Məlumat

12.2H: Floresan Anticisimlər - Biologiya

12.2H: Floresan Anticisimlər - Biologiya



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Floresan antikorları laboratoriyada aşkarlanmasını asanlaşdırmaq üçün flüoresan birləşmə ilə işarələnmiş antikorlardır.

Öyrənmə Məqsədləri

  • Flüoresan antikor konjugatlarının zülal aşkarlanması üçün immunoassaylarda necə istifadə oluna biləcəyini təsvir edin

Əsas Nöqtələr

  • İmmunoloji testlərin həssaslığını və spesifikliyini artırmaq üçün radioizotoplar və fermentlər əvəzinə antikorların floresan etiketlənməsi istifadə olunur.
  • Flüoresan anticisimlər xəstə serumundan və ya slaydda sabitlənmiş toxuma bölmələrindən və ya suspenziyadakı canlı hüceyrələrdən zülalları ləkələmək üçün istifadə edilə bilər.
  • Floresan antikorları flüoresan mikroskop və ya axın hüceyrə çeşidləyicisi ilə aşkar edilə bilər.

Əsas Şərtlər

  • radioizotop: Elementin radioaktiv izotopu.

Floresan etiketləmə antigenlərin və antikorların mürəkkəbliyini nümayiş etdirməyin başqa bir üsuludur. Floresan molekulları radioizotop və ya ferment etiketləri üçün əvəzedici kimi istifadə olunur. Floresan antikor texnikası antikorun floresan izotiyosiyanat (FITC) kimi boyalarla etiketlənməsindən ibarətdir. Bu birləşmələr birləşdikləri zülallara yüksək yaxınlığa malikdirlər.

Floresan üsulları çox spesifik və həssasdır, buna görə də flüoresan antikor əsaslı üsullar flüoresan mikroskop tələb edir. Floresan maddə bir dalğa uzunluğunun işığını udur və daha uzun dalğa uzunluğunun işığını yayır. Flüoresan mikroskop altında həyəcanlandıqda floresan sıx alma-yaşıl rəng verir. Birbaşa mikroskop müayinəsi ilə aşkarlanmasına imkan vermək üçün antikorların floresan boyalarla etiketlənməsi zamanı kimyəvi manipulyasiya antikorların fəaliyyətini pozmur.

Spesifik bir antikorun flüoresan molekulu ilə etiketlənməsindən sonra, o, hələ də antigeni ilə reaksiya verə və mikroskopik olaraq müəyyən edilə bilər. Flüoresan antikor konjugatları adətən immunoassaylarda istifadə olunur. Floresan antikorlarından istifadə edən əsas üsullara birbaşa, inhibə və dolayı immunofluoresan analiz daxildir.

Birbaşa texnikada mikroskopik səviyyədə antigen-antikor reaksiyalarını aşkar etmək üçün floresan antikor istifadə olunur. İnhibisyon immunofluoresan analizi bir antigenin əvvəlcə etiketlənməmiş antikora, sonra flüoresan antikora məruz qaldığı və nəhayət yuyulduğu və araşdırıldığı bir bloklama testidir. Dolayı immunofluoressensiya analizi antikorların antigenlərlə reaksiya vermə qabiliyyətinə, eləcə də antigen rolunu oynamağa və anti-antikorla (anti-immunoqlobulin) reaksiyaya əsaslanır. Bu üsul toxuma və hüceyrə antigenlərinə qarşı otoantikorların və antikorların aşkarlanması üçün geniş istifadə olunur. Təsvir edilən üsullar əsasən xəstə serumu və ya toxuma bölmələri olan şüşə slaydlarda aparılır. Süspansiyondakı canlı hüceyrələrdə xüsusi antigenləri müəyyən etmək üçün immunofluoressensiya da həyata keçirilə bilər. Bu üsul axın sitometriyası kimi tanınır və flüoresan mikroskopdan daha çox axın hüceyrə çeşidləyicisini tələb edir.


İmmunofluoressensiya protokollarını optimallaşdırmaq üçün məsləhətlər Ən yaxşı Şəkil əldə etmək

İmmunofluoressensiya (IF) üçün istifadə olunur - burada antikor lazerlər tərəfindən həyəcanlandıqda flüoresan olan bir molekula konyuqasiya olunur - zülalların lokalizasiyası, translyasiyadan sonrakı modifikasiya və ya aktivləşmənin təsdiqi və digər zülallara yaxınlıq/kompleksləşmə daxildir. İmmunositokimya (ICC) hüceyrə nümunələrindəki hədəflərə bağlanmaq üçün antikorlardan istifadə edən yaxşı qurulmuş bir texnikadır və Coons və b İlk dəfə 1942-ci ildə flüoresan məruzəçi molekulundan istifadə edərək immunodeteksiya təsvir edilmişdir. Hüceyrəaltı hədəflər haqqında məlumat verməklə yanaşı, immunofluoressensiyanı immunositokimya ilə birləşdirmək həyat elmlərində ən cəlbedici vizual məlumatlardan bəzilərini yaradır. Bu təlimatda antikor alimləri IF-ICC təcrübələrinizdən mümkün olan ən yaxşı görüntünü əldə etmək haqqında öyrəndiklərimizi bölüşürlər.

Şəkil 1. İmmunositokimya (ICC) neyron nüvələri, soma və aksonlarla əlaqəli zülalların yerini müəyyən edir (solda). U-251 MG insan hüceyrə xəttinin sağ, immunofluoresan boyaması.


Hamar əzələlərin aktivləşdirilməsi zamanı fermentlərin köçürülməsi

Rauf A. Xəlil, Kathleen G. Morgan, Hamar əzələlərin daralmasının biokimyası, 1996

1 Canlı Hüceyrələrdə Floresans Mikroskopiyası

Floresan mikroskopiyası bütöv hüceyrələrdə fermentlərin hüceyrəaltı paylanmasını öyrənməyə imkan verir. Canlı hüceyrələrdə kinazaların paylanmasını birbaşa izləmək üçün nisbətən az sayda zond mövcuddur. Bir nümunə canlı hüceyrələrdə PKC paylanmasını izləmək üçün istifadə edilən floresan forbol ester törəməsi Bodipy phorboldur (Xəlil və Morgan, 1991). Bu birləşmə membran keçiricidir, lakin PKC agonist fəaliyyətini saxlamaq dezavantajına malikdir. Əks mənfi cəhəti, yəni PKC antaqonist fəaliyyətinin saxlanmasını göstərən bir qrup birləşmələr mövcud olmuşdur (Chen və Poenie, 1993). Canlı hüceyrələrdə cAMP-dən asılı zülal kinaz paylanmasına və aktivliyinə nəzarət etmək üçün ratsional göstəricinin istifadəsi təsvir edilmişdir (Bacskai) və b, 1993), lakin bu anda hamar əzələlərdə istifadəsi bildirilməyib. Digər əlaqəli yanaşma, etiketli antikorları keçirici fizioloji cəhətdən bütöv hüceyrələrə daxil etməkdir (Iizuka və b, 1994). Bu yanaşmanın çətinliyi bütöv hüceyrədə qeyri-spesifik bağlanma yerlərinin "blocked" olub-olmaması problemidir.


Alətlər

Ənənəvi axın sitometrləri

Ənənəvi axın sitometrləri üç sistemdən ibarətdir: maye, optika və elektronika. Maye sistemi nümunəni lazerin kəsilməsinə və ya nümunənin təhlil edildiyi sorğu nöqtəsinə çatdırmaq və fokuslamaq üçün təzyiq altında olan qabıq mayesindən (adətən tamponlu şoran məhlulundan) ibarətdir. Optik sistem nümunəni təhlil etmək üçün istifadə olunan görünən və flüoresan işıq siqnallarını yaradan həyəcanlandırma optiklərindən (lazerlər) və toplama optiklərindən (fotomçoğaltıcı borular və ya PMT və fotodiodlardan) ibarətdir. Bir sıra dikroik filtrlər flüoresan işığı xüsusi detektorlara yönləndirir və bant keçirici filtrlər oxunan işığın dalğa uzunluqlarını müəyyən edir ki, hər bir flüoroxrom aşkarlana və ölçülə bilsin. Daha dəqiq desək, dikroik filtrlər dalğa uzunluğunda daha qısa və ya daha uzun olan işığı keçirən və qalan işığı bucaq altında əks etdirən filtrlərdir. Məsələn, 450 Dichroic Long Pass filter (DLP) 450 nm-dən daha uzun dalğa uzunluğuna malik işığı filtrdən keçirməyə imkan verir və başqa detektora göndərilmək üçün işığın daha qısa dalğa uzunluqlarını bucaq altında sıçrayır. Bandpass filtrləri işığın müəyyən dalğa uzunluğunun kiçik bir pəncərəsini aşkar edir. Məsələn, 450/50 diapazonlu bir filtr detektor tərəfindən oxunacaq filtrdən 450 nm +/− 25 nm dalğa uzunluğuna malik flüoresan işığı keçir. Elektron sistem detektorlardan gələn siqnalları kompüter tərəfindən oxuna bilən rəqəmsal siqnallara çevirir.

Çox vaxt 20 parametrə (FSC, SSC və 18 flüoresan detektor) malik olan alətlərdə çoxlu lazer sistemləri ümumidir. Beş və ya daha çox lazer və 30 parametrli yeni alət platformaları təqdim olunur, lakin bunlar daha az yayılmışdır. Ənənəvi axın sitometrlərində istifadə olunan ən çox yayılmış lazerlər 488 nm (mavi), 405 nm (bənövşəyi), 532 nm (yaşıl), 552 nm (yaşıl), 561 nm (yaşıl-sarı), 640 nm (qırmızı) və 355 nm (ultrabənövşəyi) lazerlərdir. . Xüsusi tətbiqlər üçün əlavə lazer dalğa uzunluqları mövcuddur. Bundan əlavə, həssaslığı artırmaq məqsədi ilə floresansın aşkarlanması üçün PMT-ləri uçqun fotodiodları (APD) ilə əvəz edən alətlər var.

Akustik Fokuslu Sitometrlər

Bu sitometr lazer sorğulaması üçün hüceyrələri daha yaxşı fokuslamaq üçün ultrasəs dalğalarından istifadə edir. Bu tip akustik fokuslanma daha yüksək nümunə daxilinə və daha az nümunə tıxanmasına imkan verir. Bu sitometr 4 lazer və 14 flüoresan kanaldan istifadə edə bilər.

Hüceyrə çeşidləyiciləri

Ənənəvi axın sitometrinin xüsusi növü əlavə analiz üçün nümunələri təmizləyə və toplaya bilən hüceyrə çeşidləyicisidir. Hüceyrə çeşidləyicisi istifadəçiyə istənilən parametrlər üçün müsbət (və ya mənfi) olan hüceyrələr və ya hissəciklər populyasiyasını seçməyə (qapıya) imkan verir və sonra həmin hüceyrələri toplama qabına yönləndirir. Hüceyrə çeşidləyicisi damcı yaratmaq üçün mayenin nümunə axını yüksək tezlikdə yelləməklə hüceyrələri ayırır. Daha sonra damcılara müsbət və ya mənfi yük verilir və metal əyilmə plitələrindən keçir və burada yüklərinə əsasən xüsusi bir toplama qabına yönəldilir. Toplama qabları borular, sürüşmələr və ya lövhələr ola bilər (96 quyu və ya 384 quyu ümumidir).

Lazer sorğulama nöqtəsinin yerləşdiyi yerə görə fərqlənən iki növ hüceyrə çeşidləyicisi var, kvars kyuvet və “jet-in-air”. Kvars kyuvetli hüceyrə çeşidləyiciləri sabit lazer düzülməsinə malikdir və növə hazırlamaq daha asandır. “jet in air” hüceyrə çeşidləyiciləri lazerləri gündəlik uyğunlaşdırmalıdır və quraşdırmaq daha çətindir, lakin kiçik hissəciklərin aşkarlanması üçün daha uyğundur.

Görüntüləmə Sitometrləri

Görüntü axını sitometrləri (IFC) ənənəvi axın sitometriyasını flüoresan mikroskopiya ilə birləşdirir. Bu, həm tək hüceyrə, həm də populyasiya səviyyəsində morfologiya və çox parametrli flüoresans üçün nümunənin sürətli təhlilinə imkan verir (Barteneva, Fasler-Kan, & Vorobjev, 2012). IFC konfokal və ya flüoresan mikroskop kimi ayrı-ayrı hüceyrələrdə zülal paylanmasını izləyə bilər, həm də axın sitometri kimi çoxlu sayda hüceyrəni emal edə bilər. Hüceyrə siqnalı, birgə lokalizasiya tədqiqatları, hüceyrədən hüceyrəyə qarşılıqlı əlaqə, DNT zədələnməsi və təmiri və hüceyrənin böyük populyasiyalarında flüoresan ifadəsi ilə hüceyrə yerini koordinasiya edə bilməsi lazım olan hər hansı bir tətbiq kimi bir çox tətbiqlərdə xüsusilə faydalıdır.

Kütləvi sitometrlər

Kütləvi sitometrlər uçuş vaxtı kütlə spektrometriyasını və axın sitometriyasını birləşdirir. Hüceyrələr flüoresan işarəli antikorlar əvəzinə ağır metal ionları ilə işarələnmiş antikorlarla (adətən lantanid seriyasından) etiketlənir və uçuş vaxtı kütlə spektrometriyasından istifadə etməklə aşkarlanır. Kütləvi sitometrlərdə hüceyrə aqreqatlarının aşkarlanmasının ənənəvi metoduna imkan verməyən FSC və ya SSC işıq aşkarlanması yoxdur. Bununla belə, bu məqsədlə mobil barkodlama kimi digər üsullardan da istifadə edilə bilər (Leipold, Newell, & Maecker, 2015). Həmçinin, kütləvi sitometriyada hüceyrə avtoflüoresan siqnalları yoxdur və reagentlərdə flüoresan etiketlərlə əlaqəli emissiya spektral üst-üstə düşməsi yoxdur, ona görə də kompensasiya tələb olunmur. Bununla belə, nümunə analiz zamanı məhv edilir, ona görə də hüceyrələrin çeşidlənməsi mümkün deyil və əldəetmə dərəcəsi standart axın sitometrindən (10,000 hüceyrə/saniyə əvəzinə 1000 hüceyrə/saniyə) çox aşağıdır. Hal-hazırda, 40 kanal üçün kommersiya reagentləri mövcuddur, lakin bu say antikorlara konjuqasiya üçün platin kimi digər metal ionlarının tətbiqi ilə artacaq (Mei, Leipold, & Maecker, 2016).

Bead Array Analizi üçün Sitometrlər

Multipleks muncuq massivləri kiçik nümunə həcmlərində böyük miqdarda analitin təhlili üçün məşhur olmuşdur. Qısaca olaraq, bu analizlər spesifik muncuqla əlaqəli tutulan analitin miqdarını ölçmək üçün xüsusi bir kanalda məlum miqdarda flüoresans olan tutma muncuqlarından və ayrıca lazer tərəfindən aşkar edilən reportyor molekulundan istifadə edir. Bu, mahiyyətcə 100 ELISA analizinə bərabərdir.

Bu analizləri təhlil etmək üçün adətən 2 lazer və 96 quyu yükləyicisi olan kiçik axın sitometrləri hazırlanmışdır. Bu alətlər kiçik ayaq izlərinə və iki kanal boyunca müxtəlif miqdarda flüoresan olan muncuqları aşkar etmək və ayırmaq üçün optimallaşdırılmış optik dəzgah dizaynlarına malikdir. 100-dən çox müxtəlif muncuq birləşməsini aşkar edə bilən alətlər hazırlanmışdır.

Spektral analizatorlar

Çox parametrli axın sitometriyasının problemlərindən biri fluroxromlar arasında kompensasiya (və ya spektral üst-üstə düşmənin silinməsi) ilə bağlıdır. Yeni bir axın sitometri növü olan spektral analizator bu problemi həll etmək üçün xüsusi olaraq hazırlanmışdır. Spektral analizator spektral barmaq izini yaratmaq üçün çoxrəngli nümunədə hər bir flüoroxrom üçün bütün flüoresan emissiya spektrlərini ölçür. Sonra analiz zamanı hər bir flüoroxrom üçün təmiz siqnal təmin etmək üçün hər bir spektr qarışdırılır (Sony, 2017). Spektral analiz yüksək ölçülü axın sitometriyası üçün aşkarlama metodu kimi ənənəvi PMT-ləri əvəz etməyə başlayır.

Yeni Detektor Texnologiyaları

Fotoçoğaltıcı borular (PMTs) axın sitometriyası üçün standart detektor texnologiyası olaraq qalır. Onların yüksək həssaslığı və aşağı fonları onları flüoresan texnologiyası üçün faydalı edir. Bununla belə, bəzi sitometrlərdə bərk hal detektorları görünməyə başlayır. Uçqun fotodiodları (APDs) ucuz, həssas və yüksək xəttidir və uzun qırmızı bölgədə daha çox spektral cavab verir. Silikon fotodiodlar (SiPDs) həm də bərk hal detektorları üçün perspektivli seçimdir.


Floresensiya

2005-ci ildə Active Motif 2001-ci ildə flüoresan biosensorlar sahəsində dünya lideri olan professor Otto Volfbeis tərəfindən yaradılmış Alman şirkəti Chromeon GmbH-ni aldı. Chromeon GmbH təkmilləşdirilmiş flüoresan əsaslı bioloji analizlərin işlənib hazırlanması ehtiyacını erkən müəyyən etmişdi.

Active Motif analizinin işlənməsini Chromeon-un flüoresan kimyası ilə birləşdirərək, biz Chromeon GmbH-də hazırlanmış xüsusi flüoresan boyaları və substratları özündə birləşdirən innovativ hüceyrə və molekulyar biologiya analizlərini inkişaf etdirməyə çalışırıq. Həssaslıq və çeviklik təmin edən Active Motif Chromeo boyaları flüoresan həyəcanlandırma və emissiyanın geniş diapazonu, böyük Stokes yerdəyişmələri, məhdud fotoağartma və geniş pH tolerantlığı daxil olmaqla, üstün lüminesans xassələri nümayiş etdirir.

Floresan mikroskopiyası floresan etiketli antikorlarla (İmmunofluoressensiya və ya İF) hüceyrə mühitində xüsusi zülalları aşkar etmək və onların lokalizasiyası, dəyişdirilməsi, qarşılıqlı əlaqəsi və həyat dövrü ilə bağlı suallara cavab vermək üçün geniş istifadə olunur. Bununla belə, son vaxtlara qədər hüceyrə biologiyası tədqiqatında flüoresan mikroskopiyadan istifadə görüntüləmə təcrübələrində əldə edilə bilən qətnamə ilə məhdudlaşır.

Şəkillərin həlli mikroskopun həyəcan şüasının fokuslana biləcəyi nöqtənin ölçüsü ilə məhdudlaşır. Bu, işıq saçan işığın dalğa uzunluğundan və alətin parametrlərindən asılıdır. Əldə edilə bilən ən yüksək qətnamə Abbe Qanunu ilə müəyyən edilir:

Şəkil 1: Abbe Qanunu mikroskopiyada əldə edilə bilən qətnaməni təsvir edir.

x = fəza ayırdetmə qabiliyyəti lambda = həyəcanlanan işığın dalğa uzunluğu
2n sin &alpha = mikroskopun ədədi aperturası

The Abbe limiti az ilə ayrılmış obyektləri müşahidəçinin vizual həll etmək qabiliyyətini məhdudlaşdırır

200 nm. Bu, flüoresan mikroskopiya ilə kiçik bakteriyaları, virusları, ribosomları və ya zülal qruplarını öyrənməyi qeyri-mümkün edir. Bununla belə, son bir neçə il ərzində bu məhdudiyyəti aradan qaldıran bir neçə yeni texnologiya hazırlanmışdır.

Super rezolyusiyaya malik flüoresan mikroskopiya (başqa adla yüksək rezolyusiyaya malik mikroskopiya) ayırdetmə qabiliyyətinin 20-30 nm qədər aşağı olmasına imkan verən difraksiya maneəsini &ldquobreak&rdquo edən bir qrup texnikanı təsvir edir. Bu üsullar ayırdetmə qabiliyyətini əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırmaq üçün xüsusi fizika və alət parametrlərindən və yüksək keyfiyyətli flüoresan boyaların xüsusiyyətlərindən istifadə edir. Baxmayaraq ki, bu üsullar iki fərqli yanaşmaya bölünə bilər, onların bir ümumi əsası var: flüoresan molekulları istədiyiniz zaman söndürmək imkanı.

Şəkil 2: Konfokal və STED mikroskopiyasında Aktiv Motifin əsas antikorları və flüoresan ikincili antikorları.

HeLa hüceyrələri alfa Tubulin siçan mAb (Clone 5-B-1-2) və ATTO 647N (STED/GSD) Keçi anti-siçan IgG (Kataloq No. 15038) ilə boyanmışdır. Histon H3 Histon H3 trimetil Lys4 dovşan poliklonal antikoru (Kataloq No. 39159) və Chromeo 488 Keçi anti-dovşan IgG (Kataloq No. 15041) ikincil antikoru ilə boyandı. Konfokal (solda) və STED (sağda) şəkillər Leica Microsystems, Almaniyanın nəzakətidir.

Birbaşa optik görüntüləmə ilə super qətnamə

Birinci yanaşma, fokus nöqtəsinin xarici bölgələrindəki molekulların söndürüldüyü konfokal mikroskopiyaya əsaslanır. Bu, flüoresan ləkənin ölçüsünü azaldır, çünki yalnız həyəcan zonasının mərkəzindəki boyaların flüoresans yaymasına icazə verilir. STED (STtəqlid edilmişdir Emissiya Dtükənmə) və STED CW (Cdavamlı Vpr) bu birbaşa optik təsvir üsullarına aiddir. Nümunələr normal şəkildə skan edildiyi üçün onlar heç bir hesablama qiymətləndirməsi tələb etmir. Əlavə məlumat üçün STED mikroskopiya məhsulları səhifələrimizə müraciət edin.

Lokalizasiya ilə super həll

Bu yanaşmada, həyəcanlanan ərazidəki molekulların əksəriyyəti qaranlıq bir vəziyyətə çevrilir, yalnız bəzi tək boya molekullarının flüoresan işığı yaymasına icazə verilir. Bu ayrı-ayrı molekulların mövqeyi riyazi alqoritmlə müəyyən edilir və hər biri vizuallaşdırılır. Boyaların söndürülməsi dövrünü təkrarlamaq və qalan ayrı-ayrı emitentlərin flüoresansını aşkarlamaqla minlərlə şəkil yaradılır, bu təsvirlər birləşərək son yüksək keyfiyyətli təsviri yaradır. Fərdi molekulların lokalizasiyasının stoxastik oxunmasının bu sinfinə bir neçə üsul aiddir: Fırtına (SToxastik Optical Rtikinti Mikroskopiya), PALM (PhotoAaktivləşdirilib Lokalizasiya Mikroskopiya) və GSDIM (Gdəyirmi State Dilə tükənmə Ifərdi Molekulun qaytarılması). Lokalizasiyaya əsaslanan mikroskopiya haqqında daha çox məlumat üçün GSDIM mikroskopiya məhsulları səhifəmizə daxil olun.

Yüksək ayırdetmə mikroskopiyası ilə Abbe həddini aşmaq və klassik konfokal mikroskopiya ilə müqayisədə ayırdetmə qabiliyyətini 12 dəfəyə qədər artırmaq mümkündür. 50 nm-dən aşağı qətnamələrdə təsvir eksperimentlərini yerinə yetirmək qabiliyyəti ayrılmasını asanlaşdırır. subhüceyrə quruluşları əvvəllər həll edilə bilməyən və birgə lokallaşan zülalların və strukturların bioloji rollarına inamı artırır.


Aşkarlama

Aşkarlama adətən iki üsuldan biri ilə əldə edilir: (a) kolorimetrik və ya ferment vasitəsilə aşkarlama və (b) flüoresan əsaslı aşkarlama.

İçində kolorimetrik üsul, bağlı birincili və ya ikincil antikor bir ferment tərəfindən çevrildikdə çöküntü məhsulu verən bir substrata birləşir. Bu çöküntü işıq mikroskopiyası ilə baxdıqda rəngli ləkə kimi görünür.

İçində floresan əsaslı aşkarlama üsulla, toxumada maraq doğuran antigenə bağlı antikor birbaşa və ya dolayı yolla flüorofora (həmçinin bəzən flüoroxrom da deyilir), xüsusi dalğa uzunluğunun işığının mövcudluğunda flüoresanlaşan molekula birləşir.


12.2H: Floresan Anticisimlər - Biologiya

1960-cı illərin əvvəllərində yaşıl flüoresan zülalın kəşfi, canlı sistemlərdə hüceyrə proseslərini izləmək üçün tədqiqatçılara molekulyar klonlama üsullarını tətbiq etməyə, flüorofor hissəsini müxtəlif zülal və ferment hədəflərinə birləşdirməyə imkan verərək, nəticədə hüceyrə biologiyasında yeni bir dövrü müjdələdi. optik mikroskopiya və əlaqəli metodologiyadan istifadə etməklə.Geniş sahəli flüoresans və konfokal mikroskopiya sahəsində son texniki nailiyyətlər, o cümlədən ultrasürətli aşağı işıq səviyyəli rəqəmsal kameralar və çox izləmə lazer idarəetmə sistemləri ilə birləşdirildikdə, yaşıl flüoresan zülal və onun rəngi dəyişdirilmiş genetik törəmələri minlərlə canlı hüceyrə görüntüləmə təcrübələrində əvəzolunmaz xidmət nümayiş etdirdi. .

Şəkil 1 - Canlı Hüceyrələrdə Flüoresan Protein Etiketləri

1961-ci ildə Vaşinqton Universitetinin Friday Harbor laboratoriyalarında işləyən Osamu Şimomura və Frank Conson ilk dəfə kalsiumdan asılı biolüminessent zülalı təcrid etdilər. Aequorea victoria adlarını verdikləri meduza aequorin. İzolyasiya proseduru zamanı aequorinin mavi radiasiyalı bioluminescent xüsusiyyətlərindən məhrum olan, lakin ultrabənövşəyi işıqla işıqlandırıldıqda yaşıl flüoresans yarada bilən ikinci bir zülal müşahidə edildi. Bu xüsusiyyətinə görə, zülal sonda qeyri-təntənəli adı ilə vəftiz edildi yaşıl floresan protein (GFP). Sonrakı iki onillikdə tədqiqatçılar müəyyən etdilər ki, aequorin və yaşıl flüoresan zülal, kalsiumun yaratdığı lüminessensiya siqnallarını növün xarakterik yaşıl flüoresansına çevirmək üçün meduzaların işıq orqanlarında birlikdə işləyir.

Yaşıl flüoresan zülal üçün genin ilk dəfə 1992-ci ildə klonlanmasına baxmayaraq, molekulyar zond kimi əhəmiyyətli potensial bir neçə il sonra, bakteriya və nematodlarda gen ifadəsini izləmək üçün birləşmə məhsulları istifadə edilənə qədər həyata keçirilmədi. Bu erkən tədqiqatlardan bəri yaşıl flüoresan zülal geniş şəkildə flüoresan zülallar kimi adlandırılan çoxlu sayda müxtəlif rəngli mutantlar, birləşmə zülalları və biosensorlar istehsal etmək üçün hazırlanmışdır. Bu yaxınlarda, digər növlərdən olan flüoresan zülallar müəyyən edildi və təcrid olundu, nəticədə rəng palitrası daha da genişləndi. Floresan zülal texnologiyasının sürətli təkamülü ilə, canlı hüceyrələrdə etiketlənmiş biomolekulların sadə izlənilməsindən kənar geniş spektrli tətbiqlər üçün bu genetik kodlanmış flüoroforun faydası indi tam qiymətləndirilir.

illüstrasiyalı Şəkil 1 sub-hüceyrə (orqanel) yerlərdə hədəflənmiş birləşmə məhsullarından istifadə edərək canlı hüceyrələrdə çoxlu flüoresan zülal etiketlənməsinin iki nümunəsidir. Opossum böyrək korteksinin proksimal borucuqunun epitel hüceyrəsi (tamam xətt) təqdim olunur Şəkil 1(a) ya nüvəyə (gücləndirilmiş mavi flüoresan zülal) nəqlinə vasitəçilik edən peptid siqnalları ilə birləşmiş flüoresan zülal variantlarının kokteyli ilə transfeksiya edilmişdir. ECFP), mitoxondriya (DsRed floresan protein DsRed2FP) və ya mikrotubul şəbəkəsi (inkişaf etmiş yaşıl flüoresan protein EGFP). İnsan servikal adenokarsinoma epitel hüceyrələrindən ibarət oxşar nümunə (HeLa xətt) şəklində təsvir edilmişdir Şəkil 1(b). HeLa hüceyrələri mavi rəngə birləşdirilmiş subhüceyrəvi lokalizasiya vektorları ilə birlikdə transfeksiya edildi (mFiruzəyi) və sarı (mVenera) floresan zülal kodlaşdırma ardıcıllığı (müvafiq olaraq Qolqi kompleksi və nüvə), həmçinin mitoxondrial şəbəkəni hədəf alan "Meyvə" zülalı, mCherry.

Yaşıl flüoresan zülal və onun mutasiyaya uğramış allel formaları, mavi, mavi və sarı flüoresan zülalları, mühəndis vektorlarla transfeksiya edildikdən sonra canlı hüceyrələrdə, toxumalarda və bütün orqanizmlərdə ifadə oluna bilən flüoresan kimerik zülalların qurulması üçün istifadə olunur. Qırmızı flüoresan zülallar digər növlərdən, o cümlədən mərcan rifi orqanizmlərindən təcrid edilmişdir və eyni dərəcədə faydalıdır. Floresan zülal texnikası, etiketlənmiş zülalların hüceyrələrə təmizlənməsi, etiketlənməsi və daxil edilməsi problemindən və ya səth və ya daxili antigenlər üçün xüsusi antikorların istehsalı vəzifəsindən qaçır.

Aequorea victoria Yaşıl Floresan Proteinin Xüsusiyyətləri və Modifikasiyaları

Yaşıl flüoresan zülalının ən vacib cəhətlərindən biri də odur ki, bütün 27 kiloDalton yerli peptid strukturu onun flüoresansının inkişafı və saxlanması üçün vacibdir. Maraqlıdır ki, flüorofor prinsipi bitişik amin turşularının üçlüsündən əldə edilir: 65, 66 və 67-ci yerlərdəki serin, tirozin və qlisin qalıqlarından (bu kimi istinad edilir). Ser65, Tyr66, və Gly67 görmək Şəkil 2). Bu sadə amin turşusu motivi təbiətdə çox rast gəlinsə də, ümumiyyətlə flüoresanla nəticələnmir. Floresan zülal üçün unikal olan, bu peptid üçlüyünün yerinin 11-dən ibarət olduqca sabit bir barel quruluşunun mərkəzində olmasıdır. beta- boruya qatlanmış təbəqələr.

Yaşıl flüoresan zülalın mərkəzindəki hidrofobik mühitdə Ser65-in karboksil karbonu ilə Gly67-nin amin azotu arasında reaksiya baş verir ki, bu da imidazolin-5-on heterosiklik azot halqası sisteminin əmələ gəlməsi ilə nəticələnir (şəkildə göstərildiyi kimi). Şəkil 2). Sonrakı oksidləşmə imidazolin halqasının Tyr66 ilə konjuqasiyası və flüoresan növün yetişməsi ilə nəticələnir. Qeyd etmək vacibdir ki, yerli yaşıl flüoresan protein flüorofor iki vəziyyətdə mövcuddur. Protonlaşdırılmış forma, üstünlük təşkil edən vəziyyət, 395 nanometrdə həyəcanlanma maksimumuna və təxminən 475 nanometrdə udulan daha az yayılmış, protonlaşdırılmamış bir forma malikdir. Həyəcan dalğasının uzunluğundan asılı olmayaraq, flüoresan emissiya 507 nanometrdə maksimum pik dalğa uzunluğuna malikdir, baxmayaraq ki, pik genişdir və yaxşı müəyyən edilməmişdir.

Şəkil 2 - Yaşıl Flüoresan Protein Fluorofor Yetişməsi

Flüoresan zülal flüoroforun iki üstünlük təşkil edən xüsusiyyəti onun bir zond kimi istifadəsinə mühüm təsir göstərir. Birincisi, flüorofor kimi yaşıl flüoresan zülalın fotofiziki xüsusiyyətləri olduqca mürəkkəbdir və beləliklə, molekul əhəmiyyətli miqdarda modifikasiyanı qəbul edə bilər. Bir çox tədqiqatlar geniş spektrli molekulyar zondlar təmin etmək üçün yerli yaşıl flüoresan zülalın flüoresansını dəqiq tənzimləməyə yönəlmişdir, lakin zülaldan qabaqcıl flüoroforların qurulması üçün başlanğıc material kimi istifadə edilməsinin daha əhəmiyyətli və geniş potensialını nəzərə almaq olmaz. Yaşıl flüoresan zülalın ikinci mühüm xüsusiyyəti flüoresansın tripeptid flüoroforunu əhatə edən molekulyar quruluşdan çox asılı olmasıdır.

Yaşıl flüoresan zülalın denaturasiyası, gözlənildiyi kimi, flüoresansı məhv edir və tripeptid flüoroforu əhatə edən qalıqlara mutasiyalar flüoresans xüsusiyyətlərini kəskin şəkildə dəyişə bilər. İçindəki amin turşusu qalıqlarının qablaşdırılması beta barel son dərəcə sabitdir, bu da çox yüksək flüoresan kvant məhsuldarlığı ilə nəticələnir (80 faizə qədər). Bu sıx zülal strukturu həmçinin pH, temperatur və karbamid kimi denaturantlardakı dalğalanmalar səbəbindən flüoresan dəyişikliklərinə müqavimət göstərir. Yüksək sabitlik səviyyəsi ümumiyyətlə floresansı pozan yaşıl flüoresan zülaldakı mutasiyalar tərəfindən mənfi şəkildə dəyişdirilir, nəticədə kvant məhsuldarlığının azalması və ətraf mühitin həssaslığı artır. Bu qüsurların bir neçəsi əlavə mutasiyalarla aradan qaldırılsa da, törəmə flüoresan zülallar ümumiyyətlə yerli növlərə nisbətən ətraf mühitə daha həssasdır. Genetik variantlarla eksperimentlər tərtib edərkən bu məhdudiyyətlər ciddi şəkildə nəzərə alınmalıdır.

Flüoresan zülalları məməli sistemlərində istifadə etmək üçün uyğunlaşdırmaq üçün vəhşi tipli yaşıl flüoresan zülalın bir neçə əsas modifikasiyası həyata keçirilmişdir və indi bütün tez-tez istifadə olunan variantlarda tapılır. İlk addım flüoresansın yetişməsini 37 dərəcə Selsi mühitinə optimallaşdırmaq idi. Vəhşi tipli flüoroforun yetişməsi 28 dərəcədə olduqca effektivdir, lakin temperaturun 37 dərəcəyə qədər artırılması ümumi yetişməni əhəmiyyətli dərəcədə azaldır və flüoresansın azalması ilə nəticələnir. 64-cü mövqedə fenilalanin qalığının mutasiyası (Phe64) lösin 37 dərəcədə flüoresansın yaxşılaşması ilə nəticələnir ki, bu da ən azı 28 dərəcədə müşahidə edilənə bərabərdir. Bu mutasiya, əldə edilən flüoresan zülalların ən məşhur növlərində mövcuddur Aequorea victoria, lakin digər variantlar kəşf edildiyi kimi 37 dərəcədə qatlama qabiliyyətini yaxşılaşdıran yeganə mutasiya deyil.

37 dərəcədə yetişməni yaxşılaşdırmaqla yanaşı, məməlilərin ifadəsi üçün kodon istifadəsinin optimallaşdırılması məməli hüceyrələrində ifadə edilən yaşıl flüoresan zülalın ümumi parlaqlığını da yaxşılaşdırmışdır. Ümumilikdə, insan toxumalarında ifadəni artırmaq üçün kodlaşdırma ardıcıllığına 190-dan çox səssiz mutasiya daxil edilmişdir. Kozak tərcüməsinin başlanğıc yeri (nükleotid ardıcıllığını ehtiva edir A/GCCAT) ikinci amin turşusu kimi valinin daxil edilməsi ilə də daxil edilmişdir. Bunlar, bir sıra digər təkmilləşdirmələrlə birlikdə (aşağıda müzakirə olunur), məməlilərin hüceyrələrinin canlı hüceyrə təsviri üçün çox faydalı bir zondla nəticələndi və orijinal meduza zülalından əldə edilən bütün hal-hazırda istifadə olunan flüoresan zondlar üçün ümumidir.

Floresan Protein Rəng Palitrası

Demək olar ki, bütün görünən işıq spektrini əhatə edən flüoresan emissiya spektral profillərini özündə əks etdirən geniş spektrli flüoresan protein genetik variantları hazırlanmışdır (bax. Cədvəl 1). Orijinalda mutagenez səyləri Aequorea victoria meduza yaşıl flüoresan zülalı mavidən sarıya qədər rəngləri dəyişən yeni flüoresan zondlarla nəticələndi və ən çox istifadə edilənlərdən bəziləri in vivo bioloji tədqiqatlarda müxbir molekulları. Narıncı və qırmızı spektral bölgələrdə yayılan daha uzun dalğa uzunluğuna malik flüoresan zülallar dəniz anemonundan hazırlanmışdır. Discosoma striata, və sinfinə aid rif mərcanları Antozoa. Cyan, yaşıl, sarı, narıncı və tünd qırmızı flüoresan emissiyası olan oxşar zülallar istehsal etmək üçün başqa növlər minalanmışdır. Flüoresan zülalların parlaqlığını və sabitliyini yaxşılaşdırmaq, beləliklə, onların ümumi faydalılığını artırmaq üçün inkişaf tədqiqatları davam edir.

Cədvəl 1 - Floresan Protein Xüsusiyyətləri

Zülal
(Qısaltma)
Həyəcan
Maksimum
(nm)
Emissiya
Maksimum
(nm)
Molar
Yox olma
Əmsal
Kvant
Məhsuldarlıq
in vivo
Struktur
qohum
Parlaqlıq
(EGFP-nin faizi)
GFP (ağırlıq)395/47550921,0000.77Monomer*48
Yaşıl floresan zülallar
EGFP48450756,0000.60Monomer*100
Zümrüd48750957,5000.68Monomer*116
Superqovluq GFP48551083,3000.65Monomer*160
Azami Yaşıl49250555,0000.74Monomer121
mVasabi49350970,0000.80Monomer167
TagGFP48250558,2000.59Monomer*110
TurboGFP48250270,0000.53Dimer102
AcGFP48050550,0000.55Monomer*82
ZsGreen49350543,0000.91Tetramer117
T-Sapphire39951144,0000.60Monomer*79
Mavi Floresan Zülallar
EBFP38344529,0000.31Monomer*27
EBFP238344832,0000.56Monomer*53
Azurit38445026,2000.55Monomer*43
mTagBFP39945652,0000.63Monomer98
Cyan floresan zülallar
ECFP43947632,5000.40Monomer*39
mECFP43347532,5000.40Monomer39
Cerulean43347543,0000.62Monomer*79
mFiruzəyi43447430,0000.84Monomer*75
CyPet43547735,0000.51Monomer*53
AmCyan145848944,0000.24Tetramer31
Midori-İşi Cyan47249527,3000.90Dimer73
TagCFP45848037,0000.57Monomer63
mTFP1 (Gül)46249264,0000.85Monomer162
Sarı Floresan Zülallar
EYFP51452783,4000.61Monomer*151
Topaz51452794,5000.60Monomer*169
Venera51552892,2000.57Monomer*156
mCitrine51652977,0000.76Monomer174
YPet517530104,0000.77Monomer*238
TagYFP50852464,0000.60Monomer118
PhiYFP525537124,0000.39Monomer*144
ZsSarı152953920,2000.42Tetramer25
mBanan5405536,0000.7Monomer13
Narıncı Flüoresan Zülallar
Kusabira Narıncı54855951,6000.60Monomer92
Kusabira Narıncı 255156563,8000.62Monomer118
mOrange54856271,0000.69Monomer146
mOrange254956558,0000.60Monomer104
dPomidor55458169,0000.69Dimer142
dPomidor-Tandem554581138,0000.69Monomer283
TagRFP555584100,0000.48Monomer142
TagRFP-T55558481,0000.41Monomer99
DsRed55858375,0000.79Tetramer176
DsRed256358243,8000.55Tetramer72
DsRed-Express (T1)55558438,0000.51Tetramer58
DsRed-Monomer55658635,0000.10Monomer10
mNandarin56858538,0000.30Monomer34
Qırmızı floresan zülallar
mRuby558605112,0000.35Monomer117
mApple56859275,0000.49Monomer109
mÇiyələk57459690,0000.29Monomer78
AsRed257659256,2000.05Tetramer8
mRFP158460750,0000.25Monomer37
JRed58461044,0000.20Dimer26
mCherry58761072,0000.22Monomer47
HcRed158861820,0000.015Dimer1
mMoruq59862586,0000.15Monomer38
dKeima-Tandem44062028,8000.24Monomer21
HcRed-Tandem590637160,0000.04Monomer19
mPlum59064941,0000.10Monomer12
AQ14359565590,0000.04Tetramer11
* Zəif Dimer

-də təqdim olunub Cədvəl 1 bir neçə ən məşhur və faydalı flüoresan zülal variantları tərəfindən nümayiş etdirilən xüsusiyyətlərin məcmusudur. Hər bir flüoresan zülal üçün ümumi ad və/və ya abbreviatura ilə yanaşı, zirvə udma və emissiya dalğa uzunluqları (nanometrlə verilir), molyar sönmə əmsalı, kvant məhsuldarlığı, nisbi parlaqlıq və in vivostruktur birlikləri sadalanır. Hesablanmış parlaqlıq dəyərləri EGFP dəyərinə bölünən molar sönmə əmsalı və kvant gəlirinin hasilindən əldə edilmişdir. Bu siyahı elmi və kommersiya ədəbiyyatı mənbələrindən yaradılmışdır və əhatəli olması nəzərdə tutulmayıb, əksinə ədəbiyyatda böyük diqqət almış və tədqiqat səylərində dəyərli ola biləcək flüoresan zülal törəmələrini təmsil edir. Bundan əlavə, cədvəllərdə sadalanan və aşağıda təsvir olunan udma və flüoresan emissiya spektrləri nəzarət edilən şəraitdə qeydə alınmışdır və yalnız müqayisə və nümayiş məqsədləri üçün normallaşdırılmışdır. Həqiqi flüoresan mikroskopiya tədqiqatlarında pH, ion konsentrasiyası və həlledicinin polaritesi kimi ətraf mühit təsirlərinə, həmçinin lokallaşdırılmış zond konsentrasiyasındakı dalğalanmalara görə spektral profillər və dalğa uzunluğunun maksimumları dəyişə bilər. Buna görə də sadalanan sönmə əmsalları və kvant məhsuldarlığı eksperimental şəraitdə faktiki müşahidə edilənlərdən fərqli ola bilər.

Yaşıl floresan zülallar

Doğma yaşıl flüoresan zülal əhəmiyyətli flüoresan istehsal etsə də və son dərəcə sabit olsa da, həyəcanlanma maksimumu ultrabənövşəyi diapazona yaxındır. Ultrabənövşəyi işıq xüsusi optik mülahizələrə ehtiyac duyduğuna və canlı hüceyrələrə zərər verə biləcəyinə görə, ümumiyyətlə optik mikroskopla canlı hüceyrə təsviri üçün o qədər də uyğun deyil. Xoşbəxtlikdən, yaşıl flüoresan zülalın həyəcanlanma maksimumu 65-ci mövqedəki serini treonin qalığına dəyişdirən tək nöqtəli mutasiya ilə asanlıqla 488 nanometrə (siyan bölgəsində) köçürülür.S65T). Bu mutasiya yaşıl flüoresan zülalın ən məşhur variantında özünü göstərir gücləndirilmiş GFP (EGFP), flüoresan zülal texnologiyasının liderlərindən biri olan BD Biosciences Clontech tərəfindən təklif olunan geniş vektor çeşidində kommersiya olaraq mövcuddur. Bundan əlavə, təkmilləşdirilmiş versiya flüoresan üçün nəzərdə tutulmuş ümumi mövcud filtr dəstlərindən istifadə etməklə təsvir edilə bilər və hazırda mövcud olan flüoresan zülalların ən parlaqlarından biridir. Bu xüsusiyyətlər təkmilləşdirilmiş yaşıl flüoresan zülalını ən məşhur zondlardan biri və tək etiketli flüoresan zülal təcrübələri üçün ən yaxşı seçim etdi. EGFP-nin istifadəsinin yeganə çatışmazlıqları pH-a bir az həssaslıq və dimerləşməyə zəif meyldir.

Təkmil yaşıl flüoresan zülaldan əlavə, hazırda canlı hüceyrə təsvirində bir neçə başqa variant istifadə olunur. Fotosabitlik və parlaqlıq baxımından bunlardan ən yaxşılarından biri ola bilər Zümrüd variant, lakin kommersiya mənbəyinin olmaması onun istifadəsini məhdudlaşdırmışdır. Bir neçə mənbə flüoresan rezonans enerjisinin ötürülməsi üçün fərqli üstünlüklər təklif edən humanitarlaşdırılmış yaşıl flüoresan zülal variantlarını təqdim edir (ƏHVƏT) təcrübələr. 64-cü mövqedəki fenilalanin qalığının leysinlə əvəz edilməsi (F64L GFP2) 400 nanometr həyəcanlanma pikini saxlayan və gücləndirilmiş sarı flüoresan zülal üçün effektiv tərəfdaş kimi birləşdirilə bilən mutant verir. Bir variant S65C 474 nanometrdə pik həyəcana malik mutasiya (adətən sisteini serin ilə əvəz edən) qırmızıya sürüşdürülmüş gücləndirilmiş yaşıl versiyadan daha yaxşı mavi flüoresan zülal üçün daha uyğun FRET tərəfdaşı kimi ticari olaraq təqdim edilmişdir. Nəhayət, reef mərcan zülalı adlandırılır ZsGreen1 və 505 nanometrdə emissiya pikinə malik olan, gücləndirilmiş yaşıl flüoresan zülalın əvəzi kimi təqdim edilmişdir. Məməli hüceyrələrində ifadə edildikdə, ZsGreen1 EGFP-yə nisbətən çox parlaqdır, lakin füzyon mutantlarının istehsalında məhdud faydaya malikdir və digər reef mərcan zülalları kimi, tetramerlər əmələ gətirmək meylinə malikdir.

Sarı Floresan Zülallar

Sarı flüoresan zülallar ailəsi yaşıl flüoresan zülalın kristal quruluşu treonin qalığının 203 (Thr203) xromoforun yaxınlığında idi. Bu qalığın tirozinə mutasiyası xromoforun həyəcanlı vəziyyətinin dipol anını sabitləşdirmək üçün tətbiq edildi və həm həyəcan, həm də emissiya spektrləri üçün daha uzun dalğa uzunluqlarına 20 nanometrlik sürüşmə ilə nəticələndi. Sonrakı təkmilləşdirmələr onun inkişafına səbəb oldu gücləndirilmiş sarı floresan protein (EYFP), ən parlaq və ən çox istifadə edilən flüoresan zülallardan biridir. Təkmilləşdirilmiş sarı flüoresan zülalın parlaqlığı və flüoresan emissiya spektri birləşərək bu zond flüoresan mikroskopiyada çoxrəngli görüntüləmə təcrübələri üçün əla namizəddir. Təkmilləşdirilmiş sarı flüoresan zülal, gücləndirilmiş mavi flüoresan zülalı ilə birləşdirildikdə enerji ötürülməsi təcrübələri üçün də faydalıdır (ECFP) və ya GFP2. Bununla belə, sarı flüoresan zülal bəzi problemlər yaradır ki, o, turşulu pH-a çox həssasdır və pH 6.5-də flüoresanlığının təxminən 50 faizini itirir. Bundan əlavə, EYFP də yaşıl flüoresan zülallara nisbətən xlorid ionlarına və foto ağardıcılara daha çox həssas olduğu nümayiş etdirilmişdir.

Şəkil 3 - Ümumi Flüoresan Zülalların Spektral Profilləri

Sarı emissiya üçün flüoresan zülal arxitekturasının davamlı inkişafı sarı zondlarla bağlı bir sıra problemləri həll etdi. The Sitrin sarı flüoresan zülalın variantı EYFP ilə müqayisədə çox parlaqdır və fotoağartmaya, turşulu pH-a və ətraf mühitin digər təsirlərinə daha davamlı olduğu nümayiş etdirilmişdir. adlı başqa bir törəmə Venera, ən sürətli yetişən və bu günə qədər hazırlanmış ən parlaq sarı variantlardan biridir. Mərcan rifi proteini, ZsSarı1, əvvəlcə klonlanmış a Zoanthus Hind və Sakit okeanlara xas olan növlər əsl sarı emissiya yaradır və çoxrəngli tətbiqlər üçün idealdır. ZsGreen1 kimi, bu törəmə EYFP kimi füzyon yaratmaq üçün faydalı deyil və tetramerlər əmələ gətirmək meylinə malikdir. Daha möhkəm sarı flüoresan zülal variantlarının çoxu FRET tədqiqatlarında kəmiyyət nəticələri üçün vacib olmuşdur və digər tədqiqatlar üçün də faydalı ola bilər.

illüstrasiyalı Şəkil 3 mavidən uzaq qırmızıya qədər görünən spektri əhatə edən bir çox ümumi istifadə edilən və kommersiyada mövcud olan flüoresan zülallar üçün udma və emissiya spektral profilləridir. Əldə edilən variantlar Aequorea victoria meduza, o cümlədən gücləndirilmiş mavi, yaşıl və sarı flüoresan zülallar, 425 ilə 525 nanometr arasında dəyişən pik emissiya dalğaları nümayiş etdirir. Mərcan riflərindən, DsRed2 və HcRed1-dən (aşağıda müzakirə olunur) əldə edilən flüoresan zülallar daha uzun dalğa uzunluqları yayır, lakin məməli hüceyrələrində oliqomerləşmə artefaktlarından əziyyət çəkir.

Mavi və Mavi Floresan Zülallar

Yaşıl flüoresan zülalın mavi və mavi variantları 66-cı mövqedə tirozin qalıqlarının birbaşa modifikasiyası nəticəsində yaranmışdır.Tyr66) yerli flüoroforda (bax Şəkil 2). Bu amin turşusunun histidinə çevrilməsi mavi emissiyanın 450 nanometrdə maksimum dalğa uzunluğuna malik olması ilə nəticələnir, triptaminə çevrilmə isə 500 nanometr zirvəyə çatan çiyinlə birlikdə 480 nanometr ətrafında əsas flüoresan pik ilə nəticələnir.Hər iki zond yalnız zəif floresandır və qatlama səmərəliliyini və ümumi parlaqlığı artırmaq üçün ikincil mutasiyalar tələb edir. Dəyişikliklərlə belə, bu sinif flüoresan zülalın təkmilləşdirilmiş versiyaları (EBFPECFP) gücləndirilmiş yaşıl flüoresan zülal kimi yalnız təxminən 25-40 faiz parlaqdır. Bundan əlavə, mavi və mavi flüoresan zülalların həyəcanlandırılması çox istifadə olunmayan spektral bölgələrdə ən effektivdir, buna görə də xüsusi filtr dəstləri və lazer mənbələri tələb olunur.

Mavi və mavi flüoresan zülalların çatışmazlıqlarına baxmayaraq, çox rəngli etiketləmə və FRET-ə geniş maraq onların bir sıra tədqiqatlarda tətbiqini populyarlaşdırdı. Bu, xüsusilə arqon-ion lazer (457 nanometrlik spektral xəttdən istifadə etməklə) tərəfindən pikdən kənarda həyəcanlandırıla bilən və mavi törəmə ilə müqayisədə fotoağartmaya əhəmiyyətli dərəcədə daha davamlı olan gücləndirilmiş mavi flüoresan zülal üçün doğrudur. Digər flüoresan zülallardan fərqli olaraq, görünən işıq spektrinin mavi bölgəsində daha yaxşı zondların layihələndirilməsinə yüksək səviyyədə maraq olmamışdır və bu sinifdə flüoroforlar üzərində aparılan inkişaf tədqiqatlarının əksəriyyəti siyan variantlarına yönəlmişdir.

Şəkil 4 - Floresan Protein FRET Pail Variantlarının Spektral Profilləri

Təqdim edilən təkmilləşdirilmiş mavi flüoresan zülallar arasında, AmCyan1 və gücləndirilmiş mavi variant adlanır Cerulean ən çox vəd göstərir. Reef mərcanından əldə edilir, Majano anemiyası, AmCyan1 flüoresan zülal variantı məməlilərin ifadəsi zamanı gücləndirilmiş mavi flüoresan zülalla müqayisədə yüksək nisbi parlaqlıq səviyyəsi və fotoağartmaya qarşı müqavimət yaratmaq üçün insan kodonları ilə optimallaşdırılmışdır. İşin mənfi tərəfi, digər reef mərcan zülallarının əksəriyyətinə bənzər, bu zond tetramerlər əmələ gətirmək meylinə malikdir. Cerulean flüoresan zondu daha yüksək sönmə əmsalı və təkmilləşdirilmiş kvant məhsuldarlığı əldə etmək üçün gücləndirilmiş mavi flüoresan zülalın sahəyə yönəldilmiş mutagenezi ilə hazırlanmışdır. Cerulean gücləndirilmiş mavi flüoresan zülaldan ən azı 2 dəfə daha parlaqdır və Venera kimi sarı yayan flüoresan zülallarla birləşdirildikdə siqnal-səs nisbətini əhəmiyyətli dərəcədə artırdığı nümayiş etdirilmişdir (bax. Şəkil 4), FRET araşdırmalarında.

Qırmızı floresan zülallar

Floresan zülalının inkişafının əsas məqsədi gücləndirilmiş yaşıl flüoresan zülalın qabaqcıl xüsusiyyətlərinə bərabər və ya ondan artıq olan qırmızı yayan törəmənin yaradılması olmuşdur. Uyğun qırmızı flüoresan zülalın üstünlükləri arasında mövcud konfokal və geniş sahəli mikroskoplar (və onların filtr dəstləri) ilə potensial uyğunluğu və qırmızı işığa daha şəffaf olan bütün heyvanları təsvir etmək qabiliyyətinin artırılması daxildir. Çünki qırmızıya sürüşən mutantların quruluşu Aequorea victoria meduza yaşıl flüoresan zülalının sarı spektral bölgədən kənarda çox uğursuz olduğu sübut edildi, tədqiqatçılar axtarışlarını tropik rif mərcanlarına çevirdilər.

Geniş şəkildə istifadə edilən ilk mərcan mənşəli flüoresan zülal ondan əldə edilmişdir Discosoma striata və ümumi olaraq adlandırılır DsRed. Tam yetişdikdən sonra, DsRed-in flüoresan emissiya spektri 583 nanometrdə bir zirvəyə malikdir, həyəcanlandırma spektri isə 558 nanometrdə əsas zirvəyə və 500 nanometrə yaxın kiçik zirvəyə malikdir. Bununla belə, DsRed-dən istifadə ilə bağlı bir sıra problemlər var. DsRed flüoresansının yetişməsi yavaş-yavaş baş verir və flüoresan emissiyasının yaşıl bölgədə olduğu bir müddət ərzində davam edir. adlandırılır yaşıl dövlət, bu artefakt spektral üst-üstə düşmə səbəbindən digər yaşıl flüoresan zülallarla çoxsaylı etiketləmə təcrübələri üçün problemli olduğunu sübut etdi. Bundan əlavə, DsRed məcburi tetramerdir və canlı hüceyrələrdə böyük protein aqreqatları yarada bilir. Bu xüsusiyyətlər DsRed-in gen ifadəsinin müxbiri kimi istifadəsi üçün əhəmiyyətsiz olsa da, DsRed-in epitop etiketi kimi faydalılığı ciddi şəkildə məhduddur. Yüzlərlə zülalın etiketlənməsi üçün uğurla istifadə edilən meduza flüoresan zülallarından fərqli olaraq, DsRed konjugatları daha az müvəffəqiyyətli olduğunu və çox vaxt zəhərli olduğunu sübut etdi.

DsRed flüoresan zülalları ilə bağlı bəzi problemlər mutagenez vasitəsilə aradan qaldırılıb. kimi tanınan ikinci nəsil DsRed DsRed2, protein aqreqatlarının əmələ gəlməsinin qarşısını alan və toksikliyi azaldan peptid amin terminalında bir neçə mutasiya ehtiva edir. Bundan əlavə, bu modifikasiyalarla flüoroforun yetişmə müddəti azalır. DsRed2 zülalı hələ də tetramer əmələ gətirir, lakin daha sürətli yetişmə səbəbindən çoxlu etiketləmə təcrübələrində yaşıl flüoresan zülallarla daha uyğundur. Yetişmə müddətində əlavə azalmalar üçüncü nəsil DsRed mutantları ilə həyata keçirilmişdir ki, onlar da pik hüceyrə flüoresansı baxımından artan parlaqlıq səviyyəsini nümayiş etdirirlər. Qırmızı flüoresan emissiya DsRed-Express DsRed2 üçün təxminən altı saat və DsRed üçün 11 saat ilə müqayisədə ifadədən sonra bir saat ərzində müşahidə oluna bilər. Maya üçün optimallaşdırılmış variant, adlanır Qırmızı Ulduz, təkmilləşdirilmiş yetişmə sürətinə və artan parlaqlığa malik olan işlənib hazırlanmışdır. DsRed-Express və RedStar-da yaşıl vəziyyətin olması aydın deyil, bu flüoresan zülalları çoxlu etiketləmə təcrübələri üçün narıncı-qırmızı spektral bölgədə ən yaxşı seçim edir. Bu zondlar məcburi tetramerlər olaraq qaldıqları üçün zülalların etiketlənməsi üçün ən yaxşı seçim deyillər.

Şəkil 5 - Narıncı və Qırmızı Monometrik Floresan Zülalların Spektral Profilləri

Böyük miqdarda vəd göstərən bir neçə əlavə qırmızı flüoresan zülal resif mərcan orqanizmlərindən təcrid edilmişdir. Məməlilər üçün ilk uyğunlaşdırılanlardan biridir HcRed1dan təcrid olunmuşdu Heteractis crispa və indi kommersiya baxımından mövcuddur. HcRed1 əvvəlcə udma maksimumu 588 nanometrdə və emissiya maksimumu 618 nanometrdə olan zəif floresan məcburi dimer yaratmaq üçün mutagenez vasitəsilə qırmızı işığı udan qeyri-flüoresan xromoproteindən əldə edilmişdir. Bu zülalın flüoresan emissiya spektri DsRed-dən ayrılmaq üçün adekvat olsa da, DsRed ilə birlikdə birləşməyə meyllidir və daha az parlaqdır. Tərkibində iki molekuldan ibarət maraqlı HcRed konstruksiya dimerləşməni aradan qaldırmaq üçün istehsal edilmişdir ki, bu da prinsipcə monomerik etiket yaratmaq üçün tandem cütləşməsində üstünlük təşkil edir. Bununla belə, bu əkiz zülalın ümumi parlaqlığı hələ yaxşılaşdırılmadığı üçün canlı hüceyrə mikroskopiyasında gündəlik tətbiqlər üçün yaxşı seçim deyil.

Monomerik Flüoresan Protein Variantlarının İnkişafı

Təbii vəziyyətlərində floresan zülalların çoxu dimerlər, tetramerlər və ya daha yüksək dərəcəli oliqomerlər şəklində mövcuddur. Eynilə, Aequorea victoria yaşıl flüoresan zülalın aequorin ilə tetramerik kompleksdə iştirak etdiyi düşünülür, lakin bu fenomen yalnız çox yüksək protein konsentrasiyalarında müşahidə edilmişdir və meduza flüoresan zülallarının dimerləşmə meyli ümumiyyətlə çox zəifdir (disosiasiya sabiti 100 mikromolyardan çox olan). Beləliklə, flüoresan zülalların dimerizasiyası məməli sistemlərdə ifadə olunduqda ümumiyyətlə müşahidə edilməmişdir. Bununla belə, flüoresan zülallar plazma membranı kimi xüsusi hüceyrə bölmələrinə yönəldildikdə, lokallaşdırılmış zülal konsentrasiyası nəzəri olaraq dimerləşməyə imkan verəcək qədər yüksək ola bilər. Bu, dimerləşmə artefaktları tərəfindən asanlıqla pozulan mürəkkəb məlumat dəstləri verə bilən FRET təcrübələri apararkən xüsusi narahatlıq doğurur.

Monomer DsRed variantlarının qurulması çətin bir iş olduğunu sübut etdi. Birinci nəsil monomerik DsRed zülalının (adlandırılır) yaradılması üçün strukturda 30-dan çox amin turşusu dəyişikliyi tələb olunurdu. RFP1). Bununla belə, bu törəmə çox tez yerli zülal və fotoağardıcılarla müqayisədə flüoresan emissiyasını əhəmiyyətli dərəcədə azaldır və onu monomer yaşıl və sarı flüoresan zülallardan daha az faydalı edir. Mutagenez tədqiqat səyləri, o cümlədən somatik hipermutasiya kimi yeni üsullar sarı, narıncı, qırmızı və tünd qırmızı flüoresan zülal variantlarının axtarışında davam edir ki, bu da potensial olaraq effektiv bioloji zondların öz-özünə birləşmə meylini daha da azaldır və eyni zamanda emissiya maksimumunu artırır. daha uzun dalğa uzunluqlarına doğru.

Təkmilləşdirilmiş monomerik flüoresan zülallar inkişaf etdirilir ki, onlar tükənmə əmsallarını, kvant məhsuldarlığını və fotostabilliyi artırır, baxmayaraq ki, heç bir variant bütün meyarlar üzrə optimallaşdırılmayıb. Bundan əlavə, məcburi tetramerik qırmızı flüoresan zülallarla ifadə problemləri, bioloji funksiyaya daha uyğun olan törəmələr əldə edən monomerik variantlar yaratmaq səyləri ilə aradan qaldırılır.

Bəlkə də bu cəbhədəki ən möhtəşəm inkişaf, monomerik qırmızı flüoresan zülaldan alınan flüoresan zülalların yeni məhsulunun tətbiqi olmuşdur. Q66Y67 qalıqları. Flüoresan emissiya spektral profilinə bənzər rəngləri əks etdirən meyvələr üçün adlandırılmışdır (bax Cədvəl 1Şəkil 5), monomerik flüoresan zülalların bu kadrı 560 ilə 610 nanometr arasında dəyişən dalğa uzunluqlarında maksimumları nümayiş etdirir. İterativ somatik hipermutasiya vasitəsilə bu sinfin daha da genişləndirilməsi emissiya dalğa uzunluğu 650 nanometrə qədər olan flüoresan zülallar verdi. Bu yeni zülallar mahiyyət etibarı ilə ən qırmızı yerdəyişən meduza flüoresan zülalları (məsələn, Venera) və mərcan rifinin qırmızı flüoresan zülalları arasındakı boşluğu doldurur. Bu yeni flüoresan zülalların bir neçəsi bir çox görüntüləmə təcrübələri üçün lazım olan parlaqlıq və sabitliyə malik olmasa da, onların mövcudluğu ümidvericidir, çünki bütün görünən spektrdə parlaq, sabit, monomerik flüoresan zülalların mümkünlüyünü göstərir.

Optik işıqlandırıcılar

Floresan zülal tədqiqatında ən maraqlı inkişaflardan biri də bu probların tətbiqi olmuşdur molekulyar və ya optik işıqlandırıcılar (görmək Cədvəl 2), xarici foton stimullaşdırılması və ya zamanın keçməsi nəticəsində rəngini və ya emissiya intensivliyini dəyişən. Nümunə olaraq, yerli meduza peptidinə tək nöqtəli mutasiya yaşıl flüoresan zülalın fotoaktivləşə bilən versiyasını yaradır. PA-GFP) 400 nanometr diapazonda işıqla işıqlandırma ilə həyəcan zirvəsinin ultrabənövşəyidən mavi rəngə fotoçevrilməsinə imkan verir. Dönüştürülməmiş PA-GFP, yabanı tipli zülalın profilinə oxşar həyəcanlanma pikinə malikdir (təxminən 395-400 nanometr). Fotokonversiyadan sonra 488 nanometrdə həyəcanlanma zirvəsi təxminən 100 dəfə artır. Bu hadisə PA-GFP-nin çevrilməmiş və çevrilmiş hovuzları arasında çox yüksək kontrast fərqləri doğurur və hüceyrə daxilində molekulyar alt populyasiyaların dinamikasını izləmək üçün faydalıdır. illüstrasiyalı Şəkil 6(a) əvvəl 488 nanometrlik arqon-ion lazer həyəcanı ilə təsvir edilən sitoplazmada PA-GFP olan transfeksiya edilmiş canlı məməli hüceyrəsidir (Şəkil 6(a)) və sonra (Şəkil 6(d)) 405 nanometrlik mavi diod lazeri ilə fotokonversiya.

Cədvəl 2 - Seçilmiş Optik Vurğulayıcıların Xüsusiyyətləri

Zülal
(Qısaltma)
Həyəcan
Maksimum
(nm)
Emissiya
Maksimum
(nm)
Molar
Yox olma
Əmsal
Kvant
Məhsuldarlıq
in vivo
Struktur
qohum
Parlaqlıq
(EGFP-nin faizi)
PA-GFP (G)50451717,4000.79Monomer41
PS-CFP (C)40246834,0000.16Monomer16
PS-CFP (G)49051127,0000.19Monomer15
PA-mRFP1 (R)57860510,0000.08Monomer3
CoralHue Kaede (G)50851898,8000.88Tetramer259
CoralHue Kaede (R)57258060,4000.33Tetramer59
wtKikGR (G)50751753,7000.70Tetramer112
wtKikGR (R)58359335,1000.65Tetramer68
mKikGR (G)50551549,0000.69Monomer101
mKikGR (R)58059128,0000.63Monomer53
dEosFP-Tandem (G)50651684,0000.66Monomer165
dEosFP-Tandem (R)56958133,0000.60Monomer59
mEos2FP (G)50651956,0000.84Monomer140
mEos2FP (R)57358446,0000.66Monomer90
Dendra2 (G)49050745,0000.50Monomer67
Dendra2 (R)55357335,0000.55Monomer57
CoralHue Dronpa (G)50351895,0000.85Monomer240
Kindling (KFP1)58060059,0000.07Tetramer12

Digər flüoresan zülallar da optik işıqlandırıcılar kimi istifadə edilə bilər. DsRed flüoresan zülalının üç foton həyəcanlandırması (760 nanometrdən az) normal qırmızı flüoresansı yaşıl rəngə çevirməyə qadirdir. Bu təsir, çox güman ki, DsRed-də qırmızı xromoforların selektiv foto ağardılması ilə əlaqədardır və yaşıl vəziyyətdən müşahidə olunan flüoresansla nəticələnir. The Taymer DsRed variantı bir neçə saat ərzində tədricən parlaq yaşıldan (500 nanometr emissiya) parlaq qırmızıya (580 nanometr emissiya) çevrilir. Yaşıl və qırmızı flüoresansın nisbi nisbəti daha sonra gen ifadəsi tədqiqatları üçün müvəqqəti məlumat toplamaq üçün istifadə edilə bilər.

Fotoşəkilləri dəyişdirilə bilən optik işıqlandırıcı adlanır PS-CFPYaşıl flüoresan zülal variantının mutagenezi ilə əldə edilən 405 nanometrdə işıqlandırma zamanı mavidən yaşıl flüoresansa keçid müşahidə edilmişdir (mərkəzi hüceyrənin fotokonversiyasına diqqət yetirin). Şəkil 6(b) və 6(e)). Monomer kimi ifadə edilən bu zond fotoağartma, fotokonversiya və fotoaktivləşdirmə tədqiqatlarında potensial olaraq faydalıdır. Bununla belə, PS-CFP-dən gələn flüoresan PA-GFP-dən təxminən 2,5 dəfə sönükdür və fotokonversiya səmərəliliyi baxımından digər işıqlandırıcılardan daha aşağıdır (fotokonversiya zamanı flüoresan emissiyasında 40 nanometrlik sürüşmə oxşar zondlarla müşahidə ediləndən azdır). Bu və ya əlaqəli flüoresan zülalların əlavə mutagenezi bu dalğa uzunluğu bölgəsində daha faydalı variantlar əldə etmək potensialına malikdir.

Şəkil 6 - Optik Vurğulayıcı Floresan Zülallar

Mərcan və anemon növlərindən klonlanmış flüoresan zülallarda optik işıqlandırıcılar da işlənib hazırlanmışdır. Kaede, daşlı mərcandan təcrid olunmuş flüoresan zülal, ultrabənövşəyi işığın iştirakı ilə yaşıldan qırmızıya fotokonvertasiya edir. PA-GFP-dən fərqli olaraq, Kaede-də flüoresansın çevrilməsi onun işıqlandırılmasından spektral olaraq fərqlənən işığın udulması ilə baş verir. Təəssüf ki, bu zülal məcburi tetramerdir və onu PA-GFP ilə müqayisədə epitop etiketi kimi xəzdən daha az uyğun edir. Başqa bir tetramer daş mərcan (Lobophyllia hemprichii) flüoresan zülal variantı adlanır EosFP (görmək Cədvəl 2), təxminən 390 nanometrdə ultrabənövşəyi işıqla işıqlandırıldıqda narıncı-qırmızıya dəyişən parlaq yaşıl flüoresan saçır. Bu halda, spektral yerdəyişmə, xromofora bitişik peptid onurğasında bir fasiləni əhatə edən foto-induksiya edilmiş modifikasiya ilə istehsal olunur. "Vəhşi tip" EosFP zülalının sonrakı mutagenezi monomerik törəmələri əldə etdi, bu da birləşmə zülallarının qurulmasında faydalı ola bilər.

Üçüncü qeyri-Aequorea optik işıqlandırıcı, alışdırmaq floresan protein (KFP1) ildə təcrid olunmuş qeyri-flüoresan xromoproteindən hazırlanmışdır Sulcata anemiyası, və indi kommersiya baxımından mövcuddur (Evrogen). Yanan flüoresan zülal yaşıl işıqla işıqlanana qədər emissiya nümayiş etdirmir. Aşağı intensivlikli işıq bir neçə dəqiqə ərzində xarab olan keçici qırmızı flüoresanla nəticələnir (mitoxondriyaya baxın). Şəkil 6(c)). Mavi işıqla işıqlandırma alovlanan flüoresansı dərhal söndürür və flüoresan etiketləmə üzərində sıx nəzarət etməyə imkan verir. Bunun əksinə olaraq, yüksək intensivlikli işıqlandırma geri dönməz alışma ilə nəticələnir və PA-GFP-yə bənzər sabit işıqlandırmaya imkan verir (Şəkil 6(f)). Floresensiyanı dəqiq idarə etmək qabiliyyəti, izdihamlı mühitdə hissəciklərin hərəkətini izləyərkən xüsusilə faydalıdır. Məsələn, bu yanaşma inkişafda olan sinir boşqab hüceyrələrinin taleyini izləmək üçün uğurla istifadə edilmişdir Ksenop embrionlar və fərdi mitoxondrilərin PC12 hüceyrələrində hərəkəti.

Optik işıqlandırıcıların inkişafı davam etdikcə, optik işarələmə üçün faydalı olan flüoresan zülallar asanlıqla fotokonvertasiya edilə bilən və emissiya rənglərinin geniş spektrini nümayiş etdirə bilən daha parlaq, monomer variantlara doğru inkişaf etməlidir. Bu irəliləyişlərlə birlikdə, floresan müşahidəsi və regional işarələmə üçün işıqlandırma rejimləri arasında rəvan idarə etmək üçün təchiz edilmiş mikroskoplar hüceyrə biologiyası laboratoriyalarında adi hala çevriləcəkdir. Nəhayət, bu yeniliklər siqnal ötürmə sistemlərinin məkan və zaman dinamikasında əhəmiyyətli nailiyyətlər əldə etmək potensialına malikdir.

Floresan Protein Vektorları və Gen Transferi

Floresan zülalları olduqca çox yönlüdür və mikrobiologiyadan tutmuş sistem fiziologiyasına qədər demək olar ki, hər bir bioloji intizamda uğurla istifadə olunur. Hər yerdə olan bu zondlar mədəni hüceyrələrdə və toxumalarda, eləcə də canlı heyvanlarda gen ifadəsi tədqiqatları üçün reportyorlar kimi son dərəcə faydalı olmuşdur. Canlı hüceyrələrdə flüoresan zülallar zülalların, orqanellələrin və digər hüceyrə bölmələrinin lokalizasiyasını və dinamikasını izləmək üçün ən çox istifadə olunur. Floresan zülal sintezi məhsullarını yaratmaq və məməlilər və digər sistemlərdə onların ifadəsini artırmaq üçün müxtəlif üsullar hazırlanmışdır. Floresan zülal kimerik gen ardıcıllığını hüceyrələrə daxil etmək üçün əsas vasitələr genetik olaraq hazırlanmış bakterial plazmidlər və viral vektorlardır.

Floresan protein gen füzyon məhsulları müvafiq vektordan (adətən plazmid və ya virus) istifadə edərək məməlilərə və digər hüceyrələrə keçici və ya sabit şəkildə daxil edilə bilər. Keçici və ya müvəqqəti, gen transferi təcrübələrində (çox vaxt belə adlandırılır keçici transfeksiya), ev sahibi orqanizmə daxil edilən plazmid və ya viral DNT mütləq xromosomlara inteqrasiya etmir, lakin qısa müddət ərzində sitoplazmada ifadə oluna bilir. Floresan zülalı ilə uyğun gələn filtr dəstindən istifadə edərək flüoresan emissiyasının müşahidəsi ilə asanlıqla izlənilən gen füzyon məhsullarının ifadəsi adətən transfeksiyadan sonra bir neçə saat ərzində baş verir və plazmid DNT-nin məməli hüceyrələrinə daxil edilməsindən sonra 72-96 saat davam edir. . Bir çox hallarda plazmid DNT sabit transformasiya olunmuş hüceyrə xətləri yaratmaq üçün daimi vəziyyətdə genomun tərkibinə daxil edilə bilər. Keçici və ya stabil transfeksiyanın seçilməsi tədqiqatın hədəf məqsədlərindən asılıdır.

Şəkil 7 - EYFP Endoplazmik Retikulum Lokalizasiya Vektoru

Floresan protein gen transferi təcrübələrində faydalı olan əsas plazmid vektor konfiqurasiyası bir neçə zəruri komponentə malikdir. Plazmiddə DNT üçün bakterial replikasiya mənşəyini və antibiotik müqavimət genini kodlayan prokaryotik nukleotid ardıcıllığı olmalıdır. Bu elementlər tez-tez adlanır servis məməlilərin transfeksiyaları üçün kifayət qədər miqdarda vektor yaratmaq üçün bakteriya sahibi daxilində plazmidin yayılmasına və seçilməsinə imkan verir. Bundan əlavə, plazmiddə messencer RNT transkripsiyasının başlamasına nəzarət edən bir və ya bir neçə eukaryotik genetik element, məməlilərin poliadenilasiya siqnalı, intron (isteğe bağlı) və məməli hüceyrələrində birgə seçim üçün gen olmalıdır. Transkripsiya elementləri məməli ev sahibi üçün maraq doğuran gen birləşmə məhsulunu ifadə etmək üçün lazımdır və seçmə geni adətən plazmid olan hüceyrələrə müqavimət göstərən bir antibiotikdir. Bu ümumi xüsusiyyətlər plazmid dizaynına görə dəyişir və bir çox vektor xüsusi tətbiqlər üçün uyğun olan geniş spektrli əlavə komponentlərə malikdir.

illüstrasiyalı Şəkil 7 kalretikulinin (rezident zülal) endoplazmatik retikuluma hədəfləmə ardıcıllığı ilə birləşmiş gücləndirilmiş sarı flüoresan zülalın kodlaşdırma ardıcıllığını ehtiva edən kommersiyada mövcud olan (BD Biosciences Clontech) bakterial plazmid törəməsinin məhdudlaşdırıcı fermenti və genetik xəritəsidir. Bu gen məhsulunun həssas məməli hüceyrələrində ifadəsi, bu orqanellin flüoresan etiketlənməsi üçün xüsusi olaraq hazırlanmış endoplazmik retikulum membran şəbəkəsində lokallaşdırılmış EYFP ehtiva edən kimerik peptid verir. Host vektorunun törəməsidir pUC yüksək nüsxə sayı (təxminən 500) bakterial replikasiya mənşəli plazmid, bu onu ixtisaslaşdırılmış reproduksiya üçün əlverişli edir. E. coli suşlar. Kanamisin antibiotik geni bakteriyalarda asanlıqla ifadə edilir və seçilə bilən bir marker kimi xidmət etmək üçün müqavimət göstərir.

Yuxarıda göstərilən EYFP vektorunun əlavə xüsusiyyətləri insan sitomeqalovirusudur (CMV) transfeksiya edilmiş insan və digər məməlilərin hüceyrə xətlərində gen ifadəsini idarə edən promotor və an f1 tək zəncirli DNT istehsalı üçün bakteriofaq replikasiya mənşəli. Vektor onurğasında həmçinin simian virusu 40 (SV40) SV40 T-antigenini ifadə edən məməli hüceyrələrində aktiv olan replikasiya mənşəli. Antibiotik ilə stabil transfektantların seçilməsi G418 SV40 erkən promotorundan, neomisin müqavimət genindən (aminoqlikozid 3'-fosfotransferaza) və herpes simplex virusunun timidin kinazından (poliadenilasiya siqnallarından) ibarət neomisin müqavimət kaseti ilə aktivləşdirilir.HSV-TK) messenger sabitliyi üçün. Altı unikal məhdudlaşdırıcı ferment sahəsi (bax Şəkil 7) plazmid onurğasında mövcuddur ki, bu da bu plazmidin çox yönlülüyünü artırır.

Floresan zülal plazmidlərinin yayılması, izolyasiyası və transfeksiyası

Uğurlu məməli transfeksiya təcrübələri bakterial endotoksinlərdən nisbətən təmiz olan yüksək keyfiyyətli plazmid və ya viral DNT vektorlarının istifadəsinə əsaslanır. Doğma vəziyyətdə dairəvi plazmid DNT molekulları üçüncüllük nümayiş etdirir superburulmuş qoşa spiralın öz ətrafında bir neçə dəfə döndərdiyi uyğunlaşma. Uzun illər supercoiled plazmid və virus DNT-nin təmizlənməsi üçün seçim üsulu interkalasiya agentinin (məsələn, etidium bromid və ya propidium yodid) iştirakı ilə sezium xlorid sıxlığının gradient sentrifuqalanması olmuşdur. Həm avadanlıq, həm də materiallar baxımından baha olan bu texnika, yüksək sarğılı (plazmid) DNT-ni xətti xromosom və nicked dairəvi DNT-dən üzmə sıxlığına görə ayıraraq yüksək saflıqda plazmid DNT-nin toplanmasına imkan verir. Bu yaxınlarda sadələşdirilmiş ion dəyişdirici sütun xromatoqrafiya üsulları (ümumiyyətlə a mini hazırlıq) nisbətən qısa müddət ərzində böyük miqdarda endotoksinsiz plazmid DNT əldə etmək üçün çətin və vaxt aparan sentrifuqalama protokolunu böyük ölçüdə əvəzləmişlər.

Xüsusi bakterial mutantlar adlanır səlahiyyətli hüceyrələr, plazmid vektorlarının rahat və nisbətən ucuz gücləndirilməsi üçün hazırlanmışdır. Bakteriyalar, onları plazmid replikasiyasına xüsusilə həssas edən mutasiyaların palitrasını ehtiva edir və DNT-nin membran və hüceyrə divarı arasından ötürülməsi üçün kimyəvi olaraq bilinən bir prosedura malikdir. transformasiya. Transformasiyadan sonra bakteriyalar plazmidin diktə etdiyi seçici antibiotikin iştirakı ilə loqarifmik fazaya yetişdirilir. Bakterial mədəniyyət sentrifuqa ilə konsentrasiya edilir və çirkləndirici RNT-ni parçalamaq üçün tərkibində fermentlər olan qələvi yuyucu məhlulu ilə lizislə pozulur. Sonra lizat süzülür və ion mübadiləsi sütununa yerləşdirilir. RNT, DNT və zülallar da daxil olmaqla arzuolunmaz materiallar, yüksək duzlu tampondan istifadə edilərək plazmid DNT-nin yuyulmasından əvvəl sütundan yaxşıca yuyulur. Alkoqol (izopropanol) çöküntüsü, sentrifuqa ilə toplanan, yuyulan və buferdə yenidən həll olunan, elüt edilmiş plazmid DNT-ni konsentrasiya edir. Təmizlənmiş plazmid DNT transfeksiya təcrübələrində işə hazırdır.

Şəkil 8 - Məməli Hüceyrələrində Lipid Vasitəçiliyi ilə Transfeksiya

Transfeksiya üçün istifadə edilən məməli hüceyrələri əla fizioloji vəziyyətdə olmalı və prosedur zamanı loqarifmik fazada böyüməlidir. Plazmid DNT-nin mədəni hüceyrələr tərəfindən qəbulunu optimallaşdırmaq üçün geniş spektrli transfeksiya reagentləri kommersiya baxımından işlənib hazırlanmışdır. Bu üsullar sadə kalsium fosfat çöküntüsündən tutmuş plazmid DNT-nin hüceyrə membranına birləşən və məzmunu sitoplazmaya çatdıran lipid veziküllərində sekvestrləşdirilməsinə qədər dəyişir (şəkildə göstərildiyi kimi). Şəkil 8). Kollektiv olaraq adlandırılır lipofeksiya, lipid əsaslı texnologiya çox sayda məşhur hüceyrə xəttində effektivliyinə görə geniş qəbul ilə qarşılandı və indi əksər transfeksiya təcrübələri üçün seçim üsuludur.

Keçici transfeksiyalar adətən plazmid gen məhsulunun nisbətən qısa müddət ərzində (bir neçə gün) itirilməsi ilə nəticələnsə də, stabil şəkildə transfeksiya olunmuş hüceyrə xətləri davamlı uzunmüddətli (aylardan illərə qədər) qonaq zülallarını istehsal etməyə davam edir. Stabil hüceyrə xətləri plazmid onurğasında mövcud olan antibiotik markerlərindən istifadə etməklə seçilə bilər (bax Şəkil 7). Məməlilərin hüceyrə xəttlərində stabil transfektantların seçilməsi üçün ən məşhur antibiotiklərdən biri zülal sintezini maneə törədən G418 dərmanıdır, lakin tələb olunan doza hər hüceyrə xəttinə görə geniş şəkildə dəyişir. Digər ümumi antibiotiklər, o cümlədən hidromisin-Bpuromisin, həmçinin genetik markerlər kimi sabit hüceyrə seçimi üçün hazırlanmışdır. Stabil hüceyrə xətləri əldə etməyin ən səmərəli üsulu ilkin transfeksiya üçün yüksək effektivlik texnikasından istifadə etməkdir. Bu mövzuda, elektroporasiya xəttiləşdirilmiş plazmidlər və təmizlənmiş genlərlə sabit transfektantlar yaratdığı sübut edilmişdir. Elektroporasiya plazma membranında məsamələrin əmələ gəlməsinə təkan vermək üçün hüceyrə süspansiyonuna qısa, yüksək gərginlikli impulslar tətbiq edir və sonradan transfeksiya DNT-sinin hüceyrəyə daxil olmasına imkan verir. Elektroporasiya üçün xüsusi avadanlıq lazımdır, lakin çoxlu sayda transfeksiyalar aparıldıqda texnika lipofeksiya reagentləri ilə müqayisə edilə bilər.

Floresan zülalların gələcəyi

Cari flüoresan zülal inkişafının diqqəti iki əsas məqsəd üzərində cəmlənir. Birincisi, əldə edilən mavidən sarıya flüoresan zülalların mövcud palitrasını mükəmməlləşdirmək və dəqiq tənzimləməkdir Aequorea victoria meduza, ikinci məqsəd isə görünən işıq spektrinin narıncıdan uzaq qırmızıya qədər bölgələrində yayan monomer flüoresan zülalları inkişaf etdirməkdir. Bu məqsədlərə doğru irəliləyiş olduqca təsir edici olmuşdur və yaxın infraqırmızı flüoresan zülalların üfüqdə görünməsi ağlasığmaz deyil.

Ən son nəsil meduza variantları birinci nəsil flüoresan zülalların, xüsusən də sarı və yaşıl törəmələrin çatışmazlıqlarının çoxunu həll etdi. Monomerik, parlaq və tez yetişən qırmızı flüoresan zülalın axtarışı bir neçə yeni və maraqlı flüoresan zülal sinifləri ilə nəticələndi, xüsusən də mərcan növlərindən əldə edilənlər. Mövcud flüoresan zülalların inkişafı, qeyri-təbii amin turşularının daxil edilməsi kimi yeni texnologiyalarla birlikdə rəng palitrasını daha da genişləndirəcək. Optik spektral ayırma üsulları daha yaxşı inkişaf etdikcə və daha geniş yayıldıqca, bu yeni növlər, xüsusən də spektrin sarı və qırmızı bölgələrində mövcud palitranı tamamlayacaqdır.

Flüoresan zond texnologiyasında mövcud tendensiya uzaq qırmızı və yaxın infraqırmızı rəngə flüoresan edən boyaların rolunu genişləndirməkdir. Məməli hüceyrələrində həm avtoflüoresans, həm də işığın udulması spektrin qırmızı ucunda xeyli azalır. Beləliklə, uzaq qırmızı flüoresan zondların inkişafı qalın nümunələrin və bütün heyvanların tədqiqi üçün son dərəcə faydalı olardı. Transgenik sistemlərdə flüoresan zülalların müxbir kimi uğurunu nəzərə alsaq, bütün orqanizmlərdə uzaq qırmızı flüoresan zülalların istifadəsi gələcək illərdə getdikcə daha vacib olacaqdır.

Nəhayət, biosensorların mühəndisliyi üçün flüoresan zülal tətbiqlərində böyük potensial indi həyata keçirilir. Biosensor konstruksiyalarının sayı sürətlə artır. Struktur məlumatlardan istifadə etməklə, bu zondların inkişafı həssaslığın artmasına səbəb olub və bundan sonra da edəcək. Bu cəhdlərin uğuru, şübhəsiz ki, demək olar ki, istənilən bioloji parametrin müvafiq flüoresan zülal əsaslı biosensordan istifadə etməklə ölçülə biləcəyini göstərir.

Töhfə verən Müəlliflər

David W. Piston - Molekulyar Fiziologiya və Biofizika Departamenti, Vanderbilt Universiteti, Nashville, Tennessi, 37232.

George H. PattersonCennifer Lippincott-Schwartz - Hüceyrə Biologiyası və Metabolizm Şöbəsi, Milli Uşaq Sağlamlığı və İnsan İnkişafı İnstitutu, Milli Sağlamlıq İnstitutu, Bethesda, Merilend, 20892.

Nathan S. ClaxtonMichael W. Davidson - Milli Yüksək Maqnit Sahəsi Laboratoriyası, 1800 East Paul Dirac Dr., Florida Dövlət Universiteti, Tallahassee, Florida, 32310.

Əlaqədar Nikon Məhsulları

Floresan filtr kubları

Nikon çoxlu sayda flüoroforların və flüoresan zülalların təsvirini dəstəkləmək üçün yüksək flüoresan əldə etmə səmərəliliyinə malik geniş spektrli flüoresan filtr kublarını təklif edir.

İşıq mənbələri

Nikon, stereomikroskopiya üçün koaksial sistemlərdən tutmuş epi-flüoresan tətbiqləri üçün LED əsaslı işıqlandırıcılara və qabaqcıl təsvir tətbiqləri üçün güclü lazer qurğularına qədər geniş spektrli təsvir ehtiyacları üçün işıq mənbələri təklif edir. Bir çox yüngül həllərimiz unikal tətbiqləri ehtiva edir və yüksək sürətli idarəetmə üçün işə salına bilər.


ORİJİNAL TƏDQİQAT MƏQƏLƏLƏRİ

Coons, A. H., Creech, H. J. & Jones, R. N. Floresan qrupu olan bir antikorun immunoloji xüsusiyyətləri. Proc. Soc. Uzman. Biol. Med. 47, 200–202 (1941)

Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. & Berliner, E. Flüoresan antikorun istifadəsi ilə toxumalarda pnevmokok antigeninin nümayişi. J. İmmunol. 45, 159–170 (1942)

ƏLAVƏ OXUYUN

Coons, A. H. & amp Kaplan, M. H. Toxuma hüceyrələrində antigenin lokallaşdırılması: floresan antikor vasitəsilə antigenin aşkarlanması metodunda təkmilləşdirmələr. J. Exp. Med. 91, 1–13 (1950)

Coons, A. H. İmmunofluoresansın başlanğıcı. J. İmmunol. 87, 499–503 (1961)


Rekombinant Antikorlardan Reagentsiz Flüoresan Biosensorların Biliyə əsaslanan Dizaynı

Hər hansı bir antikordan flüoresanlığın dəyişməsi ilə antigenin bağlanmasına cavab verən flüoresan konjugat əldə etmək imkanı analitik elmlərdə və zülal çiplərinin qurulması üçün böyük maraq doğuracaqdır. Bu ehtimal toyuq yumurtasının ağ lizoziminə qarşı yönəldilmiş mAbD1.3 antikoru ilə tədqiq edilmişdir. Dizayn qaydaları mutagenez yolu ilə sisteinə dəyişdirildikdən sonra flüoroforun kimyəvi cəhətdən birləşdirilə biləcəyi antikor qalıqlarını müəyyən etmək üçün hazırlanmışdır. Bu qaydalar aşağıdakılara əsaslanırdı: antikor və antigen arasındakı kompleksin strukturunda antigenin topoloji qonşuluğuna aid olan hədəf qalığı, antigenlə qarşılıqlı əlaqə üçün funksional əhəmiyyətinin olmaması və sərbəst antikorun strukturunda həlledicinin əlçatanlığı. mAbD1.3-ün tək zəncirli dəyişən fraqmenti scFv ilə ətraf mühitə həssas flüorofor arasında on yeddi konjuqat quruldu. Dizayn qaydalarına tam cavab verən on qalıqdan altısı üçün konyuqatın sərbəst və bağlı vəziyyətləri arasında flüoresan intensivliyinin nisbi dəyişməsi 12 ilə 75% arasında (optimal olmayan tamponda) və konyuqata yaxınlıqdan ibarət idi. lizozim üçün valideyn scFv ilə müqayisədə dəyişməz qaldı. Bunun əksinə olaraq, belə nəticələr qaydalardan birini təmin etməyən və nəzarət kimi istifadə edilən yeddi qalıqdan yalnız biri üçün doğru idi. Konjugatlardan biri daha ətraflı tədqiq edilmişdir. Onun flüoresanlığı nanomolyar diapazonda lizozim konsentrasiyasına mütənasib olaraq, müəyyən edilmiş tamponda 90%-ə qədər və serumda 40%-ə qədər artmışdır. Bu artım toyuq yumurtası lizozimi üçün spesifik idi və yaxından əlaqəli bir protein olan hinduşka yumurtası lizozimi ilə müşahidə olunmadı. Əməliyyat konjugatlarını verən qalıqlar (VL və biri VH), FvD1.3 ardıcıllığı boyunca funksional əhəmiyyətli olan qalıqların bilavasitə yaxınlığında yerləşirdi. Nəticələr struktur məlumatların olmadığı halda, hər hansı bir antikordan antigenə həssas flüoresan konjugatların qurulması üçün dizayn qaydalarını təklif edir.