Məlumat

Nanopor zənginləşdirilməsi üçün RNT və SNP-lərə rəhbərlik edin

Nanopor zənginləşdirilməsi üçün RNT və SNP-lərə rəhbərlik edin


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

gRNA ardıcıllığının hansı hissəsində SNP əldə etməmək daha vacibdir? Bilirəm ki, PAM saytında heç bir SNP ola bilməz, bəs digərləri? İkincisi, gRNA ardıcıllığında SNP-lərə sahib olmağın məqbul olduğu mövqelər varmı?


Nanopor ardıcıllığı və CIRI-uzunluğu ilə dairəvi RNT-lərin hərtərəfli profilləşdirilməsi

Qısa RNT ardıcıllığının oxunuşlarından dairəvi RNT-lərin (circRNAs) ardıcıllığının yenidən qurulması circRNA-ların və onlara uyğun xətti xəbərçi RNT-lərin oxşarlığını nəzərə alaraq çətin olduğunu sübut etdi. Əvvəlki ardıcıllaşdırma üsulları tam uzunluqlu circRNA-ların yüksək məhsuldarlıq aşkarlanmasına nail ola bilmədi. Burada biz nanopore texnologiyasından istifadə edərək circRNA izoformlarının zənginləşdirilməsi və tam uzunluqlu ardıcıllığı üçün protokolu təsvir edirik. Dairəvi tərs transkripsiya və ölçü seçimi əvvəlki üsullarla müqayisədə ümumi RNT-dən circRNA-ların 20 qat daha yüksək zənginləşməsinə nail olur. Biz circRNA-ların ardıcıllığını yenidən qurmaq üçün uzun müddət oxunan ardıcıllıq məlumatlarından (CIRI-long) istifadə edərək circRNA identifikatoru adlı bir alqoritm hazırladıq. İş axını simulyasiya edilmiş məlumatlarla və Illumina ardıcıllığı, eləcə də kəmiyyət real vaxt rejimində RT-PCR ilə müqayisə edilərək təsdiq edilmişdir. Biz CIRI-long-dan yetkin siçan beyin nümunələrini təhlil etmək və sistematik olaraq circRNA-ları, o cümlədən mitoxondriyadan əldə edilən və transkripsiya ilə oxunan sirkRNA-ları təhlil etmək üçün istifadə etdik. Biz xüsusi splicing və ifadə nümunələri nümayiş etdirən yeni növ intronik öz-özünə bağlanan circRNA müəyyən etdik. Bizim metodumuz nanopor uzun oxunuşlarından istifadə edir və tam uzunluqlu circRNA ardıcıllığının qərəzsiz yenidən qurulmasına imkan verir.


Wu, W., Ji, P. & amp Zhao, F. Genom Biol. 21, 101 (2020).

Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L. & Zhao, F. Genom Med. 11, 2 (2019).

Xin, R. et al. Nat. Kommun. 12, 266 (2021).

Çen, L. L. Nat. Rahib Mol. Hüceyrə Biol. 21, 475–490 (2020).

Logsdon, G. A., Vollger, M. R. və Eichler, E. E. Nat. Rev Genet. 21, 597–614 (2020).

Gao, Y. et al. Nat. Kommun. 7, 12060 (2016).

Zhao, Q. et al. Hüceyrə 183, 76–93.e22 (2020).

Legnini, I. et al. Mol. Hüceyrə 66, 22–37.e9 (2017).

Liu, C.-X. və b. Hüceyrə 177, 865–880.e21 (2019).


İstinadlar

Karamitros, T. və Magiorkinis, G. Oxford Nanopore MinION üçün çoxaldılmış hədəf ardıcıllığı: ətraflı kitabxana hazırlama proseduru. Metodlar Mol. Biol. 1712, 43–51 (2018).

Leija-Salazar, M. et al. Oksford Nanopore MinION istifadə edərək GBA səhv mutasiyaların və digər variantların aşkarlanmasının qiymətləndirilməsi. Mol. Genet. Genom. Med. 7, e564 (2019).

Gabrieli, T. et al. İnsanın selektiv nanopore ardıcıllığı BRCA1 xromosom seqmentlərinin Cas9 yardımlı hədəflənməsi (CATCH). Nuklein turşuları Res. 46, e87 (2018).

Giesselmann, P. et al. Qısa tandem təkrar genişlənmələrinin və onların nanopor ardıcıllığı ilə metilləşmə vəziyyətinin təhlili. Nat. Biotexnol. 37, 1478–1481 (2019).

Kozarewa, I., Armisen, J., Gardner, A. F., Slatko, B. E. & Hendrickson, C. L. Hədəf zənginləşdirmə strategiyalarına baxış. Curr. Protok. Mol. Biol. 112, 7.21.1–7.21.23 (2015).

Eberle, M. A. və başqaları. Üç nəsil 17 üzvlü damazlıq sekvensiyasından genetik irsiyyətlə təsdiqlənmiş 5,4 milyon mərhələli insan variantından ibarət istinad məlumat dəsti. Genom Res. 27, 157–164 (2017).

ENCODE Layihə Konsorsiumu. İnsan genomunda DNT elementlərinin inteqrasiya olunmuş ensiklopediyası. Təbiət 489, 57–74 (2012).

Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C. & Doudna, J. A. CRISPR RNT ilə idarə olunan endonükleaz Cas9 tərəfindən DNT sorğusu. Təbiət 507, 62–67 (2014).

Forbes, S. A. və başqaları. COSMIC: yüksək dəqiqlikdə somatik xərçəng genetikası. Nuklein turşuları Res. 45, D777–D783 (2017).

Lee, I. et al. Nanopor sekvensiyası ilə insan hüceyrə xətlərində xromatinin əlçatanlığının və metilasiyanın eyni vaxtda profilləşdirilməsi. Əvvəlcədən çap bioRxiv https://doi.org/10.1101/504993 (2018).

Messier, T. L. və başqaları. Histon H3 lizin 4 asetilasiya və metilləşmə dinamikası döş xərçənginin alt növlərini müəyyən edir. Hədəf 7, 5094–5109 (2016).

Welcsh, P. L. & amp King, M. C. BRCA1BRCA2 və döş və yumurtalıq xərçənginin genetikası. zümzümə. Mol. Genet. 10, 705–713 (2001).

Li, H. SNP çağırışı, mutasiya kəşfi, assosiasiya xəritəsi və ardıcıllıq məlumatlarından populyasiyanın genetik parametrlərinin qiymətləndirilməsi üçün statistik çərçivə. Bioinformatika 27, 2987–2993 (2011).

Luo, R. et al. Clair: Germline variant zəngi üçün yığın məlumatlarında dərin neyron şəbəkəsindən istifadə limitinin araşdırılması. Əvvəlcədən çap bioRxiv https://doi.org/10.1101/865782 (2019).

Simpson, J. T. və başqaları. Nanopor sekvensiyasından istifadə edərək DNT sitozin metilasiyasının aşkarlanması. Nat. Metodlar 14, 407–410 (2017).

Martin, M. et al. WhatsHap: sürətli və dəqiq oxuma əsaslı mərhələləşdirmə. Əvvəlcədən çap bioRxiv https://doi.org/10.1101/085050 (2016).

Tate, J. G. et al. COSMIC: xərçəngdə somatik mutasiyaların kataloqu. Nuklein turşuları Res. 47, D941–D947 (2019).

Martignano, F. et al. Prostat xərçəngində GSTP1 metilasiyası və protein ifadəsi: diaqnostik təsirlər. Dis. Markerlər 2016, 4358292 (2016).

Kabir, N. N., Rönnstrand, L. və Kazi, J. U. Keratin 19 ifadəsi döş xərçəngində zəif proqnozla əlaqələndirilir. Mol. Biol. Rep. 41, 7729–7735 (2014).

Wang, X.-M., Zhang, Z., Pan, L.-H., Cao, X.-C. və Xiao, C. KRT19CEACAM5 mRNA ilə işarələnmiş sirkulyasiya edilmiş şiş hüceyrələri döş xərçəngi xəstələrinin əlverişsiz proqnozunu göstərir. Döş Xərçəngi Res. Müalicə etmək. 174, 375–385 (2019).

Noguchi, S. et al. Əks transkriptaza-polimeraza zəncirvari reaksiya vasitəsilə aksiller limfa düyünlərində döş xərçəngi mikrometastazlarının aşkarlanması. MUC1 mRNA və keratin 19 mRNA gücləndirilməsi arasında müqayisə. am. J. Pathol. 148, 649–656 (1996).

Sedlazeck, F. J. et al. Tək molekullu ardıcıllığın köməyi ilə mürəkkəb struktur dəyişikliklərinin dəqiq aşkarlanması. Nat. Metodlar 15, 461–468 (2018).

Zook, J. M. və başqaları. Benchmark istinad materiallarını xarakterizə etmək üçün yeddi insan genomunun geniş ardıcıllığı. Sci. Data 3, 160025 (2016).

Kolmogorov, M., Yuan, J., Lin, Y. & Pevzner, P. A. Təkrar qrafiklərdən istifadə edərək uzun, səhvə meyilli oxunuşların yığılması. Nat. Biotexnol. 37, 540–546 (2019).

Vaser, R., Sović, I., Nagarajan, N. & Šikić, M. Uzun müddətdir düzəldilməmiş oxunuşlardan sürətli və dəqiq de novo genom yığılması. Genom Res. 27, 737–746 (2017).

Li, H. Minimap2: nukleotid ardıcıllığı üçün ikili düzülmə. Bioinformatika 34, 3094–3100 (2018).

Chaisson, M. J. P. və başqaları. İnsan genomlarında haplotiplə həll olunan struktur dəyişikliyinin çox platformalı kəşfi. Əvvəlcədən çap bioRxiv https://doi.org/10.1101/193144 (2018).

Audano, P. A. və başqaları. İnsan genomunun əsas struktur variantının allellərinin səciyyələndirilməsi. Hüceyrə 176, 663–675.e19 (2019).

Dixon, J. R. və başqaları. Xərçəng genomlarında struktur dəyişikliyinin inteqrativ aşkarlanması və təhlili. Nat. Genet. 50, 1388–1398 (2018).

Timp, W. & amp Feinberg, A. P. Xərçəng, ev sahibi hesabına hüceyrə böyüməsinə imkan verən nizamsız bir epigenom kimi. Nat. Rev. Xərçəng 13, 497–510 (2013).

Jeffares, D. C. et al. Keçici struktur dəyişiklikləri parçalanma mayasında kəmiyyət əlamətlərinə və reproduktiv izolyasiyaya güclü təsir göstərir. Nat. Kommun. 8, 14061 (2017).

Krueger, F. & amp Andrews, S. R. Bismark: Bisulfite-Seq tətbiqləri üçün çevik hizalayıcı və metilasiya çağırıcısı. Bioinformatika 27, 1571–1572 (2011).

Hansen, K. D., Langmead, B. və Irizarry, R. A. BSmooth: bütün genom bisulfit ardıcıllığından diferensial metilləşdirilmiş bölgələrə qədər oxunur. Genom Biol. 13, R83 (2012).


Nanopore ardıcıllığı 101 Q&As

Burada bütün sualları və cavabları tapa bilərsiniz Nanopore ardıcıllığı 101 vebinar.

1. Axın hüceyrəsini neçə dəfə təkrar istifadə edə bilərsiniz?

Bir nümunə ilə növbəti nümunə(lər)i işə salmaq arasında istifadə edə biləcəyiniz axın hüceyrəsinin yuyulması protokolu var. Axın hüceyrəsini nə qədər ciddi şəkildə yumağınızdan asılı olaraq, müştərilərin axın hüceyrəsini beş dəfə beşə qədər istifadə etdiyini gördük, axın hüceyrəsindən neçə dəfə təkrar istifadə edə biləcəyinizi gözləmək baxımından yaxşı başlanğıc nöqtəsi ola bilər. Siz həmçinin qaçışa başlamazdan əvvəl nə qədər nanoporanın sizin üçün mövcud olduğunu qiymətləndirmək üçün qaçışdan əvvəl QC platformasını işə sala bilərsiniz. Beləliklə, bir axın hüceyrəsini təkrar istifadə etmək istədiyiniz zaman, ardıcıllıq təcrübənizə başlamazdan əvvəl kifayət qədər aktiv nanoməsamələrin olub olmadığını qiymətləndirə bilərsiniz. Yuma dəstimizi Mağazadan əldə edə bilərsiniz.

2. Nanopor sekvensiya platformasının yaxşı həssaslıqla sıralaya biləcəyi keyfiyyətsiz DNT-nin maksimum konsentrasiyası nə qədərdir?

Biz bu tip sualları tez-tez alırıq, çünki müştərilər nanoporun çox kiçik olduğunu qəbul edirlər və buna görə də onların nanoməsamələri tıxanması ilə bağlı problemlər yarana bilər. Reallıqda bir nanoporun qarşısını almaq çətindir. Platformamıza tətbiq olunduğu üçün adətən molekulyar biologiyada istifadə edəcəyiniz standart DNT və RNT keyfiyyətinə nəzarət üsulları vasitəsilə müştərilərimizə rəhbərlik edirik. Beləliklə, A260/280 və A260/A230 nisbətlərinin ölçülməsi və QC üçün Bioanalizatordan istifadə sizin yüksək keyfiyyətli nümunələrə sahib olmağınıza kömək edir. Müştərilərimizə "bu, ardıcıllıqla qəbul etmək üçün yaxşı bir nümunədir, yoxsa yox?" qiymətləndirə bilmək üçün tövsiyə etdiyimiz əsas protokollar bunlardır.

3. Axın hüceyrəsini yuduqdan sonra necə saxlamağa dair xüsusi təlimatlar varmı? Və təkrar istifadə olunan axın hüceyrəsini nə qədər müddətə saxlaya bilərik?

Protokollar və reagentlər axın hüceyrələrinin yuyulması və saxlanması ilə təmin edilir - lütfən, əlavə məlumat üçün Flow Cell Wash Kit üçün Mağazaya və İcmadakı Protokol kitabxanasına baxın.

4. MinION-da neçə bakteriya genomunu ardıcıllıqla sıralaya bilərəm?

Axın hüceyrəsində işlədə biləcəyiniz nümunələrin sayı (gəlin MinION Flow Cell haqqında danışaq) həqiqətən eksperimental dizaynınızdan asılıdır. Bu suala cavab verə bilmək üçün bu, genom(lar)ın ölçüsündən və həmin genomlar üçün istədiyiniz əhatə səviyyəsindən asılı olacaq. Sadəlik üçün deyək ki, biz bir MinION Flow Cell-ə ​​baxırıq və biz təxminən 10 Gb məlumatı ardıcıllıqla və yaradırıq. Baxdığınız genomun ölçüsündən və hansı əhatə dairəsini istədiyinizdən asılı olaraq, bir axın hüceyrəsində emal edə biləcəyiniz nümunələrin sayının nə olduğunu müəyyən etmək üçün onu 10 Gb-a ayırırsınız. . Siz axın xananızdan 10 Gb-dan çox məlumat əldə etmək üçün növbəyə düşə bilərsiniz, bu o deməkdir ki, siz dayandırmaq, axın xanasını yumaq və əlavə məlumat yaratmaq üçün ondan başqa vaxt istifadə etmək üçün seçim edə bilərsiniz. Hesablama nümunəsi üçün Resurs Mərkəzində Metagenomics Başlanğıc təlimatına baxmağı təklif edirik.

5. Axın hüceyrəsinin tipik məhsuldarlığı nədir?

Bu, daxil olan DNT-nin keyfiyyətindən çox asılıdır. Yaxşı keyfiyyətli DNT ardıcıllığı olarsa, MinION Flow Cell 25 Gb-dən çox məlumat yaratmalıdır. Lütfən, axın hüceyrəsi çıxışları haqqında ətraflı məlumat üçün Məhsulun müqayisəsi səhifəsinə baxın (https://nanoporetech.com/products/comparison)

6. DNT ekstraksiya protokolları üçün tövsiyələriniz varmı?

Fantastik sualdır, çünki açıq şəkildə orada tək bir nümunə növü yoxdur! Nanopor icmasının Bilik bölməsində müxtəlif bioloji nümunələr üçün hasilat protokollarına həsr olunmuş bütöv bir bölmə var. Mən yalnız xüsusi olaraq qeyd edəcəyəm ki, siz metagenomika ilə məşğul olarkən çox diqqətli olmalısınız ki, sizdə çox “bərabər” hasilat protokolunuz olsun ki, ardıcıllıq nümunənin məzmununu dəqiq əks etdirsin və çıxardığınız protokolla çaşdırılmasın. istifadə edirlər.

7. VolTRAX kommersiya baxımından mövcuddurmu?

Bəli, VolTRAX Mağazada mövcuddur (https://store.nanoporetech.com).

8. VolTRAX cihazı ilə DNT kitabxanası hazırlamaq üçün hansı dəstdən istifadə etməliyəm?

Müxtəlif VolTRAX dəstləri Mağazada mövcuddur (https://store.nanoporetech.com) və daha çoxu tezliklə buraxılacaq.

9. R9.4 axın hüceyrəsi ilə R10.3 axın hüceyrəsi arasında fərq nədir?

Fərq hər bir axın hüceyrəsində mövcud olan nanoporlardadır. Nanopore mahiyyətcə ətraf mühitdə təbii olaraq tapılan bioloji zülaldır. Biz sistemimizdə istifadə üçün bu nanoməsamələri optimallaşdırmaq üçün daxildə çoxlu mühəndislik işləri həyata keçiririk ki, bu da daha böyük ötürmə qabiliyyəti və dəqiqliyə imkan verir. R9.4.1 nanoporası hazırda geniş istifadə olunan nanoporadır. DNT nanopordan keçərkən bir sıxılma nöqtəsi var - dəliyin daralması, cərəyanı ölçməyə imkan verir və beləliklə, real vaxtda molekulun yerdəyişməsini şərh edir. R10 seriyasında daha uzun bir barel və iki belə ölçmə imkanı verən iki sıxma nöqtəsi var. Bu, homopolimerlərin ardıcıllığı üçün fayda təmin edir - eyni bazanın bir neçə dəfə uzanması. Bu homopolimer uzanmaları təkcə bizim platformamız üçün deyil, bütün ardıcıllıq platformaları üçün çətindir. Biz aşkar etdik ki, bu ikinci sıxışdırma nöqtəsinin tətbiqi əvvəllər R9.4 seriyası ilə müqayisədə homopolimer ardıcıllığı üçün daha yaxşı uyğunluq təmin edir, biz təxminən on əsasdan ibarət homopolimer uzanmalarının çox dəqiq ardıcıllığını görməyə başlayırıq. R10.3 bu seriyadakı ən yeni nanoporedir və R10 seriyasının yüksək dəqiqliyini və artan ötürmə qabiliyyətini və tutma qabiliyyətini təmin edir.

10. Zəhmət olmasa, Cas9 protokolundan istifadə etməklə kitabxananın qurulması haqqında bizə ətraflı məlumat verə bilərsinizmi? Və hansı proqramlar üçün istifadə edilə bilər?

Cas9 PCR-siz zənginləşdirmə protokolu təxminən bir ildir mövcuddur ki, protokola İcmadakı Protokol Kitabxanasında baxmaq olar. Bu, kifayət qədər sadə protokoldur, təxminən 2 saat çəkir, lakin biz sizə lazım olan bəzi üçüncü tərəf reagentlərini birləşdirərək onu daha da sadələşdiririk - bu, tam dəst kimi tezliklə əlçatan olacaq. İstifadəçi icmamızdan Cas9 zənginləşdirilməsinin istifadəsi haqqında Resurs Mərkəzimizdə onlayn olaraq əldə edilə bilən bir neçə nəşrimiz və videomuz var.

11. Dəqiqlik qaçış boyu necə dəyişir? Dəqiqlik sabitdirmi və ya qısa oxunan ardıcıllıq texnologiyası kimi qaçış boyu azalır?

Bizim texnologiyamız yerli DNT-ni birbaşa ardıcıllıqla sıralaya bilir, burada gücləndirmə, enzimatik proseslər, flüoresan və ya başqa heç bir şeyə ehtiyac yoxdur. Molekullar məsamələrdən keçərkən biz sadəcə ion axını ölçürük. Buna görə və çox uzun molekulları tək oxunuşda ardıcıllıqla sıralaya bildiyimiz üçün, ardıcıllığın keyfiyyəti qaçış boyu eynidir, biz azalma görmürük. DNT və ya RNT molekulu nanopordan keçərkən, molekulun əvvəlində və sonunda eyni sədaqətlə bütünlükdə ardıcıllıqla sıralanır. Bir oxunuşda bir molekulun nə qədər uzunluqda ardıcıllıqla sıralaya biləcəyimiz baxımından üst limitin nə olduğunu da bilmirik ki, rekord hal-hazırda 2.44 Mb-dir.

12. Nanopor sekvensiyası ilə SNP aşkarlanması haqqında danışa bilərsinizmi?

Orada çoxlu müxtəlif növ alqoritmlər var - həm İcmadan, həm də Metrichor vasitəsilə məlumat təhlili qrupumuz tərəfindən təmin edilənlər. Bunlardan biri müştərilərə müxtəlif səviyyələrdə SNP təhlili aparmağa imkan verən Medaka proqram paketidir. Biz SNP aşkarlamasını həyata keçirə bilirik - bunu təsvir etdiyim konsensus strategiyası ilə birlikdə etmək, yəqin ki, ən yüksək dəqiqlik səviyyəsini və baxdığınız genomlardakı müxtəlif SNP-ləri müəyyən etmək imkanı verəcəkdir. SARS-CoV-2 ardıcıllığı ilə bağlı bəzi son nəşrlərin konsensus ardıcıllığında SNP-lərin identifikasiyası üçün nanopore ardıcıllığının dəqiqliyini göstərən son 18 ayda bir neçə nəşrin digər üsullarla mükəmməl uyğunluq nümayiş etdirdiyini gördük. Bunlar bizim vebsaytımızdakı Resurs Mərkəzində mövcuddur, siz həmişə [email protected] ünvanında bizimlə əlaqə saxlaya bilərsiniz.

13. Bitki virusları (10 kb) kimi qısa genomlar üçün tək axın hüceyrəsindən istifadə edərək neçə nümunəni multipleks edə bilərəm?

Bir flongle Flow Cell təxminən 1 Gb məlumat verəcəkdir, buna görə də bu, 100,000 oxunuşun 10 kb uzunluğuna ekvivalent olacaq - çox vaxt ona "100,000 X əhatə dairəsi" deyilir. 24-ə qədər viral genomu barkod edə biləcəyiniz tipik bir MinION Flow Cell, ehtimal ki, 20 Gb-dən çox və ya hər barkodlu nümunə üçün təxminən 100.000 oxunuş verəcəkdir.

14. Qeyri-kanonik metilasiyaları aşkar etmək üçün alətlərin əksəriyyəti tanınmış metilləşmələr əsasında hazırlanır. Bəzi alətlər daha çox çeviklik təklif edir, lakin yenə də qeyri-kanonik metilasiyaların aşkarlanması üçün istinad kimi xüsusi metilləşdirilmiş nümunənin istifadəsini tələb edir. Bu aberrant siqnalların metilasiyadan olduğunu fərz etsək, aberrant siqnalları asanlıqla çıxarmaq üçün hər hansı alətimiz varmı?

İşlənməmiş elektrik siqnalında qeyri-kanonik dəyişiklikləri müəyyən etmək üçün çoxlu alətlər mövcuddur. Resurs Mərkəzində sizin təsvir etdiyiniz kimi bir yanaşmadan istifadə edən bir sıra nəşrlər və alətlər mövcuddur. Xüsusi tələbləriniz varsa, əlaqə saxlamağınızı da tövsiyə edirik.

15. Veb saytınızdakı qiymət bütün başlanğıc paketin qiymətidir, yoxsa cihazın icarə qiyməti?

Əgər siz MinION-u nəzərdə tutursunuzsa, qiymət MinION daxil olmaqla Başlanğıc paketinin ümumi qiyməti və ya 1000 dollardır.

16. WIMP-də mikroorqanizmlərin taksonomiyası üçün hansı verilənlər bazalarından istifadə olunur?

WIMP Centrifuge təsnifat mühərrikinə əsaslanır.

17. Platforma portativdirsə, bu o deməkdir ki, biz cihazla səyahət edərkən sekvensiya edə bilərik?

Sequencer kosmosda, avtomobillərdə, təyyarələrdə və hətta velosipeddə istifadə edilmişdir! Baxın: https://twitter.com/ReindertN/status/1235202393467428864

18. Flongle Flow Cell MinION Axın Hüceyrəsinə əks ilə nə qədər sabitdir?

Artıq bir neçə ildir ki, biz MinION Flow Cells istehsal edirik. Biz onlara 4 C-də çatdırılma zamanı 3 ay, otaq temperaturunda isə 1 ay zəmanət veririk. Hal-hazırda Flongle Flow Cells çatdırıldıqdan sonra 4 həftə ərzində istifadə edilməlidir: https://store.nanoporetech.com/flongle-flow-cell-pack.html

20. Tarlada bitkilərin birbaşa RNT ardıcıllığını həyata keçirmək mümkündürmü? Hansı ekstraksiya və VolTRAX kitabxana dəstlərindən istifadə etməliyəm?

Bəli, birbaşa sahədə ardıcıllıqla etmək mümkündür. Ekstraksiya ilə bağlı növbəti Oksford Nanopore seminarımız olacaq. Eyni zamanda, mövcud VolTRAX dəstləri haqqında ətraflı məlumat üçün Mağazanın Nümunə Hazırlığı bölməsinə (https://store.nanoporetech.com) daxil olun.

21. “Adaptiv ardıcıllığın” necə işlədiyini izah edə bilərsinizmi? Məsələn, bir gen ailəsini ardıcıllaşdırmaq üçün istifadə edilə bilərmi?

22. VolTRAX və Oksford Nanopore "təcrübəli" protokollarına gəldikdə, onlar kitabxanaların eyni keyfiyyətini (uzunluq, paylama) və eyni ardıcıllıq nəticələrini yaradırmı?

Daxili testlərimiz böyük uyğunluq göstərir, lakin VolTRAX kitabxanalararası təkrarlanma qabiliyyətini yaxşılaşdırır.


Metodlar

Kök ucundan nüvənin izolyasiyası Ərəbidopsis

Vəhşi tip Ərəbidopsis şitillər (Col-0) məhsuldan 10 gün əvvəl 22 °C (16 saat işıq/8 saat qaranlıq) temperaturda 1/2 MS plitələrində əkilmişdir. Fidanların kök ucu bölgəsi (5 mm) kəsildi və dərhal maye azotda saxlanılan 1,5 ml RNazsız Eppendorf borusuna köçürüldü və boruda 1000 μl pipet ucu ilə incə toz halına salındı. Sonra toz 300 μl buz kimi soyuq Ekstraksiya Buferində (EB) həll edildi - 0,4 M saxaroza, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl2, 0,2% (w/v) Triton X-100, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1 × proteaz inhibitoru (Roche), 0,4 U/μl RNase inhibitoru (RNaseOUT, Thermo Fisher Scientific). Qeyri-ionik səthi aktiv maddə Triton X-100 nüvələri buraxmaq və FACS zamanı yığılmanın qarşısını almaq üçün istifadə olunur [62]. Yumşaq vertexing və inversiyadan sonra homogenat 20 μm hüceyrə süzgəcindən yeni boruya süzüldü. Qalan nüvələri yumaq üçün süzgəcə daha 400 μl EB əlavə edildi. 4 °C-də sentrifuqadan sonra, 2000g 5 dəqiqə ərzində sitoplazmik fraksiyadan RNT çirkləndiricilərinin qarşısını almaq üçün supernatant diqqətlə çıxarıldı. Pelet 2000-ci ildə 4 °C-də iki dəfə yuyuldug, 1 ml EB ilə 5 dəqiqə, sonra 500 μl EB-də yenidən suspenziya edildi. Çeşidləmə üçün nüvələr 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ilə boyandı və 70 μm nozzle ilə axın sitometrinə yükləndi. Toplama buferi kimi bir millilitr EB istifadə edilmişdir. Ümumilikdə 40.000 nüvə DAPI siqnalına və nüvə ölçüsünə əsasən çeşidləndi. Birləşmənin qarşısını almaq üçün çeşidlənmiş nüvələr 4 °C, 2000g, 5 dəq və sonra 100 μl PBST tamponunda (0,025% Triton X-100 aşağı konsentrasiyası ilə 1 × PBS) yenidən dayandırıldı. Nüvələrin keyfiyyətini yoxladıqdan və DAPI kanalından istifadə edərək mikroskop altında saydıqdan sonra 5000 nüvə 500 μl PBST tamponu ilə yeni bir boruya köçürüldü və 4 ° C-də sentrifuqa edildi, 2000g, 5 dəq. Sonra qranul 20 μl PBST tamponunda yenidən dayandırıldı və təxminən 1000 nüvə/μl qədər seyreltildi.

Endosperm nüvəsinin izolyasiyası

Endosperm əvvəllər bildirildiyi kimi təcrid edilmişdir [63, 64]. Qısaca olaraq, embriogenezin ürək mərhələsində olan 5 DAP ovulu diseksiyon mikroskop altında slaydda yerləşdirildi. Endosperm nüvələri iynə ilə deşildikdən sonra yumşaq təzyiqlə toxumdan sürüşməyə buraxıldı. Nüvələr təcrid tamponunda (0,3 M sorbitol, 5 mM MES (pH 5,7), 0,4 U/μl RNaseOUT) yenidən dayandırıldı və 10 μl pipetlə aşağı bağlanmış 1,5 ml Eppendorf borusuna köçürüldü. Sonra toplanmış nüvələr 20 μm hücrə süzgəci ilə yeni bir boruya süzüldü və sonra 4 °C-də yuyucu tampon (EB) ilə iki dəfə yuyuldu, 2000gSərbəst RNT və çirkləndiriciləri çıxarmaq üçün 5 dəq. Sonra nüvələr 100 μl PBST tamponunda yenidən dayandırıldı və 1000 nüvə/μl-ə qədər seyreltildi.

Illumina və Nanopore ardıcıllığı üçün tək nüvəli RNT-seq kitabxanasının qurulması

Kitabxanalar standart 10x Genomics protokoluna (Single Cell 3′ Reagent Kits v2 User Guide) uyğun olaraq Nanopore uzun müddət oxunan ardıcıllığı uyğunlaşdırmaq üçün dəyişikliklərlə qurulmuşdur. Kök ucu üçün əvvəlki addımdan nüvə süspansiyonu (

5000 nüvə) 10x Genomics ChIP-ə yükləndi və kitabxanalar 10x Chromium Single Cell 3′ Solution V2 dəstindən istifadə edilərək hazırlandı. Endosperm üçün,

10.000 nüvə yükləndi və kitabxana tikintisinə məruz qaldı. Tam uzunluqlu cDNA əldə etmək üçün cDNA amplifikasiyası zamanı uzanma müddətini standart 1 dəqiqədən 2 dəqiqəyə qədər uzadırıq. cDNA şablonunun yarısı istehsalçının göstərişinə uyğun olaraq Illumina kitabxanasını qurmaq üçün istifadə edildi və Illumina NavoSeq ilə ardıcıllıqla (Read1:28 əsas + Read2:150 əsaslar) şablonun digər yarısı Oxford Nanopore LSK- istifadə edərək Nanopore kitabxanasını hazırlamaq üçün istifadə edildi. 109 dəsti və MinION axını hüceyrəsində ardıcıllıqla (R9.4.1).

Illumina tək nüvəli məlumatların təhlili

Kökün xam oxunuşları standart parametrlərdən istifadə etməklə Cell Ranger (v3.1.0) tərəfindən TAIR10 istinad genomuna uyğunlaşdırılıb. Cell Ranger (v3.1.0) tək nüvəli kitabxanalarımızda intron tərkibli oxunmaların yüksək nisbətini yerləşdirmək üçün yalnız intronsuz oxunuşları hesablayır, biz hər oxunan intron bölgələrini çıxardıq və Cell Ranger tərəfindən istinad genomuna yenidən uyğunlaşdırdıq. nüvə ştrix kodunu, UMI-ni və hər bir oxunuşun müvafiq genini müəyyənləşdirin (Əlavə fayl 1: Şəkil S1). Keyfiyyətə nəzarət məqsədi ilə üçdən az nüvədə ifadə olunan genlər atıldı və gen sayı 2300-dən çox və ya 350-dən az olan hüceyrələr çıxarıldı. Illumina bolluğu matrisi daha sonra Scanpy paketindən (v1.6.0) [65] istifadə edərək normallaşdırma, log-transformasiya və miqyaslaşdırma üçün tövsiyə olunan parametrlərlə təhlil edildi. Sonra qruplaşma üçün bu bolluq matrisində əsas komponent analizi və Louvain alqoritmi istifadə edilmişdir. Sonra, hər klasterin hüceyrə tipini şərh etmək üçün kütləvi tək hüceyrəli kök məlumatında [17] müəyyən edilmiş müxtəlif hüceyrə növləri üçün marker genlərindən istifadə etdik (Əlavə fayl 2: Cədvəl S1). Biz əvvəlcə bütün hüceyrələr üçün hər bir hüceyrə tipinin hüceyrə hesabını, əvvəllər təsvir edilən üsul [66] kimi verilmiş hüceyrədə müəyyən edilmiş verilmiş marker geninin zənginləşmə dərəcəsinə əsasən hesablayırıq. Ən yüksək bal sıfırı keçərsə, xana uyğun xana tipinə aid edilir, əks halda naməlum kimi təyin edilir (Əlavə fayl 1: Şəkil S3a). Sonra, hər bir klaster ən yüksək nisbətə malik hüceyrə növü kimi qeyd edildi (Əlavə fayl 1: Şəkil S3b) və biz kütləvi tək hüceyrəli kök məlumatlarında [17] müəyyən edilmiş inkişaf mərhələsinə xas genlərdən istifadə etdik (Əlavə fayl 1: Cədvəl S1) qeyri-saç hüceyrələrini ya yetkin qeyri-saç və ya uzanan qeyri-saç hüceyrələri kimi əks etdirən qrupları əlavə şərh etmək (Əlavə fayl 1: Şəkil S3c).

Beş əvvəllər nəşr olunmuş tək hüceyrəli RNT-seq məlumatları protoplastik Ərəbidopsis 10x Genomics platformasından istifadə edərək köklər ictimai verilənlər bazalarından toplanmışdır [11, 12, 14,15,16]. Biz toplu effektləri aradan qaldırmaq və müxtəlif verilənlər dəstləri arasında uyğunlaşma xalını hesablamaq üçün Scanorama [30]-dan istifadə edirik.

Endosperm məlumatları üçün xam Illumina oxunuşları "--include-introns" parametrindən istifadə etməklə Cell Ranger (v5.0.0) tərəfindən işlənmiş və sonrakı analiz üçün yalnız gen sayı 400 ilə 3000 arasında olan nüvələrdən istifadə edilmişdir. Klasterləşdirmədən sonra, hüceyrə növlərini təyin etmək üçün lazer tutma mikrodisseksiya nümunələrinin [50, 51] mikroarray məlumatlarından müəyyən edilmiş əvvəllər bildirilmiş ürək mərhələsi toxuması ilə zənginləşdirilmiş genlərdən istifadə etdik (Əlavə fayl 2: Cədvəl S2). Biz Wilcoxon testini yerinə yetirmək üçün scanpy-nin “rank_genes_groups” funksiyasından istifadə etdik və klasterlə zənginləşdirilmiş genləri müəyyən etmək üçün “max_out_group_fraction = 0.25” və “min_ fold_change = 1.50” ilə “filter_rank_genes_groups” funksiyasından istifadə etdik. Və agriGO v2 [67] GO zənginləşdirmə təhlili üçün istifadə edilmişdir.


Müəllif məlumatı

Bu müəlliflər bərabər töhfə verdilər: Oğuzhan Begik, Morqan C. Lukas.

Əlaqələr

Genomik Tənzimləmə Mərkəzi (CRG), Barselona Elm və Texnologiya İnstitutu, Barselona, ​​İspaniya

Oğuzhan Begik, Morqan C. Lucas, Leszek P. Pryszcz, Xose Miguel Ramirez, Rebeca Medina, Ivan Milenkovic, Sonia Cruciani, Huanle Liu, Helaine Graziele Santos Vieira və Eva Maria Novoa

Garvan Tibbi Tədqiqatlar İnstitutu, Darlinghurst, NSW, Avstraliya

UNSW Sidney, Kensington, NSW, Avstraliya

Oğuzhan Begik və John S. Mattick

Universitat Pompeu Fabra (UPF), Barselona, ​​İspaniya

Morqan C. Lukas, İvan Milenkoviç, Sonia Cruciani və Eva Maria Novoa

Beynəlxalq Molekulyar və Hüceyrə Biologiyası İnstitutu, Varşava, Polşa

Weizmann Elm İnstitutu, Rehovot, İsrail

Aldema Sas-Chen və Schraga Schwartz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Töhfələr

O.B. və M.C.L. RNT hasilatı və nanopore kitabxanasının hazırlanması da daxil olmaqla əksər yaş laboratoriya təcrübələrini həyata keçirdi. O.B. və L.P.P. J.M.R. ilə birlikdə məlumatların bioinformatik təhlilini aparmışdır. və E.M.N. O.B. nanoCMC-seq təcrübələrini düşünmüş və həyata keçirmişdir. M.C.L. modifikasiyalı in vitro transkripsiya edilmiş ardıcıllıqları və onlara uyğun nanopor kitabxanalarını istehsal etmişdir. O.B. müxtəlif pseudouridin stoixiometries ilə in vitro transkripsiya edilmiş ardıcıllıqları hazırladı və ardıcıllıqla. L.P.P. O.B ilə birlikdə nanoRMS kodunu müqayisə etdi və yazdı. və E.M.N. J.M.R. in vitro transkripsiya edilmiş konstruksiyalar üzrə bioinformatik analizlər aparmış və əsas çağırış və xəritəçəkmə alqoritmlərini müqayisə etmişdir. I.M. polisom qradiyenti qurdu və onlara uyğun nanopor kitabxanalarında kömək etdi. S.C. və I.M. 2′-ni hazırladı və ardıcıllıqla sıraladı.O-metilləşmə mutant suşları. R.M. və H.G.S.V. mədəniyyətli S. cerevisiae müxtəlif stres şəraitində gərginliklər. H.L. cari intensivlik dəyərlərinin təhlili üçün kodla töhfə verdi. A.S.C. və S.S. bütün snoRNT-si tükənmiş maya mutant ştammlarını yetişdirdilər və onların ümumi RNT-lərini çıxardılar. E.M.N. layihəsini fikirləşdi. E.M.N. J.S.M.-nin köməyi ilə işə nəzarət etdi. M.C.L., O.B. və E.M.N. fiqurları qurdu. O.B., M.C.L. və E.M.N. məqaləni bütün müəlliflərin töhfələri ilə yazdı.

Müəllif


CRISPR/Cas9 əsaslı hədəf zənginləşdirmə ilə birlikdə nanopor sekvensiyası SNV-lərin, SV-lərin, metilləşmənin və əsas xərçənglə əlaqəli genlərin allel fazalarının profilini yaratmağa imkan verdi.

Uzunluğu oxuyun

Nanoporlar onlara təqdim olunan DNT və ya RNT-nin uzunluğunu oxuyur - qısadan ultra uzunluğa (ən uzun >4 Mb)

Ölçülər

Uyğun proqramlar daxildir

  • Bütün genomlar/ekzomlar
  • Metagenomika
  • Məqsədli ardıcıllıq
  • Tam transkriptom (cDNA)
  • Daha kiçik transkriptomlar (birbaşa RNT)
  • Daha kiçik nümunələr üçün çoxaltma

Yüksək məhsuldarlıq

Hər MinION Flow Cell üçün 50 Gb-a qədər / Flongle Flow Cell üçün 2,8 Gb*

* Sistem 72 saat (və ya Flongle üçün 16 saat) 420 baza/saniyədə işlədildikdə nəzəri maksimum çıxış. Çıxışlar kitabxananın növünə, işləmə şərtlərinə və s. görə dəyişə bilər.

Bağlantı

Çəkisi 100 q-dan azdır və yüksək sürətli USB 3.0 kabelindən istifadə edərək kompüterə və ya noutbuka qoşulur

Aşağı qiymət

  • İstehlak materialları daxil olmaqla 1000 dollardan başlayan Başlanğıc Paketləri
  • Kiçik testlər və analizlər üçün Flongle Flow Cells ilə uyğun gəlir
  • Daha yüksək nümunə ötürmə qabiliyyəti üçün çoxaltma dəstləri

Uzunluğu oxuyun

Nanoporlar onlara təqdim olunan DNT və ya RNT-nin uzunluğunu oxuyur - qısadan ultra uzunluğa (ən uzun >4 Mb)

Ölçülər

Uyğun proqramlar daxildir

  • Bütün genomlar/ekzomlar
  • Metagenomika
  • Məqsədli ardıcıllıq
  • Tam transkriptom (cDNA)
  • Daha kiçik transkriptomlar (birbaşa RNT)
  • Daha kiçik nümunələr üçün çoxaltma

Yüksək məhsuldarlıq

MinION Flow Cell üçün 50 Gb-a qədər / Flongle Flow Cell üçün 2,8 Gb*

* Sistem 72 saat (və ya Flongle üçün 16 saat) 420 baza/saniyədə işlədildikdə nəzəri maksimum çıxış. Çıxışlar kitabxananın növünə, işləmə şərtlərinə və s. görə dəyişə bilər.


Metilasiya, struktur variantları və mutasiyaların tədqiqi üçün Cas9 ilə hədəflənmiş Nanopore Sequencing

Nanopore sequencing texnologiyası sürətli və birbaşa yerli DNT molekullarını sorğulaya bilər. Çox vaxt biz yalnız yüksək dərinlikdə olan xüsusi sahələrin araşdırılmasında maraqlıyıq, lakin ənənəvi zənginləşdirmə üsulları bu günə qədər uzun müddət oxumaq üçün yararsız olduğunu sübut etdi 1 . Mövcud strategiyalar hazırda yüksək giriş DNT tələbləri, aşağı məhsuldarlıq, qısa (<5kb) oxunuşlar, vaxt tələb edən protokollar və/yaxud gücləndirmə və ya klonlaşdırma (əsas modifikasiya məlumatını itirmək) ilə məhdudlaşır. Bu yazıda biz Cas9-un müəyyən yerlərdə kəsiklər tətbiq etmək və nanopore Cas9 Targeted-Sequencing (nCATS) adlandırdığımız metodu birbaşa həmin saytlara bağlamaq qabiliyyətindən istifadə edən texnikanı təsvir edirik.

Biz bunu Oksford Nanopore MinION axın hüceyrəsindən (Tutum >10Gb+) istifadə edərək, zənginləşdirmədən əldə edilən 2-3X əhatə dairəsi üzərində bir neçə yüz dəfə təkmilləşən median uzunluğu 18kb olan 10 genomik lokusda median 165X əhatə dairəsi yaratmaq üçün nümayiş etdirdik. Biz daha kiçik Flongle axın hüceyrəsində (Tütim

1Gb), median uzunluğu 18kb olan 11 genomik lokusda 30X median əhatə dairəsi yaradır. Bələdçi RNT panellərindən istifadə edərək göstəririk ki, bu metodun yüksək əhatə dairəsi məlumatları bizə (1) xərçəng sürücüsü genlərində DNT metilasiya nümunələrinin profilini çıxarmağa, (2) məlum qaynar nöqtələrdə struktur dəyişikliklərini aşkar etməyə və (3) mövcudluğu araşdırmağa imkan verir. tək nukleotid mutasiyaları. Birlikdə bu, hüceyrə DNT-ni birbaşa tədqiq etmək üçün aşağı resurs parametrlərində belə tətbiq oluna bilən ucuz bir üsul təqdim edir. Bu texnika tibbi baxımdan müvafiq genləri qiymətləndirmək üçün geniş klinik tətbiqlərə malikdir və sürətli və hərtərəfli diaqnostika vasitəsi olmaq üçün çox yönlüdür. Xərçəng üçün bir model kimi yaxşı xarakterizə edilən GM12878 hüceyrə xəttini, eləcə də müxtəlif şiş törəmə potensialına malik üç döş hüceyrə xəttini (MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231) araşdıraraq bu texnikanın tətbiqlərini nümayiş etdiririk.

Töhfələr TG və WT tədqiqatı qurdular. TG təcrübələri həyata keçirdi. TG, IL və FS məlumatları təhlil etdilər. TG, JG, ER, RB və AH və metodu inkişaf etdirdi. TG və WT yazı yazdı


Əlavə fayl 1:

Şəkil S1. Qoyun və mal-qarada klonallıq pasta diaqramları. Şəkil S2. Klon spesifik PCR ilə SNP təsdiqi. Şəkil S3. Həqiqi SNP-lər və texniki artefaktlar arasında fərq. Şəkil S4. BLV proviruslarında hipermutasiya. Şəkil S5. Klon spesifik PCR ilə BLV struktur variantlarının doğrulanması. Şəkil S6. HİV-1 hüceyrə xəttində SNP və rekombinasiya U1. Şəkil S7. PCIP-seq effektivliyinin qiymətləndirilməsi. Şəkil S8. Xəstə 02006-dan HİV-1 proviruslarının nümunələri. Şəkil S9. Holşteyn mal-qarasında xolesterol çatışmazlığına səbəb olan ERV-nin yeridilməsi. Şəkil S10. Doğrulanmış BERVK2 PCIP-seq vasitəsilə müəyyən edilmişdir. Şəkil S11. ERV BTA3_115.3 LTRs APOB (BTA11_77.9) ERV ilə uyğun gəlir. Şəkil S12. Təsdiqlənmiş enJSRV. Cədvəl S1. PCIP-seq ilə ligasyon vasitəçiliyi ilə PCR və Illumina ardıcıllığının müqayisəsi. Cədvəl S2. Hər bir nümunədə müəyyən edilmiş SNP-lər. Cədvəl S3. PCIP-seq ilə müəyyən edilmiş BLV struktur variantları. Cədvəl S4. HİV-1 xəstələrinin klinik məlumatları. Cədvəl S5. BERVK2-lər mal-qarada PCIP-seq. Cədvəl S6. enJSRVs qoyunlarda PCIP-seq. Cədvəl S7. HPV18_PX və HPV18_PY xəstələrində müəyyən edilmiş HPV inteqrasiya sahələri. Cədvəl S8. BLV-də PCIP-seq səmərəliliyinin qiymətləndirilməsi. Əlavə qeyd 1. Dairəvi DNT-ni parçalamaq üçün CRISPR-cas9-dan istifadənin əsası. Əlavə qeyd 2. Əhatənin SNP çağırışına təsiri. Əlavə üsullar. Əlavə İstinadlar.

Əlavə fayl 2:

Dataset S1. 02006 və 06042 nömrəli xəstələrdə müəyyən edilmiş HİV-1 inteqrasiya sahələri.


Videoya baxın: Real-time microbial assembly using nanopore sequencing - Son Nguyen (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Rorke

    Düzgün cavab

  2. Jarrell

    Niyə qaynağınızda belə az sayda var?



Mesaj yazmaq