Məlumat

Hüceyrənin xromosomlarının yarısını təcrid etmək üçün bir üsul varmı?

Hüceyrənin xromosomlarının yarısını təcrid etmək üçün bir üsul varmı?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hər bir hüceyrədə 2N sayda xromosom var, görəsən, hazırda N sayda xromosomu təcrid etməyə imkan verən bir texnika varmı?


Maya genomik DNT-nin sürətli izolyasiyası: Bust n' Grab

Maya süni xromosomlarının (YAC) mutagenezi tez-tez düzgün hədəflənmiş mutantları əldə etmək üçün çoxlu sayda maya klonlarının təhlilini tələb edir. Maya genomik DNT-ni təcrid etməyin ənənəvi yolları maya hüceyrə divarını pozmaq üçün ya şüşə muncuqlardan, ya da fermentativ həzmdən istifadə edir. Kiçik şüşə muncuqlardan istifadə qarışıqdır, halbuki bir çox nümunənin təhlili lazım olduqda hüceyrələrin enzimatik həzmi baha başa gəlir. Biz maye mədəniyyətlərdən və ya plitələrdəki koloniyalardan maya genomik DNT əldə etmək üçün mövcud üsullardan daha asan və daha sürətli bir protokol hazırlamağa çalışdıq.

Nəticələr

Hüceyrələri pozmaq və genomik DNT-ni buraxmaq üçün lizis tamponunda hüceyrələrin təkrar dondurulması-əriməsi istifadə edilmişdir. Hüceyrə lizisi DNT-nin xloroform və etanol ilə çöküntü ilə çıxarılması ilə izlənildi. İki yüz ng – 3 mkq genomik DNT 1,5 ml gecəlik maye mədəniyyətdən və ya böyük bir koloniyadan təcrid edilə bilər. Nümunələr ya Southern blot hibridizasiyası üçün məhdudlaşdırıcı ferment/RNase kokteyl qarışığında birbaşa dayandırılmış və ya bir neçə PCR reaksiyası üçün istifadə edilmişdir. Biz mutagenləşdirilmiş insan β-qlobin lokusu YAC olan maya klonlarının təhlilini göstərməklə bu metodun faydalılığını nümayiş etdirdik.

Nəticə

Maya genomik DNT-ni maye kulturalardan və ya birbaşa koloniyalardan əldə etmək üçün səmərəli, ucuz üsul işlənib hazırlanmışdır. Bu protokol fermentlərin və ya şüşə muncuqların istifadəsindən yayınır və buna görə də çoxlu sayda nümunələri emal edərkən yerinə yetirmək daha ucuz və asandır.


Nuklein turşularının izolyasiyası

Nuklein turşularını öyrənmək və ya manipulyasiya etmək üçün əvvəlcə hüceyrələrdən DNT çıxarılmalıdır. Müxtəlif DNT növlərini çıxarmaq üçün müxtəlif üsullardan istifadə olunur (Şəkil 2). Nuklein turşusunun çıxarılması üsullarının əksəriyyəti hüceyrəni açmaq üçün addımları və sonra bütün arzuolunmaz makromolekulları məhv etmək üçün enzimatik reaksiyaların istifadəsini əhatə edir. Hüceyrələr tamponlayıcı birləşmələri ehtiva edən bir yuyucu məhluldan istifadə edərək açılır. Deqradasiya və çirklənmənin qarşısını almaq üçün zülallar və RNT kimi makromolekullar fermentlərdən istifadə edərək inaktivləşdirilir. Daha sonra DNT spirt istifadə edərək məhluldan çıxarılır. Yaranan DNT, uzun polimerlərdən ibarət olduğu üçün jelatinli kütlə əmələ gətirir. Bu üsul hüceyrədəki bütün nuklein turşusunu çıxarır. Bura daxildir genomik DNT (genomdakı bütün DNT), eləcə də RNT. Bu DNT əlavə tədqiqat üçün istifadə olunsaydı, RNT onu çıxarmaq üçün çox vaxt fermentlə həzm olunardı.

RNT hüceyrələrdə gen ifadə nümunələrini anlamaq üçün öyrənilir. RNT təbii olaraq çox qeyri-sabitdir, çünki RNT-ni parçalayan fermentlər təbiətdə adətən mövcuddur. Bəziləri hətta öz dərimiz tərəfindən ifraz olunur və onları təsirsiz hala gətirmək çox çətindir. DNT ekstraksiyasına bənzər olaraq, RNT hasilatı digər makromolekulları təsirsiz hala gətirmək və yalnız RNT-ni qorumaq üçün müxtəlif tamponların və fermentlərin istifadəsini nəzərdə tutur.


Fərdlər arasında genetik xəritə dəyişikliyi: fərdiləşdirilmiş genetik xəritələr üçün motivasiya

Genetik xəritələr əhalinin orta göstəriciləridir və fərdiləşdirilərsə, hər iki fərd arasında fərqlənə bilər. Bu fərqlər iki səbəblə əlaqələndirilə bilər ki, bunların hər ikisi təhlili çətinləşdirir: (1) onların xromosomları arasında struktur dəyişkənliyi var və (2) onların gametlərində krossover paylanmalar genetik tənzimləmə səbəbindən fərqlənir.

Krossover qaynar nöqtənin lokalizasiyası

Krossoverlərin paylanması xromosomlar arasında homojen deyil, eyni dərəcədə xromosom qolunu nəzərdən keçirərkən və ya yüzlərlə nukleotid miqyasına qədər diqqət mərkəzindədir. Krossover paylanmalarının heterojenliyinə dair tədqiqatlar insanlarda və siçanlarda krossover qaynar nöqtələrin əsas determinantı kimi PRDM9-un əlamətdar müstəqil kəşflərinə səbəb oldu. Müxtəlif allellər PRDM9, və meyotik rekombinasiyanı başlatmaq üçün bağlandığı 13-mer əhəmiyyətli bir hissəni izah edə bilər (

Populyasiyalar arasında müqayisə zamanı genomda krossover qaynar nöqtənin lokalizasiyasının 40%-i [11,12,13,14,15,16,17]. Əlavə tədqiqatlar, krossover paylanmalardakı variasiyanı şəxsiyyətlərarası heterojenlik səviyyəsinə qədər tədqiq etməyə davam etdi [17,18,19,20,21].

Heteroxiasmiya

Çarpaz paylanmalardakı fərqlər erkək və dişi [12, 22, 23] və hətta hermafrodit bitkilərinin erkək və dişi orqanları [24] arasında da mövcuddur. Bundan əlavə, insan genomunun müxtəlif bölgələrində cinsə xas rekombinasiya qaynar nöqtələrinin çoxluqları aşkar edilmişdir [12, 21, 25, 26]. Kişi rekombinasiyası genlərin və telomer bölgələrinin ekzonlarında daha tez-tez baş verir, qadınlarda isə daha yüksək nisbətdə krossoverlər genlər arasında və promotor bölgələrdə baş verir [12, 21]. Bundan əlavə, sağ qalan qərəzliyi kimi digər amillər də rol oynayır. Məsələn, yaşlı anaların uşaqları gənc anaların uşaqları ilə müqayisədə daha yüksək krossover göstəricilərinə malikdirlər, bu, "əlavə" krossoverlərin bivalentlərin saxlanmasına kömək etdiyi və öz növbəsində qeyri-dizyunksiyadan qoruduğu fikri ilə uyğundur [27]. Bu, fərdlərarası krossover variasiyanı öyrənmək üçün təkmilləşdirilmiş alətlərdən faydalanacaq tədqiqat sahəsidir.

Genomik struktur dəyişikliyi

Struktur variasiya (SV) tərifinə görə genetik və fiziki xəritənin marker sıralamasında dəyişiklikdir (Şəkil 1c). SV-lər xromosom miqyaslı dəyişikliklərdən daha kiçik inversiyalara, dublikasiyalara, daxiletmələrə, silinmələrə və translokasiyalara qədər dəyişə bilən genomik dəyişikliklərdir. Tarixən, xromosom miqyaslı SV-lər sitogenetik yanaşmalarla aşkar edilmişdir və hələ də yalnız bir neçə meqabaza ölçüsündə görünə bilər. Krossoverləri ölçməklə inversiya kimi SV-ni aşkar etmək üçün ortoqonal yanaşma yalnız markerlərin yenidən sıralanması ilə həll edilə bilən marker əlaqəsindəki dəyişiklikləri müşahidə etməklə mümkündür. Bununla belə, yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı və hesablama metodlarında irəliləyişlər aşkarlama və kəsilmə nöqtəsinin həllini təkmilləşdirir [28].

SV-nin minimum ölçüsü bəzən > 50 bp dəyişikliklərə istinad edərək ixtiyari olur, lakin SV-lər yüzlərlə baza cütündən çox meqabaza miqyasına qədər ölçü diapazonlarında istənilən iki fərd arasında üstünlük təşkil edir [29,30,31,32,33]. Hal-hazırda sağlam insanlarda müəyyən edilmiş SV-lərin ən əhatəli siyahılarından biri insan genomlarının de novo faza yığılması üçün bir neçə müasir ardıcıllıq texnologiyalarını birləşdirərək, hər genom üçün > 27,000 SV və > 150 inversiyanı müəyyən etməklə əldə edilmişdir [34].

Mövcud qısa və uzun oxunan ardıcıllıq texnologiyaları ilə belə, SV aşkarlanması 100 kb-dən yuxarı çətinləşir [34, 35]. Məsələn, inversiya kəsilmə nöqtələri adətən böyük təkrarlanan bölgələrdə yerləşdiyindən və onların aşkarlanması üçün lazım olan krossoverləri yatırdığından inversiyaları müəyyən etmək çətin olaraq qalır [34].

Fərqli texnologiyalar SV aşkarlanmasında müxtəlif üstünlüklər təklif edən verilənlər bazası yaradır. Qısa oxunan ardıcıllıq yüksək tək nükleotid dəqiqliyinə malikdir, lakin PCR gücləndirilməsi və daha qısa oxu uzunluqları sayəsində böyük təkrarlanan ardıcıllıqla aşağı xəritələnmə qabiliyyətinə görə SV-lərin aşkarlanmasında aşağı həssaslıq və daha yüksək yalan-müsbət nisbətə malikdir [34, 36]. Uzun oxunan texnologiyalar, daha uzun ardıcıllıqları (2 Mb-a qədər) əhatə etmə qabiliyyəti sayəsində qısa oxunan ardıcıllıqla istifadə edərək SV-lərin tədqiqindəki çatışmazlıqları qismən aradan qaldıra bilər [37, 38]. Qısa oxunan platformalara nisbətən daha yüksək nukleotid xətası dərəcəsi müəyyən tətbiqlər üçün uzun oxunan platformaların qəbulu üçün maneə olmuşdur, lakin dəqiqlikdəki son təkmilləşdirmələr SV-lərin gələcəyə çağırılmasında uzun müddət oxunan ardıcıllığın mühüm rolunu təklif edir [38, 39,40,41].

Struktur variasiyanın nümunələri və paylanmasının başa düşülməsi klinik tətbiqlər üçün klinik diaqnostik test məlumatlarının müvafiq şərhini asanlaşdıra bilər və daha geniş şəkildə, xəstəlik geninin xəritələşdirilməsini təkmilləşdirə bilər. Biz təxmin edirik ki, haplotiplə həll edilmiş fərdi və ya “fərdiləşdirilmiş” genomlar, SV ilə sağlamlıq arasındakı əlaqə bu gün gen funksiyası və xəstəliyin olduğu ilə müqayisə edilə bilən bir nöqtəyə qədər irəlilədikcə klinik cəhətdən daha aktual və faydalı olacaqdır.

IMap

Eukariotlarda hər meioz üçün krossoverlərin sayı azdır, buna görə də yüksək sıxlıqlı genetik xəritə yaratmaq üçün çoxlu sayda ardıcıl gametlər tələb olunur. Tək hüceyrəli ardıcıllıq, iMap adlandırdığımız fərdi genetik xəritə yaratmaq üçün bir şəxsdən çox minlərlə genetik unikal gametin təhlilinə imkan verir. iMap az nəsli olan bir çox insan ailələrinin genotiplənməsi problemini dəf edir (Şəkil 2). İstənilən cinsi çoxalma növündə iMap qurmağın potensial faydaları əhəmiyyətlidir. İnsan tədqiqatı üçün bu, orta uzun oxunuş uzunluqları və sitogenetik ayırdetmə, məsələn, 50 kb-dan 3 Mb/s arasında çətin ölçü diapazonlarında struktur dəyişikliyinin aşkar edilməsini asanlaşdıracaq. Beləliklə, iMap genomun tamamlanması və boşluqların bağlanması üçün tamamlayıcı bir vasitə kimi istifadə edilə bilər. iMap yanaşmasının üstünlüyü bir fərddən on minlərlə nümunəni təhlil etmək qabiliyyəti ola bilər və ardıcıllıq xərcləri azaldıqca daha çox ola bilər. Buna görə də, son dərəcə aşağı krossover sürətinə malik olan genomik bölgələrin, məsələn, sentromerik bölgələrin yığılması hələ də çətin olacaq, lakin bir çox gametləri təhlil edərək, tədqiqatçılar boşluqların bağlanmasına kömək etmək üçün istədiyiniz rekombinantların tapılma ehtimalını artıra bilərlər. İnsan tədqiqatından başqa, ümumi laboratoriya heyvanları ilə, etik təsirlər müsbətdir, çünki genetik xəritə minlərlə deyil, bir heyvandan qurula bilər. Bu yanaşma heyvanların saxlanması xərclərini də azaldacaq. Bundan əlavə, ekzotik və nəsli kəsilməkdə olan növlər üçün bu texnologiyaların nəticədə sürətli de novo genetik xəritə qurulması kimi faydalar gətirəcəyini düşünürük.

Nəsil əsaslı xəritələr və iMap. Genetik xəritələr damazlıq məlumatlardan istifadə edərək de novo tərtib edilə bilər. Fərdiləşdirilmiş genetik xəritələr gametdən əldə edilən ardıcıllıq məlumatlarından əldə edilə bilər

Xromosomların sayı və ploidi artdıqca, genetik xəritənin qurulması üçün əlaqəli markerləri tapmaq çətinliyi də artır. Gamete-dən əldə edilən iMaps, genom montaj alət dəstində qiymətli komponent təklif edir. Ərik ilə konsepsiyanın əhəmiyyətli bir sübutu haploid gametləri ardıcıllıqla sıralamaq üçün bir damcı kapsülləmə texnikasından istifadə etdi [42]. 445 gametdən istifadə edərək, SNP-lər genetik əlaqədən istifadə edərək mərhələli oldu. Sonra, uzun müddət oxunan toplu ardıcıllıqlar onların uyğun haplotiplərinə uyğunlaşdırıldı. Bir sıra ortoqonal yanaşmalar dəqiq de novo genom yığıncağının yaradıldığını təsdiqlədi. İnanırıq ki, belə bir yanaşma 42 xromosomlu 17 Gb alloheksaploid çörək buğdası kimi böyük, mürəkkəb və iqtisadi cəhətdən əhəmiyyətli genomları ardıcıllıqla sıralayan konsorsiumlara kömək etməlidir [43,44,45,46,47]. Nəhayət, eyni ərik haploidi qısa oxunan verilənlər bazası aşağı tezliklərdə allel olmayan meiotik krossoverləri də aşkar etdi ki, bu da bütün növlərdən olan fərdlərdə gələcək məhsuldarlıqla bağlı faydalı tətbiqləri açır. Qısa oxunan texnologiyalar təkbaşına yüksək səviyyəli dublikasiyaya malik növlərin genomunu dəqiq aşkarlaya və yığa bilməz və buna görə də genom yığılması inteqrasiya olunmuş yanaşma tələb edir.


Xromosom balanssızlığı ilə bağlı araşdırmalara öncülük edən hüceyrə bioloqu Anjelika Amon 53 yaşında vəfat edib.

Biologiya professoru və Koch İnteqrativ Xərçəng Araşdırmaları İnstitutunun üzvü Angelika Amon yumurtalıq xərçəngi ilə iki il yarım davam edən mübarizədən sonra oktyabrın 29-da 53 yaşında vəfat edib.

MİT prezidenti L. Rafael Reif məktubunda yazır: "Qeyri-adi elmi anlayışı və elmin ən dərin suallarına yoluxucu həvəsi ilə tanınan professor Amon qeyri-adi karyera qurdu - və bu prosesdə həmkarları, tələbələri və dostlarından ibarət sadiq bir cəmiyyət". MİT icmasına.

MIT-də Biologiya professoru və Kox İnstitutunun direktoru Tayler Ceksi əks etdirən “Anjelika təbiətin qüvvəsi və cəmiyyətimizin yüksək dəyərli üzvü idi”. “Onun intellekti və ağlı eyni dərəcədə kəskin idi və etdiyi hər şeyə misilsiz ehtiras gətirirdi. Təməlqoyma aparan tədqiqatları, bir çox insana mentorluğu, tədrisi və bir sıra digər töhfələri ilə Anjelika dünyaya inanılmaz təsir bağışladı – bu, gələcəkdə uzun müddət davam edəcək”.

Hüceyrə biologiyasında qabaqcıl

Karyerasının ən erkən mərhələlərindən etibarən Amon hüceyrənin əsas biologiyasını anlamaqda, maya, siçan və məməli orqanoidlərində hüceyrə bölünməsini və çoxalmasını tənzimləyən tənzimləyici şəbəkələri deşifrə edərək və xromosomların yaranma səbəblərini işıqlandırmaqda böyük töhfələr vermişdir. yanlış seqreqasiya və onun insan xəstəlikləri üçün nəticələri.

İnsan hüceyrələrində 23 cüt xromosom var, lakin onlar bölündükcə çox və ya çox az xromosoma gətirib çıxaran səhvlər edə bilərlər ki, bu da anevloidiya ilə nəticələnir. Amonun əvvəlcə maya, sonra isə məməlilər hüceyrələrində apardığı vasvası və ciddi təcrübələr həddən artıq çox xromosomun bioloji nəticələrini üzə çıxarmağa kömək etdi. Onun araşdırmaları müəyyən etdi ki, əlavə xromosomlar hüceyrənin tərkibinə əhəmiyyətli dərəcədə təsir edir, zülalların qatlanması və maddələr mübadiləsi kimi mühüm proseslərdə stress yaradır və xərçəngə səbəb ola biləcək əlavə səhvlərə səbəb olur. Anevloidiya nəticəsində yaranan stress hüceyrələrin yaşamaq və çoxalma qabiliyyətinə təsir etsə də, demək olar ki, universal anevloid olan xərçəng hüceyrələri nəzarətsiz şəkildə böyüyə bilər. Amon göstərdi ki, aneuploidiya hüceyrələrin adi səhv təmir sistemlərini pozaraq, genetik mutasiyaların tez bir zamanda yığılmasına imkan verir.

Aneuploidiya adətən ölümcül olur, lakin bəzi hallarda xüsusi xromosomların əlavə nüsxələri Daun sindromu və Patau və Edvards sindromları kimi tanınan inkişaf pozğunluqları kimi vəziyyətlərə səbəb ola bilər. Bu, Amonu bu mənfi təsirlərin kəskin limfoblastik leykemiya kimi xüsusilə Daun sindromu ilə əlaqəli bəzi sağlamlıq problemlərinə necə səbəb olduğunu anlamaq üçün işləməyə vadar etdi. Onun bu sahədəki təcrübəsi onu MIT-də bu yaxınlarda yaradılmış Alana Daun Sindromu Mərkəzinin həm-direktoru təyin etməyə vadar etdi.

“Anjelikanın intellekti və araşdırması onun cəsarəti və ruhu qədər heyrətamiz idi. Onun laboratoriyasının anevloidiya üzrə fundamental işi bizim mərkəzin yaradılmasının ayrılmaz hissəsi idi” deyə Nevrologiya üzrə Picower professoru və Alana Daun Sindromu Mərkəzinin həm-direktoru Li-Huei Tsai deyir. "Onun insan sağlamlığı üçün anevloidiyanın saysız-hesabsız nəticələrini araşdırması həyati əhəmiyyətli idi və elmi və tibbi tədqiqatlara rəhbərlik etməyə davam edəcəkdir."

Amon laboratoriyasında aparılan tədqiqatların digər əsas diqqəti hüceyrələrin necə böyüməsi, bölünməsi və yaşlanması arasındakı əlaqədir. Digər anlayışlar arasında, bu iş hüceyrələrin müəyyən bir böyük ölçüyə çatdıqdan sonra çoxalma qabiliyyətini itirdiyini və hüceyrə dövrünə yenidən daxil ola bilməyəcəyini ortaya qoydu. Bundan əlavə, bu artım qocalmağa, geri dönməz hüceyrə dövrünün dayanmasına və toxuma yaşlanmasına kömək edir. Əlaqədar işdə Amon kök hüceyrə ölçüsü, kök hüceyrə funksiyası və toxuma yaşı arasındakı əlaqələri araşdırdı. Laboratoriyasının araşdırmaları, hematopoetik kök hüceyrələrdə kiçik ölçülərin hüceyrələrin fəaliyyət göstərmə və çoxalma qabiliyyəti üçün vacib olduğunu aşkar etdi - əslində o, bu həftənin əvvəlində bioRxiv-də son tapıntıları dərc etdi - və eyni sualları epitel hüceyrələrində də araşdırdı.

Amon laboratoriya təcrübələri biologiyanın mexanikasını dərindən araşdıraraq müşahidələrinin arxasında duran mexanizmləri anlamağa çalışdı. Bu işi dəstəkləmək üçün o, Koch İnstitutundakı həmkarları tərəfindən hazırlanmış yanaşma və texnologiyalardan, o cümlədən Yılmaz Laboratoriyası tərəfindən hazırlanmış mürəkkəb bağırsaq orqanoidi və siçan modellərindən və Manalis Laboratoriyası tərəfindən fiziki xüsusiyyətlərin ölçülməsi üçün hazırlanmış mikrofluidik cihazdan istifadə etmək üçün tədqiqat əməkdaşlıqları qurdu. tək hüceyrələr.

Kəşf həyəcanı

1967-ci ildə anadan olan Amon Avstriyanın paytaxtı Vyanada altı nəfərlik ailədə böyüyüb. Üç kiçik bacısı ilə bütün günü çöldə oynayan o, biologiyaya və heyvanlara erkən sevgini inkişaf etdirdi. O, biologiya ilə maraqlanmadığı, əvvəlcə zooloq olmaq istədiyi vaxtları xatırlaya bilmirdi. Lakin orta məktəbdə o, 1950-ci illərin xromosom seqreqasiyası ilə bağlı köhnə ağ-qara filmi gördü və bacı xromatidlərin bir-birindən ayrıldığı anı nəfəs kəsici tapdı. O, hüceyrənin daxili quruluşunu öyrənmək istədiyini o zaman anladı və Avstriyanın Vyana Universitetində genetika ilə məşğul olmaq qərarına gəldi.

Bakalavr dərəcəsini aldıqdan sonra Amon orada doktorluq işini Molekulyar Patologiya Elmi-Tədqiqat İnstitutunda professor Kim Nasmitin rəhbərliyi altında davam etdirərək 1993-cü ildə elmlər namizədi alimlik dərəcəsini qazanmışdır. O, ilk vaxtdan hüceyrə dövriyyəsi dinamikası sahəsinə mühüm töhfələr vermişdir. Onun Nasmyth laboratoriyasında maya genetikası üzərində apardığı iş hüceyrə dövrünün bir mərhələsinin növbəti mərhələ üçün necə qurulduğuna dair böyük kəşflərə gətirib çıxardı ki, siklinlər mitoza girərkən hüceyrələrdə toplanan zülallar hüceyrələr mitozdan keçməzdən əvvəl parçalanmalıdırlar. G1, hüceyrə böyüməsi dövrü.

Doktoranturasının sonuna yaxın Amon meyvə milçəkləri genetikası ilə maraqlandı və o zaman MİT-in professoru və Whitehead İnstitutunun üzvü Rut Lehmanın əsərlərini oxudu. Lehmanın genetik yanaşmasının zərifliyindən təsirlənərək, müraciət etdi və laboratoriyasına qəbul edildi. 1994-cü ildə Amon ABŞ-a gəldi, onun daimi evinə çevriləcəyini və ya nəhayət professor olacağını bilmədi.

Amonun meyvə milçəkləri genetikası ilə sevgi münasibəti qısa olsa da, onun vədi indi Whitehead İnstitutunun direktoru olan Lehmanna dərhal aydın oldu. “Anjelikanı laboratoriyama qoşulmaq üçün Vyanadan uçarkən hava limanından götürməyi heç vaxt unutmayacağam. Uzun səfərə baxmayaraq, o, enerji ilə dolu idi, elmlə danışmağa hazır idi "dedi Lehmann. "O, yeni sahədəki bütün sənədləri oxumuş və əsas nöqtələrə bərabər şəkildə vurmaq üçün nəticələri kəsmişdi."

Amma Amon tez-tez “maya səni korlayacaq” deməyi xoşlayırdı. Lehmann izah edir ki, “onlar çox sürətli böyüdükləri və çoxlu alətlər olduğu üçün” sizin beyniniz yeganə məhdudiyyətdir”. Mən onu yavaş böyüyən sevimli orqanizmimin gözəlliyinə və üstünlüklərinə inandırmağa çalışdım. Ancaq sonda maya qalib gəldi və Angelika hüceyrələrin necə bölünməsinə verdiyi çoxsaylı töhfələrdən başlayaraq və daha yaxınlarda hüceyrə anevlodiya proqramını kəşf etmək üçün əlamətdar bir iş qurmağa davam etdi.

1996-cı ildə, Lehmann Nyu York Universitetinin Skirbol İnstitutuna getdikdən sonra Amon, öz tədqiqatlarını aparmaq üçün son PhD resursları və mentorluq təklif edən nüfuzlu bir proqram olan Whitehead Fellow olmağa dəvət edildi. Onun maya hüceyrələrinin hüceyrə dövrü boyunca necə irəlilədiyi və xromosomlarının necə bölündüyü sualı üzərində apardığı iş onun dünyanın aparıcı genetikçilərindən biri olmasında mühüm rol oynayacaq.Whitehead-də olarkən, onun laboratoriyası Cdc14 adlı fermentin hüceyrələrin mitozdan çıxmasında rolu ətrafında əsas tapıntılar etdi, o cümlədən ferment nüvə adlı hüceyrə bölməsində sekvestr edilir və hüceyrə çıxmadan əvvəl buraxılmalıdır.

Kəşf zamanı Amon laboratoriyasında postdok, hazırda isə Avropa Molekulyar Məktəbində dosent olan Rosella Visintin deyir: “Mən onunla “evrika anını” bölüşmək şanslı olanlardan biri idim” dedi. Milanda tibb. “Onun çoxu var idi. Çoxumuza yalnız birini almaq şanslıdır, mən də şanslılardan biri idim. Mən onun Cdc14 lokalizasiyasını ilk dəfə görəndə onun təbəssümünü və fəryadını heç vaxt unutmayacağam - bütün Whitehead İnstitutu da unutmayacaq: "Sən bunu etdin, bunu etdin, başa düşdün!" Ehtiras, həyəcan, sevinc - hər şey o qışqırıqda."

1999-cu ildə Amonun Whitehead Fellow kimi işi ona MIT Biologiya Departamentində və Koch İnstitutunun sələfi olan MIT Xərçəng Araşdırmaları Mərkəzində fakültə vəzifəsi qazandırdı. 2007-ci ildən tam professor, o, həmçinin Xərçəng Araşdırmaları üzrə Ketlin və Körtis Mərmər Professoru, MİT-də Paul F. Qlenn Yaşlanma Tədqiqatları Biologiyası Mərkəzinin direktor müavini, MIT-də Lüdviq Molekulyar Onkologiya Mərkəzinin üzvü və Howard Hughes Tibb İnstitutunun müstəntiqi.

Onun qabaqcıl tədqiqatları 2003-cü il Milli Elm Fondu Alan T. Waterman Mükafatı, 2007-ci ildə Xərçəng Araşdırmaları üzrə Paul Marks Mükafatı, 2008-ci il Milli Elmlər Akademiyasının (NAS) Molekulyar Biologiya üzrə Mükafatı və 2013-cü ildə Ernst də daxil olmaqla bir sıra mükafat və fəxri adlarla təltif edilmişdir. Tibb üzrə Jung Mükafatı. 2019-cu ildə o, Həyat Elmləri üzrə Sıçrayış Mükafatını və Biotibbi Elm üzrə Vilcek Mükafatını qazandı və Nyu Yorkun Karnegi Korporasiyasının Böyük Mühacirlərin, Böyük Amerikalıların illik siyahısına daxil edildi. Bu il ona İnsan Sərhəd Elmi Proqramı Nakasone Mükafatı verildi. O, həmçinin NAS və Amerika İncəsənət və Elmlər Akademiyasının üzvü idi.

İrəli yol işıqlandırır

Amonun əzmkarlığı, dərin marağı və kəşfə olan həvəsi ona müəllim, mentor və həmkar rollarında yaxşı xidmət edirdi. O, dünyanın bir çox laboratoriyaları ilə işləmiş və dərin elmi əməkdaşlıq və dostluq şəbəkəsini inkişaf etdirmişdir. O, seminarlar və qatıldığı bir çox konfranslar üçün axtarılan məruzəçi idi. MIT-də professor kimi 20 ildən çox müddət ərzində o, 80-dən çox postdok, aspirant və bakalavrlara mentorluq etmiş və Elmlər Məktəbinin bakalavr müəllimlik mükafatını almışdır.

Praecis Biologiya Professoru və MİT-in Biologiya Departamentinin rəhbəri Alan Qrossman deyir: "Anjelika heyrətamiz, enerjili, ehtiraslı və yaradıcı alim, çoxları üçün görkəmli mentor və əla müəllim idi". "Onun təsiri və irsi toxunduğu hər kəs tərəfindən yaşayacaq və əbədiləşdiriləcəkdir."

Amonun keçmiş aspirantlarından biri və hazırkı Whitehead Fellowu Kristin Knouse izah edir: "Anjelika özünəməxsus bir liqada mövcud idi". “O, ilk dəfə pipetka götürən birinin enerjisinə və həyəcanına, ancaq onilliklər ərzində bunu edən birinin parlaqlığına və müdrikliyinə sahib idi. Onun yoluxucu enerjisi və parlaq zehni sərhədsiz ürək və mətanətlə uyğunlaşdı. O, hər hansı bir məlumatı nəzərdən keçirə və dərhal başqa heç bir ağlın ağlına gəlməyəcək kəskin bir fikir verə bilərdi. Onun müsbət atributları yoluxucu idi və onunla hər hansı qarşılıqlı əlaqə, nə qədər keçici olsa da, şübhəsiz ki, özünüz və elminiz haqqında daha yaxşı hiss etdiniz.

Gənc alimlərə öz “evrika anlarını” tapmaqda kömək etməkdən böyük həzz alan Amon elm, qadınların və azlıqların hüquqlarının qorxmaz müdafiəçisi idi və başqalarını da mübarizə aparmağa ruhlandırırdı. O, tədqiqatları və inandığı səbəbləri dəstəkləməkdən çəkinmirdi. O, gənc qadın alimlər üçün nümunə idi və kişilərin üstünlük təşkil etdiyi bir sahədə onlara saysız-hesabsız mentorluq və rəhbərlik etməyə sərf etdi. O, elm sahəsində qadınlara verilən mükafatları, o cümlədən Vanderbilt Mükafatını və Hüceyrə Biologiyası üzrə Qadınlar Mükafatını lütfkarlıqla qəbul etsə də, o, qadınların elmi töhfələrindən çox, qadınlara yönəldilmiş mükafatların dəyərini şübhə altına aldı.

“Anjelika Amon ruhlandırıcı lider idi,” Lehmann qeyd edir, “yalnız qabaqcıl elmi ilə deyil, həm də cəmiyyətimizdə cinsiyyətçilik və digər məzhəbləri çağırmaqda qorxmazlığı ilə. Onun valehedici gülüşü və sarsılmaz mentorluğu və rəhbərliyi həm tələbələr, həm də müəllimlər tərəfindən darıxacaq. MIT və elm ictimaiyyəti nümunəvi bir lider, mentor, dost və menschini itirdi.

Amonun geniş marağı onu öz sahəsindən kənarda yeni ideyalar üzərində düşünməyə vadar etdi. Son illərdə o, dinozavrlara və fosillərə məhəbbətini inkişaf etdirdi və tez-tez digər planetlərdə həyatın uğuru üçün vacib hesab etdiyi terraformasiyanı öyrənmək istədiyini qeyd etdi.

"Anjelika ilə elm haqqında danışmaq həmişə heyrətamiz idi, çünki onun maraqları çox dərin və geniş idi, intellekti çox kəskin idi və həvəsi o qədər yoluxucu idi" deyə Biologiya kafedrasının müəllimi və Amonun doktorluqdan sonrakı dostu olan Vivian Siegel xatırlayır. günlər. "Laboratoriyadakı öz işindən əlavə, o, dinozavrlar da daxil olmaqla, qızlarını qazıntıya aparmağı xəyal edən liken və hətta Marsdakı həyat da daxil olmaqla bir çox şeyə heyran idi."

Biologiya professoru və Koch İnstitutunun üzvü Frank Solomon deyir: "Anjelika elm və alimləri işıqlandırdı". "Və o, ətrafdakı insanları istiləşdirdi və dost olmağın nə demək olduğunu genişləndirdi."

Amondan həyat yoldaşı Yohannes Veys, qızları Tereza və Klara Veys, üç bacısı və ailələri qalıb.


Klark və Karbon tərəfindən maya sentromerinin kəşfinin/izolyasiyasının ildönümü

İlk sentromer 35 il əvvəl Louise Clarke və John Carbon tərəfindən tumurcuqlanan mayadan təcrid edilmişdir. Onlar öz səyahətlərinə ibtidai molekulyar alətlərlə (bugünkü standartlara görə) və xromosomun strukturu, daha az sentromerin təbiəti haqqında az məlumatla başladılar. Onların kəşfi yeni sahə açdı, çünki sentromerlər indi göbələklərdən və çoxsaylı bitki və heyvanlardan, o cümlədən məməlilərdən təcrid olunub. Qönçələnən maya və bir sıra digər göbələklər nöqtə sentromerləri kimi tanınan qısa, dəqiq müəyyən edilmiş ardıcıllıqla kiçik sentromerlərə malikdir, halbuki regional sentromerlər meqabazalara qədər bir neçə kilobazı əhatə edir və DNT ardıcıllığının spesifikliyinə malik deyillər. Sentromerlər süni xromosomların mərkəzindədir və biz qönçələnmə və parçalanma mayalarında və məməlilərdə sintetik sentromerlərin doğulduğunu görmüşük. Filogeniya boyu sentromerlərdəki müxtəliflik yalnız başa düşülməyə başlayan qorunan funksiyaları inkar edir.

Təxminən 35 il əvvəl sentromer DNT-ni ilk dəfə Santa Barbara, Kaliforniya Universitetində işləyən Louise Clarke və John Carbon kəşf etdi (Clarke and Carbon, 1980, 1985). Bu işin qabaqcıl tərəfini qiymətləndirmək üçün o zamankı sualları və xüsusən də xromosomun nədən ibarət olduğunu başa düşmək vacibdir. Xromosomlar ləkələnmiş preparatlarda göründü (deməli, "rəngli cisimlər" üçün "xromosom"), lakin xromosomların bir xətti DNT molekulu olduğuna dair fiziki sübut, bütöv xromosom DNT-nin impulslu sahə gradient gel elektroforezi ilə ayrılmasına qədər müəyyən edilmədi (Şvarts və Cantor, 1984). O zaman alternativ fərziyyə ondan ibarət idi ki, hər bir xromosom bir kabel kimi qurulmuşdur və bir çox tel bir-birinə dolanmışdır. Clarke və Carbon öz layihələrini DNaz parçalanmasının kinetikasına (Gall, 1963) və nuklein turşusunun təkrar assosiasiya kinetikasına (Britten və Kohne, 1968 Wetmur və Davidson, 1968) əsaslanırdılar. Gall əsas oxdan yayılan ilmələri olan lampa fırçası xromosomlarını tədqiq edirdi. Klassik kəmiyyət tədqiqatında Gall DNaz həzm sürətindən və vizual qırılma analizindən istifadə edərək hər bir xromatidin çox uzun bir DNT ikiqat spiralını ehtiva etdiyi qənaətinə gəldi. Britten və Davidson genomun arxitekturasını (bir nüsxəli genlərin fraksiyaları və orta təkrarlanan və çox təkrarlanan ardıcıllıqlar) çıxarmaqla məşğul idilər və genomun ölçüsündən DNT/xromosomun miqdarını çıxara bildilər. Bakterial genomlar bir neçə milyon baza cütü diapazonunda idi və vəziyyətində Escherichia coli, tək dairəvi molekulda yer alırdı. Clarke və Carbon hesab edirdilər ki, eukaryotik xromosom tək, davamlı molekuldursa, sentromere bağlı mutasiyaları olan hüceyrələri transformasiya etmək, tamamlama yolu ilə geni müəyyən etmək və xromosomun bir tərəfindən yerimək üçün nuklein turşusu reassosiasiyasından (hibridləşmə) istifadə etmək lazımdır. sentromere digərinə.

Molekulyar klonlaşdırma hələ bir neçə il əvvəl qurulmuş tamamlayıcı və maya transformasiyası ilə körpəlik mərhələsində idi (Hinnen və b., 1978). Eukariotlarda plazmid amplifikasiyası üçün heç bir servis vektoru, PCR, genom ardıcıllığı və DNT məlumatlarının təhlili üçün proqram təminatı yox idi. Ən vacibi odur ki, sentromer üçün bioanaliz yox idi. Oraya çatanda haradan biləcəkdilər?

Mövcud maliyyələşdirmə mühitində əsaslandırmanın çətin olacağından qorxmayan Clarke və Carbon genləri maya xromosomu III-də sentromerin hər iki tərəfində təcrid etdilər (LEU2PGK1). Mayanın hərəkət qabiliyyətinə malik xüsusiyyətlərindən biri odur ki, mayoz hüceyrə bölünməsinin bütün məhsulları bir kisədə, ascusda olur. Homoloji xromosomlar meyoz I-də bir-birindən ayrılaraq, qeyri-sistem xromatidlər üzərində sentromere bağlı genlərin meioz I-də ayrılmasını diktə edir. Bu, askusda genlərin xarakterik düzülüşünə və sentromerin və nəticədə sentromere bağlı genlərin xəritəsini çıxarmaq üsuluna gətirib çıxarır. LEU2 mayanın tamamlanması ilə təcrid olunmamışdır ley2 mutasiya, çünki bu, 1978-ci ildə maya transformasiyasının qurulmasından əvvəl idi. Bunun əvəzinə, Ratzkin və Carbon (1977) prokaryotik və eukaryotik hüceyrələrdə ümumi biosintetik yolların ümumi fermentlərə və buna görə də ümumi genlərə malik olduğunu əsaslandırdılar. maya LEU2 gen auksotrofik mutantın tamamlanması ilə təcrid edilmişdir E. coli (leyB Ratzkin və Karbon, 1977). Prinsip sübutu olaraq mayanı da müəyyən etdilər HIS2 tamamlayan gen onunB E. coli mutantlar. III xromosomda sentromerin digər tərəfində yerləşir PGK1. PGK1 qlikolitik yolda bir addımı kataliz edir və qönçələnmə mayasında yüksək şəkildə ifadə edilir. Karbon və b. (1978) rekombinantı aşkar etmək üçün immunoloji strategiya hazırlamışdı E. coli müxtəlif maya fermentlərini ifadə edən klonlar və Hitzeman və b. (1980) bunu təcrid etmək üçün istifadə etmişdir PGK1 gen.

Gəzinti hər bir genin radioaktiv etiketlənməsi və müəyyən etmək üçün etiketlənmiş zondların hibridləşdirilməsi ilə başlayır E. coli hər bir fraqmentin bir hissəsini və ya hamısını ehtiva edən koloniyalar. Kitabxana genomik DNT-nin təsadüfi kəsilmiş fraqmentləri ilə hazırlanır və beləliklə, orta hesabla hər bir koloniyada DNT-nin eyni bölgəsinin fərqli parçaları olur. Bir koloniya müəyyən edildikdən sonra plazmid DNT təcrid olunur, məhdudlaşdırıcı fermentlərdən istifadə edərək xəritələnir və növbəti addımı atmaq üçün özü radioaktiv etiketlənir. Hər bir addım hər iki istiqamətdə gedə bilər və beləliklə, sentromere irəliləyiş gedişdən iki dəfə çoxdur. Bu gəzintidə aşkar edilən genomik əlamətlərdən biri retrotranspozon (maya TY2 Kingsman) idi. və b., 1981). Transpozisiya edilə bilən elementlər yeni kəşf edilmiş və genom boyunca dağıldığı aşkar edilmişdir (Cameron və b., 1979). Bundan əlavə, TY elementlərinin sonlarında təkrarlanan >100 “delta” ardıcıllığı da genomda, transpozisiya izlərində səpələnmişdir. Təkrarlanan DNT üst-üstə düşən hibridləşmə strateqlərinin lənətidir. Təkrarlanan bölgə ilə qarşılaşdıqdan sonra bir çox koloniyalar "işıqlanır" və əlindəki alətlərlə təkrarı "gedə biləcəyinə" ümid çox azdır.

Xoşbəxtlikdən, bu sahədə çoxları Con və Luizanın tərəqqisi ilə maraqlanırdı. Con Lee Hartwell (Vaşinqton Universiteti, Seattle, WA) ilə telefonda sentromerləri müzakirə edirdi. Li qeyd etdi ki, hüceyrə bölünməsi dövrü mutantlarından biri (XNM mutantlar Hartwell və b., 1973), CDC10, III xromosomdakı sentromere ilə sıx bağlı idi. Clarke temperatura həssas cdc10 mutasiyasını tamamlayan bir klonu təcrid etdi. Bu klonda laboratoriyadakı klonlarla üst-üstə düşən 8 kb-lıq fraqment var idi LEU2 bölgə. Ov gedirdi. CDC10 sentromere o qədər yaxındır ki, onun tərəfində olub-olmadığını genetik keçid məlumatlarından ayırd etmək çətin idi. LEU2 və ya digər tərəf. Bu klonun çox axtarılan sentromeri ehtiva etməsi mümkün idi.

Şübhəsiz ki, bu ardıcıllıqları ehtiva edən plazmidlər mitozda qeyri-selektiv böyümə və meyozda Mendel seqreqasiyası bir çox nəsillərdən sonra sabit saxlanıldı. Bunlar sentromer funksiyası üçün əlamətdar olaraq qalır. Mitotik sabitlik əlavə sentromerlərin birbaşa təcrid edilməsi üçün Hsiao və Carbon (1981) tərəfindən istifadə edilmişdir. Onlar maya DNT kitabxanasını hüceyrələrə çevirdilər və sadəcə olaraq plazmiddə tamamlayıcı gen üçün genetik seçim olmadıqda transformasiya olunmuş hüceyrələri böyüdüblər. Bu yalnız 2 il əvvəl bidət olardı. Qeyri-selektiv böyümənin bir çox raundundan sonra hüceyrələr selektiv mühitə qoyuldu. Bu yolla məlum sentromerlərdən ikisi (CEN3CEN11) və bir neçə başqaları heç bir xromosom yerimə, subklonlaşdırma və ya üst-üstə düşən hibridləşmə olmadan müəyyən edilmişdir. Mitozun tələbələri Klark və Karbonun cəsarətli təcrübəsinə və erkən xromosom gəzdirən Kreyq Çaynaulta (Chinault və Carbon, 1979) həmişə borcludurlar.

Sentromerin tumurcuqlanan mayadan təcrid olunması bir neçə sahənin yaranmasına səbəb oldu. Klark sentromer DNT-ni müəyyən etməyə davam etdi Schizosaccharomyces pombe və müəyyən edilmiş regional sentromerlər. Karbon sentromer funksiyası ilə maraqlandı və sentromer DNT-ni bağlayan zülalları təcrid etməyə getdi. Yenə də problemin miqyasını qiymətləndirmək lazımdır. Hər birində bir sentromere olan 16 xromosom var. Sentromerlərin çoxluğu genetik qeyri-sabitliyə səbəb olduğundan (McClintock, 1938, 1953), sentromer bağlayan zülalların son dərəcə aşağı bolluqda (1 dəst zülal/centromere, hər hüceyrəyə ~16) mövcud olacağına inanmaq üçün bütün əsaslar var idi. DNT bağlayan kompleksin biokimyəvi təcridində irəliləyiş J. Lechner kompleksin sentromer DNT-yə ardıcıllıqla xüsusi bağlanmasını asanlaşdırmaq üçün şaperon zülalının (kazein) tələb olunduğunu aşkar etdikdə baş verdi və 240 kDa kompleksin təcridini nəşr etdi. CBF3 kompleksdəki üç zülal üçün (Lechner və Carbon, 1991). İki il sonra, böyük alt vahid üçün gen (NDC10, 110 kDa) kompleksi eyni vaxtda Jiang tərəfindən müəyyən edilmişdir və b. (1993a) və Goh və Kilmartin (1993).

Həmişə qabaqcıl olan Karbon ikinci sentromer bağlayan kompleksi təcrid etdi, CBF5bir neçə il (1993-1999) onun diqqətini cəlb etmişdi. CBF5 rRNT və tRNT-də uridinin psevdoridinə çevrilməsini katalizləyir və H/ACA kiçik nukleolar ribonukleoproteinlərin bir hissəsidir. Bunun bir neçə genetik ipucu var idi CBF5 sentromer funksiyasına malikdir. Həddindən artıq ifadə CBF5 temperatura həssas mutantları sıxışdırır ndc10-1 (Jiang və b., 1993b) və qorunan bir domen var CBF5 mikrotubulları in vitro bağlayan. Əlaqələndirmək onilliklər çəkdi CBF5 sentromere qayıdın—uyğun olaraq, tRNT-lər və onların genləri vasitəsilə Conun ilk məhəbbəti (təxminən 1960-1970-ci illər).

Con və Luiza filogenezdə məlum olan ən kiçik sentromer olan nöqtə sentromerini təyin etməkdən məsuldurlar. Həmişə onların mentorluğuna, eləcə də müstəqil karyerama başladığıma görə borclu olduğuma görə, bir həmkarım (J.Haber, Brandeis Universiteti, Waltham, MA) məni “karyerasını sınaqdan keçirmiş biri” kimi təqdim edəndə oxucu mənim narahatlığımı qiymətləndirə bilər. sentromeri böyütmək üçün” (Bloom, 2014). Ayrı-ayrı maya sentromerləri maya milinin mərkəzi qütb-qütblü mikrotubulları ətrafında silindrik şəkildə düzülmüş 16 kinetoxor mikroborucuğun üstəgəl uclarında toplanmışdır (Şəkil 1). Bütün klasterin diametri ~250 nm və eni ~70 nm-dir. Bununla belə, bacı sentromerlər metafazada ~800 nm ilə ayrılır. Bacı kinetoxorlar arasında fiziki ayrılıq, sentromer DNT-nin dörddən çox böyüklük sırasını (mayadan insana) əhatə etməsinə baxmayaraq, filogeniya boyu yüksək dərəcədə qorunur. Sentromerik heterokromatin mexaniki qüvvənin ötürülməsi üçün uyğun olan yüksək yığcam və mütəşəkkil bir quruluşa qatlanmalıdır. Təkamül yolu ilə qorunub saxlanılan yol-mil montaj nəzarət nöqtəsi-kinetoxor mikroborucuqlarının bağlanma yerinin statusuna, o cümlədən mikroborucuğun olub-olmamasına və bacı kinetokorlar arasında gərginliyin yaranıb-yaratılmamasına nəzarət edir. Səhvlərin düzəldilməsi mexanizmləri və hüceyrənin hər bir bacı kinetoxorun vəziyyətinə cavab olaraq sabit və qeyri-sabit mikrotubul birləşməsini necə təşviq etməsi kinetokorun və sentromerik heterokromatinin strukturuna daxil edilmişdir.

ŞƏKİL 1: Solda sentromer nukleazı ilə qorunan bölgə ilə tək mikrotubul arasındakı ölçü əlaqəsi. Nukleosom 5 × 11 nm-dir, səkkiz histon molekulundan ibarət bir nüvəyə bükülmüş 146 əsas cüt DNT ilə. Nukleosomun ölçüsünə əsasən, qorunan DNT-nin artması səbəbindən kinetoxorun bir qədər böyük olduğu təxmin edildi (220-bp sentromere qarşı 160-bp nukleosom Bloom and Carbon, 1982 Bloom). və b., 1983). Doğru, sentromerik heterokromatin və mayadakı yarım millidəki 16 kinetoxor mikrotubulları arasında ölçü əlaqəsi. 16 maya sentromerləri 16 kinetoxor mikrotubulunun artı uclarında toplanır. Milin digər yarısında bacı kinetoxorlar göstərilmir. Bütün 16 xromosomun sentromerləri kohezin və kondensin vasitəsilə çarpaz bağlıdır, hər sentromeri əhatə edən 50 kb-də zənginləşdirilmiş zülallar (Stephens). və b., 2011, 2013). Sistem biologiyası nöqteyi-nəzərindən, 16 sentromerin hər birinin 50 kb-ni məməli sentromerinin ekvivalenti hesab etmək olar (800 kb maya və 1-5 Mb məməli sentromerinə qarşı).

Sentromerə sistemli bir yanaşma etsək, bütün maya milini tək bir məməli kinetoxoruna bənzədirik (Bloom, 2014). Qönçələnən maya sentromerini əhatə edən təkrar peyk ardıcıllığına malik olmasa da, tRNT genləri sentromeri əhatə edən 50 kb-də təxminən iki dəfə zənginləşir (Snider və b., 2014). The CBF5 Pseudouridin sintaza tRNT transkripsiya faktorları (məsələn, TFC3) ilə birlikdə kondensinin perisentromer xromatinə (Snider) zənginləşməsindən məsuldur. və b., 2014). Cbf5-in bağlanması, çoxlu tDNT-lərin aqreqasiyası nəticəsində müxtəlif xromosomların perisentromerlərinin toplanması ilə nəticələnən transfer DNT (tDNT) genlərinə proksimal kondensin gətirir.Bu, mil oxu boyunca kondensin konsentrasiyasına və şəbəkənin mexaniki bütövlüyünə gətirib çıxarır. Beləliklə, qönçələnən mayada fərdi sentromerlər inteqrasiya olunmuş vahid kimi fəaliyyət göstərir (Stephens və b., 2013). Cbf5 sentromer funksiyası üçün vacibdir, lakin mikrotubulun bağlanma yerində deyil, sentromerik heterokromatin səviyyəsindədir.

125 bp CEN DNT-nin uğursuz başlanğıclarından biz hazırda tDNT genləri, kondensin və kohezin və spindle ilə zənginləşdirilmiş hər sentromerin ətrafında ~1 Mb sentromerik heterokromatinlə (800 kb: 16 xromosomun 50 kb-lik bölgəsi ilə) qarşılaşırıq. ox) metafazada. Canlı hüceyrələrdə fərdi xromosomları və onların sentromerlərini vizuallaşdırmaq üçün üsullar hazırlamışıq (Robinett) və b., 1996 Düz və b., 1996, 1997 Pearson və b., 2001), biz məkan və zamanda xromosom dinamikasını izləyə bilərik və intuisiya qurmaq üçün polimer fizikasından prinsipləri birləşdirə bilərik. Əmin olan odur ki, biz davamlı təməllər quran cəsarətli təcrübələr üçün Clarke/Carbon standartına can atdığımız üçün daha çox sürprizlər gözləyir.


GİRİŞ

İnsan tərəfindən yaradılan pluripotent kök hüceyrə (hiPSC) yenidən proqramlaşdırma və CRISPR/Cas9 texnologiyasının birləşməsi kök hüceyrə tədqiqatı sahəsində inkişaf biologiyasını tərcümə və terapevtik tətbiqlərə qədər əhatə edən yeni perspektivlər yaratmışdır (Rossant & Tam, 2017 Wu & Izpisua Belmonte, 2017). Yamanaka, 2012). CRISPR/Cas9 əsaslı gen redaktəsi, ayrı-ayrı hPSC xətləri arasında genetik dəyişkənlik problemini aradan qaldıraraq, izogen nəzarət/xəstəlik xətləri yaratmaq üçün insan pluripotent kök hüceyrələrində (hPSCs) xəstəliklə əlaqəli mutasiyaları dəqiq şəkildə düzəltməyə və ya təqdim etməyə imkan verdi. Eynilə, endogen və ya təhlükəsiz liman lokuslarına daxil edilmiş müxbirlər və ya ifadə kasetləri olan transgenik hPSC-lər hüceyrə izləmə təcrübələrinə, funksional tədqiqatlara və ya gen induksiyasına imkan verir (Doudna & Charpentier, 2014 Hsu, Lander, & Zhang, 2014). hPSC və CRISPR/Cas9 texnologiyalarının birləşməsi xəstəliklərin modelləşdirilməsi və regenerativ təbabətdə inqilab yaratsa da, standartlaşdırmanın olmaması, aşağı məhsuldarlıq prosesləri və qeyri-kafi möhkəmlik tərəqqiyə mane olur.

HPSC-lər üçün genomun redaktəsi prosesində ən böyük problemlərdən biri tək hüceyrələrin təcrid edilməsi və istənilən genetik modifikasiyalarla klonal hüceyrə populyasiyalarının əldə edilməsidir. Bu tək hüceyrəli klonlama darboğazı hPSC-lərin pH, osmolyarlıq və qida təchizatı, mexaniki stress/kəsmə qüvvələri və ən əsası hüceyrə-hüceyrə və hüceyrə-hüceyrədənkənar matris (ECM) əlaqəsinin itməsi kimi ətraf mühit dəyişikliklərinə həssas olması səbəbindən baş verir. Adi 2D mədəniyyət şəraitində hPSC adətən müxtəlif ECM komponentləri ilə örtülmüş səthlərdə sıx şəkildə yığılmış koloniyalarda böyüyür. Bu hüceyrə-hüceyrə və hüceyrə-ECM təmasları pozulursa, anoikis kimi tanınan apoptotik proqram induksiya edilir ki, bu da tək hüceyrənin sağ qalma nisbətinin əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına səbəb olur (Chen, Hou, Gulbranson, & Thomson, 2010). Kiçik molekullar və optimallaşdırılmış mədəniyyət şərtlərindən istifadə edərək sağ qalma və yayılma gücləndirilməsi ilə birlikdə tək hüceyrə təcrid prosesi genomu redaktə edilmiş hPSC-lərin uğurlu seçilməsi və genişləndirilməsi üçün çox vacibdir. Tək böyümüş koloniyaların əl ilə yığılması və/və ya seyreltmənin məhdudlaşdırılması kimi yanaşmalar optimal deyil, çünki onlar əmək tutumlu və səmərəsizdir. Bundan əlavə, bu üsullar təcrid prosesindən sonra uğurlu tək hüceyrəli klonal artım hadisəsini əminliklə sübut etmir. Üstəlik, gen tənzimləmə protokolları adətən kök hüceyrələri daha zəif sağ qalmaya (məsələn, elektroporasiya) gətirib çıxaran sərt şərtlərə məruz qoyur, buna görə də yumşaq tək hüceyrə izolyasiyası və paylama texnikası klonlaşdırma səmərəliliyini artıracaq. Dəlil edilməli olan başqa bir problem prosesin uzunluğudur - tipik bir gen redaktəsi iş prosesi 2 ilə 4 ay çəkir və vaxtın böyük hissəsi hPSC subklon izolyasiyasına, genotiplənməsinə, seçilməsinə və genişləndirilməsinə sərf olunur. Buna görə də, artan tək hüceyrə sağ qalması ilə hPSC-lərin daha sürətli və daha dəqiq izolyasiyasını təklif edən avtomatlaşdırılmış sistemlər tədqiqat və kommersiya tətbiqləri üçün çox arzuolunan olardı. Tək hüceyrəli dispensasiya üçün müxtəlif cihazlar hazırlanmışdır və hazırda kommersiyada mövcuddur.

Bu məqalənin müəllifləri təcrid, klonal genişləndirmə və əlavə xarakteristikalar daxil olmaqla, tam hPSC alt klonlama iş axını daxilində tətbiq oluna bilən müxtəlif iş prinsipləri olan üç platformanı sınaqdan keçirmişlər. Burada təsvir etdiyimiz Əsas Protokol iotaScience IsoCell platforması ilə birləşdirilmişdir, bu, miniatürləşdirməyə və buna görə də xərclərin azaldılmasına imkan verən kiçik ölçüyə malik cihazdır (https://www.iotasciences.com/). Biz alternativ protokollarda iki əlavə platforma təqdim edirik: CellenONE X1/F1 (https://www.cellenion.com/ Alternativ Protokol 1-ə baxın) və Cytena c.sight/f.sight (https://www.cytena) .com/ bax Alternativ Protokol 2) tək hüceyrəli dispenserlər. Hər üç platforma yüksək hüceyrə canlılığını və aşağı çirklənmə dərəcəsini təmin etmək və monoklonal effektivliyə inamı artırmaq üçün hazırlanmışdır. Biz müxtəlif tətbiqlər üçün hPSC-lərin möhkəm və səmərəli avtomatlaşdırılmış subklonlaşdırılmasını təmin edən müvafiq hüceyrə mədəniyyəti üsullarını və xüsusi cihaz protokollarını təsvir edirik. Nəhayət, biz nümunə məlumatları təqdim edirik və hər bir cihaz sistemi üçün iş prosesini təsdiqləmək üçün karyotipik sabitliyi və saxlanılan pluripotentliyi vurğulayırıq.


Aşağı oksigen səviyyələri insan embrion kök hüceyrələrində X xromosomunun inaktivasiyasına mane olur

Whitehead İnstitutunun tədqiqatçılarına görə laboratoriyadakı oksigen səviyyələri insan embrion kök (ES) hüceyrələrini daimi olaraq dəyişdirə bilər, xüsusilə də qadın hüceyrələrində X xromosomunun inaktivasiyasına səbəb ola bilər. İnsan ES hüceyrələri müntəzəm olaraq atmosfer oksigen səviyyələrində yaradılmış və saxlanılmışdır ki, bu da təxminən 20% təşkil edir. Bədəndəki hüceyrələr adətən yalnız 1-9% oksigenə məruz qalır.

"İnsan ES hüceyrələri 20% oksigenlə təcrid olunduqda, onlar stress keçirirlər və qadın hüceyrələrində bir X xromosomunu təsirsiz hala gətirirlər" dedi Whitehead-in Qurucu Üzvü Rudolf Jaenisch. "Bu, insan ES-hüceyrələrinin yaradılmasının ənənəvi yolunun optimal olmadığını iddia edir. Biz metodumuzun yeganə yol və ya mümkün olan ən yaxşı yol olduğunu demirik, lakin bu, ənənəvi üsuldan daha yaxşıdır."

Bu nəticələr jurnalın bu həftəki onlayn sayında dərc olunub Hüceyrə.

Elm adamları insan ES hüceyrələri ilə maraqlanır, çünki onlar orqanizmdə demək olar ki, hər hansı bir hüceyrə növünə yetişmək qabiliyyətinə malikdirlər, bu xüsusiyyət pluripotentlik olaraq bilinir. Teorik olaraq, bu potensial xəstəliklər və ya xəsarətləri müalicə etmək üçün istifadə edilə bilər.

Whitehead İnsan Kök Hüceyrə Mexanizminin direktoru və tədqiqatın dizayneri Maisam Mitalipova deyir: "Həmçinin, insan ES hüceyrələri insan inkişafının başlanğıcını öyrənmək üçün yeganə vasitəmizdir". Hüceyrə.

Lakin insan ES hüceyrələri, hətta eyni hüceyrə xəttindən olsa da, təcrübələrdə fərqli nəticələr verir. Uyğun olmayan nəticələr eksperimentin üsullarını və ya nəticələrini şübhə altına ala bilər.

"ES hüceyrələrinin becərilməsi və təcrid edilməsində laboratoriyadan laboratoriyaya qədər böyük variasiya bu sahədəki böyük problemlərdən biridir" dedi Christopher Lengner, ilk müəllif. Hüceyrə kağız və Jaenisch laboratoriyasında doktorluqdan sonrakı tədqiqatçı. "Sadəcə böyümək şərtlərinə görə hüceyrələr bir-birindən tamamilə fərqli ola bilər. Beləliklə, biz əsaslara qayıtmaq və bu hüceyrələri necə təcrid etdiyimizə və onları ən təmiz şəkildə necə saxladığımıza dair bir təməl vəziyyəti yaratmaq istədik. mümkündür”.

İnsan ES hüceyrələri adətən in vitro gübrələmə (IVF) klinikalarının xəstələri tərəfindən tədqiqat üçün təyin edilmiş mayalanmış yumurtalardan əldə edilir. Embrion təxminən 100 hüceyrədən ibarət bir topa çevrildikdən sonra tədqiqatçılar ES hüceyrələrini çıxarırlar. Ənənəvi olaraq, IVF klinikasında mayalanmış yumurtaların yaradılmasından tutmuş, laboratoriyada insan ES hüceyrələrinin təcrid edilməsinə və saxlanmasına qədər bütün bu işlər atmosfer oksigen səviyyələrində yerinə yetirilmişdir. Yaranan insan ES hüceyrələri, siçan ES hüceyrələrindən bir qədər daha az çevik və pluripotent vəziyyətdə olduqlarını göstərən genomlarında çoxsaylı fərqlər nümayiş etdirir.

Məsələn, erkən təsadüfi inaktivasiyadan sonra, qadın insan ES hüceyrələrində həmişə eyni X xromosomu təsirsiz hala gəlir, siçan ES hüceyrələrində isə hüceyrələr fərqlənməyə başlayana qədər, X xromosomlarından biri hər bir hüceyrədə təsadüfi olaraq inaktivləşəndə ​​iki aktiv X xromosom olur. X inaktivasiyası qadın hüceyrəsinin düzgün inkişafı üçün çox vacibdir. Hər iki X xromosomu yetkin bir hüceyrədə aktiv qalırsa, hüceyrə X xromosomunun genlərindən iki dəfə çox ifadəyə sahib olacaq, bu da ölümcüldür.

İzolyasiya və mədəniyyət zamanı oksigen səviyyələrinin insan ES hüceyrələrinə necə təsir etdiyini yoxlamaq üçün Mitalipova altı yeni insan ES hüceyrə xətti yaratdı -- iki kişi və dörd qadın. Hər bir embriondan təcrid olunmuş hüceyrələrin yarısı 20% oksigendə, digər yarısı isə 5% oksigendə yaradılıb və saxlanılıb. Tədqiqatçılar daha sonra təkcə bu hüceyrələrdə ifadə olunan bütün genlərə deyil, həm də onların epigenetik vəziyyətinə baxıblar.

"İnsan ES hüceyrələrini bir neçə gün ərzində atmosfer oksigeninə məruz qoyduğunuzda, bütün genom çılğınlaşır - gen ifadəsində kütləvi dəyişikliklər baş verir" dedi Lengner.

Lakin bir müddətdən sonra insan ES hüceyrələri atmosfer oksigeninə uyğunlaşır və demək olar ki, bütün bu dəyişikliklər yenidən normallaşır, güclü şəkildə aktiv qalan X inaktivasiya geni XIST istisna olmaqla. Dana Farber Xərçəng İnstitutunun assistenti və məqalənin birinci müəllifi olan Alexander Gimelbrant yoxladıqda, 20% oksigenə məruz qalan qadın insan ES hüceyrələrində bir X xromosomu daimi olaraq təsirsiz hala gəldi. Bununla belə, 5% oksigendən əldə edilən insan ES hüceyrələri XIST geninin güclü aktivləşməsini nümayiş etdirmədi və qadın hüceyrələrindəki hər iki X xromosomu aktiv olaraq qaldı - bu, bu hüceyrələrin mədəni həmkarlarından daha inkişaf etmiş vəziyyətdə olduğunun göstəricisidir. atmosfer oksigenində.

Bu iş ətraf mühitin oksigen səviyyələrinin təsirlərinə yönəldilsə də, digər amillər insan ES hüceyrələrinə oxşar mənfi təsir göstərə bilər.

"Görünür, ümumiyyətlə stress, laboratoriyada hüceyrələri və ya IVF klinikasında embrionları səmərəsiz şəkildə dondurmaq və ya hüceyrələri çox manipulyasiya etmək kimi, hüceyrələri X xromosomunu təsirsiz hala gətirə və bəzi pluripotentliyi itirə bilər" dedi Mitalipova.

Yüksək oksigen səviyyəsi də daxil olmaqla bu stressorlar aradan qaldırılsa belə, insan ES hüceyrələri hələ də siçan ES hüceyrələri kimi pluripotent deyil.

Ancaq bu ayın əvvəlində nəşr olunan bir məqalədə Milli Elmlər Akademiyasının Materialları (PNAS), Jaenisch laboratoriyasında Jacob Hanna mövcud və yeni qurulmuş insan ES hüceyrələrini siçan ES hüceyrələrində görülən daha pluripotent vəziyyətə gətirmək üçün iki yanaşmanı təsvir edir. Hannanın metodları ya ES hüceyrələrinin DNT-sinə daxil edilmiş genlərə, ya da insan ES hüceyrələrini daha pluripotent vəziyyətdə saxlayan hüceyrələri əhatə edən mədəniyyət mühitinə əlavə edilən dərmanlara əsaslanır.

Bu tədqiqat Hillel və Liliana Bachrach və Susan Whitehead tərəfindən dəstəkləndi.

Hekayə Mənbəsi:

Materiallar tərəfindən təmin edilmişdir Whitehead Biotibbi Tədqiqatlar İnstitutu. Orijinal Nicole Giese tərəfindən yazılmışdır. Qeyd: Məzmun üslub və uzunluğa görə redaktə edilə bilər.


GİRİŞ

Genomik pozğunluqlar üzrə son tədqiqatlar müxtəlif nümunə mənbələrindən əldə edilməli olan çoxlu keyfiyyətli DNT-nin toplanması zərurətini doğurdu. DNT-nin yazılması hal-hazırda cinayət yerində tapılan insan bədən mayesinin ləkələrinin fərdi identifikasiyası üçün ən təsdiqlənmiş üsuldur. Geniş çeşidli genetik tədqiqatlarda, bu yanaşmanın invazivliyi nəticəsində periferik qanın nüvəli hüceyrələrindən genomik DNT əldə etmək üçün ümumi istifadə edilən üsuldur, tədqiqat subyektlərindən nümunələr əldə etmək çətin ola bilər. 1 , 2 İzolyasiya sxemləri yorucu olub və ümumi analiz vaxtları da kifayət qədər uzun olub. DNT təcridinin digər alternativ mənbələrinə bukkal hüceyrə, follikullu saç və sidik daxildir ki, onları invaziv qan toplama ilə müqayisədə qeyri-invaziv şəkildə əldə etmək daha asandır. 2 Bukkal hüceyrələrin toplanması pambıq çubuqla və ya ağız boşluğunun yuyulması prosedurundan istifadə etməklə asanlıqla həyata keçirilə bilər. 3 Bukkal çubuqlardan istifadə edərək DNT-nin təcrid edilməsi sərfəli emal, daha az nümunə həcmi tələbi, uzunmüddətli arxivləşdirmə və öz-özünə toplanmasının uyğunluğu kimi bir çox üstünlükləri təmin edir. Bu, xəstə üçün daha rahatdır və bukkal tamponlar PCR üçün kifayət qədər DNT təmin edir, çünki onlar yalnız bir neçə nanoqram DNT tələb edir. 3

İnsan saçı hüquqi araşdırmalarla əlaqəli ən çox yayılmış bioloji materiallardan biridir və kriminologiyada statistikaya əsaslanan əhali işi və DNT əsaslı analiz üçün istifadə edilmişdir. 4 DNT testinin ən qiymətli üsulu nüvə DNT-nin qısa tandem təkrar analizidir. 5 Bu, saçın kök hissəsi və/yaxud yapışan toxuma mövcud olduqda mümkündür. Bununla belə, tez-tez cinayət yeri ilə əlaqəli olan telogen tüklərdə (tökülən saçlar) heç bir nüvə materialı olmaya bilər. 5 Hüceyrə mitoxondriyaları və mitoxondrial DNT (mtDNT) hələ də toxunulmaz qalır, 5 , 6 Keratinləşmə zamanı saç şaftı sərtləşdikcə nüvə deqradasiyaya uğrayır və keratinləşdirilmiş saçdan mtDNA analizi mümkündür. Təəssüf ki, saç nümunələrinin zülalla zəngin təbiəti şaftı parçalamaq və DNT-ni sərbəst buraxmaq üçün əlavə addımlar tələb edir (məsələn, mikroskopik şüşə dəyirmanı istifadə edərək parçalanma, ardınca üzvi həlledici ekstraksiya) 7 – 9 , beləliklə, nümunə çirklənmə riskinin artması. Cinayətin yerini və ölüm növünü dəqiq müəyyən edərkən insan sidiyi ləkələrinin məhkəmə-tibbi araşdırması böyük əhəmiyyət kəsb edir. 10 İnsan sidiyi dopinq və dərman skrininq testlərində toksikoloji analiz üçün uyğun nümunədir. 11

Bununla belə, praktiki çətinliklərə və metodoloji səbəblərə görə, müxtəlif üsullardan istifadə edərək müxtəlif növ nümunələrdən əldə edilən DNT-nin məhsuldarlığını və təmizliyini maksimuma çatdırmaq üçün şəraitin optimallaşdırılması vacibdir. Bu işdə nümayiş etdirilən, saç şaftlarından DNT-nin çıxarılması üçün lazımsız addımları azaldan sadələşdirilmiş üsul DNT-nin çirklənməsini faktiki olaraq aradan qaldırır və həmçinin məhkəmə-tibb ictimaiyyəti üçün faydalı ola biləcək təhlilin müddətini əhəmiyyətli dərəcədə saxlayır. əhaliyə əsaslanan tədqiqat cəmiyyəti. Bundan əlavə, nümunənin qeyri-invaziv şəkildə toplanması ilə birləşən daha az nümunə həcmi tələbi əhaliyə əsaslanan nümunə araşdırmalarında daha geniş tədqiqatların cəlb edilməsində asanlıqla özünü göstərən pediatrik nümunə götürməyə imkan verir. Bundan əlavə, bu sadələşdirilmiş metodun işlənib hazırlanması nəzərdə tutula bilər, çünki o, DNT analizi ilə tibbi diaqnostika vasitəsi kimi tətbiq oluna bilər ki, bu da mövcud diaqnostik tibbin tələb etdiyi xəstəlik hallarını aşkar etmək üçün kifayət qədər qısa müddət ərzində (𢏈 saat) aparıla bilər. sahə həvəslə arzulayır.


Kitabxanalar

"Kitabxana" genetik məlumatın rahat saxlanma mexanizmidir.

  • Onlar adətən ya "genomik" və ya "cDNA" (yəni DNT şəklində mRNT) genetik məlumatdır.
  • Müvafiq polipeptid məlumatından çıxarılan genetik ardıcıllıqlar kitabxana daxilində xüsusi genetik məlumatı müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər.

CDNA kitabxanasının qurulması

Bunun üçün məsul olan ferment RNT-dən asılı DNT polimeraza adlanır əks transkriptaza.

  • Əks transkriptazalar ənənəvi olaraq təcrid edilmişdir viruslar genomu əslində RNT şəklindədir və dupleks DNT-yə çevrilməlidir.
  • Bu viruslar hüceyrələrə yoluxduqda adətən mRNT genetik komponenti ilə birlikdə funksional tərs transkriptaza daşıyırlar.
  • Ticarətdə mövcud olan ən çox yayılmış tərs transkriptazalardan biridir Moloney fare leykoz virusudur (MMLV).
  • Bu RNT-dən asılı DNT polimeraza (bütün polimerazalar kimi) RNT-dən istifadə edərək 5'-3' istiqamətdə yeni bir polinukleotidə nukleotidlər əlavə edir. şablon . Tərkibində heç bir 3'->5' ekzonükleaz (korrektor) aktivliyi yoxdur.

MMLV şablon kimi mRNA-dan istifadə edəcək, lakin tələb olunur primer (bir DNT primerini genişləndirə bilər, lakin birini sintez edə bilməz).

  • Eukaryotik mRNT-lər haqqında həqiqətən səliqəli şeylərdən biri də varlığıdır 3' poli A trekləri.

Qeyd edək ki, biz istehsal etmişik tamamlayıcı DNT (və ya cDNA) orijinal mRNT zəncirinə.

Bu DNT/RNT dupleksinin RNT yarısına "niklər" daxil edə bilsək, vəziyyət prokaryotik genomik DNT-nin "lagging strand" sintezində müşahidə edilən vəziyyətə çox oxşar olardı.

  • Molekulun RNT yarısında niklər RNTaz H fermentinin təsiri ilə daxil edilə bilər.
  • Bu ferment RNT/DNT hibridlərinin RNT hissəsinin endonükleolitik parçalanmasını, həmçinin 5'->3' və 3'->5' ekzoribonukleaz aktivliyini nümayiş etdirir.
  • Başqa sözlə, RNT-ni parçalayacaq və sonra hər iki istiqamətdə həzm etməyə davam edəcək:
  • Bu RNT fraqmentləri indi DNT sintezi üçün primer kimi xidmət edə bilər E. coli Pol I. Bu ferment həm də RNT primerlərini effektiv şəkildə aradan qaldırmaq üçün "nikləri" tərcümə edəcək:

Şəkil 3.6.3:DNT sintezi

Nəzərə alın ki, biz potensial olaraq ya qalıq 5' RNT qapağı bölgəsinə, ya da orijinal mRNA zəncirinin 5' ucunda boşluğa sahib olacağıq.

CDNT-nin plazmidə daxil edilməsi.

Faydalı cDNA kitabxanasının tikintisimizi başa çatdırmaq üçün bizə bir yol lazımdır saxlamaq və təbliğ etmək bizim cDNA.

  • Buna cDNA-nı uyğun bir yerə daxil etməklə nail ola bilərik plazmid.
  • Bu işi yerinə yetirməyin iki klassik yolu var:
  1. Homopolimer qalıq
  2. Bağlayıcı əlavə

Homopolimer qalıq

Terminal transferaz yalnız a adlı eukaryotik hüceyrə tipində olan qeyri-adi DNT polimerazadır prelimfosit.

  • iştirakı ilə a ikivalent kation ferment dNTP-lərin əlavə edilməsini katalizləyir 3'-hidroksil sonları DNT.
  • Əlavə ediləcək nukleotid purin olduqda, Mg 2+ kation istifadə olunur.
  • Əlavə ediləcək nukleotid pirimidin olduqda, Co 2+ istifadə olunur.
  • Reaksiya şəraitindən asılı olaraq üçdən bir neçə minə qədər baza əlavə olunacaq.

Şəkil 3.6.4:Terminal transferaz fəaliyyəti

  • Plazmidimizi kəsib terminal transferazla müalicə etsək, indi əlavə edirik tamamlayıcı baza cDNT-mizə əlavə etdiyimiz birinə cDNT-ni plazmidə birləşdirə və bağlaya bilərik.

Şəkil 3.6.5:cDNT-nin plazmidə bağlanması

  • C-quyruqlu cDNA insertinin vektorda G-quyruqlu Pst I sahəsinə daxil edilməsinin faydası aşağıdakı kimidir:
  1. Pst I tanınma ardıcıllığı və parçalanma yeridir
    5' C T G C A G 3'
    3' G A C G T C 5'
  2. Bu saytın Pst I tərəfindən parçalanması, ardından G-tailing istehsal edəcək
    5' C T G C A (G)n G 3'
    3' G (G)n A C G T C 5'

Bağlayıcılar

Kitabxana vektoruna cDNA fraqmentlərini daxil etmək üçün alternativ üsul "linkers" əlavə etməkdir.

    Bağlayıcılar qısa oliqonukleotidlərdir (

Bağlayıcı əlavə etmək üçün addımlar aşağıdakılardır:

  1. cDNA-nın S1 nukleaza ilə müalicəsi (cDNA dupleksində qalan mümkün 5' qapaqlı mRNT fraqmentini çıxarmaq üçün
  2. Potensial "ragged" uclarını Pol I ilə müalicə etməklə küt hala gətirin (5' çıxıntıları dolduracaq və 3' çıxıntıları çeynəyəcək)
  3. Eco RI methylase (plus S-adenosyl metionin) ilə müalicə ilə potensial daxili Eko RI sahələrində cDNA-nı metilləşdirin
  4. T4 DNT liqazasından istifadə edərək küt, metilləşdirilmiş cDNA-ya bağlayın
  5. Eco RI məhdudlaşdırıcı endonükleaz ilə bağlayıcıları kəsin
  6. Agaroz gel elektroforezi ilə cDNA fraqmentlərindən bağlayıcı fraqmentləri çıxarın
  7. cDNA-nı vektor DNT fraqmentinə bağlayın (Eco RI məhdudlaşdırıcı endonükleaz tərəfindən açılır

Bu dərslik 1998-ci ildə nəşr edilmişdir. İnsan Genomu Layihəsi 2003-cü ildə tamamlanmışdır.


Biologiyanın mənimsənilməsi - 12-ci fəsil

bir-birinə sıx bağlandıqda belə bölünməyə davam edirlər.

Mitozun sonunda MPF aktivliyinin azalması ilə əlaqədardır

siklinin deqradasiyası.

Bəzi orqanizmlərin hüceyrələrində mitoz sitokinezsiz baş verir. Bu nəticə verəcək

birdən çox nüvəli hüceyrələr.

Aşağıdakılardan hansı mitoz zamanı baş vermir?

Bütün xərçənglər üçün nə doğrudur?

Onlar normal hüceyrə dövrü nəzarətindən qaçıblar.

Xərçəng hüceyrələri normal hüceyrələrdən nə ilə fərqlənir?

Xərçəng hüceyrələri ölümsüz ola bilər.

Xərçəng hüceyrələrinin hüceyrə dövrünə nəzarət sistemləri normal hüceyrələrdən fərqlidir. Bu fakt üçün ən yaxşı izahı seçin.

Genetik dəyişikliklər xərçəng hüceyrəsinin zülal məhsullarının funksiyasını dəyişdirir.

Əgər eukaryotik hüceyrə hüceyrə dövrünün G1 fazasındadırsa, hüceyrənin xromosomları haqqında hansı ifadə düzgün olmalıdır?

Hər bir xromosom DNT və əlaqəli zülallar kompleksindən ibarətdir.

Hansı ifadə hüceyrə dövrünün fazalararası hissəsinin ən yaxşı təsvirini verir?

İnterfaza zamanı hüceyrə metabolik aktivdir.

Xərçəngə səbəb olduğu bilinən ətraf mühit maddəsinə nə deyilir?

Aşağıdakı iki mənbədən hansından yayılan radiasiya ən çox oxşardır?

mikrodalğalı sobalar və mobil telefonlar

Siz pestisid atrazinin mutagen olub olmadığını öyrənməyə çalışırsınız. Harada mutasiyalar axtarırsınız?

Aşağıdakılardan hansı doğrudur?

Xərçəngə səbəb olan maddələr müxtəlif yollarla işləyir.

Aşağıdakılardan hansı cib telefonları və beyin xərçəngi ilə bağlı mövcud elmi rəyi ən yaxşı şəkildə ümumiləşdirir?

Əksər tədqiqatlar cib telefonlarının beyin xərçənginə səbəb olmadığını göstərsə də, mobil telefondan istifadə artdıqca daha çox araşdırmaya ehtiyac var.

Aşağıdakı kodlardan hansı zülallara aiddir?

Bir şişin tələb etdiyi dəstəkləyici quruluşu təmin edən hüceyrələrə zərər verən yeni bir dərman hazırlayırsınız. Hansı hüceyrə növünü hədəfləyirsiniz?

Aşağıdakılardan hansı olmasaydı, şiş öz qan ehtiyatına malik ola bilməzdi?

endotel hüceyrələri immun sistemi hüceyrələri

Mövcud araşdırmalara görə aşağıdakılardan hansı doğru görünür?

İnsan orqanizmində Helicobacter pylori populyasiyası azaldıqca özofagus xərçəngi halları artır.

Bu prefiksləri, şəkilçiləri və söz köklərini onların tərifləri ilə uyğunlaşdıra bilərsinizmi?

tək: haplo hər ikisi, ikiqat: diplo- eyni: homo- (və ya homeo-) olmadan, çatışmamazlıq, yox: a- (yaxud an-) kiçik: mikro- istehsal etmək: -gen- bədən: -bəzi (və ya soma- ) xromosomlar: ploid rəng: xrom- özü: avto- çox: çox- son: telo- əvvəl: pro- iki: bi- bir: uni- arasında: seqmentarası, bədən bölməsi: -sadə sap: mito- hüceyrə: - sit (və ya sito-) hərəkət edən: kin- (və ya kinet-)

Bu yeni texnikadan əvvəl siçanlara xərçəng şişləri necə verilirdi?

Şişlər dərinin altına implantasiya edilib.

Siz onkoloqsunuz. Xəstə inkişaf etmiş prostat xərçəngi ilə müraciət edir və siz standart protokola əməl edirsiniz. Sən nə edirsən?

Xəstə kimyəvi kastrasiya ilə müalicə olunur.

Siz prostat xərçəngi üçün yeni müalicə üsullarını öyrənən endokrinoloqsunuz. Qeyri-adi dərəcədə yüksək səviyyədə dihidrotestosteron olan bir xəstəniz var. Aşağıdakılardan hansı doğrudur?

Xəstənizin xərçəngi standart müalicəyə davamlı oldu.

Prostat xərçəngi hüceyrələri ilə bağlı aşağıdakılardan hansı doğrudur?

Onlar müəyyən genləri aktivləşdirə və təsirsiz hala gətirə bilərlər.

Əminiz prostat xərçəngi var. Aşağıdakılardan hansı onun vəziyyətinin yaxşılaşmasını göstərir?

Müəyyən bir hüceyrədə mitotik aktiv toxumanın bəzi digər hüceyrələrinin yarısı qədər DNT var. Sözügedən hüceyrə böyük ehtimalla içəridədir

Sitokalazin B dərmanı aktin funksiyasını bloklayır. Heyvan hüceyrəsi dövrünün aşağıdakı aspektlərindən hansı sitoxalazin B tərəfindən ən çox pozulur?

parçalanma şırımının əmələ gəlməsi və sitokinez

Aşağıdakılardan hansı inkişaf etməkdə olan ölkələrdə döş xərçənginin artmasının əsas səbəbidir?

Aşağıdakılardan hansı doğrudur?

Dünya miqyasında döş xərçəngi qadınlarda ən çox görülən xərçəngdir və qadınların ən böyük xərçəng öldürücüdür.

Siz kolon xərçəngi üzrə ixtisaslaşmış onkoloqsunuz. Bir xəstə sizə sümüklərinə və qaraciyərinə yayılmış və heç bir müalicəsi olmayan xəstəliklə müraciət edir. Bu xərçəngin hansı mərhələsidir?

Uqandada qadına döş xərçəngi diaqnozu qoyulub. Əgər hər hansı bir müalicə aparılırsa, bunun ən çox ehtimalı nədir?

Siz ABŞ-da süd vəzi xərçəngindən xilas olmuşsunuz və müdafiəçisiniz, niyə illik mamoqramma yox, 50 yaşdan aşağı qadınlara süd vəzilərinin müayinəsini təşviq edirsiniz?

50 yaşdan kiçik qadınlarda daha sıx döş toxuması var, bu da tez-tez mamogramları qeyri-müəyyən edir.

Niyə bəzi növlər həm mitoz, həm də mayoz bölünür, digər növlər isə yalnız mitozdan istifadə edirlər?

Heyvan gametləri istehsal edirlərsə, hər ikisinə ehtiyac var.

Mitozun profilaktika mərhələsində olan insan sümük iliyi hüceyrəsi 46 xromosomdan ibarətdir. Tərkibində neçə xromatid var?

Nə üçün interfaza zamanı ayrı-ayrı xromosomları işıq mikroskopu ilə müşahidə etmək çətindir?

Onlar uzun, nazik iplər yaratmaq üçün açılıblar.

Eukaryotik hüceyrələrdə xromosomlar _____-dən ibarətdir.

İnsanda mitozun son nəticəsi nədir?

46 xromosomu olan genetik olaraq eyni somatik hüceyrələr

Döllənmiş yumurtadan (ziqotdan) başlayaraq, bir sıra beş hüceyrə bölünməsi neçə hüceyrədən ibarət erkən embrion meydana gətirəcək?

Hüceyrədə 20 təkrarlanan xromosom varsa, neçə sentromer var?

Biologiyanın əksər sahələrində olduğu kimi, mitozun və hüceyrə dövrünün öyrənilməsi bir çox yeni terminologiyanı əhatə edir. Fərqli terminlərin nə demək olduğunu bilmək hüceyrədə baş verən prosesləri başa düşmək və təsvir etmək üçün vacibdir.
Bu cümlələri düzgün tamamlamaq üçün şərtləri sol tərəfə çəkin. Bütün terminlərdən istifadə edilməyəcək.

bacı xromatid(lər) sentromer(lər) kinetokkor(lar) fazalararası mitotik mil(lər) xromatin sitokinez sentrozom(lar)

Hüceyrə dövrü hüceyrənin əmələ gəlməsindən onun iki qız hüceyrəyə bölünməsinə qədər onun həyatında baş verən hadisələrin əlaqələndirilmiş ardıcıllığını təmsil edir. Hüceyrə dövrünün əsas hadisələrinin əksəriyyəti dövr ərzində müəyyən bir zamanla məhdudlaşır.

Bu məşqdə siz hüceyrə dövrü ərzində müxtəlif hadisələrin nə vaxt baş verdiyini müəyyən edəcəksiniz. Yada salaq ki, interfaza G1, S və G2 yarımfazalarından, M fazası isə mitoz və sitokinezdən ibarətdir.
Hər etiketi müvafiq hədəfə sürükləyin.

*Bir çox orqanizmlərdə normal olaraq bölünməyən hüceyrələr var. Bu hüceyrələr G1 keçid məntəqəsindən əvvəl hüceyrə dövründən çıxırlar. Hüceyrə G1 nəzarət nöqtəsini keçdikdən sonra, adətən hüceyrə dövrünü tamamlayır–yəni, bölünür. Bölünməyə hazırlaşmağın ilk addımı hüceyrənin DNT-sini S fazasında təkrarlamaqdır. G2 fazasında sentrozom təkrarlanır. Erkən M fazasında sentrosomlar bir-birindən hüceyrənin qütblərinə doğru hərəkət edərək mitotik milin əmələ gəlməsini təşkil edir. M fazasının sonunda mitoz tamamlandıqda hüceyrə bölünür (sitokinez), genetik cəhətdən eyni olan iki qız hüceyrəsi əmələ gətirir.

Ana hüceyrənin xromosomları çoxaldıqca və hüceyrə bölünməsi zamanı iki qız hüceyrəyə paylandıqca, xromosomların strukturu dəyişir.
Hüceyrə dövrünün hər bir mərhələsi üçün üç suala bəli və yox etiketlərini cədvəldəki uyğun yerlərə sürükləyərək cavablandırın.

Qeyd: Fərz edək ki, M fazasının sonuna qədər ana hüceyrə hələ iki qız hüceyrəsi yaratmaq üçün bölünməyib.

DNT S fazasında çoxaldıqda bacı xromatidlər əmələ gəlir. Bacı xromatidlər erkən anafazada ayrıldıqdan sonra fərdi xromosomlara çevrilirlər. Eynilə, DNT replikasiyası zamanı hüceyrə DNT tərkibi S fazasında ikiqat artır. Bununla belə, hüceyrənin DNT tərkibi sitokinez tamamlanana və iki qız hüceyrə əmələ gələnə qədər normal (ikiqat) səviyyələrinə qayıtmır. DNT-nin kondensasiya vəziyyəti bacı xromatidlərin varlığı və ya olmaması ilə əlaqəli deyil. DNT profilaktika mərhələsində kondensasiya olunur və bacı xromatidlər ayrılana və yeni qız hüceyrələri əmələ gəlməyə başlayana qədər kondensasiyada qalır. Gec telofaza/sitokinezdə vurğu növbəti hüceyrə dövrü üçün hüceyrə böyüməsi və DNT replikasiyasına keçir. Bu proseslərin baş verməsi üçün DNT-nin dekondensasiyası lazımdır ki, transkripsiyada iştirak edən hüceyrə mexanizmləri üçün əlçatan olsun.

Mitozun mərhələləri əvvəlcə işıq mikroskopu ilə müşahidə olunan hüceyrə xüsusiyyətləri ilə müəyyən edilmişdir. Aşağıdakı altı mikroqrafik mitozun beş mərhələsində heyvan hüceyrələrini (tritonun ağciyər hüceyrələri) və üstəlik sitokinezi göstərir. (Qeyd edək ki, bu mikroqraflarda interfaza göstərilmir.) Bu şəkillərdə xromosomlar mavi, mikrotubullar yaşıl və mikrofilamentlər qırmızı rəngə boyanmışdır.
Hər bir mikroqrafı göstərdiyi mitoz və ya sitokinez mərhələsini göstərən hədəfə sürükləyin.

*Bu altı mikroqrafın nümayiş etdirdiyi kimi, işıq mikroskopiyası ilə müşahidə edilən hüceyrə hadisələri mitoz və sitokinezin altı mərhələsini müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər. Bununla belə, real hüceyrələrdə hansı mərhələnin olduğunu deşifrə etmək dərslikdə gördüyünüz ideallaşdırılmış hüceyrələrin təsvirlərindən daha çətin ola bilər. Beləliklə, mitotik milin tamlığını və xromosomların yerini, həmçinin xromosomların nə qədər kondensasiya edildiyini diqqətlə müşahidə etmək vacibdir.

Mitoz hüceyrədəki xüsusi hadisələrlə qeyd olunan mərhələlər ardıcıllığı ilə baş verir. Hüceyrədəki struktur dəyişiklikləri bir sıra sıx əlaqələndirilmiş əsas mexanizmlər tərəfindən həyata keçirilir.
Baş verdiyi mitoz mərhələsini göstərmək üçün hər bir prosesi müvafiq qutuda çeşidləyin. Əgər proses birdən çox mərhələdə baş verirsə, onu ilk baş verdiyi mərhələyə sıralayın.

*A Hissəsindəki mikroqraflar mitoz mərhələlərində baş verən bəzi hüceyrə proseslərini göstərir. Profazada mil aparatının mikrotubulları ayrı-ayrı tubulin alt bölmələrindən yığılmağa başlayır. Bu mərhələdə hər bir bacı xromatid cütünün eyni xromatidləri sıxlaşdıqca, onlar kohezin zülalları tərəfindən bir yerdə tutulur. Prometafaza nüvə zərfinin parçalanması, milin nüvə bölgəsinə genişlənməsi və bəzi mil liflərinin kinetoxorlar vasitəsilə xromosomlara bağlanması ilə qeyd olunur. Metafaza lövhəsi boyunca xromomların düzülməsi ilə qeyd olunan metafaza kinetokorların hizalanması və sonra hüceyrənin qütblərinə nisbətən hərəkətsiz qalması ilə baş verir. Anafazada kohezin zülalları parçalanır və kinetoxorlar hüceyrənin qütblərinə doğru hərəkət edərək bacı xromatidləri ayırır. Telofazanın gedişi ilə milin kinetoxor mikrotubulları parçalanır. Xromosomlar hüceyrənin qütblərinə çatdıqda, iki yeni qız nüvəsinin nüvə zərfləri əmələ gəlir.

Mitotik mil iki növ mikroborucuqdan ibarətdir: kinetokor mikrotubullar və kinetokor olmayan mikrotubullar. Heyvan hüceyrələrində bu iki növ mikrotubul mitoz mərhələlərində fərqli fəaliyyət göstərir.
Etiketləri müvafiq yerlərə çəkərək cümlələri tamamlayın. Etiketlər bir dəfə, birdən çox və ya ümumiyyətlə istifadə oluna bilməz.

uzatmaq uzadmaq qısaltmaq sökmək

İnhibitorla müalicə olunan heyvan hüceyrəsi ilə bağlı üç sualı nəzərdən keçirin. Suallara cavab vermək üçün etiketləri sürüşdürün. Etiketlər bir dəfə, birdən çox və ya ümumiyyətlə istifadə oluna bilməz.

Bütün hüceyrələrdə təkrarlanan xromosomların ayrılması hüceyrə bölünməsi üçün ilkin şərtdir. Bununla belə, bakteriyalarda xromosomların ayrılması mexanizmi eukariotlardan bir neçə cəhətdən fərqlənir.
Aşağıdakı ifadələri müvafiq qutuya çeşidləyin.

*Bakteriyalarda və eukariotlarda xromosomların ayrılması prosesləri ümumi təkamül mənşəli olsa da, faktiki mexanizmlər fərqlidir. Struktur olaraq, bakteriya hüceyrələrində eukaryotik hüceyrələrdən daha qısa olan tək bir xromosom var və bakteriya hüceyrələrində mitotik mil yoxdur. Bakterial xromosom ayrılmadan əvvəl tam kondensasiya olunmur. Bununla belə, replikasiya edilmiş bakterial xromosomların fiziki ayrılması hələ də hüceyrənin bəzi strukturlarına bağlanmağı nəzərdə tutur: ehtimal ki, replikasiyanın başlanğıcındakı plazma membranı.

Heyvan hüceyrələrində sitokinez hüceyrənin bölünmə müstəvisi boyunca daralması (yarılma şırımının əmələ gəlməsi) ilə həyata keçirilir. Hüceyrə divarları olan bitki hüceyrələrində tamamilə fərqli bir sitokinez mexanizmi inkişaf etmişdir.
Bitki hüceyrələrində sitokinezlə bağlı aşağıdakı müddəalardan hansı doğrudur? Uyğun olan ikisini seçin.

Hüceyrə plitəsi nəticədə iki qız hüceyrəni ayıracaq plazma membranı və hüceyrə divarından ibarətdir. Golgi aparatının vezikülləri mikrotubullar boyunca hərəkət edir, hüceyrə bölünməsi müstəvisində birləşir və hüceyrə plitəsini əmələ gətirir.

Bitki və heyvan hüceyrələri də sitokinez üçün sitoskeletal zülallara ehtiyac duyur, baxmayaraq ki, bu zülalların oynadığı rollar bakteriyalar, bitkilər və heyvanlar arasında fərqlidir.
Cədvəldəki hər bir boşluq üçün hər bir orqanizm qrupu üçün ifadənin doğru və ya yalan olduğunu göstərmək üçün müvafiq etiketi dartın.

doğru doğru yalan yalan yalan doğru doğru yalan doğru

Bu fazalardan hansı mitozun bütün mərhələlərini əhatə edir, lakin başqa hadisələr yoxdur?

_____ ərzində həm nüvənin məzmunu, həm də sitoplazma bölünür.

_____ ərzində hüceyrə böyüyür və həm orqanellərini, həm də xromosomlarını təkrarlayır.

Nukleoli _____ zamanı mövcuddur.

Sitokinez tez-tez, lakin həmişə deyil, _____ ilə müşayiət olunur.

Xromosomlar _____ ərzində görünməyə başlayır.

Sentromerlər bölünür və bacı xromatidlər _____ ərzində tam hüquqlu xromosomlara çevrilirlər.

Mil lifləri _____ ərzində kinetokorlara yapışır.

Animasiyaya baxmaq üçün sənətə klikləyin. Bu animasiya _____ hadisələrini təsvir edir.

Animasiyaya baxmaq üçün sənətə klikləyin. Bu animasiya _____ hadisələrini təsvir edir.

sitokinez heyvan hüceyrələrində baş verir

Animasiyaya baxmaq üçün sənətə klikləyin. Bu animasiya _____ hadisələrini təsvir edir.

Animasiyaya baxmaq üçün sənətə klikləyin. Bu animasiya _____ hadisələrini təsvir edir.

Animasiyaya baxmaq üçün sənətə klikləyin. Bu animasiya _____ hadisələrini təsvir edir.

Animasiyaya baxmaq üçün sənətə klikləyin. Bu animasiya _____ hadisələrini təsvir edir.

sitokinez bitki hüceyrələrində baş verir

Animasiyaya baxmaq üçün sənətə klikləyin. Bu animasiya _____ hadisələrini təsvir edir.

Profaza zamanı homoloji cüt xromosomlar _____-dən ibarətdir.

iki xromosom və dörd xromatid

Aşağıdakılardan hansı kinetokorlara aiddir?

Onlar mikrotubulların xromosomlara bağlandığı yerlərdir.

Aşağıdakılardan hansı hüceyrə dövrünün fazasına onun təsviri ilə düzgün uyğun gəlir?

Bəzi orqanizmlərdə, məsələn, müəyyən göbələklər və yosunlarda hüceyrələr, sonradan sitokinezə məruz qalmadan dəfələrlə hüceyrə dövrü keçirlər. Bunun nəticəsi nə olacaq?

çoxlu nüvədən ibarət böyük hüceyrələr

Aşağıdakılardan hansı ikili parçalanmada olur, lakin mitozda deyil?

Dublikat xromosomlar plazma membranına yapışır.

Sitokalasin B mikrofilament formalaşmasını pozan bir kimyəvi maddədir. Bu hüceyrə bölünməsinə necə müdaxilə edərdi?

Alimlər hüceyrə dövrünün müxtəlif mərhələlərində hüceyrələri təcrid edirlər. Onlar G1 faza hüceyrələrindən 1,5 dəfə çox DNT olan hüceyrələr qrupunu tapırlar. Bu qrupun hüceyrələri _____-dir.

hüceyrə dövrünün S fazasında

Hüceyrə dövründəki ilk boşluq (G1) _____-ə uyğundur.

normal böyümə və hüceyrə funksiyası

Heyvan hüceyrələrində tapılan mikrotubula təşkil edən mərkəz hüceyrə dövrünün bütün mərhələlərində mövcud olan müəyyən edilə bilən bir quruluşdur. Xüsusilə, _____ kimi tanınır.

İnsan və bir çox digər eukaryotik növlərin hüceyrələrində _____ icazə vermək üçün nüvə membranı yox olmalıdır.

mikrotubulların kinetokorlara bağlanması

Mitotik mil _____-də iştirak edən mikrotubulyar quruluşdur.

bacı xromatidlərin ayrılması

Metafaza _____ ilə xarakterizə olunur.

xromosomların ekvatorda düzülməsi

Kinetoxor mikrotubulları sentromerlərin _____ ilə parçalanması prosesinə kömək edir.

əks qütblərə doğru çəkərək gərginlik yaradır

Bəzi hüceyrələrdə bir hüceyrədə bir neçə nüvə olur. Belə çoxnüvəli hüceyrələri necə izah etmək olar?

Hüceyrə təkrar mitoz keçirdi, lakin sitokinez baş vermədi.

Bitki hüceyrəsi sitokinezi heyvan hüceyrəsi sitokinezindən nə ilə fərqlənir?

Bitki hüceyrələri metafaza plitəsinin üzərində hüceyrə divarının tikinti bloklarını ehtiva edən vezikülləri yerləşdirirlər.

FtsZ bakterial sitokinezdə iştirak edən kontraktil halqa əmələ gətirən bakterial sitoskeletal proteindir. Onun funksiyası _____ ilə oxşardır.

eukaryotik heyvan hüceyrələrinin parçalanma şırımları

Heyvan hüceyrələrində sentriollar hansı mərhələdə bir-birindən ayrılmağa başlayır?

Anafazada olan hüceyrədə 20 sentromer varsa, sitokinezdən sonra hər qız hüceyrədə neçə xromosom var?

Taxol Sakit okean yew ağacından çıxarılan xərçəng əleyhinə dərmandır. Heyvan hüceyrələrində Taxol mikrotübüllərin əmələ gəlməsini pozur. Təəccüblüdür ki, bu, mitozu dayandırır. Xüsusilə, Taxol _____ təsir etməlidir.

mitotik milin quruluşu

Aşağıdakılardan hansı heyvan hüceyrələrində deyil, bitki hüceyrələrində sitokinez üçün cavabdehdir?

Anafaza zamanı xromosomların hərəkəti ən çox _____ qarşısını alan bir dərmandan təsirlənəcəkdir.

mikrotubulların qısaldılması

Nüvəyə düşən DNT miqdarının ölçülməsi böyüyən göbələkdən çoxlu sayda hüceyrə üzərində aparılmışdır. Ölçülmüş DNT səviyyələri nüvə başına 3 ilə 6 pikoqram arasında dəyişdi. Hüceyrə dövrünün hansı mərhələsində nüvədə 6 pikoqram DNT var idi?

Bir qrup hüceyrə mitozdan dərhal sonra DNT tərkibi üçün yoxlanılır və hər nüvədə orta hesabla 8 pikoqram DNT olduğu aşkar edilir. S-nin sonunda və G2-nin sonunda neçə pikoqram tapılacaq?

Anafazanın başlanğıcı aşağıdakılardan hansı ilə göstərilir?

Kohezin enzimatik olaraq parçalanır.

Mitozun hansı mərhələsində xromatidlər xromosoma çevrilir?

Bölmə şırımı _____-dir.

plazma membranında qız nüvələri arasında bir yiv

Mitozun prometafazasında düzgün xromosom vəziyyəti hansıdır?

Mitozun telofazasında bir qız nüvəsi üçün düzgün xromosom vəziyyəti hansıdır?

Nüvə materialı müşayiət olunan şəkildə göstərilən hüceyrə mitozun tamamlanmasına doğru davam edərsə, aşağıdakı hadisələrdən hansı daha sonra baş verəcəkdir?

telofaza nüvələrinin əmələ gəlməsi

Yuxarıdakı şəkildə G1 dövrün hansı nömrələnmiş hissəsi(lər)i ilə təmsil olunur?

Yuxarıdakı şəkildə hansı rəqəm DNT sintezini təmsil edir?

Yuxarıdakı şəkildə, nömrələnmiş bölgələrdən hansında metafazada hüceyrələri tapacağını gözləyirsiniz?

Məlumatlar beta, delta və qamma ilə təyin olunmuş üç eukaryotik orqanizmin hüceyrələri tərəfindən hüceyrə dövrünün hər fazasında sərf olunan vaxtın öyrənilməsi nəticəsində əldə edilmişdir.

Hüceyrə Dövrünün Fazalarında Keçirilən Dəqiqələr

Aşağıdakılardan beta və qamma üçün S fazaları arasındakı fərqlə bağlı ən yaxşı nəticə budur ki,

qamma betadan daha çox DNT ehtiva edir

Bir neçə orqanizm, ilk növbədə protistlər, aralıq mitotik təşkilat adlanan şeyə malikdirlər.

Bu protistlər hansı mənada orta səviyyəlidirlər?

Bölünmə zamanı nüvə zərfini saxlayırlar.

Hüceyrə bölünməsinin bu aralıq formaları haqqında ən çox ehtimal olunan fərziyyə hansıdır?

Tam mitoza doğru təkamül addımlarının hamısını deyil, bəzilərini göstərirlər.

Nukleotidlər yeni yaranan DNT-yə daxil edilməzdən əvvəl radioaktiv etiketlənə bilər və buna görə də onların birləşməsini izləmək üçün analiz edilə bilər. Təcrübələr toplusunda, tələbə fakültəsinin tədqiqat qrupu etiketli T nukleotidlərindən istifadə etdi və onları müəyyən vaxtlarda insan hüceyrələrinin bölünməsi mədəniyyətinə təqdim etdi.

Təsvir edilən metoddan istifadə etməklə aşağıdakı suallardan hansı cavablandırıla bilər?

Hüceyrə dövrünün S fazasının uzunluğu nə qədərdir?

Tədqiqat qrupu, etiketlənmiş nukleotidlərin limfositlərin mədəniyyətinə daxil edilməsini öyrənmək üçün öz təcrübələrindən istifadə etdi və aşkar etdi ki, limfositlər mədəniyyətə patogen daxil edildikdən sonra etiketlənmiş nukleotidi əhəmiyyətli dərəcədə yüksək səviyyədə birləşdirdilər. Onlar belə nəticəyə gəldilər ki, _____.

infeksiya lenfositlərin daha sürətli bölünməsinə səbəb olur

Mikroskop vasitəsilə hüceyrənin ortasında inkişaf etməyə başlayan hüceyrə boşqabını və hüceyrə boşqabının hər iki tərəfində əmələ gələn nüvələri görə bilərsiniz. Bu hüceyrə çox güman ki, _____-dir.

sitokinez prosesində olan bitki hüceyrəsi

Aşağıdakılardan hansı mitoz zamanı baş vermir?

Sitokalazin B dərmanı aktin funksiyasını bloklayır. Hüceyrə dövrünün aşağıdakı aspektlərindən hansı sitoxalazin B tərəfindən ən çox pozulur?

parçalanma şırımının əmələ gəlməsi və sitokinez

Motor zülalları xromosomların mitotik milin qütblərinə doğru hərəkətində aşağıdakılardan hansını tələb edir?

Bunlardan hansı kanserogen deyil?

yuxarıda göstərilənlərin hamısı kanserogendir

_____ kolon xərçəngini təşviq edən bir kanserogendir.

Aşağıdakılardan hansı hüceyrə siklinin S fazasının funksiyasıdır?

Qardaş xromatidlərin sintezi

Xromosomların kopyalanması hüceyrə dövrünün aşağıdakı fazalarından hansında baş verir?

Erkən qurbağa embrionlarının ilk bir neçə bölünməsi üçün hüceyrələr birbaşa M fazasından S fazasına və boşluqlar olmadan yenidən M fazasına keçirlər. Erkən qurbağa embrionlarında hüceyrələrin bölünməsi ilə bağlı aşağıdakılardan hansı doğru ola bilər?

Hüceyrələr hər nəsillə kiçilir.

Doğru və ya yanlış? M fazası hüceyrənin xromosomlarının təkrarlanması və bölünməsi ilə xarakterizə olunur.

Bir orqanizmdə normal olaraq 34 xromosom varsa, hüceyrə dövrünün G1 fazasında neçə molekul DNT olmalıdır?

Aşağıdakı hadisələrdən hansı hüceyrə dövrünün dayanmasına səbəb ola bilər?

Hüceyrə dövrünün hansı fazasında nəzarət nöqtəsində lazımi siqnalı qəbul edərsə, hüceyrələr adətən bölünür?

Aşağıdakılardan hansı xoşxassəli şişlərə aiddir, bədxassəli şişlərə deyil?

Onlar orijinal saytları ilə məhdudlaşırlar

Henrietta Lacks-dən ilk dəfə hüceyrələr götürüləndə o, _____ idi.

uşaqlıq boynu xərçəngindən əziyyət çəkir

Həkimlər Henrietta Lacks-dən hüceyrələri necə yığdılar və yetişdirdilər?

Uzun illər əvvəl xərçəngdən müalicə olunarkən hüceyrələr götürülüb və o vaxtdan bu hüceyrələr laboratoriyada yetişdirilib.

Həkimlər onun hüceyrələrini götürmək üçün Henrietta Lacks'dən icazə istədilərmi və ona pul ödənilibmi?

Ona heç vaxt deməyiblər ki, onun kameraları götürülür, nə ona, nə də ailəsinə kompensasiya ödənilməyib.

Henrietta Lacks’ hüceyrələrinin hansı xüsusiyyəti laboratoriyada böyüdüldükdə ən qeyri-adi idi?

Onlar onilliklər boyu mədəniyyətdən sonra bölünməyə və çoxalmağa davam edirlər.

Henrietta Lacks-dən götürülmüş hüceyrələr _____-ə aparan təcrübələr üçün istifadə edilmişdir.

atom radiasiyasının həyata təsirinin sınaqları xərçəng üçün yeni müalicələr poliomielit peyvəndinin inkişafı

Təcrübədə nəzarətlə hansı müalicə müqayisə edilir?

Müalicə olunan glioblastoma hüceyrələri göbək kök hüceyrələrindən inhibitorun iştirakı ilə becərildi, lakin nəzarət hüceyrələri inhibitor olmadan becərildi.

Məlumatlar x oxundakı ədədi dəyişən üçün dəyərləri intervallarda qruplaşdıran histoqram adlanan qrafik növündə tərtib edilir. Histoqram eksperimental subyektlərin bütün qrupunun (bu halda hüceyrələr) davamlı dəyişən (flüoresans miqdarı) boyunca necə paylandığını görməyə imkan verir. Bu histoqramlarda çubuqlar o qədər dardır ki, məlumatlar zirvələri və enişləri aşkar edə biləcəyiniz bir əyri izləyir. Hər bir çubuq həmin intervalda flüoresan səviyyəsinə malik olduğu müşahidə edilən hüceyrələrin sayını əks etdirir. Bu da öz növbəsində həmin hüceyrələrdəki DNT-nin nisbi miqdarını göstərir.
Hansı ox dolayı yolla hüceyrə başına DNT-nin nisbi miqdarını göstərir? Hansı münasibətlə?

X oxu DNT boyanmışdır, ona görə də flüoresan və DNT tərkibi arasında müsbət korrelyasiya var.

Hər hüceyrədə ən çox DNT miqdarı olan hüceyrələrin populyasiyası hansı bölgədə göstərilir?

Hüceyrə dövrünün hansı mərhələsinin hər bir bölgə ilə təmsil olunduğunu müəyyənləşdirin. Bölgələr hər iki histoqramda eyni hüceyrə dövrü fazalarını təmsil edir.

A bölgəsi: G1 bölgəsi B: S bölgəsi C: G2

Nəzarət nümunəsi histoqramında S fazasındakı hüceyrələrin populyasiyası fərqli pik göstərirmi? Niyə və ya niyə?

S fazı irəlilədikcə hüceyrə başına DNT tərkibi dəyişmir, buna görə də S fazasındakı hüceyrələr bir sıra flüoresan səviyyələrə malikdir.

Müalicə olunan nümunə histoqramında hüceyrə dövrünün hansı mərhələsində hüceyrələr daha çox olur?

Nəzarət nümunəsi ilə müqayisədə müalicə olunan nümunədəki hüceyrələrin paylanmasındakı fərq(lər)i hansı ifadə daha yaxşı təsvir edir?

Müalicə olunan hüceyrələr əsasən G1 fazasındadır (A bölgəsi), lakin nəzarət nümunəsində həm G1, həm də G2-də (C bölgəsi) hüceyrələrin zirvələri var.

Paylanma fərqi sizə müalicə olunan nümunədəki hüceyrələr haqqında nə deyir?

Müalicə olunan xərçəng hüceyrələri G1 mərhələsində həbs olunur.

Kök hüceyrədən əldə edilən inhibitorun G1 mərhələsində xərçəng hüceyrəsi dövrünü necə dayandıra biləcəyinin ən yaxşı izahı hansı mexanizmdir?

İnhibitor G1 keçid məntəqəsinin siklin və ya siqnal molekulunun fəaliyyətini bloklaya bilər.

Məlumatlar beta, delta və qamma ilə təyin olunmuş üç eukaryotik orqanizmin hüceyrələri tərəfindən hüceyrə dövrünün hər fazasında sərf olunan vaxtın öyrənilməsi nəticəsində əldə edilmişdir.

Hüceyrə Dövrünün Fazalarında Keçirilən Dəqiqələr

Delta ilə bağlı ən yaxşı nəticə hüceyrələr _____ olmasıdır.

Neyronlar və bəzi digər ixtisaslaşmış hüceyrələr nadir hallarda bölünürlər, çünki onlar _____.

MPF _____-dən ibarət bir dimerdir.

siklin və siklindən asılı kinaz

Siklindən asılı kinaz (Cdk) _____-dir.

fosfat qruplarını digər zülallara bağlayan bir ferment

MPF (mitozu təşviq edən amil) G2-də tutulan yetişməmiş qurbağa oositlərinə daxil edilərsə nə baş verir?

Hüceyrə mitozu tamamladıqdan sonra molekulyar bölünmə tetikleyicileri söndürülməlidir. Mitoz zamanı MPF ilə nə baş verir?

MPF-nin siklin komponenti parçalanır.

M-faza nəzarət nöqtəsi bütün xromosomların mitotik milə bağlanmasını təmin edir. Bu baş verməsə, hüceyrələr çox güman ki, _____-də həbs ediləcək.

Aşağıdakılardan hansı trombositlər tərəfindən zədənin yaxınlığında ifraz olunur?

Aşağıdakılardan hansı katalitik aktiv kompleks əmələ gətirmək üçün kinazla birləşərək hüceyrə siklinin müəyyən vaxtlarında sintez edilən zülaldır?

Aşağıdakılardan hansı hüceyrənin G2 keçid məntəqəsindən keçərək mitoza keçməsinə səbəb olur?

MPF-nin siklin komponenti hansı fazanın sonuna doğru məhv olur?

Yuxarıdakı şəkildə MPF bu mərhələdə ən yüksək konsentrasiyaya çatır.

Sıxlıqdan asılı inhibə aşağıdakılardan hansı ilə izah olunur?

Hüceyrələrin sayı artdıqca, bir hüceyrənin hüceyrə səthi zülalları qonşu hüceyrələrlə təmasda olur və onların bölünməsi dayanır.

Bəzi xərçəng hüceyrələrinin həddindən artıq çoxalma qabiliyyətindən başqa, məntiqi olaraq şişin yaranmasına başqa nə səbəb ola bilər?

müvafiq hüceyrə ölümünün olmaması

Heyvan hüceyrələrinin in vitro və ya in vivo ankorasiyadan asılılığı aşağıdakılardan hansından asılıdır?

Hüceyrə dövrünün cavabı plazma membranından gələn siqnallara nəzarət edir

Tədqiqat qrupu mədəni hüceyrə xəttinin tədqiqinə başladı. Onların ilkin müşahidələri onlara göstərdi ki, hüceyrə xətti nə sıxlıqdan, nə də ankrajdan asılılıq nümayiş etdirmir. Dərhal nə nəticə çıxara bilərdilər?

Hüceyrələr şişlərin xüsusiyyətlərini göstərir.

Kimyaterapevtik dərmanın xərçəng hüceyrələrinin müalicəsində faydalı olması üçün aşağıdakılardan hansı daha çox arzu edilir?

Sürətlə bölünən hüceyrələrə müdaxilə edir.

İnkişaf etmiş bədxassəli şişlərin hüceyrələrində çox vaxt anormal xromosomlar və anormal sayda xromosomlar olur. Bədxassəli şişlərlə xromosom anomaliyaları arasındakı əlaqəni nə izah edə bilər?

Xromosom anomaliyaları olan hüceyrələri dayandırmaq üçün hüceyrə dövrü nəzarət nöqtələri mövcud deyil.

Zebra balığı nüvələrinin meiotik sitozolun təsiri altında NEP55 və L68 zülallarının siklin-asılı kinaz 2 tərəfindən fosforilasiyası baş verdi. NEP55 daxili nüvə membranının zülalı, L68 isə nüvə təbəqəsinin zülalıdır. Mitoz prosesində bu zülalların fosforlaşmasının ən çox ehtimal olunan rolu nədir?

Onlar nüvə zərfinin sökülməsində iştirak edirlər.

Sıxlıqdan asılı inhibə sıxlıqlı hüceyrələrin müəyyən optimal sıxlıq və yerdə bölünməni dayandırdığı bir hadisədir. Bu fenomen hüceyrə səthi zülalının qonşu hüceyrənin səthindəki analoquna bağlanmasını əhatə edir. Böyüməni maneə törədən bir siqnal hər iki hüceyrəyə göndərilir və onların bölünməsinə mane olur. Müəyyən xarici fiziki amillər bu inhibə mexanizminə təsir göstərə bilər.

Hüceyrə böyüməsinin qarşısını almaq üçün hüceyrə dövrü zamanı baş verə biləcək təbii hadisələr haqqında düzgün proqnoz verən ifadəni seçin.

Hüceyrələrin sayı artdıqca, hər hüceyrə üçün tələb olunan böyümə faktorlarının və qida maddələrinin miqdarı hüceyrənin böyüməsini təmin etmək üçün kifayət etmir.

Canlı hüceyrələrin özbaşına əmələ gələ bilməyəcəyini, ancaq əvvəllər mövcud olan hüceyrələrdən əmələ gəldiyini ilk dəfə (1860-cı illərdə) qəbul edən şəxs __________-dir.

Xoşxassəli şiş ilə bədxassəli şiş arasındakı fərq nədir?

Xoşxassəli şişlərin hüceyrələri bədxassəli şişlərin hüceyrələrinə metastaz vermir.

Mitotik hüceyrə dövrünün funksiyası __________ olan qız hüceyrələri istehsal etməkdir.

ana hüceyrə ilə genetik olaraq eynidir (heç bir mutasiya olmadıqda)

Aşağıdakı fərziyyələrdən hansı mədəniyyətdə xərçəng hüceyrələrini müşahidə etməklə ən yaxşı şəkildə dəstəklənir?()

Xərçəng hüceyrələri sıxlıqdan asılı inhibə nümayiş etdirmir.

Aşağıdakı insan hüceyrələrindən hansının bölündüyünü görmək ÇƏKİNDİR?

Xərçənglə əlaqəli terminləri onların təsvirlərinə uyğunlaşdıra bilərsinizmi?

xoşxassəli şiş bədxassəli şiş Metastaz xərçəng karsinomu

Cinsi yolla çoxalan çoxhüceyrəli orqanizmlərdə mitozun əsas funksiyaları _____-dir.

zədələnmiş hüceyrələrin böyüməsi və inkişafı toxuma təmiri/əvəz edilməsi

Profaza zamanı hansı hadisələr baş verir?

Nüvə zərfi parçalanır. Xromosomlar sıxlaşır və mil liflərinə bağlanır.

orijinal ana hüceyrənin sitoplazmasını və orqanoidlərini iki ayrı qız hüceyrəyə bölməklə mitozu bitirir.

_____ zamanı hüceyrə normal funksiyalarını yerinə yetirir və xromosomlar nüvə boyunca nazik şəkildə yayılır.

Bölünən hüceyrəyə işıq mikroskopundan baxdıqda, hüceyrənin əks uclarında iki ayrı xromosom qrupu görürsünüz. Hər qrup ətrafında yeni nüvə zərfləri formalaşır. Daha sonra xromosomlar boşaldıqca yox olmağa başlayır. Siz _____ şahidisiniz.

Bakteriyada ikili parçalanma zamanı __________.

replikasiyanın mənşəyi bir-birindən ayrılır

Bir biokimyaçı laboratoriyada böyüyən hüceyrələrdə DNT-nin miqdarını ölçdü və hüceyrələrdəki DNT-nin miqdarının __________ iki dəfə artdığını aşkar etdi.

G1 və G2 fazaları arasında

Hüceyrə mitoza başlamazdan əvvəl nə baş verməlidir?

Xromosomlar dublikat edilməlidir.

Mitozun hansı mərhələsində sentrosomlar bir-birindən uzaqlaşır və nüvə zərfi parçalanır?

Mitozun hansı mərhələsində xromosomlar hüceyrənin mərkəzində düzülür?

Mitozun hansı mərhələsində bacı xromatidlər ayrılır və hüceyrənin əks qütblərinə doğru hərəkət etməyə başlayır?

Xromosomlar qütblərə çatır və nüvə zərfləri mitozun hansı mərhələsində əmələ gəlir?

Mitoz (M) fazasının sonunda sitoplazma _________________ adlanan proseslə bölünür.

Qardaş xromatidlərlə bağlı aşağıdakılardan hansı YANLIŞdır?

Sitokinez baş verdikdən sonra hər iki bacı xromatid eyni qız hüceyrəsində bitir.

Eukaryotik xromosomu təşkil edən DNT və zülal kompleksi düzgün olaraq __________ adlanır.

Aşağıdakılardan hansı əksər bakteriyaların ikili parçalanmasında iştirak edir?

tək valideyn xromosomunun surətinin hər bir qız hüceyrəsinə paylanması

Replikasiya edilmiş DNT-nin iki qoşa zəncirinin bir yerdə saxlandığı xromosomun bölgəsi __________ adlanır.

Aşağıdakı proseslərdən hansı bakteriyaların bölünməsində baş vermir?

Sentromer __________ olan bölgədir.

bacı xromatidlər bir-birinə profazada bağlanır

Hüceyrə bioloqu hüceyrə mədəniyyətində böyüyən çəyirtkə hüceyrələrində DNT-nin miqdarını diqqətlə ölçdü. Hüceyrə dövrünün G2 mərhələsində tədqiq edilən hüceyrələr 200 vahid DNT ehtiva edirdi. Çəyirtkə qız hüceyrələrindən birində hüceyrə dövrünün G1-də DNT-nin miqdarı nə qədər olardı?

Hüceyrə bölünməsi ilə məşğul olmayan somatik insan hüceyrəsində neçə ana xromosomu var?

Aşağıdakılardan hansı mitoz zamanı baş vermir?

xromosomların replikasiyası

PDGF ilə toxuma mədəniyyəti təcrübələri göstərir ki, bu maddə olmadan __________.

fibroblastlar bölünə bilmir

Hüceyrə dövrünə 32 xromosomla daxil olan hüceyrə hər biri __________ olan iki qız hüceyrəsi əmələ gətirəcək.

sadalanan xromosom nömrələrinin heç biri

Xromatidlər __________-dir.

eyni dublikat xromosomun bir hissəsidirsə, bir-birinin eyni nüsxələri

İnterfaza zamanı tipik bir eukaryotik hüceyrənin genetik materialı __________ təşkil edir.

nüvədə uzun xromatin zəncirləri kimi dağılır

Mitozun telofazasında mitotik mil parçalanır və xromatin bükülür. Bu, mahiyyətcə __________-də baş verənlərin əksinədir.

"Sitokinez" __________ aiddir.

sitoplazmanın bölünməsi

Mitozun başlanğıcında bir hüceyrədə 60 xromatid varsa, hüceyrə dövrünün sonunda hər qız hüceyrədə neçə xromosom tapılacaq?

DNT replikasiyası __________-də baş verir.

interfazanın S mərhələsi

Aşağıdakı mitoz fazalarından hansı nüvə zərfinə görə prometafazanın əksinədir?

Heyvan hüceyrəsi mitozunda parçalanma şırımı hüceyrə dövrünün hansı mərhələsində əmələ gəlir?

Əgər insan somatik hüceyrəsi bölünmək üzrədirsə, onda __________ xromatidləri var.


Videoya baxın: Meyoz bölünməasan və ətraflı izah (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Magrel

    Mənə elə gəlir ki, əla fikirdir. Tamamilə sizinlə razılaşacağam.

  2. Mazugami

    Həqiqətən və əvvəl tanımadığım kimi

  3. Nickolaus

    What a nice response

  4. Nakinos

    Təsdiq edirəm. Yuxarıda göstərilənlərin hamısı ilə razıyam. Məsələni müzakirə etməyə çalışaq.

  5. Laidly

    On your place I would try to solve this problem itself.

  6. Bainbrydge

    Ümidsiz olmayın! Daha şən!

  7. Sidney

    Pul onsuz pis olduğu qədər yaxşı deyil. Faydalı məişət məsləhətləri: Zibil, ondan olan qoxu dözülməz olduqda çıxarıla bilər. Südün qaçmasının qarşısını almaq üçün inəyi möhkəm bağlayın. Yeni bir şey almasanız ayaqqabı daha uzun olacaq. Birinin ailənizdən birisini qoysanız, bir qaynar çayça daha yüksək səslənəcək ... Əgər çırpmasam, səpərəm. Güzgüdə baxırdınızsa, orada heç kim tapmadınızsa, qarşısıalınmazsınız! Nə qədər yaşamışam, iki şeyi başa düşə bilmirəm: toz haradan gəlir və pul haradan gedir.

  8. Nikolkree

    Hesab edirəm ki, yanılırsınız. Mən mövqeyi müdafiə edə bilərəm. PM-ə yazın, danışarıq.

  9. Dilkis

    Demək istəyirəm ki, səhvə icazə verirsiniz. Mən mövqeyimizi müdafiə edə bilərəm. PM-də mənə yazın, danışacağıq.



Mesaj yazmaq