Məlumat

Mikroplate oxuyucusu ilə transgen gen ifadəsinin ölçülməsi

Mikroplate oxuyucusu ilə transgen gen ifadəsinin ölçülməsi


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən yeraltı sularda arsenlə çirklənmənin bioremediasiyası üçün arsenitin arsenata avtotrofik oksidləşməsi üçün E. coli ştammının genetik mühəndisliyi üzərində işləyirəm. Tədqiqatlarım üçün bakteriyaların zamanla nə qədər arsenit oksidləşdiyini kəmiyyətcə ölçməyin yollarını tapdım. Oksidləşən arsenitin kəmiyyətcə ölçülməsi yollarını araşdırdıqdan sonra mən Conson və Pilson metodundan istifadə etmək qərarına gəldim (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003267072800059?via%3Dihub).

Arsenit oksidləşməsindən əmələ gələn arsenat suda fosfatla molibden-mavi kompleks əmələ gətirir. Arsenatın konsentrasiyası artdıqca suyun udma dəyəri mütənasib olaraq artmalıdır.

Mənim planım belə idi: Birincisi, transgen bakteriyalarımı gücləndirici lövhədə böyütdükdən sonra 96 ​​quyuluq boşqabın quyularında müxtəlif konsentrasiyalarda hüceyrə və arseniti pipetka ilə çıxarardım. Hazırda mən Fisher Scientific Multiskan FC mikroplitə fotometrindən istifadə etməyi planlaşdırıram. Hüceyrələri 37 C-də silkələməklə inkubasiya etməyi planlaşdırdım. Qarşılaşdığım əsas problem təcrübəmin idarə olunmamasıdır. Zamanla hüceyrələrin böyüməsi yalnız molibden-mavi kompleksi deyil, absorbsiya dəyərini dəyişəcəkdir. Sadəcə arsenit oksidləşməsinin dəyişənini təcrid etməliyəm.

Mən bir neçə mümkün həll yolu düşündüm, amma hiss edirəm ki, bəlkə də mühüm bir şeyi əldən vermişəm. Mikroplate oxuyucuları haqqında öyrənərkən bilirəm ki, tədqiqatçılar onlardan gen ifadəsini ölçmək üçün istifadə edə bilərlər. Bu tədqiqatçılar hüceyrə artımının dəyişən təsirini absorbans dəyərlərinə necə aradan qaldırırlar?

Birincisi, hüceyrələrin udma dəyərlərinə təsir etməyəcəyi quyunun bir tərəfinə filtrasiya etmək üçün bir yol tapmağı düşündüm. Mənim üçün dializ torbasını quyuya batırılan yerə kəsmək mümkün ola bilərmi? Bu halda hüceyrələr arseniti oksidləşdirərək (mənim fərziyyəm doğrudursa) quyuda asılmış ola bilərdi.

Hər halda, mən həqiqətən udma dəyərlərinə təsir edən hüceyrə artımı olmadan mikroplata oxuyucusu istifadə edərək zamanla arsenit konsentrasiyalarının kəmiyyətcə ölçülməsi üçün sadə bir üsul tapmaq istəyirəm.


Spektofotometriya

Fotometr işığın müxtəlif dalğa uzunluqlarından istifadə etməyə imkan verirmi? Ola bilsin ki, a spektrfotometr sizə nəzarəti və istədiyiniz dəyəri verə bilər, yəni mavi işıq nümunəniz tərəfindən udula bilər, lakin qırmızı deyil? Molibden-mavi kompleksin absorbsiya spektri çox spesifikdir və siz spektral fotometriyadan istifadə edərək bundan öz xeyrinizə istifadə edə bilərsiniz.

Fotometriya + hüceyrə böyüməsi səbəbindən absorbsiya üçün korreksiya

Başqa bir yanaşma, zamanla bakteriyalarınızın zaman funksiyası olaraq absorbsiyaya necə təsir etdiyini ölçmək və sonra bunu eksperimental dəyərlərinizdən çıxarmaqdır. Məsələn, quyu boşqabında aşağıdakıları bitişik olaraq qoyun: (i) hüceyrəsiz quyudan və məhlulda yalnız arsenitdən, (ii) arsenitsiz hüceyrələrdən və (iii) arsenitli hüceyrələrdən istifadə edin. Bu, arsenitin, hüceyrələrin və hər ikisinin udma qabiliyyətinə nə qədər təsir etdiyini olduqca dəqiq ölçməyə imkan verməlidir.

Əlbəttə ki, dediyiniz kimi, hüceyrələr və arsenit arasında hüceyrə böyüməsini yavaşlatan və ya sürətləndirən bir qarşılıqlı əlaqə ola bilər, bu, həll etmək üçün bir turşu olardı. Arsenitin böyüməyə hansı təsir göstərdiyini öyrənmək və son məlumatlarınızı bu şəkildə düzəltmək üçün bəlkə də quyu lövhələrində cəhd edə bilərsiniz (bu, ən yaxşısı olardı!).

məhluldan vaxtaşırı nümunə götürmək; ölçmədən bakteriyaların çıxarılması

Başqa bir fikir, hüceyrələrinizi arsenitdə yetişdirmək və vaxt nöqtələrini əldə etmək üçün nümunələr götürmək olardı. Hər bir nümunə üçün siz kiçik şpris filtrlərindən istifadə edərək süzürsünüz (bunlar ucuzdur və adətən məhlulları sterilizasiya etmək üçün istifadə olunur, yəni bakteriyaları aradan qaldırmaq, lakin məsamə ölçüsünü ~.1 mikron nəzərə alaraq məhlulu saxlamaq) və sonra molibden üçün fotometriya aparırsınız. mavi kompleks. Bu mikrobiologiyada tipik bir təcrübədir.

PCR? Fikir.

Nəhayət, bunun transgenik gen ifadəsinin dolayı oxunması olduğunu xatırlamaq yaxşıdır. Eynilə, hər hansı transgenin ifadəsini kəmiyyətcə müəyyən etmək üçün kəmiyyət PCR-dən istifadə edə bilərsiniz - burada siz hüceyrə sayına nəzarət kimi ev işləri genlərindən və oxunuş kimi transgeninizin mRNA ifadəsindən istifadə edirsiniz. Siz mRNT ifadəsini oxuyacaqsınız, amma mən şəxsən bunun məhluldakı arsenat konsentrasiyalarını ölçməkdən daha “dolayı” olacağını düşünmürəm, xüsusən də təmiz ölçmə almaqda qarışıqlıq yaradan amillər və yöndəmsizlik olduqda. PCR yanaşması olduqca dəqiq və ehtimal ki, daha etibarlı olardı.

Bunlar sadəcə bəzi ilkin fikirlərdir - bəlkə siz şərh əlavə edə bilərsiniz və ya bunun bəzi konkret ideyalar yarada biləcəyini düşünürsünüzsə, bu barədə söhbət edə bilərik!


FLUOstar Omega mikroplata oxuyucusu istifadə edərək real vaxt rejimində Abeta fibrilizasiyası/aqreqasiyasından sonra

Amiloid-ß (Aß) peptidinin yığılması Alzheimer xəstəliyi üçün əsas əlamətdir. Hüceyrədənkənar qocalıq lövhələrinin əmələ gəlməsi kliniki demans xəstələrdə sinaptik və neyronların zədələnməsinə səbəb olacaqdır. Aß peptidinin yığılma prosesi toxumla idarə olunur. Bu toxumlar Aß-nın kiçik sabit aqreqatlarından ibarətdir. Hesab edilir ki, bu aqreqatlar Alzheimer xəstəliyinin ilkin mərhələlərində, hətta bir xəstədə hər hansı bir simptom yaşamazdan əvvəl mövcuddur. Əgər bu doğrudursa, bu erkən aqreqatların (aqreqasiya toxumlarının) təyini əla diaqnostika vasitəsi olacaqdır.


Burada beyin toxuması homogenatlarından aqreqasiya toxumlarının miqdarını təyin etməyə imkan verən hüceyrəsiz analizi təqdim edirik (FRANK-Assay = Rekombinant Aß nukleasiya kinetikasının fibrilizasiyası). Təhlil BMG LABTECH-dən FLUOstar ® Omega mikroplata oxuyucusu ilə 2-3 gün ərzində aparılır.


Giriş

Bitki bitkilərinin genetik modifikasiyası çox vaxt adi seleksiya ilə məhsula daxil edilə bilməyən yeni xüsusiyyətləri ifadə edən mühəndis xətləri yaratmaq məqsədi daşıyır. Bu cür biomühəndislik səyləri, transgen konstruksiyasının bir hissəsi olan uyğun tənzimləyici elementlərlə birlikdə arzu olunan əlaməti verən hədəf gen(lər)in arzu olunan xüsusiyyəti sabit və etibarlı şəkildə ifadə etməsi gözləntisi üzərində qurulur. Bu gözlənti, məsələn, transgen müxtəlif genetik fonlara (yəni sortlara) daxil edildikdə və ya genetik cəhətdən dəyişdirilmiş (GM) bitkilər müxtəlif ətraf mühit şəraitinə məruz qaldıqda qiymətləndirilməlidir.

Dünyada ən çox satılan iki GM xüsusiyyətindən biri həşərat müqavimətidir ki, bu da həşəratların insektisid toksinləri ilə verilir. Bacillus thuringiensis (Bt). Bu xüsusiyyət qarğıdalı və pambıq da daxil olmaqla bir sıra bitki bitkilərində işlənmişdir. Tərkibində həşərat müqavimət xüsusiyyəti olan qarğıdalı hazırda dünyada 47 milyon hektardan çox sahədə becərilir [1] ki, bu da qarğıdalı əkilən qlobal ərazinin təxminən 27%-ni təşkil edir [2]. MON810 hadisəsindən əldə edilən Bt qarğıdalı sortları xüsusi olaraq gül kələm mozaika virusu 35S promotorundan, hsp70 intronundan və cry1Ab meydana gələn MON810 Bt qarğıdalı bitkilərinə lepidopteran zərərverici növlərinə, xüsusən də Avropa qarğıdalı budaqlarına qarşı müqavimət göstərən gen, Ostrinia nubilalis.

Ümumiyyətlə güman edilir ki, kommersiya GM bitkilərində transgenlər konstruktiv olaraq yüksək səviyyələrdə və bütün bitki toxumalarında və fenoloji fazalarda ifadə olunur [3]. Hədəf həşəratlarda Bt toksin müqavimətinin təkamülü ilə bağlı narahatlıqlar fonunda transgen ifadəsi və Bt protein tərkibinə ciddi nəzarət vacibdir [4]. Son illərdə bir sıra tədqiqatlar Bt zülalının konsentrasiyasının Bt bitkiləri daxilində (yəni toxumalar üzrə) və vegetasiya dövründə dəyişə biləcəyini bildirmişdir [5-7], digər müəlliflər isə azot gübrələməsi [8] kimi abiotik amillərin, torpaq keyfiyyət və pestisidlərin istifadəsi [9] Bt protein tərkibinə təsir edə bilər. Bununla belə, bildiyimiz qədər, transgen Bt qarğıdalıda Bt transgen ifadəsi ilə Bt protein tərkibi arasındakı əlaqəni birgə araşdıran heç bir araşdırma bu günə qədər dərc edilməmişdir. Bt pambıqda bu əlaqə məhdud sayda tədqiqatda araşdırılmışdır [10-12]. Olsen və başqaları. [12] və Adamczyk et al. [10] həşərat müqaviməti transgeninin mRNA transkript səviyyələri arasında korrelyasiya tapdı cry1Ac və Bt protein tərkibi, Li et al. [11] duz stressi altında belə bir əlaqə müşahidə etməmişdir. Buna görə də, GM bitkilərində Bt transgen ifadəsi ilə Bt zülal tərkibi arasındakı əlaqənin nə olduğu açıq qalır.

Bt qarğıdalıda belə bir əlaqənin olub-olmadığını və ətraf mühit şəraitinin ona necə təsir etdiyini müəyyən etmək vacib sualdır. Bt qarğıdalının becərilməsinə icazə verilən əksər ölkələrdə bu, həşəratlara qarşı müqavimətin idarə edilməsi (IRM) proqramının quraşdırılması şərti ilə həyata keçirilirdi. IRM-nin sütunlarından biri bitkilərin yalnız həssas hədəf həşəratlar üçün deyil, həm də bir müqavimət alleli (RS genotipləri) daşıyan heterozigotlar üçün öldürücü olan yüksək və sabit səviyyələrdə Bt protein ehtiva etməsidir [13]. IRM-nin məqsədi Bt məhsullarının davamlılığı üçün əsas təhlükə kimi müəyyən edilmiş hədəf zərərvericilərdə Bt toksinlərinə qarşı müqavimətin təkamülünü gecikdirməkdir [4].

Bu tədqiqatın məqsədləri iki Bt qarğıdalı sortunda Bt transgen ifadəsi ilə Bt zülal tərkibi arasındakı əlaqəni araşdırmaq və abiotik ekoloji stress şəraitinin transgen ifadəsi ilə protein tərkibi arasındakı əlaqəyə təsir edib-etmədiyini eksperimental olaraq yoxlamaq idi.


1. GİRİŞ

İpək qurdlarının orta ipək vəzi (MSG) və posterior ipək vəzi (PSG), Bombyx mori, böyük miqdarda ipək sapı zülalları istehsal edir. 1 Bu MSGs 1-4 və PSGs 5-8-də istehsal olunan zülalların rekombinant versiyaları zülal mühəndisliyində istifadə olunur. PSG yüksək bioloji parçalana bilən, biouyğun olan və aşağı immunostimulyator fəaliyyət göstərən biopolimer zülalı fibroini ifadə edir, bu da onu revaskulyarizasiya, 9 sümük toxumasının bərpası, 10 və dəri yaralarının sağalması üçün cərrahi tikişlər 5 və greftlər istehsal etmək üçün əlverişli edir. 11, 12

Hüceyrə artım faktorlarını ifadə etmək üçün hazırlanmış posterior ipək vəziləri in vivo və in vitro hüceyrələrin çoxalmasına nəzarət edə bilən yüksək konsentrasiyalı fibroin olan tozlar kimi biotibbi materiallara emal edilə bilər. Bununla belə, bu sistemin potensial çatışmazlığı ondan ibarətdir ki, insan fibroblast böyümə faktoru-7 (FGF-7) daxil olmaqla, hüceyrə böyüməsi faktorları ağır ekoloji şəraitdə adətən qeyri-sabitdir və onların qısa yarım ömrünə səbəb olur. 13, 14

The B.mori ailənin üzvü olan cypovirus 1 (CPV). Reoviridae, zülalları əhatə etmək və qorumaq potensial qabiliyyəti ilə diqqəti cəlb edən zülal polihedrinin mikrokristallarını ehtiva edən polihedra kimi tanınan zülallı tıxanma cisimləri istehsal edir. 15-18 Bu virus ipəkqurdunun həzm sistemindəki hüceyrələri yoluxduraraq çoxlu sayda polihedra əmələ gətirir. Nəsil virusları uzun müddət ərzində və xarici mühitdə yoluxuculuqdan qoruyan polihedralarda tıxanmışdır. 15 Əvvəllər polihedranın flüoresan zülalları, 16-19 sitokinlər, 20-23 və fermentlərdən ibarət birləşmə zülalları kimi müxtəlif xarici zülalları əhatə edə biləcəyini, N-terminal polihedron-kapsulyasiya siqnalı alfa-spiral minal ardıcıllığı V1 və C-P3 ilə 24-dən ibarət birləşmə zülallarını əhatə edə biləcəyini daha əvvəl göstərmişdik. - mədəni həşərat hüceyrələrində polihedron kristallaşması zamanı ifadə olunan etiket. Bundan əlavə, polihedralarda sitokin fəaliyyətləri uzun müddətdə sabitdir. 16 Polihedra-kapsullaşdırılmış zülalların diqqətəlayiq sabitliyi bu sistemlərin toxuma mühəndisliyi üçün sitokinlərin və digər zülalların davamlı salınan daşıyıcıları kimi möhkəm ola biləcəyini göstərir. 16, 20-24

Biz həmçinin bu yaxınlarda bildirdik ki, in vitro neyrodifferensasiya hüceyrə mədəniyyəti modelinə çoxüzlülərin daxil edilməsi, kiçik miqdarda hüceyrədən əldə edilən matriks metalloproteinazaların vasitəçiliyi ilə tədricən polihedra proteolizindən sonra polihedradan aktiv neyrotrofinin sərbəst buraxılmasına səbəb oldu. 23 Bu tapıntılar ipəkqurdu ipək vəzilərinin içərisində FGF-7 kimi sitokinləri əhatə edən çoxüzlülərin potensial biotibbi tətbiqlərini vurğulayır. Bu ipək vəziləri hüceyrə proliferasiyasına nəzarət etmək üçün sitokin-polihedraları özündə birləşdirən ipək materialları əldə etmək üçün emal oluna bilər.

Əvvəlki araşdırmalarımız göstərdi ki, biomühəndisləşdirilmiş ipək vəziləri əhatə edən zülal ifadə sistemləri fibroblast artım faktoru-2 (FGF-2 ref. 7) kimi aktiv sitokinlər istehsal edə bilir. Burada diqqətimizi polihedron kapsullu FGF-7 istehsal edən PSG və MSG-lərdən istifadə edərək transgen ipəkqurdlarının yaradılmasına yönəltdik. FGF-7 in vitro epidermisin modeli kimi xidmət edən üçölçülü (3D) mədəniyyət sisteminin yaradılması üçün istifadə olunur. 25 Biz FGF-7-nin bioloji fəaliyyətinin keratinositlərin çoxalmasına və əlavəsiz mədəniyyətdə hüceyrələrin epidermal diferensasiyasına səbəb olmaq üçün polihedradan sərbəst buraxıla biləcəyini araşdırdıq. Biz həmçinin insan epidermisi modelinin qurulmasını məlumatlandırmaq üçün 3D keratinosit mədəniyyətlərində PSG-lərə daxil edilmiş çoxüzlülərdən ayrılan FGF-7 fəaliyyətinin effektivliyini araşdırdıq.


Giriş

Floresan zülal (FP) texnologiyası molekulyar biologiya, hüceyrə biologiyası, biotibb və biotexnologiya da daxil olmaqla həyat elmlərində bir çox sahədə inqilab etdi. Həqiqətən, 2008-ci il Kimya üzrə Nobel Mükafatı kəşf və inkişafa görə verilmişdir Aequorea victoria yaşıl floresan protein (avGFP, Chalfie və b., 1994 Heim və b., 1995 Şimomura və b., 1962). Bu gün FP texnologiyası promotor funksiyasının tədqiqi, zülalların lokalizasiyası, hüceyrədaxili zülal dinamikası, zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsi, hüceyrə dövrünün inkişafı, orqanoidlərin və orqanların etiketlənməsi, transgen orqanizmin izlənməsi və digər kimi tədqiqatlar daxil olmaqla, getdikcə genişlənən tətbiqlər siyahısında istifadə olunur. kiçik molekulları və ikinci messencerləri izləmək üçün biosensorlar, sadəcə bir neçəsini adlandırmaq üçün (Stewart, 2006 Shaner) və b., 2007 Berg və Beachy, 2008 Day və Davidson, 2009 Frommer və b., 2009 Rizzo və b., 2009). Beləliklə, FP-lər bioloji tədqiqatlar üçün vacib vasitələrə çevrilmişdir. Bununla belə, bu cür alətlər mikroalq tədqiqatları üçün geniş şəkildə inkişaf etdirilməmişdir.

Mikroyosunlar bioyanacaq, omeqa-3 yağ turşuları, müalicəvi zülallar, balıq və heyvan yemi kimi qida maddələrinin istehsalı da daxil olmaqla, biotexnologiyada potensiallarına görə son vaxtlar diqqəti cəlb edən tək hüceyrəli fotosintetik orqanizmlərdir (Pulz və Qross, 2004 Spolaore). və b., 2006 Rosenberg və b., 2008 Radakovits və b., 2010 Specht və b., 2010 Yu və b., 2011 Georgianna and Mayfield, 2012). Chlamydomonas reinhardtii fotosintez və biotexnoloji tədqiqatlar üçün məşhur model orqanizmə çevrilmiş şirin su, yaşıl mikroyosundur (Harris). və b., 2009 ). C. reinhardtii insan və heyvan terapevtik zülalları və sənaye fermentləri (məsələn, (Dreesen) üçün istehsal platforması kimi də vəd etmişdir. və b., 2010 Eichler-Stahlberg və b., 2009 Qriqori və b., 2012 O və b., 2007 Jones və b., 2013 Manuell və b., 2007 Mayfield və b., 2003 Rəsalə və b., 2012, 2010 Günəş və b., 2003 Surzycki və b., 2009 Tərcümə və b., 2012, 2009 Wang və b., 2008 Yang və b., 2006 Zhang və b., 2006 ).

Həm model yosun, həm də potensial sənaye ştammı kimi, Xlamidomonas tədqiqat FP alətləri və texnologiyasının inkişafından böyük fayda verəcəkdir. Hal-hazırda yalnız bir FP, GFP geniş şəkildə istifadə edilmişdir Xlamidomonas tədqiqat. Nüvə genomundan (CrGFP, Fuhrmann) ifadə etmək üçün nüvə kodonu ilə optimallaşdırılmış gen işlənib hazırlanmışdır. və b., 1999) və xloroplast genomundan ekspressiya üçün xloroplast kodonu ilə optimallaşdırılmış gen işlənib hazırlanmışdır (Franklin). və b., 2002). GFP-nin özünün və ya xloroplastda kimerik bir zülal kimi ifadəsi nüvə ifadəsi ilə müqayisədə bir sıra üstünlüklər, o cümlədən flüoresansın aşkarlanmasını asanlaşdıran və buna görə də faydalı olan daha yüksək protein yığılması təklif etsə də, xloroplastla ifadə olunan GFP-nin dezavantajı onun xloroplastla məhdudlaşmasıdır. . Buna görə də, bir çox FP tətbiqləri bu üsulla mövcud deyil, o cümlədən xloroplastda lokallaşdırılmamış zülalların etiketlənməsi, orqanellə etiketlənməsi və nüvə promotoru tədqiqatları və digərləri. Bununla belə, nüvə genomundan GFP ifadəsi, güclü gen susdurma mexanizm(lər)inə aid edilən aşağı səviyyəli protein ifadəsi ilə ciddi şəkildə əngəllənmişdir. Xlamidomonas (Fuhrmann və b., 1999 Neupert və b., 2009). Zəif GFP ifadə problemi ilə mürəkkəbləşir ki Xlamidomonas xlorofillər və flavonoidlər kimi müxtəlif yüksək flüoresan piqmentlər istehsal edir. Beləliklə, nüvə genomundan zəif transgen ifadəsi yüksək avtoflüoressensiya ilə birlikdə mikroyosunlarda FP-lərin istifadəsinə mane oldu.

Monomer GFP-nin möhkəm ifadəsi üçün nüvə genomunun mühəndisliyi çətin olsa da, GFP füzyon zülalları ilə müəyyən uğurlar əldə edilmişdir. GFP antibiotik müqavimət geninə birləşdirilib ş-ble (Stivens və b., 1996) və nüvəyə lokalizasiyası göstərilmişdir (Fuhrmann və b., 1999 Rəsalə və b., 2012 ). ş-ble fermentativ inaktivasiyadan daha çox dərman sekestrasiyası yolu ilə antibiotiklərə qarşı müqavimət təmin edir (Dümas və b., 1994), onu yaxşı birləşmə partnyoru halına gətirir, çünki antibiotik seçimi zamanı hüceyrənin sağ qalması üçün yüksək səviyyədə protein ifadəsi tələb olunur (Fuhrmann) və b., 1999 Rəsalə və b., 2012). GFP həmçinin endogen genlərlə birləşdirilib, lakin qarışıq nəticələrlə. Məsələn, GFP flagella zülallarına birləşdirilib və canlı hüceyrələrdə flüoresan mikroskopiya ilə uğurla təsvir edilib (məsələn, Schoppmeier). və b., 2005 Huang və b., 2007 Diener, 2009 Engel və b., 2009). Bununla belə, bu, hüceyrə orqanı tərəfindən yaradılan böyük avto-flüoresans üzərində GFP siqnalını aşkar etmək üçün çox vaxt xüsusi canlı hüceyrə görüntüləmə üsullarını tələb edir. Texnikalara nümunənin işıqlandırılan sahəsinə nəzarət etmək üçün mozaika rəqəmsal işıqlandırma sistemindən (Photonic Instruments, St. Charles, IL, ABŞ) və ya flagellanın örtük slipinə yapışmasını tələb edən konfokal və ya tam daxili əks etdirən flüoresan mikroskopiyasından istifadə daxildir. , işıqlandırma sahəsindən kənarda yerləşən avtomatik flüoresan hüceyrə cisimləri ilə (Diener, 2009). GFP həmçinin hüceyrə bədəninin zülalları ilə birləşmişdir. Bununla belə, avtomatik flüoresansiyanın öhdəsindən gəlmək üçün, məsələn, GFP ilə birləşmiş plazma membran protein Rh1-in vizuallaşdırılması üçün ağ mutant ştamından ifadə tələb olunur. Xlamidomonas, karotenoid biosintezinin ilk mərhələsində bloklanır (Yoshihara və b., 2008 ).

Bildiyimizə görə, ifadə edilən yeganə digər FP Xlamidomonas bu günə qədər YFP (Neupert və b., 2009). Həmin tədqiqatda müəlliflər suşlarını yaratmaq üçün UV mutagenezindən istifadə ediblər Xlamidomonas monomerik YFP və GFP daxil olmaqla nüvə genomundan heteroloji zülalların aşkar edilə bilən səviyyələrini ifadə edən.

Bu tədqiqatın məqsədi yaşıl mikroyosunlarda vizual spektri əhatə edən FP-lərin tam komplektini ifadə etmək idi. Xlamidomonas, və reportyor gen kimi onların performansını qiymətləndirmək və müqayisə etmək. Nüvə genomundan zəif transgen ifadəsi problemini aradan qaldırmaq üçün biz FP-ləri birləşdirdik. ş-ble seçim markeri (Ble). Qarışdırılmamış, hədəflənməmiş və monomer FP-lərin yığılmasını təmin etmək üçün biz ayaq və ağız xəstəliyi virusundan (FMDV Ryan) öz-özünə parçalanan 2A peptidi daxil etdik. və b., 1991 ) Ble və FP-lər arasında. Əvvəllər göstərmişdik ki, FMDV 2A peptid effektiv şəkildə öz-özünə parçalanır Xlamidomonas, və ble-2A ifadə strategiyasının yüksək səviyyələrdə CrGFP yığılmasına, ümumi həll olunan zülalın təxminən 0,25%-nə və canlı hüceyrə mikroskopiyasında aşkar edilə bilən flüoresansa səbəb olduğu (Rasala) və b., 2012). Bu araşdırmada biz vizual spektri əhatə edən beş əlavə FP-nin (mavi mTagBFP, mavi mCerulean, sarı Venera, narıncı tdTomato və qırmızı mCherry) uğurlu ifadəsini göstəririk və onları yaşıl CrGFP ilə müqayisə edirik. Bütün FP-lər immunoblotlaşdırma, bütün hüceyrələrdə flüoresan mikroplate oxuyucu analizi, flüoresan mikroskopiya və axın sitometriyası ilə aşkar edilmişdir. Maraqlıdır ki, CrGFP-nin aşağı siqnal-küy nisbətinə görə ən az flüoresan olduğu göstərildi, daha uzun emissiya dalğa uzunluğuna malik FP-lərdə (Venera, tdTomato və mCherry) ən yüksək siqnal-küy nisbətləri var idi. Nəhayət, biz göstəririk ki, ble-2A ifadə vektoru endogen geni, α-tubulini, standart canlı hüceyrə görüntüləmə üsullarından istifadə etməklə asanlıqla aşkar edilə bilən flüoresan zülal etiketi ilə işarələmək üçün istifadə edilə bilər.


Nəticələr və Müzakirə

Eyni embrionlarda gen ifadəsinin çoxsaylı ölçülməsi üçün bir üsul yaratmaq üçün biz GFP-nin kəmiyyətcə müəyyən edilə bilən xüsusiyyətlərindən istifadə etdik, yəni sitoplazmada sərbəst yayılır, asanlıqla aşkar edilir və flüoresan siqnal zülalın miqdarına mütənasibdir. . Biz qeyd etdik ki, rGFP-nin 1 hüceyrəli embrionların sitoplazmasına yeridilməsindən sonra 1) rGFP sürətlə sitoplazmada dağılır, 2) fon avtoflüoresansından yuxarı 3 pg protein aşkar edilə bilər və 3) yüksək reproduktiv və xətti siqnal flüoresan embrionların foto şəkillərinin kompüter analizi ilə müəyyən edildiyi kimi 3-60 pg protein aralığında müşahidə edilmişdir (Şəkil 1B). Qeyd etmək lazımdır ki, rGFP proteolizə nisbətən odadavamlıdır [18], bu rGFP enjekte edilmiş embrionlar 4°C-də saxlandıqda flüoresans intensivliyi ən azı 3 gün sabit idi. Bu, çoxsaylı eksperimentlər üçün GFP floresan standartı kimi xidmət etmək üçün inyeksiya edilmiş embrionların tək dəstindən istifadə etməyə icazə verdi.

Pronuklear inyeksiya edilmiş embrionların böyük əksəriyyəti qeyri-mozaik və vahid yaşıl flüoresan siqnal göstərdi (şək. 2). Bəzi embrionlarda isə siqnal blastomerlər arasında qeyri-bərabər idi və plazmid daşıyan reportyor genindən idarə olunan transkripsiyanın əsas hissəsinin inteqrasiya olunmamış nüsxələrdən olduğunu nəzərə alsaq, bu, bölünən blastomerlər arasında mikroinyeksiya edilmiş DNT-nin qeyri-bərabər paylanması ilə bağlı ola bilərdi. Əgər belədirsə, bu, birinci yarılma zamanı deyil, daha çox preimplantasiyanın orta mərhələlərində baş verdi, çünki qeyri-bərabər flüoresan rüşeym sahəsi (həm daha güclü, həm də zəif) adətən embrionun kiçik sahəsi idi.

Pronuklear inyeksiya edilmiş embrionların böyük əksəriyyətində qeyri-mozaik d1EGFP ifadəsi (A, UV görünüşü B, parlaq işıq görünüşü). Bəzi embrionlar mikroinyeksiya edilmiş DNT-nin qeyri-bərabər paylanmasının göstəricisi kimi qeyri-bərabər yaşıl flüoresan siqnal göstərir. Ox başları qeyri-bərabər floresan embrion sahələri göstərir (həm daha güclü, həm də zəif)

Pronuklear inyeksiya edilmiş embrionların böyük əksəriyyətində qeyri-mozaik d1EGFP ifadəsi (A, UV görünüşü B, parlaq işıq görünüşü). Bəzi embrionlar mikroinyeksiya edilmiş DNT-nin qeyri-bərabər paylanmasının göstəricisi kimi qeyri-bərabər yaşıl flüoresan siqnal göstərir. Ox başları qeyri-bərabər floresan embrion sahələri göstərir (həm daha güclü, həm də zəif)

d1EGFP ifadəsinin preimplantasiya inkişafına xələl gətirmədiyini yoxlamaq üçün biz d1EGFP-ni ifadə edən embrionların inkişaf qabiliyyətini tək tamponla (sham) yeridilmiş embrionların inkişaf qabiliyyəti ilə müqayisə etdik. 4 eksperimentin nəticələrinin təhlili göstərdi ki, EGFP geni ilə enjekte edilmiş embrionlar (inyeksiyadan sağ qalan 192 embriondan 74% 142) və saxta inyeksiya edilmiş embrionlar (79% 38) arasında blastosist mərhələsinə inkişaf nisbətində əhəmiyyətli fərq yoxdur. 48 enjeksiyondan sağ qalanlar). Əvvəlki tədqiqatlarda həm GFP-flüoresan, həm də qeyri-flüoresan embrionlar arasında inkişaf səriştəsinin azalması müşahidə edildi [22, 28, 29], embrionun canlılığının azalması ilə GFP/EGFP ifadəsi arasında birbaşa əlaqənin olmadığını göstərir.

Eyni embrionda gen ifadəsini bir neçə dəfə izləmək üçün floresansı aşkar edə bilən, lakin in vitro inkişafının qarşısını almayan UV şüalanması üçün şərait yaratmaq lazım idi. Müvafiq olaraq, biz çoxlu ultrabənövşəyi şüalara məruz qalmanın embrionun canlılığına təsirini sınaqdan keçirdik. Embrionlar əvvəlcə iki hüceyrəli mərhələdə ultrabənövşəyi radiasiyaya, sonra blastosist mərhələsinə qədər hər gün UV şüalanmasına məruz qaldılar. Bizim işıqlandırma şərtlərimizdə, bu işıqlandırılmış embrionların blastosist mərhələsinə qədər inkişaf tezliyində UV işığına məruz qalmayan nəzarət embrionlarının inkişafı ilə heç bir aşkar fərq yox idi (Cədvəl 1). Daha əhəmiyyətlisi, ultrabənövşəyi şüalara dəfələrlə məruz qalma embrionların inkişaf qabiliyyətinə təsir göstərməmişdir. Daha uzun (120 saniyə), ultrabənövşəyi şüalara dəfələrlə məruz qalma blastosist mərhələsinin inkişaf tezliyini azaldıb və 2-ci mərhələdə ultrabənövşəyi şüalara dəfələrlə (5-10) və uzun müddət (120 san) məruz qaldıqdan sonra blastosist mərhələsinin inkişafı müşahidə olunmayıb. -hüceyrə mərhələsi.

Çoxlu ultrabənövşəyi şüalara məruz qalan siçan embrionlarının in vitro inkişafı.

UV məruz qalma. Blastosist/müşahidə edilmiş embrion.
30 san. 120 san.
subay 43/54 (80%) 34/45 (76%)
Çoxlu/zamanlı kurs b 142/192 (74%) c 21/50 (42%)
Çoxlu/gün d 9/50 (18%) 0/38 (0%)
29/36 (80%) məruz qalmadı
UV məruz qalma. Blastosist/müşahidə edilmiş embrion.
30 san. 120 san.
subay 43/54 (80%) 34/45 (76%)
Çoxlu/zamanlı kurs b 142/192 (74%) c 21/50 (42%)
Çoxlu/gün d 9/50 (18%) 0/38 (0%)
29/36 (80%) məruz qalmadı

1 hüceyrə mərhələsində pCMV-d1EGFP DNT ilə enjekte edilir.

Gündə bir-iki dəfə, hər gün kurs çərçivəsində.

4 ayrı təcrübədən əldə edilən məlumatlar.

Gündə beş-on dəfə, 1 gün.

Çoxlu ultrabənövşəyi şüalara məruz qalan siçan embrionlarının in vitro inkişafı.

UV məruz qalma. Blastosist/müşahidə edilmiş embrion.
30 san. 120 san.
subay 43/54 (80%) 34/45 (76%)
Çoxlu/zamanlı kurs b 142/192 (74%) c 21/50 (42%)
Çoxlu/gün d 9/50 (18%) 0/38 (0%)
Açıqlanmadı 29/36 (80%)
UV məruz qalma. Blastosist/müşahidə edilmiş embrion.
30 san. 120 san.
subay 43/54 (80%) 34/45 (76%)
Çoxlu/zamanlı kurs b 142/192 (74%) c 21/50 (42%)
Çoxlu/gün d 9/50 (18%) 0/38 (0%)
29/36 (80%) məruz qalmadı

1 hüceyrə mərhələsində pCMV-d1EGFP DNT ilə enjekte edilir.

Gündə bir-iki dəfə, hər gün kurs çərçivəsində.

4 ayrı təcrübədən əldə edilən məlumatlar.

Gündə beş-on dəfə, 1 gün.

Daha sonra eyni embrionda çoxlu ölçmələrin aparıldığı tək embrionlarda dlEGFP ifadəsini kəmiyyətləndirdik (Şəkil 3). Bu təcrübələrdə embrionlarda mövcud olan siqnal intensivliyi zülal miqdarına çevrildi və orta dlEGFP məzmunu zaman ərzində hər bir məlumat nöqtəsi üçün 20-30 embrion (4 təcrübədə cəmi ~100 embrion) qrupları üçün hesablandı. - kurs eksperimenti. Kultura zamanı inkişaf zamanı həbs edilmiş embrionlar analizdən çıxarıldı.

Qısa yarı ömrü d1EGFP-nin istifadəsi ilə transkripsiyada müvəqqəti məhdudlaşdırılmış dəyişikliklərin kəmiyyət təhlili. Embrionlara həm 1 hüceyrəli (kvadratlar) həm də 2 hüceyrəli (dairələr) mərhələdə 2 pl DNT yeridilmiş, ardınca 1,5 mM butiratın mövcudluğu (█, •) və ya olmadan (□, ○) kultivasiya edilmişdir. d1EGFP mRNA-nın sabit dövlət səviyyəsində dinamikasını müəyyən etmək üçün DNT inyeksiyasından sonra (10 ng/μl) müxtəlif vaxtlarda eyni embrionlarda d1EGFP ifadəsinin çoxsaylı qeyri-invaziv ölçmələri aparılmışdır. d1EGFP ifadəsinin kinetikası d1EGFP miqdarına çevrilmiş flüoresan qiymətlərindən müəyyən edilmişdir. Mikroinyeksiya edilmiş embrionlar üçün müşahidə edilən d1EGFP dəyərləri orta ± SEM hesablamadan əvvəl çıxarılmışdır. 4 müstəqil təcrübədən əldə edilən məlumatlar (cəmi ~100 embrion) birləşdirildi və SEM hesablandı

Qısa yarı ömrü d1EGFP-nin istifadəsi ilə transkripsiyada müvəqqəti məhdudlaşdırılmış dəyişikliklərin kəmiyyət təhlili. Embrionlara həm 1 hüceyrəli (kvadratlar) həm də 2 hüceyrəli (dairələr) mərhələdə 2 pl DNT yeridilmiş, ardınca 1,5 mM butiratın mövcudluğu (█, •) və ya olmadan (□, ○) kultivasiya edilmişdir. d1EGFP mRNA-nın sabit dövlət səviyyəsində dinamikasını müəyyən etmək üçün DNT inyeksiyasından sonra (10 ng/μl) müxtəlif vaxtlarda eyni embrionlarda d1EGFP ifadəsinin çoxsaylı qeyri-invaziv ölçmələri aparılmışdır. d1EGFP ifadəsinin kinetikası d1EGFP miqdarına çevrilən flüoresan dəyərlərindən müəyyən edilmişdir. Mikroinyeksiya edilmiş embrionlar üçün müşahidə edilən d1EGFP dəyərləri orta ± SEM hesablamadan əvvəl çıxarılmışdır. 4 müstəqil təcrübədən əldə edilən məlumatlar (cəmi ~100 embrion) birləşdirildi və SEM hesablandı

Yaşıl flüoresan siqnal ilk dəfə kişi pronukleusunun mikroinyeksiyasından 40 saat sonra (yəni 4 hüceyrəli mərhələdə) embrionlarda aşkar edilmişdir. Digərləri mikroinyeksiyadan sonra 20-24 saat ərzində plazmid daşıyan lusiferaza müxbir geninin ifadəsini bildirdilər [1]. Müşahidə etdiyimiz gecikmə, əvvəlki tədqiqatlarda yeridilən daha böyük miqdarlarla (0,2-0,4 pg) müqayisədə lüsiferaza ilə müqayisədə EGFP-nin aşkarlanması həssaslığının azalması və mikroinyeksiya edilmiş plazmid DNT-nin az miqdarının (0,02 pg) birləşməsini əks etdirə bilər [1] , 2]. Mikroinyeksiyadan sonra 70 saata qədər ifadə mahiyyətcə sabit qaldı və sonra inyeksiyadan 100 saat sonra hər hansı bir ifadə (yəni, blastosist mərhələsi) müşahidə olunana qədər tədricən azaldı. Bu azalma, çox güman ki, transkripsiya fəaliyyətinin azalması deyil, yeridilmiş plazmidin deqradasiyasını əks etdirir, çünki PCR analizi plazmid DNT-nin miqdarında azalma aşkar etmişdir (şək. 4). Biz müşahidə etdik ki, mikroinyeksiyadan sonra ilk saat ərzində plazmid DNT-nin miqdarında 30%-50% azalma daha əvvəl təklif edildiyi kimi baş verib [30], bu azalma çox güman ki, yeridilmiş DNT-nin sitoplazmaya sızması ilə əlaqədardır. sürətlə xarab olur. Genişlənmiş blastosist mərhələsində (inyeksiyadan 100 saat sonra) plazmid DNT-nin yalnız ~5%-i qalır.

Pronuklear mikroinyeksiyadan sonra müxtəlif vaxtlarda qalan plazmid DNT tərkibinin kəmiyyət PCR analizi. A) Birhüceyrəli embrionlara plazmidin ~4000 nüsxəsi yeridildi (bu, 4,9 kilobaza plazmidinin 0,02 ng-nə uyğundur) və müxtəlif inkişaf mərhələlərində olan 10 embrionda PCR analizi aparıldı. Göstərilən etidium bromidlə boyanmış 2% agaroz gelidir. B) Son nöqtə titrləmə standartı. 1-dən 8-ə qədər zolaqlar hər bir embrion üçün müvafiq olaraq 40 000, 20 000, 10 000, 5000, 3000, 2000, 1000 və 500 plazmid nüsxəsindən əldə edilən gücləndirmə fraqmentlərini göstərir. Qeyd edək ki, plazmidin 40 000 nüsxəsi 10 embriona yeridilmiş DNT miqdarına bərabərdir.

Pronuklear mikroinyeksiyadan sonra müxtəlif vaxtlarda qalan plazmid DNT tərkibinin kəmiyyət PCR analizi. A) Birhüceyrəli embrionlara plazmidin ~4000 nüsxəsi yeridildi (bu, 4,9 kilobaza plazmidinin 0,02 ng-nə uyğundur) və müxtəlif inkişaf mərhələlərində olan 10 embrionda PCR analizi aparıldı. Göstərilən etidium bromidlə boyanmış 2% agaroz gelidir. B) Son nöqtə titrləmə standartı. 1-dən 8-ə qədər zolaqlar hər bir embrion üçün müvafiq olaraq 40 000, 20 000, 10 000, 5000, 3000, 2000, 1000 və 500 plazmid nüsxəsindən əldə edilən gücləndirmə fraqmentlərini göstərir. Qeyd edək ki, plazmidin 40 000 nüsxəsi 10 embriona yeridilmiş DNT miqdarına bərabərdir.

Plazmidin ikihüceyrəli blastomerin nüvəsinə yeridilməsi ilkin olaraq kişi pronukleusunun inyeksiyasından sonra müşahidə ediləndən daha yüksək olan aşkar edilə bilən flüoresansın sürətli görünüşü ilə nəticələndi (şək. 3). 2 hüceyrəli blastomer nüvəsinin plazmid daşıyan lusiferaza reportyor geni ilə yeridilməsindən sonra da sürətli artım müşahidə olunur və bu ifadə səviyyəsi eyni şəkildə 1 hüceyrəli embrionların yeridilməsindən sonra müşahidə ediləndən daha yüksəkdir [2]. Sonra ifadə artdı və növbəti 40 saat ərzində sabit qaldı, bundan sonra blastosist mərhələsinə qədər proqressiv azalma aşkar edildi. Yenə də azalma, ehtimal ki, transkripsiya fəaliyyətinin azalması deyil, PCR analizi (Şəkil 4) ilə müəyyən edildiyi kimi vurulan plazmidin deqradasiyasını əks etdirir.

Anadan ziqota keçid zamanı transkripsiya baxımından repressiv vəziyyət yaranır ([31] və oradakı istinadlar). Bu repressiya 2 hüceyrəli nüvəyə yeridildikdən sonra plazmid daşıyan lusiferaza müxbir geninin yüksək səviyyədə ifadəsi üçün gücləndirici tələbi ilə aşkar edilmişdir [3]. Moreover, inducing histone hyperacetylation by butyrate treatment relieves this requirement. It is interesting that expression of the plasmid following microinjection into the male pronucleus shows neither a requirement for an enhancer nor increased expression following butyrate treatment [ 32]. Accordingly, we examined the effect of inducing histone hyperacetylation with butyrate on expression of our reporter gene following injection of either the male pronucleus or two-cell blastomere nucleus ( Fig. 3). Little stimulation of dlEGFP expression was observed in butyrate-treated 1-cell embryos, whereas a robust stimulation was found following injection of a 2-cell nucleus, when compared with embryos not treated with butyrate. Thus, monitoring dlEGFP fluorescence as a measure of reporter gene expression faithfully mimics the expression of a luciferase reporter gene and the effect of inducing histone hyperacetylation on reporter gene expression.

In summary, the method described in this report offers the investigator the opportunity to assay quantitatively in real-time the transcriptional activity of individual embryos under conditions that permit multiple measurements. The method should prove quite valuable in assessing the transcriptional activity in the preimplantation embryo (e.g., ascertaining the effect of different culture conditions on transcription, investigating the molecular mechanisms that underlie the maternal-to-zygotic transition, and analyzing transcription in species in which only a limited number of embryos are available [in nonhuman primates]).


NƏTİCƏLƏR

Characterization of Transgenic Plants Expressing Polyprotein Constructs with IbAMP-Based Linker Peptides

A, Diagram of the expression cassettes in plant transformation vectors pFAJ3105, pFAJ3109, pFAJ3339, pFAJ3340, pFAJ3433, and pFAJ3375. p35S, Enhanced CaMV35S promoter ( Kay et al., 1987) TMV, 5′ leader sequence of tobacco mosaic virus SP, coding region of the leader peptide derived from the DmAMP1 precursor DmAMP1, coding region of the mature DmAMP1 LP, coding region of the linker peptide RsAFP2, coding region of the mature RsAFP2 tNos, 3′-untranslated terminator region of the Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase gene ( Bevan et al., 1983) [uOcs]pMas, chimeric promoter consisting of the enhancer of theA. tumefaciens octopine synthase gene and the promoter of the A. tumefaciens mannopine synthase gene (M.F.C. De Bolle, unpublished data) tMas, 3′-untranslated terminator region of theA. tumefaciens mannopine synthase gene ( Barker et al., 1983). B, Amino acid sequence of the (poly)proteins encoded by constructs pFAJ3105, pFAJ3109, pFAJ3339, pFAJ3340, pFAJ3433, and pFAJ3375. The leader peptide of DmAMP1 is in normal font. The mature DmAMP1 domain is underlined. The linker peptide domain is in bold. The mature RsAFP2 domain is italicized.

A, Diagram of the expression cassettes in plant transformation vectors pFAJ3105, pFAJ3109, pFAJ3339, pFAJ3340, pFAJ3433, and pFAJ3375. p35S, Enhanced CaMV35S promoter ( Kay et al., 1987) TMV, 5′ leader sequence of tobacco mosaic virus SP, coding region of the leader peptide derived from the DmAMP1 precursor DmAMP1, coding region of the mature DmAMP1 LP, coding region of the linker peptide RsAFP2, coding region of the mature RsAFP2 tNos, 3′-untranslated terminator region of the Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase gene ( Bevan et al., 1983) [uOcs]pMas, chimeric promoter consisting of the enhancer of theA. tumefaciens octopine synthase gene and the promoter of the A. tumefaciens mannopine synthase gene (M.F.C. De Bolle, unpublished data) tMas, 3′-untranslated terminator region of theA. tumefaciens mannopine synthase gene ( Barker et al., 1983). B, Amino acid sequence of the (poly)proteins encoded by constructs pFAJ3105, pFAJ3109, pFAJ3339, pFAJ3340, pFAJ3433, and pFAJ3375. The leader peptide of DmAMP1 is in normal font. The mature DmAMP1 domain is underlined. The linker peptide domain is in bold. The mature RsAFP2 domain is italicized.

Northern-blot analysis of DmAMP1 expression in leaves of transgenic T1 generation lines transformed with constructs pFAJ3109 and pFAJ3105. All analyzed samples represent 15 μg of total RNA. NT, Non-transformed Arabidopsis plants 3109, Arabidopsis plants transformed with the single-protein construct pFAJ3109 (transgenic line 1 and 2) 3105, Arabidopsis plants transformed with the double-protein construct pFAJ3105 (transgenic line 1 and 2). Similar northern-blot analyses were obtained for another eight lines of Arabidopsis plants transformed with construct pFAJ3105 and six lines of Arabidopsis plants transformed with construct pFAJ3109.

Northern-blot analysis of DmAMP1 expression in leaves of transgenic T1 generation lines transformed with constructs pFAJ3109 and pFAJ3105. All analyzed samples represent 15 μg of total RNA. NT, Non-transformed Arabidopsis plants 3109, Arabidopsis plants transformed with the single-protein construct pFAJ3109 (transgenic line 1 and 2) 3105, Arabidopsis plants transformed with the double-protein construct pFAJ3105 (transgenic line 1 and 2). Similar northern-blot analyses were obtained for another eight lines of Arabidopsis plants transformed with construct pFAJ3105 and six lines of Arabidopsis plants transformed with construct pFAJ3109.

The amount of DmAMP1 and RsAFP2 in leaves from a series of T1 Arabidopsis plants transformed with pFAJ3105 was determined using ELISA assays (Table I). Most of the lines transformed with the polyprotein construct expressed both DmAMP1-cross-reactive proteins (CRPs) and RsAFP2-CRPs. In general, there was a good correlation between DmAMP1-CRP and RsAFP2-CRP levels. However, RsAFP2-CRP levels were generally 2- to 5-fold lower than the DmAMP1-CRP levels. The ELISA assays for measuring the RsAFP2-CRP levels in the extracts were, however, less reliable than those for the DmAMP1-CRPs. In the RsAFP2 ELISA assays, dilutions of extracts of transgenic plants yielded dose-response curves that deviated from those obtained for dilutions of standard solutions containing native RsAFP2, indicating that the majority of the RsAFP2-CRPs in the extracts was not immunologically identical to the native RsAFP2 itself.

Expression levels of DmAMP1 and RsAFP2 in leaves of transgenic Arabidopsis transformed with the constructs pFAJ3105 and pFAJ3109

Construct . Line . Expression Level of DmAMP1 . Expression Level of RsAFP2 .
%
pFAJ3105 1 0.77 0.29
2 1.13 0.22
3 0.48 0.20
4 0.005 <0.001
5 0.36 0.05
6 0.99 0.25
7 0.60 0.09
8 0.13 <0.001
9 0.25 0.08
10 1.35 0.35
11 0.24 0.07
12 1.18 0.24
13 0.68 0.17
14 0.49 0.07
Orta 0.62 0.15
pFAJ3109 1 0.19 nd 1-a
2 0.05 nd
3 0.02 nd
4 0.20 nd
5 0.10 nd
6 0.06 nd
7 0.07 nd
8 0.003 nd
Orta 0.09 nd
Construct . Line . Expression Level of DmAMP1 . Expression Level of RsAFP2 .
%
pFAJ3105 1 0.77 0.29
2 1.13 0.22
3 0.48 0.20
4 0.005 <0.001
5 0.36 0.05
6 0.99 0.25
7 0.60 0.09
8 0.13 <0.001
9 0.25 0.08
10 1.35 0.35
11 0.24 0.07
12 1.18 0.24
13 0.68 0.17
14 0.49 0.07
Orta 0.62 0.15
pFAJ3109 1 0.19 nd 1-a
2 0.05 nd
3 0.02 nd
4 0.20 nd
5 0.10 nd
6 0.06 nd
7 0.07 nd
8 0.003 nd
Orta 0.09 nd

Expression levels of DmAMP1 and RsAFP2 are expressed as the ratio of the amount of DmAMP1-CRP or RsAFP2-CRP to the amount of total soluble protein in crude extracts from leaves of transgenic Arabidopsis plants. The Arabidopsis plants are transformed with either the double protein construct (pFAJ3105) coding for DmAMP1 and RsAFP2 or the single protein construct (pFAJ3109) coding only for DmAMP1.

Expression levels of DmAMP1 and RsAFP2 in leaves of transgenic Arabidopsis transformed with the constructs pFAJ3105 and pFAJ3109

Construct . Line . Expression Level of DmAMP1 . Expression Level of RsAFP2 .
%
pFAJ3105 1 0.77 0.29
2 1.13 0.22
3 0.48 0.20
4 0.005 <0.001
5 0.36 0.05
6 0.99 0.25
7 0.60 0.09
8 0.13 <0.001
9 0.25 0.08
10 1.35 0.35
11 0.24 0.07
12 1.18 0.24
13 0.68 0.17
14 0.49 0.07
Orta 0.62 0.15
pFAJ3109 1 0.19 nd 1-a
2 0.05 nd
3 0.02 nd
4 0.20 nd
5 0.10 nd
6 0.06 nd
7 0.07 nd
8 0.003 nd
Orta 0.09 nd
Construct . Line . Expression Level of DmAMP1 . Expression Level of RsAFP2 .
%
pFAJ3105 1 0.77 0.29
2 1.13 0.22
3 0.48 0.20
4 0.005 <0.001
5 0.36 0.05
6 0.99 0.25
7 0.60 0.09
8 0.13 <0.001
9 0.25 0.08
10 1.35 0.35
11 0.24 0.07
12 1.18 0.24
13 0.68 0.17
14 0.49 0.07
Orta 0.62 0.15
pFAJ3109 1 0.19 nd 1-a
2 0.05 nd
3 0.02 nd
4 0.20 nd
5 0.10 nd
6 0.06 nd
7 0.07 nd
8 0.003 nd
Orta 0.09 nd

Expression levels of DmAMP1 and RsAFP2 are expressed as the ratio of the amount of DmAMP1-CRP or RsAFP2-CRP to the amount of total soluble protein in crude extracts from leaves of transgenic Arabidopsis plants. The Arabidopsis plants are transformed with either the double protein construct (pFAJ3105) coding for DmAMP1 and RsAFP2 or the single protein construct (pFAJ3109) coding only for DmAMP1.

Box plots of the DmAMP1 expression levels of T1 generation transgenic Arabidopsis plants transformed with constructs pFAJ3105 and pFAJ3109, respectively. DmAMP1 expression level is expressed as the ratio of the amount of DmAMP1 to the amount of total soluble protein in crude extracts from leaves of transgenic T1 Arabidopsis plants. Gridlines depicted as vertical dotted lines represent the DmAMP1 expression level scale. Vertical lines in the box plots correspond to the 0th, 25th, 50th (or median), 75th, and 100th percentile, respectively.

Box plots of the DmAMP1 expression levels of T1 generation transgenic Arabidopsis plants transformed with constructs pFAJ3105 and pFAJ3109, respectively. DmAMP1 expression level is expressed as the ratio of the amount of DmAMP1 to the amount of total soluble protein in crude extracts from leaves of transgenic T1 Arabidopsis plants. Gridlines depicted as vertical dotted lines represent the DmAMP1 expression level scale. Vertical lines in the box plots correspond to the 0th, 25th, 50th (or median), 75th, and 100th percentile, respectively.

To test whether enhanced expression observed for the polyprotein construct pFAJ3105 is restricted to the particular configuration of the expression unit, four other constructs (pFAJ3339, pFAJ3340, pFAJ3433, and pFAJ3375) were made (Fig. 1). The promoter used in these constructs was the chimeric promoter [uOcs]pMas, consisting of the A. tumefaciens octopine synthase enhancer linked to the A. tumefaciens mannopine synthase promoter instead of the CaMV35S promoter used in construct pFAJ3105. The terminator was the mannopine synthase terminator instead of the nopaline synthase terminator used in construct pFAJ3105. Constructs pFAJ3339 and pFAJ3340 are both polyprotein-encoding constructs, with the polyprotein encoded by pFAJ3339 being exactly the same as the polyprotein encoded by pFAJ3105 and the one encoded by pFAJ3340 having a reversed order of the DmAMP1 and RsAFP2 coding regions relative to that of pFAJ3105 and pFAJ3339. Constructs pFAJ3433 and pFAJ3375 are both single-protein constructs, with pFAJ3433 encoding mature DmAMP1 preceded by the DmAMP1 leader peptide at its amino terminus and pFAJ3375 encoding mature RsAFP2 with the DmAMP1 leader peptide.

Expression levels of DmAMP1 and RsAFP2 in leaves of transgenic Arabidopsis transformed with the constructs pFAJ3339, pFAJ3340, pFAJ3433, and pFAJ3375

Construct . n 2-a . Average Expression Level . P 2-b . P 2-c .
DmAMP1 . RsAFP2 .
%
pFAJ3339 13 0.085 0.024 a a
pFAJ3340 19 0.006 0.01 b a
pFAJ3433 20 0.009 nd 2-d b nd
pFAJ3375 13 nd 0.003 nd b
Construct . n 2-a . Average Expression Level . P 2-b . P 2-c .
DmAMP1 . RsAFP2 .
%
pFAJ3339 13 0.085 0.024 a a
pFAJ3340 19 0.006 0.01 b a
pFAJ3433 20 0.009 nd 2-d b nd
pFAJ3375 13 nd 0.003 nd b

Expression levels are expressed as described in Table I.

n is the no. of independent transformants for which expression was measured.

Comparison of the average of the ln-transformed DmAMP1 expression levels at significance level 0.05. Identical letters indicate that the averages are not significantly different according to Tukey's studentized range test.

Comparison of the average of the ln-transformed RsAFP2 expression levels at significance level 0.05. Identical letters indicate that the averages are not significantly different according to Tukey's studentized range test.

Expression levels of DmAMP1 and RsAFP2 in leaves of transgenic Arabidopsis transformed with the constructs pFAJ3339, pFAJ3340, pFAJ3433, and pFAJ3375

Construct . n 2-a . Average Expression Level . P 2-b . P 2-c .
DmAMP1 . RsAFP2 .
%
pFAJ3339 13 0.085 0.024 a a
pFAJ3340 19 0.006 0.01 b a
pFAJ3433 20 0.009 nd 2-d b nd
pFAJ3375 13 nd 0.003 nd b
Construct . n 2-a . Average Expression Level . P 2-b . P 2-c .
DmAMP1 . RsAFP2 .
%
pFAJ3339 13 0.085 0.024 a a
pFAJ3340 19 0.006 0.01 b a
pFAJ3433 20 0.009 nd 2-d b nd
pFAJ3375 13 nd 0.003 nd b

Expression levels are expressed as described in Table I.

n is the no. of independent transformants for which expression was measured.

Comparison of the average of the ln-transformed DmAMP1 expression levels at significance level 0.05. Identical letters indicate that the averages are not significantly different according to Tukey's studentized range test.

Comparison of the average of the ln-transformed RsAFP2 expression levels at significance level 0.05. Identical letters indicate that the averages are not significantly different according to Tukey's studentized range test.

A, Box plots of the DmAMP1 expression levels of T1 generation Arabidopsis plants transformed with the polyprotein constructs pFAJ3339 and pFAJ3340 and the single-protein construct pFAJ3433, respectively. B, Box plots of the RsAFP2 expression levels of T1 generation Arabidopsis plants transformed with the polyprotein constructs pFAJ3339 and pFAJ3340 and the single-protein construct pFAJ33775, respectively. Legend for both box plots as in Figure 3.

A, Box plots of the DmAMP1 expression levels of T1 generation Arabidopsis plants transformed with the polyprotein constructs pFAJ3339 and pFAJ3340 and the single-protein construct pFAJ3433, respectively. B, Box plots of the RsAFP2 expression levels of T1 generation Arabidopsis plants transformed with the polyprotein constructs pFAJ3339 and pFAJ3340 and the single-protein construct pFAJ33775, respectively. Legend for both box plots as in Figure 3.

Analysis of the Subcellular Location of Co-Expressed Plant Defensins

To determine whether the co-expressed plant defensins are either secreted extracellularly or deposited intracellularly, extracellular fluid and intracellular extract fractions were prepared from leaves of Arabidopsis plants transformed with the polyprotein construct (pFAJ3105). The cytosolic enzyme Glc-6-phosphate dehydrogenase was used as a marker to detect contamination of the extracellular fluid fraction with intracellular components. Glc-6-phosphate dehydrogenase was partitioned in a ratio of 83:17 between the intracellular extract fractions and extracellular fluid fractions. In contrast, 94% of DmAMP1-CRP content and 92% of RsAFP2-CRP content in the transgenic plants tested were found in the extracellular fluid fractions. These results indicate that both plant defensins released from the polyprotein precursors are deposited primarily in the apoplast.

Purification of Proteins Processed from Polyprotein Construct pFAJ3105

Chromatographic purification of DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs from extracellular fluid fraction of Arabidopsis plants transformed with the double-protein construct pFAJ3105. The extracellular fluid fraction was loaded on a C8 RP-HPLC column equilibrated in 15% (v/v) acetonitrile in 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA). The column was eluted at a flow rate of 1 mL min −1 for 15 min with 15% (v/v) acetonitrile in 0.1% (v/v) TFA followed by a linear gradient of acetonitrile in 0.1% (v/v) TFA from 15% (v/v) to 50% (v/v) acetonitrile in 35 min. The eluate was monitored by on-line measurement of theA 280 (A 280—) and the acetonitrile gradient (---) was monitored with an on-line conductivity sensor. Fractions were collected and assessed for the presence of DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs by the respective ELISA assays. Dotted bars represent the presence of DmAMP1-CRPs (p3105EF1 and p3105EF2), whereas the black bar represents the presence of RsAFP2-CRPs (p3105EF3). Triangles indicate the elution position of native DmAMP1 (white triangle) and of native RsAFP2 (black triangle).

Chromatographic purification of DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs from extracellular fluid fraction of Arabidopsis plants transformed with the double-protein construct pFAJ3105. The extracellular fluid fraction was loaded on a C8 RP-HPLC column equilibrated in 15% (v/v) acetonitrile in 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid (TFA). The column was eluted at a flow rate of 1 mL min −1 for 15 min with 15% (v/v) acetonitrile in 0.1% (v/v) TFA followed by a linear gradient of acetonitrile in 0.1% (v/v) TFA from 15% (v/v) to 50% (v/v) acetonitrile in 35 min. The eluate was monitored by on-line measurement of theA 280 (A 280—) and the acetonitrile gradient (---) was monitored with an on-line conductivity sensor. Fractions were collected and assessed for the presence of DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs by the respective ELISA assays. Dotted bars represent the presence of DmAMP1-CRPs (p3105EF1 and p3105EF2), whereas the black bar represents the presence of RsAFP2-CRPs (p3105EF3). Triangles indicate the elution position of native DmAMP1 (white triangle) and of native RsAFP2 (black triangle).

To test whether the purification procedure based on the extracellular fluid preparation reflects the true composition in DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs of the transgenic Arabidopsis leaves, an alternative purification procedure was developed starting from a crude leaf extract. The extract was fractionated by ion-exchange chromatography (IEC) and subsequently by RP-HPLC. After separation, fractions were collected and assessed for the presence of DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs using ELISA assays. IEC was performed by passing the extract over a cation exchange column at pH 6. When the column was eluted with a linear gradient of 0 to 0.5 m NaCl in 50 m m MES at pH 6, DmAMP1-CRPs were detected in fractions eluting between 0.17 and 0.33 m NaCl, whereas RsAFP2-CRPs were detected in fractions eluting between 0.24 and 0.49 m NaCl (data not shown). Fractions containing either DmAMP1-CRPs or RsAFP2-CRPs were pooled into two fractions (0.17–0.24 m NaCl and 0.33–0.49 m NaCl, respectively), which were each subjected to RP-HPLC on a C8-silica column eluted with a linear gradient of acetonitrile. DmAMP1-CRPs eluted in two peaks, the latter of which eluted at a position very close to that of native DmAMP1. RsAFP2-CRPs were found in a single peak that was well separated from the DmAMP1-CRP peaks and eluted at a position very close to that of native RsAFP2 (data not shown).

Molecular Analyses of the Purified Protein Fractions

The different DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs purified from the extracellular fluid were subjected to amino-terminal amino acid sequence analysis as well as to mass spectrometry. The carboxy-terminal amino acid was determined based on the best approximation of the predicted theoretical mass to the experimentally determined mass (Table III). The DmAMP1-CRPs, p3105EF1 and p3105EF2 (nomenclature as in Fig. 5), had masses that were consistent with the presence of a single additional Ser residue at their carboxy-terminal end as compared with native DmAMP1. However, whereas the mass of p3105EF2 corresponded exactly (within experimental error) to that calculated for a DmAMP1 derivative with an additional Ser (hereafter called DmAMP1+S) at its carboxy-terminal end, the mass of p3105EF1 was in excess by 4 D relative to the calculated mass for DmAMP1+S. Hence, this protein might be a DmAMP1+S derivative with partially reduced disulfide bridges. This hypothesis was confirmed by reduction of the disulfide bonds in p3105EF1 and p3105EF2 with excess dithiothreitol, followed by separation of the reduced forms by RP-HPLC. The reduced form of p3105EF1 and p3105EF2 eluted at exactly the same position, indicating that p3105EF1 only differs from p3105EF2 in its disulfide bond content (data not shown).

Molecular analysis of the purified AMP fractions

Protein Fraction . Molecular Mass Determined by: . Amino Acid Sequence .
Matrix-assisted laser-desorption ionization time of flight MS . Electrospray ionization-MS . Theoretical prediction . Determined amino terminal . Predicted carboxy terminal .
D
p3105EF1 5,614 ± 5 5,608.3 ± 1 5,604.25 ELCEKAS CYFNC S
p3105EF2 5,602 ± 5 5,604.9 ± 1 5,604.25 ELCEKAS CYFNC S
p3105EF3 6,223 ± 6 nd 3-a 6,225.15 DVEPG QKICYFPC
Protein Fraction . Molecular Mass Determined by: . Amino Acid Sequence .
Matrix-assisted laser-desorption ionization time of flight MS . Electrospray ionization-MS . Theoretical prediction . Determined amino terminal . Predicted carboxy terminal .
D
p3105EF1 5,614 ± 5 5,608.3 ± 1 5,604.25 ELCEKAS CYFNC S
p3105EF2 5,602 ± 5 5,604.9 ± 1 5,604.25 ELCEKAS CYFNC S
p3105EF3 6,223 ± 6 nd 3-a 6,225.15 DVEPG QKICYFPC

Molecular mass (D) of DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs purified as described in Fig. 3 was determined by matrix-assisted laser-desorption-ionization time of flight or electrospray ionization-mass spectrometry (MS) and amino-terminal sequence of the same components was determined by automated Edman degradation. Also shown are the predicted carboxy-terminal sequences that give best correspondence between experimental molecular mass and theoretical molecular mass. Amino acids of the mature DmAMP1 domain are underlined, amino acids of the linker peptide are in bold, and amino acids of the mature RsAFP2 domain are italicized.

Molecular analysis of the purified AMP fractions

Protein Fraction . Molecular Mass Determined by: . Amino Acid Sequence .
Matrix-assisted laser-desorption ionization time of flight MS . Electrospray ionization-MS . Theoretical prediction . Determined amino terminal . Predicted carboxy terminal .
D
p3105EF1 5,614 ± 5 5,608.3 ± 1 5,604.25 ELCEKAS CYFNC S
p3105EF2 5,602 ± 5 5,604.9 ± 1 5,604.25 ELCEKAS CYFNC S
p3105EF3 6,223 ± 6 nd 3-a 6,225.15 DVEPG QKICYFPC
Protein Fraction . Molecular Mass Determined by: . Amino Acid Sequence .
Matrix-assisted laser-desorption ionization time of flight MS . Electrospray ionization-MS . Theoretical prediction . Determined amino terminal . Predicted carboxy terminal .
D
p3105EF1 5,614 ± 5 5,608.3 ± 1 5,604.25 ELCEKAS CYFNC S
p3105EF2 5,602 ± 5 5,604.9 ± 1 5,604.25 ELCEKAS CYFNC S
p3105EF3 6,223 ± 6 nd 3-a 6,225.15 DVEPG QKICYFPC

Molecular mass (D) of DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs purified as described in Fig. 3 was determined by matrix-assisted laser-desorption-ionization time of flight or electrospray ionization-mass spectrometry (MS) and amino-terminal sequence of the same components was determined by automated Edman degradation. Also shown are the predicted carboxy-terminal sequences that give best correspondence between experimental molecular mass and theoretical molecular mass. Amino acids of the mature DmAMP1 domain are underlined, amino acids of the linker peptide are in bold, and amino acids of the mature RsAFP2 domain are italicized.

The RsAFP2-CRP fraction p3105EF3 represents an RsAFP2 derivative with the additional pentapeptide sequence DVEPG at its amino terminus, corresponding to the five carboxy-terminal amino acids of the linker peptide. This protein is further referred to as DVEPG+RsAFP2.

The different DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs purified from total leaf extract from plants transformed with construct pFAJ3105 were analyzed in the same way. The analyses indicated that the same three molecular species were present in the total leaf extract, namely DmAMP1+S, a reduced form of DmAMP1+S and DVEPG+RsAFP2 (data not shown).

In addition, DmAMP1-CRPs and RsAFP2-CRPs were also purified from extracellular fluid of plants transformed with construct pFAJ3340, the construct in which the order of DmAMP1 and RsAFP2 in the polyprotein was reversed. In this case, the molecular entities identified were authentic RsAFP2 including a pyro-Glu residue at its amino-terminus, RsAFP2 with an amino-terminal pyro-Glu and an additional carboxy-terminal Ser (RsAFP2+S), and finally DmAMP1 with an additional amino-terminal pentapeptide (DVEPG+DmAMP1 data not shown). In the plants transformed with polyprotein construct pFAJ3340, no reduced or partially reduced forms of either DmAMP1-CRPs or RsAFP2-CRPs could be detected (data not shown).

In Vitro Antifungal Activity of the Purified Proteins

The antifungal activity of the purified fractions from the extracellular fluid of plants transformed with construct pFAJ3105, containing the major processed products DmAMP1+S and DVEPG+RsAFP2, respectively, were assayed using Fusarium culmorum as a test fungus (Table IV). The specific antimicrobial activity, expressed as protein concentration required for 50% growth inhibition of the test organism, of purified DmAMP1+S appeared to be identical to that of native DmAMP1. The specific antimicrobial activity of purified DVEPG+RsAFP2, however, was about 2-fold lower relative to that of native RsAFP2. The slight drop in antimicrobial activity of DVEPG+RsAFP2 is most likely because of the presence of the five additional amino-terminal amino acids. Nevertheless, our data prove that processing of the polyprotein precursors in transgenic plants can result in the release of bioactive proteins.

Antifungal activity of the purified AMP fractions

Protein Fraction . Antifungal Activity (IC50) .
p3105EF2 3.2 ± 0.7
DmAMP1 2.8 ± 0.5
p3105EF3 3.2 ± 0.8
RsAFP2 1.7 ± 0.4
Protein Fraction . Antifungal Activity (IC50) .
p3105EF2 3.2 ± 0.7
DmAMP1 2.8 ± 0.5
p3105EF3 3.2 ± 0.8
RsAFP2 1.7 ± 0.4

Antifungal activity was determined as the concentration of protein (micrograms per milliliter) required to cause 50% growth inhibition of the fungus F. culmorum relative to a control culture. Data are given as means of triplicates with se .

Antifungal activity of the purified AMP fractions

Protein Fraction . Antifungal Activity (IC50) .
p3105EF2 3.2 ± 0.7
DmAMP1 2.8 ± 0.5
p3105EF3 3.2 ± 0.8
RsAFP2 1.7 ± 0.4
Protein Fraction . Antifungal Activity (IC50) .
p3105EF2 3.2 ± 0.7
DmAMP1 2.8 ± 0.5
p3105EF3 3.2 ± 0.8
RsAFP2 1.7 ± 0.4

Antifungal activity was determined as the concentration of protein (micrograms per milliliter) required to cause 50% growth inhibition of the fungus F. culmorum relative to a control culture. Data are given as means of triplicates with se .


Bitki və məməlilər hüceyrələri üçün güclü Cas9-dan əldə edilən gen aktivatoru

Tamamlayıcı DNT-nin həddindən artıq ifadəsi gen funksiyalarını sorğulamaq və bioloji əlamətlərin manipulyasiyası üçün ən çox istifadə edilən funksiya qazancını təmsil edir. Bununla belə, bu yanaşma klonlama üçün artan əmək, məhdud vektor tutumu, çoxsaylı promotor və terminator tələbi və dəyişən transgen ifadə səviyyələri səbəbindən multigen ifadəsi üçün çətin və səmərəsizdir. Sintetik transkripsiya aktivatorları proqramlaşdırıla bilən DNT bağlayıcı modul vasitəsilə endogen genomik lokusda nəzərdə tutulan gen promotoruna avtonom transkripsiya aktivləşdirmə sahəsini (TAD) bağlamaq yolu ilə genin aktivləşdirilməsi üçün perspektivli alternativ strategiya təqdim edir. Tanınmış xüsusi DNT bağlayıcı modullar arasında, nukleaz-ölü Streptococcus pyogenes Sintetik bələdçi RNT və DNT arasında əsas cütləşmə yolu ilə xüsusi bir DNT hədəfini tanıyan Cas9 (dCas9) zülalı sink-barmaq zülallarını və transkripsiya aktivatoruna bənzər effektorları üstələyir, hər ikisi protein-DNT qarşılıqlı əlaqəsi vasitəsilə hədəflənir 1 . Bu yaxınlarda heyvan hüceyrələri 2,3,4,5,6 üçün üç güclü dCas9 əsaslı transkripsiya aktivləşdirmə sistemi, yəni VPR, SAM və SunTag hazırlanmışdır. Bununla belə, səmərəli dCas9 əsaslı transkripsiya aktivləşdirmə platforması hələ də bitki hüceyrələri 7,8,9 üçün çatışmır. Burada biz bitki hüceyrəsi əsaslı ekranlar vasitəsilə dCas9-TV adlı yeni güclü dCas9–TAD hazırladıq. dCas9-TV, həm bitki, həm də məməli hüceyrələrində müntəzəm olaraq istifadə edilən dCas9-VP64 aktivatorundan daha güclü transkripsiya ilə tək və ya çoxlu hədəf genlərin aktivləşdirilməsini təmin edir.

Sintetik gen aktivatorları arasında dCas9-TAD-lər potensial olaraq sink-barmaq zülalı-TAD-lər və transkripsiya aktivatoruna bənzər effektor (TALE)-TAD-lər ilə müqayisədə misilsiz sadəlik və çoxalma qabiliyyəti təklif edir, çünki sintetik bələdçi RNT-lər (sgRNA) yeni hədəfləmə spesifikliyinə nail olmaq üçün asanlıqla dəyişdirilə bilər. və çoxsaylı sgRNA-lar tərəfindən idarə olunan dCas9 eyni vaxtda bir neçə müxtəlif hədəf lokusuna 10 bağlana bilər. Bununla belə, tez-tez istifadə edilən TAD 11 olan VP64 ilə dCas9 birləşməsi, bitki və məməli hüceyrələrində tək sgRNA istifadə edərək hədəf genləri zəif aktivləşdirir 7,8,9,12,13,14,15. İstifadə Ərəbidopsis protoplast əsaslı promotor-lusiferaza (LUC) analizləri ilə dCas9-VP64-ün tək sgRNA ilə yalnız zəif (maksimum 2,4 qat) və ya səmərəsiz aktivləşdirilmiş hədəf genləri olduğunu təsdiqlədik (Əlavə Nəticələr və Əlavə Şəkillər 1 və 2). Maraqlıdır ki, hədəf ardıcıllığında 5′G olmadıqda, sgRNA-nın 5′ ucuna əlavə edilmiş əlavə G-nin, ehtimal ki, sgRNA-nın transkripsiya başlamasını təşviq etməklə promotorun aktivləşdirilməsini gücləndirmək üçün (Əlavə Şəkil 1) aşkar edilmişdir. U6 təşviqatçı. Buna görə də, hədəf ardıcıllıqlar qeyri-G nukleotidlə başlayanda biz müntəzəm olaraq sgRNA-ların 5′ ucuna G əlavə edirik.


Overexpression of the Polygonum cuspidatum PcDREB2A Gene Encoding a DRE-Binding Transcription Factor Enhances the Drought Tolerance of Transgenic Arabidopsis thaliana

Plants have evolved complex signaling networks that enable them to adapt to adverse environmental conditions. The dehydration-responsive element-binding (DREB) transcription factors are important for plant responses to abiotic stresses. In this study, a new member of the AP2/ERF transcription factor gene family, PcDREB2A, was cloned and characterized from Polygonum cuspidatum, a traditional Chinese medicinal herb. PcDREB2A, which includes a typical AP2 domain, was clustered in the A-2 subgroup of the DREB subfamily. At the seedling stage, PcDREB2A expression was induced by cold, salt, and drought stresses. A yeast one-hybrid assay and an analysis of transiently transformed tobacco revealed that PcDREB2A can specifically bind to the DRE motif and transactivate reporter gene expression. Following 200 and 250 mM mannitol treatments, the PcDREB2A-overexpressing Arabidopsis thaliana lines had longer roots and a significantly higher fresh weight than the wild-type plants. Furthermore, under drought stress conditions, the PcDREB2A-overexpressing A. thaliana plants accumulated less malondialdehyde than the control plants. These results indicate that PcDREB2A encodes a novel DREB transcription factor in P. cuspidatum. Furthermore, the data generated in this study may be useful for researchers and breeders interested in genetically engineering plants to increase drought tolerance without inhibiting growth.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Improved and high throughput quantitative measurements of weak GFP expression in transgenic plant materials

Green fluorescent proteins (GFPs) are widely used in tracing transgene expression and have been known as convenient and efficient markers for plant transformation. However, sometimes researchers are still puzzled by the weak fluorescence since it makes the observation of GFP signals and confirmation of transgenic plants difficult. In this investigation, we explored the possibility of enhancing the weak signals by changing the pH environment of detection and took microplate reader as a more effective instrument compared to traditional fluorescent microscope to detect the weak signals. It was found that the fluorescence intensity of enhanced GFP (EGFP) in transgenic plants can be increased 2–6 folds by altering the environmental pH, and the concentration of EGFP at a large scale (ranged from 20 ng/ml to 20 μg/ml) can be detected and quantified. It can exclude the influence of degradation fragment and hence facilitate later analysis these advantages were further verified by comparing with western blotting and confocal microscopy. It was reliable and effective for the qualitative and quantitative analysis of transgenic plants and was more suitable for the detection of very weak fluorescent signals.

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.