Məlumat

Molekullar, Hədəflər və İzoformalar

Molekullar, Hədəflər və İzoformalar



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Sualım var. A molekulunu və X, Y geninin iki izoformasını və A-nın X-i hədəf alması barədə məlumatı nəzərə alsaq. Bundan A-nın Y-ni hədəf alıb-almaması ilə bağlı nəsə nəticə çıxara bilərəmmi?

Motivasiya olaraq Furosemid (= A) və SLC12A1, SLC12A2 haqqında düşünün. Drugbank-dan bilirəm ki, Furosemide SLC12A1-i, KEGG-dən isə Furosemidin hər iki geni hədəf aldığını bilirəm. Maraqlıdır, mən artıq Drugbank biliklərindən KEGG biliklərini çıxara bilərəmmi...

Yaxşı, Alex :)


Qısa cavab xeyrdir. Əsas odur ki, geninizin hər bir izoformunun ardıcıllığı və qatlanması (əgər siz DNT əvəzinə A-nın zülallara bağlanmasından danışırsınızsa) hələ də A-nın bağlanması ilə nəticələnir.

Başqa sözlə, A X-ə bağlana bilər. Y, X-in izoformu A-nın bağlamaq istədiyi ardıcıllığa malik olmaya bilər. Və ya zülallar və A vəziyyətində, Y bir az fərqli şəkildə qatlana bilər, A-dan Y-yə əlçatanlığın qarşısını alır.


Tenascin izoformları: xərçəngin diaqnozu və müalicəsi üçün mümkün hədəflər və onların ifadəsini tənzimləyən mexanizmlər

Fərqli sayda III homoloji təkrarları ehtiva edən funksional fərqli tenascin (TN) izoformları tək TN əsas transkriptinin alternativ birləşməsi ilə yaradılır. Bu yaxınlarda bildirilmişdir ki, daha böyük TN izoformu, ümumiyyətlə, şişin yarandığı normal toxumalara nisbətən neoplastik toxumalarda daha çox ifadə edilir. Bu, ən azı döş lezyonlarında stromal elementlərin yüksək proliferativ aktivliyi ilə bağlıdır. Əslində, TN-nin birləşməsi hüceyrə dövründən asılıdır, beləliklə, alternativ birləşməni tənzimləyən molekulyar mexanizmləri öyrənmək üçün həyat qabiliyyətli bir sistem təklif edir və birincil transkriptlərin (çox güman ki, TN ilə məhdudlaşmır) birləşmə modelində hüceyrə dövründən asılı dəyişiklikləri təklif edir. pre-mRNA) həm də hüceyrə dövrünün tənzimləmə mexanizmi ola bilər. Bundan əlavə, neoplaziyada daha böyük TN izoformunun çox yüksək yığılması bir sıra şişlər üçün daha böyük TN izoformları üçün spesifik olan daha geniş diaqnostik və terapevtik monoklonal anticisimləri nəzərdən keçirməyə imkan verir.


Hədəf Xüsusi Təhlil Xidmətlərinə Baxış

Reaction Biology yeni dərmanların kəşfini dəstəkləmək üçün 1000-dən çox hədəf üçün mürəkkəb skrininq analizlərini təklif edir. Təhlillərimizin əksəriyyəti yüksək məhsuldarlığa uyğundur və xüsusi tələblərinizə uyğunlaşdırıla bilər.

Reaction Biology sənayedə kinaz analizlərinin ən böyük portfelini təklif edir. Biz preklinik dərman kəşfi prosesinin bütün mərhələlərini əhatə edən kinaz dərmanının kəşfi üçün sona qədər xidmət göstərməyə həsr olunmuşuq.

Epigenetik fermentlər insan genomu üçün "on" və "off" açarları kimi çıxış edərək, genetik ifadə mexanikasına nəzarət edir. Bu fermentlərin nasazlıqları bir çox immunoloji və neyrodegenerativ şəraitdə, eləcə də xərçənglə əlaqədardır. Biz preklinik dərman kəşfi prosesinin bütün mərhələlərini əhatə edən epigenetik dərman kəşfi üçün sona qədər xidmət göstərməyə həsr olunmuşuq.

Kras yolunu hədəf alan dərmanların aşkarlanması üçün bir sıra analiz formatları mövcuddur. Biokimyəvi və biofiziki üsullar müxtəlif KRas tənzimləyicilərinin tədqiqinə imkan verir.

Poli (ADP-riboza) polimeraza (PARP) fermentlərinə qarşı mürəkkəb skrininq qızıl standart radiometrik aktivlik analizləri ilə aparılır.

Fosfatazaların aktivliyi anti-fosfataz birləşmələrinin profilləşdirilməsi üçün flüoresan əsaslı yanaşma ilə ölçülür.

Bizim böyük proteaz analiz panelimiz proteaz inhibitorlarının məqsədyönlü dərman kəşfinə, həmçinin proteaz panelimizlə seçicilik skrininqinə imkan verir. Bütün analizlər flüoresan əsaslıdır və proteaz aktivliyinin miqdarını müəyyənləşdirir.

Reaction Biology apoptoz yolunu hədəfləyən test molekullarının tədqiqi üçün analizlər təklif edir. Təhlil texnologiyası BCL2 kimi apoptotik zülalın BAK kimi substrat peptidinə bağlanmasını ölçür.

Metabolik Yol Təhlilləri

Fosfodiesteraza fermentlərinə qarşı yeni dərmanların kəşfini dəstəkləmək üçün Reaction Biology mürəkkəb skrininq üçün aktivlik analizlərini təklif edir.

Reaksiya Biologiyası birləşmənin toksikliyinə dair ilkin təlimatı təmin etmək üçün 6 ən vacib CYP izoformuna qarşı birləşmə profilini təmin edir.

Proteazom və deubikitinazları inhibə etmək üçün mürəkkəb skrininq üçün analizlər Reaction Biology tərəfindən flüoresan əsaslı fəaliyyət analizləri ilə təklif olunur.

Reaction Biology ion kanallarını hədəf alan dərmanların kəşfi üçün hüceyrə əsaslı testlər təklif edir.

Reaction Biology GPCR biologiyası və farmakologiyası sahəsində dərman kəşfi tədqiqatlarını inkişaf etdirmək üçün xidmətlər təklif edir.

Reaction Biology nüvə reseptorlarını modulyasiya etmək üçün yeni dərmanların kəşfini dəstəkləmək üçün hüceyrə əsaslı analizlər dəstini təklif edir.

Əlavə Hədəflər

Reaction Biology sizə kinazlar, epigenetika, PARPs, DUB, HSP, proteaza, fosfataza və sair kimi müxtəlif hədəf sinifləri üçün zülalların və analizlərin istehsalında kömək edə bilər.


Bioaktiv kiçik molekullar və onların bitki hədəfləri üzrə struktur biologiya perspektivi

Son illərdə aparılan struktur biologiya səyləri onların bitki hədəfləri ilə qarşılıqlı əlaqədə olan bioaktiv kiçik molekulların çoxsaylı ko-kristal strukturlarını yaratmışdır. Bu tədqiqatlara müxtəlif fitohormonların, patogen törəmə effektorlarının, herbisidlərin və digər bioaktiv birləşmələrin hədəfləri daxildir. Burada müzakirə edirik ki, bu strukturlar toplusunda doqquz kollektiv müşahidənin gözəl nümunələri var: molekulyar yapışqanlar, allosteriya, inhibitorlar, molekulyar mimika, qeyri-adi bağlanma yerləri, gözlənilməz elektron sıxlıqları, atom rezolyusiyasında təbii seleksiya və strukturla idarə olunan mutagenez və kiçik molekullarda tətbiqlər. dizayn.

Vurğulananlar

► Bitki zülallarının bioaktiv kiçik molekulları olan 70-dən çox kristal quruluşu haqqında məlumat verilmişdir. ► Biz bu əlyazmalardan doqquz kollektiv müşahidəni müzakirə edirik. ► Biz inhibitorlar, allosterik liqandlar və ya molekulyar yapışqan kimi fəaliyyət göstərən kiçik molekulların aydın nümunələrini tapdıq. ► Kiçik molekullar da endogen molekulları təqlid edə və ya qeyri-adi bağlanma yerlərinə bağlana bilər. ► Gözlənilməz elektron sıxlıqları təəccüblü liqandları aşkar etdi. ► Herbisid hədəfləri üzrə struktur biologiya müqavimət mutasiyalarını izah edir. ► Struktur məlumatı kiçik molekulların dizaynı və struktura əsaslanan mutagenez üçün istifadə edilmişdir.


Molekullar, Hədəflər və İzoformalar - Biologiya

MDPI tərəfindən nəşr olunan bütün məqalələr açıq giriş lisenziyası altında dərhal bütün dünyada əlçatan edilir. MDPI tərəfindən dərc edilmiş məqalənin, o cümlədən rəqəmlər və cədvəllər də daxil olmaqla, hamısının və ya bir hissəsinin təkrar istifadəsi üçün xüsusi icazə tələb olunmur. Açıq giriş Creative Common CC BY lisenziyası altında dərc olunan məqalələr üçün məqalənin hər hansı bir hissəsi orijinal məqaləyə aydın şəkildə istinad etmək şərti ilə icazəsiz təkrar istifadə edilə bilər.

Feature Papers sahədə yüksək təsir üçün əhəmiyyətli potensiala malik ən qabaqcıl tədqiqatları təmsil edir. Bədii məqalələr elmi redaktorlar tərəfindən fərdi dəvət və ya tövsiyə əsasında təqdim olunur və dərc edilməzdən əvvəl ekspert rəyindən keçir.

Bədii məqalə ya orijinal tədqiqat məqaləsi, tez-tez bir neçə texnika və ya yanaşmanı özündə cəmləşdirən əsaslı yeni tədqiqat işi, ya da elmi sahədə ən maraqlı nailiyyətləri sistematik şəkildə nəzərdən keçirən sahədəki ən son irəliləyişlərə dair qısa və dəqiq yenilikləri olan hərtərəfli icmal sənədi ola bilər. ədəbiyyat. Bu tip kağız tədqiqatın gələcək istiqamətləri və ya mümkün tətbiqlər haqqında dünyagörüşünü təqdim edir.

Redaktorun Seçimi məqalələri dünyanın hər yerindən MDPI jurnallarının elmi redaktorlarının tövsiyələrinə əsaslanır. Redaktorlar jurnalda bu yaxınlarda dərc edilmiş az sayda məqaləni seçirlər ki, onlar müəlliflər üçün xüsusilə maraqlı və ya bu sahədə vacib olacaq. Məqsəd jurnalın müxtəlif tədqiqat sahələrində dərc edilmiş ən maraqlı işlərdən bəzilərinin şəklini təqdim etməkdir.


Giriş seçimləri

1 il ərzində jurnala tam giriş əldə edin

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.
ƏDV daha sonra ödəniş zamanı əlavə olunacaq.
Vergi hesablanması yoxlama zamanı yekunlaşacaq.

ReadCube-da vaxt məhdud və ya tam məqaləyə giriş əldə edin.

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.


Nəticələr

Plantada Pi04314 ifadəsi infeksiyanı gücləndirir

Namizəd RXLR effektoru PITG_04314/PexRd24 (Pi04314) bütün ölkələrdə infeksiyanın biotrofik fazası zamanı güclü və xüsusi olaraq yuxarı tənzimlənir. P. infestans təcrid 22,23,24 sınaqdan keçirilmişdir. İnfeksiyanın erkən mərhələlərində (peyvənddən 24-72 saat sonra) onun yüksəldilməsini təsdiqlədik. N. benthamiana Laboratoriya tədqiqatları üçün istifadə etdiyimiz 88069 izolatında kəmiyyət tərs transkripsiyası (qRT) – PCR istifadə edərək (Əlavə Şəkil 1a). N. benthamiana üçün geniş istifadə olunan model ev sahibidir P. infestans, çünki keçici imkan verir Aqrobakteriya- patogen və ev sahibi arasında molekulyar qarşılıqlı əlaqənin funksional xarakteristikasına kömək etmək üçün vasitəçi gen ifadəsi, virus səbəbli gen susdurulması (VIGS) və qeyri-invaziv konfokal mikroskopiya 16,19,20,26.

Pi04314-ün hüceyrəaltı lokalizasiyasını müəyyən etmək üçün Pi04314-ə N-terminal yaşıl flüoresan zülal (GFP) birləşməsi müvəqqəti olaraq ifadə edildi. N. benthamiana. GFP–Pi04314, sabit idi bitkilərdə (Əlavə Şəkil 1b), əlavə sitoplazmik fonla nukleoplazmada və nüvədə güclü şəkildə yığılmışdır (Şəkil 1a Əlavə Şəkil 1c). Pi04314-ün töhfə verməkdə rol oynayıb-oynamadığını qiymətləndirmək P. infestans virulentlik, GFP-Pi04314 keçid dövrünün yarısında ifadə edildi. N. benthamiana digər ifadə pulsuz GFP ilə yarpaq. Yarpaqların iki yarısı damcı ilə vuruldu P. infestans zoosporlar və lezyon ölçüsü peyvənddən 7 gün sonra ölçüldü (d.p.i.). GFP-Pi04314 ifadə edən yarpaqların yarısının əhəmiyyətli dərəcədə irəlilədiyi aşkar edilmişdir (diferensiyanın təhlili (ANOVA), P<0.001) daha böyükdür P. infestans sərbəst GFP ilə müqayisədə lezyonlar, ev sahibi hüceyrələrin içərisində Pi04314 fəaliyyətinin infeksiyaya faydalı olduğunu göstərir (Şəkil 1b Əlavə Şəkil 2).

(a) Şəkillər GFP–Pi04314 konfokal Z seriyasının proqnozları və əlavə hədəf siqnalları ilə birləşmə formalarıdır. mirGFP–Pi04314 və NLSGFP–Pi04314 müvafiq olaraq nüvədəki effektor birləşməsinin səviyyəsini azaltmaq və ya artırmaq üçün. Daxil edilmiş şəkillər hüceyrələrin nüvələrindən keçən tək optik hissələrdir. Ölçək çubuğu, 20 μm. (b) GFP–Pi04314 və NLSGFP–Pi04314 təşviq edə bilir P. infestans sonrakı artım Aqrobakteriya- GFP nəzarəti ilə müqayisədə vasitəli ifadə. Lezyon diametri arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqli deyildi mirGFP–Pi04314-ifadə edən bitkilər və nəzarət. Səhv çubuqları standart xətadır və qrafik üç bioloji təkrardan birləşmiş məlumatları əks etdirir (n=56 hər konstruksiya). Qrafikdəki hərflər statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (ANOVA, P≤0.005).

Host hüceyrələrində Pi04314 fəaliyyətinin yerini daha da araşdırmaq üçün effektor N-terminal miristoyasiya siqnalı ilə ifadə edildi (mirGFP-04314), əvvəllər təsvir edildiyi kimi 19, onu bitki membranları ilə əlaqələndirmək, beləliklə də onu nüvədən uzaqlaşdırmaq. Bu strategiya nüvə ixrac siqnalının əlavə edilməsinə üstünlük verməklə seçilmişdir, çünki nüvə ixrac siqnalı ilə effektor ixrac edilməzdən əvvəl hələ də nüvəyə daxil olacaq 27 . The mirGFP-04314 füzyonu həqiqətən nüvədən əhəmiyyətli dərəcədə azad edildi (Şəkil 1a Əlavə Şəkil 1c). Bunun əksinə olaraq, Pi04314-ü nüvəyə yönəltmək üçün N-terminal nüvə lokalizasiya siqnalı əlavə edildi (NLSGFP–Pi04314) 28 . The NLSGFP-Pi04314 füzyon proteini ilk növbədə nüvədə aşkar edildi və sabit qaldı. bitkilərdə (Şəkil 1a Əlavə Şəkil 1c). mirGFP–Pi04314 və NLSGFP-Pi04314 birləşmələri keçici olaraq ifadə edildi N. benthamiana və yarpaqlara meydan oxudular P. infestans. Şəkil 1b ifadəsini göstərir mirGFP–Pi04314 pulsuz GFP nəzarəti (ANOVA, P=0,406), halbuki GFP–Pi04314 və NLSGFP–Pi04314 dəstəyi müqayisə edilə bilər P. infestans lezyon ölçüləri (ANOVA, P=0,964), bu da pulsuz GFP nəzarətindən (ANOVA, P<0.001) və ya daha çox mirGFP–Pi04314 (ANOVA, P=0,006 və P=0,007). Bu müşahidələrə əsaslanaraq, Pi04314-ün ev sahibi nüvədə lokallaşdırılmasının tələb olunduğunu və yarpaq kolonizasiyasını gücləndirmək üçün kifayət etdiyini təklif edirik. P. infestans.

Pi04314 PP1c-nin üç izoforması ilə qarşılıqlı əlaqədə olur

Pi04314-ün mümkün host hədəflərini müəyyən etmək üçün yoluxmuş kartof cDNA 16-dan yaradılmış maya-2-hibrid (Y2H) kitabxanası GAL4 DNT-ni bağlayan domen-Pi04314 birləşmə konstruksiyasına (“yem”) malik 2,6 milyon maya ko-transformantının dərinliyinə qədər yoxlanılmışdır. ). On səkkiz maya koloniyası GAL4 aktivləşdirmə domeni (“yırtıcı”) birləşmələrini ehtiva edən seçmə plitələrdən bərpa edildi, onların ardıcıllığı bundan sonra StPP1c-1, StPP1c-2 və StPP1c-3 adlanan kartof PP1c ailəsi zülallarının üç fərqli izoformuna uyğun gəlir. Kartof zülallarının kəsilmiş uyğunlaşmasına əsaslanan filogenetik ağac Ərəbidopsis birinci tip protein fosfatazları (TOPPs) StPP1c-1, StPP1c-2 və StPP1c-3-ün AtTOPP1, AtTOPP2, AtTOPP4 və AtTOPP5 ilə çoxluq təşkil etdiyini göstərdi (Əlavə Şəkil 3). Bu üçünün ifadə səviyyələri StPP1c ilk 2 gün ərzində genlər əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmir P. infestans infeksiya (Əlavə Şəkil 3), onların immunitetə ​​cavab verdiyinə dair heç bir əlamət vermir.

Qarşılıqlı əlaqələri yenidən təsdiqləmək üçün, mənfi nəzarət yemi kimi RXLR effektor SFI3 istifadə edərək, Pi04314 yeminə qarşı tam uzunluqlu StPP1c yırtıcı klonları ilə ikili Y2H aparıldı. SFI3 isə Pi04314-ə bənzər nüvə lokalizasiyasını göstərir, həm də gücləndirir P. infestans keçici olaraq ifadə edildikdə yarpaq kolonizasiyası bitkilərdə, Pi04314-dən fərqli olaraq, o, bakterial PAMP flg22 tərəfindən aktivləşdirilmiş erkən transkripsiya cavablarını boğur və onun oxşar funksiyanı paylaşmadığını göstərir 19. Pi04314, B-qalaktosidaz aktivliyinin induksiyası və histidin olmayan mühitdə böyümə ilə göstərildiyi kimi hər PP1c izoformu ilə qarşılıqlı təsir göstərir, halbuki SFI3-PP1c birləşmələri heç bir müxbiri aktivləşdirməmişdir (Şəkil 2a).

(a) PP1c izoformlarını Pi04314 ilə birgə ifadə edən maya histidin (HIS) mühitində böyüdü və b-qalaktosidaza (B-gal) aktivliyi verdi, SFI3 nəzarəti və ya boş vektor (EV) ilə birgə ifadə edilənlər isə bunu etmədi. (b) GFP–Trap istifadə edərək aqroinfiltrasiya edilmiş yarpaqlardan zülal ekstraktlarının immunoprecipitasiyası (IP) cMyc etiketli PP1c izoformlarının GFP–SFI3 nəzarəti ilə deyil, xüsusi olaraq GFP–Pi04314 ilə əlaqəli olduğunu təsdiq etdi. Yarpaqlarda konstruksiyaların ifadəsi + ilə göstərilir. Protein ölçüsü markerləri kDa ilə, zülal yüklənməsi isə Ponso ləkəsi ilə göstərilir.

Bu qarşılıqlı təsirlərin də baş verdiyini təsdiqləmək üçün bitkilərdə GFP–Pi04314 və N-terminal cMyc etiketli PP1c konstruksiyalarından (cMyc–PP1c-1, cMyc–PP1c-2 və cMyc–PP1c-3) istifadə etməklə birgə immunopresipitasiya (Co-IP) təcrübələri aparılıb və GFP–SFI3 kimi istifadə edilib. qarşılıqlı təsir göstərməyən nəzarət. GFP və cMyc birləşmə konstruksiyaları keçici olaraq birlikdə ifadə edildi N. benthamiana və GFP–TRAP_M muncuqlarından istifadə etməklə immunopresipitasiyadan sonra cMyc–PP1c-1, cMyc–PP1c-2 və cMyc–PP1c-3 konstruksiyalar GFP–Pi04314-ün iştirakı ilə immunoprecipitasiya edilmişdir, lakin bütün GFP–SFI3 konstruksiyaları ilə yox. müvafiq giriş fraksiyalarında aşkar edilmişdir (şək. 2b).

Pi04314 nüvəcikdən StPP1c izoformlarını yenidən lokallaşdırır

StPP1c izoform monomer qırmızı flüoresan zülalının (mRFP) hüceyrəaltı lokalizasiyasını araşdırmaq üçün N-terminal birləşmə konstruksiyaları yaradıldı (mRFP–PP1c-1, mRFP–PP1c-2 və mRFP–PP1c-3) və aşağıdakılara baxıldı. Aqrobakteriya-də vasitəli ifadə N. benthamiana konfokal mikroskopiyadan istifadə etməklə. Hər bir mRFP–PP1c füzyon zülalı əsasən sitoplazmatik floresansı ilə nukleoplazma və nüvəcikdə lokallaşdırılmışdır (Əlavə Şəkil 4a).

Pi04314 və StPP1c izoformaları müstəqil şəkildə ifadə olunduqda oxşar hüceyrəaltı lokalizasiyalar nümayiş etdirdiyinə görə, hər bir mRFP–PP1c konstruksiya GFP–Pi04314 və ya nəzarət kimi GFP–SFI3 ilə birgə ifadə edilmişdir. Təəccüblüdür ki, hər bir mRFP–PP1c konstruksiyası GFP–Pi04314 ilə birlikdə ifadə edildikdə azalmış nüvə flüoresansını nümayiş etdirdi, halbuki GFP–SFI3 ilə ifadə edildikdə nüvə mRFP–PP1c lokalizasiyasında heç bir dəyişiklik olmadı (Şəkil 3a).

(a) Şəkil dəstləri GFP–Pi04314 və ya mRFP ilə birləşdirilən PP1c-nin hər bir izoformu ilə GFP–SFI3 nəzarətini birgə ifadə edən tipik nüvələrin tək optik bölmələridir. Ölçək çubuğu, 5 μm. Ağ oxlar hər şəklin sağındakı qrafiklərdə göstərilən mRFP flüoresans intensivliyi qrafiklərini göstərir. (b) PP1c izoformalarından nüvə və nukleoplazmik mRFP flüoresansının orta nisbətlərinin qrafikləri, nüvədən mRFP–PP1c-nin əhəmiyyətli itkisinin yalnız GFP–Pi04314 mövcudluğunda baş verdiyini nümayiş etdirir. Orta göstəricilər hər bir şərt üçün 50-dən çox nüvənin təsvirlərindən əldə edilmişdir. Səhv çubuqları s.e. və qrafik altı bioloji təkrardan birləşdirilmiş məlumatları əks etdirir. Qrafiklərdəki hərflər statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (ANOVA, P<0.001).

mRFP-PP1c nüvəsinin nukleoplazmatik floresanya nisbəti hər bir konstruksiya və (birgə ifadə hadisəsi) üçün 50-dən çox nüvədə ölçüldü və həqiqətən də statistik əhəmiyyətli azalma aşkar etdi (ANOVA, P<0.001) GFP–Pi04314 ilə birgə ifadə edildikdə, GFP–SFI3 ilə birgə ifadə ilə müqayisədə və ya hər mRFP–PP1c konstruksiyasının tək ifadə edildiyi zaman (Şəkil 3b). GFP–Pi04314 varlığında azalmış nüvə mRFP–PP1c yığılması (1) Pi04314 qarşılıqlı təsiri PP1c-nin nüvədən yenidən lokalizasiyasına səbəb olması və ya (2) Pi04314-ün xüsusi olaraq nüvədə PP1c-nin deqradasiyasına səbəb olması ilə izah edilə bilər. Bununla belə, tək və ya GFP–Pi04314 və ya GFP–SFI3 ilə birlikdə ifadə edildikdə mRFP–PP1c diferensial yığılmasına dair heç bir dəlil yox idi (Əlavə Şəkil 4b). Bundan əlavə, GFP-Pi04314 tək GFP-Pi04314 ilə müqayisədə hər mRFP-PP1c izoformu ilə birgə ifadə edildikdə, nukleoplazmik GFP flüoresansındakı azalma da xüsusi olaraq müşahidə edildi (Əlavə Şəkil 5). Müəyyən edilə bilən zülal deqradasiyası olmadıqda, nüvədə qarşılıqlı təsir göstərən hər iki tərəfdaşda müşahidə edilən azalma GFP–Pi04314/mRFP–PP1c komplekslərinin nüvədən, potensial olaraq nukleoplazmaya yenidən lokalizasiyası ilə uyğun gəlir. Yanlış lokallaşdırılmış ilə birlikdə ifadə edildikdə buna uyğundur mirGFP–Pi04314, mRFP–PP1c nüvə flüoresansı pozulmadı (Əlavə Şəkil 6). Bunun əksinə olaraq, gözlənildiyi kimi, mRFP–PP1c-1 nüvə fokuslu ilə birlikdə ifadə edildikdə NLSGFP–Pi04314, həm effektor, həm də ehtimal olunan hədəf üçün nukleoplazmik flüoresansa nisbətən azalmış nüvə flüoresansı müşahidə edildi (Əlavə Şəkil 7).

PP1c-nin nüvədən yenidən lokalizasiyasının infeksiya zamanı da baş verib-vermədiyini araşdırmaq üçün, N. benthamiana ifadə edən GFP–PP1c-1 transgen zoosporları ilə aşılanmışdır P. infestans 88069 floresan protein Td-pomidorunu ifadə edir. Nüvə və nukleoplazmik GFP flüoresansının nisbəti, yoluxmamış ilə müqayisədə, haustoria ilə qarşılıqlı əlaqədə olan host hüceyrələrində əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır. N. benthamiana yarpaq hüceyrələri (şək. 4). Bu, GFP–PP1c-1-in yenidən lokalizasiyasının infeksiyanın erkən mərhələlərində də baş verdiyini göstərir.

(a) Tərkibində olan hüceyrələrdə GFP–PP1c-1-in nüvə və nukleoplazmatik floresansının orta nisbətinin azaldığını göstərən qrafik P. infestans haustoria (GFP–PP1c-1 flüoresansını ifadə edən və qırmızı flüoresan haustoriya göstərən hüceyrələrdən ölçülən cəmi 35 nüvə ilə üç bioloji təkrardan birləşdirilmişdir. P. infestans 88069 tdt ştammı), yoluxmamış hüceyrələrdə 22 GFP–PP1c-1 ifadə edən nüvə ilə müqayisədə. Hərflər statistik əhəmiyyəti bildirir (ANOVA, P=0.001). (b) Şəkillər nüvəcikdən GFP–PP1c-1 yenidən lokalizasiyasında müşahidə edilən müxtəlif nümunələri təmsil edir. Həssas hüceyrələrdə nüvə GFP–PP1c-1 flüoresansı yoluxmamış hüceyrələrlə (aşağı panel) müqayisədə ya əhəmiyyətli dərəcədə zəiflədi (yuxarı panel) və ya azaldı (orta panel). Müvafiq flüoresan intensivliyi qrafikləri (hər bir şəkildə göstərilən oxlu xətlərdən) şəklin sağındakı qrafiklərdə göstərilir. Qırmızı flüoresan haustoriya * miqyas çubuğu, 10 μm ilə göstərilir.

Pi04314 qorunmuş R/KVxF motivi vasitəsilə PP1c ilə qarşılıqlı əlaqədə olur

Protein fosfatazanın fəaliyyəti tez-tez zülal bağlayan tərəfdaşlarla qarşılıqlı əlaqə yolu ilə tənzimlənir. Məməlilərdəki PP1c fosfatazları >200 tənzimləyici alt bölmələrlə birləşir, PP1c-ni hüceyrə daxilində müxtəlif yerlərə yönəldir və substratın spesifikliyini təmin edir. Əksər tənzimləyici alt bölmələr konsensusa [K/R][K/R][V/I]X[F/W] uyğun gələn R/KVxF kimi tanınan qorunmuş PP1c-məcburi motiv vasitəsilə PP1c ilə qarşılıqlı əlaqədə olur. PP1c-nin R/KVxF-ni bağlayan yivi aktiv sahədən 20 Å uzaqdadır və beləliklə, bağlanma fosfatazanın aktivliyini 29 inhibə etmir. Buna baxmayaraq, PP1c-nin bir çox inhibitor alt bölmələri də R/KVxF motivi vasitəsilə qarşılıqlı əlaqədə olur, buna misal olaraq, geniş şəkildə qorunan inhibitor-2 alt bölməsi göstərilir. Ərəbidopsis 30. Pi04314-ün C-terminal bölgəsində 117-dən 120-yə qədər qalıqlardan KVTF adlı namizəd motivini müşahidə etdik və bunun effektor və PP1c izoformları arasında qarşılıqlı əlaqəyə vasitəçilik etməsi ehtimalını artırdıq. Beləliklə, Pi04314mut yaratmaq üçün bu qalıqları alaninlərə mutasiya etdik (Əlavə Şəkil 8).

Pi04314mut Y2H analizindən istifadə edərək (PP1c-1 Şəkil 5) istifadə edərək mayada PP1c-1, PP1c-2 və ya PP1c-3 ilə qarşılıqlı əlaqə qura bilmədi və ya bitkilərdə Co-IP istifadə edərək (Şəkil 5 Əlavə Şəkil 9a). Üstəlik, PP1c izoformlarını nüvədən yenidən lokallaşdıra bilmədi (Şəkil 5c,d Əlavə Şəkil 9b, c). Tənqidi olaraq, vəhşi tipli (WT) Pi04314-dən fərqli olaraq, təkmilləşdirə bilmədi P. infestans kolonizasiyası N. benthamiana yarpaqlar (şək. 5e). Pi04314-ün PP1c izoformları ilə qarşılıqlı əlaqəsi beləliklə, tənzimləyici alt bölmələri təqlid edir, çünki o, R/KVxF motivi ilə bağlanır. Bu effektorun potensial fəaliyyət rejimi ilə bağlı üç ehtimal özünü göstərir: (1) PP1c fəaliyyətinin qarşısını almaq üçün inhibitor alt birim kimi çıxış edir (2) endogen PP1c tənzimləyici alt bölmələrinin bağlanması üçün rəqabət aparır, beləliklə də dolayısı ilə inhibitor kimi çıxış edir. normal PP1c fəaliyyəti və ya (3) defosforilasiya üçün müəyyən edilmiş substratlara PP1c fəaliyyətini hədəfləyən tənzimləyici alt vahid kimi çıxış edir.

(a) -histidin (-HIS) mühitində böyüyən və β-qalaktosidaza (B-gal) aktivliyinə malik olan PP1c-1 və yabanı tipli (WT) Pi04314-ün birgə ifadəsindən sonra maya-2-hibrid analizi. PP1c-1 ilə Pi04314mut etmədi. (b) GFP–Trap istifadə edərək aqroinfiltrasiya edilmiş yarpaqlardan WT GFP–Pi04314 və GFP–Pi04314mut zülal ekstraktlarının immunoprecipitasiyası cMyc–PP1c-1-in yalnız WT GFP–Pi04314 ilə birgə immunoprecipitasiya etdiyini təsdiqlədi. Yarpaqlarda konstruksiyaların ifadəsi + ilə göstərilir. Protein ölçüsü markerləri kDa ilə, zülal yüklənməsi Ponceau ləkəsi ilə, istifadə olunan antikorlar isə göstərildiyi kimi göstərilir (αcMyc və αGFP). (c) Birgə ifadə edən nüvələr vasitəsilə tək optik bölmə göstərir ki, mRFP–PP1c-1 ilə birgə ifadə edilən mutasiyaya uğramış effektor birləşmə GFP–Pi04314mut nüvədə mRFP flüoresansının azalmasına səbəb olmayıb, WT GFP–Pi04314 isə. Ölçək çubuğu, 10 μm. Ağ oxlar hər şəklin sağındakı qrafiklərdə göstərilən mRFP flüoresans intensivliyi qrafiklərini göstərir. (d) Qrafik tək ifadə olunan mRFP–PP1c-1-dən nüvə və nukleoplazmik mRFP flüoresansının orta nisbətini, WT effektor birləşməsi GFP–Pi04314 və mutasiya edilmiş effektor GFP–Pi04314mut ilə göstərir. Orta göstəricilər hər bir nümunə üçün minimum 30 nüvədən alınmışdır. Səhv çubuqları s.e. və qrafik üç bioloji təkrardan birləşdirilmiş məlumatları əks etdirir. Qrafikdəki hərflər statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (ANOVA, P<0.001). (e) Mutasyona uğramış Pi04314 ilə GFP birləşməsi artıq əhəmiyyətli dərəcədə təşviq edə bilmir P. infestans lezyon diametri ilə ölçülən infeksiya. Səhv çubuqları s.e. və qrafik üç bioloji təkrardan birləşmiş məlumatları əks etdirir (n=108 konstruksiya üçün). Qrafikdəki hərflər statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (ANOVA, P≤0.022).

Susdurulması NbPP1c zəiflədir P. infestans infeksiya

Xəstəliyin qarşısının alınmasında və ya təşviqində PP1c fəaliyyətinin potensial rolunu yoxlamaq üçün ekvivalentini müəyyən etdik PP1c içərisində ailə üzvləri N. benthamiana (Əlavə Şəkil 2) və VIGS istifadə edərək ifadələrini susdurdular. PP1c ailə üzvlərinin fosfataza kodlayan hissələri yüksək dərəcədə qorunduğu üçün biz hər bir gendən terminal 5′ və 3′ bölgələrində fərqli hissələri seçdik, NbPP1c-1, NbPP1c-2NbPP1c-3, və tütün rattle virusu (TRV) VIGS vektoruna klonlaşdırmaq üçün iki DNT zəncirini sintez etdi: biri üç 5′ ucunu (TRV–PP1c5′), digəri isə üç 3′ ucunu birləşdirir (TRV–PP1c3′ Əlavə Şəkil 2). 10a). Aqrobakteriya bu konstruksiyaları ehtiva edən suşlar 2 həftəlik uşağa infiltrasiya edilmişdir N. benthamiana şitillər. Gen susdurma səviyyələri qRT-PCR istifadə edərək hər bioloji təkrarda bitkilərdə 2-3 həftə sonra yoxlanıldı. Həm TRV–PP1c5′, həm də TRV–PP1c3′ VIGS konstruksiyaları ardıcıl olaraq sökülür. NbPP1c-1, NbPP1c-2NbPP1c-3 transkript səviyyələri TRV-GFP nəzarət zavodlarında transkript yığılması ilə müqayisədə 80-90% (Əlavə Şəkil 10b). TRV–GFP ifadə edən bitkilərdən bir qədər kiçik olsa da, TRV–PP1c5′ və TRV–PP1c3′ ifadə edən bitkilərin böyüməsi və inkişafı başqa cür pozulmadı (Əlavə Şəkil 10c). Potensial hədəfdən kənar susdurmanı araşdırmaq üçün əlavə üçün transkript səviyyələri müəyyən edildi PP1c kartof və qarşılıqlı yaxşı BLAST hits ilə gen N. benthamiana, adlandırılır StPP1c-4NbPP1c-4, müvafiq olaraq, bunlar həm AtTOPP8, həm də AtTOPP9-a bənzəyir Ərəbidopsis (Əlavə Şəkil 2). StPP1c-4, Y2H istifadə edərək, mayada Pi04314 ilə qarşılıqlı təsir göstərmir və ya bitkilərdə Co-IP istifadə edərək (Əlavə Şəkil 11a, b), onun bu effektorun hədəfi olmadığını göstərir. Bunu tapdıq NbPP1c-4 transkript səviyyələri TRV–PP1c5′ və ya TRV–PP1c3′ ifadəsi ilə azalmadı. N. benthamiana (Əlavə Şəkil 10b), susdurmağımızın xüsusi olduğunu göstərir NbPP1c-1, NbPP1c-2NbPP1c-3.

olub olmadığını araşdırdıq P. infestans müstəmləkəçilik susdurulmaqla dəyişdirildi NbPP1c-1, NbPP1c-2NbPP1c-3. Maraqlıdır ki, in N. benthamiana TRV–PP1c5′ və ya TRV–PP1c3′ ifadə edən bitkilər, əhəmiyyətli dərəcədə azdır P. infestans infeksiya lezyonları TRV-GFP nəzarət bitkiləri ilə müqayisədə inkişaf etmişdir. Üstəlik, lezyonların meydana gəldiyi yarpaqlarda əhəmiyyətli dərəcədə azdır P. infestans sporangia istehsal edilmişdir (şək. 6). Bu onu göstərir P. infestans susdurulmuş bitkilərin kolonizasiyası zəiflədi, bu da patogenin xəstəliyin inkişafı üçün PP1c tələb etdiyini göstərir. Bu, bizi PP1c fəaliyyətinin faydalı olub olmadığını araşdırmağa sövq etdi P. infestans infeksiya.

(a) Nəticədə peyvənd faizlərinin azalmasını göstərən qrafik P. infestans TRV-GFP nəzarəti ilə müqayisədə TRV–PP1c3′ və ya TRV–PP1c5′ ifadə edən bitkilərdə lezyonlar. Səhv çubuqları s.e. və qrafik altı bioloji təkrardan birləşdirilmiş məlumatları əks etdirir (n= hər konstruksiya üçün 50). Qrafikdəki hərflər statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (ANOVA, P≤0.009). (b) TRV-GFP nəzarət bitkiləri ilə müqayisədə TRV–PP1c3′ və ya TRV–PP1c5′ ifadə edən bitkilərin yoluxmuş yarpaqlarından əldə edilən hər ml başına sporangiyaların orta sayında azalmanı göstərən qrafik. Səhv çubuqları s.e. və qrafik dörd bioloji təkrardan birləşdirilmiş məlumatları əks etdirir (n=32 hər konstruksiya). Qrafikdəki hərflər statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (ANOVA, P<0.001). (c) Nümunə yarpaqları göstərir P. infestans nəzarət və TRV–PP1c3′ və ya TRV–PP1c5′ bitkilərində lezyon inkişafı.

Fosfataz-ölü PP1c-1mut infeksiyanı zəiflədir

Səssizləşdirmə təcrübələri göstərdi ki, tam virulentlik üçün PP1c izoformları tələb oluna bilər P. infestans, biz Pi04314 ilə KVTF vasitəçiliyi ilə qarşılıqlı əlaqənin (1) PP1c fəaliyyətinin inhibitoru və ya (2) endogen tənzimləmə alt bölmələri ilə bağlanmaq üçün rəqabət edərək dolayı yolla PP1c funksiyalarını inhibə edən effektorla uyğun gəlmir, baxmayaraq ki, bu, həqiqətən də ola bilər. qarşılıqlı əlaqənin qismən nəticəsidir. Bunun əvəzinə biz təklif edirik ki, Pi04314 onların fəaliyyətindən istifadə etmək üçün PP1c izoformları ilə qarşılıqlı əlaqədə olur.

Bunu sınaqdan keçirməzdən əvvəl biz Pi04314-ün PP1c fəaliyyətinin inhibitoru kimi çıxış edə biləcəyini araşdırdıq. Əvvəlcə biz GFP–PP1c-1-i cMyc boş vektoru və ya cMyc–Pi04314 ilə birgə ifadə etdik və nəzarət olaraq GFP-ni cMyc–Pi04314 ilə birgə ifadə etdik. GFP–Trap_M muncuqları ilə immunopresipitasiyadan sonra, qərb analizləri üçün zülalların elüsyonundan əvvəl fosfatazanın aktivliyi birbaşa muncuqlarda yoxlanıldı. cMyc–Pi04314 ilə ifadə edilən GFP heç bir fosfataz aktivliyi təmin etmədiyi halda, oxşar yüksək səviyyələr (ANOVA, P=0,001) aktivlik cMyc boş vektoru və ya cMyc–Pi04314 ilə ifadə edilən GFP–PP1c-1 ilə aşkar edilmişdir (Şəkil 7a). İmmunoblotlar cMyc–Pi04314-ün gözlənildiyi kimi yalnız GFP–PP1c-1 ilə birgə immunoprecipitasiya edildiyini göstərdi (Şəkil 7b). Bu, cMyc–Pi04314-ün GFP–PP1c-1 ilə kompleksdə fosfataz fəaliyyətini maneə törətmədiyini göstərir. Qarşılıqlı olaraq, cMyc–PP1c-1 pulsuz GFP, GFP–Pi04314 və ya qarşılıqlı təsir göstərməyən GFP–Pi04314mut ilə birgə ifadə edilmişdir. Hər bir GFP füzyon zülalı GFP–Trap_M muncuqları ilə immunoprecipitasiya edildi və fosfataza aktivliyi yenidən birbaşa muncuqlarda yoxlanıldı. GFP–Pi04314 vəziyyətində fosfataza aktivliyi aşkar edilsə də, sərbəst GFP və ya GFP–Pi04314mut ilə belə bir fəaliyyət müşahidə edilməmişdir (Şəkil 7c). Muncuqlardan zülalların elüsyonundan sonra, cMyc–PP1c-1-in yalnız GFP–Pi04314 varlığında birgə immunoprecipitasiya olunduğunu təsdiqlədik (Şəkil 7d). Beləliklə, PP1c-1 ilə əlaqəli Pi04314 fosfataz fəaliyyətini maneə törətmir.

(a) cMyc–Pi04314 və ya cMyc vektoru və ya cMyc–Pi04314 ilə birgə ifadə edilən GFP–PP1c-1 ilə birgə ifadə edilən GFP-nin immunoçökməsindən sonra birbaşa GFP–Trap_M muncuqlarında ölçülən fosfataza aktivliyinin qrafiki. Səhv çubuqları s.e. və qrafik üç bioloji təkrardan birləşdirilmiş məlumatları əks etdirir. Qrafikdəki hərflər statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (ANOVA, P<0.001). (b) GFP–Trap istifadə edərək aqroinfiltrasiya edilmiş yarpaqlardan zülal ekstraktlarının immunoprecipitasiyası təsdiq etdi ki, cMyc–Pi04314 GFP–PP1c-1 ilə birgə immunoprecipitasiya olunur. Yarpaqlarda konstruksiyaların ifadəsi + ilə göstərilir. Protein ölçüsü markerləri kDa ilə, zülal yüklənməsi isə Ponso ləkəsi ilə göstərilir. İstifadə olunan antikorlar göstərilir (αcMyc və αGFP). (c) cMyc–PP1c-1 ilə birgə ifadə edilən GFP, GFP–Pi04314 və ya GFP–Pi04314mutun immunopresipitasyonundan sonra birbaşa GFP–Trap_M muncuqlarında ölçülən fosfataza aktivliyinin qrafiki. Səhv çubuqları s.e. və qrafik üç bioloji təkrardan birləşdirilmiş məlumatları əks etdirir. Qrafikdəki hərflər statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (ANOVA, P<0.001). (d) GFP–Trap istifadə edərək aqroinfiltrasiya edilmiş yarpaqlardan zülal ekstraktlarının immunoprecipitasiyası, GFP–Pi04314mut ilə deyil, GFP–Pi04314 effektoru ilə birgə immunoprecipitasiya edilən cMyc–PP1c-1-i təsdiq etdi. Yarpaqlarda konstruksiyaların ifadəsi + ilə göstərilir. Protein ölçüsü markerləri kDa ilə, zülal yüklənməsi isə Ponso ləkəsi ilə göstərilir. İstifadə olunan antikorlar göstərildiyi kimidir (αcMyc və αGFP).

Biz fərz etdik ki, PP1c izoformalarından hər hansı birinin fosfataza-ölü mutantının həddən artıq ifadəsi 'dominant mənfi' rolunu oynaya bilər, bu da gücləndirilmiş nüsxənin qarşısını alır. P. infestans effektorla bağlanaraq, lakin artıq fosfataz fəaliyyətini təmin etməklə yarpaq kolonizasiyası. PP1c izoformalarında 31 aktiv sahə qalığının əvvəlki xarakteristikası əsasında biz PP1c-1-də (H129 Əlavə Şəkil 3b) ekvivalent qalığı müəyyən etdik və onu PP1c-1mut yaradan alaninə mutasiya etdik. İfadədən sonra N. benthamiana, sərbəst GFP, GFP–PP1c-1 və GFP–PP1c–1mut, GFP–TRAP_M muncuqlarından istifadə edərək immunoçökülmüş, hər bir birləşmə zülalının sabit və bütöv olduğunu nümayiş etdirmişdir (Əlavə Şəkil 12a) və fosfataz aktivliyi birbaşa muncuqlarda yoxlanılmışdır. Halbuki GFP–PP1c-1 fosfataz aktivliyi statistik olaraq əhəmiyyətli idi (ANOVA, P<0.001) GFP nəzarətindən yüksək olduqda, GFP–PP1c–1mut ilə heç bir belə fəaliyyət aşkar edilmədi, bu da onun fəaliyyətsizliyini təsdiqləyir (Şəkil 8a Əlavə Şəkil 12b).

(a) GFP–Trap istifadə edərək aqroinfiltrasiya edilmiş yarpaqlardan protein ekstraktlarının immunopresipitiasiyası. Yarpaqlarda konstruksiyaların ifadəsi + ilə göstərilir. Protein ölçüsü markerləri kDa ilə, zülal yüklənməsi isə Ponso ləkəsi ilə göstərilir. İstifadə olunan antikorlar göstərildiyi kimidir (αcMyc və αGFP). (b) Vəhşi tipli GFP–PP1c-1 və mutasiyaya uğramış GFP–PP1c–1mutun fosfataza aktivliyinin qrafiki, mutantın GFP boş vektor nəzarətinə oxşar fon fəaliyyəti göstərdiyini göstərir. Səhv çubuqları s.e. və qrafik üç bioloji təkrardan birləşmiş məlumatları əks etdirir. Qrafikdəki hərflər statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (ANOVA, P<0.001). (c) mRFP–PP1c–1mut və ya nəzarət olaraq sərbəst mRFP ilə ifadə edilən GFP–Pi04314 füzyon zülalından nüvə və nukleoplazmik GFP floresansının orta nisbətinin qrafiki. Səhv çubuqları s.e. və qrafik üç bioloji təkrardan birləşmiş məlumatları əks etdirir (n=40 konstruksiya üçün). Qrafikdəki hərflər statistik cəhətdən əhəmiyyətli fərqləri ifadə edir (ANOVA, P<0.001). (d) Birgə ifadə edən nüvələr vasitəsilə tək optik bölmə göstərir ki, GFP–Pi04314 effektor birləşməsi mRFP–PP1c–1mut ilə birgə ifadə edildikdə nüvədə azalıb, lakin sərbəst mRFP ilə deyil. Ölçək çubuğu, 10 μm. Ağ oxlar hər şəklin sağındakı qrafiklərdə göstərilən mRFP flüoresans intensivliyi qrafiklərini göstərir. (e) cMyc–PP1c-1 vəhşi növünün birgə ifadəsi onun təkmilləşdirilməsini əhəmiyyətli dərəcədə dəyişmədi. P. infestans growth caused by expression of the GFP–Pi04314 effector compared with the control. However, co-expression of the mutant cMyc–PP1c–1mut with GFP–Pi04314 caused a significant reduction in effector-induced enhancement of colonization. Error bars are s.e. and the graph represents the combined data from three biological replicates (n=102 per construct). Letters on the graph denote statistically significant differences (ANOVA, P<0.001). (f) Expression of wild-type cMyc–PP1c-1 did not significantly alter P. infestans infection compared with the control empty (cMyc) vector (EV), but expression of the phosphatase-dead mutant cMyc–PP1c–1mut significantly reduced lesion growth. Error bars are s.e. and the graph represents the combined data from three biological replicates (n=73 per construct). Letters on the graph denote statistically significant differences (ANOVA, P<0.001).

For PP1c–1mut to act as dominant negative, its interaction with Pi04314 must be maintained. We co-expressed cMyc–PP1–1cmut or cMyc–PP1c-1 with GFP–Pi04314, immunoprecipitating the latter with GFP–TRAP_M beads, and observed that cMyc–PP1–1cmut, like cMyc–PP1c-1, was co-immunoprecipitated with the effector (Fig. 8b). This confirmed that the H129A mutation did not perturb interaction with Pi04314. When we investigated the localization of mRFP–PP1c–1mut using confocal microscopy, we observed that, like the WT protein, it accumulated in the nucleoplasm with cytoplasmic background. However, unlike the WT protein, there was no detectable accumulation of mRFP–PP1c–1mut in the nucleolus (Supplementary Fig. 12). Nevertheless, consistent with the interaction of Pi04314 with PP1c–1mut being maintained bitkilərdə, co-expression of mRFP–PP1c–1mut with GFP–Pi04314 still significantly reduced accumulation of the effector in the nucleolus, compared with a free mRFP control, which also does not localize in the nucleolus (Fig. 8c,d).

To investigate whether the PP1c–1mut had an effect on the enhanced P. infestans leaf colonization promoted by transient expression of Pi04314, free GFP was expressed on one-half of N. benthamiana leaves and either GFP–Pi04314 alone, GFP–Pi04314 co-expressed with WT cMyc–PP1c-1, or GFP–Pi04314 co-expressed with cMyc–PP1c–1mut on the other half. P. infestans zoospores were drop-inoculated onto each half of the leaves, and infection allowed to progress for 6 days. Whereas GFP–04314 alone, as anticipated, or GFP–Pi04314 co-expressed with cMyc–PP1c-1 WT, promoted similar levels of significantly enhanced (ANOVA, P<0.001) P. infestans lesion development compared with the GFP control, lesion sizes on leaves where GFP–04314 was co-expressed with cMyc–PP1c–1mut were no different to the GFP control (Fig. 8e). This indicates that the expression of the phosphatase-dead PP1c–1mut form prevents Pi04314 effector activity.

To further investigate the potential for the phosphatase-dead PP1c–1mut form to be detrimental to P. infestans infection, an empty cMyc vector (EV) was expressed on one-half of N. benthamiana leaves and either cMyc–PP1c-1 WT or cMyc–PP1c–1mut expressed on the other. A higher inoculum of P. infestans zoospores was drop-inoculated onto each side of the N. benthamiana leaves to promote enhanced colonization, and infections were allowed to progress for 7–8 days. Lesion sizes on leaf halves where cMyc–PP1c WT was expressed were no different to those where EV control was expressed. In contrast, expression of cMyc–PP1c–1mut resulted in significantly (ANOVA, P<0,001) reduced lesion sizes compared with the EV control (Fig. 8f). Thus, overexpression of the phosphatase-dead PP1c–1mut reduces levels of P. infestans infeksiya.

Pi04314 suppresses JA- and SA-responsive genes

We have shown that when expressed bitkilərdə, Pi04314 interacts with three isoforms of PP1c to enhance P. infestans leaf colonization in a phosphatase activity-dependent manner. However, it remains unclear that how the effector could be of benefit to P. infestans. We investigated whether Pi04314 could suppress cell death triggered by the P. infestans PAMP INF1, or by co-expression of the tomato cell-surface receptor Cf4 and Cladosporium fulvum effector AVR4. We have shown previously that Cf4-mediated cell death is suppressed by the RXLR effector PexRD2 (ref. 20) and that cell death mediated by both INF1 and Cf4 is suppressed by AVR3a 16 . In contrast to GFP–AVR3a, GFP–Pi04314 failed to suppress either INF1- or Cf4-mediated cell death (Supplementary Fig. 13).

We next generated transgenic susceptible potato cultivar E3 lines expressing Pi04314 and selected two lines (OE-6 and OE-8) for study (Supplementary Fig. 14). Both lines showed enhanced P. infestans colonization (Fig. 9a,b) relative to untransformed cv E3, consistent with the observation (Fig. 1) that transient expression of Pi04314 enhanced colonization in N. benthamiana. We treated leaves of the control cv E3, OE-6 and OE-8 with flg22 and investigated early-responsive gene WRKY8, encoding a transcription factor that is directly phosphorylated by the MAPK salicylic acid-induced protein kinase (SIPK) 32 and ACRE31, a generally used early flg22 marker 26 . Both genes were strongly upregulated in cv E3, OE-6 and OE-8 only 30 min after flg22 treatment (Fig. 9 Supplementary Fig. 14). This agrees with the previous observation that Pi04314 does not suppress early flg22-responsive gene induction 19 . We next selected genes that rapidly respond to exogenous application of SA and methyl jasmonate (meJA), based on recent potato microarray studies 33 , which are available on a searchable database (https://ics.hutton.ac.uk/solarray/). We selected two genes upregulated at 1 h after treatment of meJA (StMYC2-like and StJAZ1-like), and two genes upregulated at 1 h by SA (designated StWRKY40-like and StWRKY16-like) and confirmed their upregulation at 1 h in potato cv E3 following appropriate treatments (Fig. 9 Supplementary Fig. 14). In contrast, following treatments with SA or meJA, induction of all four genes was attenuated in lines OE-6 and OE-8 (Fig. 9), suggesting that Pi04314 may attenuate SA and JA defence pathways.

(a) Representative leaf images, exposed to UV, showing increased lesion sizes on Pi04314-expressing transgenic lines E-6 and OE-8, compared with the untransformed control, cv E3. (b) Mean lesion diameter is significantly increased in OE-6 and OE-8 lines compared with the control, cv E3. Letters denote statistical significance (ANOVA, P<0.001) from three biological replicates, each containing inoculation of three leaves from each of the six plants. (c) Relative expression of flg22 marker genes StWRKY8 and StACRE31 30 min after treatment with flg22 in E3, OE-6 and OE-8 lines, compared with untreated lines (which was given a value of 1). (d) Relative expression of JA-responsive genes StJAZ1-like (StJAZ1L) və StMYC2L 1 h after treatment with meJA in E3, OE-6 and OE-8 lines, compared with untreated lines (which was given a value of 1). (e) Relative expression of SA-responsive genes StWRKY40-like (StWRKY40L) və StWRKY16L 1 h after treatment with SA in E3, OE-6 and OE-8 lines, compared with untreated lines (which was given a value of 1). Results in B-E are the mean of three independent biological replicates. Error bars show s.e. and * denotes significantly reduced induction (ANOVA, P<0.001) of responsive genes in transgenic lines compared with the E3 control.


Molecules, Targets and Isoforms - Biology

Chemical genetics employs diverse small-molecule compounds to elucidate biological processes in a manner analogous to the mutagenesis strategies at the core of classical genetics. Screening small-molecule libraries for compounds that induce a phenotype of interest represents the forward chemical genetic approach, whereas the reverse approach involves small molecules targeting a single protein. Here, we review key differences between the goals for small-molecule screening in industry qarşı academia, recent developments in high-throughput screening, and publicly available resources of compound collections, screening facilities, and databases. A particularly exciting outcome of a chemical genetic screen is the discovery of a previously unknown role for a protein in a pathway together with compounds that affect the function of that protein. In illustrative cases, such discoveries have led to progress toward therapeutic development and more commonly have increased the size of the small molecule “toolbox” available to the research community for the study of biological processes.


Resource library

Quickly find answers to your biological questions.

Rapidly identify the best biomarker and target candidates based on biological characteristics most relevant to your discovery study. Our powerful and high-quality biomarker identification tools are driven by over 20 million scientific findings and over 500,000 samples, to save you valuable time and resources while empowering your biomarker research by driving new discoveries.

Biomarker and target discovery techniques and approaches:

  • Identify and prioritize molecular candidates
  • RNT seq
  • Gene expression
  • Interaction network analysis
  • Uncover potential mechanism of action
  • Explore molecules and pathways associated with disease

Derive insights from your data to make impactful discoveries

Your journey to biomarker and target discovery involves
exploring molecules and molecular interactions at critical points in a disease-causing pathway. Our biomarker identification tools and solutions enable a systems biology approach to drive your discoveries by combining genetics, genomics and cell and chemical
biologiya. QIAGEN IPA’s powerful causal analytics and unique visualization tools empower you to interpret many types of data with biological context and get visually intuitive and useful insights about your experimental systems. QIAGEN OmicSoft Studio and Lands bring over half a million curated public datasets to allow you to compare and structure your ‘omics data to query, visualize and accurately define potential targets and elucidate probable mechanism of action to accelerate drug development.


Təşəkkürlər

We thank the Packard Foundation, Amgen, Astra Zeneca and Novartis and the US National Institutes of Health (NIH GM 79465) for providing funding for this work. C.J.C. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. B.C.D. was partially supported by a Chemical Biology Training Grant from the NIH (T32 <"type":"entrez-nucleotide","attrs":<"text":"GM066698","term_id":"222039788","term_text":"GM066698">> GM066698). Due to space limitations, we apologize if we inadvertently omitted citations of major contributions to this area.


Videoya baxın: - Azərbaycan dili Fonetika və Sait səslər (Avqust 2022).