Məlumat

Eukariotlarda qapaq/poliA və ya prokaryotlarda UTR-lərin çıxarılması ilə RNT deqradasiyası nə dərəcədə əhəmiyyətlidir?

Eukariotlarda qapaq/poliA və ya prokaryotlarda UTR-lərin çıxarılması ilə RNT deqradasiyası nə dərəcədə əhəmiyyətlidir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Sual kifayət qədər izahlıdır, lakin iki hissəyə bölünür. Mən ribozimləri olan xüsusi bölgələrdə RNT-nin parçalanmasından istifadə edən repressiya sistemindən istifadə etməyə çalışıram ki, onları deqradasiya (və ya sadəcə inaktivləşdirmə) məqsədi ilə.

Bu ssenari eukariotlarda daha çox görünür, çünki onlar RNT sabitliyini təmin edən 5' UTR-ləri və 3' UTR-də bir poliA quyruğu bağlamışlar. Qapaqsız RNT nə qədər tez və nə qədər parçalanacaq? PoliA quyruğunun olmaması haqqında nə demək olar?

Prokaryotlarda bu strukturlar olmadığından, mənim xüsusi nümunəmdə UTR bölgələrinin istifadəsi ilə məhdudlaşıram. İstər ümumiyyətlə, istərsə də xüsusi zülallar üçün prokaryotlarda RNT inaktivasiyası üçün UTR bölgəsindən istifadə etməyə imkan verəcək oxşar mexanizm varmı? Xahiş edirik unutmayın ki, bu UTR bölgələrinə sintetik ardıcıllıqlar əlavə etmək, şübhəsiz ki, bir ehtimaldır.


Xrn1/2 kimi 5'→3' eksonükleazlar tərəfindən deqradasiya üçün 5' qapağın çıxarılması vacibdir. Xrn1/2 konstitutivdir və qapaqsız RNT-lərin deqradasiyası olduqca sürətli olardı (dəqiq ömür üçün istinad yoxdur). Deadenilasiya ümumiyyətlə ekzosom tərəfindən 3'→5' deqradasiyadan əvvəl baş verir, lakin bunun ilkin şərt olub olmadığına əmin deyiləm. Bununla belə, quyruqsuz mRNA-lar Pab1p (Poly-A bağlayıcı zülal) 3'UTR-ə bağlanmaqla sabitləşdirilə bilər. Bu kağıza baxın.

Əlaqədar kağızın Şəkil 4.

Bağlanmış Pab1p quyruğu qəbul etməyən mRNA-ları sabitləşdirir. (A) Strategiya. HDV özünü parçalayan ribozim MFA2/MS2 RNT-nin 3' UTR-ə daxil edildi və in vivo olaraq poli(A) quyruğu (A0) olmayan mRNT əldə etdi. (B) Oliqo(dT) selüloz xromatoqrafiyası. RNT-lər A-da təsvir edilmiş ribozim tərkibli konstruksiyanı və ya əvvəlki şəkillərdə istifadə olunan nəzarət plazmidini daşıyan hüceyrələrdən çıxarılmışdır. RNT-lər oliqo (dT) selüloz xromatoqrafiyası ilə fraksiyalaşdırıldı, sonra Northern blotlama ilə təhlil edildi. Ribozim tərkibli RNT sütunda saxlanılmır, nəzarət RNT isə saxlanılır. (T) Fraksiyadan əvvəl ümumi RNT; (+) sütun tərəfindən saxlanılır; (−) sütun tərəfindən saxlanılmır. mRNT oliqo(dT) saxlanılan (+) nümunədə ümumi (T) RNT ilə müqayisədə bir qədər daha sürətli işləyir, çünki hər zolağa daha az RNT yüklənir. (C) S1 nukleaz analizi. Ribozim tərkibli RNT-ni daşıyan ştammdan hazırlanmış mRNT-nin 3' ucu S1 nukleaza xəritəsi ilə müəyyən edilmişdir. Həzm olunmamış zondun (65 nukleotid) və qorunan növlərin (43 nukleotid) mövqeyi göstərilir. Görkəmli 3' terminal ribozimin parçalanması üçün gözlənilən mövqedə yerləşir. (D) Ribozimlə parçalanmış RNT-nin transkripsiyalı nəbz təqibi təcrübəsi və Northern blotting ilə parçalanması. Ribozimlə parçalanmış reportyor mRNA-ların dövriyyə sürəti MS2/Pab1p olan (solda) və ya olmayan (sağda) suşlarda müəyyən edilmişdir. Transkripsiya repressiyasından sonrakı vaxt (dəqiqə ilə) birbaşa yuxarıda verilir; yarı ömrü aşağıdır. (E) Nəticələrin kəmiyyəti. mRNT-nin miqdarı D. (•) MS2/Pab1p-də hər zolağın altındakı 18S rRNA səviyyəsinə normallaşdırıldı; (○) vektor tək.

Prokaryotik UTR-lərin heç bir ümumi paradiqması yoxdur. Prokaryotik sistemdə mRNT-nin idarə olunan inaktivasiyası üçün riboswitches və ya cis-repressiv RNT (RBS tamamlayıcı RNT) istifadə edə bilərsiniz. CRISPR-Cas sistemindən istifadə edən prokaryotlarda da RNT-nin idarə etdiyi RNT deqradasiyası mümkündür. Bu kağıza baxın. Bu fəaliyyət üçün Cmr-1,2,3,4 və 6 proteinləri tələb olunur.


Bio Fəsil 14

Yuxarıdakı şəkildəki DNT-nin yerli olaraq açılmış qoşa zəncirini nəzərə alsaq, transkripsiya zamanı RNT polimeraza hansı istiqamətdə və hansı zəncirdə hərəkət edir?

bir zülalın aktiv yerini kodlayan bir ekzonda bir nukleotidin silinməsi

bütün və ya çoxlu intronun dublikasiyası

Şablon olmayan zəncirinin 3' ucundan bir kodon uzaqda olan çərçivə dəyişikliyi mutasiyası

genlər xüsusi fermentlərin istehsalını diktə edir və təsirlənmiş fərdlərdə müəyyən fermentlərin olmamasına səbəb olan genetik qüsurlar olur.

bir çox metabolik fermentlər DNT-dən kofaktor kimi istifadə edirlər və təsirlənmiş fərdlərdə onların fermentlərinin DNT ilə səmərəli qarşılıqlı əlaqəsinə mane olan mutasiyalar olur.

Müəyyən metabolik reaksiyalar ribozimlər tərəfindən həyata keçirilir və təsirlənmiş şəxslərdə əsas birləşmə faktorları yoxdur.

transkripsiya prosesinin bir hissəsi kimi RNT-ni sintez edən bir ferment

RNT-dən substrat kimi istifadə edən ferment

böyük və kiçik ribosomal alt bölmələr arasında əlaqəni kataliz edən ferment

bazanın ya daxil edilməsi, ya da silinməsi

mRNT nüvədən kənara daşınmayacaq.

Molekul nüvədəki məhdudlaşdırıcı fermentlər tərəfindən həzm olunur.

Molekul hidrolitik fermentlər tərəfindən parçalanır, çünki o, artıq 5' və 3' ucunda qorunmur.

Hər bir amin turşusunu kodlaşdırmaq üçün bir çox nukleotid lazımdır.

mRNT-nin başlanğıcına yaxın son ekzonlar var.

Genetik kodda artıqlıq var.

GGG kodonunun birinci nukleotidinin əvəzlənməsi

iki nukleotidin silinməsi

vaxtından əvvəl transkripsiyanın dayandırılması

I1-in mRNT-yə daxil edilməsi

Zülalda funksiyasını dəyişə bilən fərqli bir amin turşusunu əvəz edə bilər.

Bir serin kodonu fərqli bir serin kodonu ilə mübadilə edə bilər.

O, bir dayanacaq kodonunu başqa bir dayanacaq kodonu ilə əvəz edə bilər.

Bu, RNT polimerazanın DNT-yə bağlanmasını kodlayan ardıcıllıqdır.

O, dəyişdirilmiş guanini mRNT-nin 3' ucuna əlavə edir.

Bu tərcümənin dayandırıldığı yeri göstərir.

Ardıcıllıq çox sürətlə inkişaf edir.

Ardıcıllıqdakı hər hansı mutasiya qarşı seçilir.

Ardıcıllığa bütün promouterlərdə deyil, bir çoxunda rast gəlinir.

Transkripsiya sürətini artırır.

Tək mRNT-dən müxtəlif protein məhsullarının istehsalına imkan verə bilər.

Bu, transkripsiya sürətini artıra bilən bir mexanizmdir.

Transkripsiya başladıqdan sonra RNT polimeraza xromosomun sonuna çatana qədər transkripsiya edir.

RNT polimeraza terminator ardıcıllığı ilə transkripsiya edir, polimerazanın DNT-dən ayrılmasına və transkripti buraxmasına səbəb olur.

RNT polimeraza bir intron vasitəsilə transkripsiya edir, bu da polimerazın transkripti buraxmasına səbəb olur.

bir amin turşusu olmayan bir polipeptid

Prokaryotlarda ən azı üç növ RNT polimeraz var, eukaryotlarda isə yalnız bir.

Həm eukariotlar, həm də prokaryotlar transkripsiyanı dayandırmaq üçün poliadenilləşmə siqnalını tanıyırlar.

Həm prokaryotlarda, həm də eukaryotlarda RNT polimeraza eyni RNT molekullarını istehsal edir.

Hər bir gen bir proteini kodlayır.

Növ yüksək dərəcədə inkişaf etmişdir.

5' UTR-nin çıxarılmasının heç bir təsiri yoxdur, çünki ekzonlar toxunulmaz qalır.

Birinci ekson oxunmayacaq, çünki I1 indi UTR kimi xidmət edəcəkdir.

5' UTR-nin çıxarılması 5' qapağı da çıxarır, buna görə də mRNT hidrolitik fermentlər tərəfindən tez parçalana bilər.

Gen ifadəsi zülalların RNT sintezini istiqamətləndirdiyi prosesdir.

Gen ifadəsi DNT-nin zülalların sintezini istiqamətləndirdiyi prosesdir.

Gen ifadəsi zülalların DNT sintezini istiqamətləndirdiyi prosesdir.

digər üçlüklərdən məkan baxımından ayrılmış üçlük

amin turşusunun bağlanma yerindən tRNT-nin əks ucunda üçlük

yuxarı axın AUG ilə eyni oxu çərçivəsindəki üçlük

Transkripsiya zamanı yaranan RNT daha sonra hər iki növ orqanizmdə dəyişdirilir.

Transkripsiya prokaryotlarda davam edərkən tərcümə başlaya bilər, lakin eukariotlarda deyil.

Transkripsiya və tərcümə hər iki orqanizmdə eyni vaxtda baş verə bilər.

mRNT, tRNT və rRNT transkripsiya edilir.

Transkripsiya polipeptiddə ilk bir neçə amin turşusu yığıldıqdan sonra başlaya bilər.

mRNT-nin 3' ucuna poli-A quyruğu, 5' ucuna isə qapaq əlavə olunur.


Nəticələr

Homo- və ya Heteropolimerik Quyruq Tərkibində Parçalanmış 28S rRNA Molekulları İnsan Hüceyrələrinin Həm Sitoplazmasında, həm də Nüvəsində Mövcuddur.

Əvvəlki işlərdə homo və ya heteropolimerik quyruqları olan kəsilmiş 28S və 18S rRNA-ları aşkar etdik (18). Bu rRNT fraqmentlərinin əvvəllər qeyd olunan nüvə prosesinin deqradasiya aralıqları olması inandırıcı idi, lakin ikinci variantı nəzərdən qaçırmaq olmazdı: sitoplazmada RNT-nin keçici, bəlkə də deqradasiyasına kömək edən, sabit poli(A) quyruğu ilə birlikdə mövcud olan adenilasiyası. bu hüceyrə yerini xarakterizə edir. Beləliklə, ilk məqsədimiz bu quyruqlu, kəsilmiş molekulların nüvədə, sitoplazmada və ya hər ikisində olub olmadığını müəyyən etmək idi.

RNT və protein HeLa hüceyrələrindən hazırlanmış sitoplazmik və nüvə fraksiyalarından əldə edilmişdir. Ümumi, sitoplazmik və nüvə RNT-nin etidium bromidlə boyanması zamanı yetkin rRNT və pre-rRNA (və tRNA)-nın aydın fraksiyaya spesifik paylanması müşahidə edilmişdir (Şəkil S1). Fraksiyaların təmizliyini qiymətləndirmək üçün Northern blots və immunoblots hazırlanmışdır və Şəkil 1A RNT və zülal markerlərinin yalnız müvafiq fraksiyalarda aşkar edildiyini göstərir. Sonra, parçalanmış poliadenillənmiş 28S rRNA-nın mövcudluğu oliqo(dT) RT-PCR ilə qiymətləndirildi. Nəticələr həm nüvədə, həm də sitoplazmada homo- və ya heteropolimerik uzantılara malik 28S rRNA fraqmentlərini açıqladı (Şəkil 1).B). Bildiyimizə görə, bu, insan hüceyrələrinin sitoplazmasında daxili adenilatlanmış RNT-nin ilk aşkarlanmasıdır.

İnsan hüceyrələrinin sitoplazmasında və nüvələrində homo- və ya heteropolimerik poli(A) quyruğu olan 28S rRNT fraqmentləri. (A) Fraksiyanın saflığı İmmunoblotlar (IBs) və RNT ləkələri ilə fraksiyaya məxsus markerlərdən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir: C, sitoplazma: GAPDH. N, nüvə: histon H3 (H3), fibrillarin və U2/U3/U5-snoRNAs. T, ümumi hüceyrə RNT/zülalları. (B) Cyt (yuxarıda) və nuc (aşağıda) fraksiyalardan kəsilmiş, adenilatlanmış 28S rRNA molekullarının Oliqo(dT) RT-PCR təcrid edilməsi. 28S rRNA sxematik olaraq primer yerlərini göstərən oxlarla və quyruq yerlərini və məzmununu göstərən şaquli xətlərlə təqdim olunur (Cədvəl S1). (C) cyt (yuxarıda) və nuc (aşağıda) fraksiyalardan kəsilmiş 28S rRNA molekullarının cRT-PCR təcrid edilməsi. “A” hərfinin kodlaşdırılıb-kodlaşdırılmadığı və ya transkripsiyadan sonra əlavə edilib-edilmədiyi məlum olmayan hallar ulduz işarəsi ilə qeyd olunur (Cədvəl S2).

Hər iki fraksiyada kəsilmiş molekulları qərəzsiz poli(A) uzantıları ilə qiymətləndirmək üçün 28S rRNA-nın eyni bölgəsinə dairəvi tərs transkripsiya (cRT) tətbiq edilmişdir (Şəkil 1).C). Kəsilmiş molekullar həm sitoplazmik, həm də nüvə fraksiyalarından uğurla təcrid olundu. Əksər fraqmentlərin quyruqsuz olmasına baxmayaraq, kiçik sayda 1-dən 4 nt-ə qədər uzantılar olsa da, adenozinin kodlanmış ardıcıllığın bir hissəsi olub-olmaması və ya transkripsiyadan sonra əlavə olunduğu aydın deyil. Bu molekullar oliqo (A) əlavəsini əks etdirə bilər və ya quyruq sintezindən əvvəlki mərhələdə və ya 3′-5′ deqradasiyası arasında ola bilər. Buna görə də, keçici adenilasiyanın bir çox əvvəlki tədqiqatlarında olduğu kimi, uzun daxili quyruqları görmək və onların nt tərkibini qiymətləndirmək üçün oliqo(dT) RT-PCR kimi qərəzli üsullar lazımdır ki, bu da çox vaxt poliadenilləşdirici amilin eyniliyinə səbəb ola bilər (7, 19). ).

Homo və ya heteropolimer quyruqları saxlayan kəsilmiş, intronsuz β-aktin transkriptləri.

rRNA-ya əlavə olaraq, mRNA-nın bu prosesdən keçə biləcəyini yoxlamaq üçün oliqo(dT) RT-PCR istifadə edərək, kəsilmiş adenilatlanmış β-aktin mRNA molekullarının mövcudluğu təhlil edilmişdir. Gen üçün spesifik primerlər tətbiq edildi, onlardan bəziləri intronların dərhal yuxarı hissəsində mRNT ardıcıllığını hədəf aldı və potensial olaraq həm birləşdirilmiş, həm də birləşməmiş adenilatlanmış β-aktin fraqmentlərinin təcrid olunmasına imkan verdi. Şəkil 2-də göstərildiyi kimiA, kəsilmiş adenilatlanmış β-aktin fraqmentləri təcrid olundu və rRNT-yə bənzər, həm homo-, həm də heteropolimerik quyruqlar müşahidə edildi. Həmçinin, belə molekullar həm nüvə, həm də sitoplazmik fraksiyalardan əldə edilmişdir (Cədvəl S1). Təcrid olunmuş ardıcıllıqlar arasında heç bir intronlar mövcud deyildi və bu, bunların (qismən, tam olmasa da) birləşdirilmiş transkriptlər olduğunu açıqlayır. Bu nəticələr göstərir ki, rRNT kimi, mRNA da keçici adenilasiyaya məruz qala bilər.

(A) İnsan hüceyrələrindən təcrid olunmuş homo- və ya heteropolimerik poli(A) quyruğu olan birləşdirilmiş β-aktin fraqmentləri. İlkin β-aktin mRNT sxematik şəkildə təqdim olunur (intronlar qara, ekzonlar boz). Hər bir ekzon/intronun uzunluqları göstərilir. Homo- və heteropolimerik quyruqlar müvafiq olaraq genin üstündə və aşağıda təqdim olunur (Cədvəl S1). (B) Transfeksiyadan 4 saat sonra HeLa hüceyrələrindən kəsilmiş, adenilləşdirilmiş VV RNT molekullarının [G8R (viral mRNA) və GFP (viral genomuna inteqrasiya olunmuş)] Oliqo(dT) RT-PCR təcrid edilməsi (Cədvəl S3).

Homo- və ya Heteropolimerik Quyruqları Daşıyan Kəsilmiş Vaccinia Virus RNT-ləri Yoluxmuş Hüceyrələrdən Təcrid edilmişdir.

Fraksiyalanma təmizlik analizlərinə əlavə olaraq (Şəkil 1A), daha əvvəl təsvir edildiyi kimi sitoplazmik fraksiyalardan əldə edilən RNT molekullarının ya in vivo, ya da eksperimental prosedurlarımız zamanı sitoplazmaya “sızmış” nüvə prosesinin aralıq maddələri olmadığına əmin olmaq üçün biz əlavə bir yanaşma tətbiq etdik: vaccinia virusu ( VV) poxvirus ailəsinə aiddir və 200-dən çox zülal kodlayan ikiqat zəncirli DNT genomunu ehtiva edir. Poxviruslar bütün həyat dövrü ərzində nüvəyə daxil olmamaları ilə əksər DNT virusları arasında unikaldır (20). Viral RNT-nin sitoplazma daxilində keçici adenilləşməyə məruz qalıb-qalmadığını yoxlamaq üçün RNT yoluxmuş HeLa hüceyrələrindən təmizləndi və viral genomda kodlanmış genlərin kəsilmiş, poliadenilləşdirilmiş transkriptlərinin olması üçün təhlil edildi. Şəkil 2B viral genomuna daxil edilmiş GFP genindən istehsal edilən G8R mRNA, aralıq viral geni və GFP mRNA-nın təhlilinin nəticələrini göstərir (21). Bu genlərdən qaynaqlanan, ya homo- və ya heteropolimerik quyruğu olan kəsilmiş transkriptlər aşkar edilmişdir. Bu nəticələr sitoplazmada keçici RNT poliadenilasiyasını əhatə edən mexanizmin mövcud olduğuna və təkcə rRNT-yə deyil, mRNT-yə də aid olduğuna dair əlavə dəstək verir. Müvafiq olaraq, növbəti addım əvvəllər tədqiq edilmiş bütün sistemlərdə olduğu kimi bu tip RNT adenilasiyası ilə RNT-nin parçalanması arasında əlaqənin olub-olmadığını yoxlamaq idi.

Kəsilmiş, Poliadenilləşdirilmiş Transkriptlər Deqradasiya Aralıqlarıdırmı?

Kəsilmiş, adenilatlanmış RNT molekullarının aşkar edildiyi bütün sistemlərdə, sonradan onların poli(A) yardımlı RNT parçalanma yolunda ara məhsullar olduğu göstərilmişdir. Biz soruşduq ki, burada, sitoplazmada müşahidə olunan quyruqlar həqiqətən belə bir prosesin xəbərdaredici əlamətləridirmi? Əgər belədirsə, ekzonükleolitik fəaliyyətin inhibəsi bakteriyalarda, bitki mitoxondrilərində, maya nüvələrində və insan hüceyrələrində müşahidə edildiyi kimi onların yığılması ilə nəticələnəcək (12-14, 22). Bu məqsədlə biz (KD) hXrn1 və ekzosom alt bölmələrini yıxmaq üçün RNAi-dən istifadə etdik. Sonuncu üçün, ekzosomla əlaqəli ekzoribonukleaza olan PM/Scl-100 və ekzosom əsas zülalı olan hRrp41 hədəf alındı. Immunoblots hədəf zülalların əhəmiyyətli KD açıqladı (Şəkil 3.).A). Ekzosom aktivliyinin azalması həm PM/Scl-100, həm də hRrp41 ilə susdurulmuş hüceyrələrdə 5.8S rRNA prekursorunun yığılması ilə təsdiq edilmişdir (Şəkil 3).B) (13, 23).

Ekzosom alt bölmələrinin, hXrn1, hXrn2 və Lsm1-in RNTİ vasitəçiliyi ilə susdurulması. (A) Səssizləşdirmənin effektivliyi xüsusi antikorlarla immunoblot vasitəsilə ölçüldü. (B) Ekzosom fəaliyyətinin itirilməsi Northern blot tərəfindən aşkar edilən 5.8S rRNT prekursorunun yığılması ilə təsdiq edilmişdir. (C) Antikorları mövcud olmayan RNTi ilə susdurulmuş zülalların KD effektivliyi RT-PCR ilə yoxlanılmışdır. İmmunoblotlar və RT-PCR β-aktin ilə normallaşdırıldı.

Deqradasiya aralıqları çox deyil və sürətlə deqradasiyaya uğrayır, ona görə də belə əlaqəli molekullar üçün yüksək ifadəli transkriptləri təhlil etmək faydalıdır. Buna görə də, daha əvvəl təsvir olunduğu kimi, adenilatlanmış fraqmentlərin oliqo(dT) RT-PCR ilə təcrid olunduğu 28S rRNT bölgəsinə diqqət yetirməyi seçdik. Parçalanmış, adenilatlanmış 28S rRNT toplanmasının vizual qiymətləndirilməsi üçün radiolabeling analizi tətbiq olundu.A). Oliqo(dT) tərs transkripsiyasından sonra, kəsilmiş molekulların əvvəllər təcrid olunduğu eyni primerlərdən istifadə edildi, lakin bu dəfə məhsulların 5′ ucu [32 P] 28S rRNA primeri ilə etiketləndiyi əlavə PCR mərhələsi daxil edildi. . Denaturasiya edən poliakrilamid gel üzrə fraksiyalaşdırma, etiketlənmiş gücləndirici məhsulların yığılmasının həssas qiymətləndirilməsinə imkan verdi. Kəsilmiş molekullar 28S rRNT boyunca müxtəlif yerlərdə poliadenilləşdiyindən (şək. 1)B) və uzantılar müxtəlif uzunluqlarda idi, yığılma tək bir zolaqla nəticələnmir, əksinə ləkələnmiş bir siqnaldır. PM/Scl-100 və hXrn1-in RNAi susdurulmasını təmsil edən zolaqlarda kəsilmiş 28S rRNA fraqmentlərinin əhəmiyyətli dərəcədə yığılması müşahidə edilmişdir (Şəkil 4).B). PM/Scl-100 (mayada Rrp6) sitoplazmada mövcud olduğu bildirilsə də, o, əsasən insan hüceyrələrinin nüvəsində nüvə ekzosomu ilə əlaqədə olur (24, 25). Buna görə də, bu zolaqda müvafiq siqnal, çox güman ki, nüvə lokallaşdırılmış deqradasiya aralıqlarının yığılmasının nəticəsidir. Bunun əksinə olaraq, hRrp41 ilə susdurulmuş hüceyrələrdə kəsilmiş 28S rRNA fraqmentlərinin yığılması daha az kəskin idi.

Adenilatlanmış 28S rRNT deqradasiyası aralıq maddələri əsas ekzonükleazların RNT-nin susdurulması ilə hüceyrələrdə əhəmiyyətli dərəcədə toplanır. (A) KD eksonükleazından sonra adenilatlanmış, kəsilmiş 28S rRNA molekullarının yığılmasını aşkar etmək üçün PCR etiketləmə analizinin sxematik təqdimatı. Qısaca olaraq, müxtəlif KD hüceyrələrindən RNT-nin oliqo(dT) RT-dən sonra [32 P] ilə işarələnmiş gen-spesifik primerlə PCR (Şəkil 1-də göstərildiyi kimi molekulları təcrid etmək üçün istifadə edilən ulduz işarəsi ilə eynidir)B) və adapter oliqosu yerinə yetirildi. (B) Saxta və KD HeLa hüceyrələrindən təmizlənmiş RNT poliadenillənmiş, parçalanmış 28S rRNA-nın yığılmasını qiymətləndirmək üçün bu analizə məruz qalmışdır. DNT markerlərinin miqrasiyası sola göstərilir (nukleotid nömrələri). (C) Göstərilən zülalların RNTi tərəfindən susdurulduğu hüceyrələrdən alınan sitoplazmik və ya nüvə RNT-si oliqo(dT) RT-PCR etiketinə məruz qalmışdır. Reaksiyadan çıxarılan əks transkriptaz ilə idarəetmə hər panelin ən sağ zolağında göstərilir. (D) PCR məhsullarının poliadenilləşdirilmiş transkriptlərdən əmələ gəldiyini yoxlamaq üçün sitoplazmik fraksiyaların poli(A) quyruqlarının oliqo(dT) ilə astarlanmış RT-PZR-dən əvvəl oliqo(dT) və RNase H ilə inkubasiya yolu ilə çıxarıldığı bir nəzarət həyata keçirilmişdir. etiketləmə.Bu, RNase H ilə müalicə olunan, lakin oliqo(dT) olmayan hXrn1 nümunəsi ilə müqayisədə gücləndirmə siqnallarının fon səviyyələrinə azalması ilə nəticələndi [hXrn1 (-) etiketli zolaq].

hXrn1 sitoplazmada 5′-3′ RNT deqradasiyasında mərkəzi rol oynayır. İntuitiv olaraq əksinə, onun susdurulması poliadenillənmiş molekulların əhəmiyyətli dərəcədə yığılması ilə nəticələndi. Bu transkriptlərin sitoplazmik lokalizasiyası hXrn1 ilə nəzərdə tutulur, lakin açıq sual budur ki, niyə 5'-3' ekzonükleazın inhibəsi 3' uclu poli(A) quyruğu olan deqradasiya aralıqlarının yığılması ilə nəticələnir. Bu məsələyə baxılacaq Müzakirə.

Birlikdə, bu analizdən istifadə edərək əldə edilən məlumat, təcrid olunmuş poliadenillənmiş 28S rRNT fraqmentlərinin həqiqətən deqradasiya aralıqları olduğunu göstərir. Hüceyrə yerini qəti şəkildə müəyyən etmək üçün burada təsvir edilən analizlər nüvənin və sitoplazmanın fraksiyalaşdırılmasından sonra təkrarlandı. Həmçinin, ekzosom nüvəsinin bu prosesdə iştirak edib-etmədiyini daha da araşdırmaq üçün bir neçə əlavə subunit və ekzoribonukleazlar aşağı tənzimləndi.

Ekzoribonukleazların RNTİ-nin susdurulması İnsan Hüceyrələrinin Sitoplazmasında Poli(A)-a köməkli RNT-nin çürüməsinin mövcud olduğunu təsdiqlədi.

Keçici adenilatlanmış RNT-nin deqradasiyasının insan hüceyrələrinin sitoplazmasında baş verdiyini təsdiqləmək üçün nüvə və sitoplazmik fraksiyalar hazırlandıqdan sonra analiz təkrarlandı. İki əlavə ekzosom əsas komponenti, hRrp40 və PM/Scl-75 və iki ekzoribonukleaz, hDis3 və hDis3L yıxıldı. hDis3 maya Dis3 zülalının homoloqudur, hidrolitik 3′-5′ ekzoribonukleaz, mayada həm nüvədə, həm də sitoplazmada olan ekzosomla əlaqəli əlavə endonükleaz aktivliyə malikdir. Bu zülal sitoplazmik maya ekzosomunda yeganə katalitik alt birlik kimi xidmət edir (25, 26). Bu iş davam edərkən, insan hüceyrələrində əlavə Dis3 homoloqu hDis3L kəşf edildi və hDis3-dən fərqli olaraq, ekzosom nüvəsi ilə güclü əlaqəli olduğu və sitoplazmada lokallaşdırıldığı aşkar edildi. Buna görə də, insan hüceyrələrində daha çox ehtimal olunan Dis3 ortoloqudur və onun susdurulması daxil edilmişdir (27). İki əlavə ferment susduruldu: hXrn2 və Lsm1. Birincisi əsas, nüvədə lokallaşdırılmış 5′-3′ eksonükleazdır və buna görə də onun KD-nin sitoplazmada deyil, nüvədə toplanmasına səbəb olacağı gözlənilir (4). Lsm zülalları bakterial Hfq zülallarına bənzər bir rol oynayır, quyruq əlavə etməklə bakterial mRNT-nin parçalanmasında iştirak edir. Lsm1 hXrn1, qapağı açan fermentlər (Dcp1/Dcp2) və sitoplazmada mRNT çürüməsi ilə əlaqələndirilir. Həmçinin, histon mRNA oliqo (U) vasitəçiliyi ilə parçalanmada birbaşa iştirak etdiyi göstərildi. Beləliklə, onun RNAi susdurmasının təsiri də qiymətləndirilmişdir (28). Müvafiq antikorların olmaması üçün RT-PCR kəmiyyəti, susdurulmuş zülalların mRNA səviyyələrində əhəmiyyətli azalma göstərdi (Şəkil 3).C).

Ekzosom komponentləri hRrp40 və ya PM/Scl-75 ilə susdurulmuş hüceyrələrin sitoplazmasında heç bir yığılma müşahidə olunmadı və onların nüvə fraksiyalarında yalnız kiçik yığılma müşahidə oluna bildi (şək. 4).C). Bunun əksinə olaraq, hDis3 və ya hDis3L-nin KD-si kəsilmiş 28S rRNA fraqmentlərinin fərqli sitoplazmik yığılması ilə nəticələndi və bu, bu iki zülalın deqradasiya prosesində iştirak etdiyini göstərir. Gözlənildiyi kimi, hXrn1 və PM/Scl-100 susdurulması müvafiq olaraq sitoplazmik və nüvə fraksiyasında əhəmiyyətli yığılmaya səbəb oldu və hXrn2-nin KD yalnız nüvə fraksiyasında toplanması ilə nəticələndi. Lsm1-in susdurulması hər iki fraksiya daxilində yığılma ilə nəticələnmədi. Geldə müşahidə olunan etiketli məhsulların qeyri-spesifik tərs transkripsiyanın artefaktları deyil, poliadenilləşdirilmiş 28S rRNA molekullarının gücləndirilməsi yolu ilə əldə edildiyinə əmin olmaq üçün sitoplazmadan təmizlənmiş RNT oliqoddan (dT) əvvəl RNase H və oliqo(dT) ilə inkubasiya edilmişdir. )-primed əks transkripsiya (şəkil 4D). Bu yolla, bütün poli(A) quyruqları çıxarılacaq və sonrakı oliqo(dT) ilə astarlanmış RT zamanı heç bir cDNA istehsal olunmayacaq. Həqiqətən də, bu müalicə müşahidə olunan gücləndirilmiş siqnalları fon səviyyəsinə endirdi. Bu, ya tək RNase H ilə, ya da oliqo(dT) ilə birlikdə RNase H ilə inkubasiya edilmiş hXrn1 ilə susdurulmuş hüceyrələrdən təmizlənmiş RNT üçün alınan nəticəni müqayisə edərkən xüsusilə aydın olur (Şəkil 4).D).

Birlikdə bu nəticələr təsdiqləyir ki, rRNT təkcə insan hüceyrələrinin nüvəsində deyil, həm də sitoplazmada keçici adenilləşə bilər və bu, rRNT-nin çürüməsi ilə əlaqələndirilir. Sitoplazmada iştirak edən ekzoribonukleazlara hDis3L, hDis3 və hXrn1 daxildir, çünki adenilləşdirilmiş deqradasiya aralıqları onların aşağı tənzimlənməsi zamanı toplanır.

Ekzosom və ya hPNPase Susturulması Hetero-Adenilləşdirilmiş Klonların Faizinin azalmasına səbəb olmur.

Bu mərhələdə quyruqların, xüsusən də heteropolimer təbiətin əlavə edilməsindən məsul olan fermenti müəyyən etməyə çalışdıq. PNPase və arxeal ekzosom həm hetero-quyruq, həm də deqradasiya edən bakterial, orqanellar və arxaeal RNT-dən məsuldur (7). Struktur olaraq oxşar eukaryotik ekzosom əvvəlcə burada müşahidə edilən heteroaktivliyə namizəd idi və əgər o, hetero-quyruqların əmələ gəlməsinə cavabdeh olsaydı, onun KD-də homo-uzatmaların lehinə sürüşmə baş verəcəyi gözlənilir. Bununla belə, ekzosomda fosforolitik aktivliyin olmadığı bildirildi (25) və bununla razılaşaraq, təcrid olunmuş və ardıcıl klonların ümumi miqdarında homotaillərin faizinin ekzosom alt bölmələrinin KD-də, hRrp41, PM/ artmadığını aşkar etdik. Scl-100 və PM/Scl-75 (şək. 5).

Ekzosom komponentlərinin və ya hPNPase, VV ilə yoluxmuş hüceyrələr və mayaların RNTİ susdurulması ilə HeLa hüceyrələrindən təcrid olunmuş homopolimer quyruqlu molekulların faizi. HRrp41, PM/Scl-75, PM/Scl-100 və ya hPNPase (28S rRNA təhlil edilib) RNT-nin susdurulması ilə HeLa hüceyrələrindən təcrid olunmuş ardıcıl molekulların ümumi sayı arasında homopolimer quyruqlu molekulların faizi artmadı. VV ilə yoluxmuş hüceyrələrdə viral G8R RNT təhlil edildi və in S. cerevisiae, 25S rRNA, CYH2 və Actin1 (Cədvəl S3, S4 və S5).

PNPase insan hüceyrələrində (hPNPase) mövcuddur və fosforolitik aktivdir (29). Mitoxondrial membranlararası məkanda (IMS) (30) lokallaşdırılmış olsa da, biz hPNPase-nin sitokrom C və endonükleaza G (31) kimi digər İMS zülallarına bənzər, bu bölmədən azad olunaraq sitoplazmaya (və/) daxil ola bilməsi ehtimalını nəzərdən keçirdik. və ya nüvə), hetero-quyruqları polimerləşdirə bilər. Bununla belə, sabit hPNPase shRNA susdurulması olan hüceyrələrdə homotail nisbətində heç bir artım müşahidə edilməmişdir (32).


Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N. & Shatkin, A. J. Gen ifadəsinə nəzarətdə qapaq və qapaq bağlayan zülallar. RNT 2, 277–298 (2011)

Chen, Y. G., Kowtoniuk, W. E., Agarwal, I., Shen, Y. & Liu, D. R. LC/MS mobil RNT analizi NAD ilə əlaqəli RNT-ni aşkar edir. Təbiət Kimyası. Biol. 5, 879–881 (2009)

Houtkooper, R. H., Cantó, C., Wanders, R. J. & amp Auwerx, J. NAD + nın gizli həyatı: yeni metabolik siqnal yollarını idarə edən köhnə bir metabolit. Endokr. Rev. 31, 194–223 (2010)

Oppenheimer, N. J. NAD + və NADP + fermentlər üçün protez qrupları kimi. eLS http://dx.doi/org/10.1002/9780470015902.a0000637.pub2 (2010)

Deana, A., Celesnik, H. & amp Belasco, J. G. RppH bakterial fermenti 5′ pirofosfatın çıxarılması ilə messenger RNT deqradasiyasına səbəb olur. Təbiət 451, 355–358 (2008)

Mackie, G. A. Ribonuclease E 5′-ucundan asılı olan endonükleazdır. Təbiət 395, 720–724 (1998)

Frick, D. N. və Bessman, M. J. Yeni bir NADH pirofosfatazının klonlaşdırılması, təmizlənməsi və xüsusiyyətləri. MutT kimi fermentlərdə nukleotid pirofosfataz katalitik domeninin sübutu. J. Biol. Kimya. 270, 1529–1534 (1995)

Walseth, T. F. & amp Lee, H. C. Siklik-ADP-riboza səbəb olan Ca 2+ buraxılışının antaqonistlərinin sintezi və xarakteristikası. Biokim. Biofiz. Akta 1178, 235–242 (1993)

Preugschat, F., Tomberlin, G. H. & Porter, D. J. NAD + glikohidrolazın əsas mübadiləsi reaksiyası: yeni heterosiklik alternativ substratların müəyyən edilməsi. tağ. Biokimya. Biofiz. 479, 114–120 (2008)

Migaud, M. E., Pederick, R. L., Bailey, V. C. və Potter, B. V. Probing Aplysia californica Substrat bağlama tələbləri üçün adenozin 5'-difosfat ribosil siklaza: güclü inhibitorların dizaynı. Biokimya 38, 9105–9114 (1999)

Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V. & Sharpless, K. B. Addım-addım Huisgen sikloyükləmə prosesi: azidlərin və terminal alkinlərin mis (I)-katalizli regioselektiv "liqasiyası". Angew. Kimya. Int. Edn Engl. 41, 2596–2599 (2002)

Tornøe, C. W., Christensen, C. & amp Meldal, M. Peptidotriazoles on bərk faza: [1,2,3]-triazoles by regiosspecific mis(I)-catallysed 1,3-dipolyar cycloadditions to terminal alkines to azids. J. Org. Kimya. 67, 3057–3064 (2002)

Huang, F. CoA, NAD və FAD-ın RNT-yə effektiv şəkildə daxil edilməsi in vitro transkripsiya. Nuklein turşuları Res. 31, e8 (2003)

Opdyke, J. A., Fozo, E. M., Hemm, M. R. & Storz, G. RNase III, GadY-dən asılı olan parçalanmada iştirak edir. gadX-gadW mRNT. J. Mol. Biol. 406, 29–43 (2011)

Opdyke, J. A., Kang, J. G. & Storz, G. GadY, turşu reaksiya genlərinin kiçik RNT tənzimləyicisi Escherichia coli. J. Bakteriol. 186, 6698–6705 (2004)

Gerhart E, H. & Nordström, K. Plazmid R1-in replikasiya nəzarətində iştirak edən RNT molekulunun struktur analizi. Nuklein turşuları Res. 14, 2523–2538 (1986)

Lacatena, R. M. & Cesareni, G. Primer prekursorunda tamamlayıcı ardıcıllıqla RNT I-nin əsas cütləşməsi ColE1 replikasiyasını maneə törədir. Təbiət 294, 623–626 (1981)

D'Alessio, G. & Josse, J. Gliseraldehid fosfat dehidrogenaz, fosfogliserat kinaz və fosfogliseromutaz Escherichia coli. Eyni vaxtda təmizlənmə və fiziki xüsusiyyətlər. J. Biol. Kimya. 246, 4319–4325 (1971)

Masuda, N. & amp Church, G. M. Turşu müqaviməti genlərinin tənzimləyici şəbəkəsi Escherichia coli. Mol. Mikrobiol. 48, 699–712 (2003)

Jin, Y., Watt, R. M., Danchin, A. & Huang, J. D. Kiçik kodlaşdırılmayan RNT GcvB turşu müqavimətinin yeni tənzimləyicisidir. Escherichia coli. BMC Genomics 10, 165 (2009)

Hayes, E. T. və başqaları. Oksigen məhdudiyyəti katabolizmin və hidrogenazların, çoxlu dərman daşıyıcılarının və zərf tərkibinin pH tənzimlənməsini modulyasiya edir. Escherichia coli K-12. BMC Microbiol. 6, 89 (2006)

Gustavsson, N., Diez, A. & Nyström, T. Universal stress zülalının paraloqları Escherichia coli koordinasiyalı şəkildə tənzimlənir və DNT zədələnməsinə qarşı müdafiədə əməkdaşlıq edirlər. Mol. Mikrobiol. 43, 107–117 (2002)

Eguchi, Y. & Tomizawa, J. Komplementar RNT kök döngələri ilə əmələ gələn kompleks və onun zülalla sabitləşməsi: CoIE1 Rom zülalının funksiyası. Hüceyrə 60, 199–209 (1990)

Dumelin, C. E., Chen, Y., Leconte, A. M., Chen, Y. G. & Liu, D. R. Bakteriyalarda geranylated RNT-nin kəşfi və bioloji xarakteristikası. Təbiət Kimyası. Biol. 8, 913–919 (2012)

Bandyra, K. J. et al. Kiçik bir RNT-nin toxum bölgəsi, endoribonükleaza RNase E tərəfindən hədəf mRNT-nin idarə olunan məhvini idarə edir. Mol. Hüceyrə 47, 943–953 (2012)

McLennan, A. G. Nudiks hidrolazları arasında substrat qeyri-müəyyənliyi: bioloji əhəmiyyətli, təkamül qalığı, yoxsa hər ikisi? Hüceyrə. Mol. Həyat Elmi. 70, 373–385 (2013)

Song, M. G., Bail, S. & amp Kiledjian, M. Çoxlu Nudix ailə zülalları mRNA decapping fəaliyyətinə malikdir. RNT 19, 390–399 (2013)

Gherardini, P. F., Ausiello, G., Russell, R. B. & Helmer-Citterich, M. Nukleotid bağlayan ciblərin modul arxitekturası. Nuklein turşuları Res. 38, 3809–3816 (2010)

Bandyra, K. J., Bouvier, M., Carpousis, A. J. & Luisi, B. F. RNT deqradosomunun sosial quruluşu. Biokim. Biofiz. Akta 1829, 514–522 (2013)

Fjeld, C. C., Birdsong, W. T. & amp Goodman, R. H. NAD + və NADH-nin diferensial bağlanması transkripsiya corepressor karboksil-terminal bağlayıcı zülalın metabolik sensor kimi xidmət etməsinə imkan verir. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 100, 9202–9207 (2003)

Baba, T. və b. Tikintisi Escherichia coli K-12 çərçivəli, tək genli nokaut mutantları: Keio kolleksiyası. Mol. Sistem. Biol. 2, 2006.0008 (2006)

Hafner, M. et al. cDNA kitabxana ardıcıllığından istifadə edərək mikroRNT-lərin və digər kiçik tənzimləyici RNT-lərin identifikasiyası. Metodlar 44, 3–12 (2008)

Lohse, M. et al. RobiNA: RNT-Seq əsaslı transkriptomika üçün istifadəçi dostu, inteqrasiya olunmuş proqram həlli. Nuklein turşuları Res. 40, W622–W627 (2012)

Halbritter, F., Vaidya, H. J. və Tomlinson, S. R. GeneProf: yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı təcrübələrinin təhlili. Təbiət üsulları 9, 7–8 (2012)

Flicek, P. et al. Ansambl 2013. Nuklein turşuları Res. 41, D48–D55 (2013)

Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, S. L. Qısa DNT sekanslarının insan genomuna ultra sürətli və yaddaş səmərəli uyğunlaşdırılması. Genom Biol. 10, R25 (2009)

Nicol, J. W., Helt, G. A., Blanchard, S. G., Jr, Raja, A. & Loraine, A. E. İnteqrasiya edilmiş Genom Brauzeri: genom miqyaslı məlumat dəstlərinin yayılması və tədqiqi üçün pulsuz proqram. Bioinformatika 25, 2730–2731 (2009)

Keseler, I. M. et al. EcoCyc: model orqanizm verilənlər bazalarının sistem biologiyası ilə birləşməsidir. Nuklein turşuları Res. 41, D605–D612 (2013)

Bernofsky, C. & amp Gallagher, W. J. Azaldılmış və oksidləşmiş piridin nukleotidləri arasında enzim olmayan hidrogen transferi. Biokim. Biofiz. Akta 659, 1–6 (1981)

Celesnik, H., Deana, A. & amp Belasco, J. G. RNT-nin PABLO analizi: 5′-fosforilasiya vəziyyəti və 5′-ucu xəritəçəkmə. Metodlar Enzimol. 447, 83–98 (2008)

Celesnik, H., Deana, A. & Belasco, J. G. RNT çürüməsinin başlanması Escherichia coli 5′ pirofosfatın çıxarılması ilə. Mol. Hüceyrə 27, 79–90 (2007)

Tomcsányi, T. & Apirion, D. Emal fermenti ribonukleaza E xüsusi olaraq RNT I-ni parçalayır. Plazmid DNT sintezində primer əmələ gəlməsinin inhibitoru. J. Mol. Biol. 185, 713–720 (1985)

Masukata, H. & Tomizawa, J. ColE1 plazmid replikasiyası üçün primer formalaşmasına nəzarət: primer transkriptinin konformativ dəyişməsi. Hüceyrə 44, 125–136 (1986)

Blomberg, P., Wagner, E. G. & Nordström, K. Plazmid R1-in təkrarlanmasına nəzarət: antisens RNT, CopA və onun hədəfi CopT arasındakı dupleks xüsusi olaraq işlənir. in vivoin vitro RNase III tərəfindən. EMBO J. 9, 2331–2340 (1990)

Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H. & Vogel, J. Kiçik bir RNT, ribosom bağlayan yerlərin içərisində və yuxarı hissəsində C/A ilə zəngin elementləri hədəf alaraq çoxlu ABC daşıyıcı mRNA-nı tənzimləyir. Genes Dev. 21, 2804–2817 (2007)

Thomason, M. K., Fontaine, F., De Lay, N. & Storz, G. Qida maddələrinin mövcudluğundakı dəyişikliklərə cavab olaraq hərəkətliliyi və biofilmin formalaşmasını tənzimləyən kiçik bir RNT. Escherichia coli. Mol. Mikrobiol. 84, 17–35 (2012)

Jørgensen, M. G. et al. Kiçik tənzimləyici RNT-lər çox hüceyrəli yapışqan həyat tərzini idarə edir Escherichia coli. Mol. Mikrobiol. 84, 36–50 (2012)

Jørgensen, M. G., Thomason, M. K., Havelund, J., Valentin-Hansen, P. & Storz, G. Biofilm formalaşmasına nəzarət etməkdə McaS kiçik RNT-nin ikili funksiyası. Genes Dev. 27, 1132–1145 (2013)

Rasmussen, A. A. və başqaları. Konservləşdirilmiş kiçik RNT xarici membran zülalı YbfM-nin susdurulmasına kömək edir. Mol. Mikrobiol. 72, 566–577 (2009)

Mandin, P. & amp Gottesman, S. Maraqlanan genlərin kiçik RNT tənzimləyicilərini tapmaq üçün bir genetik yanaşma RybC-ni DpiA/DpiB iki komponentli sistemi tənzimləyən kimi müəyyən edir. Mol. Mikrobiol. 72, 551–565 (2009)

Weilbacher, T. et al. Karbon saxlama tənzimləmə sisteminin yeni sRNA komponenti Escherichia coli. Mol. Mikrobiol. 48, 657–670 (2003)

Lease, R. A., Smith, D., McDonough, K. & Belfort, M. Kiçik kodlaşdırılmayan DsrA RNT turşuya davamlılıq tənzimləyicisidir. Escherichia coli. J. Bakteriol. 186, 6179–6185 (2004)

Sledjeski, D. D., Gupta, A. və Gottesman, S. Kiçik RNT, DsrA, eksponensial artım zamanı RpoS-in aşağı temperaturda ifadəsi üçün vacibdir. Escherichia coli. EMBO J. 15, 3993–4000 (1996)

İcarə, R. A. və Belfort, M. A trans- RNT-də idarəetmə açarı kimi fəaliyyət göstərir Escherichia coli: DsrA alternativ strukturlar formalaşdırmaqla funksiyanı modulyasiya edir. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 97, 9919–9924 (2000)

Lease, R. A., Cusick, M. E. & Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNT çoxlu lokuslarda RNT:RNT qarşılıqlı təsiri ilə fəaliyyət göstərir. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 95, 12456–12461 (1998)

Göpel, Y., Papenfort, K., Reichenbach, B., Vogel, J. & amp Görke, B. RNase E üçün bir adapter zülalı ilə tənzimləyici kiçik RNT-nin hədəflənmiş çürüməsi və anti-adaptor RNT ilə əks təsir. Genes Dev. 27, 552–564 (2013)

Urban, J. H. & amp Vogel, J. İki zahirən homoloji kodlaşdırmayan RNT aktivləşdirmək üçün iyerarxik şəkildə hərəkət edir. glmS mRNA tərcüməsi. PLoS Biol. 6, e64 (2008)

Reichenbach, B., Maes, A., Kalamorz, F., Hajnsdorf, E. & Görke, B. Kiçik RNT GlmY, sRNT GlmZ-nin aktivləşdirilməsində yuxarıda hərəkət edir. glmS ifadə edilir və poliadenilləşmə yolu ilə tənzimlənir Escherichia coli. Nuklein turşuları Res. 36, 2570–2580 (2008)

Moon, K. & amp Gottesman, S. A PhoQ/P ilə tənzimlənən kiçik RNT həssaslığını tənzimləyir. Escherichia coli antimikrobiyal peptidlərə. Mol. Mikrobiol. 74, 1314–1330 (2009)

Fozo, E. M. və başqaları. Sib və OhsC kiçik RNT-ləri tərəfindən kiçik zəhərli protein sintezinin repressiyası. Mol. Mikrobiol. 70, 1076–1093 (2008)

Vogel, J. et al. RNomics in Escherichia coli yeni sRNT növlərini aşkar edir və bakteriyalarda paralel transkripsiya çıxışını göstərir. Nuklein turşuları Res. 31, 6435–6443 (2003)

Blasi, F. et al. Histidin operonunun transkripsiyasının inhibəsi in vitro histidin yolunun birinci fermenti tərəfindən. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 70, 2692–2696 (1973)

Richards, J., Luciano, D. J. & Belasco, J. G. Tərcümənin RppH-dan asılı mRNT deqradasiyasına təsiri. Escherichia coli. Mol. Mikrobiol. 86, 1063–1072 (2012)

Nobelmann, B. & amp Lengeler, J. W. Gat genlərinin molekulyar analizi. Escherichia coli və onların qalaktitolun daşınmasında və metabolizmində rolları. J. Bakteriol. 178, 6790–6795 (1996)

Tucker, D. L., Tucker, N. & amp Conway, T. pH reaksiyasının gen ifadə profili Escherichia coli. J. Bakteriol. 184, 6551–6558 (2002)

Penq, C. A., Oliver, M. J. və Vud, A. J. Rehidrin TrDr3-dür. Tortula ruralis soyuq, duzluluq və azaldılmış pH tolerantlığı ilə bağlıdır? TrDr3-ortoloqun fizioloji qiymətləndirilməsi, HdeD-dən Escherichia coli abiotik stressə cavab olaraq. Bitki Biol. 7, 315–320 (2005)

Lawther, R. P. & Hatfield, G. W. İlvGEDA operonunun zəiflədicisində transkripsiyanın dayandırılmasının multivalent tərcümə nəzarəti Escherichia coli K-12. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 77, 1862–1866 (1980)

Purta, E. et al. The yfhQ gen Escherichia coli tRNT-ni kodlayır: Cm32/Um32 metiltransferaza. BMC Mol. Biol. 7, 23 (2006)

Elovson, J. & amp Vagelos, P. R. Acyl daşıyıcı protein. X. Asil daşıyıcı zülal sintetaza. J. Biol. Kimya. 243, 3603–3611 (1968)

Lu, P., Vogel, C., Wang, R., Yao, X. & amp Marcotte, E. M. Mütləq protein ifadəsi profili transkripsiya və tərcümə tənzimlənməsinin nisbi töhfələrini təxmin edir. Təbiət Biotexnologiyası. 25, 117–124 (2007)

Rudolph, F. B. & Fromm, H. J. Aspartazanın təmizlənməsi və xassələri. Escherichia coli. tağ. Biokimya. Biofiz. 147, 92–98 (1971)

Karsten, W. E. & Viola, R. E. L-aspartazanın kinetik tədqiqatları Escherichia coli: pH-dan asılı fəaliyyət dəyişir. tağ. Biokimya. Biofiz. 287, 60–67 (1991)

Maki, Y., Yoshida, H. & Wada, A. Stasionar fazada istirahət edən ribosomlarla əlaqəli iki zülal, YfiA və YhbH Escherichia coli. Gen Hüceyrələri 5, 965–974 (2000)

Agafonov, D. E., Kolb, V. A., Nazimov, I. V. & Spirin, A. S. Bakterial ribosomun subunit interfeysində yerləşən zülal. Proc.Natl akad. Sci. ABŞ 96, 12345–12349 (1999)

Vila-Sanjurjo, A., Schuwirth, B. S., Hau, C. W. & Cate, J. H. Stress zamanı tərcümənin başlanmasına nəzarət üçün struktur əsas. Təbiət quruluşu. Mol. Biol. 11, 1054–1059 (2004)

Agafonov, D. E., Kolb, V. A. & Spirin, A. S. Aminoasil-tRNA bağlanma mərhələsində tərcüməni maneə törədən ribosomla əlaqəli zülal. EMBO Rep. 2, 399–402 (2001)

Kim, K. S. & amp Lee, Y. Siqma amillərinin və endoribonukleazların istifadəsini dəyişdirməklə 6S RNT biogenezinin tənzimlənməsi. Nuklein turşuları Res. 32, 6057–6068 (2004)

Weber, M. M., French, C. L., Barnes, M. B., Siegele, D. A. & McLean, R. J. Əvvəllər xarakterik olmayan gen, yjfO (bsmA), təsir edir Escherichia coli biofilmin əmələ gəlməsi və stresə reaksiya. Mikrobiologiya 156, 139–147 (2010)

Robbins, J. C. & amp Oxender, D. L. Alanin, serin və glisin üçün nəqliyyat sistemləri Escherichia coli K-12. J. Bakteriol. 116, 12–18 (1973)

Ghrist, A. C. və Stauffer, G. V. The Escherichia coli qlisinin nəqli sistemi və onun qlisinin parçalanması ferment sisteminin tənzimlənməsində rolu. Mikrobiologiya 141, 133–140 (1995)

Pulvermacher, S. C., Stauffer, L. T. və Stauffer, G. V. sRNA GcvB-nin tənzimlənməsində rolu sikA in Escherichia coli. Mikrobiologiya 155, 106–114 (2009)

Hugovieux-Cotte-Pattat, N. & Robert-Baudouy, J. Tənzimləmə və transkripsiya istiqaməti exuR, özünü tənzimləyən repressor Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol. 156, 221–228 (1982)

Rodionov, D. A., Mironov, A. A., Rakhmaninova, A. B. & Gelfand, M. S. Qamma bənövşəyi bakteriyalarda heksuronidlər, heksuronatlar və heksonatlar üçün nəqliyyat və istifadə sistemlərinin transkripsiya tənzimlənməsi. Mol. Mikrobiol. 38, 673–683 (2000)

Cole, S. T. və başqaları. Nukleotidlərin ardıcıllığı və gen-polipeptid əlaqələri glpABC anaerobu kodlayan operon sn-qliserin-3-fosfat dehidrogenaz Escherichia coli K-12. J. Bakteriol. 170, 2448–2456 (1988)

Schryvers, A., Lohmeier, E. & amp Weiner, J. H. Membranla əlaqəli, aerob qliserol-3-fosfat dehidrogenazın yerli və yenidən qurulmuş formalarının kimyəvi və funksional xüsusiyyətləri. Escherichia coli. J. Biol. Kimya. 253, 783–788 (1978)

Summers, M. C. & amp Rose, I. A. Metilglioksal sintazanın proton transfer reaksiyaları. J. Am. Kimya. Soc. 99, 4475–4478 (1977)

Plumbridge, J. A. Nag regulonun repressiyası və induksiyası Escherichia coli K-12: rolları nagCnagA induksiya olunmamış vəziyyətin saxlanmasında. Mol. Mikrobiol. 5, 2053–2062 (1991)

White, R. J. Amin şəkər metabolizmasına nəzarət Escherichia coli və amin şəkərlərini parçalaya bilməyən mutantların təcrid edilməsi. Biokimya. J. 106, 847–858 (1968)

Freundlich, M., Ramani, N., Mathew, E., Sirko, A. & Tsui, P. Gen ifadəsində inteqrasiya host faktorunun rolu. Escherichia coli. Mol. Mikrobiol. 6, 2557–2563 (1992)

Nelson, W. C., Howard, M. T., Sherman, J. A. & amp Matson, S. W. The tray gen məhsulu və inteqrasiya host faktoru stimullaşdırır Escherichia coli F plazmid oriT-də DNT helikaz I-katalizli nicking. J. Biol. Kimya. 270, 28374–28380 (1995)

Dhavan, G. M., Crothers, D. M., Chance, M. R. & Brenowitz, M. DNT-nin uyğunlaşdırılmış bağlanması və əyilməsi Escherichia coli inteqrasiya host faktoru. J. Mol. Biol. 315, 1027–1037 (2002)

Yanagisawa, T., Sumida, T., Ishii, R., Takemoto, C. & amp Yokoyama, S. Lizil-tRNA sintetazasının paraloqu P tərcümə uzadılması faktorunda qorunan lizin qalığını aminoasilatlayır. Təbiət quruluşu. Mol. Biol. 17, 1136–1143 (2010)

Kaiser, K. & amp Murray, N. E. "Rac peyğəmbərliyi" nin fiziki xarakteristikası. E. coli K12. Mol. General Genet. 175, 159–174 (1979)

Caldas, T. et al. FtsJ/RrmJ istilik şok zülalı Escherichia coli 23 S ribosomal RNT metiltransferazadır. J. Biol. Kimya. 275, 16414–16419 (2000)

Theobald, A., Springer, M., Grunberg-Manago, M., Ebel, J. P. & Giege, R. Üçüncü quruluş Escherichia coli tRNA Thr 3 məhlulunda və bu tRNA-nın qohum treonil-tRNA sintetaza ilə qarşılıqlı təsiri. Avro. J. Biochem. 175, 511–524 (1988)

Serres, M. H. və başqaları. Funksional yeniləmə Escherichia coli K-12 genomu. Genom Biol. 2, RESEARCH0035 (2001)

Tschowri, N., Busse, S. & Hengge, R. BLUF-EAL zülalı YcgF mavi işıq reaksiyasında birbaşa antirepressor kimi çıxış edir. Escherichia coli. Genes Dev. 23, 522–534 (2009)

Daley, D. O. və başqaları. Qlobal topologiya təhlili Escherichia coli daxili membran proteomu. Elm 308, 1321–1323 (2005)

Lhoest, J. & amp Colson, C. Soyuq həssas ribosomların birləşməsi Escherichia coli ribosomal protein L3-də tək metil qrupu olmayan mutant. Avro. J. Biochem. 121, 33–37 (1981)

Heurgue-Hamard, V., Champ, S., Engström, A., Ehrenberg, M. & amp Buckingham, R. H. The hemK gen içində Escherichia coli kodlaşdırır N 5 - peptidlərin buraxılması faktorlarını dəyişdirən glutamin metiltransferaza. EMBO J. 21, 769–778 (2002)

White, P. J., Millar, G. & Coggins, J. R. Xorizmat sintazasının həddindən artıq ifadəsi, təmizlənməsi və tam amin turşusu ardıcıllığı. Escherichia coli K12 və onun fermenti ilə müqayisəsi Neyrospora crassa. Biokimya. J. 251, 313–322 (1988)

Imamura, R. et al. nin identifikasiyası cpdA siklik 3′,5′-adenozin monofosfat fosfodiesterazı kodlayan gen Escherichia coli. J. Biol. Kimya. 271, 25423–25429 (1996)

Long, C. W. və Pardee, A. B. Sitidin trifosfat sintetaza Escherichia coli B. I. Təmizləmə və kinetik. J. Biol. Kimya. 242, 4715–4721 (1967)

Py, B., Higgins, C. F., Krisch, H. M. & amp Carpousis, A. J. A DEAD-box RNT helicase Escherichia coli RNT deqradosomu. Təbiət 381, 169–172 (1996)

Jeanningros, R., Creuzet-Sigal, N., Frixon, C. & Cattaneo, J. Purification and xass of a debraching ferment from Escherichia coli. Biokim. Biofiz. Akta 438, 186–199 (1976)

Ballicora, M. A., Iglesias, A. A. və Preiss, J. ADP-qlükoza pirofosforilaza, bakterial glikogen sintezi üçün tənzimləyici ferment. Mikrobiol. Mol. Biol. Rev. 67, 213–225 (2003)

Joly, J. C. & Wickner, W. Translokazanın SecA və SecY alt bölmələri translokasiya edən preproteinin ən yaxın qonşularıdır və onu fosfolipidlərdən qoruyur. EMBO J. 12, 255–263 (1993)

Wada, A. & Sako, T. Yeni ribosomal zülalların A və B üçün əsas strukturları və genləri. Escherichia coli. J. Biochem. 101, 817–820 (1987)

Sparrow, C. P. & Raetz, C. R. Membranla əlaqəli CDP-diqliserid sintetazasının təmizlənməsi və xassələri. Escherichia coli. J. Biol. Kimya. 260, 12084–12091 (1985)

Langley, K. E. & Kennedy, E. P. CTP-nin qismən təmizlənməsi və xassələri: membranlardan fosfatidik turşu sitidiltransferaza Escherichia coli. J. Bakteriol. 136, 85–95 (1978)

Kanehara, K., Ito, K. & amp Akiyama, Y. YaeL (EcfE) anti-sigma (E), RseA-nın site-2 parçalanması vasitəsilə stress cavabının sigma (E) yolunu aktivləşdirir. Genes Dev. 16, 2147–2155 (2002)

Alba, B. M., Lids, J. A., Onufryk, C., Lu, C. Z. & Gross, C. A. DegS və YaeL, siqmadan (E) asılı ekstrasitoplazmik stress reaksiyasını aktivləşdirmək üçün RseA-nın parçalanmasında ardıcıl olaraq iştirak edirlər. Genes Dev. 16, 2156–2168 (2002)

Takeda, K., Akimoto, C. & Kawamukai, M. Effektləri Escherichia coli sfsA gen üzərində mal gen ifadəsi və SfsA-nın DNT bağlama fəaliyyəti. Biosci. Biotexnol. Biokimya. 65, 213–217 (2001)

Kawamukai, M. et al. Nukleotidlərin ardıcıllığı və xarakteristikası sfs1 gen: sfs1 CRP*-dən asılı olaraq iştirak edir mal gen ifadəsi Escherichia coli. J. Bakteriol. 173, 2644–2648 (1991)

Paul, B. J. et al. DksA: ppGpp və başlanğıc NTP tərəfindən rRNA promotorlarının tənzimlənməsini gücləndirən transkripsiya başlama mexanizminin kritik komponenti. Hüceyrə 118, 311–322 (2004)

Clark, R. B. & amp Ogilvie, J. W. Aspartokinase I-homoserin dehidrogenaz I Escherichia coli K12. Subunit molekulyar çəkisi və nikotinamid-adenin dinukleotid fosfat bağlanması. Biokimya 11, 1278–1282 (1972)

Starnes, W. L. və başqaları. Treoninə həssas aspartokinaz-homoserin dehidrogenaza kompleksi, amin turşusu tərkibi, molekulyar çəkisi və kompleksin subunit tərkibi. Biokimya 11, 677–687 (1972)

Burr, B., Walker, J., Truffa-Bachi, P. & Cohen, G. N. Homoserine kinase from Escherichia coli K12. Avro. J. Biochem. 62, 519–526 (1976)

Johansen, J., Eriksen, M., Kallipolitis, B. & Valentin-Hansen, P. Xarici membran zülallarının kodlaşdırılmayan RNT-lər tərəfindən aşağı tənzimlənməsi: cAMP-CRP- və σE-dən asılı CyaR-ompX tənzimləmə işinin açılması. J. Mol. Biol. 383, 1–9 (2008)

De Lay, N. və Gottesman, S. Crp ilə aktivləşdirilmiş kiçik kodlaşdırmayan tənzimləyici RNT CyaR (RyeE) qidalanma vəziyyətini qrup davranışı ilə əlaqələndirir. J. Bakteriol. 191, 461–476 (2009)

Andersen, J., Forst, S. A., Zhao, K., Inouye, M. & Delihas, N. The funksiyası micF RNT. micF RNT, OmpF zülalının istilik tənzimlənməsində əsas amildir Escherichia coli. J. Biol. Kimya. 264, 17961–17970 (1989)

Deighan, P., Free, A. & Dorman, C. J. Rol Escherichia coli Modulyasiya yolu ilə OmpF porin ifadəsində H-NS kimi protein StpA micF RNT sabitliyi. Mol. Mikrobiol. 38, 126–139 (2000)

Trotochaud, A. E. və Wassarman, K. M. 6S RNT funksiyası hüceyrənin uzunmüddətli sağ qalmasını artırır. J. Bakteriol. 186, 4978–4985 (2004)

Wassarman, K. M. & Storz, G. 6S RNT tənzimləyir E. coli RNT polimeraz fəaliyyəti. Hüceyrə 101, 613–623 (2000)

Kim, E. Y., Şin, M. S., Rhee, J. H. və amp Choy, H. E. Siqma-38 ehtiva edən RNT polimerazının stasionar faza gen ifadəsində üstünlüklü istifadəsinə təsir edən amillər Escherichia coli. J. Mikrobiol. 42, 103–110 (2004)

Muto, A. et al. 10Sa RNT-nin quruluşu və funksiyası: trans- tərcümə sistemi. Biokimya 78, 985–991 (1996)

Roche, E. D. & amp Sauer, R. T. SsrA vasitəçiliyi ilə peptid etiketlənməsi nadir kodonların və tRNA çatışmazlığının səbəb olduğu. EMBO J. 18, 4579–4589 (1999)

Kawano, M., Reynolds, A. A., Miranda-Rios, J. & Storz, G. 5′- və 3′-UTR-dən əldə edilən kiçik RNT-lərin və cis-kodlaşdırılmış antisens RNT-lərin aşkarlanması. Escherichia coli. Nuklein turşuları Res. 33, 1040–1050 (2005)


Mol Gen İmtahan 4

İnduksiya olunan operon adətən transkripsiya edilmir. Mənfi induksiya olunan operonda repressor zülalını təsirsiz hala gətirməklə və ya müsbət induksiya olunan operonda aktivator zülalını stimullaşdırmaqla transkripsiyanı stimullaşdırmaq üçün induktor molekulu tələb olunur.

(a) mRNT-də akridin boyası ilə səbəb olan mutasiya. Vəziyyət cəlb olunan hüceyrədə heterozigotdur.

2. Tərcümənin qarşısının alınması

3. Transkripsiyanın susdurulması

2. Eukaryotik hüceyrələrdə xromatin quruluşu genlərin tənzimlənməsində rol oynayır. Qatılaşdırılmış xromatin transkripsiyanı maneə törədir. Beləliklə, ifadənin baş verməsi üçün xromatin strukturda dəyişikliklərə imkan vermək üçün dəyişdirilməlidir. Bu dəyişikliklərdə histon zülallarının asetilasiyası və DNT metilasiyası vacibdir.

3. Transkripsiyanın başlaması səviyyəsində proses eukaryotik hüceyrələrdə daha mürəkkəbdir. Eukariotlarda inisiasiya RNT polimeraza, ümumi transkripsiya faktorları və transkripsiya aktivatorlarını əhatə edən mürəkkəb bir maşın tələb edir. Bakterial RNT polimeraza ya bloklanır, ya da tənzimləyici zülalların hərəkətləri ilə stimullaşdırılır.

Eukariotlarda promotorlar, proksimal promotor elementlər, gücləndiricilər və səsboğucular.

a.
orta dərəcədə təkrarlanan DNT
b.
çox təkrarlanan DNT
c.
qısa kəsişən elementlər
d.
uzun kəsişmiş elementlər
e.
unikal ardıcıllıq DNT

2. Birbaşa təmir. DNT zədəsi zədələnmiş nukleotidin birbaşa orijinal quruluşuna qaytarılması ilə bərpa olunur.

3. Baza eksizyonunun təmiri. Zədələnmiş baza çıxarılır və sonra bütün nukleotid dəyişdirilir.

4. Fotoreaktiv təmir - UV işığının təsiri ilə əmələ gələn pirimidin dimerlərinin geri çevrilməsi. Fotoaktivləşdirmə fermentini tələb edir

5. Post-replikasiya təmiri - DNT replikasiyası zamanı ilkin uyğunsuzluq təmirindən xilas olmuş zədələnmiş DNT-də baş verir. Bu mexanizmdə RecA zülalı eyni qütbün zədələnməmiş ana zəncirində müvafiq olanı yenidən birləşdirir.

6. Cüt zəncir qırıqlarının təmiri - DNT-nin iki qırıq zəncirinin birləşdirilməsinə cavabdehdir - şablon kimi homoloji rekombinasiya təmirindən və bacı xromatiddə müvafiq bölgədən istifadə edir.


Eukaryotik pre-mRNT tərcümə olunmağa hazır olana qədər geniş emaldan keçir. Eukaryotik mRNT-nin yetişməsində iştirak edən əlavə addımlar prokaryotik mRNT-dən daha uzun yarı ömrü olan bir molekul yaradır. Eukaryotik mRNA-lar bir neçə saat davam edir, halbuki tipikdir E. coli mRNT beş saniyədən çox davam etmir.

Pre-mRNA-lar əvvəlcə RNT-ni stabilləşdirən zülallarla örtülür, bunlar pre-mRNT-ni emal edilərkən və nüvədən xaric edilərkən deqradasiyadan qoruyur. Pre-mRNT emalının üç ən mühüm addımı molekulun 5′ və 3′ uclarına stabilləşdirici və siqnal faktorlarının əlavə edilməsi və uyğun amin turşularını təyin etməyən ara sıraların aradan qaldırılmasıdır. Nadir hallarda, mRNT transkripti transkripsiya edildikdən sonra “redaktə edilə bilər”.

5′ Qapaq

Pre-mRNT hələ də sintez olunarkən, a 7-metilquanozin qapağı fosfat əlaqəsi ilə böyüyən transkriptin 5′ ucuna əlavə olunur. Bu hissə (funksional qrup) yaranmaqda olan mRNT-ni deqradasiyadan qoruyur. Bundan əlavə, protein sintezində iştirak edən amillər ribosomlar tərəfindən tərcümənin başlanmasına kömək etmək üçün qapağı tanıyır.

3′ Poly-A Quyruq

Uzatma tamamlandıqdan sonra pre-mRNT AAUAAA konsensus ardıcıllığı ilə GU ilə zəngin ardıcıllıq arasında endonükleaz tərəfindən parçalanır və AAUAAA ardıcıllığı pre-mRNT-də qalır. Poli-A polimeraza adlı ferment daha sonra təxminən 200 A qalıqdan ibarət bir sıra əlavə edir. poli-A quyruğu. Bu modifikasiya pre-mRNT-ni deqradasiyadan daha da qoruyur və transkriptin sitoplazmaya ehtiyac duyduğu hüceyrə faktorlarının ixracına siqnal verir.

Pre-mRNA Splicing

Eukaryotik genlərdən ibarətdir ekzonlar, protein kodlaşdırma ardıcıllığına uyğundur (keçmişüzərində olduqlarını bildirir məsbasdı) və intadlanan ervening ardıcıllığı intronlar (intron onları bildirir intervening rol), gen tənzimlənməsində iştirak edə bilər, lakin emal zamanı pre-mRNT-dən çıxarılır. mRNT-də intron ardıcıllığı funksional zülalları kodlaşdırmır.

İntronların kəşfi 1970-ci illərdə prokaryotlarda müşahidə etdikləri kimi pre-mRNT-lərin əlavə emal etmədən zülal ardıcıllığını təyin edəcəyini gözləyən tədqiqatçılar üçün sürpriz oldu. Yüksək eukariotların genləri çox vaxt bir və ya daha çox intron ehtiva edir. Bu bölgələr tənzimləyici ardıcıllığa uyğun ola bilər, lakin bir gendə çoxlu introna malik olmanın və ya çox uzun introna malik olmağın bioloji əhəmiyyəti aydın deyil. Mümkündür ki, intronlar gen ifadəsini yavaşlatır, çünki çoxlu intronlu pre-mRNA-ları transkripsiya etmək daha uzun vaxt aparır. Alternativ olaraq, intronlar təkamül boyu qədim genlərin birləşməsindən qalan qeyri-funksional ardıcıllıq qalıqları ola bilər. Bu, ayrı-ayrı ekzonların tez-tez ayrı-ayrı zülal alt vahidlərini və ya domenlərini kodlaşdırması ilə dəstəklənir. Əksər hallarda, intronların ardıcıllığı zülal məhsuluna təsir etmədən mutasiya edilə bilər.

Protein sintezindən əvvəl mRNT-dən əvvəlki bütün intronlar tamamilə və dəqiq şəkildə çıxarılmalıdır. Əgər proses hətta tək bir nukleotid tərəfindən də səhv olarsa, yenidən birləşən ekzonların oxu çərçivəsi dəyişəcək və nəticədə ortaya çıxan zülal disfunksiyalı olacaq. İntronların çıxarılması və ekzonların yenidən birləşdirilməsi prosesi adlanır qoşma (Şəkil 1). Pre-mRNT hələ də nüvədə olarkən intronlar çıxarılır və parçalanır. Birləşmə, intronların çıxarılmasını və ekzonların tək bir nukleotidin dəqiqliyi və dəqiqliyi ilə yenidən birləşməsini təmin edən ardıcıllığa xüsusi bir mexanizm vasitəsilə baş verir. Pre-mRNA-ların birləşdirilməsi spliceosomlar adlanan zülal və RNT molekullarının kompleksləri tərəfindən həyata keçirilir.

Təcrübə sualı

Şəkil 1. Pre-mRNT splicing ilkin RNT transkriptindən intronların dəqiq çıxarılmasını nəzərdə tutur. Birləşmə prosesi zülallardan və snRNA adlanan RNT molekullarından ibarət olan spliceosomlar adlanan zülal kompleksləri tərəfindən kataliz edilir. Spliceosomlar intronun 5′ və 3′ ucundakı ardıcıllığı tanıyır.

Birləşmədə səhvlər xərçəng və digər insan xəstəliklərinə səbəb olur. Hansı növ mutasiyalar birləşmə xətalarına səbəb ola bilər?

Qeyd edək ki, 70-dən çox fərdi intron mövcud ola bilər və hər biri tək, tərcümə oluna bilən mRNT molekulu yaratmaq üçün 5′ qapaq və poli-A quyruğunun əlavə edilməsinə əlavə olaraq birləşmə prosesindən keçməlidir.

Tripanosomlarda RNT Redaktəsi

Şəkil 2. Trypanosoma brucei insanlarda yuxu xəstəliyinin törədicisidir. Zülal sintezi baş verməzdən əvvəl bu patogenin mRNA-ları nukleotidlərin əlavə edilməsi ilə dəyişdirilməlidir. (Kredit: Torsten Ochsenreiter tərəfindən işin dəyişdirilməsi)

Tripanosomlar patogenin daxil olduğu protozoa qrupudur Trypanosoma brucei, insanlarda yuxu xəstəliyinə səbəb olur (Şəkil 2). Tripanosomlarda və demək olar ki, bütün digər eukariotlarda hüceyrəni kimyəvi enerji ilə təmin edən mitoxondriya adlanan orqanoidlər var. Mitoxondriyalar öz DNT-lərini ifadə edən orqanoidlərdir və eukariotla udulmuş prokaryot arasındakı simbiotik əlaqənin qalıqları olduğuna inanılır. Tripanosomların mitoxondrial DNT-si Mərkəzi Doqma üçün maraqlı bir istisna nümayiş etdirir: onların pre-mRNT-lərində funksional zülal təyin etmək üçün düzgün məlumat yoxdur. Adətən bunun səbəbi mRNT-də bir neçə U nukleotidinin olmamasıdır. Hüceyrə bunu düzəltmək üçün RNT redaktəsi adlı əlavə bir RNT emal mərhələsi həyata keçirir.

Mitoxondrial genomun digər genləri 40-80 nukleotid bələdçi RNT-ləri kodlayır. Bu molekullardan biri və ya bir neçəsi pre-mRNT transkriptindəki bəzi nukleotidlərlə tamamlayıcı baza cütləşməsi yolu ilə qarşılıqlı əlaqədə olur. Bununla belə, bələdçi RNT-də pre-mRNT-nin bağlanması üçün U nukleotidlərindən daha çox A nukleotidləri var. Bu bölgələrdə bələdçi RNT dövrələri çıxır. Bələdçi RNT-lərin 3′ ucları uzun poli-U quyruğuna malikdir və bu U əsasları bələdçi RNT-lərin ilgəkləndiyi pre-mRNT transkriptinin bölgələrinə daxil edilir. Bu proses tamamilə RNT molekulları tərəfindən həyata keçirilir. Yəni, zülallar deyil, bələdçi RNT-lər RNT redaktəsində katalizator rolunu oynayır.

RNT-nin redaktəsi təkcə tripanosomların fenomeni deyil. Bəzi bitkilərin mitoxondrilərində demək olar ki, bütün pre-mRNT-lər redaktə olunur. RNT redaktəsi siçovullar, dovşanlar və hətta insanlar kimi məməlilərdə də müəyyən edilmişdir. Pre-mRNT emalında bu əlavə addımın təkamül səbəbi nə ola bilər? Ehtimallardan biri, qədim prokaryotların qalıqları olan mitoxondrilərin gen ifadəsini tənzimləmək üçün eyni dərəcədə qədim RNT əsaslı metoda sahib olmasıdır. Bu fərziyyəni dəstəkləmək üçün, pre-mRNA-lara edilən düzəlişlər hüceyrə şəraitindən asılı olaraq fərqlənir. Spekulyativ olsa da, RNT-nin redaktəsi prosesi zülalların əvəzinə RNT molekullarının reaksiyaları kataliz etmək üçün cavabdeh olduğu ibtidai dövrdən qalmış ola bilər.


Nəticələr

Biz miRNA-dan asılı deqradasiyaya həssas bir transkript yaratmaqla başladıq. Biz mir6.1 onurğasına əsaslanan süni miRNT yaratdıq (Chen et al., 2007) Drosophila genomu, E-RNAi (Horn & Boutros, 2010) və GESS (Yılmazel et al., 2014) proqramları və nükleotid BLAST ilə bələdçi ardıcıllığının axtarışı ilə müəyyən edilmişdir. Drosophila melanogaster genom (FB2016_04 buraxılışı). Süni miRNT 3′ UTR introna daxil edilmişdir mKate2 miRNT konstruksiyasının ifadəsini izləməyə imkan verən gen.Sona yönəldilmiş deqradasiya və ya tərcümə inhibəsindən daha çox miRNT-yə yönəldilmiş parçalanmaya üstünlük vermək üçün miRNA üçün üç mükəmməl tamamlayıcı hədəf yer (Ameres & Zamore, 2013) Atəşböcəyi lusiferazının 3′ UTR-inə daxil edilmişdir.FLuc) reportyor geni. Gözlənildiyi kimi, birgə ifadə FLuc reportyor və miRNA konstruksiyasının ifadəsi ilə müqayisədə FLuc protein səviyyəsinin böyük azalması ilə nəticələndi. FLuc reportyor konstruksiyası tək (100%-dən 5,3 ± 0,4%-ə qədər, Şəkil 1A).

MiRNA hədəflənmiş transkriptləri deqradasiyadan xilas edə biləcəyimizi müəyyən etmək üçün miRNA hədəf sahələrinə dərhal 5 ′ və kodlaşdırma ardıcıllığının aşağı axınında 139 əsasdan ibarət poli(A) traktını yerləşdirdik. FLuc. Biz əsaslandırdıq ki, reportyor transkriptlərinin miRNT-nin idarə etdiyi endonükleolitik parçalanmasından sonra kəsilmiş transkriptin yeni yaradılmış 3′ ucunda yerləşən daxili poli(A) traktı 3′-dən 5′-ə qədər eksonükleolitik deqradasiyadan daha çox 5′ ardıcıllığı qoruyacaq və tərcümə (Wilusz, Wormington & Peltz, 2001). Daxili poli(A) traktının içəriyə əlavə edilməsi FLuc müxbiri ilə müqayisədə FLuc ifadəsində təvazökar bir azalmaya səbəb oldu FLuc poli(A) traktı olmayan reportyor (100%-dən 89,9 ± 6,5%-ə qədər Şəkil 1A). Bununla belə, miRNA və FLuc Müxbir konstruksiyalarının ortaq ifadə edildiyini, gördük FLuc daxili poli(A) traktına (yəni, poly(A)+) malik reportyor FLuc ifadəsinin daha yüksək səviyyəsini dəstəklədi. FLuc daxili poli(A) traktına malik olmayan müxbir (yəni, poli(A)−): müvafiq olaraq 81,4 ± 4,0% və 5,3 ± 0,4% (Şəkil 1A).

Reportyor transkriptlərinin süni miRNT tərəfindən parçalandığını yoxlamaq üçün miRNA və poli(A)+ və ya poli(A)− reportyoru ifadə edən hüceyrələrdən RT-PCR analizi apardıq. 1-ci zəncir cDNA 3′ mövqeyindən miRNA hədəf sahələrinə tərs transkripsiya edilmişdir. Daxildə daha 5′ bölgə FLuc kodlaşdırma bölgəsi daha sonra PCR istifadə edərək gücləndirildi (Şəkil 1B). Belə bir təcrübədə PCR məhsulunun miqdarı kəsilməmiş səviyyələrə mütənasib olmalıdır FLuc transkript. Şəkil 1C-də göstərildiyi kimi, miRNT-nin əlavə edilməsi onun miqdarının 65% azalmasına səbəb olmuşdur. FLuc Transkriptdə daxili poli(A) traktının olub-olmamasından asılı olmayaraq, RT-PCR məhsulu, miRNA-sız nəzarətlə müqayisədə. miRNT-nin olması da poliadenillənmiş mRNA-ların ümumi səviyyələrinə təsir etməmişdir Drosophila S2 hüceyrələri RT-PCR ilə təyin olunmamış transkriptdən ölçüldü β qlükuronidaza (βGlu) gen (şəkil 1C). Birlikdə, bu nəticələr daxili poli(A) traktının daha 3′ yerdə parçalanmış transkriptləri sabitləşdirdiyi modelə uyğundur. Bu modeli nəzərə alaraq, tərcümənin bloklandığı, lakin miRNA-dan asılı parçalanma ilə azad edilə bilən bir transkript yaratmağa başladıq.

Bir mRNT-nin 5′ -UTR-də ikinci dərəcəli quruluş bir çox kontekstdə mRNT tərcüməsini sıxışdıra bilər (Kozak, 2005 Lammich et al., 2011). Biz 5′ UTR-də 3′ UTR-də parçalanma ilə aradan qaldırıla və ya əmələ gəlməsinin qarşısı alına bilən ikinci dərəcəli struktur qurmağa çalışdıq. Bunu etmək üçün, iki fərqli RNT molekulu arasında qarşılıqlı təsir nəticəsində sabit bir RNT strukturunun yaradıldığı təbii sistemlərə müraciət etdik. CopT və CopA yaxşı xarakterizə edilən bakteriya RNT molekullarıdır. Hər biri bir saç sancağı meydana gətirir və 90-dan çox nükleotidi tamamlayır. Bakteriyalarda CopA bağlanır trans lider bölgəsində yerləşən CopT-yə repA, tərcüməsinə mane olan bir quruluş meydana gətirir repA mRNA (Blomberg və digərləri, 1994 Blomberg, Nordstrom və Wagner, 1992). Cütləşmə keçici döngə-döngü qarşılıqlı əlaqəsi (öpüşmə kompleksi) ilə başlayır və sabit bir quruluşa, dörd sarmal qovşağına keçir (Kolb et al., 2000a Kolb et al., 2000b). Bu quruluş ribosomların ribosomların bağlanma yerlərinə girişini bloklayır repA mRNA (Blomberg et al., 1994). Biz fərz etdik ki, əgər CopT və CopA eyni transkriptin müvafiq olaraq 5′ və 3′ UTR-də yerləşsəydilər, onların assosiasiyası nəticəsində yaranan ikinci dərəcəli strukturun formalaşması aradakı kodlaşdırma ardıcıllığının tərcüməsinə mane olar.

Bu ideyanı araşdırmaq üçün biz CopT və ya CopA-nı tək və ya birlikdə təqdim etdik FLuc transkriptlər. Tək CopT-nin 5′ UTR-ə daxil edilməsi FLuc mRNT FLuc ifadəsinin azalmasına səbəb oldu (100%-dən 65,3 ± 6,7%-ə qədər Şəkil 2A-2B: 2), eyni zamanda transkriptin 3′ UTR-də tək CopA yerləşdirilməsi FLuc ifadəsinə əhəmiyyətli təsir göstərmədi (107,7 ± 26,1%) Şəkillər 2A–2B: 3). Bu nəticələr gözlənilir, çünki başlanğıc kodonun yuxarı hissəsində yerləşdirilmiş, lakin 3′ UTR-də olmayan güclü saç tıxacının strukturu tez-tez tərcümənin başlanmasına mane olur (Kozak, 2005). Bununla belə, önəmlisi odur ki, CopT və CopA eyni 5′ və 3′ UTR-lərə daxil edildikdə FLuc ifadəsinin daha güclü azalması müşahidə edilmişdir. FLuc müvafiq olaraq transkript (100%-dən 2,8 ± 0,7%-ə qədər Şəkil 2A–2B: 4). Bu susdurma, çox güman ki, tərcümənin maneə törədilməsi ilə bağlıdır, çünki bir, hər ikisi və ya heç bir saç tıxacının strukturu mövcud olduqda transkript səviyyələri oxşar idi (Şəkil 2C).

Bu müşahidələrlə biz soruşduq ki, miRNT-nin CopA və CopT arasındakı qarşılıqlı əlaqəni pozaraq və ya qarşısını almaqla mRNT tərcüməsinin repressiyasını dayandıra və ya qarşısını ala bilər. Biz bir transkript yaratdıq, burada süni miRNT üçün əvvəllər sınaqdan keçirilmiş üç hədəf sahəsi (Şəkil 1) CopA-dan yuxarıya yerləşdirildi. FLuc hər iki hairpin strukturları ilə transkript (Şəkil 2A: 4). Bundan əlavə, kodlaşdırma ardıcıllığının 3′ ucu arasında bir poli(A) traktı daxil edilmişdir. FLuc və miRNA hədəf saytları. Bu tənzimləmə, kəsilməsini təmin edir FLuc transkript 3′ ucunda poli(A) traktına malikdir. Bu konstruksiya bundan sonra miRNA müxbiri adlandırılacaq (Şəkil 3A). MiRNA müxbirinin effektivliyini qiymətləndirmək üçün biz ondan FLuc ifadəsini 3′ UTR-də CopA-nın bərabər uzunluqlu təsadüfi ardıcıllıqla əvəz edildiyi nəzarət transkriptindəki ifadə ilə müqayisə etdik (müxbir CopA−). Reportyor CopA− CopA-CopT vasitəçiliyi ilə repressiya olmadıqda FLuc ifadəsinin ölçülməsini təmin edir və beləliklə miRNA ilə və ya olmadan reportyorun performansı üçün istinad kimi xidmət edir.

nin tərcüməsini tapdıq FLuc miRNA reportyoru müxbir CopA− ilə müqayisədə güclü repressiyaya məruz qalmışdır (100%-dən 4,4 ± 0,5%-ə qədər, Şəkil 3B). Bu repressiya miRNT-nin birgə ifadəsi ilə kəskin şəkildə azaldı (4,4 ± 0,5%-dən 41,9 ± 4,2%-ə qədər). MiRNT-nin CopA- müxbiri ilə birgə ifadəsi əks effekt verdi: FLuc tərcüməsi bir qədər azaldı (100%-dən 84,0 ± 3,5%-ə qədər Şəkil 3B). Ən əsası, RT-PCR təhlili göstərir ki, miRNA-nın mövcudluğu, miRNA nəzarəti olmayan (100%-dən 43%-ə qədər, Şəkil 3C) müqayisədə parçalanmamış miRNA reportyor transkriptinin səviyyələrində əhəmiyyətli azalmaya səbəb olsa da, FLuc miRNA-ifadə edən hüceyrələrdən miRNA-sız nəzarət üzərindən 10 dəfə artırıldı (Şəkil 3B). Bu müşahidələr birlikdə iddia edir ki, reportyorun transkriptinin miRNA-nın idarəolunması ilə spesifik hədəf yerlərində parçalanması tərcümə repressiyasını tərsinə çevirir və ya qarşısını alır, beləliklə, müsbət tərcümə oxunuşu ilə miRNA parçalanması müxbiri ilə nəticələnir.


RNT (ribonuklein turşusu): strukturu və növləri (diaqramlarla)

RNT-nin ilkin quruluşu DNT ilə eynidir. O, həmçinin 5 ′-3′ şəkər fosfat əlaqələri olan bir polinükleotid zənciridir. Lakin şəkər ribozadır və ümumiyyətlə tək zəncirli molekul kimi mövcuddur. Bu səbəbdən, tamamlayıcı əsaslar arasında bir-bir nisbəti yoxdur. Purinlərin miqdarı pirimidinlərin miqdarına bərabər deyil.

RNT-dəki dörd əsas bazadan biri timin əvəzinə urasildir (U). RNT-nin biofiziki xassələri ikinci dərəcəli quruluşu daha az göstərir. Bununla belə, əsasların ardıcıllığını eyni zəncirdə tamamlayıcı ardıcıllıqla izlədikdə, polinükleotid saç sancısı kimi tanınan antiparalel dupleks quruluş yaratmaq üçün öz üzərinə qatlana bilər.

Onun gövdəsi, əsas qoşalaşmış qoşa spiral nahiyəsi və bir ucunda qoşalaşmamış əsasları olan ilgək var (şək. 3.55). Bu bölgələrdə G də U ilə cütləşə bilər, lakin G-C cütü qədər güclü deyil.

Hüceyrələr üç növ RNT-xəbərçi RNT (mRNA), ribosomal RNT (rRNA) və transfer RNT (tRNT) ehtiva edir. Messenger RNT protein sintezi üçün şablon kimi xidmət edir. Bu molekulların çox heterojen sinfidir və çox qeyri-sabitdir. Normal hüceyrənin ümumi RNT-nin 2 – 5%-ni təşkil edir. İlk dəfə Hershey (1956) tərəfindən aşkar edilmişdir. Messenger RNT-nin adı və konsepsiyası ilk dəfə F.Jacob və J.Monod (1961) tərəfindən verilmişdir.

Ərinmiş DNT bəzi xüsusi m-RNT ilə yavaş-yavaş soyuduqda, DNT-RNT hibrid molekulları əmələ gəlir ki, bu da m-RNT-nin DNT dupleksinin şablon zəncirindən əmələ gəldiyini göstərir.

Ölçü baxımından çox heterojendir, çünki genlər və ya gen qrupları uzunluğa görə dəyişir. Prokariotlarda mRNT molekulunun tərcüməsi çox vaxt onun transkripsiyasının tamamlanmasından əvvəl başlayır, çünki mRNT-lər həm transkripsiya edilir, həm də 5-3-ə çevrilir və hər iki proses nüvə membranı ilə ayrılmır.

(i) mRNA-ların strukturu :

Messenger RNT-lər zülalların amin turşusu ardıcıllığını kodlayır. Fərdin həyatının müəyyən bir mərhələsində müəyyən bir hüceyrədə fərqli mRNA növlərinin sayı və növləri (transkriptomik = mRNT profili) həmin mərhələdə hüceyrədə mövcud olan müxtəlif zülalların (proteomika = zülal profili) sayı ilə müqayisə edilə bilər. Messenger RNT-lər ümumi hüceyrə RNT-nin 1%-dən 2%-ə qədərini təşkil edir.

Bütün mRNA-lar müəyyən xüsusiyyətlərə malikdir:

(a) Onlar xüsusi bir polipeptidi kodlayan davamlı nukleotidlər ardıcıllığını ehtiva edirlər

(b) Onlar sitoplazmada olur və

(c) Onlar ya ribosomlara bağlıdırlar, ya da tərcümə olunmaq üçün belə bir birləşməyə qadirdirlər.

(d) Polipeptidlər üçün müşahidə olunan molekulyar kütlələrin diapazonuna uyğun olaraq, mRNA-ların uzunluğu bir neçə yüz nukleotiddən bir neçə min nukleotidə qədər dəyişir.

(e) mRNA-lar ümumiyyətlə rRNA və tRNA-dan daha labildir, baxmayaraq ki, bəzi mRNA-lar üçün dövriyyə sürəti olduqca yavaşdır.

Əksər mRNA-larda əhəmiyyətli kodlaşdırılmayan seqment, yəni amin turşularının yığılmasına rəhbərlik etməyən bir hissə var. Məsələn, hər bir globin mRNT-nin təxminən 25 faizi kodlaşdırılmayan, tərcümə olunmamış bölgələrdən (UTR) ibarətdir. Kodlaşdırılmayan hissələr mesajçı RNT-nin həm 5, həm də 3-cü ucunda yerləşir və mühüm tənzimləyici rolları olan ardıcıllıqları ehtiva edir.

Kodlaşdırılmayan nukleotidlərə əlavə olaraq, eukaryotik mRNA-ların 5 və 3 terminallarında prokaryotik mesajlarda olmayan xüsusi modifikasiyaları var. Eukaryotik mRNT-lərin 5-ci ucunda metilləşdirilmiş quanosine “cap, ”- 3′-də poli(A) quyruğu əmələ gətirən 50-250 adenozin qalığından ibarət bir sıra var.

Başlama və bitirmə kodonları arasındakı ardıcıllıq açıq oxu çərçivəsini (ORF) təşkil edir. Bu uzunluqda çox dəyişkən olan 5′ və 3′ tərcümə edilməmiş bölgələrlə əhatə olunmuşdur. Nəticə etibarilə, mRNT-nin uzunluğu həmişə onun kodladığı amin turşusu ardıcıllığının uzunluğu ilə uyğun gəlmir.

5′ və 3′ UTR-lərin dəqiq funksiyası bir çox mRNT-lər üçün hələ də zəif başa düşülür, lakin çox vaxt bu bölgələrdə ikinci dərəcəli strukturlar yarada bilən və mRNT-nin daşınmasını, tərcüməsini və sabitliyini tənzimləyən zülallarla qarşılıqlı əlaqədə olan RNT ardıcıllığı olur.

3′ poliadenilat quyruğu DNT-də kodlaşdırılmır, lakin mRNT nüvədən sitoplazmaya ixrac edilməzdən əvvəl transkripsiyadan sonra əlavə olunur. Endonükleaza və poli(A) polimerazı ehtiva edən ferment kompleksi transkriptin 3-cü ucuna yaxın bir siqnal ardıcıllığını (5′ – AAUAAA – 3′) tanıyır, siqnaldan aşağı axındakı pre-mRNT-ni ayırır. , və 3’sonuna 20-250 adenozin qalığı əlavə edir.

Plastid və mitoxondrial mRNT-lərin quruluşu sitoplazmatik mRNT-dən fərqlənir. Orqanellar mRNA-lar həm 5′ qapaq, həm də poli(A) quyruğu ilə üz-üzədir. Transkripsiyadan sonrakı RNT emalındakı fərqlər nəticəsində mitoxondrial mRNT-lər adətən 5 trifosfat qrupunu saxlayır, əksər plastid mRNA-ların 5 ucları isə monofosforilləşir.

Prokaryotik mRNA-lar kimi, əksər orqanella mRNA-ların 5- və 3-UTR-ləri tənzimləyici və sabitləşdirici funksiyaları olan kök-halqa quruluşunu yarada bilər. Bu RNT strukturları tez-tez zülallarla qarşılıqlı əlaqədə olur və mRNT-nin işlənməsi, tərcüməsi və deqradasiyasına təsir edən siqnallar kimi xidmət edir.

Eukaryotik hüceyrələr kiçik, sabit RNT-lərin əlavə siniflərini ehtiva edir. Stabil uridinlə zəngin RNT-lər kiçik nüvə ribonukleo-proteinlərinin (UsnRNP) komponentləridir və eukariotların kiçik nüvə RNT-lərinin (snRNA) əsas sinfini təşkil edir. Bu RNT-lər U1-dən başlayaraq nömrələnir. Bəzi snRNA-lar nukleoplazmada yüksək nüsxədə olur və əsas snRNA kimi tanınır.

Kiçik snRNA-ların əksəriyyəti nüvədə yerləşir və buna görə də snoRNA-lar (kiçik nüvə RNTləri) təyin olunur. SnRNP-lərdəki snRNA-ların əksəriyyəti nüvədəki prekursor mRNT-lərdən kodlaşdırılmayan bölgələrin birləşdirilməsində iştirak edir.

Digər snRNA-lar, poli (A) quyruğu olmayan histon pre-mRNT-nin 3'terminalının emalında iştirak edirlər. SnoRNA-ların əksəriyyəti rRNT prekursorlarının emalında iştirak edir.

Eukariotlarda transkripsiya və tərcümə eyni vaxtda olmur, çünki transkripsiya nüvə prosesidir və tərcümə sitoplazmatik prosesdir. Yeni transkripsiya edilmiş mRNA-lar nüvədən sitoplazmaya daşınan əsas gen transkriptləri adlanır.

Eukariotların funksional mRNA-ları bir neçə növ emal yolu ilə əsas gen transkriptlərindən aşağıdakı kimi alınır:

(a) Pre-mRNT və ya böyük mRNT prekursorunun kiçik fərdi mRNT molekullarına parçalanması.

(b) Molekulun 5-ci ucuna 7-metil quanozin qruplarının bağlanması və ya əlavə edilməsi.

(c) Poli (A) quyruğu və ya mRNT molekulunun 3-8242 ucuna 200 nukleotid uzunluğunda adenilat nukleotid ardıcıllığının əlavə edilməsi.

(d) Xüsusi zülallarla komplekslərin əmələ gəlməsi.

5′ sonundan başlanğıc kodonuna qədər olan əsas ardıcıllığa lider ardıcıllığı, aralarındakı kodlaşdırılmayan ardıcıllıqlara isə intronlar deyilir. Zülala çevrilən kodlaşdırma ardıcıllığına ekzonlar deyilir. İlkin transkriptin işlənməsi intron ardıcıllığının çıxarılmasını nəzərdə tutur.

Fərdi gen transkriptlərinin transkripsiyadan sonrakı modifikasiyaları yuxarıda qeyd olunan 4 növ emaldan bəzi və ya hamısından keçə bilər.

Eukaryotik hüceyrələrin nüvələrində sintez edilən qeyri-ribosomal RNT-lərin əksəriyyəti çox böyükdür və ölçüləri çox dəyişkəndir və heterogen nüvə RNT(hnRNA) və ya pre-mRNT adlanır.

Transkripsiyadan dərhal sonra bu nəhəng molekulların nüvə daxilində sürətli işlənməsi nüvədən sitoplazmaya daşınan mRNT molekullarının əmələ gəlməsi ilə nəticələnir. Emal zamanı ilkin transkriptlərdən intronlar ayrılır.

Aşağıdakı kimi üç fərqli bağlama mexanizmləri var:

(a) tRNT prekursorunun endonükleaza və liqaz fermenti ilə birləşdirilməsi.

(b) Tetrahymena RNT prekursorunun avtosplikasiyası unikal reaksiya mexanizmidir və RNT molekulunun özü tərəfindən kataliz edilir (öz-özünə yapışma). Bu katalizator RNT molekullarına ribozimlər deyilir. Bu cür birləşmə mexanizmində heç bir protein fermenti iştirak etmir.

Bu avtokatalitik aktivliyin bir neçə aşağı eukariotun rRNT prekursorlarında və bir çox müxtəlif növlərin mitoxondri və xloroplastlarında çoxlu sayda mRNT, tRNT və mRNT prekursorlarında baş verdiyi göstərilmişdir.

(c) mRNT-dən əvvəlki transkriptlərin intronları splisiosomlar adlanan ribonukleoprotein kompleksləri tərəfindən kataliz olunan iki mərhələli reaksiyalarda bölünür.

Bitki nüvə pre-mRNA-larının intronları dəyişir, AU ilə zəngindir və onların birləşmə qovşaqlarında qorunmuş ardıcıllığa malikdir. Dikotlarda bu intronlar 70% AU ehtiva edir, monokotlarda isə 60%. Hər bir ekson-intron qovşağını əhatə edən nukleotid ardıcıllığı yüksək dərəcədə qorunur.

Bitkilərin demək olar ki, bütün nüvə mRNT intronlarında, 5′ birləşmə yerində (donor yer) və 3’splice sahəsində (qəbuledici yer) sərhəd ardıcıllığı 5′ GU və AG 3′-dən ibarətdir. Bu xüsusiyyət GU-AG qaydası kimi tanınır. Əlavə struktur elementi, filial sahəsi, adətən, 3’splice yerindən 20-40 nukleotid yuxarıda yerləşir.

İntronun kəsilməsi zamanı intronun 5’sonu budaq yerində adenin qalığı ilə birləşərək lariat əmələ gətirir. Pre-mRNT intron birləşməsi böyük ribonukleoprotein kompleksində (splisosomda) baş verir ki, bu kompleksdə snRNA-lar U1, U2, U4/U6 kompleksi və kiçik ribonuklear zülallarla (snRNP) və qeyri-snRNP zülal faktorları ilə əlaqəli qalan 115 var. Şəkil 3.58).

Aşağıdakı cədvəldə dörd əsas intron növü verilmişdir:

Öz-özünə yapışma mexanizmi intronlar qrupundan asılı olaraq dəyişir. Qrup-l intronlarının birləşdirilməsi guanozin molekulu və ya 5'fosforilləşdirilmiş törəmə intron ardıcıllığına bağlandıqda başlanır. Bağlanmış guanosinin 3'OH qrupu 5'splice yerindəki fosfat qrupuna hücum edərək, bu yerdəki fosfodiester bağını parçalayaraq ekson-1-i buraxır.

Ekson-1-in sonundakı 3′ OH 3’splice yerində fosfatla reaksiya verir, iki eksonu bağlayır və xətti intronu buraxır (şək. 3.59). II qrup intronların öz-özünə yapışma mexanizmi nüvə pre-mRNT-lərinin birləşdirilməsinə bənzəyir, lakin spliceosomun əmələ gəlməsini nəzərdə tutmur. Bu birləşmə reaksiyaları adətən molekuldaxili olur və bir transkriptdən ekzonları birləşdirirlər və cis-splicing adlanır.

Bunun əksinə olaraq, bitkilərin müəyyən qrup II intronları iki və ya daha çox RNT molekulunu əhatə edən yeni bir trans-splicing mexanizmi ilə çıxarılır. Bitki xloroplastlarında və mitoxondrilərdə olur. Yalnız RNT polimeraza III tərəfindən transkripsiya edilən kiçik, sabit RNT-lərin müəyyən növləri geniş emaldan keçmir.

RNT növləri:

(i) Ribosomal RNT :

Hüceyrə RNT-nin əsas hissəsi ribosom RNT-dir. Ribosomların əsas komponentidir, lakin zülal sintezində onun müəyyən rolu aydın deyil. Bitkilər, yosunlar və fotosintetik protistlərin hər birində üç sinif ribosom var: sitoplazmatik, plastid və mitoxondrial. E. coli ribosomlarında üç növ rRNT tapılır. Onlar çöküntü davranışına görə 5S, 16S və 23S adlanırlar.

Hər ribosomda bu rRNT növlərinin hər birinin bir molekulu var. Eukaryotik ribosomlar isə 5S, 7S, 18S və 28S rRNT növlərinin hər birində bir molekuldan ibarətdir. Ribosomal RNT hüceyrədə 3 növ RNT arasında ən çox olanıdır.

Ribosomal RNT tək zəncirlidir, lakin o, həm də tamamlayıcı bölgələr və saç sancağı ilgəkləri arasında qoşa zəncirlərin əmələ gəlməsi səbəbindən yüksək dərəcədə ikinci dərəcəli modifikasiyalar göstərir. Hər bir döngə dupleks gövdələri ehtiva edir. Döngələr və gövdələr zülal sintezi üçün müxtəlif ribosomal zülallar və digər fermentlər üçün xüsusi vektor bağlayıcı yerləri təmin edir.

E. coli-dən təcrid olunmuş 16S rRNT-nin 3-cü ucu 30S ribosomunda mRNT-nin bağlanma yeri kimi xidmət edən Parıltı və Dalqarno ardıcıllığına malikdir. Bu ardıcıllıq mRNT-nin başlanğıc sonunu tanımağa kömək edir. 5S rRNA bütün tRNA-ların TΨC ardıcıllığını tamamlayan bir ardıcıllığa malikdir. Beləliklə, 5S RNT tRNT-nin ribosomlara bağlanması üçün vacibdir.

Pre-rRNA-ların emalına nukleolitik parçalanma və metilləşmə daxildir. Bəzi eukaryotik rRNT transkriptləri intronun özü tərəfindən birləşir (öz-özünə birləşən, ribozim).

17S, 5.8S və 25S rRNA molekullarını kodlayan nüvə rRNA gen klasterindəki transkripsiya vahidləri RNT polimeraza I tərəfindən tək bir uzun prekursor molekuluna transkripsiya edilir, daha sonra bir sıra parçalanma və metilləşmə mərhələlərindən keçərək 17S51S əldə edir. , və 25S rRNT molekulları.

5S rRNT-nin müvafiq nüvə genlərindən transkripsiyası müstəqildir və RNT polimeraza III tərəfindən katalizlənir. Heç bir emal tələb etmir.

17S, 5.8S və 25S rRNA-lar bir neçə RNaz tərəfindən katalizləşdirilmiş reaksiyaların işlənməsi ilə ümumi 45S rRNA prekursor molekulundan istehsal olunur. Emal zamanı 25S və 5.8S rRNA-ları hidrogen bağına çevrilir və emal başa çatdıqdan sonra qoşalaşmış qalır (şək. 3.60).

Dörd plastid rRNA molekulu polikistronik transkripsiya vahidi kimi kodlaşdırılıb ki, bura həm də 16S və 23S rRNT-ni ayıran spacer bölgəsində tRNA ala və tRNA lle-ni kodlayan iki tRNT genini ehtiva edir, hər birində uzun bir intron var. Mürəkkəb bir emal yolu ilə prekursor RNT 16S, 23S, 4.5S və 5S rRNA-lara və tRNT prekursorlarına parçalanır.

Parçalanmış tRNT prekursorları daha sonra funksional tRNT lle və tRNA ala molekullarına işlənir. tRNA-lar nüvə genlərinin klasterlərindən RNT polimeraza III tərəfindən transkripsiya edilir, lakin 5S rRNA-dan fərqli olaraq onların işlənməsi lazımdır (Şəkil 3.61).

(ii) Transfer RNT :

Transfer RNT ilk dəfə 4S-də çökən RNT-nin bir hissəsi kimi müəyyən edilmişdir. tRNT-lərin uzunluğu 75-85 nukleotiddir. Onlar həmçinin həll olunan RNT və ya sitoplazmik RNT kimi tanınırlar. Transfer RNT ikiqat funksiyaları yerinə yetirən bir adapter molekuldur. Həm kodonu, həm də amin turşusunu tanıyır.

tRNT-nin nukleotid ardıcıllığı yonca yarpağı formasını verir. Bu quruluşda bir-birini tamamlayan qoşalaşmış əsaslar tək telli ilmələr üçün gövdələr əmələ gətirir. Kök və döngə strukturları tRNT-nin qolları kimi tanınır.

tRNT molekulunun əsas ardıcıllığı ilk dəfə 1965-ci ildə Robert Holley tərəfindən müəyyən edilmişdir. Adi A, G, C və U istisna olmaqla, onların tərkibində psevduridin (Ψ), dihidroridin (H) kimi müxtəlif qeyri-adi nukleozidlər var.2U), ribotimidin (rT), inozin (I), adenozin və quanosinin mono- və dimetil törəmələri və onların tiollaşdırılmış törəmələri.

Bu dəyişikliklər yalnız poliribonukleotid zəncirinə daxil edildikdən sonra dörd əsasdan birində baş verir. tRNT molekulunda dörd döngə və dörd əsas qol var. Qollar strukturlarına və funksiyalarına görə adlanır.

Həmişə qoşalaşmamış -C-C- ilə bitən əsas qoşalaşmış gövdən ibarət qəbuledici qolu Sərbəst 3''OH qrupu aminoasilatlanmış və 5'' ucu ümumiyyətlə G və ya C ilə bitən ardıcıllıq.

Digər qollar qoşalaşmış gövdələrdən və qoşalaşmamış ilmələrdən ibarətdir. D-qolu dihidrourasil əsasının mövcudluğuna görə adlandırılmışdır. Antikodon qolu həmişə döngənin mərkəzində antikodon üçlüyü ehtiva edir. TΨC qolu bu üçlü ardıcıllığın mövcudluğuna görə adlandırılmışdır.

tRNT-nin dəyişkən xüsusiyyəti, TΨC və antikodon qolları arasında yerləşən əlavə qoldur və təbiətinə görə tRNT iki növə təsnif edilir: I sinif tRNA (kiçik əlavə qolu olan) və sinif. -II tRNT-lər (böyük əlavə qolu olan). Yonca yarpağı ətrafında saat əqrəbi istiqamətində həmişə qəbuledici sapda 7 əsas cüt, TΨC qolunda 5, antikod qolunda 5 və adətən D qolunda üç əsas cüt olur.

Nüvə tRNT intronlarının mövqeyi qorunur, lakin onların ardıcıllığı qorunmur. Endonükleaza pre-tRNT-ni intronun hər iki ucunda parçalayır və nəticədə 5'tRNT seqmentinin 3'üncü hissəsində siklik 2', 3'fosfat qrupu və sərbəst 5' əmələ gəlir. -3′ tRNT seqmentinin hidroksil qrupu.

Siklik fosfat qrupu 2'fosfat qrupu yaratmaq üçün parçalanır. Sərbəst 5' hidroksil qrupu daha sonra fosforlaşdırılır və hər iki yarı RNT liqazı ilə birləşdirilir. 2'fosfataz 2'fosfat qrupunu xaric edərək, yetkin birləşdirilmiş tRNT əldə edir.


Giriş seçimləri

1 il ərzində jurnala tam giriş əldə edin

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.
ƏDV daha sonra ödəniş zamanı əlavə olunacaq.
Vergi hesablanması yoxlama zamanı yekunlaşacaq.

ReadCube-da vaxt məhdud və ya tam məqaləyə giriş əldə edin.

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.


Müzakirə

Bu tədqiqat diffuziya yolu ilə hüceyrələrə daxil olan və xaric olan aşağı molekulyar ağırlıqlı molekullar tərəfindən induksiya edilən ifadə sistemlərində rekombinant mRNT çürüməsini izləmək üçün istifadə edilə bilən qRT-PCR əsaslı yanaşma təqdim etdi. Rifampisin antibiotiki [50] ilə bakterial RNT polimerazının qlobal inhibəsini nəzərdə tutan mRNT sabitliyinə daxil olmaq üçün əksər digər üsullardan fərqli olaraq, bu olduqca sadə üsul müalicə olunan hüceyrələrə minimal təsir göstərir. Sonuncu yanaşma naməlum mənfi yan təsirlərə səbəb ola bilər və əlavə olaraq rifampisinə həssas olmayan promotorlar təsvir edilmişdir [48].

-nin təhlili bla əlaqəli 5′-UTRs birbaşa göstərdi ki, transkript səviyyəsinin LV-2 və LII-11 variantları tərəfindən stimullaşdırılması transkripsiyanın gücləndirilmiş sürətinə əsaslanır və daha sabit mRNT deyil (Şəkil 1). Həmçinin LII-11 variantı ilə sənədləşdirildiyi kimi, daha səmərəli tərcümə digər genlər üçün bildirildiyi kimi heç də həmişə transkript deqradasiyasına qarşı daha yaxşı qorunma ilə nəticələnmir [37], [51]. Bununla belə, həmin hesabatlara uyğun olaraq, biz burada göstərdik ki, insan geninin 5-ci ucuna çərçivədə birləşdirilən translokasiya siqnal ardıcıllığı onun mRNT sabitliyini stimullaşdıra bilər (Şəkil 4). Bu gözlənilməz fərqlər, ehtimal ki, transkripsiya, mRNT-nin parçalanması və tərcümə arasındakı əlaqələrin mürəkkəbliyinin nəticəsidir. 5 siqnal ardıcıllığının əlavə edilməsi mRNA qatlanmasına təsir göstərə bilər və sonra RNase E-vasitəçiliyi ilə mRNA çürüməsinə təsir edə bilər və ya təsir etməyə bilər. Alternativ olaraq, transkript miqdarında müşahidə olunan artım və 5-füzyon halında mRNT-nin yarımparçalanma müddətinin uzadılması, daha səmərəli tərcümənin başlanması səbəbindən ribosomların tərcüməsi ilə transkriptlərin mümkün qorunmasını göstərə bilər. Əlavə tədqiqatlar, məsələn, tərcümə edilmiş mRNT-lərdə [52] ribosom sıxlığının kəmiyyət təhlili üçün yeni bir texnikanın istifadəsi ilə, potensial olaraq daha ətraflı məlumat əldə etmək üçün istifadə edilə bilər, lakin ümumiyyətlə, əsas mexanizmləri açmaq çox mürəkkəb olduğuna inanırıq. mövcud texnikalar vasitəsilə.

Eynilə bla əlaqəli 5′-UTR variantları, sinonim mutasiyaların tətbiqi bla 5 kodlaşdırma ardıcıllığı mRNT sabitliyinə açıq şəkildə təsir etmədən yığılmış transkript səviyyəsinin artmasına səbəb oldu (Şəkil 3). Bunun səbəbləri LV-2 UTR mutasiyalarının [14] təsirinin altında yatan səbəblərlə oxşar ola bilər, lakin maraqlıdır ki, bir genin kodlaşdırma ardıcıllığı transkripsiyanın özünə belə təsir göstərə bilər. 5 kodlaşdırma bölgəsi mRNA ikincil strukturları və kodon istifadəsi vasitəsilə tərcümənin idarə edilməsi ilə dəfələrlə əlaqələndirilmiş olsa da [53], [54] onun transkripsiyaya necə təsir göstərə biləcəyi haqqında çox az şey məlumdur. Göstərilmişdir ki, bitişik 5'UTR DNT bölgəsi 'promotor elementinə (TATAAT) bənzəyən ardıcıllıqlar vasitəsilə transkripsiya prosesinə təsir göstərə bilər ki, bu da 'x003c3 70-dən asılı transkripsiya dayandırılmasına səbəb ola bilər [55], [56]. ]. Triptofanaz operonu halında (tna), TnaC lider peptidinin və TnaA triptofanazın kodlaşdırma bölgələrini ayıran 220-nükleotidlik uzun boşluq bölgəsində transkripsiya fasiləsi yerləri təsvir edilmişdir və transkripsiya ilə tərcümənin birləşməsində iştirak etmişdir [57]. Bir ehtimal, buna görə də daxilində sinonim mutasiyaların olmasıdır bla kodlaşdırma bölgəsi vəhşi tipdə fasilə saytlarına təsir göstərir bla Transkripsiya üçün stimullaşdırıcı bir şəkildə DNT ardıcıllığı.

mRNT sabitliyinin qiymətləndirilməsi üçün yeni metodologiyanın ümumi aktuallığını əsaslandırmaq üçün biz onun istifadəsini IPTG-induksiya edən promotorda da genişləndirdik. mRNT-lərin parçalanması (ompA-gm-csfgm-csf, Şəkil 5 )-dən yaradılmışdır Ptac promotor, metodologiyanın bu IPTG-induksiya olunan sistem üçün olduğu kimi eyni dərəcədə faydalı olduğunu təsdiqlədi m-toluat-induksiya olunan XylS/Pm sistemi. Bu metodun potensial məhdudiyyətlərindən biri o ola bilər ki, o, aşağı fon ifadəsi səviyyəsinə malik induksiya olunan promotorun istifadəsini tələb edir. Tədqiq olunan mRNT-nin hər hansı fon istehsalı çox güman ki, faktiki çürümə və müəyyən səviyyəli yeni transkript sintezinin qarışığına gətirib çıxaracaq ki, bu da nisbi çürümə sürətinin hesablanmasında səhvə səbəb olur.

İnduktorun yuyulması üsulu həm aşağı (məsələn, pIB11), həm də orta dərəcədə yüksək nüsxə nömrəsinə (məsələn, pGM29) malik plazmidlərlə sınaqdan keçirilmişdir. qRT-PCR-nin ümumiyyətlə yüksək spesifik və həssas bir texnika kimi qəbul edildiyini nəzərə alsaq, metodun çətinlik çəkmədən müxtəlif ifadə səviyyələrini həll edə biləcəyinə inanırıq. Bundan əlavə, transkript səviyyələrinin və müvafiq zülal miqdarının təyini ilə birlikdə istifadə edildikdə, induktorun yuyulması üsulu rekombinant genin ümumi ifadə səviyyəsinə təsir göstərə biləcək müxtəlif amilləri aydınlaşdırmaq üçün faydalı olmalıdır. Burada təsvir edilən konsepsiya, çox güman ki, molekulyar biologiya tədqiqatlarında geniş şəkildə istifadə olunan hər hansı hüceyrə tipində (hətta bəzi eukariotlarda) hər hansı bir gen üçün mRNT çürüməsini ölçmək üçün istifadə edilə bilər. Səbəb odur ki, diffuziv induktorlara əsaslanan sistemlər demək olar ki, universaldır. Maraqlanan gen nə olursa olsun, o, sadəcə öz UTR ilə PCR ilə gücləndirilə və sonra induksiya olunan promotorun aşağı axınına daxil edilə bilər. Bu, çox güman ki, genin lokallaşdırıldığı təbii mühitdən eyni transkript verəcəkdir.