Məlumat

Tənzimlənən promouter nədir? Və bunu necə tənzimləmək olar?

Tənzimlənən promouter nədir? Və bunu necə tənzimləmək olar?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən patent oxuyuram, onlar (S. cerevisae YNP5 gərginliyində):

yerli ERG9 promotorunu tənzimlənən MET3 promotoru ilə əvəz etməklə ERG9 genini aşağı tənzimləyin

Tənzimlənən promouter nədir və onu necə tənzimləmək olar? İfadəni aşağı salmaq üçün bulyona nəsə əlavə etmək lazımdırmı?

Mədəniyyət mühitində xüsusi bir şey görmürəm.


Tənzimlənən promotor o deməkdir ki, bu promotorun aşağı axınında genin ifadəsi ya induksiya edilə, ya da repressiya edilə bilər. Met3 belə tənzimlənən promouterlərə misaldır və mediaya metioninin əlavə edilməsi ilə tənzimlənir. Mayada Met3 geni metionin biosintetik yolunda bir ferment olan ATP sulfurilazanı kodlayır. Metionin əlavə edildikdə, Met3 promotoru tərəfindən idarə olunan gen repressiyaya məruz qalır, çünki onun ifadə səviyyəsi mediaya əlavə olunan metioninin konsentrasiyası ilə tərs korrelyasiya olunur (bu sənəddəki şəkil):


Tənzimlənən promouter nədir? Və bunu necə tənzimləmək olar? - Biologiya

Bakteriyalarda və arxeyalarda, əlaqəli funksiyaları olan struktur zülallar, məsələn, bir biokimyəvi yolda bir çox mərhələləri kataliz edən fermentləri kodlayan genlər, adətən, genom daxilində bir blokda kodlanır. operon və təkin nəzarəti altında birlikdə transkripsiya edilir təşviqatçı. Bu, polikistronik transkript təşkil edir (Şəkil 1). Promotor daha sonra bu struktur genlərin transkripsiyasının tənzimlənməsinə eyni vaxtda nəzarət edir, çünki ya hamısı eyni anda lazım olacaq, ya da heç birinə ehtiyac olmayacaq.

Şəkil 1. Prokariotlarda əlaqəli funksiyanın struktur genləri çox vaxt genomda birlikdə təşkil edilir və bir promotorun nəzarəti altında birlikdə transkripsiya edilir. Operonun tənzimləmə bölgəsinə həm promouter, həm də operator daxildir. Əgər repressor operatora bağlanarsa, o zaman struktur genlər transkripsiya edilməyəcəkdir. Alternativ olaraq, aktivatorlar transkripsiyanı gücləndirərək tənzimləyici bölgəyə bağlana bilər.

Fransız alimləri Fransua Yaqub (1920-2013) və Jak Monod Paster İnstitutunda ilk dəfə olaraq bakteriya genlərinin operonlara təşkilini göstərdilər. lak operon of E. coli. Bunu içərisində tapdılar E. colilaktozadan enerji mənbəyi kimi istifadə etmək üçün lazım olan fermentləri kodlayan bütün struktur genlər laktozada bir-birinin yanında yerləşir (və ya lak) operon tək bir promotorun nəzarəti altındadır lak təşviqatçı. Bu işə görə onlar 1965-ci ildə Fiziologiya və Tibb üzrə Nobel Mükafatını qazandılar.

Eukaryotik genlər operonlarda təşkil edilməsə də, prokaryotik operonlar ümumiyyətlə gen tənzimlənməsini öyrənmək üçün əla modellərdir. Eukariotlarda operonlara bənzər fəaliyyət göstərən bəzi gen qrupları var. Prinsiplərin çoxu eukaryotik sistemlərə tətbiq oluna bilər və xərçəng kimi patoloji dəyişikliklərlə nəticələnə bilən eukariotlarda gen ifadəsindəki dəyişiklikləri başa düşməyimizə kömək edə bilər.

Hər bir operona öz transkripsiyasına təsir edən DNT ardıcıllığı daxildir, bunlar tənzimləyici bölgə adlanan bölgədə yerləşir. Tənzimləyici bölgəyə promouter və promouteri əhatə edən bölgə daxildir transkripsiya amilləri, tənzimləyici genlər tərəfindən kodlanan zülallar bağlana bilir. Transkripsiya amillərinin bağlanmasına təsir göstərir RNT polimeraza promotora ötürür və onun proqressivləşməsinə struktur genləri transkripsiya etməyə imkan verir. A repressor adlanan tənzimləyici bölgə daxilində DNT ardıcıllığına bağlanaraq xarici stimula cavab olaraq genin transkripsiyasını boğan transkripsiya faktorudur. operator, promotorun RNT polimeraza bağlanma yeri ilə birinci struktur genin transkripsiya başlanğıc yeri arasında yerləşir. Repressorun bağlanması RNT polimerazanı struktur genlərin transkripsiyasından fiziki olaraq bloklayır. Əksinə, an aktivator RNT polimerazanın promotorla bağlanmasını asanlaşdırmaqla xarici stimula cavab olaraq genin transkripsiyasını artıran transkripsiya faktorudur. An induktor, tənzimləyici molekulun üçüncü növü, repressor və ya aktivator ilə qarşılıqlı təsir göstərərək transkripsiyanı aktivləşdirən və ya repressiya edən kiçik bir molekuldur.

Prokaryotlarda gen məhsulları kifayət qədər ardıcıl tələb olunan və buna görə də ifadəsi tənzimlənməyən operon nümunələri var. Belə operonlar var konstruktiv şəkildə ifadə olunur, yəni hüceyrəni zülal məhsullarının sabit aralıq səviyyələri ilə təmin etmək üçün onlar transkripsiya edilir və davamlı olaraq tərcümə edilir. Bu cür genlər DNT-nin replikasiyası, təmiri və ifadəsi də daxil olmaqla, hüceyrənin saxlanması üçün tələb olunan təsərrüfat funksiyalarında iştirak edən fermentləri, həmçinin əsas maddələr mübadiləsində iştirak edən fermentləri kodlayır. Bunun əksinə olaraq, yalnız lazım olduqda ifadə olunan və repressorlar, aktivatorlar və induktorlar tərəfindən tənzimlənən digər prokaryotik operonlar var.


13.1: GAL1 promouterinin tənzimlənməsi

  • Clare M. O&rsquoConnor tərəfindən töhfə
  • Boston Kollecində fəxri dosent (biologiya).

Mayada qlikoliz enerji istehsalında böyük rol oynayır və qlükoza onun üstünlük verdiyi karbon mənbəyidir. Digər karbon mənbələrinin metabolizmində iştirak edən genlər adətən qlükoza mövcud olduqda repressiya olunur. Qlükoza mövcud olmadıqda, maya qalaktoza kimi digər mövcud enerji mənbələrini metabolizə edən genləri aktivləşdirir. Qalaktoza qalaktozanı hüceyrələrə daşıyan və nəticədə onu qlikolizdə aralıq olan qlükoza-6-fosfata (G6P) çevirən fermentlər üçün bir neçə genin transkripsiyasını artırır. Qalaktozanın yaratdığı yoldakı ilk gen, GAL1, qalaktozanı qalaktoza-1-fosfata fosforlaşdıran qalaktokinazanı kodlayır. (Yoxlayın GAL1 yollar SGD-də əlaqələndirilir.) The GAL1 promotor həm pBG1805, həm də pYES2.1 plazmidlərində ORF sahəsinin yuxarı axınına daxil edilmişdir və buna görə də plazmidlə kodlanmış transkripsiyaya nəzarət edir. MET/MetlacZ transformasiya edilmiş hüceyrələrdə genlər.

Qarşı səhifədəki rəqəm gen ifadəsinin sadə icmalını təqdim edirGAL1 qlükoza, rafinoz və qalaktozun iştirakı ilə promotor. Promotorda DNT ardıcıllığı daxilində kodlanmış həm mənfi, həm də müsbət tənzimləyici saytlar var. Qlükoza varlığında repressor zülalları mənfi tənzimləyici yerlərə bağlanır və transkripsiyanı repressiya edir. Gal4p transkripsiya aktivatoru müsbət tənzimləyici saytlara bağlanır. Gal4p DNT-yə dimer kimi bağlanan transkripsiya faktorudur. (Bu fəslin əvvəlindəki rəqəm DNT ilə kompleksləşmiş Gal4p-nin DNT bağlama və dimerləşmə domenlərinin kristal quruluşunu göstərir.) Qlükozanın iştirakı ilə Gal4p qeyri-aktivdir, çünki o, repressor zülalı olan Gal80p ilə bağlıdır.

Qlükoza repressiyasını rafinoza kimi zəif bir karbon mənbəyində böyüyən hüceyrələri aradan qaldırmaq olar. Raffinoza qalaktoza, fruktoza və qlükozadan ibarət trisaxariddir. Raffinoza yüksək səviyyələri induksiya etməyə qadir deyil GAL1 qalaktoza tələb edən ifadə. Qalaktoza varlığında, ifadəsi GAL1 gen artır

qlükozanın mövcudluğunda müşahidə olunan səviyyədən 1000 dəfə yuxarı. Bu stimullaşdırma, ilk növbədə, Gal80p zülalının inhibitoru ilə bağlı olmayan Gal4p-nin fəaliyyəti ilə bağlıdır. Gal4p qalaktoza mübadiləsinin əsas tənzimləyicisi kimi çıxış edir. Aktivləşdirməyə əlavə olaraq GAL1 transkripsiya, Gal4p də promotorlara bağlanır GAL7GAL10 ilə bitişik olan genlər GAL1 maya xromosomunda gen 2. kimi GAL1, the GAL7GAL10 genlər qalaktoza mübadiləsində iştirak edən zülalları kodlayır.

tənzimlənməsi GAL1təşviqatçı. Qlükoza varlığında transkripsiya repressiya olunur, çünki repressor zülallar tənzimləyici yerlərə bağlanır.
DNT-də və Gal4p transkripsiya aktivatoruna. Qlükoza repressiyası rafinozun iştirakı ilə rahatlaşır, lakin Gal4p qeyri-aktiv qalır.
Gal4p, Gal80p zülalının çıxarılması səbəbindən qalaktozun iştirakı ilə transkripsiyanı aktivləşdirir.


T7 RNT polimeraza/promoter sistemindən istifadə edərək ifadə

Bu bölmə genlərin bakteriofaq T7 RNT polimerazının nəzarəti altında yerləşdirilməsi ilə ifadəsini təsvir edir. T7 RNT polimeraza çox aktiv fermentdir: o, RNT-ni E. coli RNT polimerazından bir neçə dəfə tez sintez edir və transkripsiyanı əslində daha az tez-tez dayandırır, onun transkripsiyası plazmidin ətrafından keçə bilir, nəticədə RNT ölçüsünə görə plazmid uzunluğundan bir neçə dəfə çox olur. . T7 RNT polimerazı həmçinin öz promotor ardıcıllığında başlama üçün yüksək selektivdir və E. coli RNT polimerazanı inhibə edən rifampisin kimi antibiotiklərə davamlıdır. Nəticə etibarilə, T7 RNT polimeraza istehsal edən hüceyrələrə rifampisinin əlavə edilməsi, T7 RNT polimeraza promotorunun (p(T7)) nəzarəti altında genlərin eksklüziv ifadəsi ilə nəticələnir. Əsas Protokolda iki plazmid eyni E. coli hüceyrəsində saxlanılır. Biri (ifadə vektoru) ifadə ediləcək genin yuxarı axınında p(T7) ehtiva edir. İkincisi istiliklə induksiya olunan E. coli promotorunun nəzarəti altında T7 RNT polimeraza genini ehtiva edir. İstilik induksiyasından sonra T7 RNT polimerazı istehsal olunur və ifadə vektorunda transkripsiyaya başlayır, nəticədə p(T7) nəzarəti altında gen(lər)in ifadəsi baş verir. Arzu edilərsə, gen məhsulları proseduru minimal mühitdə həyata keçirməklə, E. coli RNT polimerazını inhibə etmək üçün rifampisin əlavə etməklə və sonra zülalları [35S]metioninlə etiketləməklə unikal şəkildə etiketlənə bilər.


İstinadlar

Grey WM: Bitki böyüməsi və inkişafının hormonal tənzimlənməsi. PLoS Biol. 2004, 2: E311-10.1371/journal.pbio.0020311.

Lumba S, Tsuchiro T, Delmas F, Hezky J, Provart N, Lu QSM, McCourt P, Gazzarrini S: Embrion yarpaq şəxsiyyəti geni FUSCA3 Arabidopsisdə etilenlə tənzimlənən gen ifadəsini mənfi modulyasiya edərək vegetativ faza keçidlərini tənzimləyir. BMC Biol. 2012, 10: 8-10.1186/1741-7007-10-8.

Gazzarrini S, Tsuchiya Y, Lumba S, Okamoto M, McCourt P: Transkripsiya faktoru FUSCA3, gibberellin və absisik turşusu hormonları vasitəsilə Arabidopsisdə inkişaf vaxtını idarə edir. Dev Cell. 2004, 7: 373-385. 10.1016/j.devcel.2004.06.017.

Abeles FB, Morgan PW, Saltveit ME: Bitki Biologiyasında Etilen. 1992, San Dieqo: Akademik Mətbuat, 2

Chen YF, Etheridge N, Schaller GE: Etilen siqnal ötürülməsi. Ann Bot (London). 2005, 95: 901-915. 10.1093/aob/mci100.

Zhu Z, An F, Feng Y, Li P, Xue L, AM, Jiang Z, Kim JM, To TK, Li W, Zhang X, Yu Q, Dong Z, Chen WQ, Seki M, Zhou JM, Guo H: Etilenlə stabilləşdirilmiş transkripsiya faktorlarının (EIN3/EIL1) derepressiyası Arabidopsisdə jasmonat və etilen siqnal sinergiyasına vasitəçilik edir. Proc Natl Acad Sci ABŞ. 2011, 108: 12539-12544. 10.1073/pnas.1103959108.

Lingam S, Mohrbacher J, Brumbarova T, Potuschak T, Fink-Straube C, Blondet E, Genschik P, Bauer P: bHLH transkripsiya faktoru FIT və ETHYLENE INSESITIVE3/ETİLEN HESASLI 3-LIKE1 arasındakı qarşılıqlı əlaqə dəmirin molekulyar tənzimlənməsi arasında əlaqəni ortaya qoyur. və Arabidopsisdə etilen siqnalı. Bitki hüceyrəsi. 2011, 23: 1815-1829. 10.1105/tpc.111.084715.

Zhong S, Zhao M, Shi T, Shi H, An F, Zhao Q, Guo H: EIN3/EIL1 foto-oksidləşmənin qarşısını almaq və Arabidopsis fidanlarının yaşıllaşdırılmasını təşviq etmək üçün PIF1 ilə əməkdaşlıq edir. Proc Natl Acad Sci ABŞ. 2009, 106: 21431-21436. 10.1073/pnas.0907670106.

Chen MK, Hsu WH, Lee PF, Thiruvengadam M, Chen HI, Yang CH: MADS qutusu geni, FOREVER YOUNG FLOWER, Arabidopsisdə çiçək orqanının qocalmasına və abssizasiyasına nəzarət edən repressor kimi çıxış edir. Bitki J. 2011, 68: 168-185. 10.1111/j.1365-313X.2011.04677.x.

Chuck G, Hake S: İnkişaf keçidlərinin tənzimlənməsi. Curr Opin Bitki Biol. 2005, 8: 67-70. 10.1016/j.pbi.2004.11.002.


Promoter nədir

Promotor, transkripsiyanı başlatan genin əsas tənzimləyici elementlərindən biridir. O, genin yaxınlığında, kodon ardıcıllığının yuxarı hissəsində yerləşir. Promotorun ölçüsü 100-1000 bp ola bilər. Cavab elementləri adlanan xüsusi DNT ardıcıllığı həm RNT polimeraza, həm də RNT polimerazını cəlb edən transkripsiya faktorları üçün ilkin bağlanma yerlərini təmin edir. RNT polimeraza mRNT molekulunu sintez etmək üçün tamamlayıcı RNT nukleotidlərini polimerləşdirərək transkripsiyadan məsul olan fermentdir.

Şəkil 2: Promoter

Siqma faktoru ilə əlaqəli bakterial RNT polimeraza promotorla bağlana bilər. Sigma faktoru bakterial transkripsiya başlanğıc faktorudur. Eukariotlarda, RNT polimerazanı işə götürmək üçün təxminən 7 müxtəlif bazal transkripsiya faktoru promotorla bağlanmalıdır.


Promotor ardıcıllığı və onun gen ifadəsindəki gücü arasında əlaqə

Promoter gücü və ya fəaliyyəti gen mühəndisliyi və sintetik biologiyada vacibdir. Verilmiş bir RNT üçün müəyyən gücə malik olan konstitutiv promotor tez-tez digər RNT-lər üçün təkrar istifadə edilə bilər. Buna görə də bir promotorun gücü əsasən onun nukleotid ardıcıllığı ilə müəyyən edilir. Gen mühəndisliyi və sintetik biologiyada əsas çətinliklərdən biri müəyyən bir zülalın müəyyən bir səviyyədə ifadəsini necə idarə etməkdir. Bu məqsədə çatmaq üçün adətən istifadə edilən yollardan biri, transkripsiya sürətini tənzimləmək üçün istifadə edilə bilən uyğun gücə malik bir promotor seçməkdir, bu da protein ifadəsinin lazımi səviyyəsinə gətirib çıxarır. Bu məqsədlə indiyədək eksperimental olaraq bir çox promotor kitabxanalar yaradılmışdır. Bununla belə, bir promotorun gücünü onun nukleotid ardıcıllığından proqnozlaşdırmaq üçün nəzəri üsullar arzuolunandır. Bu cür üsullar yalnız müəyyən gücə malik promotorun dizaynında dəyərli deyil, həm də gen transkripsiyasında promotorun mexanizmini başa düşmək üçün mənalıdır. Bu işdə, müxtəlif testlər vasitəsilə, promotor gücü və nukleotid ardıcıllığı arasındakı əlaqəni təsvir etmək üçün nəzəri bir model təqdim olunur. Təhlillərimiz göstərir ki, promotorun gücünə onların ardıcıllığında üç bitişik nukleotid olan nukleotid qrupları böyük təsir göstərir. Eyni zamanda, promotor ardıcıllığının müxtəlif bölgələrindəki nukleotidlər promotorun gücünə fərqli təsir göstərir. üçün eksperimental məlumatlar əsasında E. coli Promotorlar üçün hesablamalarımız göstərir ki, promotor ardıcıllığının −10 bölgəsindəki, −35 bölgəsindəki və diskriminator bölgəsindəki nukleotidlər promotorun gücünü təyin etmək üçün məsafə bölgəsindəkilərdən daha vacibdir. Eksperimental məlumatlara uyğunlaşdırılmaqla əldə edilən model parametr dəyərləri ilə dörd promotor kitabxanası nəzəri olaraq müvafiq eksperimental mühitlər üçün qurulur ki, onların altında gen ifadəsində promotorun gücünə dair məlumatlar əvvəllər ölçülür.

Qrafik abstrakt

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Nəticələr

Şərti tükənməsi Lhx8 tərəfindən Gdf9Cre kütləvi primordial follikulların aktivləşməsinə səbəb olur

Qlobal nokaut barədə daha əvvəl məlumat vermişdik Lhx8 postnatal 7-ci günə (PD7) [14] sonsuzluğa və oosit itkisinə səbəb olur. Qlobal nokautda Lhx8, ibtidaişəkilli follikullar əmələ gəlir (diametri 20 mkm-dən az olan oositlər və yastı qranuloza hüceyrələri ilə əhatə olunmuşdur), lakin oositlər böyümür. ildən Lhx8 həm embrion, həm də postnatal qadın germ hüceyrələrində ifadə edilir, ola bilər ki, qlobal nokaut Lhx8 postnatal oositlərin tükənməsinə səbəb olan erkən embrion yollarını pozur. Buna görə də biz postnatal funksiyalarını araşdırdıq Lhx8 şərti nokaut siçan yaradan, bir floxed istifadə edərək Lhx8 allel (Lhx8 flx/flx ) [15] və a Gdf9Cre transgen siçan [16]. The Gdf9Cre transgen inaktivləşəcək Lhx8 xüsusilə ilkin oositlərdə. Gdf9Cre oositlərdə və hər ikisində olduqda yüksək effektivdir Lhx8 flx/flx və ya Lhx8 flx/- eyni yumurtalıq fenotipini göstərən heyvanlar. istifadə etdik Lhx8 flx/flx Gdf9Cre təsirlərini öyrənməkdir Lhx8 yumurtalıqların inkişafı üzrə primordial follikulların şərti çatışmazlığı.

PD7 və PD14-də LHX8 proteini tükəndi Lhx8 flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqlar və ibtidai follikullarda kütləvi oosit aktivasiyası baş verdi, bu, ətrafdakı düz qranuloza hüceyrələrinin əhəmiyyətli transformasiyası olmadan 20 μm-dən çox diametrə çatan oositlərlə özünü göstərdi (Şəkil 1a-f). PD7-də, Lhx8 flx/flx Gdf9Cre siçanlar hər yumurtalıqda 398 ± 53 aktivləşdirilmiş primordial follikullara malik idilər. Lhx8 flx/flx nəzarət edir. İlkin follikulların sayı hər yumurtalıqda 1917 ± 23 idi Lhx8 flx/flx nəzarət edir və hər yumurtalıq üçün 1043 ± 119-a qədər əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır Lhx8 flx/flx Gdf9Cre siçanlar (şəkil 1c). İlkin follikullarda azalma aşkar etdik Lhx8 flx/flx Gdf9Cre siçanlar, aktivləşdirilmiş ibtidai follikullardan birincil follikullara keçiddə bloku nəzərdə tutur. PD7-də cüzi sayda inkişaf etmiş follikul növləri (çox qatlı qranuloza hüceyrələri ilə əhatə olunmuş oositlər) var idi. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqlarla müqayisədə Lhx8 flx/flx nəzarət edir.

Postnatal inaktivasiya Lhx8 primordial follikulların vaxtından əvvəl aktivləşməsinə və yumurtalıq çatışmazlığına səbəb olur. ab Anti-LHX8 antikorları, doğuşdan sonrakı 7-ci gündə (PD7) götürülən paraformaldehidlə fiksasiya olunmuş və hematoksilinlə əks-boyanmış yumurtalıqlarda oositləri aşkar etmək üçün istifadə edilmişdir. Yumurtalıqlar nəzarətdən əldə edilmişdir (Lhx8 flx/flx , A) və Lhx8 şərti nokaut (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre, B) siçanlar. Ox ucları içində daxil Panel A anti-LHX8 antikorları ilə ləkələnən ilkin follikulları göstərir (qəhvəyi siqnal). Ox ucları içində daxil B panelində aktivləşdirilmiş primordial follikullar (kuboidal qranuloza hüceyrələri olmadan 20 μm-dən böyük oositlər) göstərilir. d, e, gh PD14 (D və E) və PD21 (G və H) yumurtalıqlarının nəzarət (D və G) və Lhx8 şərti nokaut (E və H) siçanlar. Ox ucları içində daxil panellərin D və E ilkin aktivləşdirilmiş primordial follikulları göstərir. c, fi Yumurtalıq follikul növlərinin miqdarının təyini Lhx8 flx/flxLhx8 flx/flx Gdf9Cre siçan. PD7 (C), PD14 (F) və PD21 (I) yumurtalıqlarının beş cütü parafinə yerləşdirildi və 5 mikron qalınlığında ardıcıl olaraq kəsildi və follikullar sayıldı. Anti-NOBOX anticisimləri follikulogenez boyunca oosit nüvələrini ləkələyir və saylarımızda oositləri müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir. Hər beşinci bölmə sayılırdı. Biz ibtidai follikulları (PF), aktivləşdirilmiş primordial follikulları (Akt. PF, kuboid qranuloza hüceyrələri olmadan oosit diametri 20 μm-dən çox), birincili follikulları (PrF) və ikincil/antral follikulları (SF/AF) qiymətləndirdik. *P < 0,05, **P < 0,01. Ölçək çubuqları: 100 μm (A, B, D, E, G və H) 20 μm (daxil A, B, D və E)

PD14-də, Lhx8 flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqlarda hər yumurtalıqda 847 ± 82 aktivləşdirilmiş primordial follikullar var idi. Lhx8 flx/flx nəzarət edir. İlkin follikulların sayı 1753 ± 204-dən əhəmiyyətli dərəcədə azaldı. Lhx8 flx/flx 353 ± 58 düym qədər idarə edir Lhx8 flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqlar (Şəkil 1f). PD21-ə qədər follikulların ümumi sayı ibtidaidən ikinciliyə doğru xeyli azaldı. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre yumurtalıq (şək. 1g–i). PD35-də demək olar ki, heç bir oosit və follikul aşkar edilməmişdir Lhx8 flx/flx Gdf9Cre yumurtalıq (bax. Əlavə fayl 1: Şəkil S1C) və Lhx8 flx/flx Gdf9Cre dişilər steril idi (bax. Əlavə fayl 2: Şəkil S2A). Araşdırmalarımız göstərir ki, postnatal inaktivasiya Lhx8 primordial follikulların oositlərində kütləvi oosit aktivləşməsinə, oosit aktivasiyasının somatik hüceyrə transformasiyasından ayrılmasına, oosit ölümünə və sonsuzluğa səbəb olur.

LHX8 PI3K-AKT yolu ilə qarşılıqlı əlaqədədir

PD7-də PI3K-AKT-mTOR yollarının mühüm üzvlərini kodlayan genlərin RNT ifadəsini araşdırdıq. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre oositlər. Real-time polimeraza zəncirvari reaksiya (PCR) ifadəsində əhəmiyyətli dəyişikliklər aşkar etmədi Pten, Akt, Foxo3, Pdk1, Mtor, Rps6, Deptor, Riktor, və ya Tsc1/2 (bunlardan bəziləri Şəkil 2-də göstərilmişdir). Bu nəticələr göstərir ki, LHX8 PI3K-AKT-mTOR yollarında zülalları kodlayan genlər alt dəstinin transkripsiyasına birbaşa təsir etmir. Sonra PI3K-AKT yolunun zülal səviyyəsində aktiv olub olmadığını qiymətləndirdik Lhx8 flx/flx Gdf9Cre oositlər. AKT apoptoz və PFA-da əsas rol oynayan serin/treonin spesifik protein kinazdır. Fosforilləşdirilmiş AKT FOXO3 fosforilasiyası da daxil olmaqla bir çox aşağı axın yollarını aktivləşdirir və nəticədə oosit aktivasiyası baş verir [8]. PD7 yumurtalıqlarından olan oositlər üzərində Western blot analizləri göstərdi ki, iki yerdə, S473 və T308-də AKT-nin fosforlaşması daha yüksək olub. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre nəzarət (Şəkil. 2h) daha oositlər. Amma maraqlıdır ki, aktivləşdirilmiş primordial follikullarda yalnız p-AKT (T308) aşkar edilmişdir (bax. Əlavə fayl 3: Şəkil S3).

AKT aktivləşdirilib Lhx8 flx/flx Gdf9Cre oositlər. ag Oositlər PD7 nəzarətindən təcrid edilmişdir (Lhx8 flx/flx , Ctrl) və Lhx8 flx/flx Gdf9Cre (G9cKO) siçan yumurtalıqları və RNT cDNA çevrilməsi və real vaxtda kəmiyyət polimeraza zəncirvari reaksiyası (RT-qPCR) üçün çıxarılıb. Məlumatlar normallaşdırıldı Gapdh ifadə və orta nisbi kəmiyyət kimi verilir (nəzarətlə müqayisədə), ortanın standart xətasını əks etdirən xəta çubuqları ilə. Tələbələr t-hesablamaq üçün testdən istifadə edilmişdir P dəyərlər. Yalnız əhəmiyyətli fərq ifadəsində qeyd edildi Lhx8, gözlənildiyi kimi. ** P < 0,01. h Oositlər PD7 nəzarətindən təcrid olundu və Lhx8 flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqlar, zülal çıxarıldı və AKT və onun iki fosforlanmış formasına (S473 və T308) qarşı antikorlardan istifadə edərək üç müstəqil nümunədə Western blot testi aparıldı. Histon H3 immunoreaktivliyi nəzarət kimi istifadə edilmişdir

Əvvəlki tədqiqatlar PI3K-AKT-mTOR yolları vasitəsilə FOXO3 nukleositoplazmik translokasiyasının və rpS6 fosforilasiyasının PFA ilə əlaqəli olduğunu göstərmişdir [5, 6, 8]. PD7-də FOXO3 nukleositoplazmik translokasiyasını və rpS6 fosforlaşmasını araşdırdıq. PtenLhx8 şərti nokautlar (Şəkil 3 və Əlavə fayl 4: Şəkil S4). FOXO3 nukleositoplazmik translokasiya 30 μm-dən böyük oositlərdə nəzərə çarpırdı, lakin 20-30 μm arasında olan oositlər arasında aşkar translokasiya göstərmədi. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre siçanlar (şək. 3d–f, f', p). Primordial follikulların oositləri PtenLhx8 şərti tək nokautlar, eləcə də müvafiq nəzarət FOXO3 nukleositoplazmik translokasiyanı göstərməmişdir. Bununla belə, FOXO3 nukleositoplazmik translokasiyası PD7 cütlüyünün ilkin (<20 μm) oositlərində (Şəkil 3j–l, l', p) əhəmiyyətli dərəcədə induksiya edilmişdir. Lhx8/Pten şərti nokautlar (Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre). Bu məlumatlar LHX8 və PTEN zülallarının FOXO3 nukleositoplazmik translokasiyasında sinergik təsirini göstərir.

Lhx8 və Pten FOXO3 lokalizasiyasına şərti nokaut təsirləri. ac Nəzarət siçanlarında (Lhx8 flx/flx ), FOXO3 ibtidai oositlərin nüvəsində və sitoplazmasında ifadə edilir (PF, oxlar in c'). df In Lhx8 flx/flx Gdf9Cre siçanlarda 20-30 μm (aPF, ox in f') lakin 30 μm-dən böyük aktivləşdirilmiş primordial follikullarda qeyd olunur (aPF, ox F'). di FOXO3 lokalizasiyasının oxşar ifadə nümunəsi burada mövcuddur Pten şərti nokaut (Pten flx/flx Gdf9Cre) siçan. The oxlar in i' 30 μm-dən aşağı aktivləşdirilmiş primordial follikullarda (aPF) FOXO3-ün həm nüvə, həm də sitoplazma ifadəsi və FOXO3-ün sitoplazma ifadəsi ilə primordial follikulları (PF) təmsil edir. jl Bununla belə, hər ikisində şərti olaraq əskik olan siçanlarda Lhx8Pten (Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre), FOXO3 nukleositoplazmik translokasiya ilkin, aktivləşdirilmiş və birincili oositlərdə mövcuddur. Mənfi nəzarət ikincil antikorların varlığında immunofluoressensiyadır və göstərilir mo. The qutulu sahələr C, F, I, L və O, C', F', I', L' və O'-də böyüdülmüş şəkildə göstərilir. səh FOXO3 paylanmasının qrafik təsviri (yalnız sitoplazma və ya nüvə və sitoplazma). Oositlər ölçüsünə (diametrinə) görə 20 μm-dən az, 20 ilə 30 μm arasında və 30 μm-dən çox olaraq qruplaşdırılmışdır. Yalnız şəffaf DAPI nüvə boyanması olan oositlər sayılır. Ölçək çubuqları: 50 μm (A–C, D–F, G–I, J–L və M–O) 20 μm (C', F', I', L' və O')

İkiqat təsirlərini də araşdırdıq PtenLhx8 rpS6-da çatışmazlıq. mTORC1 qismən S6K1-in aktivləşdirilməsi (onun treoninin 389-un fosforlaşması ilə) və eIF4E bağlayan zülalların fosforlaşması və inaktivasiyası vasitəsilə zülalın tərcüməsini və hüceyrə böyüməsini təşviq edir. S6K1 rpS6-nın fosforilasiyası və aktivləşdirilməsindən məsuldur ki, bu da zülal translyasiyasının və ribosomların biogenezinin artmasına gətirib çıxarır. Nəzarət altında, Lhx8 flx/flx Gdf9Cre, və Pten flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqlarda, rpS6 yalnız PD7-də böyüyən follikullarda əhəmiyyətli dərəcədə aktivləşdirildi (bax. Əlavə fayl 4: Şəkil S4). Bununla belə, PD7 Lhx8 flx/flx Pten flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqlar ilkin (Lhx8 və Pten yollar PFA ilə əlaqəli iki hadisəni sürətləndirmək üçün sinergik şəkildə qarşılıqlı təsir göstərir - FOXO3 nukleositoplazmik translokasiya və rpS6-nın fosforilasiyası.

Lin28a Lhx8flx/flxGdf9Cre oositlərində RNT və zülal ifadəsi yuxarı tənzimlənir.

LHX8 transkripsiya faktorudur və biz onun əsas təsirinin RNT səviyyəsində olacağını gözləyirik. Buna görə də transkriptomunu təhlil etdik Lhx8 flx/flx Gdf9Cre yüksək məhsuldarlıqlı RNT ardıcıllığı (RNT-seq) vasitəsilə yumurtalıqlar. Biz hər bir nümunədə 180 milyon teq sıraladıq və PD7-dən əldə edilən PI3K-AKT-mTOR yollarında genlər tərəfindən kodlanmış RNT etiketlərinin nisbi bolluğunu müqayisə etdik. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre və yumurtalıqları idarə edir. PI3K-AKT-mTOR yol genlərinin RNT ifadəsində əhəmiyyətli fərqlər yoxdur (Pik3r1, Pik3ca, Kit, Kitl, Gsk3b, Cdnd1, Wee1, Cdkn1a/b, Rheb, Mlst8, Mapkap1, Prr5, və Eif4ebp1) RNT-seq təcrübəsində aydın idi (bax. Əlavə fayl 5: Cədvəl S1).

Məlum PI3K-AKT-mTOR genlərinin ifadəsini təhlil etməklə yanaşı, biz transkriptomda qlobal fərqləri öyrəndik. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre və yumurtalıqları idarə edir. 6 dəfə artım müşahidə etdik Lin28a RNT transkriptləri Lhx8 flx/flx Gdf9Cre nəzarət yumurtalıqları ilə müqayisədə (Şəkil 4b və Əlavə fayl 5: Cədvəl S1). Anti-LIN28A antikorları ilə immunofluoressensiya və Western blot analizi göstərdi ki, LIN28A zülalında əhəmiyyətli dərəcədə yüksək səviyyədə ifadə edilib. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre nəzarət ilə müqayisədə oositlər (Şəkil 4a, c).

Lhx8 basdırır Lin28a ifadə. a Anti-LIN28A antikorları ilə immunofluoressensiya göstərir ki, LIN28A üstünlük olaraq yumurtalıqda olan oositlərdə ifadə edilir. LIN28A bolluğu daha yüksəkdir Lhx8 şərti çatışmazlığı olan oositlər (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre) nəzarət vasitələri ilə müqayisədə (Lhx8 flx/flx ). bc Lin28a transkriptlər və zülal əhəmiyyətli dərəcədə daha yüksək ifadə olunur Lhx8 flx/flx Gdf9Cre nəzarətlərdən (Ctrl) fərqli olaraq oositlər (G9cKO). af Oositlərdə anti-LHX8 yaxınlığı ilə təmizlənmiş antikorlarla xromatin immunoprecipitation (ChIP) analizləri. d LHX8 bağlama konsensus ardıcıllığına mükəmməl uyğun gələn ehtimal olunan LHX8 DNT bağlama yeri, TGATTG [22], −536-dan −531-ə qədər mövqedə müəyyən edilmişdir. Lin28a transkripsiyanın başlanğıc yeri. e Anti-LHX8 antikorları TGATTG bağlama ardıcıllığını ehtiva edən genomik DNT-ni çökdürür. Lin28a ChIP-kəmiyyət PCR (qPCR) ilə göstərildiyi kimi promotor bölgəsi. İmmunoqlobulin G (IgG) antikorları nəzarət rolunu oynayır. qPCR məlumatlarını təhlil etmək üçün faiz daxiletmə üsulu istifadə olunur. “Giriş” immunopresipitasiyadan əvvəl xromatin qranullarından alınan PCR məhsuludur. Üçqat orta Ct Faiz daxilolmalarının hesablanması üçün düzəliş edilmiş giriş üçün normallaşdırılmış istifadə edilmişdir. ChIP-qPCR-ni yerinə yetirmək üçün iki primer dəsti (F1 və R1) və (F2 və R2) istifadə edilmişdir. f F1/R1 və F2/R2 primer dəstləri ilə normal qvineya donuzu IgG və anti-LHX8 antikorları tərəfindən çökdürülmüş DNT ilə yanaşı, oosit daxil olan DNT-nin PCR gücləndirilməsi. Ölçək çubuqları: 50 μm (A)

LIN28A, biogenezi bloklayan RNT bağlayıcı zülaldır qoy-7 mikroRNT-lər və menarşın başlanğıcı daxil olmaqla, məməlilərin bədən ölçüsünün və metabolizminin məlum tənzimləyicisi [17, 18]. Lin28a üstünlük olaraq oositlərdə və embrion kök hüceyrələrində ifadə edilir [19, 20]. Bundan əlavə, PI3K-AKT-mTOR yolları LIN28A [21] tərəfindən aktivləşdirilə bilər. Buna görə də LIN28A oositlərin aktivləşməsi və böyüməsində rol oynaya bilər.

LHX8 birbaşa LHX8 DNT bağlama motivinə bağlana bilər Lin28a təşviqatçı

LHX8-in bağlana biləcəyini yoxladıq Lin28a təşviqatçı. LHX8, DNT-ni bağlayacağı proqnozlaşdırılan oosit spesifik LIM homeodomain transkripsiya tənzimləyicisidir. Əvvəlki araşdırma göstərdi ki, LHX8 homeodomain üstünlük olaraq TGATTG DNT motivini bağlayır [22]. Tək TGATTG DNT motivini −531 ilə −536 bp arasında olan ehtimal olunan transkripsiyanın başlanğıc yerindən yuxarıda müəyyən etdik. Lin28a gen (Şəkil 4d). The Lin28a TGATTG motivi digər məməlilərdə, o cümlədən insanlarda qorunur. Biz yüksək spesifik və yaxınlıqda təmizlənmiş anti-LHX8 anticisimlərimizdən istifadə edərək vəhşi tipli oositlər üzərində xromatin immunoprecipitation (ChIP) təcrübəsini həyata keçirdik [13]. Anti-LHX8 antikorları üstünlüklü olaraq immunoprecipitasiya etdi Lin28a TGATTG motivini ehtiva edən promotor DNT fraqmenti (Şəkil 4e, f). Bu məlumatlar daha da LHX8-in repressiya etdiyini göstərir Lin28a birbaşa bağlayaraq ifadə edir Lin28a təşviqatçı.

Lin28a əskikliyi qismən xilas edir Lhx8 flx/flx Gdf9Cre fenotip

Məlumatlarımız LHX8-in bastırdığını göstərir Lin28a ifadə. LIN28A böyüməyi təşviq edən amil [17, 23] olduğundan, oositlərdə üstünlük təşkil edir, biz fərz etdik ki, Lin28a çatışmazlıq xilas edəcək Lhx8 flx/flx Gdf9Cre- səbəb olan PFA. yetişdirdik Lin28aLhx8 ilə siçanlar floxed Gdf9Cre yaratmaq Lhx8/Lin28a ikiqat şərti nokautlar (Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre).

İkiqat nokautun PFA-ya təsirini müəyyən etmək üçün yumurtalıqların morfometrik analizləri apardıq. Aralarında morfometrik fərq müşahidə edilməmişdir Lin28a flx/flx Gdf9Cre və PD7-də qadınları idarə edin (Şəkil 5a, c, e). Gözlənildiyi kimi, bizdə əhəmiyyətli dərəcədə daha az aktivləşdirilmiş primordial follikullar müşahidə etdik Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre müqayisədə Lhx8 flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqlar, lakin onlar nəzarət ilə müqayisədə tamamilə normal deyildi (Şəkil 5a, b, d, f).

Lin28a çatışmazlığı xilas edir Lhx8 flx/flx Gdf9Cre- səbəb olan PFA. ad Nəzarətin reprezentativ histologiyası (Lhx8 flx/flx ), Lhx8 şərti nokaut (Lhx8 flx/flx Gdf9Cre), Lin28a şərti nokaut (Lin28 flx/flx Gdf9Cre), və ikiqat Lhx8/Lin28a şərti nokaut (Lhx8 flx/flx Lin28 flx/flx Gdf9Cre) yumurtalıqlar. İkiqat Lhx8/Lin28a şərti nokautlar aktivləşdirilmiş primordial follikulların sayının azaldığını göstərir. Anti-Nobox antikorları oosit nüvələrini (tünd qəhvəyi) etiketləmək üçün istifadə edilmişdir. PF: primordial follikul aPF: aktivləşdirilmiş primordial follikul. e The Lin28 flx/flx Gdf9Cre (Lin28G9cKO) siçanları nəzarət (Ctrl) siçanları ilə oxşar fenotipə malikdir və primordial follikulların sayı ümumi follikulların faizi kimi ifadə edilir. f Nəzarətdə aktivləşdirilmiş primordial follikulların miqdarının təyini, Lhx8 şərti və ikiqat Lhx8/Lin28a şərti nokautlar. Primordial follikulların (PF) və aktivləşdirilmiş primordial follikulların (aPF) faizi göstərilir. Üç cüt yumurtalıqdan Lhx8 şərti nokaut və dubl Lhx8/Lin28a şərti nokautlu siçanlar ardıcıl olaraq bölündü və hər beşinci bölmə hesablandı. g AKT fosforilasiyası ikiqat azalır Lhx8/Lin28a şərti nokautlar. İlkin və aktivləşdirilmiş primordial follikullarda flüoresan p-AKT (T308) ifadəsi ilə kəmiyyətini təyin etdik. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre (G9cKO) və Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre PD7-də (G9dKO) yumurtalıqlar. AKT-nin fosforlaşmasında əhəmiyyətli bir azalma var Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre ibtidai və aktivləşdirilmiş primordial follikullarla müqayisədə Lhx8 flx/flx Gdf9Cre. Tələbələr t-hesablamaq üçün testdən istifadə edilmişdir P dəyərlər. *P < 0,05, **P < 0,01. Ölçək çubuqları: 50 μm (A–D)

Qismən xilasetmə Lhx8 flx/flx Gdf9Cre-induksiya edilmiş PFA tərəfindən Lin28a əskiklik bunu müdafiə edir Lin28a oosit artımının tənzimləyicisidir. Aktivləşdirilmiş primordial follikulların sayının azalması Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqlar AKT yolunun aktivləşməsinin də azaldığını göstərir. İlkin və aktivləşdirilmiş primordial follikullarda p-AKT (T308) siqnalını təhlil etdik. Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9CreLhx8 flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqlarda (Şəkil 5g) və ifadəsində əhəmiyyətli dərəcədə azaldığını tapdı Lhx8 flx/flx Lin28a flx/flx Gdf9Cre yumurtalıqların yumurtalıqları ilə müqayisədə Lhx8 flx/flx Gdf9Cre siçan.

Lhx8 follikulların birincidən ikinciliyə keçidini tənzimləyir

Əvvəlki tədqiqatlar göstərmişdir ki, PTEN ilə tənzimlənən yollar primordial oosit aktivləşməsində vacibdir, lakin birincili oositlərdə deyil [24]. rolunu öyrəndik Lhx8 əmələ gətirərək ilkin oositlərdə Lhx8 flx/flx Zp3Cre siçan. Zp3Cre ilkin oositlərdə xüsusi olaraq ifadə edilir və Lhx8 flx/flx Zp3Cre yumurtalıqlar LHX8-i ibtidai oositlərdə ifadə etməyə davam edir, lakin əsas deyil. Morfometrik analizlər göstərdi ki, Lhx8 flx/flx Zp3Cre şərti nokaut yumurtalıqları əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmirdi Lhx8 flx/flx PD0 və PD7-də (nəzarət) siçanlar (Şəkil 6a-f). Bununla belə, PD14-də yumurtalıqda 159 ± 23 əsas follikul və 29 ± 7 ikincil/antral follikul saydıq. Lhx8 flx/flx Zp3Cre siçanlar, nəzarət siçanlarında yumurtalıq başına 79 ± 6 əsas follikul və 108 ± 7 ikincil/antral follikulla müqayisədə (Şəkil 6g-i). PD14-də birincili follikulların nisbi artması və çox qatlı follikulların nisbi azalması Lhx8 flx/flx Zp3Cre yumurtalıq, birincili follikullardan ikincil follikullara keçidin bloklandığını göstərdi, bu da müşahidə ilə uyğundur. Lhx8 flx/flx Gdf9Cre siçanlar (şək. 1f). PD21 və PD30-da bir çox ilkin follikulların oositlərdən məhrum olduğunu müşahidə etdik (Şəkil 6k, n). PD21 yumurtalıqlarında LIN28A üçün boyadıq və LIN28A-nın güclü şəkildə ifadə edildiyini gördük. Lhx8 çatışmazlığı olan oositlər Lhx8 flx/flx Zp3Cre yumurtalıq, lakin boş follikullarda heç bir ifadə aşkar edilmədi (bax. Əlavə fayl 6: Şəkil S5). Ancaq bu boş birincil follikullar xaric, birincil follikulların sayı nəzarət və Lhx8 flx/flx Zp3Cre yumurtalıqlar PD21 və ya PD30-da əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmirdi (Şəkil 6l, o). İkincili/antral follikullar üçün bu rəqəm PD21-də 17 ± 3-ə, PD30-da isə 2 ± 1-ə qədər kəskin şəkildə azalmışdır. Lhx8 flx/flx Zp3Cre yumurtalıqlar, nəzarət siçanlarında müvafiq olaraq 170 ± 2 və 104 ± 4 ilə müqayisədə. Bu tapıntılar böyüyən follikul hovuzunun aradan qaldırılmağa davam etdiyini göstərir Lhx8 flx/flx Zp3Cre siçan. Lhx8 flx/flx Zp3Cre siçanlar sonsuz idi (bax Əlavə fayl 2: Şəkil S2A) və superovulyasiya müalicəsi Lhx8 flx/flx Zp3Cre siçanlar oositlər yaratmadı (bax. Əlavə fayl 2: Şəkil S2B). Bu nəticə sekonder/antral follikulların kəskin azalması ilə uyğun gəlirdi Lhx8 flx/flx Zp3Cre PD21-də yumurtalıq. Bu məlumatlar birlikdə götürdükdə follikulogenez olduğunu göstərir Lhx8 flx/flx Zp3Cre siçanların ibtidai follikul mərhələsindən ikincil fazaya keçidi bloklanır və birincili oosit ölümü və sonsuzluqla nəticələnir. The relative stability of the primordial follicle pool from PD14 to PD30 suggests that the PFA into primary follicles was not affected by the diminution in the number of secondary and more advanced ovarian follicles in Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries.

Lhx8 inactivation in primary follicles (Lhx8 flx/flx Zp3Cre) abolishes follicle growth. Histomorphological analysis was done on control (Lhx8 flx/flx ) və Lhx8 deficient ovaries (Lhx8 flx/flx Zp3Cre) at various stages of postnatal ovarian development ranging from newborn (PD0) to postnatal day 30 (PD30). af Periodic acid–Schiff (PAS) staining and counting of different follicle types in the newborn and PD7 ovaries showed no significant differences between control and Lhx8 deficient ovaries. go Anti-NOBOX antibodies were used to stain oocytes (brown immunoreactivity) in ovaries from PD14 (G and H), PD21 (J and K), and PD30 (M and N) mice. At PD14, the Lhx8 flx/flx Zp3Cre ovaries showed a significantly higher number of primary follicles (PrF) and significantly diminished number of secondary/preantral (SF/AF) follicles characterized by two or more layers of granulosa cells. At PD21 and PD30, the primary follicle pool did not differ significantly between Lhx8 flx/flx Zp3Cre and control ovaries however, there was a marked decrease in the number of secondary and more advanced ovarian follicles in conditional knockouts including degenerating follicles without oocytes (marked by asterisks in insets in K and N). The primordial follicle (PF) pool remained relatively stable between PD14 and PD30, with no significant difference between Lhx8 flx/flx Zp3Cre and control ovaries. **P < 0,01. Scale bars: 100 μm (A, B, D, and E) 200 μm (G, H, J, K, M, and N) 50 μm (insets of K and N)


Tetracycline-inducible Empty Backbones

Find a construct that will allow you to insert and induce your gene of interest.

ID Plazmid Təsvir Co-expressed tTA, rtTA, or TetR On or Off PI
21916 Tet-pLKO-neo 3rd generation lentiviral plasmid for inducible expression of shRNA neomycin selection plasmid 21915 has puromycin selection TetR Aktiv Wiederschain
41393 pCW57.1 Lentiviral vector for inducible expression for Gateway cloning selection cassette in format: PGK-rtTA-2A-puro see article for tagged insert options rtTA Aktiv Root
11651 pLVUT-tTR-KRAB Lentiviral vector for inducible expression of transgene or shRNA see article for detailed information about cloning and additional plasmids tetR-KRAB Aktiv Aebischer & Trono
16542 pBI-MCS-EGFP Expression of your gene of interest (MCS with a &beta-globin poly A) & EGFP from a bidirectional tet-responsive promoter (Pbi) Pbi contains a TRE between two minimal CMV and is silent in absence of binding of tTA or rtTA Heç biri Aktiv Vogelstein
25735 pSLIK-Neo Lentiviral vector for inducible expression of a miR-shRNA selection cassette in format: rtTA3+IRES+Neo see article for additional selection options third-generation rtTA Aktiv Fraser
44012 pInducer20 Lentiviral vector for shRNA expression see article for additional tookit plasmids third-generation rtTA Aktiv Elledge
19407 pTREtight2 Promoter contains a modified TRE that is silent in absence of binding tTA or rTA has high copy E. coli origin Heç biri ya Ralser
64238 pTet-IRES-EGFP Lentiviral plasmid for inducible expression of transgene of interest and EGFP Heç biri ya Ağciyər
11662 pPRIME-TET-GFP-FF3 Lentiviral, miRNA expression (PRIME) system for application in knockdown of gene expression at a single copy in mammalian cells Expresses firefly luciferase hairpin and GFP under pTREtight promoter Heç biri ya Elledge
35625 pAAV-Ptet-RFP-shR-rtTA AAV shRNA cloning vector for evaluation of shRNA efficacy using fluorescence use with pGFPns-reporter for cDNA target rtTA Aktiv Gu
60495 pSBtet-GP Sleeping Beauty transposon system has luciferase in cloning site see article for additional selection and FP option rtTA Aktiv Kowarz
16623 pBI-GFP Expression of your gene of interest & GFP from a bidirectional tet-responsive promoter (Pbi) Pbi contains a TRE between two minimal CMV and is silent in absence of binding of tTA or rtTA Heç biri ya Vogelstein
100521 pCW57.1-MAT2A Lentiviral Tet-Off all in one plasmid derived from pCW57.1. rtTA was replaced with tTA, and Puromycin was replaced with Blasticidin selection. Please NOTE, this vector contains an insert (MAT2A) which would need to be replaced by the gene of interest. tTA Söndür Sabatini
92099 AAVS1_Puro_Tet3G_3xFLAG_Twin_Strep Bidirectional promoter controls expression of gene of interest with Strep-Tag and Tet-On 3G transactivator, creating an auto-regulated Tet-On 3G System. Contains homology arms for integration into AAVS1 Genomic Safe Harbor Locus. Tet-On 3G Aktiv Doyon
58245 pGLTR-X-GFP Single vector lentiviral Gateway RNAi system for conditional cell line generation contains expression cassette for TetR-P2A-GFP see article for additional constructs TetR Aktiv Geley


Misal 4

In experiments using S. aureus cells grown in culture, intracellularly expressed ssJT01ss bound to and inhibited a specific essential cellular target in a manner similar to that of an antimicrobial drug. Hence induction of expression of this peptide during an infection should have the effect of an antibiotic. An established animal infection model was used to test this concept (Onyegji, C. O. et al., Antimikrobiyal agentlər və kemoterapi 38:112-117, 1994).

Six groups of CD-1 female mice (5 mice per group, Charles River Laboratories, Wilmington, Ma.) weighing 20-24 grams were used in this experiment. The inoculum was prepared from CYL316tt/pC 3 883 (encoding a ssJT01ss peptide-GST fusion protein under the control of the tet operon) which was cultured at 37° C. for 17 hours in TS broth containing erythromycin and kanamycin. 1.6×10 10 cfu (colony-forming units) of S. aureus CYL316tt/pC 3 883 (OD 600 of 0.1=10 8 cfu/ml) from the overnight culture were diluted to 20 ml with 0.01 M PBS (Sigma P-0261) containing 8% hog gastric mucin (Sigma M-2378) as well as 50 μg/ml kanamycin and 10 μg/ml erythromycin. Each mouse of groups 1 through 4 was injected with 0.5 ml of the inoculum intraperitoneally (i.p.), equivalent to 4×10 8 cfu/mouse (lethal dose). Groups 5 and 6 served as vector controls. Each mouse of these two groups was injected with 4×10 8 cfu of CYL316tt/pC 3 875, which was cultured and processed the same way as CYL316tt/pC 3 883. One half hour and four hours after the inoculation, groups 1 and 5 received a saline injection i.p. at 10 ml/kg groups 2 and 6 received i.p. injections of tetracycline (Sigma T-3383) at 8 mg/kg group 3 received i.p. injections of tetracycline at 4 mg/kg group 4 received i.p. injections of ciprofloxacin (Bayer 851510, dissolved in water) at 50 mg/kg. The injection volume for all the animals was 10 ml/kg. Surviving mice were counted at 7 days post inoculation. Ciprofloxacin given at 50 mg/kg protected all infected animals from lethal infection.

The data summarized in Table 2 demonstrate that induction of intracellular expression of the ssJT01ss peptide can be achieved in an animal infection. inhibe S. aureus MetRS by the intracellularly expressed ssJT01ss peptide cured a lethal infection in a mouse model.

TABLE 2
inhibe S. aureus growth in mice by intracellular production
of S. aureus MetRS inhibitor
# of Mice# of Mice
Experimental ConditionTestedSağ qalma
M1 Peptide
Saline, 10 mg/kg C250
Inducer, mg/kg C255
Expression Control
Saline, 10 mg/kg C250
Inducer, mg/kg C250

The relevant teachings of all references cited herein are hereby incorporated by reference herein in their entirety.

While this invention has been particularly shown and described with references to preferred embodiments thereof, it will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.

28 1 33 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 1 acgggtcgac tcatatcttt tattcaataa tcg 33 2 32 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 2 ccggaaagct tacttattaa ataatttata gc 32 3 34 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 3 taagtaagct taaggaggaa ttaatgatgt ctag 34 4 34 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 4 acgggtcgac ttaagaccca ctttcacatt taag 34 5 45 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 5 ctcggtaccg agctaaaatt cggaggcata tcaaatgagc tctgg 45 6 44 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 6 ggcatatcaa atgagctctg gaggtggagg catgtcccct atac 44 7 31 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 7 aggcctaggt taatccgatt ttggaggatg g 31 8 42 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 8 ctgatccgaa tacgtggcag ttgcggtggc ctatgcatag ct 42 9 42 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 9 atgcataggc caccgcaact gccacgtatt cggatcagag ct 42 10 48 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 10 tcgagttcat gaaaaactaa aaaaaatatt gacatcccta tcagtgat 48 11 45 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 11 agagataatt aaaataatcc ctatcagtga tagagagctt gcatg 45 12 29 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 12 caagctctct atcactgata gggattatt 29 13 56 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 13 ttaattatct ctatcactga tagggatgtc aatatttttt ttagtttttc atgaac 56 14 58 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 14 aataaaaaac tagtttgaca aataactcta tcaatgatag agtgtcacaa aaaggagg 58 15 56 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 15 gatagagtgt caacaaaaag gaggaattaa tgatgtcccc tatactaggt tattgg 56 16 36 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 16 ggattaaggt aaccttaatc cgattttgga ggatgg 36 17 12 PRT Artificial Sequence Synthetic Peptide 17 Asp Pro Asn Thr Trp Gln Leu Arg Trp Pro Met His 1 5 10 18 6 PRT Artificial Sequence Synthetic Peptide 18 Gly Gly Arg Gly Gly Met 1 5 19 54 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 19 gatcctaata catggcagtt gaggtggcct atgcatggcg gccgcggagg tatg 54 20 66 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 20 agctctgatc ctaatacatg gcagttgagg tggcctatgc attcttcagg cggccgcgga 60 ggtatg 66 21 21 PRT Artificial Sequence peptide 21 Ser Arg Trp Glu Lys Tyr Ile Asn Ser Phe Glu Leu Asp Ser Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Met 20 22 63 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 22 tctagatggg aaaaatatat taattctttt gaattagatt ctcgaggtgg tagaggtgga 60 atg 63 23 21 PRT Artificial Sequence peptide 23 Ser Ser Gln Gly Thr Met Arg Trp Phe Asp Trp Tyr Arg Ser Arg Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Gly Met 20 24 63 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 24 agctctcaag gtactatgag atggtttgat tggtatagat ctcgaggtgg tagaggtgga 60 atg 63 25 49 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 25 agcaccttgg cggccgcgga ggtgctagca aaggagaaga actcttcac 49 26 37 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 26 aactgaggta acctcagttg tacagttcat ccatgcc 37 27 52 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 27 tttaccttgg cggccgcgga ggtaaactga agaaggtaaa ctggtaatct gg 52 28 40 DNA Artificial Sequence Oligonucleotide 28 acttagggta accttaagtc tgcgcgtctt tcagggcttc 40


Identification of the Omega4514 regulatory region, a developmental promoter of Myxococcus xanthus that is transcribed in vitro by the major vegetative RNA polymerase

Omega4514 is the site of a Tn5 lac insertion in the Myxococcus xanthus genome that fuses lacZ expression to a developmentally regulated promoter. DNA upstream of the insertion site was cloned, and the promoter was localized. The promoter resembles vegetative promoters in sequence, and sigma(A) RNA polymerase, the major form of RNA polymerase in growing M. xanthus, initiated transcription from this promoter in vitro. Two complete open reading frames were identified downstream of the promoter and before the Omega4514 insertion. The first gene product (ORF1) has a putative helix-turn-helix DNA-binding motif and shows sequence similarity to transcriptional regulators. ORF2 is most similar to subunit A of glutaconate coenzyme A (CoA) transferase, which is involved in glutamate fermentation. Tn5 lac Omega4514 is inserted in the third codon of ORF3, which is similar to subunit B of glutaconate CoA-transferase. An orf1 disruption mutant exhibited a mild sporulation defect, whereas neither a disruption of orf2 nor insertion Omega4514 in orf3 caused a defect. Based on DNA sequence analysis, the three genes are likely to be cotranscribed with a fourth gene whose product is similar to alcohol dehydrogenases. ORF1 delays and reduces expression of the operon during development, but relief from this negative autoregulation does not fully explain the regulation of the operon, because expression from a small promoter-containing fragment is strongly induced during development of an orf1 mutant. Also, multiple upstream DNA elements are necessary for full developmental expression. These results suggest that transcriptional activation also regulates the operon. Omega4514 is the first example of a developmentally regulated M. xanthus operon that is transcribed by the major vegetative RNA polymerase, and its regulation appears to involve both negative autoregulation by ORF1 and positive regulation by one or more transcriptional activators.

Rəqəmlər

Physical map of the Ω4514…

Physical map of the Ω4514 insertion region and summary of upstream segments tested…

Developmental expression of lacZ under…

Developmental expression of lacZ under the control of the Ω4514 promoter. Developmental β-galactosidase…

Localization of an mRNA 5′…

Localization of an mRNA 5′ end within the Ω4514 upstream region. Low-resolution S1…

Primer extension analysis of Ω4514…

Primer extension analysis of Ω4514 mRNA. RNA was isolated from wild-type DK1622 cells…

Developmental expression of lacZ from…

Developmental expression of lacZ from a small segment containing the Ω4514 promoter. Developmental…

In vitro transcription from the…

In vitro transcription from the Ω4514 promoter. DNA fragments containing the Ω4514 promoter…

Western blot analysis of σ…

Western blot analysis of σ A in growing and developing M. xanthus cells.…

təsiri orf1orf2…

təsiri orf1orf2 mutations on developmental lacZ expression under the control…

Level of ORF1 protein and…

Level of ORF1 protein and β-galactosidase specific activity during growth and development. (A)…

Sequences of promoters transcribed in…

Sequences of promoters transcribed in vitro by M. xanthus σ A RNAP. The…


Videoya baxın: Gene Silencing by microRNAs (Avqust 2022).