Məlumat

Klonlaşdırma üçün qələvi fosfataz və liqaz protokolu

Klonlaşdırma üçün qələvi fosfataz və liqaz protokolu



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Şəkildə dairəvi molekul məhdud vektor, xətti qırmızı molekul isə DNT əlavəsidir. Mən bu protokolu dərs qeydlərimdə tapdım, amma liqazanın 5'-OH və 5'-P arasında reaksiyanı katalizləməsinin necə mümkün olduğunu başa düşmürəm. Bu reaksiya məhsul olaraq əlavənin 2 nukleotidi ilə vektor arasında 5'-5' körpü təşkil etməlidir. Adətən liqaz 5'-P və 3'-OH arasındakı boşluqları düzəldir, beləliklə nuklein turşularında normal olan nukleotidlər arasında 5'-3' bağlar yaradır, ona görə də mənim sualım, DNT-nin bir xüsusiyyətə malik olmasına baxmayaraq, necə işləməsi mümkündür. 5'-5' bağ?


DNT liqazası arasında bir əlaqənin meydana gəlməsini katalizləyir 3'-OH5'-PO4 onun nuklein turşusu substratı. (Bax Lehnman, 1974) Ligazanın hərəkət etməsinə imkan verən müvafiq uclar bir-birinə yaxın olduqda bağlanma bağı yaranacaq. Diaqramınızı yenidən çəkək və ona 5' və 3' işarələrini əlavə edək. Düşünürəm ki, bu, bəzi məqamları aydınlaşdırmağa kömək edə bilər.

Bağlama ilə qələvi fosfatazanın müalicəsinə gəldikdə, düşünürəm ki, Dale və Greenaway bunu məndən daha yaxşı söylədi. Sitat (Dale və Greenaway, 1985):

[Strategiya] parçalanmış vektor DNT-ni DNT-dən 5'-fosfat qrupunu çıxaran qələvi fosfatazla müalicə etməkdir. Terminal 5'-fosfatın olması DNT liqazının fəaliyyəti üçün zəruri olduğundan, fosforlanmış DNT zəncirinin bağlanması reaksiyasında iştirak edə bilməyəcək. Bu, xəttiləşdirilmiş vektorun hər iki ucuna aid olacağından, ucları yenidən birləşdirmək mümkün deyil, yəni valideyn vektorunun bərpası mümkün deyil. Bu vektor tərəfindən çevrilmənin çox aşağı tezliyi ilə nəticələnir (çünki xətti DNT çox zəif çevrilir). Bununla belə, 3'-hidroksil vektoru bitir var klonlanacaq hər hansı DNT fraqmentlərinin 5'-fosfat uclarına qoşulmaq üçün (DNT ligaza ilə) mövcuddur. Bu, vektor hissəsinin hər bir ucunda tək zəncirli nik ilə dairəvi rekombinant molekullarla nəticələnəcək. Bu molekullar adətən tam bağlanmış məhsul kimi səmərəli şəkildə çevrilir və çentiklər transformasiyadan sonra in vivo təmir edilir. Beləliklə, vektor molekullarının fosfatazla müalicəsi transformasiya olunmuş hüceyrələrin populyasiyasında hibrid DNT molekullarının nisbətini artırır, həmçinin vektorun oliqomerik formalarının yaranmasının qarşısını alır.

İstinadlar

Dale, J.W. və Greenaway, P.J. (1985) “Vektor regenerasiyasının qarşısını almaq üçün qələvi fosfatazanın istifadəsi” Metodlar Mol. Biol. 2: 231-236. Kağıza keçid

Lehnman, I.R. (1974) "DNT Ligase: Struktur, Mexanizm və Funksiya" Elm 186: 790-797. Kağıza keçid


Klonlaşdırma

Məhdudiyyət fermentləri (məhdudiyyət endonükleazları) DNT-ni xüsusi tanınma yerlərində (və ya onlara yaxın) kəsən zülallardır (istehsalçıların kataloqlarına və ya Məhdudiyyət fermenti verilənlər bazasına baxın). Hədəf DNT-ni kəsmə üsulu ilə fərqlənən iki növ məhdudlaşdırıcı ferment mövcuddur:

Küt uc kəsicilər. Bu fermentlər hədəf DNT-nin hər iki zəncirini eyni yerdə kəsərək küt uclar yaradır.

Yapışqan son kəsicilər. Bu fermentlər hədəf DNT-nin hər iki zəncirini müxtəlif nöqtələrdə kəsərək 1-4 nukleotiddən (yapışqan uclar adlanır) 3'- və ya 5'-aşıntılar yaradır.

Klonlama və ya ifadə vektoruna bir DNT əlavəsini klonlaya bilmək üçün hər ikisi uyğun uclar yaradan iki məhdudlaşdırıcı fermentlə müalicə edilməlidir. İstifadə olunan fermentlərdən ən azı biri yapışqan uc kəsici olmalıdır ki, əlavənin düzgün istiqamətə daxil olmasını təmin etsin.

İki həzmi eyni vaxtda həyata keçirə bilsəniz (ikiqat həzm) çox vaxtınıza qənaət edəcəksiniz. Bütün məhdudlaşdırıcı fermentlər kommersiya olaraq mövcud olan bütün tamponlarda eyni dərəcədə yaxşı işləmir və buna görə də yoxlamağa dəyər (məs. New England Biolabs kataloqunun istinad əlavəsində) hansı fermentlərin uyğun olduğunu və hansı tamponda olduğunu. Səmərəli həzmi təmin etmək üçün iki tanınma yeri bir-birindən 10 əsas cütdən çox olmalıdır. Fermentlərdən biri zəif kəsicidirsə və ya sahələr 10 əsas cüt və ya daha az ayrılırsa, həzmlər ardıcıl olaraq aparılmalıdır. Birinci həzm ən zəif kəsici olan fermentlə aparılmalıdır və həzm yoxlanıldıqdan sonra əlavə edilən ikinci ferment reaksiya qarışığının nümunəsini agaroza gel üzərində işlətməklə aparılmalıdır.

Klonlama işimiz üçün müxtəlif 5'-çıxışlar yaradan iki yapışqan kəsici seçdik:

  • 3'-end: Nco I. Onun tanınma saytı aşağıdakıları ehtiva edir ATG kodon başlayın.
  • 5'-end: BamH I. Əksər tamponlarda ucuz və aktivdir.

Xüsusi istifadə etmək tövsiyə olunur BamH I bufer (New England Biolabs) bu ikiqat həzm üçün.


Ətraflı Məlumat

Proqramlar

  • Özünü bağlama və vektor fonunu azaltmaq üçün fosfat qrupunun çıxarılması
  • Kinaz etiketləmə reaksiyalarından əvvəl DNT 5' termininin defosforilasiyası

Mənbə

Saxlama

Bakterial qələvi fosfataz (E. coli) son dərəcə sabitdir və tamamilə istiliklə təsirsiz hala gətirilmir, buna görə də fermenti təsirsiz hala gətirmək üçün reaksiya məhsulları fenol-xloroform ekstraksiyasından sonra etanol çöküntüsü ilə iki dəfə təmizlənməlidir.

Bufer

10X Reaksiya Tamponu [500 mM Tris-HCl (pH 9.0), 10 mM MgCl ilə təchiz edilmişdir.2]

Vahid tərifi

Bir vahid 1 mikromol/dəq əmələ gətirmək üçün tələb olunan ferment miqdarı kimi müəyyən edilir səh-nitrofenoldan səh-nitrofenilfosfat 25°C və pH 8.0.

Konsentrasiya

Məhsul sitatları

Reid, T. W. və Wilson, I. B. E. coli qələvi fosfataz. Ferment. 4, 373&ndash415 (1971).

Takanami, M. Ribonuklein turşularının 5'-terminal nukleotid ardıcıllığının təhlili: I. 5'-terminallar. Escherichia coli ribosomal RNT. J. Mol. Biol. 23, 135&ndash48 (1967).

Əlavə məhsul məlumatı

Saxlama şəraiti, məhsul komponentləri və texniki spesifikasiyalar haqqında məlumat üçün məhsulun Təhlil Sertifikatı ilə tanış olun. Lütfən, dəst komponentlərini müəyyən etmək üçün Kit Komponentləri Siyahısına baxın. Təhlil Sertifikatları və Komponentlər Siyahıları Sənədlər tabının altında yerləşir.

Takara Bio USA, Inc.
Amerika Birləşmiş Ştatları/Kanada: +1.800.662.2566 &bull Asiya Sakit Okean: +1.650.919.7300 &bull Avropa: +33.(0)1.3904.6880 &bull Yaponiya: +81.(0)77.565.6999
YALNIZ TƏDQİQAT ÜÇÜN İSTİFADƏ. DİAQNOSTİK PROSEDURLARDA İSTİFADƏ ÜÇÜN DEYİL. © 2021 Takara Bio Inc. Bütün hüquqlar qorunur. Bütün ticarət nişanları Takara Bio Inc. və ya onun ABŞ və/və ya digər ölkələrdəki filial(lar)ının və ya onların müvafiq sahiblərinin mülkiyyətidir. Bəzi əmtəə nişanları bütün yurisdiksiyalarda qeydə alınmaya bilər. Əlavə məhsul, əqli mülkiyyət və məhdudlaşdırılmış istifadə məlumatı takarabio.com saytında mövcuddur.

Takara Bio Europe biotexnologiya vasitəsilə insan vəziyyətinin yaxşılaşdırılmasına sadiq olan aparıcı həyat elmləri şirkəti olan Takara Bio Group-un üzvüdür. Takara, Clontech və Cellartis brendlərimiz vasitəsilə bizim missiyamız kəşfi sürətləndirmək üçün yüksək keyfiyyətli innovativ alətlər və xidmətlər inkişaf etdirməkdir.


Ətraflı Məlumat

Proqramlar

  • Klonlaşdırma zamanı xətti vektorun özünü bağlamasının və vektor fonunun azalması
  • Kinaz etiketləmə reaksiyalarından əvvəl DNT-nin defosforilasiyası
  • 5'-ucu etiketləmədən əvvəl şablonun hazırlanması
  • Protein defosforilasiyası

Mənbə

Saxlama

Qeydlər

Dana bağırsağının qələvi fosfatazası (CIAP) tamamilə istiliklə təsirsiz hala gətirilə bilməz və buna görə də DNT məhsulunun gel və ya spin kolonunun təmizlənməsi və ya fenol-xloroform ekstraksiyası ilə təmizlənməsi tövsiyə olunur.

Bufer

10X Reaksiya Tamponu [500 mM Tris-HCl (pH 9.0), 10 mM MgCl ilə təchiz edilmişdir.2].

Vahid tərifi

Bir vahid 1 &mikromol/dəq əmələ gətirən fermentin miqdarı kimi müəyyən edilir səh-nitrofenoldan səh-37°C və pH 9.8-də nitrofenilfosfat.

Konsentrasiya

Məhsul sitatları

Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. Molekulyar klonlaşdırma: laboratoriya təlimatı. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Əlavə məhsul məlumatı

Saxlama şəraiti, məhsul komponentləri və texniki spesifikasiyalar haqqında məlumat üçün məhsulun Təhlil Sertifikatı ilə tanış olun. Lütfən, dəst komponentlərini müəyyən etmək üçün Kit Komponentləri Siyahısına baxın. Təhlil Sertifikatları və Komponentlər Siyahıları Sənədlər tabının altında yerləşir.

Takara Bio USA, Inc.
Amerika Birləşmiş Ştatları/Kanada: +1.800.662.2566 &bull Asiya Sakit Okean: +1.650.919.7300 &bull Avropa: +33.(0)1.3904.6880 &bull Yaponiya: +81.(0)77.565.6999
YALNIZ TƏDQİQAT ÜÇÜN İSTİFADƏ. DİAQNOSTİK PROSEDURLARDA İSTİFADƏ ÜÇÜN DEYİL. © 2021 Takara Bio Inc. Bütün hüquqlar qorunur. Bütün ticarət nişanları Takara Bio Inc. və ya onun ABŞ və/və ya digər ölkələrdəki filial(lar)ının və ya onların müvafiq sahiblərinin mülkiyyətidir. Bəzi əmtəə nişanları bütün yurisdiksiyalarda qeydə alınmaya bilər. Əlavə məhsul, əqli mülkiyyət və məhdudlaşdırılmış istifadə məlumatı takarabio.com saytında mövcuddur.

Takara Bio Europe biotexnologiya vasitəsilə insan vəziyyətinin yaxşılaşdırılmasına sadiq olan aparıcı həyat elmləri şirkəti olan Takara Bio Group-un üzvüdür. Takara, Clontech və Cellartis brendlərimiz vasitəsilə bizim missiyamız kəşfi sürətləndirmək üçün yüksək keyfiyyətli innovativ alətlər və xidmətlər inkişaf etdirməkdir.


Amerika

Sayt ingilis dilində göstəriləcək.

Biz bu kukilərdən saytımızın təhlükəsiz və düzgün işləməsini təmin etmək üçün istifadə edirik ki, onlar xidmətlərimizin işləməsi üçün lazımdır və sistemlərimizdə söndürülə bilməz. Onlar adətən yalnız daxil olmaq, alış-veriş səbətindən istifadə etmək və ya formaları doldurmaq kimi xidmətlər üçün sorğuya bərabər olan sizin etdiyiniz hərəkətlərə cavab olaraq təyin edilir. Siz brauzerinizi bu kukiləri bloklamaq və ya sizi xəbərdar etmək üçün təyin edə bilərsiniz, lakin xidmətlərimizin bəzi hissələri onlarsız işləməyəcək. İstifadə etdiyimiz digər kukilər kimi, ciddi şəkildə zəruri olan kukilər birinci tərəf kukiləri və ya üçüncü tərəf kukiləri ola bilər.

Biz bu kukilərdən parametrlərinizi və seçimlərinizi yadda saxlamaq üçün istifadə edirik. Məsələn, biz sizin dil seçimlərinizi yadda saxlamaq üçün bu kukilərdən istifadə edə bilərik.
Üstünlük kukilərinə icazə verin

Biz bu kukilərdən xidmətlərimizlə qarşılıqlı əlaqəniz haqqında məlumat toplamaq və onları ölçmək və təkmilləşdirməkdə bizə kömək etmək üçün istifadə edirik. Məsələn, sizin müəyyən bir səhifə ilə əlaqə saxlayıb-etmədiyinizi müəyyən etmək üçün bu kukilərdən istifadə edə bilərik.
Performans/Statistika kukilərinə icazə verin

Biz və reklam partnyorlarımız bu kukilərdən reklamları çatdırmaq, onları sizin üçün daha uyğun və mənalı etmək, həm xidmətlərimizdə, həm də digər internet saytlarında və sosial mediada reklam kampaniyalarımızın səmərəliliyini izləmək üçün istifadə edirik.
Marketinq kukilərinə icazə verin


Amerika

Sayt ingilis dilində göstəriləcək.

Biz bu kukilərdən saytımızın təhlükəsiz və düzgün işləməsini təmin etmək üçün istifadə edirik ki, onlar xidmətlərimizin işləməsi üçün lazımdır və sistemlərimizdə söndürülə bilməz. Onlar adətən yalnız daxil olmaq, alış-veriş səbətindən istifadə etmək və ya formaları doldurmaq kimi xidmətlər üçün sorğuya bərabər olan sizin etdiyiniz hərəkətlərə cavab olaraq təyin edilir. Siz brauzerinizi bu kukilər haqqında sizi bloklamaq və ya xəbərdar etmək üçün təyin edə bilərsiniz, lakin xidmətlərimizin bəzi hissələri onlarsız işləməyəcək. İstifadə etdiyimiz digər kukilər kimi, ciddi şəkildə zəruri olan kukilər birinci tərəf kukiləri və ya üçüncü tərəf kukiləri ola bilər.

Biz bu kukilərdən parametrlərinizi və seçimlərinizi yadda saxlamaq üçün istifadə edirik. Məsələn, biz sizin dil seçimlərinizi yadda saxlamaq üçün bu kukilərdən istifadə edə bilərik.
Üstünlük kukilərinə icazə verin

Biz bu kukilərdən xidmətlərimizlə qarşılıqlı əlaqəniz haqqında məlumat toplamaq və onları ölçmək və təkmilləşdirməkdə bizə kömək etmək üçün istifadə edirik. Məsələn, sizin müəyyən bir səhifə ilə əlaqə saxlayıb-etmədiyinizi müəyyən etmək üçün bu kukilərdən istifadə edə bilərik.
Performans/Statistika kukilərinə icazə verin

Biz və reklam partnyorlarımız bu kukilərdən reklamları çatdırmaq, onları sizin üçün daha uyğun və mənalı etmək, həm xidmətlərimizdə, həm də digər internet saytlarında və sosial mediada reklam kampaniyalarımızın səmərəliliyini izləmək üçün istifadə edirik.
Marketinq kukilərinə icazə verin


Yapışqan son məhsulların fosfataz müalicəsi? - (15 sentyabr 2006)

2400 bp vektora 800 bp fraqmenti daxil etməyə çalışır. Hər ikisi Bam HI və Hind III ilə ikiqat həzm olundu. İkisi Roche's Rapid Ligation Kit (T4 ligase) ilə bağlanmalı idi. Erkən problemlər yaşayırdım, ona görə də həzm olunmuş vektoru və həzm olunmuş 800 bp parçasını dana bağırsağı və karides fosfatları ilə fosforsuzlaşdırmağı öz üzərimə götürdüm.

Mənə dedilər ki, bu, küt uclu ligasiyalar üçün yaxşı olsa da, yapışqan sonlu ligasiya üçün ən azı vektorda və ya əlavədə ligasyonun davam etməsi üçün fosfatlar olmalıdır. Bağlamalara və transformasiyalara daha çox vaxt sərf etməyə başlamazdan əvvəl kimsə mənə bunun doğru olduğunu və ya köhnə arvad nağılı olduğunu deyə bilərmi?!!

Bilirəm ki, siz vektoru fosforsuzlaşdıra bilərsiniz, lakin məncə, siz əlavəni də fosforsuzlaşdıra bilərsiniz: sərbəst fosfat olmadan necə ligat edə bilərsiniz?

bəli, düzdür
vektor üçün defosforulyasiya vektorun bağlanmasının qarşısını almaq üçün vacibdir, lakin
əlavə üçün, o, sadəcə bir fraqment olduğu üçün deyil

və buna görə vektor bağlama üçün işləməli olduğumuz şeydir,
ona görə də vektorun küt ucları və ya yapışqan ucları olmasından asılı olmayaraq hər iki ucunda sərbəst 5-P olmalıdır.

başqa cavabları gözləyək..

biz yalnız vektoru defosforiləşdiririk, lakin bu, yalnız küt son klonlama üçündür. Yapışqan uçlar üçün biz nadir hallarda bu prosedurdan keçirik.

Əgər vektoru və inserti defosforilləşdirsəniz, bağlama işləməyəcək.

Nə vektor, nə də əlavə fosforsuzlaşdırılmadıqda, yapışqan uc ligasyonu işləmişdir. Bununla belə, bağlama fosfatazla müalicə olunan vektor və müalicə olunmamış əlavə ilə işləmədi. Niyə bilmirəm, amma bir dəfə işə başladım, buna görə xoşbəxtəm!!

Hər kəs protoplast əmələ gəlməsi üçün Novozyme 234 üçün yaxşı alternativ bilir?

protoplast şey haqqında əmin deyil, lakin mənim .02 əlavə etmək istədi.

fosfataz üçün, istifadə etdiyiniz növdən və reaksiya şərtlərinizdən asılı olaraq, ferment fosfatı çıxardıqdan sonra DNT fraqmentinizin uclarını çeynəyə bilər. belə ki, bəzən o, işləməyəcək, çünki bəlkə siz ucların birini və ya hər ikisini məhv etmisiniz ki, saytlar artıq mövcud deyil və onlar tamamlayıcı yapışqan sonluğa qayıda bilmirlər. bəzən DNT-ni pozmadan ən yaxşı defosforilasiyanı əldə etmək üçün fosfataza reaksiyasının şərtləri ilə oynamaq lazımdır.

protoplast şey haqqında əmin deyil, lakin mənim .02 əlavə etmək istədi.

fosfataz üçün, istifadə etdiyiniz növdən və reaksiya şərtlərinizdən asılı olaraq, ferment fosfatı çıxardıqdan sonra DNT fraqmentinizin uclarını çeynəyə bilər. belə ki, bəzən o, işləməyəcək, çünki bəlkə siz ucların birini və ya hər ikisini məhv etmisiniz ki, saytlar artıq mövcud deyil və onlar tamamlayıcı yapışqan sonluğa qayıda bilmirlər. bəzən DNT-ni pozmadan ən yaxşı defosforilasiyanı əldə etmək üçün fosfataza reaksiyasının şərtləri ilə oynamaq lazımdır.

Onlar qeyd etməyiblər ki, təlimatda Roche-dan karides və dana bağırsağındakı qələvi fofatların birləşməsindən istifadə olunub. Nə vektor, nə də insert fosforsuzlaşdırılmadığı zaman uğurlu ligasyonun və vektorun fosfataza ilə müalicə edildiyi zaman uğursuz ligasyonun niyə əldə edildiyini izah edərdim.

Amikins ilə razıyam -- deposforilasiya vektorun özünü bağlama şansınızı minimuma endirmək və vektorunuzu məhv etmək arasında balansdır.

Sözügedən təcrübəyə heç bir defosporilasiya lazım deyildi, çünki (hər iki fermentin vektoru kəsdiyini fərz etsək), vektorun öz-özünə bağlanması mümkün deyildi. Lakin, bir ferment həzmi və ya küt həzm nəticəsində vektoru deposforilləşdirmək lazım olduqda, çox az defosforilaza istifadə edin, defosforilasiya reaksiyasını məhdud müddət ərzində (37°C-də 5-15 dəqiqə) inkubasiya edin və gel- istifadə etməzdən əvvəl vektoru təmizləyin.


Dizayn (fermentlərin seçilməsi)

Addgene-nin Ardıcıllıq Analizatoru da daxil olmaqla bir çox DNT analizi alətləri verilmiş ardıcıllıqda hansı məhdudiyyət sahələrinin mövcud olduğunu müəyyən etməyə imkan verir. Məhdudiyyət fermentlərini seçərkən, aşağıdakı fermentləri seçmək istərdiniz:

  • Vuruşunuzu yan tərəfə qoyun, lakin içəridən kəsməyin
  • Alıcı plazmidinizdə istədiyiniz yerdə (adətən Çoxlu Klonlama Saytında (MCS)), lakin plazmidin başqa yerində kəsməyin
  • Alıcı plazmiddə insertinizin düzgün oriyentasiyada olması ilə nəticələnəcək. (Siz geninizin antisens versiyasını ifadə etmək istəmirsiniz!)
  • Alıcı plazmiddə etiketlər və ya füzyon zülalları ilə çərçivədədirlər (əgər siz füzyon zülalı yaradırsınızsa)

İdeal olaraq, subklonlaşdırmanız üçün iki fərqli məhdudlaşdırıcı ferment tapacaqsınız. Tək bir fermentdən istifadə etmək də mümkündür, lakin bu, alıcı plazmidinizin fosfatazla müalicəsini və əlavənin düzgün oriyentasiyada klonlandığını yoxlamaq üçün daha sonra xüsusi hazırlanmış test həzmini tələb edəcək.

Bu meyarlara cavab verən fermentləri tapa bilmirsinizsə, qorxmayın. Digər seçimləriniz var, məsələn:

  • İstədiyiniz məhdudiyyət saytlarının əlavə edin : Siz PCR Əsaslı Klonlamadan istifadə edə və oliqoslarınızın uclarına məhdudiyyət saytları əlavə edə bilərsiniz. Bu, qəbuledici plazmidin MCS ilə uyğun gələn məhdudiyyət saytları ilə əhatə olunmuş əlavənizin versiyasını hazırlamağa imkan verəcək. Bununla belə, siz hələ də insertinizdə kəsilən məhdudlaşdırıcı fermentlərdən qaçınmalısınız.
  • Alıcı plazmidinizə istədiyiniz məhdudiyyət saytlarının əlavə edilməsi : Siz Annealed-oligo Cloning istifadə edərək alıcı plazmidinizin MCS-ni dəyişdirə bilərsiniz.

Əgər daxiletmənizi əhatə edən və alıcı plazmiddə düzgün oriyentasiya ilə nəticələnəcək fermentlər üçün bir neçə varianta sahib olmaq şanslısınızsa, bir ferment dəstinin eyni məhdudlaşdırıcı ferment tamponunda işləyəcəyini yoxlamaq faydalıdır (bax: New England Biolabs. məhdudlaşdırıcı ferment tamponları haqqında daha çox məlumat). Eyni tamponda fəaliyyət göstərə bilən fermentləri seçsəniz, bu, gələcək addımlarda vaxtınıza qənaət edəcəkdir.


Plazmid Klonlamada Dana Bağırsaq Qələvi Fosfatazını (CIP) istifadə etməlisiniz?

Ellen Mossner və kolleqalarının [1] 1980-ci il tarixli qeyri-müəyyən əlyazması ilk dəfə onun təcridini təsvir etdi, lakin gen klonlamasında dana bağırsağında qələvi fosfatazanın (CIP) istifadəsinin ilk dərc edilmiş təsviri bir müddət sonra Sambrook və digərlərinin əfsanəvi 1989-cu ildə nəşr olundu. təlimat, Molekulyar Klonlama (2-ci Nəşr) [2]. Beləliklə, vektoru fosforsuzlaşdırmaq üçün CIP-dən istifadə etmək üçün çətin elm yarandı.

CIP xəttiləşdirilmiş DNT-nin 5-ci ucundan fosfat qrupunu çıxarmaqla işləyir, bu o deməkdir ki, siz vektor molekulunuzun öz-özünə bağlanmasının qarşısını almaq və ligasiya və transformasiyadan sonra yüksək boş vektor fonunun baş ağrısından qorunmaq üçün ondan istifadə edə bilərsiniz. . Ancaq onunla işləmək əsl ağrı ola bilər, çünki:

1. İstilik denatürasiyası ilə aradan qaldırmaq çətindir. Protokolda deyilir ki, fermenti 65°C-də 30 dəqiqə ərzində denatürasiya edir, lakin bu, onu tamamilə aradan qaldırmır. Buna görə də əlavə təmizləmə mərhələsinə (spin sütunu və ya fenol çıxarılması) ehtiyac var.

2. DNT-nin uclarına limpet kimi yapışır, bu, qurtarmağı daha da çətinləşdirir və ligasyona müdaxilə edə bilər.

3. Əgər qalıq CIP aktivliyi ligasiyaya keçirsə, o, əlavəni fosforsuz edəcək, ligasyonun baş verməsinin qarşısını alır.

4. Anekdot olaraq, qələvi fosfataz müalicəsinin həddindən artıq olması DNT-yə zərər verə bilər. Bununla belə, zərərin qeyri-spesifik nükleazların səbəb ola biləcəyi təklif edildiyi Biotexnika forumunda bu yaxınlarda keçirilən müzakirədən başqa, mən heç vaxt buna və ya bunun necə baş verə biləcəyinə dair hər hansı yaxşı fikir tapa bilmədim. .

CIP-ə daha yeni alternativlər

Yaxşı xəbər budur ki, işi görən bir neçə yeni ferment var, lakin çoxlu çatışmazlıqlar yoxdur. Bunlar Karides Qələvi Fosfatazı (SAP) və NEB'in Antarktika Fosfatazıdır (AP). Bunların hər ikisi CIP-dən daha çox istiliyə davamlıdır, yəni istilik denaturasiyasından istifadə etməkdən xilas olmaq daha asandır.

Bununla belə, hətta SAP 65°C-də 30 dəqiqə ərzində tam aradan qaldırılmasa da, 65°C-də cəmi 5 dəqiqədən sonra tamamilə məhv olan AP onu çox üstün seçim edir. Əslində, NEB deyir ki, AP ilə işlənmiş vektorun istilik denatürasiyası başa çatdıqdan sonra, heç bir əlavə təmizləmə addımı olmadan birbaşa leqasiyaya keçmək təhlükəsizdir. Mən həmişə ligasyondan əvvəl təmizlənmə mərhələsini əlavə edirəm, amma mən çox şeydə paranoyam, ona görə də mənə məhəl qoyma.

Beləliklə, klonlamada CIP istifadə etməlisiniz? Mən yox deyirəm — sən niyə etməlisən? Əslində, niyə CIP hələ də klonlaşdırma üçün reagent kimi satılır? AP çox üstün seçimdir. AP-nin CIP-dən iki dəfə baha başa gəlməsinə baxmayaraq, düşünürəm ki, siz CIP-dən istifadə edərək uğursuz klonlaşdırma təcrübələrində daha çox pul itirəcəksiniz, ona görə də daha ucuz seçim saxta iqtisadiyyatdır.

Nə fikirləşirsən? CIP istifadə edirsiniz?

(Oh, əgər DNT-yə zərər verən CIP əfsanəsinin bitdiyini bilirsinizsə və xüsusən də bunun necə baş verdiyini bilirsinizsə, mən bilmək istərdim.)


Liqasiya qeyri-mümkündür: klonlama protokolumla kömək edin?

hamıya salam, mən sadə bir klonlama ilə o qədər əsəbiləşdim ki, məsləhət üçün sizə müraciət edim.

mən 700bp-lik fraqmenti ekspressiya vektoruna yapışdırmağa çalışıram, lakin 2 ay və 6 cəhddən sonra hələ də uğurlu rekombinant plazmid əldə edə bilmirəm. budur mənim protokolum:

NdeI/BamHI pBlueScript-dən 700bp fraqmenti kəsdi və gel təmizlədi - daxiletmə ardıcıllıqla edildi və hər iki məhdudiyyət sahəsi mövcuddur. Mən bu həzmi ya ikiqat həzm, ya da iki tək həzm kimi plazmid xəttiləşdirmədən yoxlamağa cəhd etmişəm. təmizləndikdən sonra əlavə gel üzərində gözəl görünür.

kəsilmiş vektor (yuxarıda olduğu kimi, həm ikiqat həzm, həm də ardıcıl tək həzmləri sınamışıq), qələvi fosfatazla müalicə edin və fermentləri 20 dəqiqə ərzində 80°C-də istiliklə öldürün. Hər iki məhdudlaşdırıcı ferment ayrıca kəsildikdə vektoru xəttiləşdirir, lakin vektorun hər ikisi tərəfindən kəsildiyini yoxlaya bilmirəm.

16°C-də gecə ligat (daxil edin:vektor 5:1), istilik şoku DH5a hüceyrələrinə çevrilir və apramisin R üçün seçin. liqaza və səlahiyyətli hüceyrələr bütün digər təcrübələrimlə yaxşı işləyirlər, buna görə də problemin burada olması ehtimalı azdır.

hər dəfə heç bir əlavə olmayan bir neçə fon koloniyası əldə edirəm (boş vektordan daha kiçik plazmid təcrid olunub). işlədiyim gen bakterial transkripsiya faktorudur, lakin o, tiostreptonla induksiya olunan promotorun nəzarəti altında olduğundan, məncə, gen məhsulunun transkripsiyaya məruz qalması və e. üçün zəhərli olması ehtimalı azdır. coli.

Mənə "plazmid qeyri-sabitliyi" adlı bir şey haqqında danışdılar, burada transformasiya sadəcə mümkün deyil, lakin mən bundan əvvəl metodda hər hansı digər potensial qüsurları istisna etmək istəyirəm. Əgər sınaya biləcəyim başqa bir şey varsa, mənə bildirin. təşəkkürlər!