Məlumat

Nə üçün PCR-də polimerazları qarışdırırsınız?

Nə üçün PCR-də polimerazları qarışdırırsınız?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

DNT-ni dəstdə təhlil etməzdən əvvəl PCR ilə gücləndirməyinizi tələb edən dəst üçün təlimatı oxuyurdum. Təlimat korrektə oxuyan və oxunmayan polimerazaların qarışdırılmasını təklif edir:

Uzunluğu 2500 bp-dən çox olan PCR məhsulları üçün DNT polimeraza qarışığından istifadə edin, tərkibində Taq DNT polimerazı və yoxlayıcı DNT polimerazı əlavə edin.

Bu, uzun məhsulların gücləndirilməsini necə yaxşılaşdıracaq? Bu, 2500 bazadan aşağı fraqmentlər üçün yalnız korrektor polimerazdan istifadə etməyi təklif edir. Qeyri-oxuyan polimerazanın əlavə edilməsi sürəti artırırmı? Məndə TAQ və PFU Ultra var, lakin hər iki təlimat hər kb üçün 1 dəqiqəlik uzadılma müddətindən istifadə etməyi deyir.


Taq polimeraza kifayət qədər sürətli fermentdir (sintez sürəti təxminən 1 kb/dəqdir), lakin geriyə çəkilən cəhət odur ki, onun yeni sintez edilmiş DNT-nin yoxlanılmasına imkan verəcək 3'-5'eksonükleaz aktivliyi yoxdur. Bu, səhvlərin ortaya çıxmasına gətirib çıxarır və sintez etmək istədiyiniz DNT nə qədər uzun olarsa, onları əldə etmək şansı daha yüksəkdir.

Pfu kimi korrektə edə bilən (eksonükleaz aktivliyinə malik olan) polimerazların səhv nisbəti daha aşağıdır, lakin digər tərəfdən daha yavaşdır, adətən 0,5 kb/dəq. Pfu da Taq polimerazasından daha bahalıdır. Aşağıdakı istinad 1-dən cədvəl 1-ə baxın:

Hər iki polimerazın üstünlüklərini birləşdirmək üçün adətən Taq və Pfu qarışığından istifadə edirsiniz. Sonra siz Pfu-nun korrektə qabiliyyəti ilə birlikdə Taq-ın yüksək emal qabiliyyətini əldə edirsiniz və az miqdarda mutasiya ilə yaxşı DNT məhsulu əldə edirsiniz. Bu sistem haqqında təfərrüatlar üçün 2-ci istinada da baxın.

İstinadlar:

  1. DNT polimeraza ilə polimeraza zəncirvari reaksiya zamanı xəta dərəcəsinin müqayisəsi
  2. Klonlanmış əlavələrdən və insan genomik DNT-dən uzun hədəflərin effektiv gücləndirilməsi.

PCR üçün düzgün DNT polimerazını seçin

New England BioLabs-da PCR-də istifadə üçün nəzərdə tutulmuş bir çox polimeraz var. Hansına ehtiyacınız olduğuna necə qərar verirsiniz? Bu, ilk növbədə ərizənizdən asılı olacaq. Çox güman ki, verəcəyiniz ilk qərar odur ki, sizə yüksək dəqiqlik gücləndirilməsi lazımdır, yoxsa standart gücləndirmə? Əgər siz PCR məhsulunuzu zülal ifadəsi və ya ardıcıllıq kimi sonrakı təcrübələrdə istifadə etməyi planlaşdırırsınızsa, siz səhvlərin daxil olmasını minimuma endirmək istəyirsiniz və yüksək keyfiyyətli polimeraza seçməlisiniz. Əgər sadəcə olaraq PCR məhsulunuz olub-olmadığını görmək lazımdırsa, məsələn, plazmidinizdə əlavənin olduğunu təsdiq edirsinizsə, standart və ya koloniya PZR uyğun olacaq.

Yüksək dəqiqlikli gücləndirmə üçün Q5 yüksək dəqiqlikli DNT polimerazı ilə başlamağı tövsiyə edirik, çünki o, ən aşağı xəta dərəcəsinə malikdir və həmçinin ATGC spektrində həqiqətən güclü performans üçün optimallaşdırılıb. Standart PCR və ya koloniya PZR üçün, hətta GC zəngin kimi çətin şablonlarla belə böyük performans üçün optimallaşdırılmış OneTaq DNT polimerazı ilə başlamağı tövsiyə edirik.

Sonra, reaksiyalarınızı otaq temperaturunda qurmaq lazımdırmı? Spesifiklik problemdirmi? Əgər belədirsə, polimerazın isti başlanğıc versiyası ideal olacaqdır.

Növbəti qərarınız polimeraza formatı olacaq. İstifadə rahatlığı üçün bizdə ferment, bufer və dNTP-lərdən ibarət master mikslər, həmçinin yükləyici boya ehtiva edən sürətli yükləmə master miks formatları var ki, siz PCR-ni birbaşa gelə yükləyə biləsiniz. Və əlbəttə ki, bizdə müstəqil polimerazlar da var.


DNT polimerazanın yoxlanılması

3´→ 5´ korrektə oxuyan ekzonükleaza sahəsi əksər DNT polimerazalarına xasdır. Bu, fermentə DNT sintezi zamanı hər bir nukleotidi yoxlamağa və uyğun olmayan nukleotidləri 3´-dən 5´-ə qədər aksizləşdirməyə imkan verir. Korrektor domeni həmçinin polimeraza küt uclar yaratmaq üçün qoşalaşmamış 3´-dən çox asılmış nukleotidləri çıxarmağa imkan verir. Yüksək dəqiqlikli PCR, 3´ overhang cilalama və yüksək dəqiqlikli ikinci zəncir sintezi kimi protokollar hamısı 3´→ 5´ eksonükleazın mövcudluğunu tələb edir.

Əksinə, bəzi tətbiqlər düzəliş fəaliyyəti olmadan polimerazaların istifadəsi ilə gücləndirilir. Məsələn, DNT etiketləməsinin effektivliyi korrektənin olmaması ilə artır, çünki o, daxil edilmiş əsasların kəsilməsinin qarşısını alır, dəyişdirilmiş bazadan daha az istifadə etməyə imkan verir.

Gen ifadəsinin çoxrəngli analizi, gen xəritəsi və yerində Aşkarlanmağı asanlaşdırmaq üçün flüoresan nukleotidlə işarələnmiş DNT-dən istifadə edən hibridləşmə NEB-in eksonükleaz çatışmazlığı olan DNT polimerazları ilə yaxşı uyğunlaşır. Yalnız seçilmiş dNTP-lərlə 5´ çıxıntıları qismən doldurarkən oxunmayan polimerazlar da əvəzolunmazdır. TA klonlaşdırılması üçün tələb olan küt ucların 3' ucunda şablonlaşdırılmamış dNTP-nin əlavə edilməsi də oxunmayan fermentlər tərəfindən dəstəklənir. Bu kateqoriyaların hər birində bir neçə vəhşi tipli polimeraza əlavə olaraq, NEB korrektə oxuyan ekzonükleaz aktivliyinin zəiflədiyi və ya ləğv edildiyi bir neçə düzəldici polimerazanın genetik cəhətdən dəyişdirilmiş versiyalarını təklif edir.


PCR-ə təsir edən parametrlər

Polimeraza zəncirvari reaksiyaların əsas komponentləri:

    DNT-nin şablondan asılı sintezini kataliz etmək üçün termostabil DNT polimeraza:

Böyük DNT məhsullarını sintez etmək qabiliyyətindən, sədaqətindən, səmərəliliyindən asılı olaraq, indi geniş çeşiddə fermentlər mövcuddur. Rutin PCR-lər üçün Taq polimeraza (standart 25-50 uL reaksiya üçün 0,5-2,5 vahid) seçim fermenti olaraq qalır. Taq-ın əksər kommersiya preparatlarının spesifik fəaliyyəti

80.000 vahid/mq protein. Taq polimeraza ilə primer uzantısının səmərəliliyi ümumiyyətlə olduğundan

0.7, reaksiyada 1.4*1012-dən 7*1012-ə qədər gücləndirilmiş məhsul molekulları yığıldıqda ferment məhdudlaşdırıcı olur.

Oliqonukleotid primerinin dizaynı gücləndirmə reaksiyasının effektivliyinə və spesifikliyinə təsir edən ən mühüm amil olduğundan, yüksək məhsuldarlıqla istənilən məhsulların əldə edilməsi, arzuolunmaz ardıcıllığın gücləndirilməsinin qarşısının alınması və gücləndirilmiş maddələrin sonrakı manipulyasiyasını asanlaşdırmaq üçün primerlərin diqqətlə layihələndirilməsi tələb olunur. məhsul. Primerlər PCR protokollarının müvəffəqiyyətinə və ya uğursuzluğuna çox güclü təsir göstərdiyinə görə, onların dizaynı üçün təlimatların əsasən keyfiyyətli olması və yaxşı başa düşülən termodinamik və ya struktur prinsiplərdən daha çox sağlam düşüncəyə əsaslanması istehzalıdır.

PCR üçün oliqonukleotid primerlərinin dizaynı

Müəyyən hallarda hədəf DNT-nin bir neçə seqmentinin eyni vaxtda gücləndirilməsi arzu oluna bilər. Bu hallarda, reaksiya qarışığına birdən çox cüt primer daxil edən "multipleks PCR" adlı gücləndirmə reaksiyası istifadə olunur. Standart reaksiyalar qeyri-məhdud miqdarda primerlərdən ibarətdir, adətən hər bir primerdən 0,1-0,5μM (6*1012-dən 3*1013 molekula qədər). Bu miqdar DNT-nin 1 kb seqmentinin ən azı 30 amplifikasiya dövrü üçün kifayətdir. Primerlərin daha yüksək konsentrasiyaları qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb ola biləcək qeyri-səlis işləməyə üstünlük verir.

Standart PCR-lər dörd dNTP-nin bərabər molyar miqdarını ehtiva edir. Tərkibində 1,5 mM MgCl2 olan reaksiyalarda Taq polimeraza üçün tövsiyə olunan hər bir dNTP-nin 200-250μM konsentrasiyası. 50 uL reaksiyada bu miqdarlar sintezinə imkan verməlidir

Səkkiz və ya daha çox primer cütünün eyni vaxtda istifadə edildiyi multipleks reaksiya üçün belə kifayət qədər olan 6-6,5 μg DNT. DNTP-lərin (>4mM) yüksək konsentrasiyası, ola bilsin ki, Mg2+ sekestrinə görə inhibə edir. Bununla belə, gücləndirilmiş bir fraqmentin 20μM- 0.5-1.0pM qədər aşağı dNTP konsentrasiyaları ilə qənaətbəxş miqdarda gücləndirilmiş məhsul istehsal edilə bilər.

uzunluğu 1 kb. Problemlərin qarşısını almaq üçün dNTP ehtiyatları -20 o C-də kiçik hissələrdə saxlanmalı və ikinci dondurma və ya ərimə dövründən sonra atılmalıdır. -20 o C-də uzunmüddətli saxlama zamanı az miqdarda su buxarlanır və sonra flakonun divarlarında donur. Konsentrasiyada dəyişiklikləri minimuma endirmək üçün tərkibində dNTP məhlulları olan flakonlar əridikdən sonra mikro sentrifuqada bir neçə saniyə sentrifuqa edilməlidir.

Bütün termostabil DNT polimerazaları aktivlik üçün sərbəst ikivalent kationlar tələb edir - adətən Mg2+. Bəzi polimerazlar da Mn2+ olan tamponlarla daha az effektiv olsa da işləyəcək. Kalsium ionları olduqca təsirsizdir. dNTP-lər və oliqonukleotidlər Mg2+-nı bağladığından, kationun molyar konsentrasiyası dNTP-lərin və primerlərin yaratdığı fosfat qruplarının molar konsentrasiyasını aşmalıdır. Buna görə də bütün hallarda isteğe bağlı olan Mg2+ konsentrasiyasını tövsiyə etmək mümkün deyil. 1,5 mM Mg2+ konsentrasiyası müntəzəm olaraq istifadə olunsa da, Mg2+ konsentrasiyasının 4,5 mM və ya 6 mM-ə artırılmasının bəzi hallarda qeyri-spesifik astarlanmasını azaltdığı, digərlərində isə artırdığı bildirilmişdir. Buna görə də, Mg2+-nın optimal konsentrasiyası hər bir primer və şablon kombinasiyası üçün empirik olaraq müəyyən edilməlidir. Şablon DNT preparatlarında Mg2+ sekvestri edə bilən əhəmiyyətli miqdarda xelatlaşdırıcı maddələr (EDTA və ya PO43- kimi mənfi yüklü ionlar) olmamalıdır.

Otaq temperaturunda 8.3 ilə 8.8 arasında pH-a uyğunlaşdırılmış Tris -Cl 10 mM konsentrasiyada standart PCR-lərə daxil edilir. 72 o C-də (PZR-in uzadılma mərhələsi) inkubasiya edildikdə, reaksiya qarışığının pH-ı tam vahiddən çox aşağı düşərək pH-ı olan bir tampon meydana gətirir.

Standart PCR tamponu 50 mM KCl ehtiva edir və uzunluğu & gt500bp olan DNT seqmentlərinin gücləndirilməsi üçün yaxşı işləyir. KCl konsentrasiyasının artırılması

70-100mM tez-tez daha qısa DNT seqmentlərinin məhsuldarlığını yaxşılaşdırır.

Hədəf ardıcıllıqlarını ehtiva edən şablon DNT tək və ya cüt zəncirli formada PCR-ə əlavə edilə bilər. Qapalı dairəvi DNT şablonları xətti DNT-lərdən bir qədər daha az effektiv şəkildə gücləndirilir. Şablon DNT-nin ölçüsü kritik olmasa da, yüksək molekulyar ağırlıqlı DNT-yə (>10kb) daxil edilmiş ardıcıllıqların gücləndirilməsi şablonu hədəf ardıcıllıq daxilində parçalanmayan məhdudlaşdırıcı fermentlə həzm etməklə yaxşılaşdırıla bilər.

Ən yaxşı şəkildə işləyərkən, PCR şablon olaraq hədəf ardıcıllığının yalnız bir nüsxəsini tələb edir. Ancaq daha tipik olaraq, hədəf DNT-nin bir neçə min nüsxəsi reaksiyaya səpilir. Məməlilərin genomik DNT-si vəziyyətində, hər bir reaksiya üçün 1 μq-a qədər DNT istifadə olunur, bu məbləğdə

Tək nüsxəli autosomal genin 3*105 nüsxəsi. Hər reaksiya üçün istifadə edilən maya, bakterial və plazmid DNT-lərinin tipik miqdarı müvafiq olaraq 10μg, 1μg və 1pg-dir.


PCR Master Mix seçimi

Real vaxt rejimində PCR təcrübələri üçün PCR master mixindən istifadə daha az pipetləmə, çirklənmənin azalması, borudan boruya daha az dəyişkənlik və daha çox təkrarlana bilən nəticələrlə daha sürətli quraşdırma təmin edir.

Bio-Rad PCR master qarışıqları müxtəlif tətbiqlər üçün optimallaşdırılmışdır, məsələn, gen ifadəsinin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi, genotipləşdirmə və ya yüksək həlledici ərimə analizi. Tətbiqiniz üçün ən yaxşı PCR master mixini seçərkən bir sıra mülahizələr var, o cümlədən:

  • PCR növü &mdash skrininq, klonlama və ya kəmiyyət
  • Amplikonun ölçüsü
  • Şablonun mürəkkəbliyi və G-C məzmunu, ikinci dərəcəli struktur və s.
  • DNT polimerazanın sürəti, etibarlılığı və emal qabiliyyəti
  • İnhibitor tolerantlığı
  • Antikor vasitəçiliyi ilə isti başlanğıc polimeraza
  • Müxtəlif primer T kimi reaksiya parametrlərinə dözümlülükm dəyərlər
  • Ölçeklenebilirlik
  • Hər reaksiya üçün xərc

DiyBio Thermocycler Seçimləri

Evdə PCR reaksiyaları aparmaq istəyən diybio insanlar üçün bir neçə variant var. Nəzərə alsaq ki, bütün termosikllər həqiqətən DNT nümunələrini bir neçə dövr ərzində qızdırmaq və sərinləməkdir, seçimlər arasındakı fərq qiymətə, ölçüyə və avtomatlaşdırma dərəcəsinə düşür.

Burada seçimlərdən bəziləri var.

MiniPCR mini8

Cib PCR

BentoLab

Orada idi həmçinin OpenPCR, lakin görünür, layihə dayandırılıb və təxminən 5000 dollardan başlayan qPCR maşını ilə əvəz edilib. Mən bunu atlayacağam, çünki bu, əksər DIY bioloqlarının əhatə dairəsindən kənardadır.

Beləliklə, mən hansı termosikleri seçdim?

Mən bütün variantları ölçüb-biçdim və başqa istiqamətə getdim: eBay-də işlənmiş termosikl almaq!

eBay-də alış-veriş, təbii olaraq risklidir, lakin bunu etmək olar. Siyahıda cihazın sınaqdan keçirildiyinə və işlədiyinə mütləq əmin olmalısınız. Onun istilik bloku (boruların oturduğu böyük metal parçası) ilə birlikdə olduğundan əmin olmalısınız, əks halda yeni blok almaq maşının özündən baha başa gələ bilər.

Mən eşitmişəm ki, bəzi insanlar xarab qurğuları təmir etməkdə şanslı olurlar, lakin diybio-da yenisinizsə, bu yanaşmanı tövsiyə etməzdim, çünki siz artıq görəcəyiniz və öyrənəcəyiniz işlərlə məşğul olacaqsınız.

Mən təxminən 300 dollara Applied Biosystems GeneAmp PCR 9700 aldım (vahid üçün 150 dollar + göndərmə üçün 150 dollar).

Bu seçim mənim üçün yuxarıda qeyd olunan bütün variantlardan ən ucuzu idi, hətta yüksək çatdırılma xərcləri ilə belə. O, portativ olmasa da və proqram vasitəsilə idarə olunmasa da, işləyir. Onun 96 quyulu istilik bloku var ki, bu da mənim ev laboratoriyam üçün ehtiyac duyduğumdan artıqdır. Bu, mənə PCR prosedurlarımı asanlıqla proqramlaşdırmağa və saxlamağa imkan verir. Təəccüblüdür ki, birdəfəlik istifadə olunan və ətraf qurğuların çoxu hələ də ThermoFisher tərəfindən satılır.

Göndərilən Qablaşdırmada Termosikllərin Üst Görünüşü Thermocycler Ekranının Görünüşü

PCR-nin icrası üçün lazım olan əlavə komponentlər

Termocycler DNT-ni gücləndirməkdə tapmacanın yalnız bir parçasıdır. PCR reaksiyasını uğurla həyata keçirmək üçün sizə lazım olacaq başqa prosedurlar və tələb olunan alətlər + reagentlər var.

Mənim təcrübəm göbələk nümunələrindən ITS geninin çıxarılması və gücləndirilməsidir, lakin gücləndirmək istədiyiniz gen(lər) üçün eyni ümumi tələblər tələb olunacaq:

  • DNT çıxarılması Sizə nümunə, DNT-ni çıxarmaq üçün protokol, DNT-ni mədəniyyət hüceyrələrinizdən çıxarmaq üçün reagentlər, sentrifuqa və 1,5 ml və ya 2 ml Eppendorf boruları lazımdır.
  • Oliqonukleotidlər (primerlər) primerlər gücləndirmək istədiyiniz gen(lər)ə prefiks və şəkilçi qoyan kiçik DNT zəncirləridir. DNT-ni çıxardıqdan sonra, PCR-ni işə salmadan əvvəl protokolunuza uyğun olaraq primerləri qarışdıracaqsınız. PCR zamanı primerlər maraq geninə yapışacaq, burada aşağıdakı növbəti reagent maraq genini ikiqat artırmaq üçün işləyəcək.
  • TAQ Polimeraz Bu reagent primerlərə əlavə edilir və bu, hər bir denatürasiya/tavlama dövrü arasında maraq doğuran gen(lər)in ikiqat artırılmasını asanlaşdıran xüsusi istiliyədavamlı fermentdir.
  • Bufer Bufer adətən sadəcə su və Tris-HCL pH 8.0 (bəzən EDTA ilə) olur, lakin onun rolu çıxarılan DNT-ni tarazlaşdırmaq və sabitləşdirmək və/və ya primer seyreltmələri yaratmaqdır.

PCR-dən sonra gel elektroforezi PCR reaksiyanızın uğurlu olub-olmadığını yoxlamaq üçün istifadə edilə bilər. Bu mühüm addımdır, çünki ardıcıllıq kimi bahalı növbəti addımlara davam etməzdən əvvəl düzgün geni gücləndirdiyinizi təmin edir.

Yekun olaraq deyəcəm ki, PCR öyrənmək inanılmaz dərəcədə faydalı və çox yönlü bir vasitədir. Danışdığım insanların çoxu PCR reaksiyalarını öyrənməyə və həyata keçirməyə sərf etdikləri vaxtları həvəslə düşünürlər. Müasir genetik işlərin çoxu PCR olmadan mümkün olmazdı. Beləliklə, irəli gedin və öyrənin! Bu, vaxtınıza dəyər olacaq.


QPCR və RT-qPCR

Kəmiyyət son nöqtəsi PCR

PCR və RT-PCR ümumiyyətlə bioloji nümunələri qiymətləndirmək üçün keyfiyyət formatında istifadə olunur. Bununla belə, virus yükünün müəyyən edilməsi, terapevtik agentlərə reaksiyaların ölçülməsi və gen ifadəsini xarakterizə etmək kimi geniş çeşidli tətbiqlər hədəf bolluğunun kəmiyyətcə müəyyən edilməsi ilə təkmilləşdiriləcəkdir. Nəzəri cəhətdən, PCR-in eksponensial xarakterini nəzərə alaraq buna nail olmaq asan olmalıdır, çünki gücləndirmə dövrlərinin sayı ilə molekulların sayının loqarifmi arasında xətti əlaqə mövcuddur. Təcrübədə isə gücləndirmə səmərəliliyi çirkləndiricilər (inhibitorlar), rəqabət reaksiyaları, substratın tükənməsi, polimerazanın inaktivasiyası və hədəfin reannealasiyası səbəbindən azalır. Dövrlərin sayı artdıqca, gücləndirmə səmərəliliyi azalır və nəticədə plato effekti yaranır.

Normalda, kəmiyyət PCR ölçmələrin yayla mərhələsindən əvvəl aparılmasını tələb edir ki, dövrlərin sayı və molekullar arasında əlaqə nisbətən xətti olsun. Gücləndirmənin səmərəliliyinə təsir edə biləcək çoxsaylı amillər səbəbindən bu nöqtə müxtəlif reaksiyalar üçün empirik olaraq təyin edilməlidir. Ölçmə reaksiya platosundan əvvəl aparıldığı üçün kəmiyyət PCR əsas PCR ilə müqayisədə daha az gücləndirmə dövründən istifadə edir. Bu, son məhsulun aşkar edilməsində problemlər yarada bilər, çünki aşkarlanacaq məhsul azdır.

Gücləndirmənin effektivliyinə nəzarət etmək üçün bir çox proqramlar PCR-ə daxili standart daxil etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. Belə yanaşmalardan biri reaksiyada bir &ldquohousekeeping&rdquo geni (yəni, müqayisə edilən nümunələr arasında sabit ifadə səviyyələrinə malik olan gen) üçün xüsusi olan ikinci primer cütünü əhatə edir (Gaudette və Crain, 1991 Murphy və b. 1990). Təchizat genlərinin gücləndirilməsi hədəf nuklein turşusu və reaksiya komponentlərinin məqbul keyfiyyətə malik olduğunu yoxlayır, lakin daxili standart və kəmiyyətcə ölçülən hədəf arasında məhsulun ölçüsü və ya primer yumşalma səmərəliliyindəki fərqlərə görə gücləndirmə effektivliyindəki fərqləri nəzərə almır.

Rəqabətli PCR və kəmiyyət PCR-nin mdasha dəyişməsi konsepsiyası bu məhdudiyyətə cavabdır. Rəqabətli PCR-də reaksiyaya məlum miqdarda nəzarət şablonu əlavə edilir. Bu şablon eksperimental hədəf molekulu ilə eyni primer cütündən istifadə edilməklə gücləndirilir, lakin fərqləndirilə bilən məhsul verir (məsələn, fərqli ölçü, məhdudlaşdırıcı həzm nümunəsi və s.). Nəzarət və sınaq məhsulunun miqdarı gücləndirildikdən sonra müqayisə edilir. Bu yanaşmalar hədəf nuklein turşusunun keyfiyyətinə, tampon komponentlərinə və primerin yumşaldılmasının effektivliyinə nəzarət etsə də, onların öz məhdudiyyətləri var (Siebert and Larrick, 1993 McCulloch) və b. 1995), o cümlədən bir çoxunun elektroforez ilə yekun analizdən asılı olması faktı.

Hər reaksiyada əmələ gələn gücləndirmə məhsulunun miqdarını ölçmək üçün çoxlu flüoresan və bərk fazalı analizlər mövcuddur, lakin onlar çox vaxt qeyri-spesifik gücləndirmə məhsullarından maraq doğuran gücləndirilmiş DNT-ni ayırd edə bilmirlər. Bu analizlərin bəziləri nuklein turşusunun ötürülməsinin effektivliyinə görə başqa dəyişəni təqdim edən blotlama üsullarına əsaslanır, digər analizlər isə gel elektroforezinə olan ehtiyacı aradan qaldırmaq üçün işlənib hazırlanıb, lakin lazımi spesifikliyi təmin edir. Hər bir gücləndirmə dövrünün nəticələrinə baxmaq imkanı verən real vaxtlı PCR, elektroforez vasitəsilə analiz ehtiyacını aradan qaldırmağın məşhur üsuludur.

Kəmiyyət Real-Time PCR

PCR məhsulunun aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün flüoresan etiketli oliqonukleotid zondlarının və ya primerlərin və ya floresan DNT-ni bağlayan boyaların istifadəsi real vaxtda kəmiyyət PCR-ni həyata keçirməyə imkan verir. Xüsusi hazırlanmış alətlər hədəfi gücləndirmək üçün həm termal dövriyyəni, həm də PCR məhsulunun yığılmasına nəzarət etmək üçün flüoresan aşkarlamanı həyata keçirir. DNT bağlayan boyalardan istifadə etmək asandır, lakin spesifik və qeyri-spesifik PCR məhsulları arasında fərq qoymur və multipleks reaksiyalar üçün əlverişli deyil. Floresan etiketli nuklein turşusu zondlarının üstünlüyü var ki, onlar yalnız spesifik PCR məhsulları ilə reaksiya verir, lakin onlar bahalı və dizaynı çətin ola bilər. Bəzi qPCR texnologiyaları zondlar əvəzinə floresan etiketli PCR primerlərindən istifadə edir.

Floresan DNT bağlayıcı boyaların istifadəsi ən asan qPCR yanaşmalarından biridir. Boya sadəcə reaksiyaya əlavə edilir və hər bir PCR dövründə flüoresans ölçülür. Bu boyaların flüoresanlığı ikiqat zəncirli DNT-nin iştirakı ilə kəskin şəkildə artdığından, floresan siqnalda artım kimi DNT sintezi izlənilə bilər. Bununla belə, PCR şərtlərinin yalnız xüsusi məhsul verməsini təmin etmək üçün ilkin işlər çox vaxt aparılmalıdır. Sonrakı reaksiyalarda spesifik gücləndirmə ərimə əyri analizi ilə yoxlanıla bilər. Termal ərimə əyriləri bütün məhsulun daha aşağı temperaturda (təxminən 60°C) ikiqat zəncirli DNT əmələ gəlməsinə imkan verməklə və temperaturu yavaş-yavaş denatürasiya səviyyəsinə (təxminən 95°C) yüksəltməklə əmələ gəlir. Məhsulun uzunluğu və ardıcıllığı ərimə temperaturuna (Tm) təsir edir, buna görə də ərimə əyrisi amplikonun homojenliyini xarakterizə etmək üçün istifadə olunur. Qeyri-spesifik gücləndirmə ərimə əyrisindəki geniş zirvələr və ya gözlənilməz Tm dəyərləri olan zirvələrlə müəyyən edilə bilər. Spesifik və qeyri-spesifik gücləndirmə məhsullarını fərqləndirməklə, ərimə əyrisi gündəlik istifadə zamanı keyfiyyətə nəzarət aspektini əlavə edir. Zond əsaslı TaqMan® texnologiyası kimi Taq DNT polimerazının 5&prime&rarr3&prime ekzonükleaz aktivliyinə əsaslanan analizlərlə ərimə əyrilərinin yaradılması mümkün deyil.

Bəzi qPCR strategiyaları DNT hədəfini ölçmək üçün tamamlayıcı nuklein turşusu zondlarından istifadə edir. Bu zondlar tək nukleotid polimorfizmlərini aşkar etmək üçün də istifadə edilə bilər (Lee və b. 1993 Bernard və b. 1998). Hidroliz, saç sancağı və sadə hibridləşdirmə zondları da daxil olmaqla real vaxt rejimində PCR zondlarının bir neçə ümumi kateqoriyası var. Bu zondlar zondun toplanan PCR məhsuluna bağlanmasına imkan verən tamamlayıcı ardıcıllığı ehtiva edir, lakin zondlar flüoresan reportyorların sayı və yerində fərqlənə bilər.

Hidroliz zondları 5&əsas ucunda flüor və 3&əsas ucunda söndürücü ilə etiketlənir və iki müxbir yaxınlıqda olduğundan, flüoresan siqnal söndürülür. Yuvlama mərhələsi zamanı zond əvvəlki gücləndirmə dövrlərində yaranan PCR məhsuluna hibridləşir. Nəticədə əldə edilən zond: hədəf hibrid, tavlanmış zondu pisləşdirən və flüoru azad edən DNT polimerazın 5&prime&rarr3&prime eksonükleaz aktivliyi üçün substratdır (Hollandiya). və b. 1991). Flüor enerji uducu söndürücünün təsirindən azad edilir və nəticədə flüoresansiyanın artması ilə reaksiyanın gedişi və PCR məhsulunun yığılması izlənilir. Bu yanaşma ilə, yaranan siqnalın istənilən PCR məhsulunun miqdarı ilə mütənasib olduğunu və qeyri-spesifik gücləndirmənin baş vermədiyini göstərmək üçün kəmiyyət təcrübi təcrübələrindən əvvəl ilkin təcrübələr aparılmalıdır.

Molekulyar mayak kimi də tanınan saç sancağı zondları hədəf DNT-ni tamamlayan ardıcıllıqla ayrılmış ters çevrilmiş təkrarları ehtiva edir. Təkrarlanan tavlamalar saç sancağı strukturu yaratmaq üçün 5&əsas ucunda flüor və 3&əsas ucunda söndürücü bir-birinə yaxındır və nəticədə kiçik flüoresan siqnal verir. Saç sancağı zondu elə qurulmuşdur ki, zond saç tıxacının strukturunu saxlamaqdansa, hədəf DNT-yə üstünlük verir. Reaksiya irəlilədikcə, toplanan PCR məhsuluna artan miqdarda zond əlavə olunur və nəticədə fluor və söndürücü fiziki olaraq ayrılır. Flüor artıq söndürülmür və flüoresans səviyyəsi artır. Bu texnikanın üstünlüyü ondan ibarətdir ki, saç sancağı zondlarının hidroliz zondlarına nisbətən uyğunsuzluq ehtimalı daha azdır (Tyagi və b. 1998). Bununla belə, siqnalın istənilən PCR məhsulu üçün spesifik olduğunu və qeyri-spesifik gücləndirmənin baş vermədiyini göstərmək üçün ilkin təcrübələr aparılmalıdır.

Sadə hibridləşdirmə zondlarının istifadəsi iki etiketli zond və ya alternativ olaraq bir etiketli zond və etiketli PCR primerini əhatə edir. Birinci yanaşmada, bir zondda flüorun buraxdığı enerji, yaxınlıqda hibridləşən ikinci zonddakı flüor tərəfindən udulur. İkinci yanaşmada, buraxılan enerji, primerin bir hissəsi kimi PCR məhsuluna daxil edilmiş ikinci flüor tərəfindən udulur. Bu yanaşmaların hər ikisi enerji qəbuledicisinin flüoresansının artması və enerji donorunun flüoresansının azalması ilə nəticələnir. Hibridləşdirmə zondlarının istifadəsi daha da sadələşdirilə bilər ki, yalnız bir etiketli zond tələb olunsun. Bu yanaşmada flüorun deoksiguanozin tərəfindən söndürülməsi flüoresansda dəyişiklik yaratmaq üçün istifadə olunur (Crockett and Wittwer, 2001 Kurata və b. 2001). Etiketli zond elə yumşaldır ki, fluor hədəf ardıcıllıq daxilində G qalıqlarına yaxın olsun və zondla bağlanma artdıqca deoksiquanosinin söndürülməsi səbəbindən flüoresans azalır. Bu yanaşma ilə zondun yeri məhduddur, çünki zond hibridləşməlidir ki, flüoresan boya G qalığına çox yaxın olsun. Sadə hibridləşmə zondlarının üstünlüyü onların müxtəlif ərimə temperaturlarına malik müxtəlif rəngli florların və zondların istifadəsi yolu ilə hidroliz və saç sancağı zondlarından daha asan çoxalma qabiliyyətidir (Wittwer-də nəzərdən keçirilmişdir). və b. 2001).

Bəzi qPCR strategiyaları DNT hədəfini ölçmək üçün tamamlayıcı nuklein turşusu zondlarından istifadə edir. Bu zondlar tək nukleotid polimorfizmlərini aşkar etmək üçün də istifadə edilə bilər (Lee və b . 1993 Bernard və b . 1998). Hidroliz, saç sancağı və sadə hibridləşdirmə zondları da daxil olmaqla real vaxt rejimində PCR zondlarının bir neçə ümumi kateqoriyası var. Bu zondlar zondun toplanan PCR məhsuluna bağlanmasına imkan verən tamamlayıcı ardıcıllığı ehtiva edir, lakin zondlar flüoresan reportyorların sayı və yerində fərqlənə bilər.

QPCR Məhsulları və Resursları

GoTaq® qPCR və RT-qPCR dəstləri boya əsaslı və ya zond əsaslı real vaxt PCR yanaşmaları üçün mövcuddur. GoTaq qPCR Sistemləri SYBR Green ilə müqayisədə maksimum gücləndirmə səmərəliliyi və daha çox flüoresanlığı təmin edən BRYT Yaşıl Boya ehtiva edir.

GoTaq® Zond Sistemləri hidroliz zondu əsaslı aşkarlama üçün reaksiya montajını sadələşdirən istifadəyə hazır master-mikslərdir.


In vitro mutagenez

Dairəvi DNT-nin PCR mutagenezi

PCR mutagenezi maraq doğuran geni ehtiva edən bütün plazmidi gücləndirmək üçün də istifadə edilə bilər. “Tərsinə çevrilmiş” və ya “əks” PCR adlandırılan sadə üsullardan biri arxa-arxa primerlərdən istifadə edir (Şəkil 2B), bir PCR primeri mutagen oliqonukleotid kimi xidmət edir, digər oliqonukleotid isə mutagen primerə bitişik olan əks zəncirdən əmələ gəlir. PCR məhsulu tam uzunluqlu, xətti plazmiddir, sonra transformasiyadan əvvəl fosforlaşdırılır və bağlanır. Bu üsul, primerlər arasında boşluq yaratmaqla, silinmə mutantları yaratmaq üçün asanlıqla istifadə edilə bilər. Bu metodun variantlarına “rekombinant dairə” PCR (Şəkil 2C) və “rekombinasiya” PCR daxildir, hər ikisi xətti plazmidlərin rekombinasiyasına əsaslanır. Bu üsullarda fərqli yerlərdə boşluqlu primerlərlə iki tərs PCR həyata keçirilir. Bu iki mutant plazmid sonra yenidən birləşdirilir in vitro qarışdırma və tavlama (rekombinant dairə PCR) və ya in vivo (rekombinasiya PCR). Boşluqlar daha sonra bakterial DNT təmir aparatları tərəfindən düzəldilir.


Advantage HD Polimeraza Qarışığı

Advantage HD Polimeraza Qarışığı maksimum sədaqət və genişləndirilmiş PCR məhsul uzunluğu təmin edərək, onu cDNA klonlaması, sahəyə yönəldilmiş mutagenez və mutasiya genotiplənməsi (yəni, SNP analizi) kimi yüksək dəqiqlik tələb edən tətbiqlər üçün xüsusilə faydalı edir.

Advantage HD Polymerase Mix, isti başlanğıc antikoru olan yeni DNT polimerazadan ibarətdir və 5X tampon boru ilə (Mg 2+ ilə) gəlir.

Advantage HD Polimeraza Qarışığı maksimum sədaqət və genişləndirilmiş PCR məhsul uzunluğu təmin edərək onu cDNA klonlaması, sahəyə yönəldilmiş mutagenez və mutasiya genotiplənməsi (yəni, SNP analizi) kimi yüksək dəqiqlik tələb edən tətbiqlər üçün xüsusilə faydalı edir.

Advantage HD Polimeraz Qarışığı isti başlanğıc antikoru olan yeni DNT polimerazadan ibarətdir və 5X tampon boru ilə (Mg 2+ ilə) gəlir.

Advantage HD Polimerase Mix son dərəcə aşağı səhv nisbəti ilə nəticələnən 3' &rarr 5' eksonükleaz aktivliyinin mövcudluğuna görə üstün dəqiqlik təmin edir. O, həmçinin GC ilə zəngin və digər daha mürəkkəb şablonlarda çox yaxşı işləyir. Advantage HD Polimeraza Qarışığı insan genomik DNT-sindən 8,5 kb-a qədər, 10 kb-a qədər hədəfləri gücləndirir. E. coli genomik DNT və lambda DNT-dən 22 kb. Advantage HD Polimerase Mix-in gücləndirmə səmərəliliyi vəhşi tipdən daha yüksəkdir Taq polimeraza.


PrimeSTAR Max DNT Polimerase—sürətli və yüksək keyfiyyətli PCR

PrimeSTAR Max DNT Polimeraz istənilən Takara Bio fermenti arasında ən yüksək dəqiqliyə və ən sürətli uzanma sürətinə malikdir. Tərkib Takara-nın unikal, yüksək dəqiqliyə malik PrimeSTAR HS DNT Polimerazına əsaslanır və effektiv astarlama və uzatma təmin etmək üçün uzanma faktoru ilə birləşdirilir ki, bu da yumşalma və uzatma mərhələləri üçün tələb olunan vaxtı xeyli azaldır. Nəticədə, PrimeSTAR Max DNT Polimerase olduqca sürətli PCR üçün istifadə edilə bilər. O, optimallaşdırılmış bufer və dNTP-lərdən ibarət 2X premiks kimi hazırlanmışdır ki, bu da yüksək məhsuldarlıqlı tətbiqlər üçün reaksiyaların tez hazırlanmasına imkan verir.

PrimeSTAR Max DNT Polimeraz istənilən Takara Bio fermenti arasında ən yüksək dəqiqliyə və ən sürətli uzanma sürətinə malikdir. Tərkib Takara'nın unikal, yüksək dəqiqliyə malik PrimeSTAR HS DNT Polimerazına əsaslanır və effektiv astarlama və uzatma təmin etmək üçün uzanma faktoru ilə birləşdirilir ki, bu da yumşalma və uzatma mərhələləri üçün tələb olunan vaxtı xeyli azaldır. Nəticədə, PrimeSTAR Max DNT Polimerase olduqca sürətli PCR üçün istifadə edilə bilər. O, optimallaşdırılmış bufer və dNTP-lərdən ibarət 2X premiks kimi hazırlanmışdır ki, bu da yüksək məhsuldarlıqlı tətbiqlər üçün reaksiyaların tez hazırlanmasına imkan verir.

Bundan əlavə, uzatma addımının vaxtının standartlaşdırılması PrimeSTAR Max DNT Polimerazını qeyri-spesifik bağlanma səbəbindən gücləndirilməsi adətən çətin olan həddindən artıq nuklein turşuları ilə reaksiyalar üçün uyğun edir. PrimeSTAR Max DNT Polimerase-nin üstün emal qabiliyyəti həddindən artıq nuklein turşuları tərəfindən inhibənin qarşısını alır, nəticədə minimal tələb olunan optimallaşdırma ilə PCR üçün daha yüksək müvəffəqiyyət nisbəti əldə edilir. Antikor vasitəçiliyi ilə işləyən isti başlanğıc funksiyası reaksiya yığılması zamanı yanlış başlanğıc hadisələrinin qarşısını alaraq təkmilləşdirilmiş spesifikliyi təmin edir.


Videoya baxın: I Have Been A PCR Test!! NEPAL LAST VIDEO 328 (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Hypnos

    Tamamilə haqlısan. Bu və yaxşı bir fikir var, biz onu dəstəkləyirəm.

  2. Selwyn

    Razılaşdı, əla bir düşüncədir

  3. Laudegrance

    Nəhayət, bir növ spam planından istifadə edin, əks halda oxumaq mümkün deyil ... zəhmət olmasa ...

  4. Tolar

    Fikirinizi tam bölüşürəm. Bu barədə bir şey var və bu, yaxşı bir fikirdir. Sizi dəstəkləməyə hazıram.

  5. Golticage

    Mən sizinlə bu sual ətrafında danışmaq istərdim.

  6. Stanwyk

    Bu barədə nə demək olar?

  7. Kitilar

    Sözünüz çox gözəldir



Mesaj yazmaq