müəyyən edə bilərsiniz

izotiyosiyanat və prosesi təkrarlaya bilərsiniz.

Ancaq Edmanın deqradasiya reaksiyalarına bağlı olmayan bəzi məhdudiyyətlər var

çox kəmiyyətli deyil, əslində reaksiyalar 90-dan çox yüksək məhsuldardır

faiz gəlir. Ancaq yadda saxlamalısınız ki, 90 addımlar olsa belə

reaksiyalar faiz verir, ikinci mərhələdən sonra reaksiya ümumi yüzdə 81 olur

məhsuldarlıq. Və beləliklə, nəzərə alsaq, hər addımda aşağı endiyi üçün kəskin şəkildə azalır

məhsuldarlığın 90% olduğunu, sonra 10 addımdan sonra olacaq

35%. Eynilə, sonra ümumi gəlir

Fərdi addımın səmərəsi 80% götürülərsə, 10 addım 9%-ə yaxın olacaq. The

Əgər siz sadəcə on 9-u çoxaltsanız, faiz əldə edilir və bu sizə gəlir və

ki, yaddaşa bölünən ona bölünən bir faizdir.

Beləliklə, nəticədə faiz çox aşağı olacaq, yalnız bir nümunə, dördünü etdiyinizi düşünək

hər addım 90% gəlirli addımlar. Beləliklə, məbləğ 9 x 9 x 9 x 9 olacaq, belə ki, olacaq

81, sonra 73 və 66 olun. Beləliklə, nəhayət, təxminən 63% gəlir (dəqiq olmaq üçün 65,6%) olacaq.

4 addımdan sonra. Beləliklə, gəlir aşağı düşür və hazırda məhdudiyyət gedə biləcəyinizdir

ola bilsin ki, dövr başına təxminən 30-a qədər amin turşusu ardıcıllığı bir gedişdə, bir atışda

Edmanın deqradasiyası. Beləliklə, bir zülalınız varsa, orada sona çatdıq, amma problem yatır

çox böyük olan zülalınız var və zülallar adətən çox böyükdür.

İndi sual budur ki, zülal və peptid arasındakı fərq nədir? Bəzən biz

peptid deyirik, bəzən biz zülalları çağırırıq, ümumiyyətlə, əsasən molekulyardır

çəki. Heç bir sərt və sürətli qaydalar yoxdur, ancaq bir şey 50-dən az amin ehtiva edirsə

turşuları sonra peptid adlandırılacaq. Tərkibində 50-dən çox amin turşusu varsa, adətən

sonra bu protein kimi təsnif edilir. Ancaq hər ikisini əhatə edəcək ümumi termindir

"polipeptid" polipeptidləri zülallarla yanaşı, 50-dən az amin turşusu olan peptidləri ehtiva edir.

50-dən çox amin turşusu. Ancaq hər ikisi arasında kəskin sərhəd yoxdur.

İndi yenə suala qayıdaq ki, əgər sizdə bir amin turşusu varsa

çox sayda amin turşusu, onda nə edəcəksən? Çünki, bir növ sən

yalnız 30-a qədər amin turşusunu və 30-dan çox olduqda, daha çoxunu təyin edə bilər

100 amin turşusu deməkdənsə, proteini daha kiçik parçalara ayırmalısınız. I

sizə dedim ki, bəzi fermentlərin çox spesifik olmasını edə bilən fermentlər var. Sən

zülalı amid bağlarını hidroliz edən turşu və ya əsasla müalicə etməklə bunu edə bilməz

lakin onlar konkret deyil. Beləliklə, hər bir amid bağı hidroliz ediləcək.

Beləliklə, zülalın daha kiçik parçalara parçalanmasında müəyyən xüsusiyyətlərə sahib olmalısınız.

Bu, əsasən, dərzi kəsir, dərzi düzəldilmiş qırılma deyilən şeydir

bir parça parçanı o qədər kiçik parçalara ayırır ki, nəticədə onlar bir-birinə bağlanırlar

paltar tikmək. Bu, proteini daha kiçik parçalara ayırdığınız çox oxşar bir prosesdir.

o kiçik parçaların ardıcıllığını, kiçik olanların amin turşularının ardıcıllığını təyin edin

parçaları və yenidən bağlayın, onlara qoşulun. bu birləşmədə fiziki birləşmə deyil, yenə sən deməkdir

sadəcə ardıcıllıqların nə olduğunu yazın və nəhayət, tapmaq üçün ardıcıllığı birləşdirin

İndi bununla bağlı yenə problemlər var, çünki zülal kimi bir proteininiz olduğunu düşünürsünüzsə

bu. Dedim ki, onu üç hissəyə kəssən A B C və müəyyən edirsən

bütün bu üç amin turşusu ardıcıllığı. Sonra növbəti sual gəlir ki, nədir?

Proteini üç hissəyə kəsdikdən sonra həqiqətən hansı parça olduğunu bilirsiniz

birinci gəlir, ondan sonra hansı və üçüncü nədir. Beləliklə, nə etməlisən, əgər

üç parçanız var, onda N terminalının nə olduğunu əlavə edə bilərsiniz (Sander tərəfindən

metod), C termini nədir ( karboksipeptidaza üsulu ilə). Və bunu etsəniz

onda hansının əslində A və C arasında olduğunu bilirsiniz.

İndi zülalları seçici şəkildə kəsə bilən bu fermentlərdən bəziləri haqqında danışaq

molekulu belə üç hissəyə ayırır. Beləliklə, onlara süni qayçı deyilir. İndi danışaq

bu süni qayçı və ya fermentlər nədir, hansı haqqında danışırıq

müəyyən mövqelərdə peptid bağlarının parçalanmasında çox xüsusi seçiciliyə malikdir.

Fermentlər də zülallardır. Beləliklə, əsasən katalitik gücə malik olan zülallardır

fermentlər adlanır, indi burada fermentlərdən danışırıq. Beləliklə, bu fermentlər onu pozur

zülal (peptid bağı) buna görə də, onlar birlikdə peptidaza adlanır, çünki onlardır

İndi bu fermentlərdən bəziləri hansılardır? Onların hamısı təbii olaraq hazırlanmışdır və bir xüsusi

birinə kimotripsin, digərinə tripsin deyilir, onda pepsin var. Beləliklə, bunlar

proteaz və ya peptidazdan bəziləridir, çünki onlar da proteaz adlandıra bilərsiniz

peptid bağını pozaraq, zülalları hissələrə ayırırlar.

Beləliklə, onlara proteazlar, bəzən proteazlar, bəzən peptidazlar deyilir. Və,

bunlar daha çox tripsin və kimotripsin istifadə olunan fermentlərdir

son dərəcə spesifik olanlar. Xüsusi o deməkdir ki, onlar yalnız müəyyən aminləri tanıyırlar

turşular və yalnız bu amin turşularını tanıdıqda peptid bağını parçalayacaqlar

amin turşuları ilə əlaqələndirilir.

Daha geniş spesifikliyə, daha geniş spesifikliyə malik olan hər hansı ferment identifikasiya deməkdir

bu 20-dən çoxlu amin turşusu varsa, o zaman peptidi parçalamaq və ya

zülalları bizim də istəmədiyimiz bir çox fraqmentlərə ayırır. Çünki biz fraqmentlər istəyirik

böyük olan, optimal ölçüləri olan və sayı çox olmamalıdır

Lazımsız olaraq zülal 10 ədəd 10 amin turşusuna kəsilirsə, bu,

məqsədə xidmət çünki, biri Edman dövrü sonda qətiyyətə gətirib çıxaracaq

30 amin turşusumuzdan çox geniş olan bir ferment seçməyin mənası yoxdur

Beləliklə, insanlar bu kimotripsin və tripsini seçdilər, çünki onlar var

son dərəcə seçicidir, onların seçiciliyi olduqca dardır. Olduqca dar yalnız onlar deməkdir

çox spesifik (müəyyən minimum sayda) amin turşularını tanıyır. Ximotripsin, bu nədir

Əgər sizdə CONH peptid bağı varsa və o, aromatikdirsə

bu tərəfdə amin turşusu və bu tərəfdə başqa bir amin turşusu.

Sonra ximotripsin bu aromatik amin turşusu ilə peptid bağını parçalayır

C terminal ucundan digər amin turşusu. Ximotripsin yalnız olduqda parçalanır

bir aromatik amin turşusu olan fenilalanin, o aromatik amin turşularını xatırlayın,

sonra Y olan tirozin və triptofan olan W. Beləliklə, bunlar üç aromatik amindir

turşular (F, Y və W). Beləliklə, əgər onlar mövcuddursa, peptid bağı parçalanacaq, lakin

bu aromatik amin turşusunun 2 peptid bağı ilə bağlandığını unutmayın. Biri N-də

terminal tərəfi, digəri isə C terminalı istiqamətindədir.

Beləliklə, əslində aromatik amin turşusu ilə peptid bağını pozur

karboksilik son. Deməli, demək istədiyim odur ki, bu da yenə başqasına bağlıdır

həm sol, həm də sağ tərəfdə peptid bağı. Burada aromatik amin turşusu üçün demək lazımdır, o

karboksi ucunda amin turşusu ilə peptid bağını pozur. Beləliklə, C ikiqat bağı

O bu sonunda, çünki, bu tərəfdəki karboksi sondur. Beləliklə, bu, kimotripsin haqqındadır

və ancaq bir şeyi xatırlamalısan ki, bu bitişik amin turşusu var

Məhdudiyyət, əgər bu amin turşusu prolin olarsa, hidroliz qəbul edilə bilməz

yer. Beləliklə, aromatik amin turşusu ilə əlaqəli növbəti amin turşusu olur

prolin olarsa, bu hidroliz baş verə bilməz. Bəs tripsin? Tripsin

çox oxşar şəkildə hidroliz edir, lakin o, yalnız lizin və kimi yüksək əsaslı amin turşularını tanıyır

arginin. Beləliklə, bu vəziyyətdə əsas amin turşusunuz var, əsas amin turşusu amin deməkdir

çox yüksək əsaslı yan zəncirinə malik olan turşular burada histidin haqqında danışmırıq. Mən dedim

histidin əsas amin turşusuna qruplaşdırılsa da, əsaslığı daha azdır

arginin və lizininizlə müqayisədə yaxşıdır.

Beləliklə, əsas amin turşusu varsa, hidroliz də baş verəcək, lakin bu dəfə

lazım olan ferment tripsindir. Beləliklə, tripsin amid bağını yenidən hidroliz edir

Əsas bir amin turşusunun karboksi ucunda isə pepsin çox daha genişdir

spesifiklik, o, əslində bir neçə amin turşusunu hidroliz edə bilir. Beləliklə, pepsindir

ümumiyyətlə proteini daha kiçik parçalara kəsmək üçün istifadə edilmir. İndi isə növbəti səhifəyə keçək.

Beləliklə, hər hansı digər mövzuya keçməzdən əvvəl növbəti nöqtə, əvvəlcə bir problemi həll etməyə icazə verin

indiyə qədər öyrəndiklərimizə əsaslanır.

Burada tripsinin nə olduğunu və necə göründüyünü göstərən bəzi şəkillərim var

kimi. Beləliklə, bu, tripsinin kristal quruluşudur və bu tripsin, kimotripsin və pepsinin

qidaların həzm olunması üçün vacib fermentlərdir. Belə ki, tərkibində çox olan qida qəbul etdiyimiz zaman

zülallar, bu zülallar daha kiçik parçalara və nəticədə parçalanmalıdır

amin turşularına çevrilir. Belə ki, bağırsaq vasitəsilə sorulur və sonra onlar yenidən

bədənimizdə ehtiyac duyduğumuz müxtəlif zülalları hazırlamaq üçün istifadə olunur.

Beləliklə, əvvəlcə katabolizm var, katabolizm böyük molekulları parçalayır. Beləliklə, biz

zülalları olan qidaları qəbul edin və bu zülallar tripsinin köməyi ilə hidrolizə olunur,

kimotripsin və pepsin, nəticədə daha sonra olan fərdi amin turşularına

sorulur və sonra sistem tərəfindən istifadə olunur. İndi tripsin belə görünür və var

əsas amin turşularını, lisini və arginini güclü şəkildə tanıdığı üçün spesifiklik.

Sonra sizdə kimotripsinlər var və bu, kimotripsinin kristal quruluşudur. Bu nə

edir? Yalnız aromatik amin turşularını tanıyır. Aromatik amin turşuları böyükdür

hidrofobik yan zəncir. Beləliklə, sual bəzi amin turşularını niyə tanımalarıdır

Ferment kimyasını öyrəndiyiniz zaman görərik ki, baş verənlər bu

molekul (perspektivli substrat) içəri daxil olur və böyük hidrofobik cib var

burada, aromatik qruplar əvvəlcə zəif qarşılıqlı təsirlərlə bağlanır, hidrofobikdir

qarşılıqlı təsirlər və sonra hidroliz və ya reaksiya davam edir.

Tripsin halında mənfi yüklü bir cib olmalıdır və onu tanıyır

normal pH 7.2-də müsbət yüklənmiş əsas amin turşuları. Deməli, gedəcək

və orada bağlayın və spesifiklik belə gəlir.

Və sonra pepsin var, pepsin seçiciliyi bir az daha geniş olan digəridir

digər peptid bağlarını tanıyır. Baxmayaraq ki, burada yalnız fenilalanin yazılıb,

triptofan və tirozin, yəni aromatik amin turşusu. Amma məncə, sonradan belə oldu

O, hətta digər amin turşularını da tanıya bildiyi üçün digərlərini də hidroliz edə bildiyini aşkar etdi

yalnız aromatik deyil, həm də hidrofobikdir.

Çünki hidrofobik qruplar təkcə aromatik qruplara aid deyil, tərkibində də mövcuddur

alifatik hidrofobik qruplara malik olan lösin, izolösin, valin. Beləliklə, pepsin üçün onun

spesifiklik bir qədər azdır, buna görə də insanlar pepsinə o qədər də etibar etmirlər.

İndi sizə dedim ki, yemək qəbul edərkən o, həzm olunmalı və parçalanmalıdır

daha kiçik amin turşuları və sonra bu amin turşuları udulur və onları etmək üçün istifadə olunur

Düşünürəm ki, bu təsnifatla, sual budur ki, biz edə bilərikmi?

amin turşuları bədən daxilində və ya yox.. Və bilirsiniz ki, aminlərin bir təsnifatı var

bədənimizdə amin turşularını hazırlaya bilməyəcəyimizə əsaslanan turşular. Və,

amin turşuları bədəndə biosintez edilə bilmədiyi zaman həmin amin turşuları deyilir

10 əvəzolunmaz amin turşusu vardır ki, onları pəhrizdən və qalanları ilə təmin etmək lazımdır

Bədən daxilində hazırlaya biləcəyimiz 10. Yəqin ki, siz bunu bilirsiniz, bu vacibdir

amin turşuları orqanizmdə əmələ gələ bilmir, onun qida ilə qəbulu vacibdir.

Digərləri isə vacib olmayan amin turşularıdır, onlar kifayət qədər normal şəkildə hazırlana bilər

həm böyüklərdə, həm də uşaqlarda miqdarı. Beləliklə, bu, aminlərin başqa bir təsnifat növüdür

İndi gəlin bir məsələ ilə məşğul olaq. İndi bir daha xatırlatmaq istəyirəm ki, bu tripsin və ya kimotripsin

və hətta digər proteazlarla əlaqəni poza bilmədilər (amin turşusu olsa belə

onların tanıdıqları seçim) ona bitişik prolin olduqda. Və, səbəb

prolinin bu nöqtədə quruluşu pozan ikincil amin qrupuna sahib olmasıdır.

Beləliklə, fermentlər üstünlük verdikləri amin turşusunun yan zəncirini yerləşdirə bilmirlər.

prolin həmin nöqtədə hidrolizi belə dayandırır. Hər hansı bir kimyəvi üsul varmı?

peptid bağını seçici olaraq parçalayır? Cavab bəli, bir reagent var

inkişaf etmişdir və buna siyanogen bromid deyilir.

Sianogen bromid CNBr düsturu olan çox sadə reagentdir. Sianogen

bromid yalnız əlaqəli peptid bağının qırılmasında çox spesifikdir

metionin. Beləliklə, o, yalnız bir amin turşusunu tanıyır. Və hansı reaksiya tələb olunur

bura yer? Baş verən kimya hər şeydən əvvəl əlaqəlidir, yəni sizdə var

aydın olsun ki, əgər metionindirsə, kodu M, əgər NH-dirsə, bu, bağdır.

siyanogen bromid tərəfindən parçalanır.

İndi isə slaydlarda mexanizmin burada verilə biləcəyi mexanizmi çəkməyə çalışaq,

Burada göstərə bilərəm. Baxın, bu, göstərilən genişləndirilmiş formada bir peptiddir. Və

metionin haradadır? Bu yan zəncir ilə metionin CH2CH2 və sonra

SME. Bu, çox əhəmiyyətli bir amin turşusudur ki, sonradan öyrənəcəksiniz ki, bu metioninin bir var

fərqli rol. Bədənimizdə metionin istehsal edə bilmiriksə, protein sintezimiz davam edir

çökmək. Ancaq məsələ bu deyil, biz siyanojenin necə olduğunu görməyə çalışırıq

bromid metioninlə əlaqəli peptid bağını parçalaya bilir.

Beləliklə, bu sizin metionin hissənizdir və bu da peptid bağıdır. Və indi müalicə etdiyiniz kimi

sianogen bromid, sianogen bromiddə bilirsiniz, bu karbon yüksək elektrofilikdir

iki elektronmənfi atomla əhatə olunmuşdur. Beləliklə, bu siyanogen bromidə hücum edir,

xüsusilə karbon və brom yarpaqları, çünki burada yaxşı tərk edən qrupdur. Belə ki,

brom yarpağı və brom gedən kimi, siz belə bir növ alırsınız.

S metil artıq orada idi və indi S bir siyanidə və bromidə birləşdiriləcək

ion siyanogen bromiddən ayrılır. Lakin, prosesdə sizin yaratdığınız şey a

sulfonium ionu, burada kükürdün artı yükü var.

Və indi nə olacaq ki, siz bunu etdikcə bu sulfonium hissəsi bir hala gəldi

indi qrupdan ayrılması çox yaxşıdır. Kükürd indi nə etmək istəyəcək? Kükürd istəyəcək

bu bağı qır. Yaxşı, necə olacaq? Bu, qonşulardan hər hansı biri tərəfindən baş verəcəkdir

Deməli, yaxınlıqda bu karbona hücum edə biləcək nukleofilik mərkəz varsa və ölçüsü

üzük olduqca uyğundur ki, uyğun bir varsa da vacibdir

Bu karbona hücum edən nükleofil, lakin o, yalnız 4 üzvlü və ya 3 üzvlü halqa yarada bilər.

üzvlü üzük (gərgin olan), onda bu baş verməyə bilər. Bu halda nə baş verir

nukleofilik mərkəz var və o, əsasən bu azot və bu amiddir

İndi, bu ikisi arasında, azotlu tək elektron cütü ilə konjugasiya var

karbonil. Bu o deməkdir ki, oksigen mənfi yükdə daha çox paya malikdir

azot və oksigen arasında. Beləliklə, siz onu göstərmək üçün sadəcə fərqli bir şəkildə yazırsınız

Başqa bir təsdiq, bu tərəfdəki karbonil və bu eyni peptiddir

yalnız burada baş verənləri sizə göstərmək üçün başqa bir təsdiqdə yazılmış istiqraz. Əgər

bu tərzdə yazırsan, onda görürsən ki, bu oksigen bu karbona çox yaxındır

indi müsbət yüklü kükürdün yaratdığı elektron çatışmazlığından əziyyət çəkir

kükürd özü ilə birlikdə bağlanmış elektronları alaraq uzaqlaşmaq istəyir.

Yaxşı, indi nə olacaq? Bütün bunlara azot, hidrogen kömək edəcək

burada tək cüt axır və sonra karbona hücum edən oksigen mənfi olur və

bu sönür. Beləliklə, nəhayət, çıxan molekul yan məhsul kimi bu CH3SCN-dir.

İndi sual budur ki, zülalımızla nə baş verir? Zülal indi bu iminium şəklindədir

azot əlavə yüklü və sonra bu çox sabit olmayacaq.

İndi su gəlir və bu karbona hücum edir və nəticədə hidroliz baş verir. Deməli, bu

hidroliz nəticədə siklik 5 üzvlü laktona gətirib çıxarır və bu lakton

Və bunun nəticəsi nə oldu? Nəticə bizdə olan bu peptid bağıdır

başladı, o peptid indi getdi ki, peptid bağı yoxdur. Və sizdə yeni var

bundan məhrum olan peptid, bu sol tərəfdən, burada yaşayan nə varsa, nə olursa olsun

Buradakı amin turşularının sayı nə qədərdirsə, o da yox olur. Beləliklə, metionin hissəsi çevrilir

N-terminal peptid fraqmentinə. Beləliklə, bu çox vacib bir reaksiyadır. Sianogen

bromid yalnız metionin üçün çox spesifikdir. Ancaq bu lakton indi adlanır

homoserin lakton. Niyə homoserin lakton adlanır? Serin nədir?

Serin bir α amin turşusudur və sonra bir CH2 və sonra bir OH var. Bu halda, nədir

baş verir? Serin olan bir CH2 var, onda başqa bir CH2 var, bu da sizə verir

serinin daha yüksək homoloqu və sonra oksigeniniz var.

Beləliklə, əsasən laktona çevrilən homoserindir. Beləliklə, nəticədə

homoserin laktona çevrilir

. Beləliklə, əgər bu əmələ gəlirsə, o zaman bilirsiniz ki, bu mövqedə bir metionin var və

fraqmentin qalan hissəsi, yəni C terminalından digər peptid hissəsidir

Ancaq ikinci amin turşusu sianogen bromid reaksiyası işləmir

serin olur. Burada görə bilərsiniz ki, bu serindir və bu sizin metionininizdir.

İlk reaksiya heç bir problem olmadan baş verir, brom sönür, buna görə də bunu əldə edirsiniz

sulfonium ionu. İndi, növbəti addımda, bir peptid bağı oksigen gəlir və buna hücum edir

karbon, kükürdün kimyası daha əvvəl baş verənlərə çox bənzəyir.

Ancaq indi bütün bu marşrutla getsəniz, görəcəyiniz şey, nəticədə siz olacaqsınız

homoserin laktonu ilə deyil, homoserin özü ilə nəticələnirsiniz.

Bu o deməkdir ki, burada peptid bağını pozmursunuz. Yəni buna baxmayaraq reaksiya verdi

sianogen bromid, son təsir metioninin a-ya çevrilməsidir

hər birinin son məhsulu olan homoserin. Bu mexanizmi özünüz sınaya bilərsiniz,

lakin əvvəlki ilə çox oxşardır.

Amma mexanizmin nə olduğunu problem olaraq sizin ixtiyarınıza buraxıram, onu da paylaşmaq fikrində deyiləm

slayd indi bu slayd göstərir ki, nəticədə homoserinə necə daxil olur. Belə ki,

Yenə təkrar edirəm əgər metionindən sonra serin varsa, o zaman o metionin olur

homoserin olur və bu son məhsuldur və heç bir peptidin qırılması yoxdur

bağ. Beləliklə, əgər heç bir qırılma yoxdursa, bunun olub olmadığını indi söyləmək həqiqətən çətin olacaq

metionin var idi ya yox.

Metionindən sonra sistein varsa, reaksiya da uğursuz olur, sisteinə nə olur?

Siz metionin kimi çox oxşar reaksiya gözləyə bilərsiniz. Əgər sistein varsa,

nə olacaq? Sistein də siyanogen bromid ilə reaksiya verəcək və nəhayət, o

peptid bağını da pozacaq? Xeyr, yox. Nə baş verir ki, sistein olacaq

mütləq reaksiya verir, SH var, siyanogen bromid ilə reaksiya verir. Beləliklə, SCN-ni təşkil edir

və bromid ionu ayrılır.

Problem ondadır ki, kükürdün müsbət yükü yoxdur, çünki əvvəllər

metionində hidrogen var idi, onun bir Me var, ancaq sisteininizdə SH-dir. Belə ki,

hidrogen burada itir və beləliklə, kükürdün müsbət yükü yoxdur. Deməli, a deyil

bu halda yaxşı ayrılan qrup və buna görə də son nəticə siyanidin əldə edilməsidir

hidroliz olunur. Beləliklə, siyanid hidrolizə düşərsə, izosiyanik turşu alırsınız və geri qayıdırsınız

Beləliklə, serin siyanogen bromid ilə reaksiya verir və sianogen bromid nəticədə

bu izosiyanik turşuya çevrilir. İzosiyanik turşu son məhsuldur, lakin yoxdur

hər hansı bir peptid bağının parçalanması. Deməli, bu, danışdığımız kimyəvi reagentdir.

Deməli, qırılmanın kimyəvi üsulu var. Beləliklə, zülalın necə parçalanacağını bilirik

tripsin və ya kimotripsin kimi fermentlərdən istifadə edərək daha kiçik parçalara ayırın. Və ya istifadə edə bilərsiniz

kimyəvi reagent, metioninin olub olmadığını və ya necə olduğunu bilmək istəyirsinizsə

bir çox metioninlər mövcuddur, bunların hamısı siyanogen bromid ilə müalicə edilə bilər.

Beləliklə, bütün mexanizm belə işləyir. Bu gün protein ardıcıllığı var

avtomatlaşsan, onu proqramlaşdırdığın maşın var və hər şey düzələcək.

Əvvəlcə tripsin və ya kimotripsin ilə həzm olacaq və biz bunu triptik adlandıracağıq

həzm və ya kimotriptik həzm. Və sonra ayrılacaq, parçalar olacaq

ayrılır və o, birbaşa amin turşusu analizatoruna gedəcək. Və sonra Edman edin

deqradasiya və nəticədə məlumatlar kompüter ekranına çıxacaq ki, bunlardır

Və nəhayət, bioinformatika alətindən istifadə etməklə siz nəyin olduğunu müəyyən edə bilərsiniz

fraqmentlər, müəyyən etdiyiniz ayrı-ayrı fraqmentlərin nə ilə bağlı olmasıdır


Müzakirə

Bitkilərdə xromatin 3D xəritəsi ilə bağlı əvvəlki tədqiqatlar əsasən yerli xromatin strukturlarına yönəlmişdi. Buğdada xromosomlararası qarşılıqlı təsirlər haqqında son hesabat əsasən transkripsiya qaydaları ilə əlaqələndirilmişdir [3]. Biz burada adi buğdada həm xromosom, həm də subgenom səviyyələrində yüksək səviyyəli struktura təsir edən mexanizmi araşdırdıq. Tapıntılar genetik ardıcıllığın kontekstinin poliploidiyanın sabitliyinə və bitki genomunun təkamülünə təsir göstərə bilən yüksək dərəcəli xromatin strukturlarına təsiri haqqında anlayışımızı artırdı.

Homologiya vasitəçiliyi ilə xromosomlararası qarşılıqlı təsirlərin nəticələri

Stabil subgenom irsiyyəti poliploid növlərin əsas xüsusiyyətidir [40, 41]. homoeologous cütləşmənin tanınmış yatırılması ilə yanaşı Ph1 locus [42,43,44], eyni altgenomda buğda xromosomları üçün artan yaxınlıqları təşviq edən əlavə mexanizmlər ola bilər. Müəyyən etdik ki, subgenom-qərəzli TE-lərlə əlaqəli yüksək ardıcıllıq homologiyası subgenomlar daxilində qarşılıqlı əlaqənin yüksək tezliyinə kömək edir. In addition to promoting within-subgenome links, homology-mediated inter-chromosome interactions are supported by or can help explain multiple genetic and cytological phenomena at the molecular level. First, the abundant interactions between subgenomes A and B may be due to the substantial genetic communication that developed during the relatively long co-existence period following tetraploidization. Second, the introgressed 1RS fragment has few inter-chromosomal interactions, likely because of the minimal genetic exchange with wheat chromosomes. Third, the Rabl chromosomal configuration has been detected in barley and wheat as well as in other crops with large genomes [28, 29]. An examination of Hi-C matrices indicated that the strong signal along the diagonal is associated with the centromere regions (Fig. 1a, c), implying in wheat cells with Rabl configuration, a major driving force of chromosome folding is likely derived from the centromere. The high density of TEs surrounding centromeres and the inter-chromosomal interactions within subgenomes may facilitate the formation of the Rabl structure. Fourth, the recent finding that inter-chromosomal interactions are more abundant than intra-chromosomal interactions in the autotetraploid species Arabidopsis [45] may be due to a relatively high inter-chromosomal sequence similarity.

Impact of TEs on higher-order subgenome stability

We revealed a previously uncharacterized role for subgenome-biased TEs related to within-subgenome communication in a hexaploid plant species (wheat). The canonical roles of TEs were previously confirmed to mainly involve changing gene and chromosome structures, developing new regulatory functions, and altering the accompanying epigenetic status [46]. In support of our findings, a recent study in mammals proved that TEs contribute to many loop anchors, some of which help maintain conserved higher-order chromosomal structures [47]. Furthermore, we observed a similar but more prominent pattern in human, where the location of Alu elements, the most proliferative retrotransposon in primates [48], is highly correlated with inter-chromosome interactions (Additional file 2: Supplemental Fig. 5). This is consistent a recent study in metazoan reporting the 3D folding correlated with the clustering of similar repetitive elements [49]. Our findings also raise an interesting question. Previous studies suggested that TEs in polyploid species can mediate inter-element recombinations, ultimately leading to rediploidization [46]. However, our data suggest the subgenome-biased TEs help promote the higher-order subgenome affinity in allohexaploid wheat. Thus, how the chromosomes of a wheat subgenome maintain their structural stability in the face of the high frequency of within-subgenome interactions should be determined. It remains unclear whether there is a mechanism restricting the degree of within-subgenome interactions to balance the maintenance of higher-order chromosomal structures and the sequence stability of the interacting chromosomes.


Böyük Şəkil


So, which method for library quantitation is right for you? Your answer will depend on a number of factors that are specific to your situation, including your laboratory&rsquos preferred DNA quantitation method, the tools you have available, your source material, and the size and scope of your experiment. No matter which platform you&rsquoll be sequencing on, it is important to accurately determine the amount of sequence-ready DNA present. As we&rsquove described, accurate quantitation makes a meaningful differ- ence in the quality of the data you&rsquoll create and the overall value of your experiment, by ensuring generation of optimal cluster densities and the equivalent representation of multiplexed libraries when pooling.

Using a qPCR-based approach, as we&rsquove just reviewed, ensures the most accurate quantitation, providing optimal conditions for Illumina&rsquos sequencing chemistries. To make NGS library quantitation more accurate and reproducible, New England Biolabs® (NEB®) offers the NEBNext Library Quant Kit for Illumina. This qPCR-based kit is compatible with a broad range of library insert sizes and GC content, and has a user-friendly workflow.


The purpose of these two steps is to clear water of the small particles that cause it to be turbid or cloudy. Turbidity renders the water hard to disinfect. The water is rapidly agitated to disperse coagulant chemicals throughout it. The small particles, including many bacteria, begin to form large clumps called flocs or floccules. In flocculation, the water is mixed gently so that these clumps combine and precipitate out further.

The water and flocs are pumped into sedimentation basins. Here, the flocs settle beneath the water so that they can be removed. About 85 to 90 percent of the suspended particles responsible for turbidity are removed at this point, including large amounts, but not all, of the bacteria.


Zhe Liang and Qian Zhang contributed equally to this work.

Əlaqələr

Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100081, China

Zhe Liang, Qian Zhang, Guihua Hu, Pingxian Zhang, Yifan Wang, Liwen Yang & Xiaofeng Gu

Centre for Organismal Studies, Heidelberg University, 69120, Heidelberg, Germany

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, 571101, China

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Töhfələr

Z.L. and X.G. tədqiqatı düşünüb və layihələndirib. Z.L., Q.Z., Y.Z., and G.H. performed the experiments. Z.L., C.J., P.Z., Y.W., L.Y., and X.G. analyzed data. Z.L. and X.G. wrote the paper. The authors read and approved the final manuscript.

Müəllif


Summary: The ATAC-Seq Method Has Changed the Way Researchers Start Doing Epigenetics

When first getting started in the field of epigenetics, the vast variety of methods that are out there can be overwhelming. To pick one approach to tackle your biological question might not be so obvious or easy. Methods like DNase-Seq, FAIRE-Seq, DamID, Hi-C, or ChIP-Seq require millions of cells and often a fair amount of optimization, and in the end, they may only deliver a limited amount of information, leaving you with an incomplete picture of the epigenomic landscape in your samples.

ATAC-Seq has changed the way scientists can approach getting started with epigenetics. The ATAC-Seq protocol requires only about 50,000 cells as starting material, and with its relatively short two-step protocol, it is an attractive method to start your epigenetic journey.

Whether you want to analyze the state of the chromatin in your sample or compare the chromatin state before and after a special treatment, ATAC-Seq allows you to investigate genome-wide chromatin changes and can offer guidelines about which epigenetic modification or transcription factor should be studied next in the follow-up experiments and which method should be used to study them.

ATAC-Seq has made it easier and faster than ever to study the chromatin landscape and take your first steps into the world of epigenetics.

Contact us if you are interested in learning more about ATAC-Seq, how our service works, or to obtain a quote.

Müəllif haqqında

Stefan Dillinger, Ph.D.

Stefan was born in the Free State of Bavaria, Germany. After studying biochemistry in Ulm and Regensburg, he got his Ph.D. in the field of epigenetics, studying the distribution of heterochromatin around nucleoli during cellular senescence. As a graduate student he started his own German science podcast &ldquoThe Random Scientist&rdquo and is now the host of Active Motif&rsquos Epigenetics Podcast. When Stefan is not working at Active Motif or recording podcasts, he is a passionate runner (he finished the New York City Marathon in 3 hours 21 minutes!!) and loves to spend time with his wife and son.

Contact Stefan on LinkedIn with any questions, or to get running advice.

What are your favorite recent epigenetics breakthroughs? We&rsquod love to hear from you! Please contact us at [email protected] or on Twitter (@activemotif) to share your thoughts and feedback! We&rsquore also looking for science writers to contribute to MOTIFvations, so if you&rsquore an established science communicator or just want to get started, please reach out &ndash there might be a story we can collaborate on!


Müəllif məlumatı

Əlaqələr

MOE Key Laboratory of Bioinformatics Bioinformatics Division and Center for Synthetic & Systems Biology, TNLIST School of Medicine, Tsinghua University, Beijing, 100084, China

Zhengyu Liang, Yanjian Li, Michael Q. Zhang & Yang Chen

MOE Key Laboratory of Bioinformatics Bioinformatics Division and Center for Synthetic & Systems Biology, TNLIST Department of Automation, Tsinghua University, Beijing, 100084, China

Guipeng Li, Zejun Wang, Mohamed Nadhir Djekidel & Yang Chen

Medi-X Institute, SUSTech Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Southern University of Science and Technology, Shenzhen, 518055, China

School of Mathematical Sciences, Peking University, Beijing, 100871, China

Department of Biological Sciences, Center for Systems Biology, The University of Texas, Dallas 800 West Campbell Road, RL11, Richardson, TX, 75080-3021, USA


Videoya baxın: Fatback - Backstrokin Official Audio (Yanvar 2022).