Məlumat

SsDNA-nın in vivo çatdırılması

SsDNA-nın in vivo çatdırılması


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən (böyük miqdarda) ssDNA çatdıra biləcəyim bir sistem axtarıram in vivo (siçanlarda deyin). Bunun əhəmiyyəti olub-olmadığını bilmirəm, lakin ssDNT fraqmentlərinin 5' ucunun fosforilləşdiyi güman edilir.

Mənə bir neçə səmərəli çatdırılma sistemi təklif etsəniz, çox şad olaram.

Əvvəlcədən köməyinizə görə çox sağ olun!


In vivo HPV ilə idarə olunan şişlərdə immunostimulyasiya edən siRNA-nın yerli və sistemli çatdırılmasının müqayisəsi

Onkogen ifadəsini maneə törətmək və həmçinin Toll-bənzər reseptor (TLR) tanınması vasitəsilə fitri immun cavabları aktivləşdirmək üçün kiçik müdaxilə edən RNT-lərin (siRNA) müəyyən xərçəng modellərində xərçəng əleyhinə terapiya kimi faydalı olduğu göstərilmişdir. Bu işdə biz immun stimullaşdırıcı Dicer-substrat siRNA-ların (IS-DsiRNAs) yerli və sistemli çatdırılmasının insan papillomavirusu (HPV) ilə idarə olunan şiş modelinə təsirini araşdırdıq. siRNA-nın şişdaxili inyeksiyasından istifadə edərək lokallaşdırılmış siRNA çatdırılması venadaxili (IV) çatdırılma və güclü aktivləşdirilmiş fitri immun cavablarla müqayisədə şişə siRNA çatdırılmasını artıra bilmişdir. Bununla belə, IV inyeksiya şiş böyüməsini azaltmaq üçün daha təsirli çatdırılma yolu olaraq qaldı. Baxmayaraq ki, IS-DsiRNA-lar anadangəlmə immun hüceyrələrini aktivləşdirib və şiş böyüməsinə tam təsir göstərmək üçün interferon-α (IFNα) tələb edir, biz aşkar etdik ki, IFNα-dan asılı olmayaraq fəaliyyət göstərən güclü susdurucu siRNA TC-1 şişinin böyüməsini maneə törətməkdə ümumilikdə daha effektivdir. IS-siRNA-lardan istifadə edən digər nəşr olunmuş işlər IS-siRNA tərəfindən güclü şəkildə aktivləşdirilən təbii öldürücü hüceyrələrin hədəfi olan əsas histouyğunluq kompleksi (MHC)-class 1-in aşağı səviyyələri olan şiş modelləri üzərində aparılmışdır. Tədqiqatımızda istifadə edilən TC-1 hüceyrələri yüksək səviyyəli MHC sinif I ifadə etdiyinə görə, immunostimulyator motivlərin əlavə edilməsi bu xüsusi şiş modelində o qədər də faydalı olmaya bilər. Məlumatlarımız göstərir ki, siRNA profilinin və şiş mühitinə əsaslanan çatdırılma metodunun seçilməsi siRNA əsaslı müalicələrin inkişafı üçün çox vacibdir.

Diqqət edin: Nəşriyyatçı müəlliflər tərəfindən verilən hər hansı dəstəkləyici məlumatın məzmununa və ya funksionallığına görə məsuliyyət daşımır. İstənilən sorğu (çatışmayan məzmundan başqa) məqalə üçün müvafiq müəllifə ünvanlanmalıdır.


Nuklein turşularının liposomal çatdırılması In Vivo

İn vivo tətbiqlər və terapevtiklər üçün katyonik liposom komplekslərinin optimallaşdırılması bir çox fərqli komponentləri əhatə edən mürəkkəbdir. Bu komponentlərə nuklein turşusunun təmizlənməsi, plazmid dizaynı, çatdırılma vasitəsinin formalaşdırılması, tətbiq marşrutu və cədvəli, dozaj, gen ifadəsinin aşkarlanması və s. daxildir. Bu baxış müxtəlif sahələrdə istifadə üçün bu komponentlərin optimallaşdırılmasına yönəldiləcəkdir in vivo tətbiqlər. Çatdırılma üçün təkmilləşdirilmiş lipozom formulalarının istifadəsi in vivo gen terapiyası üçün dəyərlidir və viral çatdırılma ilə bağlı bir sıra problemlərdən qaçınacaqdır. Liposomlardan istifadə edərək nuklein turşularının çatdırılması gen terapiyasına təhlükəsiz və qeyri-immunogen yanaşma kimi perspektivlidir. Bundan əlavə, süni reagentlərdən ibarət gen terapevtikləri bioloji deyil, dərman kimi standartlaşdırıla və tənzimlənə bilər. Çatdırılma sisteminin bütün komponentlərinin optimallaşdırılması insan xəstəliklərini və ya pozğunluqlarını müalicə etmək və ya müalicə etmək üçün liposom komplekslərindən geniş istifadə etməyə imkan verəcəkdir.


MATERİALLAR VƏ METODLAR

Hüceyrə xətləri və reagentlər

İnsan kolorektal xərçəng hüceyrə xətti HCT116 Çin Elmlər Akademiyasının (Şanxay, Çin) Tip Mədəniyyət Kolleksiyasından əldə edilib və tərkibində ölümcül iribuynuzlu zərdab (FBS, 10%) və penisilin-streptomisin (100 IU/ml) olan RPMI1640-da yetişdirilib. İnsan kolorektal xərçəng hüceyrə xətti CL187 ATCC-dən alınmış və tərkibində FBS (10%) və penisilin-streptomisin (100 IU/mL) olan Dulbecco-nun dəyişdirilmiş Eagle mühitində (DMEM) yetişdirilmişdir. Bütün hüceyrələr 5% CO-da 37 ° C-də saxlanıldı2 atmosfer.

İki tampon istifadə edilmişdir: yuyucu bufer (WB, 4,5 q/L qlükoza və 5 mM MgCl2 PBS-də) və bağlayıcı tampon (BB, 1 mq/mL iribuynuzlu zərdab albumini və DB-də 0,1 mq/mL qızılbalıq sperma DNT).

Tədqiqat Çin Tibb Universitetinin (Şenyanq, Çin) Etika Komitəsi tərəfindən təsdiqləndi və bu tədqiqat üçün qan nümunələrini təqdim edən bütün könüllülərdən yazılı məlumatlı razılıq alındı.

DNT sintezi

L33 aptameri (5′-ACCTAACTTCGTCGAGAGTTTTTCGTCTCGGCTAGT GTGATAGTGTTAGG-3′) və ssDNA kitabxanası (5′-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-45N-TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3′) Co.Shang Biotechology (SangonShang China Ltd.) tərəfindən sintez edilmişdir. Bağlama analizləri üçün sintetik aptamer və ya ssDNA kitabxanası 5′ ucunda FITC ilə etiketlənmişdir.

Aptamer L33-ün hüceyrə daxililəşdirilməsi

HCT116 və CL187 hüceyrələri kamera slaydlarında yetişdirildi və bir gecədə becərildi. Hüceyrələr WB ilə yuyuldu və müvafiq olaraq 4°C və ya 37°C-də 2 saat ərzində 250 nM yekun konsentrasiyada FITC etiketli L33 və ya ssDNA kitabxanası ilə inkubasiya edildi. İki dəfə yuyulduqdan sonra hüceyrələr 15 dəqiqə ərzində 4% formaldehidlə bərkidildi və 5 dəqiqə ərzində DAPI ilə əks boyadı. Nəhayət, hüceyrələr flüoresan mikroskopiya (Olympus IX51, Yaponiya) ilə təhlil edildi.

Axın sitometriyasının təhlili üçün hüceyrələr 0,1% EDTA/PBS ilə həzm olundu və FITC etiketli L33 ilə 37°C-də 2 saat ərzində 0,025% tripsin ilə 10 dəqiqə inkubasiya olunmadan inkubasiya edildi. Daha sonra hüceyrələr üç dəfə WB ilə yuyuldu və 300 µL PBS-də dayandırıldı. Nəhayət, fluoressensiya intensivliyi axın sitometriyası (BD, ABŞ) ilə müəyyən edilmişdir.

Aptamer L33-ün biostabillik analizi

üçün bioloji sabitliyi yoxlamaq üçün in vivo aptamer L33 tətbiqləri ilə aptamer plazma sabitliyi təcrübəsini həyata keçirdik. Təzə insan plazması tam qanın sentrifuqalanması ilə hazırlanmışdır. L33 (0,8 nmol) tərkibində 10% FBS və ya insan plazması olan mühitlə qarışdırılmış və 37°C-də 6 saat inkubasiya edilmişdir. Sonra qarışıq müxtəlif vaxtlarda (0, 0,5, 1, 2, 3, 4 və 6 saat) toplandı və 3% agaroz gellərində elektroforetik olaraq ayrıldı və fotoşəkili çəkildi. Axın sitometriyası təhlili üçün, orta və ya insan plazmasında 6 saat inkubasiya edildikdən sonra, FITC etiketli L33 HCT116 hüceyrələrinə 4°C-də 20 dəqiqə ərzində əlavə edildi və təyin edildi. FITC etiketli ssDNA kitabxanası mənfi nəzarət kimi istifadə edilmişdir.

L33-Dox Kompleksi

Aptamer L33-ün müxtəlif konsentrasiyaları 0, 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 0,25, 0,5, 1, və fluorenslik aptamer/Dox molar nisbətlərində otaq temperaturunda 60 dəqiqə ərzində PBS-də 3 µM Dox (Siqma) ilə inkubasiya edilmişdir. Dox spektri daha sonra Hitachi F-4500 flüoresan spektrofotometrindən (λEx = 488 nm, λEm = 520-680 nm) istifadə edilərək araşdırıldı.

L33-Dox Kompleksinin Yaxınlığı və Xüsusiyyəti

L33-Dox kompleksinin hədəf HCT116 hüceyrələrinə xüsusi bağlanmasını qiymətləndirmək üçün rəqabət analizi aparıldı. HCT116 hüceyrələri əvvəlcə L33-Dox kompleksi ilə 4°C-də 20 dəqiqə inkubasiya edildi, sonra iki dəfə yuyuldu və əlavə 20 dəqiqə inkubasiya üçün FITC etiketli L33-də dayandırıldı. Nəhayət, fluoressensiya intensivliyi axın sitometriyası ilə müəyyən edildi. L33-Dox kompleksinin bağlanma yaxınlığı HCT116 hüceyrələrini FITC-nin ardıcıl konsentrasiyaları (0, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 və 256 nM) ilə 4°C-də 20 dəqiqə inkubasiya etməklə müəyyən edilmişdir. -etiketli L33-Dox kompleksi. Tarazlıq dissosiasiya sabitləri (Kdkompleksin ) daha sonra Sigma Plot proqram təminatından istifadə etməklə əldə edilmişdir (Jandel, San Rafael, CA). Bağlama təhlili təcrübələri ən azı üç dəfə təkrarlandı və FITC etiketli ssDNA kitabxanası mənfi nəzarət kimi istifadə edildi.

L33-Dox Kompleksinin Hüceyrə Alma Tədqiqatları

L33-Dox kompleksinin hədəf hüceyrələr tərəfindən spesifik hüceyrə qəbulu flüoresan mikroskopiya və axın sitometriyası ilə tədqiq edilmişdir. HCT116 və ya CL187 hüceyrələrinin bir gecədə 24 quyu boşqabına yapışmasına icazə verildi və sonra 37°C-də 2 saat ərzində mədəniyyət mühitində 2,0 µM sərbəst Dox və ya L33-Dox kompleksi ilə inkubasiya edildi. İki dəfə yuyulduqdan sonra hüceyrələr 15 dəqiqə ərzində 4%-li formaldehidlə bərkidildi və flüoresan mikroskopiya ilə analiz edildi. Axın sitometriyası analizi üçün hüceyrələr 0,1% EDTA/PBS ilə həzm olundu və 2 saat ərzində 37°C-də 2,0 µM pulsuz Dox və ya L33-Dox kompleksi ilə inkubasiya edildi. İki yuyulmadan sonra hüceyrələr axın sitometriyası ilə müəyyən edildi.

L33-Dox Kompleksinin Sitotoksiklik Təhlili

Hər bir hüceyrə xətti üçün sərbəst Dox və L33-Dox kompleksinin sitotoksiklikləri MTS analizlərindən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir (Promega, ABŞ). 96 quyu boşqabında yetişdirilən hüceyrələr mühitdə sərbəst Dox və ya L33-Dox kompleksi ilə müalicə olundu. 4 saat inkubasiyadan sonra hüceyrələr üç dəfə PBS ilə yuyuldu və 48 saat ərzində daha da hüceyrə böyüməsi üçün təzə mühit əlavə edildi. Sonra hər quyuya CellTiter reagenti (20 µL) əlavə edildi və hüceyrələr 37°C-də 1 saat inkubasiya edildi. Absorbans (490 nm) boşqab oxuyucusu vasitəsilə qeydə alınıb.

Statistik təhlillər

Məlumatlar ± SD-lər kimi ifadə edilir və statistik qiymətləndirmələr cütləşməmiş iki quyruqlu Tələbə ilə aparılmışdır. t testlər. P 0,05-dən aşağı olan dəyərlər əhəmiyyətli hesab edilmişdir. Statistik təhlillər GraphPad Prism 5 proqramından istifadə etməklə aparılmışdır.


CRISPR Skrininq Layihələrinizi Sürətləndirin

İki telli qırılmalar CRISPR/Cas9 redaktəsi vasitəsilə yaradılır, sonra homoloji olmayan son birləşmənin (NHEJ) və HDR-nin endogen hüceyrə yolları ilə təmir edilir. HDR yolu homoloji rekombinasiya yolu ilə genetik məlumatın surətini çıxarmaqda müvəffəq olduğunu sübut etsə də, ekzogen genetik materialın daxil edilməsi HDR-nin xas səmərəsizliyinə görə problemdir. İkiqat zəncirli DNT tarixən genlərin daxil edilməsi üçün seçim şablonu olmuşdur, lakin son tədqiqatlar HDR üçün donor şablonu kimi ssODN-lərin üstünlüyünü göstərmişdir. Daha qısa homoloji qollarla uzun ardıcıllıqlar daxil etmək üçün daha yüksək effektivlik təklif edən ssDNA bu proses üçün üstünlük verilən donor şablonuna çevrildi. GENEWIZ indi uzun (10.000 nt-a qədər) ssDNA fraqmentləri təklif edir, dsDNA donorları ilə müqayisədə yüksək effektivliyə və azaldılmış hüceyrə toksikliyinə və ya hədəfdən kənar inteqrasiyaya malik uzun ardıcıllıqların daxil edilməsinə imkan verir.

Şəkil 1.1. Bələdçi RNT hədəf DNT-ni parçalamaq üçün Cas9 istiqamətləndirici fermenti ilə kompleks əmələ gətirir və nəticədə cüt zəncirli qırılma (DSB) yaranır.

Şəkil 1.2. Bir ssDNA donor şablonunun iştirakı ilə DSB-dən sonra homologiyaya yönəldilmiş təmir, dəqiq gen knock-in ilə nəticələnir.


Nəticə və perspektivlər: siçan transgenezinin gələcəyi necə olacaq?

CRISPR/Cas9 gen redaktə texnologiyası transgenez texnologiyalarını əhəmiyyətli dərəcədə dəyişdi. Son 3-5 ildə yüksək templə nəzərəçarpacaq nailiyyətlər əldə edilmişdir. Easi-CRISPR və i-GONAD üsulları, əgər üsullar bir çox tədqiqat qrupları və transgenez əsas qurğuları tərəfindən geniş şəkildə mənimsənilirsə, siçanlarda dəyişdirilmiş allellərin yaradılmasının ənənəvi marşrutunu tamamilə yenidən formalaşdırmaq potensialına malikdir. Tezliklə siçanlarda nokaut və ya nockin allellərini səmərəli şəkildə yaratmaq üçün bütün ənənəvi addımların atılacağını və CRISPR/Cas9 reagentlərinin in situ yumurta kanalına çatdırılacağını proqnozlaşdırmaq olar. Stereomikroskop və elektroporasiya cihazı sadə və ya mürəkkəb allellər üçün redaktə yaratmaq üçün kifayət edəcəyi üçün bu, daha az yüksək ixtisaslı kadr və ya xüsusi avadanlıq tələb edəcəkdir. Əhəmiyyətli olan odur ki, bu, heyvan işi üçün 3Rs qaydasına uyğun olaraq heyvanlardan istifadəni azaltmağa imkan verəcək. Mən təxmin edərdim ki, genlərin redaktəsi və yardımçı çoxalma sahəsində son texnoloji inkişafın onilliklər ərzində transgenezi yenidən müəyyən edəcək. Bu dəyişikliklərin tempinin necə olacağını gələcək göstərəcək.


Müzakirə

The Aqrobakteriya patogenez mexanizmi uzun ssDNT molekullarının eukaryotik hüceyrələrə səmərəli transferinə imkan verir [2]. VirE2 zülalı bu prosesdə ssDNT-ni nukleaz deqradasiyasından qorumaqla və nüvə idxalına vasitəçilik etməklə iştirak edir [2]. Burada, yeni eksperimental tapıntılara əsaslanaraq, VirE2-nin T-DNT-ni ev sahibinə aktiv şəkildə çəkmək və onu nüvəyə daxil olduğu ilk andan nukleaz deqradasiyasından qorumaq üçün erkən mərhələdə ev sahibinin sitoplazmasına daşınan effektor olduğunu təklif edirik. hüceyrə. İlk addımda tək bir VirE2 zülalı bitki hüceyrəsinə daxil olarkən T-DNT-yə bağlanır. Fermuar kimi hərəkətdə baş verən bu bağlanma əsasən T-DNT-nin termal dalğalanmaları ilə məhdudlaşır. İkinci mərhələdə VirE2-nin sürətli kooperativ bağlanması spiral quruluşun formalaşmasını asanlaşdırır və T-DNT-ni bitki sitozoluna aktiv şəkildə çəkir (Şəkil 5). Bu modelin dolayı fərziyyələri var. Birincisi, VirE2 və T-DNT bakteriyada qarşılıqlı təsir göstərməməlidir, baxmayaraq ki, onların hər ikisi orada sintez olunur. Həqiqətən, in Aqrobakteriyanin sitoplazması, VirD2-T-DNT və VirE2 qarşılıqlı təsir göstərmir və VirE2 yalnız bitki sitozolunda olduqdan sonra T-DNT-yə bağlanır [23]. İkincisi, VirE2 zülalı T-DNT-nin daxil olduğu yerdə, yəni bitki hüceyrələrinin periferiyasında olmalıdır. Bunu immunofluoressensiya təcrübələri sübut etdi (Şəkil 4 B), VirE2-nin bitki sitozoluna daxil olarkən T-DNT-nin çəkilməsinə kömək etmək üçün düzgün lokallaşdırıldığını göstərir. Nəhayət, VirE2 ilə əlaqəli ssDNA və sərt mikrotubul şəbəkəsi arasındakı qarşılıqlı əlaqə, translokasiya prosesinin erkən mərhələsində VirE2 vasitəçiliyi ilə güc ötürülməsini asanlaşdıracaq bir bağlama nöqtəsi təmin edə bilər [14].

Köçürülmüş ssDNA-VirD2 Tip IV sekresiya sistemi (T4SS, açıq mavi) vasitəsilə bakteriyadan xaricə çıxarılır və ana hüceyrə sitoplazmasına çatır. Orada VirE2-nin spiral bir quruluşa kooperativ təşkili daxil olan T-DNT-ni bitki hüceyrəsi sitozoluna aktiv şəkildə çəkir. Bundan əlavə, polimerləşmənin böyük sürəti (𢏁 μm/s) T-DNT-nin ev sahibi sitozola daxil olduğu anda sürətli qorunmasına vasitəçilik edir. IM: daxili membran, OM: xarici membran, PM: plazma membranı.

VirE2-ni T-DNT-ni bitki sitoplazmasına çəkən mühüm amil kimi müəyyən edən modelimizə görə, nukleoprotein kompleksinin əmələ gəlməsi zamanı sərbəst buraxılan sərbəst enerji VireE2 zülallarına T-nin yerini dəyişdirmək üçün tələb oluna bilən böyük qüvvələrə qarşı işləməyə imkan verir. DNT ev sahibinə (aşağıya bax). Mexanik enerjinin istehsalı, xarici enerji mənbəyinə, məsələn, nukleotid hidrolizinə ehtiyac olmadan VirE2-nin ssDNA-ya bağlanması zamanı yalnız sərbəst enerji qazanması hesabına baş verir. Bildiyimizə görə, ssDNT-nin alıcı hüceyrəyə köçürülməsində iştirak edən qüvvələrə nəzər salmaq ilk dəfədir. Onların böyüklüyü dsDNA-nın yerini dəyişdirən molekulyar mühərriklər tərəfindən istehsal olunan qüvvələrlə müqayisə edilir (bax, məsələn, [24]). Digər rəqabət mexanizmləri DNT-ni ana sitozoldan geri çəkməyə meylli ola bilər. Məsələn, konjugasiya zamanı pili ana hüceyrəyə bağlandıqdan sonra geri çəkilə bilər [25]. Üstəlik, DNT-nin ev sahibinə köçürülməsi zamanı, Tip IV pilus Neisseria gonorrhoeae bir neçə on pN-ə qədər geri çəkilmə qüvvələri yaradaraq bir sıra uzadılma və geri çəkilmə dövrlərindən keçə bilər [25]. Beləliklə, bir zülalın ötürülən ssDNT-yə bağlanması, T4SS-də ssDNT-nin bu cür qüvvələr tərəfindən geri çəkilməsinə mane olan bir kompleks meydana gətirməsi böyük bir üstünlük olardı.

Tato və başqaları. TrwB zülalının birləşməsini təklif etdilər Escherichia coli R388 konyuqativ sistemi molekulyar motoru daşıyan ATP ilə idarə olunan ssDNA kimi çıxış edir [26]. VirD4-ün bu analoqu bakteriyanın daxili membranında yerləşir və ssDNA-nı Tip IV ifrazat kanalı vasitəsilə nəql etdiyi düşünülür. ssDNA-nın qısa davamlılıq uzunluğunu (𢏀.7 nm) və birləşdirici zülal ilə ana membran arasındakı böyük məsafəni (ən azı 30 nm [27]) nəzərə alsaq, sadəcə çevik ssDNA-nı T4SS vasitəsilə itələmək səmərəsiz olardı. Köçürmə hostda mövcud olan VirE2 tərəfindən də aktiv şəkildə çəkilsəydi, asanlaşdırılardı.

Tək molekullu təcrübələr, əldə edilən 𠇏inal” VirE2-ssDNA spiral filamentinin çox sabit və sərt bir quruluş olduğunu göstərdi. Kompleksin VirE2 zülalı olmayan tamponla yuyulması kompleksin sabitliyini pozmur. Ancaq in vivo olaraq, filamentin örtülməsi T-DNT-nin alıcı hüceyrənin nüvə genomuna inteqrasiyası üçün lazımdır. Beləliklə, sual sərt VirE2-ssDNA kompleksinin VirE2-dən necə azad edildiyidir. Həqiqətən də VirE2 ilə ssDNA və VirE2 molekulları arasında çox sıx qarşılıqlı əlaqə VirE2 zülalını çıxarmaq üçün xüsusi bir deqradasiya mexanizminə ehtiyac duyur. Bu yaxınlarda göstərildi ki, VirE2 xüsusi olaraq proteoliz üçün VirF tərkibli Skp1-Cdc53-cullin-F-box kompleksi tərəfindən parçalanma üçün hədəflənir [28]. Proteazomal deqradasiyanın kritik rolu Aqrobakteriya-Vasitəçili genetik transformasiya bir proteazomal inhibitor tərəfindən T-DNT ifadəsinin inhibə edilməsindən də aydın olmuşdur. Xülasə, bizim tapıntılarımız və bu məlumatlar gözəl bir şəkildə əlaqələndirilir və belə bir xüsusi deqradasiya mexanizminin nə üçün lazım olduğunu izah edir.

Unikal mexanizm Aqrobakteriya Hər hansı bir ssDNT molekulunun yerini dəyişdirmək üçün istismarlar bitkilərin və göbələklərin genetik mühəndisliyinə yol açdı, həm də genlərin məməli hüceyrələrinə köçürülməsi üçün yeni imkanlar təklif edir [2]. Bununla belə, Aqrobakteriya burada təklif edilən çəkmə mexanizmi daha ümumi ola bilər. O, VirE2-yə güvənmir, lakin aşağıdakılara ehtiyac duyur: (i) qarşılıqlı təsir zamanı ssDNA-nı sıxlaşdıran ssDNA bağlayıcı zülal və (ii) bu tək zəncirli bağlama (SSB) fəaliyyətinin yalnız bir bölmədə baş verməsi. Bakterial konjuqasiya və DNT-nin qəbulu proseslərində SSB zülalları da mövcuddur və mühüm funksiyaya malik ola bilər. Məsələn, SBB homoloqları (YwpH) üstünlük olaraq hüceyrə qütblərində toplanır. B. subtilis [29]. Beləliklə, bu zülallar, VirE2 kimi, xarici enerji mənbəyi olmadan bir güc yarada və ssDNT-ni alıcı bölməsinə çəkə bilər.


5 NƏTİCƏLƏR

Viral çatdırılma və peyvənd vektorları ilə bağlı daxili məhdudiyyətlər və xərclər, yeni in vivo gen və xərçəng terapevtiklərinə böyük ödənilməmiş ehtiyac, strukturlaşdırılmış DNT birləşmələri kimi qeyri-viral vektorları əvvəlcədən mövcud çatdırılma vasitələri ilə bağlı unikal xüsusiyyətlərini araşdırmaq üçün cəlbedici edir. Xüsusilə, biz burada 10-100 nm miqyasda onların ölçüsünü idarə etmək imkanı təklif edən DNT birləşmələrinin dəqiq, 3D virusa bənzəyən həndəsəsini vurğulayırıq, o, 10-100 nm miqyasda, həmçinin hədəflənən liqandların nüsxə sayını və məkan təşkilini təklif edir. biomolekulyar tanınma vasitəsilə hüceyrə hədəflənməsi, qəbulu və alverində idarə olunan avidlik və spesifiklik üçün peptidlər, şəkərlər, aptamerlər, lipidlər və hər hansı digər molekulyar agent daxil ola bilər. Bundan əlavə, onların siRNA-lar, ASO-lar, mRNA-lar və HDR şablonu ilə CRISPR RNP-ləri daxil edə bilən gen terapevtik yüklənməsində onların çox yönlü olması, mümkün klinik tərcüməyə doğru preklinik tədqiqatlarda daha çox araşdırma aparmaq üçün bu məclisləri böyük maraq doğurur. Klinikadan əvvəlki və hətta klinik tətbiqlər üçün tələb olunan miqyaslarda dizayn, istehsal və istehsalın bir çox aspektləri indi həll olunsa da, in vivo biopaylanma, sabitlik, toxuma/orqan/şiş və hüceyrə hədəflənməsi, immun hüceyrələrin stimullaşdırılması, toksiklik və təmizlənmə ilə bağlı çoxsaylı suallar qalmaqdadır. . Buna baxmayaraq, strukturlaşdırılmış DNT (və RNT) birləşmələri sahəsi artıq mövcud dizayn və istehsal problemlərini geridə qoyduğuna görə, biz immunonkologiya və digər tətbiqlər üçün bu yeni çatdırılma və peyvənd agentlərinin klinik tərcüməsi ilə qarşıdan gələn yüksək məhsuldar preklinik tədqiqatların onilliyini gözləyirik. insan sağlamlığı üçün mühüm əhəmiyyət kəsb edir.


Kinesin-3 vasitəçiliyi ilə presinaptik neureksinin çatdırılması artan dendritik tikanları və postsinaptik komponentləri stabilləşdirir. in vivo

Sinir sxemlərinin funksional xassələri onların tərəfdaş neyronları arasında sinaptik əlaqələrin nümunələri ilə müəyyən edilir, lakin dövrə əlaqəsini sabitləşdirən mexanizmlər zəif başa düşülür. Biz sistemli şəkildə bu sualı yeni səciyyələnən dendritik tikələrə sinapslarda araşdırdıq C. elegans GABAergik motor neyronları. Biz göstəririk ki, presinaptik yapışma zülalı, neurexin/NRX-1, postsinaptik strukturun sabitləşməsi üçün tələb olunur. Biz tapırıq ki, erkən postsinaptik inkişaf hadisələri sinaptik fəaliyyət üçün ciddi tələb olmadan davam edir və neyreksinin silinməsi ilə pozulmur.nrx-1. Bununla belə, presinaptik NRX-1 olmadıqda, dendritik onurğalar və reseptor qrupları yetkinlik yaşına çatmazdan əvvəl sabitləşir və dağılır. Biz kinesin-3/UNC-104-ün NRX-1-i presinaptik terminallara çatdırdığını nümayiş etdiririk və yetkin heyvanlarda postsinaptik baxım üçün davamlı çatdırılmanın tələb olunduğunu göstəririk. Sinaps əmələ gəlməsi hadisələrinin dinamikasını və zaman sırasını müəyyən etməklə in vivo, biz neurexin əsaslı yapışma vasitəsilə yetkin dövrə bağlantısını sabitləşdirmək üçün bir mexanizm təsvir edirik.


Xülasə

Kritik bioloji rollardan əlavə, DNT həm də yüksək proqramlaşdırıla bilən və ünvanlılığın unikal xüsusiyyətlərinə malik əla mühəndislik materialı hesab olunur. DNT nanotexnologiyasındakı son nailiyyətlər müxtəlif incə DNT nanostrukturlarının rasional dizaynını və dəqiq istehsalına imkan verir və texnoloji istifadələr üçün bir çox yeni imkanlar yaradır. Bu arada, DNT nanostrukturlarının molekulyar tanınma qabiliyyəti ilə inteqrasiyası onların tətbiq dairəsini daha da genişləndirə bilər. Xüsusilə bu məqsəd üçün uyğun olan aptamerlər bir zəncirlə seçilən qısa bir zəncirli nuklein turşularıdır in vitro eksponensial zənginləşdirmə yolu ilə liqandların sistematik təkamülü adlanan strategiya. Antikorların analoqu olaraq aptamerlər kiçik molekullar, zülallar, viruslar, bakteriyalar və hətta bütün hüceyrələr kimi müxtəlif hədəflərə bağlana bilər. Antikor kimi müqayisə edilə bilən spesifiklik və yaxınlıqdan başqa, aptamerlərin kiçik molekulyar çəkisi, yüksək dizayn qabiliyyəti, asan sintezi və rahat modifikasiyası da daxil olmaqla bir sıra üstünlükləri var. Həqiqətən də aptamerlərin DNT nanostrukturları ilə nikahı qabaqcıl bioloji və biotibbi tətbiqlər üçün çoxlu güclü alətlər yaratmışdır. Bu icmalda biz biosensinq, bioimaging, məqsədyönlü dərman çatdırılması, biotənzimləmə və biomimikriya sahələrində aptamerlə inteqrasiya olunmuş DNT nanotexnologiyasının son tərəqqisini, tətbiqini və perspektivini ümumiləşdiririk.


Videoya baxın: ستندهش رحلة إلى داخل جسم الإنسان بتفاصيله تحت الميكروسكوب (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Eward

    I have thought and have removed this phrase

  2. Nigal

    İçində bir şey var. İndi hamısı çıxır, bu sualda kömək üçün çox təşəkkür edirəm.

  3. Roberto

    Did I miss something?

  4. Corran

    Sən düzgün deyilsən. Əminəm. Mən mövqeyi müdafiə edə bilərəm. PM-də mənə yazın, danışacağıq.

  5. Meztigore

    It is the phrase of value

  6. Duran

    Təbrik edirəm, parlaq fikir

  7. Shataur

    what should of this?



Mesaj yazmaq