Məlumat

Plazmid seçimi

Plazmid seçimi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

C. elegansın qidalanmasında eksperiment hazırlamaq. C. elegans-ı qidalandıra bilən maraq genini daxil etmək üçün plazmid vektoru seçməlidir. Bir çox kağız qidalanma vektoru üçün pL4440-dan istifadə edir, bunun C. elegan qidalanmasında ilk istifadə olduğunu və iki T7 promotoru sayəsində eksperimentin aparılmasının asan olduğunu söyləyir. T3 promotorunun C. elegans-da qidalanma üçün uyğun olmadığını göstərən kağız da var. Mənə maraqlıdır ki, niyə T3 uyğun deyil? və C. elegan-da qidalanma təcrübəsini yerinə yetirmək üçün başqa vektordan istifadə edən çoxlu kağız görmədiyim üçün. Görəsən, iki T7 promotoru olan və pLT61 kimi qurdlarda ifadə etmək üçün istifadə edilən plazmid seçsəm, bu, qidalanmaya və ya səmərəliliyə təsir edəcəkmi ki, insanlar C.eleganda qidalanma üçün pL4440-dan istifadə etsinlər? Yoxsa insanlar pL4440 vektorundan istifadə edir, çünki o, C. elegan-ın qidalanma təcrübəsi üçün nəzərdə tutulmuşdur? Çox sağ ol!


ÖN SÖZ: Mətn var, C. elegans: Metodlar və Tətbiqlər, xüsusilə doi: 10.1385/1-59745-151-7:109. Onlar bu dəqiq təcrübəni mahiyyətində təsvir edirlər və diaqramlardan birində (səhifə 110) qeyd olunur ki, RNT-nin məqsədləri üçün C. elegans, T3 promotoru xüsusi olaraq bakterial qidalanma üsulu üçün işləmir, lakin inyeksiya və ya islatma prosedurları üçün işləyir. Bunun konkret olaraq niyə olduğunu tam olaraq anlaya bilmirəm, amma araşdırmaya davam edəcəyəm.

YENİLƏNİB: Hər şeyi təmizlədiyiniz üçün mdperry-yə çox sağ olun! Göründüyü kimi, bu, eksperimental dizayn məsələsidir. Məlumatdan istifadə edərək Bakterial olaraq ifadə edilən dsRNA-ların qəbulu Caenorhabditis elegans-da spesifik və güclü genetik müdaxilə yarada bilər., və Mənbə Bioscience:

HT115 (DE3) bu şəkildə hazırlanmış bir qidalanma gərginliyidir,

Genotip aşağıdakı kimidir: F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, lambda -, rnc14::Tn10(DE3 lizogen: lavUV5 promotor -T7 polimeraza) (IPTG-induksiya olunan T7 polimeraza) (RNase III minus) . Bu ştam LB və ya 2xYT plitələrində böyüyür (və tetrasiklinə davamlıdır, aşağıya baxın) və səlahiyyətli hüceyrələr standart üsullarla hazırlana bilər.

Bunları nəzərdən keçirə və dəyişikliklərə də baxa bilərik:

F- konjuqasiya üçün F plazmidinin olmaması deməkdir. mcrA/B E. coli-nin yad DNT-yə hücum etmək qabiliyyətini azaldan mutasiyalara aiddir. IN(rrnD-rrnE)1 təsirindən əmin olmadığım bəzi rRNT operonlarının bölgəsindəki inversiyadır. Lambda- lambda lizogenini çıxarır. Görə bilərsiniz ki, onlar E. coli-nin əlaqəli klonlama vektorunu ifadə etmək üçün T7 polimeraza istehsal etməyə başlaması üçün vacib olan IPTG-induksiya olunan T7 polimeraza üçün lavUV5 promotoruna malikdirlər. Siz həmçinin görə bilərsiniz ki, HT115 (DE3) RNase III üçün çatışmazdır, lakin bu, normal olaraq dsRNA-nı pisləşdirir və onu qidalanma təcrübəsi üçün uyğun edir.

L4440 (pPD129.36) klonlama vektoru çox klonlama yeri ilə ayrılmış əks oriyentasiyada iki konvergent T7 polimeraza promotorunu ehtiva edir və standart klonlaşdırma üsullarından istifadə etməklə hazırlanmışdır (Timmons və Fire, 1998).

pLT61 L4440 vektoruna daxil edilmiş 0,8 kb unc-22 ehtiva edir.

Düşünürəm ki, L4440 plazmidini bu təcrübə üçün optimallaşdırmaq çox asandır və ucuzdur. Əgər yuxarıda bağladığım məqaləyə daxil ola bilsəniz, onlar bəzi əlavə plazmidləri kataloqlayırlar. Yekun olaraq, belə görünür ki, əgər E. coli-nin özlərinin T3 polimeraza istehsal edə biləcəyi bir sistemimiz olsaydı, bu promotorlardan istifadə etmək yaxşı olardı. Bu təcrübə vəziyyətində bakteriyaların qidalanma ştammının genotipi istifadə olunan vektoru gözəl şəkildə tamamlayır.


Plazmidlər 101

Plazmidlər, ev sahibinin xromosomundan müstəqil surətdə təkrarlanan bakteriya hüceyrələrində olan dairəvi DNT parçalarıdır. Onlar bioloji tədqiqatların demək olar ki, bütün sahələrinə toxunan güclü və hər yerdə mövcud olan alətlərdir. Ümumiyyətlə, plazmidlər hədəf hüceyrələrdə spesifik genləri ifadə etmək, yeni elementlər təqdim etmək üçün istifadə olunur və müxtəlif digər genetik manipulyasiyalarda istifadə edilə bilər. Blokun bu bölməsində plazmidin müxtəlif hissələri, molekulyar klonlaşdırma üsulları, plazmidlərdən istifadə üçün məsləhətlər, xüsusi plazmid əsaslı alətlər və s. haqqında ətraflı məlumat əldə edin.


Əksər hallarda, yüksək surətli plazmid vektoru ən yüksək məhsuldarlığı əldə etmək üçün ən yaxşı yanaşmadır. Məsələn, pBluescript-in nüsxə nömrəsi 300-500 və pUC 700-ə çata bilər. Ola bilsin ki, pACYC-də olduğu kimi bəzi plazmidlərin 10-12 nüsxə nömrəsi kimi daha təvazökar dəyəri var. Bu daha ixtisaslaşmış vektorlar yüksək surətli plazmidlərin yaratdığı bəzi problemlərin qarşısını almaq üçün hazırlanmışdır. DNT fraqmentiniz, məsələn, yüksək səviyyədə olduqda hüceyrə üçün zəhərli ola bilər. Bu halda, hər hansı problemdən qaçmağın ən yaxşı yolu aşağı nüsxə vektorundan istifadə etmək ola bilər.

Klonlaşdırma prosesində mühüm addım DNT fraqmentinin plazmidlə bağlanmasıdır. Bu, xüsusi məhdudlaşdırıcı endonükleazların istifadəsi ilə çox asanlaşdırılır. Bu o deməkdir ki, plazmid və seçilmiş məhdudlaşdırıcı fermentlərin uyğun olub olmadığını yoxlamaq vacibdir. Əslində, bu, indiki vaxtda o qədər də problemli deyil, çünki müasir vektorların əksəriyyətinə bir çox müxtəlif məhdudlaşdırıcı endonükleaz kəsici yerləri olan süni DNT uzantısı daxildir. Əgər hər şey uğursuz olarsa, küt uc bağlamalar mümkündür, lakin müvəffəqiyyətlə tamamlamaq çox çətin ola bilər.


Fərqli xüsusiyyətlər Aqrobakteriya vektorlar

İki əsas irəliləyiş əldə edildi Aqrobakteriya transformasiya bitki transformasiyası üçün seçilən üsul.

  • Bütün T-DNT genlərinin çıxarılmasına mane olmur Aqrobakteriya DNT-ni köçürmək qabiliyyətinə malikdir, lakin şişlərin əmələ gəlməsinin qarşısını alır. Bu, elm adamlarına "silahsız suşlar" istehsal etməyə imkan verdi.
  • üçün iki əsas komponent Aqrobakteriya plazmid, T-DNT və virulentlik (vir) bölgəsi ayrı-ayrı plazmidlərdə yerləşə bilər. Bu komponentlər ikili Ti vektorları adlanan müasir Ti plazmid vektorlarının əsasını təşkil edir.

T-DNT-nin ölçüsü təxminən 10-30 kbp-dir (plazmid ölçüsünün təxminən 10%-i). Bəzi plazmidlərdə birdən çox T-DNT bölgəsi ola bilər. Bundan əlavə, plazmiddə T-DNT-nin işlənməsi və onun bakteriyadan bitki hüceyrəsinə sonrakı ixracı üçün məsul olan təxminən 35 virulentlik geni var.

Ən çox in vitro gen manipulyasiya üsullarından istifadə edir E. coli tez böyüyən bakteriya olduğu üçün plazmid məhsuldarlığını artırmaq üçün. Beləliklə, ikili Ti vektorları ilə işləməyin bir üstünlüyü onların hər ikisində təkrarlanma qabiliyyətidir E. coliAqrobakteriya.

Fərqli mövcud olanlar haqqında danışaq Aqrobakteriya bitki transformasiyasında istifadə olunan vektorlar.

İkili vektor

İkili vektor termini hərfi mənada biri T-DNT, digəri virulent genlər üçün olan iki replikondan (DNT molekullarından) ibarət olan bütün sistemə istinad etsə də, T-DNT-ni daşıyan plazmid çox vaxt ikili vektor adlanır. Rahatlıq üçün, oxucuya daha ətraflı məlumat vermək üçün iki plazmidin hərfi tərifinə əməl edirəm.

Binar vektor iki plazmiddən ibarətdir: T-DNT bölgəsini daşıyan tərksilah edilmiş Ti plazmid və virulentlik genlərini ehtiva edən köməkçi plazmid.

Silahsız Ti ​​plazmidi:

Silahsızlaşdırılmış Ti-plazmid T-DNT və vektor onurğa sütunundan ibarətdir (Şəkil 2A). Hər iki komponentin birlikdə köçürüləcək DNT ardıcıllığını təyin edən və dəyişdirilmiş toxuma və ya bitkinin identifikasiyasına kömək edən fərqli genlər var. Aşağıda mən tərksilah edilmiş Ti-plazmiddə mövcud olan bu iki komponentin hər birini təsvir etdim.

Cədvəl 1. Silahsızlaşdırılmış Ti-plazmidin komponentləri.

sağ sərhəd (RB) və sol sərhəd (LB) Oktapin və Nopaline Ti plazmidlərindən gələ bilər.

Plazmid replikasiya funksiyaları

Bu, təkrarlanacaq bir mənşəli replikasiyadır E. coliA. tumefaciens. üçün A. tumefaciens bizdə IncP, IncW, pVS1 və pRi var. üçün E. coli, bizdə pUC, ColE1, IncP, F faktoru və Phage P1 var.

pUC və pBluescript plazmidlərində çoxlu klonlama yerləri var.

Bakterial seçilə bilən marker

Kanamisin, ampisilin, gentamisin, spektinomisin, xloramfenikol və tetrasiklin ola bilər.

Bu kanamisin, hiqromisin, fosfinotrisin, qlifosat, fosfomannoz izomeraza ola bilər.

Plazmid mobilizasiya funksiyaları

OriT və Bom kimi T-DNT mobilizasiya funksiyalarını dəstəkləyirlər

Bu GUS, LUC, GFP floresan zülalları ola bilər

Təsisedici promotorlar adətən seçilə bilən marker genlərini idarə edirlər. Bunlara CamV 35S, T-DNT genləri, ubiquitin və aktin genləri daxildir.

Köməkçi plazmid:

VirA, virB, virC və s. adlı bir neçə virulentlik genləri var ki, bunların hamısı T-DNT-nin köçürülməsində müxtəlif rollara malik olan müxtəlif zülallar istehsal edir. Aqrobakteriya onun sahibinə (Şəkil 2B). Aşağıda hər bir gen üçün yerinə yetirilən əsas funksiyaları təsvir edən bir cədvəl.

Cədvəl 2. Virulentlik genlərinin funksiyalarının təsviri Aqrobakteriya köməkçi plazmid.

Fenolik birləşmələri hiss edir və virulentlik genlərinin ifadəsini yaradır

Sekresiya sistemində vacibdir. T-kompleksinin hüceyrəyə ixracı üçün tələb olunur

Yüksək effektiv T-tel sintezini təşviq edir

Müvafiq olaraq topoizomeraz və endonükleaz funksiyaları

Şaperon funksiyası. T-telini nüvə hücumundan qoruyun.

Şəkil 2. Binar vektorun komponentləri. A) Silahsızlaşdırılmış Ti-plazmid. B) Köməkçi plazmid. B marker: bakterial seçilə bilən marker LB: Sol sərhəd Mob: Səfərbərlik funksiyası MSC: Çoxlu klonlama saytları Ori A: Agrobacterium Ori E üçün replikasiya funksiyası: E. coli üçün replikasiya funksiyası P marker: Bitki seçilə bilən marker Pro: Promoter RB: Sağ sərhəd Rep: Reportyor geni.

Superbinar vektor

Bəzi virulentlik genlərinin gen dozası effektləri nümayiş etdirməsinin tapılması əlavə virulent genləri daşıyan superbinar vektorun inkişafına səbəb oldu. Superbinar vektor sistemi ikili vektorla eyni onurğaya malikdir, lakin o, həmçinin pTiBo542-dən virB, virC və virG kimi virulent genləri ehtiva edən əlavə DNT seqmentinə malikdir və o, kiçik T-DNT-daşıyan plazmidə daxil edilir. Bu bölgəyə "S vir" də deyilir. Əlavə vir genlər müxtəlif bitkilərin, xüsusilə də mühüm dənli bitkilər kimi inadkar bitkilərin transformasiyasında yüksək effektivliyə səbəb olmuşdur.

Şəkil 3. Superbinar vektorun komponentləri. S vir (qırmızı rəngdə) virulentlik genlərini daşıyan əlavə seqmentdir və bu, ikili vektorla fərqlənir.

Üçlü vektor

Üçlü vektor Anand və başqalarının təklif etdiyi yeni sistemdir. (2018) əlavə virulentlik gen klasterini daşımaq üçün "aksesuar plazmid" və ya "virulent köməkçi plazmid" adlandırılan üçüncü plazmiddən istifadə edir. Üçlü vektor sistemi tərksilah edilmiş Ti plazmidi, köməkçi plazmidi və əlavə virulent plazmidi olan üç komponentli sistemdir.

Silahsız Ti ​​plazmidi:

Silahsızlaşdırılan Ti plazmidi RB və LB ilə əhatə olunan T-DNT bölgəsindən ibarətdir ki, bu da təkrarlanmanın (ori) mənşəyidir. Aqrobakteriya (məsələn, pVS1 və ya pRiA4) və digər ori üçün E. coli (pUC) və bitki seçilə bilən marker (adətən kanamisin).

Köməkçi plazmid:

Köməkçi plazmidin a vir bölgə, bakterial seçilə bilən marker (str, streptomisin), Ti plazmidlərinin konyuqasiya ötürülməsində fəaliyyət göstərən tra/trb bölgələri və əgər varsa, Ti plazmidlərinin təkrarlanması funksiyasına malik repABC/repAʹBʹCʹ bölgəsi.

Əlavə virulent plazmid:

Əlavə virulent plazmid bir oridən ibarətdir Aqrobakteriya (məsələn, pVS1 və ya pRiA4) və ori üçün E. coli (pUC ori) və bakterial seçilə bilən marker (spe, spectinomycin) və böyük bir virulentlik bölgəsi.

Üçlü vektor sistemi, itaətkar qarğıdalı inbred xətlərində transformasiya səmərəliliyini təxminən iki dəfə artırır (Anand et al., 2018). Üçlü sistem də səmərəliliyi asanlaşdırdı Aqrobakteriya sorqo transformasiyası (Sorghum ikirəngli) və populyar, lakin inadkar Afrika növləri üçün transformasiya protokollarını hazırlamaq üçün istifadə edilmişdir (Che et al., 2018).

Şəkil 4. Üçlü vektorun komponentləri. The aksesuar plazmid üçlü vektorda yeni komponentdir və bu, əvvəlki vektorlarla fərqlənir. Tra/trb: transkripsiya aktivatorları rep ABC: ABC replikasiya mənşəyi.

Cədvəl 3. Aralarındakı ümumi cəhətlər və fərqlər Aqrobakteriya vektorlar.

Tərkibində virulentlik genləri olan köməkçi plazmid var

T-DNT-daşıyan plazmiddə əlavə virulent genlərə malikdir

Monokotlarda və inadkar bitkilərdə yaxşı işləyir

Böyük bir virulentlik bölgəsini ehtiva edən köməkçi köməkçi plazmidə malikdir

Bəzi monokotlarda və inadkar bitkilərdə intensiv infeksiyaya səbəb olur


Plazmid xəritəsi nədir

Plazmid xəritəsi plazmidin əsas işarələrinin və ya elementlərinin yerlərini göstərən plazmidin qrafik təsviridir. Plazmid daxilində elementlərin nisbi mövqeləri ilə müəyyən edilə bilər məhdudiyyət xəritəsi. Məhdudiyyət xəritəsi müəyyən bir plazmid daxilində məhdudiyyətlərin tanınması yerlərinin xəritəsidir. Beləliklə, məhdudlaşdırıcı fermentlər tərəfindən plazmidin həzmində iştirak edir. Məhdudiyyət xəritəsi göstərilir rəqəm 1.

Şəkil 1: Məhdudiyyət xəritəsi

Məhdudiyyət xəritəsində iki üsuldan istifadə edilə bilər:

1. Məhdud həzm

– Plazmidin bir və ya iki məhdudlaşdırıcı fermentlə həzminin məhdudlaşdırılması

– Plazmiddən alınan fraqmentlərin ölçülərinə əsasən plazmidin xəritələşdirilməsi

2. Sıralama

– Bütün plazmidin ardıcıllığı

– Plazmid elementlərinin identifikasiyası


Sinif 12 Biologiya Fəsil 15 Genetika Mühəndisliyi üçün RBSE Həlləri

RBSE Sinif 12 Biologiya Fəsil 15 Çox Seçimli Suallar

Sual 1.
Aşağıdakı fermentlərdən hansı DNT-ni müəyyən bir yerdə kəsir?
(a) ligaza
(b) polimeraza
(c) məhdudlaşdırıcı endonukleaz
(d) yuxarıda göstərilənlərin hamısı
Cavab:
(c) Məhdudiyyətli endonukleaz

Sual 2.
Məhdudiyyət endonükleaz fermenti təbii olaraq tapılır?
(a) Bakteriyalar
(b) Virus
(c) Bitkilər
(d) Heyvanlar
Cavab:
(a) Bakteriyalar

Sual 3.
DNT vektoru nədir?
(a) Plazmid
(b) cDNA
(c) Sintez edilmiş DNT
(d) yuxarıda göstərilənlərin hamısı
Cavab:
(a) Plazmid

Sual 4.
M13 misaldır?
(a) Plazmid
(b) bakteriofaq
(c) Kosmid
(d) yuxarıda göstərilənlərin hamısı
Cavab:
(b) bakteriofaq

Sual 5.
Blotting texnikasından hansı DNT seqmentlərinin identifikasiyası üçün istifadə olunur?
(a) Genomik DNT
(b) Qərb
(c) cənub
(d) Şimal
Cavab:
(c) cənub

Sual 6.
Hansı ferment sərbəst DNT uclarını birləşdirir?
(a) məhdudlaşdırıcı endonükleaz
(b) liqazlar
(c) Lizozim
(d) yuxarıda göstərilənlərin hamısı
Cavab:
(b) ligazalar

Sual 7.
Jumping genləri adlanır?
(a) Fazmid
(b) Plazmid
(c) Kosmid
(d) Transpozonlar
Cavab:
(d) Transpozonlar

Sual 8.
Mullis 1989-cu ildə kəşf edildi?
(a) Plazmid
(b) Polimeraza zəncirvari reaksiya
(c) Southern Blotting texnikası
(d) Western Blotting texnikası
Cavab:
(b) Polimeraza zəncirvari reaksiya

Sual 9.
C-DNT əmələ gəlməsində istifadə olunur?
(a) tRNT
(b) mRNT
(c) rRNT
(d) DNT
Cavab:
(b) mRNT

Sual 10.
Aşağıdakılardan hansı EcoRI mənbəyidir?
(a) Bakteriyalar
(b) yosunlar
(c) Bitki
(d) yuxarıda göstərilənlərin hamısı
Cavab:
(a) Bakteriyalar

RBSE Sinif 12 Biologiya Fəsil 15 Çox Qısa Cavab

Sual 1.
Rekombinant DNT Texnikasının (RDT) işlənib hazırlanmasında kimə borc verilir?
Cavab:
Stanley Cohen, Herbert Boyer et al (1973).

Sual 2.
Rekombinant DNT texnologiyasını təyin edin?
Cavab:
Hər hansı bir orqanizmin DNT-də dəyişiklikləri daxil etmək üçün tələb olunan müxtəlif təsirli tədbirlərə rekombinant DNT texnologiyası deyilir.

Sual 3.
Klonlama vektorları nədir?
Cavab:
Rekombinant DNT texnologiyasında, hədəflənmiş bitki/heyvanda arzu olunan geni təqdim etmək üçün, istənilən geni daşıya bilən və hədəf bitki/heyvana daxil olub onun DNT-sini təkrarlaya bilən bir daşıyıcı tələb olunur. Bu daşıyıcıya vektor deyilir. Plazmidlər, Bakteriofaqlar və Kosmidlər rekombinant DNT texnologiyasında vektor kimi istifadə olunur.

Sual 4.
Molekulyar zondlar dedikdə nə nəzərdə tutulur?
Cavab:
Bəzi orqanizmlərin C-DNT və ya RNT seqmentlərinin müəyyən edilə biləcəyi DNT və ya RNT seqmentlərinə molekulyar zondlar deyilir.
Molekulyar zondlar aşağıdakı növlərə malikdir:

Sual 5.
Marker genlər nədir? Nümunələr yazın.
Cavab:
İstənilən gen vektorla birləşdirildikdə, bir neçə arzuolunmaz məhsul da əldə edilir. Bu arzuolunmaz məhsulları aradan qaldırmaq və ana hüceyrədəki rekombinant DNT-ni müəyyən etmək üçün xüsusi bir gen növü istifadə olunur. Bu, dəyişdirilmiş/çevrilmiş hüceyrələrdə xüsusi xüsusiyyətlər yaradır. Vektor DNT-yə daxil olan bu gen marker gen adlanır.
Misal: Kanamisinə davamlı gen.

Sual 6.
Müxbir genləri nədir? Nümunələr verin.
Cavab:
Marker genlərdən başqa, ev sahibi hüceyrədə bəzi spesifik xüsusiyyətlər yaradan və ya təqdim edən müəyyən genlər var. Bunlara reportyor genləri deyilir. Bu genlər xüsusi təsir yaradır, ona görə də bu genləri ehtiva edən hüceyrələr digər hüceyrələrdən fərqli görünür.
Misal: LUC geni atəş milçəyində (“Jugnoo”) tapılır və bioluminesans yaradır.

Sual 7.
Genomik kitabxana nədir?
Cavab:
Hər hansı bir orqanizmin bütün genomunun klonlaşdırılmış seqmentlərinin toplanması genomik kitabxana adlanır. Genomik kitabxana orqanizmin haploid xromosom dəstinin tam DNT tərkibini çıxarmaqla formalaşır.

Sual 8.
Kosmidlər nədir?
Cavab:
Kosmidlər plazmid və 2 (Lambda) faqın hibrididir. λ (Lambda) faqının ‘Cos’ sahəsinin DNT ardıcıllığının daxil olduğu belə plazmidlər kosmidlər kimi tanınır.

Sual 9.
Endonükleazın məhdudlaşdırıcı fermentini təyin edin.
Cavab:
DNT molekulunu müəyyən yerlərdə kəsən fermentə restriksiya endonükleaza deyilir. Bu fermentlər, DNT-ni müəyyən yerlərdə seqmentə kəsən molekulyar qayçı kimidir.

Sual 10.
Gel elektroforez texnikasında istifadə olunan gelləri adlandırın.
Cavab:

Sual 11.
RFLP-nin tam formasını yazın.
Cavab:
Məhdudiyyət Fraqmentinin Uzunluğu Polimorfizmi RFLP kimi qısaldılmışdır.

RBSE Sinif 12 Biologiya Fəsil 15 Qısa Cavab Sualları

Sual 1.
Klonlama vektorları nədir? Rekombinant rDNT texnologiyasında istifadə olunan müxtəlif klonlama vektorları haqqında qısa məlumat yazın?
Cavab:
İstənilən gen(lər)i təcrid etdikdən sonra bu geni özündə birləşdirə və onunla birlikdə ana hüceyrəyə daxil ola və onun DNT-sini orada təkrarlaya bilən vektor tələb olunur. Bu vektor klonlama vektoru adlanır. Plazmid, Bakteriofaqlar və Kosmidlər rekombinant DNT texnologiyasında istifadə olunan əsas klonlama vektorlarıdır.
Plazmidlər:

  • Bunlar bakteriya hüceyrəsindəki ekstraxromosomal komponentlərdir.
  • DNT dairəvi və cüt zəncirli molekuldur.
  • Onlar replikasiya yerinin mənşəyini ehtiva edir və bakterial xromosomdan asılı olmayaraq təkrarlana bilirlər.
  • İstənilən genin daxil oluna biləcəyi xüsusi məhdudiyyət sahələri var.
  • Onların marker saytları var.
  • Plazmiddə 3-100 gen ola bilər.
  • Bakterial yolla yoluxduran və bakteriya hüceyrəsinin parçalanmasına səbəb olan viruslara bakteriofaqlar deyilir.
    Misal: λ (Lambda) faq və M13 faj və s.
  • Bakteriofaqlar plazmidlərlə müqayisədə daha yaxşı vektordur.
  • Böyük DNT seqmentləri (24 Kbp) bakteriofaqlarda klonlana bilər.
  • Hər bir bakteriofaq mədəniyyətdə lövhə əmələ gətirir. Buna görə də onların tanınması asandır.
  • Bu plazmid və λ (Lambda) faqının hibrididir.
  • Bunlar ana hüceyrədə plazmid kimi çoxalda bilər.
  • ‘Cos’ saytının mövcudluğuna görə bunlar faj hissəcikləri kimi qablaşdırılır.
  • Kosmidlər 45 Kbp-ə qədər DNT seqmentini klonlaşdırmaq üçün istifadə edilə bilər.

Sual 2.
PBR 322 plazmidini şərh edin.
Cavab:
PBR 322 plazmid ən çox istifadə edilən plazmid vektorudur. Bu plazmiddə TetR (Tetrasiklinə davamlı) və AmpR (Ampisillinə davamlı) iki marker yeri tapılır. O, 12 müxtəlif məhdudlaşdırıcı fermentlər üçün tanınma sahələrini ehtiva edir. İstənilən DNT (xarici DNT) məhdudlaşdırıcı fermentin köməyi ilə TetR və AmpR geni arasına daxil edilir.

Sual 3.
Qısa bir qeyd yazın:

  1. Southern Blotting texnikası.
  2. DNT Barmaq izi.
  3. Polimeraza zəncirvari reaksiya.
  4. Məhdudlaşdırıcı fermentlərin nomenklaturası.
  5. Vektorların xüsusiyyətləri.

Cavab:
1. Southern Blotting texnikası:
Bu texnika DNT seqmentlərinin təhlili üçün istifadə olunur. Bu, E.M. Southern (1975) tərəfindən hazırlanmış və buna görə də belə adlandırılmışdır. Bu texnikada DNT seqmentləri nitroselüloz filtrinə köçürülür. Bunlar daha sonra DNT zondları ilə hibridləşmə yolu ilə müəyyən edilir.

2. DNT Barmaq izi:
DNT Barmaq Çapı Alec Jeffreys və iş yoldaşları tərəfindən kəşf edilmişdir (1985). Bu üsulda müəyyən bir insanın DNT-si kiçik seqmentlərə kəsilir və elektroforez yolu ilə lentlər şəklində ayrılır. Bir insanın şəxsiyyəti, şəxsin DNT-sində tapılan xüsusi əsas ardıcıllıqla müəyyən edilə bilər. Bu üsuldan hər hansı bir uşağın atalığı ilə bağlı mübahisəli məsələlərin həllində və uşağın doğulmasından əvvəl genetik xəstəliklərin aşkarlanmasında istifadə olunur. O, həmçinin cinayətkarların (Qatillər və Təcavüzkarlar və s.) müəyyən edilməsində istifadə olunur.

3. Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (PZR):
Polimeraza Zəncirvari Reaksiya Mullis (1989) tərəfindən kəşf edilmişdir. Bu, bir DNT molekulunun milyonlarla nüsxəsini çox qısa müddətdə DNT-nin təkrarlanması üçün vektorları cəlb etmədən əldə edə biləcəyi güclü bir texnikadır. Bu, DNT termal siklatorunda həyata keçirilir. Bu dövrü 20 – 30 dəfə təkrar etməklə DNT-nin nüsxələri əldə edilir.

4. Məhdudlaşdırıcı fermentlərin nomenklaturası:

  • Ferment adının ilk əlifbası onun təcrid olunduğu cinsin adını ifadə edir. Böyük hərflərlə yazılmışdır.
  • Bundan sonrakı iki əlifba cinsin növlərini təmsil edir. Bunlar kiçik hərflərlə yazılmışdır.
    Qeyd: Hər üç hərf kursivlə yazılmışdır.
    Misal: E co = Escherichia coli.
  • Dördüncü əlifba (söz) fermentin təcrid olunduğu növün ştamını təmsil edir.
    Nümunə Eco R = E.coli-nin R ştammı.
  • Əgər eyni orqanizmdən (eyni ştamm) birdən çox məhdudlaşdırıcı ferment alınırsa, bunlar Roma rəqəmləri ilə göstərilir.
    Nümunə: Eco RI, E.coli-nin R ştamından birinci məhdudlaşdırıcı ferment. Eco RII, E.coli-nin R ştamından ikinci məhdudlaşdırıcı ferment.
  • O, ana hüceyrəyə asanlıqla daxil edilə bilər və asanlıqla təcrid edilə bilər.
  • O, ana hüceyrədə sərbəst şəkildə özünü təkrarlamalıdır.
  • Vektor Məhdudiyyət sahələrinə malik olmalıdır ki, məhdudlaşdırıcı ferment həmin yerdə DNT-ni kəsə bilsin ki, istənilən DNT fraqmenti asanlıqla daxil olsun.
  • Rekombinant hüceyrələrin seçilməsində kömək edə biləcək bir marker geni və ya marker sahəsi olmalıdır.
  • Transformasiya asan və mükəmməl olmalıdır.
  • İstənilən xarici DNT-nin ifadəsi üçün vektor əsasən promotor, operator tənzimləyici saytlar kimi komponentlərə malik olmalıdır.

Sual 4.
Genomik Kitabxananın formalaşması prosesini izah edin.
Cavab:
Bir orqanizmin haploid xromosom dəstinin (genomunun) tam DNT tərkibinin toplanması onun genomik kitabxanası adlanır. Genomik kitabxana bütün DNT-ni hüceyrədən təcrid etməklə əmələ gəlir. Genomik kitabxana aşağıdakı üsulla formalaşır:

Sual 5.
Bakteriofaqın klonal vektor kimi əhəmiyyəti haqqında qısa qeyd yazın.
Cavab:
Aşağıdakı səbəblərə görə bakteriofaqlar plazmidlərdən daha yaxşı vektordur:

  • Nisbətən böyük ölçülü (24 kbp) DNT seqmentini klonlaya bilir.
  • Hər bir bakteriofaq mədəniyyətdə bir lövhə sahəsi əmələ gətirir ki, onun vasitəsilə sınaq nisbətən asandır.

λ (Lambda) faqı M-dən daha çox vektor kimi istifadə olunur13 fag, çünki λ fag xətti və ikiqat zəncirli DNT-yə malikdir və E.coli fajıdır və böyük ölçülü xarici DNT onun DNT-sinə asanlıqla daxil edilə bilər.

RBSE Sinif 12 Biologiya Fəsil 15 İnşa Növü Sualları

Sual 1.
Rekombinant DNT texnologiyasının müxtəlif mərhələləri haqqında yazın.
Cavab:
1. İstədiyiniz Genin İdentifikasiyası və İzolyasiyası:
İstənilən gen və ya DNT seqmenti müəyyən edilir və onun təcrid edilməsi üçün məhdudlaşdırıcı endonükleaz fermentindən istifadə edilir. Məhdudiyyətli endonükleaz fermenti Werner Arber və Hamilton O. Smith (1970) tərəfindən kəşf edilmişdir.
Məhdudiyyətli endonukleaz:

  1. Bu fermentlər DNT-ni müəyyən yerlərdə kəsən molekulyar qayçı kimidir.
  2. Bu fermentlər təbii olaraq E.coli, Bacillus, Streptococcus və Thermus aquatics kimi bakteriyalarda olur.
  3. Məhdudiyyətli endonükleaz fermentləri üç növdür:
    1. Tip I Endonukleaza (RI)
    2. Tip II Endonukleaza (R-II)
    3. Tip III Endonukleaz (RIII). II tip.

    Qeyd: Məhdudiyyət endonükleazı (RII) ən çox gen klonlaşdırılması və məhdudlaşdırma xəritəsində istifadə olunur.
    Misal: E.co.RI, Hind II və s.

    Məhdudiyyətli endonukleazın nomenklaturası:

    1. Fermentin adının ilk əlifbası onun təcrid olunduğu cinsi təmsil edir. Bu həmişə böyük hərflə yazılır.
    2. Bundan sonrakı iki əlifba həmin cinsin növlərini təmsil edir. Bunlar kiçik hərflərlə yazılmışdır.
      Qeyd: Hər üç hərf kursivlə yazılmışdır
      Misal: Escherichia coli-dən olan eko.
      Hin – Haemophilus qripindən.
    3. Dördüncü söz fermentin təcrid olunduğu cinsin ştamını ifadə edir.
      Nümunə: Eco R – E.coli-nin R ştamından.
    4. Bir orqanizmdən birdən çox məhdudlaşdırıcı ferment alınarsa, onların sayı Roma rəqəmləri ilə göstərilir.
      Nümunə: Eco RI, (Birinci olaraq E.coli-nin R ştamından) Eco RII və s. (E.coli-nin R. ştamından ikinci) Endonukleaza fermenti Eco RI DNT molekulunda spesifik əsas ardıcıllığını tanıyır və əsas G və A arasında kəsir.

    Qeyd: İki müxtəlif mənbədən alınan DNT seqmentləri DNT liqaza fermentinin iştirakı ilə qarışdırıldıqda, hər iki DNT seqmenti fosfo-di-ester bağları ilə birləşərək ikiqat zəncirli struktur əmələ gətirir.

    Genetika mühəndisliyində istifadə olunan digər fermentlər:

    1. RNT-dən asılı DNT Polimeraz – Bu ferment RNT şablonunda DNT zəncirinin nukleotidlərinin polimerləşməsinə səbəb olur.
    2. DNT-dən asılı DNT Polimeraz – Bu ferment DNT şablonunda tamamlayıcı DNT zəncirinin nukleotidlərinin polimerləşməsinə səbəb olur.
    3. Ligase – Bu ferment şablondakı DNT seqmentlərinin uclarını birləşdirir.
    4. Lizozimlər – Bu fermentlər bakteriyanın hüceyrə divarını həll edir ki, bakterial DNT asanlıqla təcrid olunsun.
    5. Qələvi fosfatazlar – Bu ferment dairəvi DNT-nin 5-ci ucundakı fosfatı kəsir və yad DNT seqmentinin içinə daxil edilə bilməsi üçün onu xətti formada saxlamağa kömək edir. Bu ferment DNT-nin dairəvi təbiətinin qarşısını alır.

    2. Klonlama vektorlarının seçimi:
    İstənilən gen məhdudlaşdırıcı endonükleaz ilə təcrid olunur. DNT seqmentini ehtiva edən bu arzu olunan gen daha sonra uyğun vektora daxil edilir. Bu vektor hədəf sahibi və ya reseptor hüceyrəsinə daxil ola bilməli və onun DNT-sini ana hüceyrədə təkrarlamalıdır.

    Vektorun əsas xüsusiyyətləri:

    1. O, ana hüceyrəyə asanlıqla daxil edilə bilər və asanlıqla təcrid edilə bilər.
    2. O, ana hüceyrədə sərbəst şəkildə təkrarlanmalıdır.
    3. Vektor xüsusi Məhdudiyyət sahələrinə malik olmalıdır ki, məhdudlaşdırma fermenti həmin yerlərdə DNT-ni kəsə bilsin və istənilən DNT fraqmenti asanlıqla daxil edilsin.
    4. Rekombinant hüceyrələrin seçilməsində kömək edə biləcək bir marker geni və ya marker sahəsi olmalıdır.
    5. Onun vasitəsilə çevrilmə asan və mükəmməl olmalıdır.
    6. İstənilən xarici DNT-nin ifadəsi üçün vektor əsasən promotor, operator tənzimləyici saytlar kimi komponentlərə malik olmalıdır.

    Qeyd: E.coli-də həm təbii, həm də süni vektorlardan istifadə edilə bilər.

    E.coli-də istifadə olunan bəzi mühüm vektorlar bunlardır:

    1. Plazmid:
    Lederber, (1952) ilk dəfə bakteriya hüceyrəsində plazmidləri ekstraxromosomal material kimi müşahidə etdi. Aşağıdakı mühüm xüsusiyyətlərə malikdir.

      1. Bunlar ekstraxromosomal (xromosom DNT-dən başqa) komponentlərdir.
      2. Bunlar dairəvi, cüt zəncirli DNT molekullarıdır
      3. Onlar replikasiya mənşəyini (ori) ehtiva edir. Beləliklə, hüceyrə daxilində müstəqil şəkildə çoxalma qabiliyyətinə malikdir.
        1. Bakteriyaların böyüməsi və yaşaması üçün bunlar lazım deyil
          .
        1. Bunlar istənilən genin daxil edilə biləcəyi xüsusi məhdudlaşdırıcı yerləri ehtiva edir.
        2. Marker genləri və ya marker saytları da tapılır.
        3. Plazmiddə üçdən minə qədər gen ola bilər.

        Qeyd: Ən çox istifadə olunan plazmid vektoru pBR322-dir.
        Bu plazmiddə TetR (Tetrasiklinə davamlı) və AmpR (Ampisillinə davamlı) iki marker yeri tapılır. O, 12 müxtəlif məhdudlaşdırıcı fermentlər üçün tanınma sahələrini ehtiva edir. İstənilən DNT (xarici DNT) məhdudlaşdırıcı fermentin köməyi ilə TetR və AmpR geni arasına daxil edilir.

        Plazmiddə yad DNT-ni daxil etmək üçün onun DNT-si məhdudlaşdırıcı fermentin köməyi ilə xətti düzəldilir və bundan sonra plazmidin DNT-sinin iki ucu arasına 5-10 Kb yad DNT daxil edilir və ya daxil edilir.

        Qeyd: Replikasiya şəraitindən asılı olaraq bakteriya hüceyrəsində tapılan əlavə xromosom materialı plazmid və ya epizom adlanır. Müstəqil surətdə çoxalmağa qadir olan ekstraxromosom quruluşuna plazmid deyilir, ancaq onunla birlikdə bakterial xromosomla birləşdikdə çoxalırsa, epizoma deyilir.

        2. Bakteriofaq:
        Bakteriyaları yoluxduran viruslara bakteriofaqlar deyilir.
        Misal: λ (Lambda) və M13 və s.
        Aşağıdakı səbəblərə görə bakteriofaqlar plazmidlərdən daha yaxşı vektordur:

        • Böyük ölçülü (24Kb) DNT fraqmenti bunlarda klonlaşdırıla bilər.
        • Hər bir bakteriofaq testin nisbətən asan olduğu bir lövhə sahəsi yaradır.

        λ fag M-dən daha çox vektor kimi istifadə olunur13 aşağıdakılara görə:

        • Onlar E.coli-nin bakteriofaqlarıdır.
        • DNT xətti və cüt zəncirlidir.
        • Fag DNT-nin vacib olmayan hissəsi çıxarıla bilər. Nəticədə vektor molekulunun ölçüsü azalır və buna görə də böyük ölçülü xarici DNT ona asanlıqla daxil edilə bilər.

        • Plazmid və lambda (λ) faqının hibrididir.
        • O, ilk növbədə Barbara Horn və Con Kollinz (1978) tərəfindən tikilmişdir.
        • Lambda fag DNT-nin ‘Cos’ sahəsinin DNT ardıcıllığının daxil edildiyi belə plazmidlər kosmidlər kimi tanınır. Beləliklə, kosmid həm plazmidin, həm də lambda bakteriofaqının xüsusiyyətlərinə malikdir.
        • Kosmidlər bakteriya hüceyrəsində plazmid kimi çoxalırlar və ‘Cos’ saytının olması səbəbindən bunlar lambda faj hissəcikləri kimi yığılır.
        • Kosmidlər ölçüsü 45 Kbp-ə qədər olan DNT seqmentlərini klonlaşdırmaq üçün istifadə edilə bilər.
          Misal: Cosmid PLFR-5
        • Bu kosmiddə iki Cos sahəsi, 6 məhdudlaşdırıcı endonükleaza sahəsi, replikasiya yerinin mənşəyi və tetrasiklin antibiotik müqavimət genləri mövcuddur.

        Qeyd: Plazmid, bakteriofaqlar və kosmiddən başqa, gen mühəndisliyində bəzi başqa vektorlar da istifadə olunur.

        Transpozonlar həmçinin Jumping genləri kimi tanınır.

        3. İstədiyiniz genin klonlama vektoruna daxil edilməsi:
        İstənilən genin bir klonlama vektoruna daxil edilməsi üçün hər iki gendə ilk olaraq oxşar məhdudlaşdırıcı stiyalar edilir. Bundan sonra hər ikisi birlikdə birləşdirilir (çünki hər ikisi eyni məhdudiyyət saytlarına malikdir). Bu proses ligasiya adlanır.
        Bu prosesdə aşağıdakı fermentlər tələb olunur:

        1. Məhdudiyyətli endonükleazlar
        2. Metilazlar
        3. DNT ligazaları
        4. Qələvi fosfatazlar
        5. Əks transkriptaza
        6. Terminal transferazları

        4. Ev sahibi hüceyrədə rekombinant DNT-nin çoxalması:
        Rekombinant DNT aşağıdakı iki üsulla ana hüceyrəyə daxil edilə bilər:

        Bu prosesdə əsasən E.coli bakteriya hüceyrəsi ev sahibi kimi istifadə olunur. Bu proseslər (Transformasiya və Transduksiya) əvvəllər öyrənilmişdir. Rekombinant DNT E.coli hüceyrələrində çoxalır

        5. Klonlanmış genin identifikasiyası və digər orqanizmlərə köçürülməsi:

        • Biz müəyyən genlərdən, məsələn, antibiotiklərə davamlı gen və ya LacZ geni (β galaktosidaza istehsal edən) kimi müəyyən genlərdən marker genlər kimi istifadə edirik ki, bu genlərdə klonlama yerləri varsa və onların arasına DNT daxil edilərsə, genlər qeyri-funksional olur və insertion adlanır. inaktivasiya.
        • Müəyyən bir genin marker gen kimi ifadəsi və ya ifadə edilməməsi əsasında biz rekombinantları qeyri-rekombinantlardan seçə bilərik.
        • Marker genlərlə yanaşı, spesifik xüsusiyyətlər yaradan bəzi digər genlər də var. Bunlara xüsusi xüsusiyyətlərinə görə digər hüceyrələrdən tamamilə fərqli görünən reportyor genlər deyilir.
          Nümunə: atəşböcəyində olan və Bioluminescence istehsal edən LUC (Lusiferaza) geni.

        Sual 2.
        Müxtəlif ləkələmə üsullarını ətraflı təsvir edin.
        Cavab:
        Blotting texnikası:
        Bu texnikada DNT seqmentləri agaroz geldə elektroforez yolu ilə əldə edilir və sonra nitroselüloz filtrinə köçürülür və stabilləşdirilir. Daha sonra bunlar DNT zondları ilə hibridləşmə yolu ilə müəyyən edilir. Bu proses blotting texnikası adlanır.
        1. Southern Blotting Technique: E.M. Southern (1975) ilk dəfə bu üsuldan istifadə etdi və DNT seqmentlərini nitroselüloz filtrinə köçürdü. Bu texnika Southern blotting texnikası adlandırıldı. DNT-nin bu texniki analizi ilə seqmentlər edilir.

        2. Şimal Blotting Texnikası:
        Alwin və digərləri (1979) nitroselüloz filtri yerinə amin benzil oksimetriya (OBM) membranında elektroforezdən sonra RNT seqmentlərini köçürdülər. Bu texnika Northern blotting texnikası adlanırdı. Bu texnika RNT seqmentlərinin təhlili üçün istifadə olunur.

        3. Western Blotting Texnikası:
        Tobin və başqaları. (1979) ilk dəfə natrium-do-desil sulfat (SDS) köməyi ilə zülalları polipeptidlərə parçaladı. After separating them with the help of electrophoresis, transferred these on nitrocellulose filter or nylon membrane. These were then decoded on an X-ray plate and identified the protein. By this technical analysis of proteins is done. This is called western blotting technique.

        Sual 3.
        Write a detailed account on plasmid as a cloning vector.
        Cavab:
        Plasmid:
        Lederber, (1952) first observed the plasmids as extrachromosomal material in Bacterial cell. It has the following important features.

        • These are extrachromosomal. (Other than chromosomal DNA) components.
        • These are circular, double-stranded DNA molecules.
        • They contain an origin of replication (ori). Hence being able to replicate independently within the cell.
        • These are not necessary for the growth and survival of Bacteria.
        • These contain specific restriction sites where the desired gene can be inserted.
        • Marker genes or marker sites are also found.
        • The plasmid may contain three to one thousand genes.

        Most commonly used plasmid vector is pBR322.
        In this plasmid, two marker sites TetR (Tetracycline resistant) and AmpR (Ampicillin resistant) are found. It contains recognition sites for 12 different restriction enzymes. Desired DNA (foreign DNA) is inserted in between TetR and AmpR gene with the help of restriction enzyme.

        Sual 4.
        What do you understand by molecular probes? Explain its utility.
        Cavab:
        Molecular Probes:
        Segments of DNA or RNA with the help of which cDNA or RNA segments of any organism present in it can be identified are called molecular probes.
        The molecular probes are of two types.

        • These are used to identify specific DNA segments used in the research of genetic engineering.
        • Pollutants in food can be detected with the help of probes.
        • These are used in the field of forensic science, in resolving disputed paternity issues and establishing the family relationship.
        • These can be used to identify an improved variety of crops and hybridized seeds of crops.

        Sual 5.
        Write an essay on the importance of genetic engineering.
        Cavab:
        Scientist working in the field of biotechnology have succeeded in achieving results which have proved advantageous in the field of medical science, agriculture and industries. By using these techniques it has become possible to improve the variety of agricultural crops and domestic animals and also the quality of industrial products. Presently biotechnology is considered as the most important branch of biology.
        Some important achievements are as follows:


        Plasmid vs Lentivirus as a transfection vector - Opinions? (Jan/12/2008 )

        I'm looking into creating a stably transfected variant of a few human tumor cell line that I'll eventually use for xenograft experiments. I'd like to insert a tag for in vivo imaging (IVIS). I'm thinking GFP or luciferase would be suitable, but I'm not sure what is a better vector. I have a pEGFP plasmid left over from a earlier student in the lab that I could use with lipofectamine, but someone suggested a lentiviral GFP would be better. My specific questions are:

        Would I expect a difference in transfection stability, assuming G418 selection?
        After selecting G418-resistant clones, can I remove the G418 before xenograft?
        Would one or the other have a greater trasfection efficiency?

        Any opinion would be appreciated! Cheers-JAH

        lentivirus are good for cells that are hard to trasnfect using lipids. the choice of reporter system depends on which imagine system do you have. Luc is better and more quatitative.

        For your specific questions:
        1) stability is more or less gene specific. ie. is the gene you want to express grwoth promoting or inhibitory. Cells will drop the inhibitory gene over time if you dont use a regulated expression system. Both routes can generate stable cell lines.

        2) Yes, you can remove selection pressure for a few generations.

        3) Its cell type dependent. Lenti have more chance to work but making virus is more exprensive and takes longer to get the virus.

        Would I expect a difference in transfection stability, assuming G418 selection?
        i don't strickly remember the mechanism of virus insertion in genomic dna but i still belive that the DNA is circular or should be opened for linear insertion. In viruses, the opening point is quite strict, and does not interferes either with your selection gene or the gene of interest. So it's better than plasmids in this way, as the opening point wich is not compatible with the selectio marker may occur in the gene of interest.

        After selecting G418-resistant clones, can I remove the G418 before xenograft?
        yes you can remove it but for few generations as mentioned previously.

        Would one or the other have a greater trasfection efficiency?
        it depends on the cell type. for hela 293 and such cells, transfection by plasmids gets a high efficiency. On primary cell lines, transfection has a poor efficiency and lentiviruses have better delivery efficiency in general. so retroviruses are better choice (if you can afford costs)

        My preference would be to go with plasmid transfection than lentiviral infection as virus preps are more time consuming and an additional step. Also to choose between GFP and luciferase, it depends on the experiments you wish to do. if you wish to use them for invivo, then having gfp will help in easy readout. But something quantititaive, then luc might be better.

        In terms of stability, both methods should be kind of similar.

        One can get high transfection efficiency with both systems, ofcourse depending on cell types. but something like 293 or hela, it should be fine.

        Thanks again for all of your comments. I think for my purposes, I don't necessarily need quantitative data, so I think GFP will be sufficient. Basically, I'm orthotopically inoculating human rhabdomyosarcoma cells into the thigh muscle of nude mice and would like to be able to verify tumor engraftment after injection and localize metastases, should they occur I'd also like to perform FFPE histology with the affected tissues, so I think GFP will facilitate this better than a luciferase tag. I've not tried to transfect anything into these cells so I don't know yet if thay are as genehunter-1 put it "hard to trasnfect using lipids". Reading these responses, I'm inclined to try the plasmid vector first As such a few more questions came to mind.

        "Yes, you can remove selection pressure for a few generations." (genehunter-1, regarding G418 selection)
        "yes you can remove it but for few generations as mentioned previously." (fred_33, regarding G-418 selection)

        1) I can't very well put G418 in to mice though. should I just wean the selected cells off of the G418 prior to inoculation, and just hope they don't kick out the plasmid?

        Quoth fred_33:"i still belive that the DNA is circular or should be opened for linear insertion. So it's better than plasmids in this way, as the opening point which is not compatible with the selection marker may occur in the gene of interest."
        1) So, should I compare a linearized plasmid in parallel with a circular/supercoiled one?
        2) Assuming the plasmid is linearized by RE digestion, is there a particular end (blunt/sticky/overhang) that I should strive for?
        3) Where should the digestion site be. obviously not through the GFP or selection gene or their promoter/regulatory regions so as not to alter the ORF?

        Quoth genehunter-1 "is the gene you want to express grwoth promoting or inhibitory. Cells will drop the inhibitory gene over time if you dont use a regulated expression system. "
        - I don't believe the plasmid I have is explicitly responsive to growth regulatory process. I believe the promoter was cloned from a 'housekeeping' gene, though I'm trying to figure out what this regulatory element is. Anyway, the cells I'm going to try are show very aggressive growth, doubling in

        18h, and do not appear to be contact inhibited at all. But I'm not sure if the plasmid harbors something that might change this behavior, but will be sure to compare them vs. non-transfected cells before in-vivo use.


        A plasmid is an extrachromosomal DNA of bacteria, yeasts, archaea and protozoa. They are small double-stranded circular DNA molecules. Whereas, a vector is a small DNA molecule that acts as a vehicle to deliver foreign DNA from donor to host. So, this is the key difference between plasmid and vector.

        Moreover, a further difference between plasmid and vector is that the plasmids are naturally occurring in bacteria and other organisms, but some vectors are natural while some are artificially synthesized.

        Below infographic summarizes the difference between plasmid and vector.


        The Next Plasmid

        Interestingly, the biologists who do not think they need design tools are often craving better tools for supporting their laboratory efforts. Tools for primer design, for planning of cloning experiments, and for sample tracking are very high on their wish list. This may partly explain their lack of interest in the design aspect of their work.

        The vast majority of potential users of design tools have been trained to clone DNA. They are completely focused on the process of deriving new DNA molecules from existing ones.

        When they say that their project is simple, they don't mean that it will be simple to deliver an expression system that works. What they mean is that it is simple to figure out the next plasmid to make.

        For instance, if it is easy to add a solubility tag to the coding sequence of a gene in an existing plasmid, then they assume there is nothing more to think about. The next plasmid to make is easily identified mostly based on the ease of cloning criteria, not on functional criteria.


        Discussion Questions

        1. Why was it important to find an enzyme that would cut the plasmid at only one site? What could happen if the plasmid were cut at more than one site?

        2. Which restriction enzyme did you use? _____________ Ask other groups what they used and compare the final transgenic plasmids. Why might there be some of different lengths?


        3. Why was it important to discard any enzymes that cut the plasmid at the replication site?

        4. Why is it important to cut the plasmid and the human DNA with the same restriction enzyme?

        5. Do restriction enzymes exist naturally in organisms? If so, what is their purpose?

        6. Why would restriction enzymes that created "blunt" ends not be as useful in recombination as those that create sticky ends?


        7. In the activity, you simulated creating a recombinant bacteria organism. For each of the following materials, indicate what they represent?

        Scissors _______________________________________Tape ______________________________________




Şərhlər:

  1. Al-Asfan

    Doğru sözlər nədir ... Super, parlaq düşüncə

  2. Tsidhqiyah

    analoqları varmı?

  3. Euryton

    Məncə, bu, göz qabağındadır. Sualınızın cavabını google.com saytında axtarmağı məsləhət görürəm

  4. Capek

    Təşəkkür edirəm, mənə çox maraqlıdır, daha oxşarı olacaq?



Mesaj yazmaq