Məlumat

Fərqli toxumalardan çıxarılan fermentlər eyni şəraitdə fərqli $K_m$ qiymətlərinə malik ola bilərmi?

Fərqli toxumalardan çıxarılan fermentlər eyni şəraitdə fərqli $K_m$ qiymətlərinə malik ola bilərmi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Laboratoriya komandam istifadə edilmişdir süksinat dehidrogenaz (1.3.5.1) -dən Gallus gallus domesticus döş ətini (toyuqun ən çox ətli hissəsi, burada nuggets əldə edəcəksiniz) təyin etmək $K_{m}$$V_{max}$ 3 xəttiləşdirmə metodu altında.

Ancaq BRENDA səhifəsində bir çox orqanizm üçün müxtəlif dəyərlər tapdım, məsələn Bos buğa, və onlar qaraciyər toxuması kimi digər toxumaları seçirlər.

Niyə fərq?

PD. Bu dəyərlərin harada tapılacağına dair hər hansı bir istinad Gallus gallus mesticus çox təqdir ediləcək.

EDIT: Reaksiya trikarborksilik turşu dövrü üzrə süksinatın fumaratın dehidrogenləşdirilməsindən ibarətdir. Trans-ikiqat istiqrazın yaradılmasını daxil edin.

Laboratoriya təcrübəmi təsvir edərək, biz əti şüşə qum ilə mayalandırırıq və bu qarışığı 2 növə bölürük: biri metilen mavisi və trixloroasetik turşu (TCA) ilə, digəri isə TCA olmadan. İndi mən bilirəm ki, TCA zülal çöküntüsüdür, metilen mavisi isə göstəricidir; daha az mavi, daha az succinate. Beləliklə, absorbans testləri ilə aydınlaşdıra bilərik [Succinate] vs zaman süjeti, və nisbəti təxmini $V_{max}/K_m$ substrat konsentrasiyasının çürüməsi üçün michael tənliyindən: $$S(t)=S_0 e^{-frac{V_{max}}{K_m}t}$$ Həmçinin, məncə, onun törəməsi ilə ani sürəti modelləşdirmək və xəttləşdirmə planlarını yaratmaq mümkün olacaq, lakin buna çox da əmin deyiləm.

EDIT2: Təcrübə hesabatımla bağlı köməyə görə təşəkkür edirəm (həqiqətən bunu qiymətləndirirəm), lakin mən hələ də fərqli ola biləcəyini bilmək istəyirəm. $K_m$ eyni fermentdə dəyərlər, yalnız reaksiya üçün toxuma dəyişir.


Əgər fermentlər həqiqətən eynidirsə, fərqli toxumalardan eyni fermentin fərqli Km dəyərlərinə sahib olmasını gözləməzsiniz.

Bundan əlavə, təmizləmə zamanı Km dəyərinin dəyişməsini gözləməzsiniz: təmizlənmiş ferment üçün Michaelis sabiti xam nümunə ilə müəyyən edilənlə eyni olmalıdır. Əgər bu doğru deyilsə, bu o demək ola bilər ki, ferment təmizlənmə zamanı, ola bilsin ki, proteoliz yolu ilə dəyişdirilib (müayinə edən şəxsin qeyd etməsini və ya təklif etməsini istədiyiniz bir şey deyil!).

Michaelis sabitinin üstünlüyü ondan ibarətdir ki, o, ferment konsentrasiyasından asılı deyil (və beləliklə, təmizlik dərəcəsindən asılı deyil).

Bunu dedikdən sonra, məncə, müxtəlif toxumalardan təcrid olunmuş fermentlərin fərqli Km dəyərlərinə malik olması çox da qeyri-adi sayılmayacaq.

Mümkün səbəblər bunlardır:

  • Təhlil şərtləri əslində eyni deyil. pH, ion gücü, temperatur və tampon tərkibi Km-ə təsir edə bilər. Michaelis sabiti 37-də 100 mM fosfatda pH 7-də müəyyən ediliroC 50 mM Tris pH 7 və 25-də müəyyən ediləndən çox fərqli ola biləroC
  • Tərcümə sonrası dəyişiklik vacib ola bilər. Məsələn, bir toxumadan olan ferment fosforilləşə bilər. Bir laboratoriya dəyişdirilmişləri təcrid etmiş ola bilər, digər laboratoriya isə müntəzəm olaraq fosfataz inhibitorlarını ehtiva edə bilər.
  • Xam toxuma preparatında mövcud olan proteazlar fermenti dəyişdirmiş ola bilər.

Süksinat dehidrogenaz vəziyyətində daha iki vacib mülahizə var.

  • Süksinat dehidrogenaza membrana bağlı fermentdir (tərkibində kovalent bağlı flavin var) və ekstraksiya üsulu hər şeydən önəmli olacaq və tədqiq edilməli əsas sahə ekstraksiya şəraitinin Km fərqini hesablaya biləcəyidir.
  • Nəhayət, və məncə bu vacibdir. SDH iki substratlı fermentdir və A substratı üçün Km B substratının konsentrasiyasından asılı olacaq ! İki substratlı ferment üçün "əsl" Michaelis sabitini müəyyən etmək üçün (substrat inhibəsinin olmadığını nəzərə alaraq) biz ko-substratın "sonsuz" konsentrasiyalarına ekstrapolyasiya etməliyik. Əks halda biz məşğul oluruq aydın Km dəyərləri.

Əminəm ki, son nöqtə vacibdir. Problem ondadır ki, ən azı bildirilən km-lərin bəziləri var aydın dəyərlər, yəni ko-substrat konsentrasiyası müxtəlif eksperimental şəraitdə fərqlidir?


Ferment Təhlilləri

Spektroskopik üsullar

Absorbans spektroskopiyası. Bəzi ferment analizləri üçün reaktivi və ya məhsulu birbaşa onun absorbsiya xüsusiyyətlərinə əsaslanaraq ölçmək mümkündür Fersht (1999). Qlükoza-6-fosfat dehidrogenaz (EC 1.1.1.49) tərəfindən kataliz edilən reaksiyada bir məhsul (NADH) 340 nm-də işığı udur və bu dalğa uzunluğunda absorbansın artmasına riayət etməklə reaksiyaya nəzarət etməyə imkan verir.

Qlükoza 6-fosfat + NAD + → 6-fosfoqlükonat + NADH + H +

Digər hallarda reaktiv və ya məhsul dolayı yolla ölçülür. Asetilkolinesteraza (EC 3.1.1.7) ilə, məsələn, asetiltiokolin fermentə məruz qaldıqda tioxolin azad edən substrat kimi istifadə olunur. Tiokolin Ellman reagenti ilə reaksiyaya girərək rəngli məhsul əldə edir, bu da absorbansın artımını izləməklə reaksiyanı izləməyə imkan verir.

Asetiltiokolin + H2O → asetat + H + + tioxolin

Tiokolin + Ellman reagenti → rəngli törəmə

Birləşdirilmiş analizlər bəzən ferment aktivliyini izləmək üçün istifadə olunur. Bu halda, maraq doğuran enzimatik reaksiya, rahat ölçmə üçün birləşdirilən ikinci reaksiya ilə birləşdirilir. Buna misal olaraq heksokinazın analizində göstərilə bilər (EC 2.7.1.1). Bu halda, qlükoza-6-fosfatdehidrogenazın və NAD+-nın artıqlığı analiz qarışığına daxil edilir və 340 nm-də absorbsiyaya nəzarət edilir.

Reaksiya I: Qlükoza + ATP → qlükoza 6-fosfat + ADP

Reaksiya II: Qlükoza 6-fosfat + NAD + → 6-fosfoqlükonat + NADH + H +

Bu nümunədə I reaksiya sürəti məhdudlaşdırmalı və qlükoza 6-fosfatın konsentrasiyası gecikmədən sonra sabit vəziyyətə çatmalıdır. Cleland Cleland (1979) birləşdirilmiş analizin fermentin reaksiya sürətinin dəqiq ölçülməsini təmin etmək üçün bir prosedur hazırladı. Mümkünsə, bir reaksiyanı davamlı olaraq izləmək üstünlük təşkil edir. Yuxarıda təsvir edilən analizlərlə spektrofotometr vaxt funksiyası kimi davamlı oxunuş vermək üçün proqramlaşdırıla bilər. Radioaktivliyin, elektroforezin və ya xromatoqrafiyanın istifadəsini əhatə edə bilən ayırma üsullarında fasiləsiz və ya son nöqtə analizləri istifadə olunur. Təhlil üçün xətti vaxt müddəti təyin edildikdən sonra, parametr xətti zaman periyodu daxilində bir vaxt nöqtəsində ölçülür (ən yaxşısı, xətti fazanın ortasına yaxın vaxt nöqtəsi). Daha sonra sürət həmin vaxt nöqtəsində və reaksiyanın başlanğıcında siqnal fərqindən müəyyən edilir. Son nöqtə analizləri ilə diqqətli olmaq lazımdır və xəttiliyi təsdiqləmək üçün vaxt kursları yoxlanılmalıdır. Temperatur, pH və ya substrat konsentrasiyası kimi inkubasiya şəraitindəki dəyişikliklər analizin xəttini dəyişə bilər. Rutin ferment analizləri üçün reaksiya qabı komponentlərdən biri istisna olmaqla hamısını ehtiva edir və reaksiya çatışmayan komponentin (ferment və ya substratlardan biri) əlavə edilməsi ilə başlanır. Digər komponentlər pH, temperatur və ion gücü baxımından tarazlaşdırılmalıdır. Reaksiya adətən itkin komponentin az miqdarda konsentratlı məhlulunun əlavə edilməsi ilə başlanır. Kiçik həcm bu əlavənin artıq qurulmuş tarazlıq şərtlərini pozmamasını təmin edir. Kiçik bir komponenti əlavə etmək mümkün olmadıqda, ayrılmış komponentlər eyni temperaturda, ion gücündə və p H səviyyəsində olmalıdır. Baxmayaraq ki, iki komponentin tam qarışığı olmalıdır, güclü silkələnmədən qaçınmaq lazımdır, çünki o, denatürasiya edə bilər. ferment zülalı. Qarışdırma, əlavə edilmiş tıxaclı borunun və ya Parafilm möhüründən istifadə edərək küvetin çevrilməsi ilə həyata keçirilə bilər. Seyreltilmiş zülallar daha çox konsentrasiya edilmiş zülallara nisbətən daha az stabildir və təmizlənmiş fermenti sabitləşdirmək üçün analizlər tez-tez inert zülalın, məsələn, iribuynuzlu zərdab albumini (0,25 mq/ml) iştirakı ilə aparılır. Zülalın inert olmasını təmin etmək üçün təcrübələr aparılmalıdır. Albümin, məsələn, hidrofobik substratlara bağlana bildiyi üçün bu məqsəd üçün həmişə uyğun olmaya bilər. Fasiləsiz analizlər üçün taymer təyin oluna və nümunələr qarışdırıldıqdan sonra müəyyən vaxt intervallarında aspire edilə bilər. Əksər spektrofotometrlər üçün aşkarlama alət paneli və ya kompüter klaviaturasından istifadə etməklə əl ilə başlanır. Küvetə komponent əlavə etmək üçün kyuvetanı spektrofotometrə yerləşdirmək və kompüter düyməsini basaraq aşkarlamağa başlamaq üçün təxminən 20 saniyə lazımdır. Bu vaxt adətən böyük əhəmiyyət kəsb etmir, çünki əksər reaksiyalar üçün analiz 10 ilə 30 dəqiqə arasında aparılır. Nəzarət ölçmələrinə tərkibində ferment olmayan blank və qeyri-substrat tərkibli blank daxildir. Bu cür nəzarətlər təsadüfi reaksiyaların baş verməməsini təmin edir. Enzimatik reaksiyanın faktiki sürətini təmin etmək üçün eksperimental tərəfindən yaradılan tarixdən nəzarət (fermentsiz boşluq) dərəcəsi çıxarılır. Bir çox analizlər üçün, məhsulun sonrakı istehsalının qarşısını almaq üçün müəyyən bir zamanda reaksiyanı söndürmək və ya dayandırmaq lazımdır. Məsələn, nümunələr əvvəlcədən müəyyən edilmiş bir müddət üçün 5 dəqiqəlik fasilələrlə götürülə bilər və məhsul HPLC ilə ölçülə bilər.

Hər bir xromatoqrafik analizin tamamlanması 30 dəqiqə çəkə bilər. Reaksiyanı dayandırmaq üsulları adətən fermentin turşu əlavə etməklə denatürasiyasını və ya qaynar su banyosuna batırılmasını nəzərdə tutur. Bəzi metalloenzimlərin fəaliyyəti EDTA və ya digər metal ion chelator ilə söndürülə bilər. Əksər ferment analizləri spektroskopik üsullara əsaslanır, ən çox istifadə olunan ikisi udma və flüoresan Fersht (1999). Reaksiya sürətini izləmək üçün istifadə olunan dalğa uzunluğu substrat və məhsul arasında udmada ən böyük fərqi verən dalğa uzunluğu olmalıdır. Absorbsiya ölçmələri xüsusi hüceyrələrdə və ya kyuvetlərdə olan nümunələrlə standart spektrofotometr ilə aparılır. 1 və ya 3 ml nümunələri saxlayan birdəfəlik plastik küvetlər ticarətdə mövcuddur. Onların istifadəsi görünən dalğa uzunluğu diapazonu (350-800 nm) ilə məhdudlaşır. 350 nm-dən az dalğa uzunluğunda ölçmələr üçün kvars kyuvetlərdən istifadə edilməlidir (şüşə və plastik UV diapazonunda işığı udur). Küvetlər üçün yol uzunluqları istehsalçı tərəfindən təmin edilir. Populyar yol uzunluqları 1.00 sm, 0.40 sm və 0.20 sm-dir. Artan sayda analizlər plastik və ya kvars dibləri olan 96 quyu mikrotitr lövhələri ilə aparılır. Müəyyən dalğa uzunluqlarında işığı udan maddənin konsentrasiyası Pivə qanunundan müəyyən edilə bilər:

burada A müəyyən dalğa uzunluğunda nümunənin udulması, c nümunənin konsentrasiyası, l yolun uzunluğu və ε sönmə əmsalı və ya molar udma qabiliyyətidir. ε M −1 sm −1 və ya mM −1 sm −1 vahidlərinə malikdir. Müəyyən bir maddə üçün ε qiyməti məlumdursa, onun məhlulda udulmasını ölçməklə həmin maddənin məhluldakı konsentrasiyasını hesablamaq olar. Pivə qanunundan istifadə edərək, reaksiya zamanı konsentrasiyanın dəyişmə sürətini hesablamaq olar. Absorbsiya ölçmələrindən istifadə edən potensial xəta, Pivə qanunundan kənara çıxma nəticəsində yaranır, çünki o, yalnız sonlu udma dəyərlərinə aiddir. Beləliklə, 1-dən çox udma qabiliyyəti ilə tətbiq oluna bilməyəcəyinə görə, təhlillər eksperimental dəyərləri bundan az saxlamaq üçün tərtib edilməlidir. Daha qısa yol uzunluqlu kyuvetlərdən istifadə etməklə bu problemlərin bəzilərinin qarşısını almaq mümkün ola bilər. 1,00 sm yol uzunluğu hüceyrəsində 1,00 udma qabiliyyəti olan nümunə, 0,20 sm yol uzunluğu hüceyrəsində 0,20 udma qabiliyyətinə malik olacaqdır. Ümumiyyətlə, 0,5-ə yaxın absorbansla işləmək spektrofotometrə xas olan optik səs-küyü minimuma endirmək və ölçmək üçün ağlabatan siqnala malik olmaq arasında kompromis deməkdir. Məhluldakı bulanıqlıq işığı səpə bilər və görünən absorbsiya yarada bilər. Bu hissəcikləri çıxarmaq üçün filtrasiya və ya sentrifuqadan istifadə edilə bilər. Yol uzunluğundakı dəyişikliklər xəttilikdən bəzi sapmalardan yan keçsə də (yəni, absorbans o qədər yüksək olduqda ki, spektrofotometr dəqiq ölçmə apara bilmir), çox vaxt sapmalar udma növləri arasında molekullararası qarşılıqlı təsirlərdən qaynaqlanır. Dimerləşmə (və ya daha yüksək dərəcəli eksimerlərin formalaşması) udma növlərinin daha yüksək konsentrasiyalarında baş verir. Bu hallarda, məhsulun konsentrasiyası azalarsa, Beer's qanununa əməl ediləcəkdir. Bu, ya reaksiyanı yavaşlatmaqla (ferment konsentrasiyasını azaltmaqla) və ya daha qısa müddət ərzində ölçmələr aparmaqla (Beer qanunundan kənara çıxmalara rast gəlməzdən əvvəl) nail olmaq olar.


Fon

Timidilat (dTMP) DNT-nin əsas tikinti blokudur və xilasetmə və de novo yollarla sintez olunur (Şəkil 1). Xilasetmə yolunda dTMP timidin kinazları (TK1 və TK2) tərəfindən katalizlanan timidin (dT) fosforilasiyası və de novo yolunda timidilat sintaza (TS) ilə katalizlanan deoksiuridilat (dUMP) metilasiyası ilə istehsal olunur. TK1 əsasən proliferasiya edən toxumalarda ifadə olunan sitozolik fermentdir [1, 2]. Mitoxondrial TK2 isə konstitutiv olaraq ifadə olunur [3, 4]. Toxuma və ya hüceyrə ekstraktlarında TK1 və TK2 aktivliyinin təyini hər iki fermentin üst-üstə düşən substrat spesifikliyinə malik olması səbəbindən çətinləşir [5,6,7]. Əsasən limfoid toxumalarda ifadə edilən sitozolik deoksisitidin kinaz (dCK), deoksisitidin (dC) dCMP-yə fosforlaşmasını kataliz edir, daha sonra dCTP-yə fosforlaşdırıla və ya dUMP-ə dezaminasiya oluna bilər və dTMP sintezi üçün istifadə olunur (Şəkil 8, 1). . Mitozdan sonrakı toxumalarda ribonukleotid reduktaza (RNR) fəaliyyəti minimaldır, çünki kiçik alt bölmənin ifadəsi S-fazaya xasdır [10, 11]. Bununla belə, p53 induksiyalı RNR kiçik subunitinin (p53R2) olması de novo yola hətta qeyri-dönən hüceyrələr üçün də dNTP təmin etməyə imkan verir [12]. Bundan əlavə, TS fəaliyyəti dTMP-nin de novo sintezi üçün ilkin şərtdir. Gəmiricilərdə həm TK1, həm də TS aktivliyi inkişaf baxımından aşağı tənzimlənir və doğuşdan sonra 2 həftə ərzində minimum səviyyəyə enir [13, 14]. Bizim məlumatımıza görə, TS və p53R2 səviyyələri və sitozolik deoksinukleozid kinazaların yetkin heyvan toxumalarında paylanması barədə məlumat verilməmişdir.

dTMP sintez yollarının sxematik təqdimatı. TK1, sitozolik timidin kinaz 1 TK2, timidin kinaz 2 TS, timidilat sintaza dCK, deoksisitidin kinaz R1, ribonukleotid reduktaza böyük subunit p53R2, p53 induksiya olunan kiçik subunükleotid reduktaza

TK2 və ya p53R2 çatışmazlığı insanlarda ölümcül miopatiya və/yaxud ensefalomiopatiyaya səbəb olur [15, 16]. Toxuma spesifik mtDNA tükənməsi, həmçinin TK2 H126N yıxılan və TK2 yıxılan siçanlarda, eləcə də p53R2 nokaut siçanlarında müşahidə edilmişdir [16,17,18]. Nukleotid metabolizmasındakı qüsurlar da nüvə genomunun qeyri-sabitliyi və vaxtından əvvəl qocalma ilə əlaqələndirilmişdir [19,20,21].

TK2 və p53R2 çatışmazlığının niyə mtDNA tükənmə sindromlarına (MDS) səbəb olduğunu anlamaq üçün biz böyük yetkin siçovul toxumalarında dTMP sintezində fermentlərin səviyyələrini və paylanmasını öyrəndik. TK2-nin sitozolik izoformu qismən təmizləndi və mitoxondrial TK2-yə əlavə olaraq xarakterizə edildi. TS aktivliyi və TS zülalının səviyyələri, həmçinin p53R2 zülalının səviyyələri müəyyən edilmişdir.


Nəticələr

Biz insanın metabolik şəbəkəsini istiqamətləndirilmiş reaksiya qrafiki kimi təqdim etdik, burada düyünlər enzimatik reaksiyalardır və nəticədə bu reaksiyanı həyata keçirən fermentləri kodlayan genlərlə əlaqələndirilir (bax: Əlavə fayl 1: Şəkil S1 və Əlavə fayl 2: Cədvəl S1) . Düyünlər ortaq metabolitlərlə əlaqələndirilir: əgər fermentativ reaksiyanın məhsulu digərinin substratıdırsa, reaksiyaları təmsil edən düyünlər arasında yönəldilmiş əlaqə yaranır. Enzimatik reaksiyanın əlaqələrinin və ya əlaqələrinin sayı aşağıdakılarla ayrılır: reaksiyamızın substrat kimi qəbul etdiyi metabolitləri əmələ gətirən reaksiyaların sayını təmsil edən daxil olan keçidlər (dərəcədə) və nömrəni təmsil edən gedən bağlantılar (dərəcədən kənar) reaksiyamızın məhsullarını substrat kimi istifadə edən reaksiyalar. Bu reaksiya qrafiki təsviri iki verilənlər bazasına tətbiq edilmişdir: insan metabolizminin ən son genom miqyaslı şəbəkə rekonstruksiyasına, Recon3D [16] və HumanCyc Pathway/Genome verilənlər bazasından fərdi metabolik yollara [5, 17]. Bu iki mənbənin seçilməsi metabolik yolun və onun sərhədlərinin necə müəyyən edilməsi problemi ilə bağlı idi. Genişmiqyaslı şəbəkə bizə qlobal nümunələri çıxarmağa və bioloji proseslər arasında qarşılıqlı əlaqə effektlərini hesablamağa imkan verəcək, çatışmazlıq odur ki, əhəmiyyətli məlumatların hesablama üsulu ilə idarə olunduğunu və metabolik modelləşdirmə üçün uyğun olduğunu nəzərə alsaq, qarşılıqlı əlaqə daha az etibarlı ola bilər. Buna görə də, genetik sübut olmayan, lakin fizioloji sübutu olan və ya modelləşdirmə üçün tələb olunan metabolik reaksiyalar fərqli güvən ballarına daxil edilir [18]. Digər tərəfdən, yüzlərlə kiçik miqyaslı şəbəkələri müqayisə etmək bizə daha asan bioloji şərhlə yerli paylaşılan nümunələri aşkar etməyə imkan verə bilər. Bu araşdırmada əhatə olunmayan ölçü toxumaya məxsus ifadə və ya müəyyən bir inkişaf mərhələsinə görə fərqlərdir. Hüceyrə üçün xüsusi bir model deyil, ümumi metabolizm modelindən istifadə etdiyimiz üçün burada sistemin dinamikası nəzərə alınmır, hətta yüksək metabolik axınlara malik fermentləri kodlayan genlərin təkamülündə daha çox məhdud olduğu məlum olsa da [19]. ]. Bizim yanaşmamız müxtəlif vaxtlarda və ya toxumalarda potensial olaraq fəaliyyət göstərən seçim qüvvələrinin ümumi, təbəqələşdirilmiş təsirlərini ortaya qoyur. Bu səbəbdən, bir toxumaya və ya inkişaf mərhələsinə xas olan təkamül nümunələrini ortaya çıxara bilmir və nəticələrin şərhini və seçim altında olan xüsusi bioloji funksiyanı müəyyən etməyi çətinləşdirə bilər.

Məməlilərdə təmizləyici seçim çox bağlı düyünlərdə daha güclüdür

Qlobal metabolik şəbəkədə təmizləyici seçimin gücü qeyri-sinonim əvəzetmələrin sürəti (dN) və sinonim əvəzetmələrin sürəti (dS) arasındakı nisbət kimi ölçüldü, burada dN/dS-nin aşağı qiymətləri daha güclü təmizləyici seçimi göstərir. Əksər ferment kodlayan genlərin dN/dS dəyəri 0,5-dən aşağıdır, bu da metabolik genlərdə təmizləyici seleksiyanın geniş yayılmasını göstərir (bax. Əlavə fayl 1: Şəkil S2). Protein kodlaşdırma ardıcıllığının (CDS) uzunluğuna, GC məzmununa və kodon meylinə nəzarət edən təkamül təxminlərinə xətti reqressiya tətbiq etməklə və qalıqlardan istifadə etməklə genomik dəyişənləri qarışdırmağın mümkün təsiri nəzərdən keçirilmişdir (bax. Əlavə fayl 1: Şəkil S3). orijinal xalların əvəzinə dəyərlər.Qarışıq dəyişənlərin təsirini aradan qaldırdıqdan sonra, daha çox əlaqəsi olan qovşaqlarda təmizləyici seçimin daha güclü olduğunu görürük (Şəkil 1 və Əlavə fayl 1: Şəkil S4a). Maraqlıdır ki, həddindən artıq yüksək çıxış dərəcəsi olan qovşaqlar dS dəyərlərinin azalması səbəbindən daha az məhdudlaşdırılır (bax. Əlavə fayl 1: Şəkil S4b-c). Eyni şəkildə fərdi metabolik yollarda aşkar edildiyi kimi [5], metabolik şəbəkədə ilk addımları kataliz edən fermentləri kodlayan genlər, aralıq və son mərhələlərdəki reaksiyaları kataliz edənlərə nisbətən daha zəif təmizləyici seçim altındadır (bax. Əlavə fayl 1: Şəkil S5a).

İnsan metabolik şəbəkəsində gen əlaqəsinə qarşı məməlilər arasında təxmin edilən təmizləyici seçimin gücü. Düyünlər 25-ci, 50-ci və 75-ci persentillərdən istifadə etməklə bölündü və genomik dəyişənlərə (CDS uzunluğu, kodon meyli və GC məzmunu) nəzarət edən dN/dS xətti reqressiyasının qalıqlarının orta ± standart xətası hər qrup üçün tərtib edilir. Qruplar arasında qlobal fərqlər Kruskal-Wallis Rank Sum testi ilə qiymətləndirildi. Yüksək əlaqəli genlər daha güclü təmizləyici seçim altındadır

Node bağlantısı müsbət seçimin fəaliyyətinə təsir göstərir

Qlobal metabolik şəbəkədə, nəsillərin hər hansı birində seleksiya hadisələrini aşkar etmək üçün PAML-də (M7/M8) M8 sayt modelini tətbiq etməklə məməlilər arasında müsbət seçim altında 67 gen (metabolik genlərin 3,79%-i) tapdıq. Müsbət seçimin filial-sayt testini tətbiq etməklə (PAML-də Test 2) insan nəslində müsbət seçim altında doqquz gen (0.51%) aşkar etdik (bax. Əlavə fayl 2: Cədvəl S2). Məməlilər arasında müsbət seçim altında olan genlər metabolik genlərin qalan hissəsinə nisbətən fərqli əlaqə nümayiş etdirirlər: onlar müsbət seçmə sübutu olmadan metabolik genlərdən həm aşağı, həm də aşağı dərəcəli fermentləri kodlayırlar (Cədvəl 1). Eynilə, yalnız insan nəslindən seçilən genlər neytral genlərə nisbətən daha aşağı dərəcə göstərir. Həmçinin onların əlaqəsinə əsaslanaraq, şəbəkə daxilində qovşaqların mövqeyini təsnif etdik: məməlilər arasında müsbət seçim altında olan genlər üstünlük olaraq yuxarı mövqelərdə tapılır (dərəcə = 0) (Pearsonun Ki-kvadrat testi, Χ 2 = 1200, səh-dəyər = 0,0005 Əlavə fayl 1: Şəkil S5d). Beləliklə, uzunmüddətli müsbət seçim metabolik proseslərin ilk addımları ilə əlaqəli zəif əlaqəli və ya periferik genlərə üstünlük verdi.

İnsan populyasiyalarında son müsbət seçimi aşkar etmək üçün tam (Tam HB) və natamam selektiv taramalar (Yarımçıq HB) altında olan genləri aşkar etmək üçün İerarxik Artırma (HB) [20] istifadə etdik. İnsan populyasiyalarında, qlobal metabolik şəbəkədə fermentləri kodlayan 1769 gendən biz avropalılarda (CEU) pozitiv seçim altında tam selektiv taramaya malik 13 gen (metabolik genlərin 0,73%-i) və natamam tarama (1,07) olan 19 gen tapdıq. %), və Asiyalılarda (CHB) tam (1,24%) olan 22 gen və natamam selektiv tarama ilə 15 gen (0,85%) (bax Əlavə fayl 2: Cədvəl S2). Sub-Sahara Afrika populyasiyasında (YRI) metabolik genlərdə müsbət seçim siqnalı tapılmadı, lakin YRI-də Hierarxik Artırma tərəfindən aşkar edilən siqnalların azlığı nəzərə alınmaqla bu, gözlənilir [20]. İnsanlarda müsbət seçim altında olan metabolik genlər (həm CEU-da, həm də CHB-də) ferment kodlaşdıran genlərin qalan hissəsindən fərqli əlaqə göstərir (Cədvəl 1). Tam selektiv tarama altında olan genlər, metabolik genlərin qalan hissəsinə nisbətən həm aşağı, həm də aşağı dərəcə ilə zəif əlaqəli fermentləri kodlayır. Lakin natamam selektiv tarama altında olan genlər fərqli bir əlaqə nümunəsi göstərir: onlar hələ də aşağı dərəcəyə malik fermentləri kodlasalar da, orta metabolik gendən daha yüksək səviyyəyə malikdirlər. Beləliklə, tam selektiv tarama altında olan genlər uzunmüddətli müsbət seçimdə aşkar edilənlərə bənzər davranır, natamam tarama altında olanlar isə gedən bağlantılarla yüksək dərəcədə bağlıdır. İnsan populyasiyaları arasında son müsbət seçimin hərəkəti seçilmiş variantın son tezliyindən asılı olaraq dəyişir.

Bağlantı ilə əlaqəli son müsbət seçimin gücünə baxarkən, nümunə mürəkkəbdir (bax Əlavə fayl 1: Şəkil S4d-g). Aşağı əlaqəsi olan genlər, HB-nin yüksək səviyyəli genlərin çox aşağı HB dəyərlərinə malik olduğu CEU-da tam HB istisna olmaqla, daha yüksək əlaqəyə malik genlərdən daha kiçik HB dəyərlərinə malikdirlər. Şəbəkə daxilində qovşağın mövqeyinə gəldikdə, CEU-da aydın xətti tendensiya var. Metabolik şəbəkədə ilk addımlarda iştirak edən genlər HB (Tam və Natamam) dəyərlərinə, aralıq və alt pillələrdə iştirak edən genlərə nisbətən daha aşağıdır, sonuncu pillələrlə əlaqəli genlər isə ən yüksək dəyərlərə malikdir. Biz CHB-də bu tendensiyanı müşahidə etmirik. Aralıq və son mərhələlərdə iştirak edən genlər ilk addımları yerinə yetirən genlərdən daha yüksək HB Complete dəyərlərinə malikdir, lakin aralıq və alt kateqoriyalar arasında heç bir fərq yoxdur. Yol daxilində genin mövqeyindən asılı olaraq CHB-də HB Natamam qiymətləri arasında əhəmiyyətli fərq yoxdur (bax. Əlavə fayl 1: Şəkil S5b). Müvafiq olaraq, biz yalnız CEU-da qovşaq mövqeyinə görə son müsbət seçim altında olan genlərin sayında fərqlər tapırıq: hər ikisi, metabolik şəbəkənin son mərhələlərində fəaliyyət göstərən fermentlər üçün tam və ya natamam selektiv tarama altında olan genlər (Pearsonun Ki-kvadrat testi) , səh-dəyər < 0.05, bax Əlavə fayl 1: Şəkil S5d).

Fərdi metabolik yolların daha kiçik məlumat dəstində biz CEU-da tam selektiv tarama ilə üç gen (fərdi yollardakı metabolik genlərin 0,32%-i) və natamam tarama ilə 10 gen (1,06%) aşkar etdik. CHB-də tam (1,16%) 11 gen və natamam selektiv tarama ilə doqquz gen (0,95%) tapdıq (bax Əlavə fayl 2: Cədvəl S3). Yalnız CHB-də natamam selektiv tarama altında olan genlər metabolik genlərin qalan hissəsinə nisbətən daha aşağı dərəcə dəyərini göstərir (bax. Əlavə fayl 2: Cədvəl S4). Biz CEU-da həm fərdi metabolik yollarda, həm də qlobal şəbəkədə oxşar tendensiya görürük: üst mövqelərdə olan genlər aralıq və ya aşağı mövqelərdə olan genlərə nisbətən tam HB-nin daha kiçik dəyərlərinə malikdir (bax. Əlavə fayl 1: Şəkil S5c). Bununla belə, qovşaq mövqeyinə görə müsbət seçim altında olan genlərin sayında fərq tapmırıq.

Bütün metabolik funksiyalar eyni seçici təzyiq altında deyil

Fərdi metabolik yollar maddələr mübadiləsinin üç qatlı sistem kimi qlobal görünüşünə əsaslanaraq əsas metabolik funksiyalarına görə qruplaşdırıla bilər [5]: i) Daxili nüvə (qlikoliz / trikarboksilik turşu dövrü / pentoza fosfat və polisaxaridlər), ii) aralıq. (Membran Lipidləri, Nukleotid, Yağ Turşusu / Triasilgliserid, Kofaktor, Yağ Turşusu / Hormon və Amin turşusu) və iii) Xarici (Steroid, İkincil Metabolizm və Detoksifikasiya). Qruplar arasında təkamül ölçülərindəki fərqləri müqayisə etdik (Şəkil 2). Daxili nüvəyə aid olan yollar, Tam HB-də daha güclü bir tendensiya ilə digər təbəqələrə nisbətən daha yüksək HB xallarına malikdir. Bununla belə, biz yalnız CHB-də kateqoriyalar arasında müsbət seçim altında olan genlərin sayında fərqlər tapırıq, burada aralıq və xarici təbəqələrdə natamam selektiv tarama altında gözləniləndən daha çox gen var (Pearsonun Ki-kvadrat testi, Χ 2 = 6.6, səh-qiymət = 0,04).

İnsanlarda son seçim və metabolik funksiyalar arasında əlaqə. Fərdi metabolik yollar [5]-də təsvir olunduğu kimi üç qatlı sistem kimi metabolizmin qlobal görünüşü əsasında təsnif edilmişdir. Genomik dəyişənlərə (CDS uzunluğu, kodon meyli və GC məzmunu) nəzarət edən İyerarxik Artırma (HB) ballarının xətti reqressiyasının qalıqlarının orta ± standart xətası hər bir kateqoriya üçün tərtib edilmişdir. a) CEU-da tam HB balları, b) CEU-da natamam HB balları, c) CHB-də HB ballarını tamamlayın və d) CHB-də natamam HB balları. Daxili nüvə: qlikoliz / trikarboksilik turşu dövrü / pentoza fosfat və polisaxaridlər Ara: membran lipidləri, nukleotid, yağ turşusu / triasilgliserid, kofaktor, yağ turşusu / hormon və amin turşusu Xarici: steroid, ikincil metabolizm. Cüt şəkildə səh-dəyərlər FDR tərəfindən tənzimlənir (ns: səh > 0,05 *: səh < = 0,05 **: səh < = 0,01 ***: səh < = 0,001 ****: səh < = 0,0001)

Fərdi yollara bənzər şəkildə, qlobal şəbəkə daxilində müsbət seçim altında genlərlə zənginləşdirilmiş hər hansı funksional yolun olub olmadığını hesabladıq. Lipid metabolizması (yağ turşularının oksidləşməsi, qliserofosfolipidlərin mübadiləsi, xolesterol və öd turşularının mübadiləsi) və membran nəqli ilə bağlı metabolik funksiyalar müsbət seçilmiş genlərlə zənginləşdirilmişdir (Pearsonun Ki-kvadrat testi, bütün testlərdə p-qiyməti < 0,05, Əlavə fayl 1-ə baxın) : Şəkil S6). Bütün bu proseslər funksional olaraq bir-birinə bağlıdır, çünki onlar lipidlərin daşınmasında və istifadəsində, həmçinin membranın axıcılığı və keçiriciliyində iştirak edirlər.

Gözlənildiyi kimi, metabolik şəbəkədə genlər və fermentativ reaksiyalar arasında tək-tək xəritələşmə yoxdur: genlərin 61,60%-i birdən çox reaksiyada iştirak edən fermentləri kodlayır və orta hesabla bir gen 7,44 reaksiyada iştirak edir (bax. Əlavə fayl 1: Şəkil S7). Bir genin funksiyalarının sayı və ya gen tərəfindən kodlanmış ferment(lər) tərəfindən həyata keçirilən enzimatik reaksiyaların sayı molekulyar gen pleiotropiyasının ölçüsüdür [21]. Müsbət seleksiya altında olan genləri metabolik genlərin qalan hissəsi ilə müqayisə edərkən, müsbət seçilmiş genlər tərəfindən kodlaşdırılmış fermentlər tərəfindən həyata keçirilən fermentativ reaksiyaların sayında, istər növlərarası, istərsə də intraspesifik səviyyədə fərqlər tapmırıq (Permutasiya testi, səh-bütün müqayisələrdə dəyər > 0,05).


Müzakirə

Gen ailəsinin üzvləri müxtəlif toxuma, inkişaf və ya ətraf mühitə xas ifadə nümunələrinə malik ola bilər. istifadə edərək GLO düyü genomunda mövcud olan gen ailəsi [15, 24], dörd düyü olduğunu göstəririk. GLO genlər müxtəlif toxumalarda və düyü bitkisinin inkişaf mərhələlərində (şəkil 1a və b), həmçinin stresslərə cavab olaraq (şəkil 1c) fərqli şəkildə ifadə olunur. Əldə etdiyimiz tapıntıların fizioloji rollarının olduğunu göstərir GLO genlər lazımsız deyil, bununla belə, düyünün dəqiq bioloji əhəmiyyəti GLO gen ailəsinin əlavə araşdırmaya ehtiyacı var.

Ümumiyyətlə, fərqli ifadə nümunələrinə malik olan gen ailəsi üzvləri müxtəlif fermentativ xüsusiyyətlərə və fizioloji rollara malik müxtəlif izozimləri kodlayır [21, 28]. Bitkilərdə GLO ilk dəfə ispanaqdan təmizlənmiş [29, 30], ispanaq GLO-nun (SpGLO) ilkin strukturu yalnız bir vahid peptiddən ibarət olan peptid ardıcıllığı ilə müəyyən edilmişdir [31] və onun K m qlikolatın 0,38 mM olduğu müəyyən edilmişdir [32]. GLO da təcrid edilmişdir Parthenium histerophorusPisum sativum, hər ikisi iki fərqli peptiddən ibarət idi. The K m (qlikolat) -nin Parthenium histerophorus GLO 0,2 mM və odur Pisum sativum GLO 0,3 mM-dir [33]. Bununla belə, bitkilərdə hər bir GLO izoziminin fermentativ xüsusiyyətləri nadir hallarda müqayisəli təhlil edilir. Ərəbidopsis beş GLO üzvü var, i. e. GOX1, GOX2, GOX3, HAOX1 və HAOX2 [4, 34], yalnız GOX1, GOX2 və GOX3 heteroloji olaraq ifadə edilmiş və təmizlənmişdir. E.coli, müvafiq olaraq. Bu təmizlənmiş fermentlərin fermentativ analizləri göstərdi ki, onların hamısının qlikolata yüksək yaxınlığı var, lakin fərqli xüsusiyyətlərə malikdir. K m dəyərlər. Bundan əlavə, GOX3 L-laktat üçün yüksək katalitik effektivliyə malikdir [22]. Bu işdə biz bütün düyü GLO izozimlərinin enzimatik xüsusiyyətlərini müqayisəli şəkildə araşdırdıq. GLO1 + 4, substrat kimi qlikolatdan istifadə edərək ən yüksək katalitik səmərəliliyi göstərdi, ardından müvafiq olaraq GLO1 və GLO4 (Şəkil 2b Cədvəl 1 və Əlavə fayl 3). Həqiqətən, yuxarı tənzimlənmiş və ya ləğv edilmiş GLO1 və ya GLO4 olan transgen düyü bitkiləri müvafiq olaraq daha yüksək və ya daha aşağı GLO aktivliyi nümayiş etdirdi. Əvvəlki tədqiqatlarımız həmçinin GLO1 və GLO4 yuxarı tənzimlənən və ya aşağı tənzimlənən transgenik xətlərdə fenotiplərin dəyişdirildiyini müşahidə etdi [4, 5]. Bunun əksinə olaraq, GLO3 və GLO5 yuxarı tənzimlənən və ya RNAi düyü xətlərində GLO fəaliyyəti və fenotiplərində heç bir dəyişiklik olmadı (Şəkil 3a Şəkil 4). Bundan əlavə, GLO izozimlərinin zimoqramma analizi düyü yarpaqlarında GLO izozimlərinin GLO1 və GLO4 alt bölmələrindən ibarət olduğunu (Şəkil 3b və c) və GLO1-in düyü yarpaqlarında GLO4-dən daha çox olduğunu təsdiqlədi (Şəkil 3b). Əvvəlki nəticələrimizlə [24] birlikdə belə nəticəyə gəlmək olar ki, GLO1, GLO4 və GLO1+4 düyüdə fototənəffüs üçün GLO izozimləridir. Bundan əlavə, bu tədqiqat GLO1 + 4 və GLO1-in GLO4-ə nisbətən qlikolat oksidləşməsində daha yüksək katalitik effektivliyə malik olduğunu aşkar etdi (Şəkil 2a və b Cədvəl 1). Buna görə də, GLO1-in GLO fəaliyyətinə və nəticədə fotonəfəs almaya və əlaqəli H2O2 istehsal.

GLO3 düyü homoloqudur Ərəbidopsis GOX3. Bu yaxınlarda GOX3 in Ərəbidopsis Normoksik şəraitdə köklərdə L-laktat səviyyəsinin aşağı səviyyədə saxlanılması üçün L-laktat oksidazı kimi fəaliyyət göstərir [22]. Müşahidə etdik ki, düyü GLO3 də L-laktatın piruvata oksidləşməsini effektiv şəkildə kataliz edə bildi (Şəkil 2b Cədvəl 1). Əvvəlki nəticələrimiz bunu göstərdi GLO3 əsasən köklərdə ifadə edilir [15, 24], lakin gözlənilmədən yabanı tipli düyü köklərində heç bir GLO fəaliyyəti aşkar edilmədi (Əlavə fayl 7). Bundan əlavə, GLO3 həddindən artıq ifadəli düyü bitkilərinin L-laktat toksikliyinə qarşı heç bir təkmil müqavimət göstərmədiyini gördük (Əlavə fayl 6). Bu, ilə uyğun gəlmirdi Ərəbidopsis L-laktat toksikliyinə daha dözümlü olduğu nümayiş etdirilən GOX3 həddindən artıq ekspressiya bitkiləri [22]. Yarımsu bitkisi kimi düyü buğda, kartof və Ərəbidopsis [35,36,37,38], bu da GLO3-ün düyüdə laktat toksikliyi ilə əlaqəli olmadığını izah edə bilər. Ərəbidopsis [22].

GLO-nun əsas metabolik rolu yaxşı bilinsə də, fizioloji funksiyası hələ də yaxşı başa düşülməyib. Rojas və başqaları. (2012) hər bir GLO izoziminin ev sahibi olmayan xəstəliklərə qarşı müqavimətdə fərqli rol oynadığını irəli sürdü. Ərəbidopsis [16]. Daha yeni bir araşdırma göstərdi ki, Ərəbidopsis GOX1 və GOX2 oksidləşdirici stresslə əlaqəli hüceyrə ölümündə fərqli rol oynamışdır [23]. GLO-nun zülalların bərpası reaksiyaları və salisilik turşunun siqnal yolu kimi bəzi digər bioloji proseslərdə də iştirak etdiyi bildirilmişdir [39, 40]. Daha maraqlısı odur ki, son tədqiqatlar fotorespirator H2O2 və auksin [41, 42]. GLO fəaliyyətinin H. ilə sıx əlaqəli olduğunu gördük2O2 düyü yarpaqlarında səviyyələr (Əlavə fayl 5) və beləliklə, GLO aşağı tənzimlənən düyü xətlərinin cırtdanlıq fenotipi auksin siqnalı ilə əlaqəli morfoloji aberasiya ola bilər [43, 44]. Buna baxmayaraq, bizim əvvəlki işimiz göstərdi ki, GLO-nun bastırılması fotosintezi maneə törədən qlioksilatın yığılmasına səbəb ola bilər [5], buna görə də cırtdanlıq fenotipinin inhibe edilmiş fotosintezdən qaynaqlanması da mümkündür. Buna görə də, hər bir GLO izozim düyüdəki bu müxtəlif bioloji proseslərdə fərqli fizioloji funksiyalar nümayiş etdirə bilər, lakin potensial mexanizmləri aydınlaşdırmaq üçün daha birbaşa eksperimental sübutlara ehtiyac var.


CH450 və CH451: Biokimya - Molekulyar Səviyyədə Həyatın Müəyyənləşdirilməsi

6.1 Fermentlərin təbiəti və təsnifatı

6.2 Fermentlərin adları və təsnifatı

6.3 Fermentin strukturu və substratın bağlanması

6.4 Fermentlər və reaksiya tarazlığı

6.5 Fermentlərin xassələri və təsir mexanizmləri

6.6 Fermentlər pH və temperaturdan təsirlənir

6.7 Fermentlər İnhibitorlara Həssasdır

6.8 Allosterik tənzimləyicilər və fermentlərin fəaliyyətinə nəzarət

6.9 Fermentlərin mənşəyi, təmizlənməsi və istifadəsi

6.10 Sənaye enzimologiyası

6.11 İstinadlar

6.1 Fermentlərin təbiəti və təsnifatı

Fermentlər canlı orqanizmlərdə biokimyəvi reaksiyaları sürətləndirən bioloji katalizatorlardır (biokatalizatorlar kimi də tanınır). Onlar həmçinin hüceyrələrdən çıxarıla və sonra kommersiya baxımından əhəmiyyətli proseslərin geniş spektrini kataliz etmək üçün istifadə edilə bilər. Məsələn, şirinləşdirici maddələrin istehsalında və antibiotiklərin modifikasiyasında mühüm rola malikdirlər, yuyucu tozlarda və müxtəlif təmizləyici məhsullarda istifadə olunur və klinik, məhkəmə və ekoloji tətbiqləri olan analitik cihazlarda və analizlərdə əsas rol oynayırlar. "Ferment" sözü ilk dəfə 1878-ci ildə alman fizioloqu Vilhelm Kühne tərəfindən mayanın şəkərdən spirt istehsal etmə qabiliyyətini təsvir edərkən istifadə edilmişdir və yunanca en ("daxili" deməkdir) və zume (məna) sözlərindən əmələ gəlmişdir. 'Maya').

On doqquzuncu əsrin sonu və iyirminci əsrin əvvəllərində bir çox fermentlərin çıxarılması, xarakteristikası və kommersiya məqsədli istismarı sahəsində əhəmiyyətli irəliləyişlər əldə edildi, lakin katalitik fəaliyyətin zülal molekulları ilə əlaqəli olduğunu üzə çıxaran fermentlər yalnız 1920-ci illərdə kristallaşdı. Sonrakı 60 il ərzində bütün fermentlərin zülal olduğuna inanılırdı, lakin 1980-ci illərdə bəzi ribonuklein turşusu (RNT) molekullarının da katalitik təsir göstərə bildiyi məlum oldu. Ribozim adlanan bu RNT-lər gen ifadəsində mühüm rol oynayır. Eyni onillikdə biokimyaçılar katalitik xüsusiyyətlərə malik olan antikorlar yaratmaq texnologiyasını da inkişaf etdirdilər. Bu “abzimlər” həm yeni sənaye katalizatorları, həm də terapevtiklər kimi əhəmiyyətli potensiala malikdir. Bu görkəmli istisnalara baxmayaraq, klassik enzimologiyanın çox hissəsi və bu essenin qalan hissəsi katalitik aktivliyə malik zülallara yönəldilmişdir.

Katalizatorlar olaraq fermentlər yalnız çox aşağı konsentrasiyalarda tələb olunur və reaksiya zamanı özləri istehlak edilmədən reaksiyaları sürətləndirirlər. Biz adətən fermentləri substrat molekullarının məhsul molekullarına çevrilməsini kataliz edə bilən kimi aşağıdakı kimi təsvir edirik:

Fermentlər güclü katalizatorlardır.

Fermentlərin nəhəng katalitik fəaliyyəti, bəlkə də, ən yaxşı şəkildə bir sabit ilə ifadə edilə bilər. kpişik, ki, müxtəlif cür adlandırılır dövriyyə sürəti, dövriyyə tezliyi və ya dövriyyə nömrəsi. Bu sabit vahid vaxtda (adətən dəqiqədə və ya saniyədə) bir ferment molekulu tərəfindən məhsula çevrilə bilən substrat molekullarının sayını göstərir. Dövriyyə dərəcəsi qiymətlərinin nümunələri Cədvəl 6.1-də verilmişdir. Məsələn, bir karbon anhidraz molekulu onun substratlarının, karbon dioksidin (CO) yarım milyondan çox molekulunun çevrilməsini kataliz edə bilər.2) və su (H2O), məhsula, bikarbonat (HCO3 − ), hər saniyə—həqiqətən əlamətdar nailiyyət.

Fermentlər xüsusi katalizatorlardır

Fermentlər yüksək güclü katalizator olmaqla yanaşı, həm də diqqətəlayiq spesifikliyə malikdirlər ki, onlar ümumiyyətlə yalnız bir növ substrat molekulunun (və ya ən çoxu bir sıra oxşar növlərin) məhsul molekullarına çevrilməsini katalizləyirlər. Bəzi fermentlər qrup spesifikliyini nümayiş etdirir. Məsələn, qələvi fosfataza (ferment kinetikasına dair birinci il laboratoriya seanslarında tez-tez rast gəlinən bir ferment) bir fosfat qrupunu müxtəlif substratlardan çıxara bilər.

Digər fermentlər daha yüksək spesifiklik nümayiş etdirirlər ki, bu da mütləq spesifiklik kimi təsvir olunur. Məsələn, qlükoza oksidaz substratı, β-D-qlükoza üçün demək olar ki, tam spesifiklik göstərir və digər monosaxaridlərlə praktiki olaraq heç bir fəaliyyət göstərmir. Daha sonra görəcəyimiz kimi, bu spesifiklik mürəkkəb qarışıqda (məsələn, qan və ya sidik nümunəsi) xüsusi substratı (məsələn, qlükoza) ölçən bir çox analitik analizlərdə və cihazlarda (biosensorlarda) böyük əhəmiyyət kəsb edir.

Cədvəl 6.1 Geniş Dəyişiklik Göstərən Bəzi Ümumi Fermentlərin Dövretmə Faizləri

Yuxarıya qayıt

6.2 Fermentlərin adları və təsnifatı

Fermentlərin adətən ‘-ase’ şəkilçisi (məsələn, oksidaza, dehidrogenaz, karboksilaza) ilə katalizlədikləri reaksiyaya istinad edən ümumi adları (çox vaxt “xırda adlar” adlanır) olur, baxmayaraq ki, fərdi proteolitik fermentlər ümumiyyətlə & şəkilçisinə malikdir. #8216-in’ (məsələn, tripsin, kimotripsin, papain). Çox vaxt mənasız ad fermentin fəaliyyət göstərdiyi substratı da göstərir (məsələn, qlükoza oksidaz, spirt dehidrogenaz, piruvat dekarboksilaza). Bununla belə, bəzi mənasız adlar (məsələn, invertaz, diastaza, katalaza) substrat, məhsul və ya iştirak edən reaksiya haqqında az məlumat verir.

Fermentlərin artan mürəkkəbliyi və adlarının uyğunsuzluğu səbəbindən Beynəlxalq Biokimya Birliyi bu problemi həll etmək üçün Ferment Komissiyası yaratdı. İlk Ferment Komissiyası Hesabatı 1961-ci ildə nəşr olundu və fermentlərin adlandırılmasına sistemli bir yanaşma təqdim etdi. 1992-ci ildə nəşr olunan altıncı nəşrdə 3200-ə yaxın müxtəlif fermentin təfərrüatları var idi və hər il nəşr olunan əlavələr indi bu rəqəmi 5000-dən çox artırdı.

Bu sistem daxilində bütün fermentlər dörd hissəli Enzim Komissiyası (EC) nömrəsi ilə təsvir edilir. Məsələn, laktat dehidrogenazın mənasız adı olan fermentin EC nömrəsi 1.1.1.27 var və daha düzgün olaraq l-laktat adlanır: NAD + oksidoreduktaza. EC nömrəsinin birinci hissəsi fermentin kataliz etdiyi reaksiyaya aiddir (Cədvəl 6.2). Qalan rəqəmlər birinci rəqəmlə müəyyən edilən reaksiyanın təbiətinə görə fərqli mənalara malikdir. Məsələn, oksidoreduktaza kateqoriyasında ikinci rəqəm hidrogen donorunu (Cədvəl 6.3), üçüncü rəqəm isə hidrogen qəbuledicisini bildirir (Cədvəl 6.4). Beləliklə, EC nömrəsi 1.1.1.27 olan laktat dehidrogenaz hidrogen donoru (ikinci rəqəm) kimi laktat molekulunun spirt qrupu və hidrogen qəbuledicisi (üçüncü rəqəm) kimi NAD+ olan oksidoreduktazadır (birinci rəqəmlə göstərilir) və bu qrupa aid edilən 27-ci ferment (dördüncü rəqəm).

Cədvəl 6.2 Fermentlərin təsnifatı: AK sistemində fermentlərin əsas sinifləri

Cədvəl 6.3 Fermentlərin təsnifatı: AK sistemində oksidoreduktazaların ikinci dərəcəli sinifləri

Cədvəl 6.4 Fermentlərin təsnifatları: AK sistemində oksidoreduktazaların üçüncü dərəcəli sinifləri

Xoşbəxtlikdən, Ferment Nomenklaturası Məlumat Bazasından (http://enzyme.expasy.org saytında mövcuddur) istifadə edərək, hər hansı bir ferment üçün bu məlumatı tapmaq indi çox asandır.

Yuxarıya qayıt

6.3 Fermentin strukturu və substratın bağlanması

Amin turşusu əsaslı fermentlər ölçüləri 100-dən az ilə 2000-dən çox amin turşusu qalığı arasında dəyişən qlobular zülallardır. Bu amin turşuları bir və ya daha çox polipeptid zəncirləri şəklində düzülə bilər ki, onlar qatlanmış və bükülmüş spesifik üçölçülü struktur yaratmaq üçün substratın faktiki olaraq bağlandığı aktiv sahə kimi tanınan kiçik bir sahəni özündə birləşdirir (Şəkil 6.1). Aktiv sahə yalnız az sayda (10-dan az) tərkib amin turşularını əhatə edə bilər. Məhz aktiv sahənin forma və yük xassələri ona bir növ substrat molekuluna bağlanmağa imkan verir, beləliklə, ferment öz katalitik fəaliyyətində əhəmiyyətli spesifiklik nümayiş etdirə bilir.

Fermentin spesifikliyinin substratın və onun aktiv sahəsinin tamamlayıcı təbiətindən irəli gəldiyi fərziyyəsi ilk dəfə 1894-cü ildə alman kimyaçısı Emil Fişer tərəfindən irəli sürüldü və Fişerin “kilit və açar hipotezi” kimi tanındı, burada yalnız düzgün ölçülü və forma (substrat) kilidin (fermentin) açar dəliyinə (aktiv yer) uyğun gəlir. Təəccüblüdür ki, bu nəzəriyyə fermentlərin zülal olduğunun belə müəyyən edilmədiyi bir dövrdə irəli sürüldü.

Şəkil 6.1 Enzim Molekulunun Aktiv Sahəsinə Substrat Bağlanmasının Təqdimatı.

X-ray kristalloqrafiyası kimi üsullarla fermentlərin quruluşu haqqında daha çox öyrənildikcə fermentlərin sərt strukturlar olmadığı, əslində olduqca çevik formada olduqları aydın oldu. Bu tapıntının işığında, 1958-ci ildə Daniel Koshland Fişerin fikirlərini genişləndirdi və substratın və fermentin bağlanmasının "induksiya edilmiş uyğun modelini" təqdim etdi, burada ferment molekulu substratın bağlanmasına uyğunlaşmaq üçün şəklini bir qədər dəyişdirir. Tez-tez istifadə edilən bənzətmə "əllə əlcək modeli"dir, burada əl və əlcək geniş şəkildə bir-birini tamamlayır, lakin mükəmməl uyğunluğu təmin etmək üçün əlcək taxılarkən əlin ətrafında qəliblənir.

Substrata bağlanan tək aktiv sahə olduğundan, zülal molekulunun qalan hissəsinin rolunun nə olduğunu soruşmaq məntiqlidir. Sadə cavab ondan ibarətdir ki, o, aktiv sahəni sabitləşdirmək və sahənin substrat molekulu ilə qarşılıqlı əlaqəsi üçün müvafiq mühit təmin etmək üçün fəaliyyət göstərir. Buna görə də, aktiv sahəni katalitik fəaliyyətini itirmədən zülalın qalan hissəsindən ayırmaq mümkün deyil, baxmayaraq ki, laboratoriya əsaslı istiqamətləndirilmiş (və ya məcburi) təkamül tədqiqatları bəzən aktivliyi saxlayan daha kiçik fermentlər yaratmaq mümkün olduğunu göstərmişdir. Fermentin digər bölgələri də 8-ci Fəsildə daha ətraflı müzakirə ediləcək ferment fəaliyyətinin tənzimlənməsində iştirak edə bilər.

Qeyd etmək lazımdır ki, çoxlu sayda fermentlər yalnız zülaldan ibarət olsa da, bir çoxunda protein olmayan komponent də var. kofaktor, bu fermentin katalitik fəaliyyəti üçün lazımdır. Kofaktor başqa bir üzvi molekul ola bilər, bu halda ona a deyilir koenzim, və ya qeyri-üzvi molekul, adətən dəmir, manqan, kobalt, mis və ya sink kimi bir metal ionu ola bilər. Zülalla sıx və daimi birləşən koenzim ümumiyyətlə adlanır protez qrupu fermentdən. Bir fermentin fəaliyyəti üçün bir kofaktor tələb olunduqda, qeyri-aktiv zülal komponenti ümumiyyətlə ferment adlanır. apoenzim, və apoenzim plus kofaktor (yəni aktiv ferment) adlanır. holoenzim(Şəkil 6.2). İnsan pəhrizində minerallara və vitaminlərə olan ehtiyac qismən onların kofaktorlar və koenzimlər kimi maddələr mübadiləsində rolu ilə əlaqədardır.

Şəkil 6.2 Holofermentin komponentləri

Yuxarıya qayıt

6.4 Fermentlər və reaksiya tarazlığı

Fermentlər Reaksiya Faizlərini Gücləndirir

Fermentlər necə işləyir? Bu sualın geniş cavabı ondan ibarətdir ki, onlar ETMƏYİN reaksiyanın tarazlığını (yəni termodinamikasını) dəyişdirmək. Bunun səbəbi, fermentlərin məhsulların və reagentlərin strukturunu və enerjisini əsaslı şəkildə dəyişdirmir, əksinə, reaksiya tarazlığının daha sürətli əldə edilməsinə imkan verir. Buna görə də gəlin kimyəvi tarazlıq anlayışını aydınlaşdırmaqla başlayaq. Bir çox hallarda reaksiyanın tarazlığı çox “sağda” olur, yəni faktiki olaraq bütün substrat (S) məhsula (P) çevrilir. Bu səbəbdən reaksiyalar çox vaxt belə yazılır

Bu, sadələşdirmədir, çünki bütün hallarda bu reaksiyanı aşağıdakı kimi yazmaq daha düzgündür:

Bu, tarazlığın mövcudluğunu göstərir. Bu konsepsiyanı başa düşmək üçün tarazlıq nöqtəsinin olduqca mərkəzi olduğu bir reaksiyaya baxmaq bəlkə də ən faydalıdır. Misal üçün:

Bu reaksiyada 1 M qlükoza məhlulu ilə başlasaq və fermenti əlavə etsək, başa çatdıqdan sonra təxminən 0,5 M qlükoza və 0,5 M fruktoza qarışığına sahib olacağıq. Bu xüsusi reaksiyanın tarazlıq nöqtəsidir. Hazırkı fermentlə bu son nöqtəyə çatmaq cəmi bir neçə saniyə çəksə də, əslində qlükozanı məhlulun içinə qoysaq və fermentin yoxluğunda reaksiyanın baş verməsini aylarla gözləsək, eyni nöqtəyə gələrik. . Maraqlıdır ki, biz də bu reaksiyanı 1M fruktoza məhlulu ilə başlaya bilərdik və o, eyni tarazlıq nöqtəsinə çatana qədər əks istiqamətdə davam edərdi.

Bu reaksiya üçün tarazlıq nöqtəsi tarazlıq sabiti ilə ifadə edilir, Kek, göstərildiyi kimi:

Beləliklə, mərkəzi tarazlıq ilə reaksiya üçün, Kek = 1, tarazlıq üçün 'sağa', Kek >1 və tarazlıq üçün 'sola' Kek< 1-dir. Deməli, reaksiyanın a Kek dəyəri 10 6 , tarazlıq çox sağdadır və onu tək ox kimi işarələməklə sadələşdirmək olar. Biz tez-tez bu cür reaksiyanı “tamamlamaq” kimi təsvir edə bilərik. Əksinə, bir reaksiya varsa Kek dəyəri 10 −6 olarsa, tarazlıq çox soldadır və bütün praktik məqsədlər üçün onun ümumiyyətlə davam etməsi nəzərdə tutulmayacaqdır.

Qeyd etmək lazımdır ki, reaktivlərin konsentrasiyası tarazlıq nöqtəsinə heç bir təsir göstərməsə də, pH və temperatur kimi ətraf mühit amilləri tarazlığın mövqeyinə təsir edə bilər və təsir edir. Onu da qeyd etmək lazımdır ki, baş verən hər hansı biokimyəvi reaksiya, in vivo, canlı sistemdə təcrid olaraq deyil, metabolik yolun bir hissəsi kimi baş verir ki, bu da reaktivlər və reaksiyalar arasındakı əlaqəni konseptual şəkildə təsəvvür etməyi çətinləşdirir. In vivo, reaksiyaların tarazlıq vəziyyətinə keçməsinə icazə verilmir. Əgər onlar baş versəydilər, reaksiya mahiyyətcə dayanacaq (yəni, irəli və tərs reaksiyalar bir-birini tarazlayacaq) və yolda xalis axın olmayacaqdı. Bununla belə, bir çox mürəkkəb biokimyəvi yollarda fərdi reaksiya mərhələlərinin bəziləri tarazlığa yaxındır, digərləri isə tarazlıqdan uzaqdır, sonuncular (tənzimləyici fermentlər tərəfindən katalizlənir) yol boyunca materialların ümumi axınına nəzarət etmək üçün ən böyük imkanlara malikdir.

Fermentlər Substratları ilə Komplekslər əmələ gətirirlər

Biz tez-tez ferment katalizli reaksiyanı üç mərhələdən keçərək aşağıdakı kimi təsvir edirik:

ES kompleksi substratın (S) fermentə (E) bağlandığı bir mövqeyi təmsil edir ki, reaksiya (nə olursa olsun) daha əlverişli olsun. Reaksiya baş verən kimi, məhsul molekulu (P) fermentdən ayrılır, sonra başqa bir substrat molekuluna bağlanmaq üçün sərbəstdir. Bu proses zamanı müəyyən bir nöqtədə substrat aralıq formaya (çox vaxt keçid vəziyyəti adlanır) və sonra məhsula çevrilir. Fermentin reaksiya sürətini artırmaq üçün hərəkət etdiyi dəqiq mexanizm bir sistemdən digərinə fərqlənir və 7-ci fəslin mövzusudur. Bununla belə, ümumi prinsip odur ki, substratın fermentə bağlanması ilə substratın iştirakı ilə reaksiya baş verir. reaksiyanın aktivləşmə enerjisini aşağı salmaqla daha əlverişli hala gətirilir.

Enerji baxımından reaksiyalar ya ekzerqonik (enerji buraxan) və ya enderqonik (enerji istehlak edən) ola bilər. Bununla belə, hətta ekzerqonik reaksiyada reaksiyaya 'başlanğıc' vermək üçün aktivləşmə enerjisi adlanan kiçik bir enerji tələb olunur. Yaxşı bir bənzətmə, başında enerji ilə zəngin olan bir kibritlə bənzətmədir. kimyəvi maddələr (fosfor sesquisulfid və kalium xlorat). Kibrit yandıqda, əhəmiyyətli miqdarda işıq və istilik enerjisi buraxır (O ilə ekzerqonik reaksiya verir).2 havada). Bununla belə, və bəlkə də xoşbəxtlikdən, kibrit öz-özünə alovlanmayacaq, əksinə reaksiyaya başlamaq üçün sürtünmə nəticəsində yaranan istilik şəklində kiçik bir enerji girişi (yəni kibrit vurması) lazımdır. Əlbəttə ki, kibrit vurulduqdan sonra ayrılan enerjinin miqdarı əhəmiyyətlidir və vurma prosesi zamanı verilən kiçik enerjini xeyli üstələyir.

Şəkil 6.3-də göstərildiyi kimi, fermentlərin keçid vəziyyətinin əmələ gəlməsini enerji baxımından asanlaşdırmaqla sistemin aktivləşmə enerjisini aşağı salması hesab edilir. Bir ferment katalizatorunun iştirakı ilə keçid vəziyyətinin formalaşması enerji baxımından daha əlverişlidir (yəni, "təpik başlanğıcı" üçün daha az enerji tələb edir), bununla da reaksiyanın davam edəcəyi sürəti sürətləndirir, lakin enerji səviyyələrini əsaslı şəkildə dəyişdirmir. ya reaktivdən, ya da məhsuldan.

Şəkil 6.3 (a) katalizlənməmiş və (b) fermentlə katalizlənmiş reaksiya olduğu reaksiyanın başlaması üçün lazım olan aktivləşmə enerjisinin azaldılmasına fermentin təsiri.

Yuxarıya qayıt

6.5 Fermentlərin xassələri və təsir mexanizmləri

Ferment Kinetikası

Fermentlərin kinetikası fermentlə katalizləşən reaksiyaların sürətini təyin edən amillərin öyrənilməsidir. O, tələbələrlə ilk dəfə qarşılaşdıqda onları çaşdıra biləcək bəzi riyazi tənliklərdən istifadə edir. Bununla belə, kinetik nəzəriyyə həm məntiqli, həm də sadədir və fermentlərin həm maddələr mübadiləsində, həm də biotexnologiyada rolunu qiymətləndirə bilmək üçün bu mövzuya dair anlayışı inkişaf etdirmək vacibdir.

Ferment fəaliyyətinin təhlilləri (ölçmələri) ya fasiləsiz, həm də davamlı şəkildə həyata keçirilə bilər. Fasiləsiz üsullar substrat və fermentin birlikdə qarışdırılmasını və müəyyən bir müddətdən sonra əmələ gələn məhsulun ölçülməsini nəzərdə tutur, buna görə də bu üsullar ümumiyyətlə asan və tez yerinə yetirilir. Ümumiyyətlə, sistem haqqında az şey bildiyimiz (və ilkin araşdırmalar apardığımız zaman) və ya alternativ olaraq sistem haqqında çox şey bildiyimiz və seçdiyimiz vaxt intervalının uyğun olduğuna əmin olduğumuz zaman belə fasiləsiz analizlərdən istifadə edərdik.

Davamlı ferment analizlərində biz ümumiyyətlə fermenti substratla qarışdırmaqla və məhsulun zamanla görünüşünü davamlı olaraq ölçməklə fermentlə katalizlənmiş reaksiyanın sürətini öyrənirik. Əlbəttə ki, substratın zamanla yox olmasını ölçməklə reaksiyanın sürətini eyni dərəcədə yaxşı ölçə bilərik. Həqiqi istiqamətdən başqa (biri artan və biri azalan), iki dəyər eyni olacaq. Ferment kinetik təcrübələrində rahatlıq üçün biz çox vaxt süni substratdan istifadə edirik. xromogen Bu, parlaq rəngli məhsul verir, reaksiyanı kolorimetr və ya spektrofotometrdən istifadə edərək izləməyi asanlaşdırır. Bununla belə, biz faktiki olaraq məhsulun və ya substratın konsentrasiyasını ölçmək qabiliyyətinə malik olan hər hansı mövcud analitik avadanlıqdan istifadə edə bilərik.

Demək olar ki, bütün hallarda qarışığa bufer məhlulu da əlavə edərdik. Görəcəyimiz kimi, ferment aktivliyi pH-dan güclü şəkildə təsirlənir, buna görə də pH-ı müəyyən bir dəyərdə təyin etmək və təcrübə boyu sabit saxlamaq vacibdir. İlk ferment kinetik təcrübəmiz buna görə də substrat məhlulunun (xromogen) bufer məhlulu ilə qarışdırılmasını və fermentin əlavə edilməsini əhatə edə bilər. Bu qarışıq sonra spektrofotometrə yerləşdiriləcək və rəngli məhsulun görünüşü ölçüləcəkdir. Bu, Şəkil 6.4-də göstərildiyi kimi, bir neçə saniyə və ya dəqiqədən sonra yavaşlamağa başlaya bilən sürətli reaksiyanı izləməyə imkan verəcəkdir.

Şəkil 6.4 Zamana Qarşı Planlaşdırılan Ferment-Katalizli Reaksiyada Məhsulun əmələ gəlməsi.

Reaksiya sürətinin (sürətinin) bu şəkildə yavaşlamasının ümumi səbəbi qarışıqdakı substratın tükənməsi və bununla da məhdudlaşdırıcı olmasıdır. Alternativ olaraq, fermentin qeyri-sabit olması və təcrübə zamanı denaturasiyası ola bilər və ya bir çox reaksiyalar protonları istehlak etdiyi və ya buraxdığı üçün qarışığın pH-ı dəyişir. Bu səbəblərə görə, bizdən reaksiyanın sürətini təyin etməyimiz istənildikdə, ferment əlavə edilən kimi və yuxarıda qeyd olunan məhdudiyyətlərdən heç biri tətbiq edilmədikdə bunu tez bir zamanda edirik. Biz bu ilkin sürətli sürətə ilkin sürət kimi müraciət edirik (v0). Bu ilkin mərhələdə reaksiya sürətinin ölçülməsi də olduqca sadədir, çünki sürət effektiv şəkildə xəttidir, ona görə də reaksiyanı qiymətləndirmək üçün sadəcə düz xətt çəkə və qradiyenti ölçə bilərik (konsentrasiya dəyişikliyini vaxt intervalına bölməklə) bu müddət ərzində dərəcəsi.

Substrat və ya ferment konsentrasiyası dəyişdirildikdə və ya pH dəyişdikdə ilkin sürətin necə dəyişdiyini qiymətləndirmək üçün indi bir sıra oxşar ferment analizləri həyata keçirə bilərik. Bu tədqiqatlar tədqiq olunan fermentin xüsusiyyətlərini xarakterizə etməyə kömək edəcəkdir.

Fermentin konsentrasiyası ilə reaksiyanın sürəti arasındakı əlaqə adətən sadədir. Yuxarıda təsvir olunan təcrübəni təkrar etsək, lakin 10% daha çox ferment əlavə etsək, reaksiya 10% daha sürətli olacaq və ferment konsentrasiyasını iki dəfə artırsaq, reaksiya iki dəfə sürətlə davam edəcəkdir. Beləliklə, reaksiya sürəti ilə reaksiyanı kataliz etmək üçün mövcud olan fermentin miqdarı arasında sadə xətti əlaqə mövcuddur (Şəkil 6.5). Bu əlaqə həm in vivo fermentlərə, həm də mövcud fermentin miqdarının tənzimlənməsinin reaksiya sürətini idarə edə bildiyi biotexnoloji tətbiqlərdə istifadə olunanlara aiddir.

Şəkil 6.5 Fermentin konsentrasiyası ilə fermentlə katalizləşən reaksiyanın sürəti arasında əlaqə.

Eyni ferment konsentrasiyasından istifadə edərək, lakin bir sıra müxtəlif substrat konsentrasiyaları ilə bir sıra ferment analizləri apardıqda, Şəkil 6-da göstərildiyi kimi, bir qədər daha mürəkkəb əlaqə yaranır. İlkin olaraq, substrat konsentrasiyası artırıldıqda, reaksiya sürəti artır. xeyli. Bununla belə, substratın konsentrasiyası daha da artdıqca, substrat konsentrasiyasının artırılmasının reaksiya sürətinə daha az təsir göstərdiyi mərhələyə çatana qədər reaksiya sürətinə təsirlər azalmağa başlayır. Bu nöqtədə fermentin substratla doymağa yaxınlaşdığı və maksimal sürətini nümayiş etdirdiyi hesab edilir (Vmaks). Nəzərə alın ki, bu maksimal sürət əslində nəzəri hədddir ki, biz ona çox yaxınlaşa bilsək də, heç bir təcrübədə həqiqətən əldə edilməyəcəkdir.

Şəkil 6.6 Substrat konsentrasiyası ilə fermentlə katalizləşən reaksiyanın sürəti arasında əlaqə.

Burada təsvir edilən əlaqə riyaziyyatçının dərhal düzbucaqlı hiperbola kimi müəyyən edəcəyi kifayət qədər ümumi bir əlaqədir. Belə bir əlaqəni təsvir edən tənlik aşağıdakı kimidir:

Beləliklə, a və b iki sabiti xətti əlaqədə olduğu kimi bu hiperbolik əlaqəni təsvir etməyə imkan verir (y = mx + c), iki sabitlə ifadə oluna bilər m (yamac) və c (kesmə). Biz faktiki olaraq sabiti artıq müəyyən etmişik a - bu Vmaks. Daimi b bir az daha mürəkkəbdir, çünki y-nin maksimal dəyərinin yarısını verən x oxundakı dəyərdir. Enzimologiyada biz bunu Michaelis sabiti (Km), yarı maksimal sürəti verən substrat konsentrasiyası kimi müəyyən edilir.

Son tənliyimiz adətən adlanır Michaelis-Menten tənliyi, buna görə də olur:

1913-cü ildə Leonor Michaelis və Maud Menten ilk dəfə fermentin substratla reaksiyaya girərək məhsul əmələ gətirməsi ilə bağlı bəzi sadə fərziyyələrlə bu tənliyi ilk prinsiplərdən riyazi olaraq çıxarmağın əslində mümkün olduğunu göstərdilər. Onların əldə edilməsinin mərkəzində reaksiyanın ES kompleksinin əmələ gəlməsi ilə baş verməsi anlayışı dayanır ki, bu da yarandıqdan sonra məhsulu buraxmaq üçün ya ayrıla (məhsuldar) və ya məhsulun əmələ gəlməsi olmadan əks istiqamətdə dissosiasiya edə bilər. Beləliklə, reaksiya aşağıdakı kimi təqdim edilə bilər k1, k−1k2 üç fərdi reaksiya mərhələsinin sürət sabitləridir:

Michaelis-Menten törəməsi iki mühüm fərziyyə tələb edir. Birinci fərziyyə ondan ibarətdir ki, biz reaksiyanın ilkin sürətini nəzərdən keçiririk (v0), məhsulun konsentrasiyası əhəmiyyətsiz dərəcədə kiçik olduqda (yəni [S] ≫ [P]), hər hansı bir məhsulun substrata qayıtma ehtimalını gözardı edə bilərik. İkinci fərziyyə odur ki, substratın konsentrasiyası fermentin konsentrasiyasını xeyli üstələyir (yəni [S] ≫ [E]).

Törəmə ilkin sürətin, məhsulun əmələ gəlmə sürətinin, ES kompleksinin məhsul yaratmaq üçün dissosiasiya sürəti kimi ifadəsi üçün tənlikdən başlayır. Bu sürət sabitinə əsaslanır k2və ES kompleksinin konsentrasiyası aşağıdakı kimidir:

ES ara məhsul olduğundan onun konsentrasiyası məlum deyil, lakin biz onu məlum qiymətlərlə ifadə edə bilərik. Stabil vəziyyət təxminində biz güman edə bilərik ki, substratın və məhsulun konsentrasiyası dəyişsə də, ES kompleksinin özünün konsentrasiyası sabit qalır.

Beləliklə, ES kompleksinin əmələ gəlmə sürəti və onun parçalanma sürəti balanslaşdırılmalıdır, burada:

ES kompleksinin əmələ gəlmə sürəti = ES kompleksinin parçalanma dərəcəsi

Tənlik [ES] əldə etmək üçün aşağıdakı kimi yenidən təşkil edilə bilər:

Michaelis sabiti Km aşağıdakı kimi müəyyən edilə bilər:

[ES] tənliyi daha sonra sadələşdirilə bilər:

Substratın konsentrasiyası fermentin konsentrasiyasını (yəni [S] ≫ [E]) əhəmiyyətli dərəcədə üstələdiyi üçün birləşməyən substratın [S] konsentrasiyası demək olar ki, substratın ümumi konsentrasiyasına bərabərdir. Birləşməmiş fermentin [E] konsentrasiyası bərabərdir ümumi ferment konsentrasiyası [E]Tsubstrat [ES] ilə birləşən minus. Bu şərtləri yuxarıdakı tənliyə daxil etmək və ES üçün həll etmək bizə aşağıdakıları verir:

Sonra [ES] üçün bu termini yuxarıdakı ilkin sürət tənliyinə daxil edə bilərik:

Termin k2[E]T əslində V təmsil edirmaks, maksimal sürət. Beləliklə, Michaelis və Menten öz son tənliyini aşağıdakı kimi əldə edə bildilər:

Michaelis sabitləri bir çox tez-tez istifadə olunan fermentlər üçün müəyyən edilmişdir və adətən aşağı millimolyar diapazondadır (Cədvəl 6.5). Qeyd etmək lazımdır ki, eyni reaksiyanı kataliz edən, lakin müxtəlif orqanizmlərdən alınan fermentlər çox fərqli ola bilər. Km dəyərlər. Bundan əlavə, bir çox substratı olan bir ferment tamamilə fərqli ola bilər Km hər bir substrat üçün dəyərlər.

Cədvəl 6.5 Michaelis sabitinin tipik dəyərlər diapazonu

A aşağı Km dəyər fermentin doymuş olması üçün yalnız az miqdarda substrat tələb etdiyini göstərir. Beləliklə, maksimum sürət nisbətən aşağı substrat konsentrasiyalarında əldə edilir. Yüksək Km dəyər maksimum reaksiya sürətinə nail olmaq üçün yüksək substrat konsentrasiyalarına ehtiyac olduğunu göstərir. Beləliklə, biz ümumiyyətlə müraciət edirik Km fermentin onun substratına olan yaxınlığının ölçüsü kimi-əslində tərs ölçüdür, burada yüksək Km göstərir aşağı yaxınlıq və əksinə.

The Km dəyər bizə müəyyən bir ferment haqqında bir neçə vacib şey deyir:

  1. Aşağı bir ferment Kmsubstratın fizioloji konsentrasiyasına nisbətən dəyər, ehtimal ki, həmişə substratla doymuş olacaq və buna görə də fizioloji diapazonda substratın konsentrasiyasındakı dəyişikliklərdən asılı olmayaraq sabit bir sürətlə hərəkət edəcəkdir.
  2. Yüksək olan bir ferment Kmsubstratın fizioloji konsentrasiyasına nisbətən dəyəri substratla doymayacaq və buna görə də onun fəaliyyəti substratın konsentrasiyasına görə dəyişəcək, buna görə də məhsulun formalaşma sürəti substratın mövcudluğundan asılı olacaq.
  3. Bir ferment bir neçə substratda fəaliyyət göstərirsə, ən aşağı olan substrat Kmdəyərinin çox vaxt həmin fermentin “təbii” substratı olduğu güman edilir, baxmayaraq ki, bu, bütün hallarda doğru olmaya bilər.
  4. Əgər iki ferment (oxşar Vmaks) müxtəlif metabolik yollarda eyni substrat üçün yarışır, onda biz bilirik Km iki ferment üçün dəyərlər biz iki yolun nisbi fəaliyyətini proqnozlaşdıra bilərik. Əsasən aşağı olan fermenti olan yol Kmdəyər çox güman ki, "üstünlük verilən yol" olacaq və əksər şərtlərdə daha çox substrat bu yoldan axacaq. Məsələn, fosfofruktokinaz (PFK) hüceyrə üçün ATP şəklində enerji istehsal edən glikolitik yolda ilk törədilmiş addımı kataliz edən fermentdir, halbuki qlükoza-1-fosfat uridililtransferaza (GUT) yolun əvvəlində olan bir fermentdir. glikogenin (enerji saxlama molekulu) sintezinə gətirib çıxarır. Hər iki ferment substrat kimi heksoza monofosfatlardan istifadə edir, lakin Kmonun substratı üçün PFK, substrat üçün GUT-dan daha aşağıdır. Beləliklə, aşağı hüceyrə heksoz fosfat konsentrasiyalarında PFK aktiv olacaq və bağırsaqlar əsasən qeyri-aktiv olacaq. Daha yüksək heksoza fosfat konsentrasiyalarında hər iki yol aktiv olacaq. Bu o deməkdir ki, hüceyrələr yalnız bolluq zamanı glikogen saxlayır və həmişə daha vacib funksiya olan ATP istehsal yoluna üstünlük verirlər.

Çox vaxt qiymətləndirmək mümkün deyil Km substrat konsentrasiyasına qarşı birbaşa sürət qrafikindən dəyərlər (Şəkil 6.6-da göstərildiyi kimi), çünki biz maksimal sürəti təxmin etməyə belə yaxınlaşmaq üçün kifayət qədər yüksək substrat konsentrasiyalarından istifadə etməmişik və buna görə də yarı maksimal sürəti qiymətləndirə bilmirik və beləliklə Km. Xoşbəxtlikdən, bu dəyərləri əldə etmək üçün eksperimental məlumatlarımızı bir qədər fərqli şəkildə tərtib edə bilərik. Ən çox istifadə edilən alternativ Lineweaver-Burk süjetidir (çox vaxt ikiqat qarşılıqlı süjet adlanır). Bu süjet hiperbolik əyri əlaqəni xəttiləşdirir və çıxarılan xəttin qiymətləndirilməsinə imkan verən ekstrapolyasiya etmək asandır. VmaksKm.

Məsələn, Şəkil 6.6-da yalnız ilk yeddi məlumat nöqtəsini əldə etsək, qiymətləndirməkdə çətinlik çəkərdik. Vmaks Şəkil 6.7a-da göstərildiyi kimi birbaşa süjetdən. Bununla belə, Şəkil 6.7b-də göstərildiyi kimi, əgər bu yeddi nöqtə 1/substrat konsentrasiyasına qarşı sürət 1/sürət qrafikində (yəni, ikiqat qarşılıqlı qrafik) çəkilirsə, məlumatlar xəttiləşdirilir və xətt asanlıqla ekstrapolyasiya edilə bilər. həm y oxu, həm də kəsişmələri təmin etmək üçün sol
x oxu, hansından VmaksKm, müvafiq olaraq qiymətləndirilə bilər.

Şəkil 6.7 Michaelis Menton Kinetikası. (a) Verilənlərin birbaşa planı (b) Eyni kinetik məlumatın Lineweaver-Burk planı.

Lineweaver-Burk planının istifadəsinin əhəmiyyətli bir praktik çatışmazlığı onun ən aşağı substrat konsentrasiyalarında aparılan ölçmələrə verdiyi həddindən artıq təsirdir. Bu konsentrasiyalar səhvə ən çox meylli ola bilər (birdən çox seyreltmənin hazırlanmasında çətinliklərə görə) və reaksiya sürətləri ilə nəticələnir ki, onlar yavaş olduğundan ölçmə xətasına da ən çox meylli ola bilər. Çox vaxt, Şəkil 8-də göstərildiyi kimi, Lineweaver-Burk planında transformasiya edilən bu cür nöqtələr məlumatlardan təxmin edilən ən yaxşı uyğunluq xəttinə və buna görə də hər ikisinin ekstrapolyasiya edilmiş qiymətlərinə əhəmiyyətli təsir göstərir. VmaksKm. Şəkil 8-də göstərilən iki nöqtə dəsti, çox aşağı substrat konsentrasiyasından və aşağı reaksiya sürətindən əldə edilən bir nöqtəni əks etdirən (süjetin ikiqat qarşılıqlı təbiətinə görə) yuxarı sağdakı tək nöqtə istisna olmaqla, eynidır. Bununla belə, bu tək nöqtə ən yaxşı uyğunluq xəttinə və kinetik sabitlərin müşayiət olunan təxminlərinə böyük təsir göstərə bilər.

Şəkil 6.8 Yalnız bir verilənlər nöqtəsində fərqlənən oxşar kinetik verilənlərin Lineweaver-Burk planı (Son məlumat nöqtəsi (a) 1/v 0.03-də 0.2-nin 1/S-də və (b) 0.18-in 1/S-də 1/v 0.031).

Əslində istifadə edilə bilən digər kinetik süjetlər də var, o cümlədən Eadie-Hofstee süjeti, Hanes süjeti və Eisenthal-Korniş-Bowden süjeti, bu cür problemlərə daha az meyllidir. Ferment kinetikası ev tapşırığında siz bu digər növ xəttiləşdirmə üsulları ilə sınaq keçirəcəksiniz.

Yuxarıya qayıt

6.6 Fermentlər pH və temperaturdan təsirlənir

Müxtəlif ətraf mühit amilləri zülal strukturunda geri dönən və ya geri dönməz dəyişikliklər vasitəsilə ferment katalizli reaksiyaların sürətinə təsir göstərə bilir. PH və temperaturun təsiri ümumiyyətlə yaxşı başa düşülür.
Əksər fermentlər katalizləşdirilmiş reaksiyanın sürətinin maksimal olduğu, yuxarıda və aşağıda isə sürətin azaldığı xarakterik optimal pH-a malikdir (Şəkil 6.9).

Şəkil 6.9 β-qlükozidazanın pH profili.

pH profili bir sıra amillərdən asılıdır. pH dəyişdikcə, həm fermentin aktiv yerində, həm də substratda qrupların ionlaşması dəyişə bilər və substratın aktiv sahəyə bağlanma sürətinə təsir edə bilər. Bu təsirlər çox vaxt geri çevrilir. Məsələn, optimal pH (pH) olan bir fermenti götürsəkseçim) 7,0 və onu pH 6,0 və ya 8,0 olan bir mühitə yerləşdirin, fermentin və substratın yük xassələri suboptimal ola bilər ki, bağlanma və buna görə də reaksiya sürəti azalır. Daha sonra pH-ı 7.0-ə tənzimləsək, optimal yük xassələri və deməli, fermentin maksimal fəaliyyəti tez-tez bərpa olunur.

Bununla belə, fermenti daha həddindən artıq turşu və ya qələvi mühitə yerləşdirsək (məsələn, pH 1 və ya 14), baxmayaraq ki, bu şərtlər əslində zülalın ilkin strukturunun çox sabit kovalent strukturunda dəyişikliklərə səbəb olmaya bilər (yəni onun konfiqurasiyası). ), onlar zülalın konformasiyasında (formasında) elə dəyişikliklər yarada bilər ki, o, pH 7.0-ə qaytarıldıqda, ilkin konformasiya və deməli, fermentin tam katalitik fəaliyyəti bərpa olunmur. Nəzərə almaq lazımdır ki, fermentin optimal pH-ı onun normal hüceyrədaxili ətrafı ilə eyni olmaya bilər. Bu onu göstərir ki, yerli pH ferment aktivliyinə nəzarətedici təsir göstərə bilər.

Temperaturun ferment aktivliyinə təsiri olduqca mürəkkəbdir və eyni zamanda, lakin əks istiqamətdə hərəkət edən iki qüvvə kimi qəbul edilə bilər. Temperatur yüksəldikcə molekulyar hərəkət sürəti və buna görə də reaksiya sürəti artır, lakin eyni zamanda ferment zülalının denaturasiyası nəticəsində mütərəqqi inaktivasiya baş verir. Temperatur artdıqca bu daha qabarıq şəkildə özünü büruzə verir, beləliklə, görünən temperatur optimaldır (Tseçim) müşahidə olunur (Şəkil 6.10).

Şəkil 6.10 Temperaturun fermentlərin fəaliyyətinə təsiri.

Termal denaturasiya zamandan asılıdır və bir ferment üçün "optimal temperatur" termininin bu temperatura məruz qalma müddəti qeyd olunmadığı təqdirdə çox az real mənası var. Fermentin istilik dayanıqlığı əvvəlcə zülalın müəyyən bir müddət ərzində müəyyən bir temperatur aralığına məruz qalması və sonra onun aktivliyini bir əlverişli temperaturda (məsələn, 25°C) ölçməklə müəyyən edilə bilər.

Denaturasiyanın vacib olduğu temperatur bir fermentdən digərinə dəyişir. Normalda 30 ° C-dən aşağı cüzidir və 40 ° C-dən yuxarı nəzərə çarpmağa başlayır. Tipik olaraq, mikrob mənbələrindən əldə edilən fermentlər məməli mənbələrindən alınan fermentlərə nisbətən daha yüksək istilik dayanıqlığı nümayiş etdirir və termolizin (bir proteaz) kimi son dərəcə termofilik mikroorqanizmlərdən əldə edilən fermentlər. Bacillus thermoproteolyticus) və Taq polimeraza (bir DNT polimeraza). Termus aquaticus), 70 ° C-də tamamilə termostabil ola bilər və hələ də 100 ° C-də əhəmiyyətli dərəcədə aktivliyi saxlaya bilər.

Yuxarıya qayıt

6.7 Fermentlər İnhibitorlara Həssasdır

Enzim katalizli reaksiyanın aktivliyini azaldan maddələrə inhibitorlar deyilir. Onlar birbaşa və ya dolayı yolla aktiv sahənin katalitik xüsusiyyətlərinə təsir etməklə hərəkət edirlər. İnhibitorlar hüceyrəyə və ya onun təbii komponentlərinə yad ola bilər. Sonuncu kateqoriyada olanlar hüceyrə mübadiləsinin tənzimlənməsinin mühüm elementini təmsil edə bilərlər. Bir çox toksinlər və həmçinin bir çox farmakoloji cəhətdən aktiv agentlər (həm qeyri-qanuni dərmanlar, həm də reseptlə satılan və reçetesiz satılan dərmanlar) fermentlə katalizləşən spesifik prosesləri inhibə edərək fəaliyyət göstərir.

Geri dönən inhibe

İnhibitorlar bir fermentə geri çevrilən şəkildə bağlandıqda geri çevrilən inhibitorlar kimi təsnif edilir. Struktur olaraq normal substrata bənzəyən bir molekul fermentin aktiv sahəsinə tərsinə bağlana bilər və buna görə də ferment rolunu oynaya bilər. rəqabət inhibitoru. (Şəkil 6.11) Məsələn, malonat suksinat dehidrogenaz fermentinin rəqabət qabiliyyətli inhibitorudur, çünki o, fermentin təbii substratı olan suksinata yaxın struktur oxşarlığına görə fermentin aktiv yerinə bağlana bilir (aşağıya bax). Malonat suksinat dehidrogenazanın aktiv yerini tutduqda, təbii substratın, süksinatın bağlanmasının qarşısını alır və bununla da süksinatın fumarat oksidləşmə sürətini ləngidir (yəni reaksiyanı maneə törədir).

Rəqabətli inhibitorların xüsusiyyətlərindən biri odur ki, substratın yüksək konsentrasiyası istifadə olunarsa, onlar aktiv sahədən kənarlaşdırıla bilər və bununla da ferment aktivliyi bərpa olunur. Beləliklə, rəqabətli inhibitorlar artır Km fermenti doyurmaq üçün lazım olan substratın konsentrasiyasını artırdıqları üçün reaksiya. Bununla belə, onlar dəyişmir Vmaks özü.

Müəyyən fermentlər vəziyyətində, ya substratın, ya da məhsulun yüksək konsentrasiyası inhibitor ola bilər. Məsələn, yüksək konsentrasiyalı saxaroza (onun substratı) olduqda invertaz aktivliyi əhəmiyyətli dərəcədə azalır, halbuki β-qalaktozidaza Aspergillus niger qalaktoza (onun məhsulu) tərəfindən güclü şəkildə inhibə edilir. Bir ferment reaksiyasının məhsulları ən çox rast gəlinən rəqabətli inhibitorlardan bəziləridir.

Şəkil 6.11 Rəqabətin qarşısının alınması. Substrat (S) və inhibitor (I) hər ikisi fermentdə eyni yerə bağlandıqda rəqabətli inhibə baş verir. Əslində, onlar aktiv sayt üçün rəqabət aparır və bir-birini istisna edən bir şəkildə bağlanırlar.

Geri dönən inhibitorların digər növləri də mövcuddur. Rəqabətli olmayan inhibitorlar aktiv sahədən fərqli bir yerdə fermentlə reaksiya verir. Buna görə də inhibitorun bağlanması substratın bağlanma yerini fiziki olaraq blok etmir, lakin sonrakı reaksiyanın qarşısını alır. Əksər rəqabət qabiliyyətli olmayan inhibitorların substratla kimyəvi əlaqəsi yoxdur və substrat konsentrasiyasını artırmaqla onların inhibəsini aradan qaldırmaq mümkün deyil. Bu cür inhibitorlar məhluldakı aktiv fermentin konsentrasiyasını azaldır və bununla da onun konsentrasiyasını azaldır Vmaksreaksiyasından. Ancaq dəyərini dəyişdirmirlər Km.

Şəkil 6.12 Rəqabətsiz Qadağa. Nonompetitiv inhibisyon, inhibitor (I) substratdan uzaq bir yerdə fermentə bağlandıqda baş verir. Əslində, rəqabət qabiliyyəti olmayan inhibitor fermentin konformasiyasını dəyişdirir ki, o, katalizator funksiyasını azaldır və ya məhdudlaşdırır.

Rəqabətsiz inhibə olduqca nadirdir, inhibitor yalnız substrat molekulu özü bağlandıqdan sonra fermentə bağlana bildikdə baş verir. Beləliklə, inhibe yüksək substrat konsentrasiyalarında ən əhəmiyyətlidir və onun azalması ilə nəticələnir Vmaks reaksiyasından. Rəqabətsiz inhibə də azalmağa səbəb olur Km, Bu, bir qədər ziddiyyətli görünür, çünki bu o deməkdir ki, inhibitor mövcud olduqda fermentin substratına olan yaxınlığı həqiqətən artır. Bu təsir ona görə baş verir ki, inhibitorun ES kompleksinə bağlanması ES kompleksini effektiv şəkildə aradan qaldırır və bununla da ES kompleksinin formalaşmasına müsbət təsir edən reaksiyanın ümumi tarazlığına təsir göstərir. Ancaq diqqətəlayiqdir ki, hər ikisindən bəri VmaksKm azaldıldıqda, mövcud olan inhibitorla müşahidə olunan reaksiya dərəcələri həmişə rəqabətsiz inhibitor olmadıqda olduğundan daha aşağıdır.

Şəkil 6.13 Rəqabətsiz Qadağa. Rəqabətsiz inhibisyonda inhibitor reaksiyanın ES kompleksinə bağlanır və fermentin reaksiyanı tamamlamaq qabiliyyətini bloklayır.

Geri dönən inhibitorların təsirləri Şəkil 6.14-də göstərildiyi kimi Lineweaver-Burk diaqramından istifadə etməklə asanlıqla müəyyən edilə bilər.

Şəkil 6.14 Reversible inhibitorların Lineweaver-Burk Plots. Qadağan edilməmiş ferment profilləri qırmızı, inhibitorların tədricən mövcud olduğu reaksiyalar isə yaşıl rənglə göstərilir. (A) rəqabətli inhibə, (B) rəqabətsiz inhibə və (C) rəqabətsiz inhibə.

Geri dönməz inhibitorlar və zəhərlər

Bir inhibitor bir fermentə qalıcı olaraq bağlanırsa, ona bir ferment deyilir geri dönməz inhibitor. Bir çox geri dönməz inhibitorlar inhibe etdikləri fermentlərə kovalent şəkildə bağlanır və onların strukturunun daimi olaraq dəyişməsinə səbəb olur. Beləliklə, bir çox geri dönməz inhibitorlar buna görə də güclü toksinlərdir.

Diizopropil flüorofosfat (DFP) kimi orqanofosfor birləşmələri fermentin aktiv yerində tapılan mühüm serin qalığı ilə kovalent reaksiyaya girərək asetilkolinesterazanın fəaliyyətini maneə törədir. Bu inaktivasiyanın fizioloji təsiri sinirlərin sinapslarında nörotransmitterin inaktivasiyasına müdaxilədir, nəticədə sinir impulslarının daimi yayılması ilə nəticələnir, bu da əzələ qıcolmalarına səbəb ola bilər və ölümlə nəticələnə bilər. DFP ilk olaraq İkinci Dünya Müharibəsi zamanı İngilislər tərəfindən kimyəvi döyüş agenti kimi qiymətləndirilmişdi və bu birləşmənin dəyişdirilmiş versiyaları indi parathion və malathion daxil olmaqla orqanofosfat pestisidləri kimi geniş istifadə olunur (Şəkil 6.15). Xüsusilə DFP eyni zamanda Herpes Simplex Virusunun proteaz fermentinin güclü inhibitorudur və bu zülalın aktiv ərazi dinamikasını öyrənmək üçün istifadə edilmişdir (Şəkil 6.15). Bir çox dərman da rol oynayır geri dönməz inhibitorlar, penisilin kimi beta-laktam antibiotikləri də daxil olmaqla.

Şəkil 6.15 Organofosfatlar dönməz inhibitorlardır. (A) Diizopropil flüorofosfat (DFP), malatyon və parationun strukturu, (B) Aktiv sahənin serin qalığının kovalent modifikasiyası vasitəsilə fermentlərin DFP tərəfindən dönməz inhibəsi və (C) Herpes Simplex Virus Proteazının/İnhibitorunun (DFP) kristal quruluşu ) kompleks. Aktiv sahə serin (sarı) geri dönməz inhibə ilə nəticələnən fosfonilləşməyə məruz qalmışdır. PDB 1AT3-dən göstərilmişdir.

Yuxarıya qayıt

6.8 Allosterik tənzimləyicilər və fermentlərin fəaliyyətinə nəzarət

Fermentlərin kinetikası və Michaelis-Menten əlaqəsi haqqında öyrənməyə vaxt sərf etdikdən sonra, ən vacib fermentlərdən bəzilərinin əslində belə xüsusiyyətlərə malik olmadığını tapmaq çox vaxt çox narahat edir. Allosterik fermentlər inhibitorlara və aktivatorlara cavab verməklə metabolik yolların fəaliyyətinə nəzarət edən əsas tənzimləyici fermentlərdir. Bu fermentlər əslində adi hiperbolik əlaqədən daha çox reaksiya sürəti ilə substratın konsentrasiyası arasında sigmoidal (S-şəkilli) əlaqəni göstərir (Şəkil 6.16). Beləliklə, allosterik fermentlər üçün aktivliyin ekvivalent “normal” fermentinkindən aşağı olduğu bir sahə və həmçinin ekvivalent “normal” fermentin aktivliyindən yüksək olduğu və bu iki faza arasında sürətli keçid olduğu bir sahə var. Bu, daha tez “söndürülən”dən (aşağı aktivlik) “on”a (tam fəaliyyət) dəyişdirilə bilən keçid kimidir.

Şəkil 6.16 Allosterik (açıq çevrələr) və Qeyri-allosterik (bərk dairələr) Fermentlərin Fəaliyyət/Substrat Profilləri Eyni Yaxınlıq və Maksimal Sürətlə.

Allosterik fermentlərin əksəriyyəti polimerdir, yəni ən azı iki (və çox vaxt daha çox) fərdi polipeptid zəncirindən ibarətdir. Onlar həmçinin substratın bağlana biləcəyi çoxlu aktiv sahələrə malikdirlər. Allosterik fermentlərin funksiyası haqqında anlayışımızın çox hissəsi, ferment olmasa da, oksigeni eyni şəkildə əməkdaşlıq edən və bununla da bu siqmoidal əlaqəni nümayiş etdirən hemoglobinin (Hb) tədqiqatlarından əldə edilir. Allosterik fermentlərin substrata ilkin olaraq aşağı yaxınlığı var, lakin bir substrat molekulu bağlandıqda, bu, ferment daxilində bəzi bağları poza bilər və bununla da zülalın formasını dəyişdirə bilər ki, qalan aktiv sahələr daha yüksək yaxınlıq ilə bağlana bilsin. Buna görə də allosterik fermentlər çox vaxt a-dan hərəkət edən kimi təsvir olunur gərgin vəziyyət və ya T vəziyyəti (aşağı yaxınlıq) heç bir substratın bağlanmadığı, a rahat vəziyyət və ya R vəziyyəti substrat bağlandığı üçün (yüksək yaxınlıq). Digər molekullar da əlavə tənzimləyici yerlərdə (yəni aktiv yerdə deyil) allosterik fermentlərə bağlana bilər. Proteini T vəziyyətində sabitləşdirən molekullar buna görə də allosterik inhibitorlar kimi çıxış edir, zülalı R vəziyyətinə keçirən molekullar isə allosterik aktivatorlar və ya promotorlar kimi çıxış edəcəklər.

Hemoqlobin iki alfa və iki beta alt bölməsindən ibarət tetramerik zülaldır. Monomerik oksigen bağlayan zülal, miyoqlobin ilə homologdur. Şəkil 6.17-də göründüyü kimi, oksigenin miyoqlobinə bağlanması standart hiperbolik profil verir, hemoglobin isə siqmoidal oksigen bağlanmasını göstərir. Hemoqlobinin sigmoidal kinetik profili oksigenlə əlaqənin olduğunu göstərir kooperativ və ya bir oksigenin bir alt bölməyə bağlanması oksigenin başqa bir alt bölmədə bağlanma ehtimalını artırır.

Şəkil 6.17 Mioqlobin (A) və Hemoqlobinin (B) Strukturlarının və (C) Oksigenlə Bağlanma Kinetikasının Müqayisəsi.

The Konsert Model, kimi də tanınır simmetriya modeliHemoqlobinin , izah etmək üçün istifadə olunur kooperativlikoksigen bağlanmasında, eləcə də eyni subunitlərdən ibarət olan zülalların keçidlərində. Bu, hemoglobinin T və R vəziyyətlərinin iki vəziyyətinə diqqət yetirir. Hemoqlobinin T vəziyyəti deoksihemoqlobin şəklində olduğu üçün daha gərgindir, hemoglobinin R vəziyyəti isə oksihemqlobin şəklində olduğu kimi daha rahatdır. T vəziyyəti subunit-alt bölmənin qarşılıqlı təsiri səbəbindən məhdudlaşdırılır, R vəziyyəti isə oksigen bağlama qabiliyyətinə görə daha çevikdir. Deoksihemoqlobinin və oksihemoqlobinin fərqi ondan ibarətdir ki, “deoksi” formasında oksigen yoxdur və “oxy” forması yüksək dərəcədə oksigenə bağlıdır. Oksigenin bir yerdə bağlanması digər aktiv yerlərdə bağlanma yaxınlığını artırır və ya asanlaşdırır. Beləliklə, hemoglobinin oksigen bağlayan kinetikası üçün siqmoidal əyri müşahidə olunur. Şəkil 6.18-də göründüyü kimi, hemoglobinin uyğunlaşdırılmış modelində, bir oksigenin aktiv bir yerə bağlanmasının digər oksigenin hemoglobinin digər aktiv sahələrinə bağlanma ehtimalını artıracağını göstərir. Bu qabiliyyət kimi tanınır kooperativlik və ya kooperativ bağlama. Ümumiyyətlə, oksigenin bağlanması tarazlığı R vəziyyətinə çevirir. Bu o deməkdir ki, yüksək oksigen səviyyələrində R forması, aşağı oksigen səviyyələrində isə T forması üstünlük təşkil edəcəkdir. 2,3-bifosfogliserat (2,3-BPG) kimi hemoglobinin allosterik effektorları, allosterik inhibitor və ya allosterik promotor olmasından asılı olaraq tarazlığı T vəziyyətinə doğru və ya ondan uzaqlaşdıraraq fəaliyyət göstərir. Bu model R və T keçidlərinin ekstremal hallarını göstərir. Həqiqi bir sistemdə, hemoglobinin davranışını izah etmək üçün hər iki modelin xüsusiyyətləri lazımdır.

Şəkil 6.18 Hemoqlobində oksigenin bağlanmasının dinamikası. Yuxarıda (A) göstərildiyi kimi, oksigenlə əlaqə az olduqda, hemoglobinin gərgin vəziyyətinə (T-dövlətinə) üstünlük verilir. Tetramer oksigen bağlanması ilə T vəziyyətindən rahat vəziyyətə (R vəziyyətinə) keçir. Əslində, bir oksigenin bir alt bölmə ilə bağlanması oksigenin digər alt bölmələrlə bağlanma ehtimalını artırır. kooperativlik. (B) Hemoqlobinin (Hb) oksigenə bağlanmasının qrafik təsvirini göstərir və T-vəziyyəti və R-dövləti arasında keçid edir.

Bohr effekti

Bor effekti ilk dəfə 1904-cü ildə Danimarka fizioloqu Kristian Bor tərəfindən təsvir edilən fizioloji bir hadisədir: hemoglobinin oksigenlə əlaqəsi həm turşuluq, həm də karbon dioksidin konsentrasiyası ilə tərs bağlıdır. Aşağıdakı diaqram pH-nin O-ya təsirini göstərir2 Hb-yə bağlanır. Eksperimental müşahidə belədir ki, pH 7.2 və 20 torr-da daha çox O2 pH 7.6 ilə müqayisədə boşaldılır (Şəkil 6.19).

Şəkil 6.19 Hemoqlobinin oksigenlə bağlanması pH-dan asılıdır.

Bu pH təsirinin əsasını düşünmək üçün üç vacib amili xatırlayın: (1) CO2/HCO3 – bioloji sistemlərdə tarazlıqda mövcuddur və ümumi pH-a təsir edə bilər, (2) deoksiHb O-dan daha güclü əsasdır.2•Hb və (3) qırmızı qan hüceyrələrində (RBC) CO-nun nəmləndirilməsini kataliz edən karbonik anhidraz adlı bir ferment var.2 su ilə HCO əmələ gətirir3 – .


Yuxarıdakı tənliklər hemoglobinin O-nun boşaldılmasını necə maksimum dərəcədə artırdığını təsvir etmək üçün istifadə edilə bilər2 toxumalarda və CO-nun boşaldılması2 ağciyərlərdə.

Birinci misal:Məşq zamanı əzələlərdə qlükoza CO-yə çevrilir2. CO2 sonra kapilyarlara və qırmızı qan hüceyrələrinə yayılır və H+ və HCO-ya bərabərləşir3 – . Hb-nin bəzi yan zəncirləri tampon rolunu oynayır. H + s deoksiHb ilə bağlanır və beləliklə, tarazlığı sağa sürüşdürərək daha çox O buraxır.2.

İkinci misal: DeoksiHb qan dövranı sistemi vasitəsilə yenidən ağciyərlərə daşınır və burada O2 toplayır.2. O2 tarazlığı sola sürüşdürərək H + yaradır. Daha sonra protonlar HCO ilə reaksiya verirlər3 – CO yaratmaq2 və H2O. CO2 ekshalasiya olunur.

Ümumilikdə, hemoglobinin bioloji fəaliyyətinin təhlili göstərir ki, tək zülalın fəaliyyətinin tənzimlənməsi mürəkkəbdir və bədənin müxtəlif yerlərində və ya allosterik effektorlara məruz qaldıqda fərqlənə bilər.

Yuxarıya qayıt

6.9 Fermentlərin mənşəyi, təmizlənməsi və istifadəsi

Fermentlər hər yerdə mövcuddur

Fermentlər hüceyrə mübadiləsinin mürəkkəb reaksiyalarını katalizlədiyinə və əlaqələndirdiyinə görə heyvanların, bitkilərin və mikroorqanizmlərin vacib komponentləridir. 1970-ci illərə qədər fermentlərin kommersiya tətbiqinin çox hissəsi heyvan və bitki mənbələrindən istifadə olunurdu. O dövrdə kütləvi fermentlər ümumiyyətlə yalnız qida emalı sənayesində istifadə olunurdu və heyvanlardan və bitkilərdən alınan fermentlərə üstünlük verilirdi, çünki onlar fermentlərlə əlaqəli toksiklik və çirklənmə problemlərindən azad hesab olunurdular.
mikrob mənşəlidir. Bununla belə, tələbat artdıqca və fermentasiya texnologiyası inkişaf etdikcə, mikrob fermentlərinin rəqabətədavamlı dəyəri tanındı və onlar daha geniş istifadə olundu. Bitki və heyvan mənşəli fermentlərlə müqayisədə mikrobial fermentlərin iqtisadi, texniki və etik üstünlükləri var ki, bunlar da indi açıqlanacaq.

İqtisadi Üstünlüklər

Qısa müddət ərzində və kiçik bir istehsal müəssisəsində istehsal oluna bilən çox miqdarda ferment mikroorqanizmlərin istifadəsinə böyük üstünlük verir. Məsələn, rennin (pendir istehsalında istifadə olunan süd laxtalanmasına səbəb olan ferment) istehsalı zamanı ənənəvi yanaşma buzovun (hələ də ana südü ilə qidalanan gənc inək) mədəsindən çıxarılan fermentdən istifadə etməkdir. Bir buzovun mədəsindən çıxarılan şirənin orta miqdarı 10 kq-dır və bir buzov yetişdirmək üçün bir neçə ay intensiv əkinçilik tələb olunur. Müqayisə üçün, rekombinant Bacillus subtilis-in 1000 litrlik fermentatoru 12 saat ərzində 20 kq ferment istehsal edə bilər. Beləliklə, mikrob məhsulu açıq şəkildə iqtisadi cəhətdən üstünlük təşkil edir və heyvanların istifadəsini əhatə edən etik məsələlərdən azaddır. Həqiqətən də, hazırda supermarketlərdə satılan pendirin çoxu laxtalanmış süddən hazırlanır
mikrob fermentləri ilə (vegetarianlar üçün də uyğundur).

Mikrob fermentlərindən istifadənin digər üstünlüyü onların çıxarılması asanlığıdır. Biotexnoloji proseslərdə istifadə olunan bir çox mikrob fermentləri hüceyrədənkənar ifraz olunur ki, bu da onların çıxarılmasını və təmizlənməsini xeyli asanlaşdırır. Mikrob hüceyrədaxili fermentləri, həmçinin, ekvivalent heyvan və ya bitki fermentlərinə nisbətən əldə etmək çox vaxt daha asandır, çünki onlar ümumiyyətlə daha az ekstraksiya və təmizlənmə mərhələləri tələb edir.

Heyvan və bitki mənbələri adətən ekstraksiya qurğusuna daşınmalıdır, halbuki mikroorqanizmlər istifadə edildikdə eyni qurğu ümumiyyətlə istehsal və ekstraksiya üçün istifadə edilə bilər. Bundan əlavə, kommersiya baxımından əhəmiyyətli heyvan və bitki fermentləri çox vaxt yalnız bir orqan və ya toxuma daxilində yerləşir, buna görə də qalan material mahiyyət etibarı ilə tullantı məhsuludur və onların utilizasiyası tələb olunur.

Nəhayət, bitki və heyvan mənşəli fermentlər məhsuldarlıqda geniş dəyişkənlik göstərir və yalnız ilin müəyyən vaxtlarında mövcud ola bilər, halbuki bu problemlərin heç biri mikrob fermentləri ilə əlaqəli deyil.

Texniki Üstünlüklər

Mikrob fermentləri tez-tez onları kommersiya istismarı üçün daha uyğun edən xüsusiyyətlərə malikdir. Heyvan və bitki mənşəli fermentlərlə müqayisədə mikrob fermentlərinin sabitliyi adətən yüksək olur. Məsələn, termofilik mikroorqanizmlərdən fermentlərin yüksək temperatur sabitliyi proses yüksək temperaturda işləməli olduqda (məsələn, nişastanın emalı zamanı) çox vaxt faydalıdır.

Mikroorqanizmlər, həmçinin plazmidin daxil edilməsi kimi nisbətən sadə üsullardan istifadə edərək, yeni və ya dəyişdirilmiş fermentlər istehsal etmək üçün genetik modifikasiyaya çox uyğundur. Heyvanların və bitkilərin genetik manipulyasiyası texniki cəhətdən daha çətindir, daha bahalıdır və hələ də əhəmiyyətli etik narahatlıq mövzusudur.

Fermentlər hüceyrədaxili və ya hüceyrədənkənar ola bilər

Bir çox fermentlər hüceyrə daxilində saxlanılsa da və xüsusi hüceyrəaltı bölmələrdə yerləşə bilsə də, digərləri ətraf mühitə buraxılır. Sənayedə istifadə olunan fermentlərin əksəriyyəti ya göbələk mənbələrindən olan hüceyrədənkənar zülallardır (məs. Aspergillus növlər) və ya bakterial mənbələr (məs. Bacillus növ). Bunlara misal olaraq a-amilaza, sellülaz, dekstranaza, proteazlar və amiloqlükozidaza daxildir. Qeyri-sənaye məqsədləri üçün istifadə olunan bir çox digər fermentlər hüceyrədaxili olur və hüceyrə tərəfindən daha az miqdarda istehsal olunur. Bunlara misal olaraq asparaginaza, katalaza, xolesterin oksidaz, qlükoza oksidaz və qlükoza-6-fosfat dehidrogenaz daxildir.

Fermentlərin təmizlənməsi

Mövcud olan ümumi zülalla (yəni spesifik aktivlik) fermentin aktivliyi müəyyən edilə və fermentin saflığının ölçüsü kimi istifadə edilə bilər. Fermenti təmizləmək üçün çirkləndirici materialı çıxarmaq üçün müxtəlif üsullardan istifadə edilə bilər (və 3-cü Fəsildə ətraflı müzakirə olunur). Diaqnostik reagentlər kimi və klinik terapevtiklərdə istifadə olunan fermentlər adətən yüksək təmizlik dərəcəsi ilə hazırlanır, çünki kataliz edilən reaksiyanın spesifikliyinə böyük diqqət yetirilir. Aydındır ki, təmizlənmə səviyyəsi nə qədər yüksək olarsa,
ferment istehsalının dəyəri nə qədər yüksəkdir. Bir çox kütləvi sənaye fermentləri üçün təmizlənmə dərəcəsi daha az əhəmiyyət kəsb edir və belə fermentlər çox vaxt böyümə mühitini, orqanizmləri (bütün və ya parçalanmış) və maraq doğuran fermentləri ehtiva edən mədəni bulyonun çox xam preparatları kimi satıla bilər. Bununla belə, hətta ən ucuz toplu fermentlər (məsələn, yuyucu tozlarda istifadə üçün proteazlar) istifadə edildikdə belə, fermentin dəyəri son məhsulun dəyərinin təxminən 5-10%-ni təşkil edə bilər.

Əvvəlcədən müalicə

Tələb olunan fermentlə zəngin mikroorqanizmin yetişdirildiyi fermentasiyanın sonunda, mikrobların daha da böyüməsinin qarşısını almaq və ferment məhsulunu sabitləşdirmək üçün bulyon sürətlə 5°C-ə qədər soyudula bilər. Ferment sabitliyini optimallaşdırmaq üçün pH da tənzimlənə bilər. Ferment istehsal edən orqanizm bir göbələkdirsə, bu, aşağı sürətlə sentrifuqa ilə çıxarıla bilər. Ferment mənbəyi bakterialdırsa, bakteriyalar tez-tez alüminium sulfat və ya kalsium xlorid ilə flokulyasiya edilir, bu da bakterial membranlardakı yükü ləğv edir, onların yığılmasına səbəb olur və beləliklə, suspenziyadan çıxır.

Müalicə

Hüceyrədənkənar fermentlər ilkin müalicə prosesinin maye komponentində olur. Bununla belə, hüceyrədaxili fermentlər daha geniş müalicə tələb edir. Biokütlə sentrifuqa yolu ilə konsentrasiya oluna və orta komponentləri çıxarmaq üçün yuyula bilər. Hüceyrə komponenti daha sonra ferment tərkibini buraxmaq üçün parçalanmalıdır. Bu, aşağıdakı proseslərdən biri və ya bir neçəsi ilə edilə bilər:
• top frezeleme (şüşə boncuklardan istifadə etməklə)
• hüceyrə divarının enzimlə çıxarılması
• dondurma-ərimə dövrləri
• yüksək təzyiqdə kiçik deşikdən maye kəsilməsi (məsələn, fransız presi daxilində)
• osmotik şok
• sonication.

Yaranan məhluldan fermentlərin ayrılması daha sonra müxtəlif ayırmaları əhatə edə bilər
3-cü Fəsildə təsvir olunduğu kimi, tez-tez ardıcıl şəkildə tətbiq olunan proseslər.

Fermentlərin bitirilməsi

Fermentlər antigenikdir və 1960-cı illərin sonlarında istehsalat işçilərinin ferment tozlarını tənəffüs etdikdən sonra ciddi allergik reaksiyalar göstərdiyi zaman problemlər yarandığından, indi toz əmələ gəlməsini azaltmaq üçün prosedurlar həyata keçirilir. Bunlara fermentlərin mümkün olduğu yerlərdə maye şəklində verilməsi və ya quru tozların hissəcik ölçüsünün 10 μm-dən 200-500 μm-ə qədər artırılması daxildir. prilling (fermentin polietilen qlikol ilə qarışdırılması və atomizasiya yolu ilə kiçik kürələrin hazırlanması) və ya marumerizing (fermentin bağlayıcı və su ilə qarışdırılması, uzun sapların ekstruziyası, marumerizatorda kürələrə çevrilməsi, qurudulması və üzərlərinin örtülməsi)
mumlu palto).

Yuxarıya qayıt

6.10 Sənaye enzimologiyası

Pendir istehsalı kimi bir çox sənaye prosesləri ənənəvi olaraq heyvanlardan və ya bitkilərdən alınan natəmiz ferment mənbələrindən istifadə etsə də, müasir sənaye enzimologiyasının çox hissəsinin inkişafı mikrob fermentlərinin kommersiya istismarı ilə paralel getmişdir. Bunlar Qərbə təxminən 1890-cı ildə yapon alimi Cokiçi Takamine ABŞ-da məskunlaşdıqda və Yapon texnologiyası əsasında ferment fabriki qurduqda tanış oldu. Əsas məhsul amilolitik və proteolitik qarışığı olan Takadiastaz idi
göbələklərin becərilməsi ilə hazırlanan fermentlər Aspergillus oryzae düyü və ya buğda kəpəyi üzərində. Takadiastase ABŞ-da nişastanın natamam həzm edilməsi nəticəsində yarandığına inanılan dispepsiya müalicəsi üçün həzm sistemi vasitəsi kimi uğurla satıldı.

Bakterial fermentlər Fransada 1913-cü ildə Avqust Boidin və Jean Effront tərəfindən hazırlanmışdır. Bacillus subtilis səməni və ya taxılın çıxarılması ilə hazırlanmış maye mühitdə böyüdükdə istiliyə davamlı α-amilaza istehsal etdi. Ferment ilk növbədə tekstil sənayesində pambıq istehsalında əyriliyi qoruyan nişastanın çıxarılması üçün istifadə edilmişdir.

Təxminən 1930-cu ildə göbələk pektinazlarının meyvə məhsullarının hazırlanmasında istifadə oluna biləcəyi aşkar edilmişdir. Sonrakı illərdə, bir neçə başqa hidrolaz hazırlanmış və kommersiya olaraq satılmışdır (məsələn, pektosanaz, sellülaz, lipaz), lakin texnologiya hələ də kifayət qədər ibtidai idi.

İkinci Dünya Müharibəsindən sonra fermentasiya sənayesi sürətlə inkişaf etdi, çünki antibiotiklərin istehsalı üçün üsullar inkişaf etdirildi. Bu üsullar tezliklə fermentlərin istehsalı üçün uyğunlaşdırıldı. 1960-cı illərdə qlükoamilaza nişastanı hidroliz edən, turşu hidrolizini əvəz edən vasitə kimi təqdim edildi. Daha sonra, 1960 və 1970-ci illərdə proteazlar yuyucu vasitələrə daxil edildi və sonra yüksək fruktoza şərbətləri şəklində tatlandırıcı maddələr istehsal etmək üçün qlükoza izomeraza tətbiq edildi. 1990-cı illərdən etibarən lipazlar yuyucu tozların tərkibinə daxil edilmişdir və bir çoxu hüceyrədaxili fermentlərdən istifadə edən müxtəlif immobilizasiya olunmuş ferment prosesləri hazırlanmışdır (fermentlərin immobilizasiyası bölməsinə baxın).

Hal-hazırda, fermentlər ticarət və texnologiyanın dörd fərqli sahəsində istifadə olunur (Cədvəl 6):


Fəaliyyətlər

Qida fermentləri EFSA-nın Qida Təmas Materialları, Fermentlər, Dadlandırıcılar və Emal Yardımları üzrə Paneli (CEF) tərəfindən həyata keçirilir. 2009-cu ildə CEF Paneli ərizəçilərə qida fermentlərinin təhlükəsizliyinin qiymətləndirilməsi üçün lazım olan məlumatlar haqqında təlimat nəşr etdi. Bu, qida məhsullarının təhlükəsizliyinin qiymətləndirilməsi üçün rəsmi müraciətin formatını, tələb olunan inzibati və texniki məlumatları və ümumiyyətlə tələb olunan toksikoloji testlərin çeşidini izah edir. Tələb olunan məlumatlar arasında ərizəçilər mənbə materiallarının şəxsiyyəti, istehsal prosesi, qiymətləndirilməsi və toksikoloji məlumatları (yuxarıda göstərilən hallar istisna olmaqla) təqdim etməlidirlər. 2011-ci ildə EFSA məlumat tələblərini daha da aydınlaşdıran və praktiki nümunələri təqdim edən dəstəkləyici izahat qeydini dərc etdi.

EFSA-nın Təhlükəsizliyin İxtisaslı Prezumpsiyası () siyahısı ilə əlaqədar olaraq, Səlahiyyətli orqan, artıq siyahıda olan hər hansı mikroorqanizmlər və ya təqdim oluna biləcək siyahıya daxil edilməsi üçün mümkün olan ən erkən anda məlumat almaq istəyir. qida fermenti tətbiqinin bir hissəsi kimi. Məlumat, o cümlədən ferment istehsalı üçün istifadə edilən mikrob və nəzərdə tutulan istifadə aşağıdakı ünvana göndərilməlidir: FIP [at] efsa.europa.eu .

Əsas iş gedir

EFSA qida fermentləri ilə bağlı iki əsas funksiyaya malikdir:

  • Aİ qanunvericiliyi ilə müəyyən edilmiş təqdimetmə müddəti ərzində Avropa İttifaqında (Aİ) hazırda bazara çıxarılan və ya bazara çıxarılması nəzərdə tutulan bütün fermentlərin qiymətləndirilməsi.
  • Təsdiqlənmiş fermentlərin Aİ siyahısı yaradıldıqdan sonra yeni fermentlərin icazəsi üçün müraciətlərin qiymətləndirilməsi.

Materiallar və metodlar

Bitki materialları

İyirmi yeddi bitki nümunəsi yerli olaraq Misirdəki bitki toxumu tədarükçülərindən alınmışdır (Cədvəl 1). Onlar müxtəlif miqdarda polisaxaridlər, zülallar və polifenollara malik olduqları və yeddi fərqli sıraya aid olduqları üçün bu tədqiqata yazılmaq üçün seçilmişlər. Bu bitki nümunələri əsasən Avropa, Amerika və Asiyada yayılmış müxtəlif ölkələrdən gətirilirdi. Bundan əlavə, müxtəlif təchizatçılardan dörd heyvan pəhriz nümunəsi (D1, D2, D3 və D4) alınmışdır. Bu dörd pəhriz nümunəsində soya və qarğıdalı qarışıqları var.

Reagentlər

3x ekstraksiya buferi: 3% CTAB (w/v), 1,4 M NaCl, 0,8 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 M EDTA pH 8,0 (avtoklavlanmış)

Xloroform: izoamil spirti (24:1 v/v).

Buzlu 100% izopropil spirti

1× TE tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 1 mM EDTA, pH 8.0, avtoklavlanmış).

Dəyişdirilmiş DNT ekstraksiya protokolu

3× ekstraksiya tamponunu su banyosunda 65 °C-də əvvəlcədən qızdırın. İstifadədən dərhal əvvəl 3× CTAB ekstraksiya tamponuna 0,3% 2-β-merkaptoetanol əlavə edin.

50 mq bitki nümunələrini əvvəlcədən soyudulmuş havan və havan istifadə edərək maye azotda toz halına gətirin. Hələ məhlulda ikən üyüdülmüş bitki nümunələrinə 800 μl əvvəlcədən qızdırılmış 3× CTAB ekstraksiya tamponunu əlavə edin və pestle ilə qarışdırmaq üçün yumşaq bir şəkildə çevirin.

Nümunə qarışığını 2 ml mikrosentrifuqa borusuna köçürün, 60-65 °C-də su banyosunda 1 saat inkubasiya edin, borunu hər 20 dəfə çevirərək hər 20 dəqiqədən bir yumşaq qarışdırın, sonra otaq temperaturuna qədər soyudun.

Bərabər həcmdə xloroform:izoamil spirti əlavə edin (24:1 v/v) və cüzi inversiya ilə qarışdırın.

Otaq temperaturunda (RT) 15 dəqiqə 13000 rpm-də sentrifuqa edin.

Geniş delikli pipetdən istifadə edərək, DNT-ni ehtiva edən yuxarı sulu fazanı 1,5 ml-lik yeni eppendorf borusuna diqqətlə köçürün.

Yuxarı sulu faza aydınlaşana qədər lazım olduqda çıxarma addımlarını (iv-vi) təkrarlayın.

Sulu fazanın həcmini hesablayın (təxminən 700 μl) sonra bu həcmin yarısını (350 μl) 6 M NaCl əlavə edin və yaxşı qarışdırın. Ardıcıl olaraq 1/10 həcmdə (70 μl) 3 M kalium asetat əlavə edin və eyni vaxtda 500 μl buzlu 100% izopropil spirti (sulu fazın həcminin təxminən üçdə ikisi) ilə qarışdırın. DNT ipləri əmələ gələnə qədər DNT-ni çökdürmək üçün yumşaq bir şəkildə çevirin.

-20 °C-də 30 dəqiqə inkubasiya edin.

13000 rpm-də 5 dəqiqə sentrifuqa edin, supernatantı atın.

Supernatantın boşaldılmasını başa çatdırmaq üçün DNT qranulunu ehtiva edən borunu toxuma kağızına çevirin.

DNT peletini 500 μl 70% etanol ilə yuyun və bir dəfə çevirin (qalıq duzları həll etmək və DNT-nin saflığını artırmaq üçün).

13000 rpm-də 5 dəqiqə sentrifuqa edin.

Borulardan 70% spirt atın. filtr kağızı üzərinə çevirin və qranul olan boruların otaq temperaturunda 15 dəqiqə qurumasına icazə verin.

DNT pelletini 50 μl 1 × TE tamponunda yenidən dayandırın. Tam yenidən dayandırılmasını təmin etmək üçün DNT-ni 50 °C-də 1-2 saat inkubasiya edin.

Sonrakı istifadə olunana qədər -20 °C temperaturda saxlayın.

Müəyyən edilmiş CTAB üsulu və dəyişdirilmiş protokolla çıxarılan DNT-nin kəmiyyət və keyfiyyət analizi

DNT konsentrasiyası, saflığı və keyfiyyəti

DNT konsentrasiyası 260 nm-də spektrofotometrik olaraq təyin edildi (A260) NanoDrop1000 (Thermo Scientific) istifadə edərək udma. DNT-nin zülal və polisaxarid çirklənməsindən təmizliyi (Wilson and Walker 2005) A-da absorbsiya nisbətini təxmin etməklə qiymətləndirilmişdir.260/A280 və A260/A230 müvafiq olaraq. Hər iki protokoldan istifadə edərək ekstraksiya edilmiş DNT-nin keyfiyyəti, həmçinin etidium bromid (1 mkq/ml) ilə boyanmış 0,8% agaroz geldə bütün DNT nümunələri üçün elektroforezin ayrılması yolu ilə qiymətləndirilib.

DNT həzm analizi

Fang və həmkarlarının (1992) proseduruna uyğun olaraq DNT nümunələrini həzm etmək üçün HindIII məhdudlaşdırıcı fermentdən istifadə edilmişdir. Təxminən 20 μg genomik DNT HindIII məhdudlaşdırıcı ferment (Amersham Pharmacia Biotech. UK Ltd) ilə 37 °C-də 1 saat ərzində ayrıca həzm olundu. PCR gücləndirilməsi üçün bütün ləkələnmiş elektroforez ayırma matrisləri və həm ekstraksiya edilmiş, həm də həzm olunmuş DNT nümunələri SYNGENE Bio Imaging Gel Documentation System (Böyük Britaniya) tərəfindən həll edilmişdir.

Təsadüfi gücləndirilmiş polimorfik DNT analizi

İstifadə olunan iki protokolu tətbiq etməklə müxtəlif bitki toxumlarından çıxarılan genomik DNT-nin PCR gücləndirilməsi Operon Primer Kits (Operon, ABŞ) tərəfindən sintez edilmiş təsadüfi gücləndirilmiş polimorfik DNT (RAPD) dekamer primerindən (OPZ-09) istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. Primer ardıcıllığı 5′-CAGCACTGAC-3′-dir. Devi və həmkarları (2013) tərəfindən təsvir edilən metoda uyğun olaraq bütün nümunələr üçün PCR aparılmışdır.

Geni dəyişdirilmiş (GM) bitkilərin aşkarlanması

Bu protokolun geni dəyişdirilmiş məhsulların aşkarlanması üçün uyğun keyfiyyətli DNT istehsalında effektivliyi də qiymətləndirilmişdir. Hazırkı protokol və ənənəvi üsul vasitəsilə müxtəlif bitki nümunələrindən təcrid olunmuş genomik DNT transformasiya proseslərində seçilə bilən marker gen kimi istifadə olunan neomisin fosfotransferaza geninin (nptII) PCR gücləndirilməsi üçün şablon kimi istifadə edilmişdir. NPTII-nin (173 bp hədəfi) mövcudluğu bu gen üçün xüsusi primerlərdən (F: 5′-GGATCTCCTGTCATCT-3′ və R: 5′-GGATCTCCTGTCATCT-3′) istifadə edərək, bu işdə qeyd olunan bitki toxumlarında tədqiq edilmişdir. PCR gücləndirilməsi 12,75 μl DNazsız su, 100 ng şablon DNT (2 μl), hər dNTP-dən 200 μM (2,5 μl), hər bir primerdən 2,5 pmol (2,5 μl) olan 25 μl reaksiya qarışığında aparılmışdır. və tərkibində 75 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM MgCl olan reaksiya tamponunda (2,5 μl) 2,5 vahid taq DNT polimeraza (0,25 μl)2, 50 mM KCl, 20 mM (NH4)2BELƏ Kİ4, və 0,001% BSA.

PCR gücləndirmələri 2 dəqiqə ərzində 98 °C-lik ilkin denaturasiya addımını yerinə yetirmək üçün proqramlaşdırılmış TM Thermal cycler (MJ Research PTC-100 thermocycler) ilə həyata keçirildi, ardınca denaturasiya üçün 95 °C-də 30 saniyədən ibarət 40 dövr, 45 s. yumşalma temperaturu (50 °C) və uzadılması üçün 72 °C-də 30 s. 72 °C-də 7 dəqiqəlik son uzatma addımı yerinə yetirildi. Döngü reaksiyası başa çatdıqdan sonra, hər bir reaksiya məhsulunun 10 μl-ə 2 μl yükləmə boyası (bromofenol mavisi) əlavə edildi və 1 μg/ml etidium bromid ilə boyanmış 2% agaroz gel elektroforezi ilə ayrıldı. PZR məhsulları SYNGENE Bio Imaging Gel Documentation System istifadə edərək, gözlənilən əsas cüt (bp) ölçüsündə (173 bp) flüoresan zolağın olması üçün təhlil edilmişdir.


Etika bəyannamələri

Rəqabət edən maraqlar

Müəlliflər məqalənin mövzusu ilə birbaşa ziddiyyətlərin olmadığını bilirlər, lakin M.G.V.H. Agios Pharmaceuticals, Aeglea Biotherapetics, iTeos Therapeutics, Faeth Therapeutics və Auron Therapeutics üçün elmi məsləhət şurasının üzvüdür. F.M. aşağıdakı şirkətlər üçün məsləhətçidir: Amgen, Daiichi, Ideaya Biosciences, Kura Oncology, Leidos Biomedical Research, PellePharm, Pfizer, PMV Pharma və Quanta Therapeutics. F.M. aşağıdakı şirkətlər üçün məsləhətçi və həmtəsisçidir (səhm opsionları daxil olmaqla, mülkiyyət payı ilə): BridgeBio, DNAtrix, Olema Pharmaceuticals və Quartz. F.M. Frederik Milli Xərçəng Tədqiqat Laboratoriyasında/Leidos Biotibbi Tədqiqatlarda NCI RAS Təşəbbüsünün elmi direktorudur. Bu mənsubiyyətlərin heç biri bu sənədlə bağlı maraqların toqquşmasını təşkil etmir.


Təsərrüfat genlərinin xüsusiyyətləri və problemləri

Təsərrüfat genləri qrupu unikal genomik və təkamül xüsusiyyətlərini birləşdirir. Onların məsələn, daha qısa intronlar və ekzonlar, daha sadə ardıcıllıq təkrarları və 5′ bölgəsində 2 nukleosom əmələ gəlməsi üçün daha aşağı potensial var. Buna baxmayaraq, mümkün ev təsərrüfatı genləri haqqında yeni məlumatların toplanması onların kompensasiya etmək üçün istifadə etdikləri eyni etibarlılıq problemləri ilə mübarizə aparır. Bir neçə birləşmə variantları, təkrarlanan bölgələr, və general aşağı ifadə of yuxarı axın ekzonları əks transkriptaza xətalarının səbəb olduğu RT-PCR nəticələrinin şərhini çətinləşdirir (şək. 1).

Digər bir məsələ Housekeeping genlərinin özünün tərifidir 3 . Genləri axtarmaq kifayətdirmi? bütün toxumalarda ifadə edilir, ya da genlər də olmalıdır sabit səviyyədə ifadə edilir toxumalar arasında? İlkin tədqiqatlar ümumiyyətlə ilk tərifi qəbul etdi və əslində GAPDH və eksperimental nəzarət üçün digər məşhur Housekeeping genlərinin toxumalar arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqləndiyi aşkar edildi. Buna görə də yeni təcrübəyə başlamazdan əvvəl digər tədqiqatçıların hansı gen(lər)dən istifadə etdiyini müəyyən etmək üçün öz sahənizdə ədəbiyyatı və texniki məlumatları nəzərdən keçirməyiniz məsləhətdir. Təcrübə vəziyyətinin fərdi Housekeeping geninin ifadəsinə göstərə biləcəyi hər hansı təsiri nəzərə almaq üçün hər bir gen ifadəsi təcrübəsi üçün birdən çox Housekeeping genindən istifadə edilməsi tövsiyə olunur.

Şəkil 1: Housekeeping Gen aşkarlanmasında baş verən problemlər. (I) Bir neçə əlavə variantı olan genlər, genin müxtəlif hissələri üçün fərqli ifadə səviyyələrinə malik ola bilər. (II) Dublikativ bölgələr, ifadə səviyyəsinin ölçülməsinə mənfi təsir göstərə bilər. (III) Qismən cDNT molekulları ilə nəticələnən qeyri-kamil əks transkripsiyaya görə yuxarı axın ekzonlarının aşağı ifadəsi (orta hesabla).


Videoya baxın: Boğaz altə qırışların aradan дряблости шеи на Plexr Plus. (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Duante

    Bilirəm, necə hərəkət etmək lazımdır...

  2. Brainard

    Və effektivdirmi?

  3. Machaon

    İnanılmaz cavab)

  4. Serafim

    Sən düzgün deyilsən. Mən əminəm. Bunu müzakirə edək. PM-də mənə e-poçt göndərin, danışacağıq.

  5. Martyn

    I congratulate, the admirable idea and it is timely

  6. Alaric

    Mənə parlaq düşüncə kimi görünür



Mesaj yazmaq