Məlumat

11.4: Nuklein turşusunun kəmiyyət ölçülməsi - Biologiya

11.4: Nuklein turşusunun kəmiyyət ölçülməsi - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kəmiyyət PCR (qPCR)

Bu spesifik genlərin PCR vasitəsilə maraq doğuran fərdi genlərin ölçülməsi edilə bilər. Real-Time PCR və ya kəmiyyət PCR kimi tanınan proses (qPCR) flüoresan ölçmələrdən istifadə edərək fərdi genləri ölçmək üçün istifadə olunur. Yalnız iki zəncirli DNT-yə bağlanan interkalasiya agenti deyilir Sybr Green hər bir PCR dövründən sonra floresansı ölçən qPCR maşınında istifadə olunur, dolayı yolla gücləndirilmiş məhsulun miqdarını göstərir. Bununla belə, gücləndirmənin qeyri-spesifik məhsulları da ölçülə bilər və orijinal amplikondan fərqləndirilmir.

Sybr Green-ə alternativ TaqMan texnologiyası ilə nümunədir. TaqMan ilə üçüncü primer (TaqMan araşdırması) gücləndiriləcək sahənin ortasında nəzərdə tutulmuşdur. Bu orta astar 5′ və 3′ uclarının bir-birinə yaxın olması üçün saç sancağının özünü tamamlayıcı xüsusiyyəti ilə dizayn edilmişdir. Bir ucunda, A floresan müxbiri digər terminalda isə əlavə olunur söndürən hər hansı bir flüoresan siqnalı udur. Normal şəraitdə flüoresans ölçmələri çox aşağı olacaq. PCR uzadılması baş verdikdə, Polimeraza bu orta primeri hidroliz edir və bununla da söndürücü və reportyoru ayırır. TaqMan adı sözlər oyunudur, çünki polimerazın Pacman kimi probu çeynədiyi təsəvvür edilir. Söndürən/reportyor arasında artan məsafə ilə bu zonddan gələn flüoresan siqnalı indi ölçmək olar. Bu üsul Sybr Green-dən daha spesifikdir. Bununla belə, xüsusi zondların istifadəsi xərcləri xeyli artırır.

Eşik dövrləri (Ct)

Kredit: Zuzanna K. Filutowska (CC-BY-SA 3.0)

PCR prosesinin əvvəlində flüoresansın ölçülməsi az sayda dsDNA molekulları (Sybr Green) və ya əksər TaqMan primerlərinin söndürülməsi səbəbindən çox aşağı olacaq. Bu eksponensial DNT istehsalı zamanı flüoresansın xətti olaraq artacağı bir həddə çatılacaq. Flüoresansın aydın şəkildə ölçülə bildiyi xüsusi bir nöqtə deyilir Eşik dövrü (Ct) ifadə dəyərlərini müqayisə etmək üçün istinad nöqtəsi kimi istifadə olunur.

Yuxarıdakı Sybr Green qPCR nümunəsinə baxsaq, nümunələrin daha aşağı dövr sayında (C) eksponent olaraq artdığını müşahidə etmək olar.t) daha yüksək dövr sayına (sağa doğru) malik nümunələrə nisbətən həmin genin mRNT ifadəsinin daha yüksək səviyyəsinə (sola doğru) malikdir. Diqqət yetirin ki, flüoresans nəhayət yaylalara düşür və artmağı dayandırır. Bu, dNTP kimi DNT istehsalı üçün xammalın tükənməsi ilə əlaqədardır.

PZR reaksiyaları nəzəri olaraq hər sikldən sonra DNT-nin ikiqat artmasını təmsil etdiyindən, Ct dəyərlər baza 2 sistemində şərh edilə bilər. C-də fərq varsat iki nümunə arasında (ΔCt) 5 dövrə, bu 2-yə uyğundur5 və ya 32 qat fərq. Maraqlanan genimizin flüoresan dəyərlərini aktin kimi bir təmizlik geni ilə müqayisə etməklə RNT hazırlığında dəyişikliklərə nəzarət edə bilərik. Reaksiyalara ilkin girişi normallaşdırmaq və nümunələr arasında müqayisə etmək üçün ev saxlama geninin istifadəsi belə adlanır. Nisbi Kəmiyyət.

Sybr Green üçün ərimə əyriləri

Üst panel iki zəncirli DNT-nin dissosiasiyası səbəbindən temperaturun artması ilə flüoresansın azalmasını göstərir. Aşağı panel birinci törəmə süjeti göstərir. Bu nümunədəki hər bir zirvə fərqli bir alleli göstərir. İkiqat zirvələr gücləndirmə məhsullarında 2 fərqli allelin mövcudluğunu təmsil edir.

Kredit: Seans Potato Business (CC-BY-SA 3.0)

Sybr Green istifadə edərkən, biz PCR-nin spesifik olmasını təmin etməliyik ki, flüoresans ölçmə həqiqətən maraq doğuran genimizin gücləndirilməsini əks etdirsin. Hər qPCR işinin sonunda (~40 dövr) ərimə əyrisi həyata keçirilir. A ərimə əyrisi (və ya dissosiasiya əyrisi) temperatur artdıqca daimi ölçmələrdən gəlir. Temperatur artdıqca DNT zəncirləri denatürasiyaya başlayır və flüoresans azalmağa başlayır. DNT zəncirlərinin tam ayrılmasından sonra floresans yenidən sabit qalacaq. Bu əyriyə baxılma üsulu flüoresan oxunuşda əyilmənin bildirildiyi törəmə süjetdən keçir. ərimə temperaturu (Tm).

Bu ərimə əyrisi hər bir nümunədə ərimə temperaturu 83,51°C olan eyni xüsusi məhsulu əks etdirir.

Bu plandakı hər hansı zirvələr müəyyən bir PCR məhsuluna aiddir. Birdən çox zirvə görünsə, nəticələr bir məhsulu birbaşa ölçmədiyi üçün etibarlı olmayacaq.

İfadə Ölçmələri

Diferensial gen ifadəsi müxtəlif şərtlər altında hüceyrə tərəfindən aktivləşdirilmiş transkripsiya proqramlarına aiddir. “Diferensial” iki və ya daha çox vəziyyətin və ya vaxt nöqtəsinin müqayisəsinə aiddir. Zülalın dolayı ölçülməsi kimi mRNA-dan istifadə edərək, hansı zülalların bu müxtəlif vəziyyətlərlə əlaqəli olduğunu müəyyən etmək olar. Eukariotlarda bu, poliA tərkibli yetkin mRNT üçün ümumi RNT-nin zənginləşdirilməsi ilə qiymətləndirilə bilər. Oliqo-(dT) tərkibli qatrandan istifadə etməklə, mRNT-ni zülal olmayan kodlaşdıran RNT-dən ayırmaq olar. Eyni şəkildə, oliqo-(dT) primerdən istifadə edərək tərs transkripsiyanın həyata keçirilməsi PCR ilə istifadə oluna bilən sabit tamamlayıcı DNT (cDNA) molekulu yaradacaqdır. Bu şəkildə qPCR istifadə deyilir RT-PCR və ya məlum genin kiçik bir hissəsini gücləndirmək üçün xüsusi primer cütlərinin istifadə edildiyi əks transkripsiya polimeraza zəncirvari reaksiya.

Hibridləşməyə əsaslanan üsullar və mikroarraylar:

Kredit: FrozenMan (CC-BY-SA 4.0)

RT-PCR-dən əvvəl fərdi genlərin ifadəsi hibridləşdirməyə əsaslanan yanaşma ilə qiymətləndirilmişdir. Bu üsul, RNT-nin agaroza gel üzərində işlədilməsini və “blotting” adlanan üsulla ölçülü fraksiyalaşdırılmış RNT-lərin membrana köçürülməsini tələb edirdi. Bu köçürülmüş RNT daha sonra müəyyən bir gen üçün radioaktiv olaraq etiketlənmiş zondla hibridləşdirildi (əks tamamlayıcı ardıcıllığa uyğundur) və adlanan prosesdə rentgen filminə məruz qalaraq vizuallaşdırıldı. Şimal Blotting. Qrupun intensivliyi maraq geninə uyğun gələn mRNT miqdarı ilə mütənasib olacaqdır. Aktin kimi bir təsərrüfat geni ilə təkrar araşdırma, hər bir quyuya oxşar miqdarda ümumi RNT yükləndiyini göstərmək üçün yükləmə nəzarəti kimi istifadə ediləcəkdir. Northern Blot-da mRNT-nin ölçülərindəki fərqlər, müxtəlif dövlətlərdə yetkin mRNT-nin birləşmə variantlarında da fərqlər aşkar etdi.

Kredit: Ceremi Seto (CC-BY-NC-SA)

Bu texnika sonradan qeyri-radioaktiv metodlardan istifadə etməklə uyğunlaşdırılmışdır. Bu qeyri-radioaktiv üsullardan istifadə edərək, çoxlu gen hədəflərini ölçmək üçün əks protokol hazırlanmışdır. Genin spesifik zondlarını membrana və ya mikroskop slaydına sistematik şəkildə immobilizasiya etməklə bir sıra hədəflər əldə etmək olar. 2 vəziyyətə (nəzarət və ya eksperimental) malik olan ən sadə paradiqmada hər bir nümunədən cDNA immobilizasiya edilmiş zondlara hibridləşə bilən flüoresan RNT yaratmaq üçün istifadə edilə bilər. 2 fərqli flüoresan markerdən istifadə massivdə rəqabətli hibridləşməyə imkan verir ki, bununla da hər bir kanaldakı flüoresan siqnal 2 rəngdə iki vəziyyətin diferensial gen ifadəsini aşkar edə bilər. mikroarray.


Kəmiyyət Bacarıqları

Eksperimental elm səbəb və nəticə əlaqələrin növlərinə baxır. Nəzarət edilən təcrübələr, digər amil və ya əlamətə təsirini müşahidə etmək üçün amillərdən və ya əlamətlərdən birini dəyişir. Bu amillər deyilir dəyişənlər . A asılı dəyişən təcrübədə başqa amilin dəyişdirilməsi nəticəsində müşahidə edilən və dəyişməsi gözlənilən bir şeydir. Yəni nəticə asılıdır başqa amil üzərində. Asılı dəyişənin başqa adıdır cavab dəyişən . The müstəqil dəyişən eksperimentator tərəfindən dəyişən və ya dəyişdirilən amil və ya şərtdir. Bəzən gözləmək dəyişən şərtdir, müstəqil dəyişən: vaxt. Müstəqil dəyişəni dəyişdirdiyimiz üçün ona da deyilir manipulyasiya edilmiş dəyişən .


Spektrofotometriya

Spektrofotometrlər (spektr-şəkil/rəng Şəkil-işıq metr-ölçü) udulma və ya ötürülmə xüsusiyyətlərinə əsaslanan məhlulların kimyəvi analizi üçün istifadə olunur.

Spektrofotometrin sxemi. Monoxromator işığı parçalayan prizmadır. Bir dalğa uzunluğunda işıq küvetdəki məhluldan keçmək üçün diyaframdan fokuslanır GYassineMrabetTalk [CC-BY-SA] . Keçiricilik məhluldan keçən işığın miqdarına aiddir.

Kyuvet vasitəsilə işıq mənbəyinin keçiriciliyi. İşığın intensivliyi, I0, məhluldan keçdikcə azalır. Sensor tərəfindən aşkar edilən işıq, I, məhlulun keçiriciliyini əks etdirir.

Əgər işıq məhluldakı kimyəvi maddələr tərəfindən udulursa, bu, daha aşağı ötürülmə ilə nəticələnir. Absorbsiya ona görə də tənliklə ifadə olunduğu kimi keçiriciliklə tərs bağlıdır:

Spektrofotometriyanın daha dərin izahı üçün http://www.virtual-labs.leeds.ac.uk/pres/spectrophotometry/ (CC-BY-NC-SA) ünvanında virtual nümayişi izləyin.


Cameron A. Myhrvold

Myhrvold laboratoriyası transkripsiya tənzimlənməsi və RNT lokalizasiyası kimi bioloji prosesləri daha yaxşı başa düşməyə imkan verəcək texnologiyalara diqqət yetirməklə, virus və ana RNT-nin öyrənilməsi üçün CRISPR əsaslı texnologiyalar hazırlayır. Biz, həmçinin, COVID-19-un törədicisi olan SARS-CoV-2-yə diqqət yetirməklə, virus RNT-lərini aşkar etmək və məhv etmək üçün bu texnologiyaları tətbiq edirik.

Cas13 ilə kəmiyyət, yüksək multipleksləşdirilmiş nuklein turşusunun aşkarlanması

Biz nuklein turşusunun kəmiyyət aşkarlanması üçün yüksək multipleksləşdirilmiş Cas13 əsaslı texnologiyalar inkişaf etdiririk. Bu, bizim kütləvi şəkildə multipleksləşdirilmiş nuklein turşusunun aşkarlanması texnologiyası CARMEN üzərində qurulur. İlkin olaraq biz CARMEN-in kəmiyyət versiyalarını hazırlayacağıq ki, bu da bizə gen ifadəsini ölçməyə imkan verəcək (sadəcə nuklein turşularının mövcudluğunu və ya olmamasını göstərmək əvəzinə). Biz həmçinin CARMEN-in geniş şəkildə yayılması daha asan versiyalarını hazırlayacağıq ki, bu da insanlara CARMEN-dən çoxlu dövriyyədə olan virus infeksiyalarının olduğu yerlərdə məhdud resurs şəraitində istifadə etməyə imkan verir.

Müraciət edir Cas13 sistematik olaraq host-patogen qarşılıqlı əlaqəni öyrənmək üçün

Viral RNT-nin Cas13 hədəflənməsini tənzimləyən qaydaları anlamaq üçün yüksək məhsuldarlıqlı təcrübələr aparacağıq. Qrip və SARS-CoV-2 kimi virusları model sistemlər kimi istifadə edərək, ev sahibi-patogen qarşılıqlı əlaqəni eksperimental olaraq öyrənmək üçün Cas13-ü tətbiq edəcəyik. Məqsədimiz CARMEN-dən istifadə etməklə infeksiyada iştirak edən əsas virus və ev sahibi genlər dəstinin dinamikasını eyni vaxtda ölçməklə, eyni zamanda infeksiya şərtlərini (infeksiyanın çoxluğu, hüceyrə növü, viral və ya host genotipi kimi) dəyişdirməklə sistem biologiyasına yanaşmaqdır. . Biz bir çox müxtəlif yoluxmuş toxumalardan hüceyrə yığaraq, heyvan modellərində infeksiyalarla bu təcrübələri izləyəcəyik.

RNT dinamikasını pozmaq və oxumaq üçün Cas13 əsaslı texnologiyalar

CRISPR-Cas9 bizim genomik məlumatı öyrənmək və manipulyasiya etmək qabiliyyətimizdə inqilab etdi. Cas13 əsaslı texnologiyaların inkişafı RNT-ni öyrənmək və manipulyasiya etmək üsulumuzda inqilab edə bilər. Biz yüksək ötürmə qabiliyyəti ilə RNT-ni pozmaq və oxumaq üçün müxtəlif Cas13 əsaslı texnologiyalar inkişaf etdiririk. Biz müxtəlif bioloji problemləri öyrənmək üçün yeni texnologiyalarımızı tətbiq etmək üçün şöbədəki həmkarlarımızla sıx əməkdaşlıq edirik. Bizim işimiz RNT biotexnologiyası sahəsini inkişaf etdirəcək, bizə gen ifadəsinin, tənzimlənməsinin və funksiyasının sirlərini açmağa imkan verəcək.

Cameron Myhrvold 2021-ci ilin yanvarında Prinston Universitetində Molekulyar Biologiya üzrə Dosent kimi fəaliyyətə başlayacaq. Onun işi RNT viruslarının aşkarlanması və məhv edilməsinə diqqət yetirməklə RNT-nin öyrənilməsi üçün CRISPR əsaslı texnologiyaların işlənib hazırlanmasında ixtisaslaşıb. O, 2016-cı ildə Harvardda Sistem Biologiyası üzrə fəlsəfə doktoru dərəcəsi alıb. Onun sintetik biologiya və nuklein turşusu nanotexnologiyası üzrə fəlsəfə doktoru tədqiqatları Fannie və John Hertz Fondunun təqaüdü ilə dəstəklənib, öz-özünə yığılan nanostrukturlar üçün müxtəlif tətbiqləri nümayiş etdirən üç texnologiyanın işlənib hazırlanmasını əhatə edib. . Postdoktur zamanı o, diqqətini RNT hədəfləyən CRISPR effektor proteini Cas13-ə yönəltdi, burada o, CARMEN, CARVER və SHINE daxil olmaqla dörd Cas13 əsaslı texnologiyanın inkişafına rəhbərlik edib və ya birgə rəhbərlik edib.


Nəticələr

Platformadan müstəqil və ardıcıllıq yoxlanılan məlumat daxiletməsi

Tətbiqin girişi qPCR maşınından və kimyadan müstəqildir. Hər bir sınaqdan keçirilmiş analiz üçün nümunə adları, Cq dəyərlər və nisbi nüsxə nömrələri (nümunə qatılmalarına əsaslanaraq) əvvəlcədən formatlaşdırılmış tab ilə ayrılmış məlumatları daxiletmə formasına yapışdırmaqla idxal edilir. Bu yolla, bir və ya iki nümunə seyreltmələri və istənilən sayda texniki təkrarlarla təhlil edilən nümunə məlumatları emal edilə bilər. Faktiki və ya nisbi surət nömrələri ola bilən standart əyri üçün məlumatlar ayrıca idxal olunur (Əlavə fayl 3).

Microfluidic qPCR platforması BioMark (Fluidigm) standart çıxış faylları quantGenius saytında mövcud olan “Fluidigm data hazırlama alətindən” istifadə edərək idxala uyğun formata çevrilə bilər.

Yanlış idxal nəticəsində səhv hesablamaların qarşısını almaq üçün (məsələn, kopyalama-yapışdırma xətaları) bütün idxal edilmiş məlumatlar avtomatik olaraq ardıcıllıq üçün yoxlanılır (yəni nümunə adları, replikasiyalar və bir sıra seyreltmələrin hədəf və istinad genləri arasında uyğunluğu).

Nömrənin hesablanması və normallaşdırılmasını istinad genlərinə köçürün

QuantGenius-da bütün lövhələrdə eyni standart əyri istifadə edildikdə, çox lövhəli eksperimentlərdə müqayisə edilə bilən surət nömrələrinin hesablanmasına imkan verən standart əyri kəmiyyət yanaşması həyata keçirilir. Prosesin optimal şəffaflığı üçün hesablamalar sadə (bir qatılmalı) və ya iki qatılmalı analizin seçilməsindən bir qədər fərqlənməklə bir neçə mərhələdə aparılır (Şəkil 1, Əlavə fayl 2). Standart əyri parametrlərinə (Əlavə fayl 2, Tənliklər 3-8) əsasən, nümunə hədəf və istinad geninin surət nömrələri hesablanır (Əlavə fayl 2, Tənlik 11). Növbəti addımlarda təkrar nüsxə nömrələri orta hesablanır və nümunənin seyreltilməsi nəzərə alınır (Əlavə fayl 2, Tənliklər 13, 14).

Hədəf gen nüsxə nömrələri, gen nüsxə nömrələrinə istinad etmək üçün normallaşdırılır və ya bir neçə istinad genləri halında, onların orta göstəricisi (Şəkil 2 Əlavə fayl 2, Tənliklər 17-20). Fərdi istinad genlərinin qeyri-bərabər qatqısının qarşısını almaq və QC problemlərinə görə istinad genlərindən biri üçün məlumatların çatışmadığı hallarda kəmiyyətin müəyyən edilməsinə imkan vermək üçün bütün istinad geninin surət nömrələri idxal edilmiş istinad geninin ortasına miqyaslanır. birinci (Əlavə fayl 2, Tənlik 18).

İstinad nüsxəsi nömrələrinin hesablanmasının ekran görüntüsü. İki istinad geninin nümunəsi (COXEF-1) göstərilir. İkinci idxal edilmiş istinad gen (EF-1) idxal edilən ilk istinad geninin ortasına ölçülür və hər iki dəyərin orta qiyməti hesablanır. Hesablamalar hər seyreltmə üçün ayrıca aparılır

İstifadəçi tərəfindən idarə olunan keyfiyyətə nəzarətə əsaslanan qərara dəstək sistemi

Təqdim olunan tətbiqin unikal və yeni xüsusiyyəti quantGenius, kəmiyyət biologiyası məlumatlarının möhkəm təhlilinə imkan verən, istifadəsi asan QC-əsaslı DSS-nin tətbiqidir. Buraya qPCR QC-nin bütün kritik parametrləri daxildir, məsələn, texniki pipetləmə xətaları, nuklein turşusunun çıxarılması və əks transkripsiya məhsuldarlığı, analizlərin aşkarlanması və kəmiyyət diapazonlarının təxminləri, həmçinin fərdi nümunələrdə inhibitorların identifikasiyası [3]. Bir neçə QC parametrləri iş axınının müxtəlif mərhələlərində hesablanır (Şəkil 1, Əlavə fayl 2, Tənliklər 2, 4, 5, 8–10, 13, 15, 22). QC sərtliyi xüsusi tətbiq üçün tələb olunan dəqiqlik səviyyəsinə əsaslanaraq istifadəçi tərəfindən idarə olunur (Şəkil 3). QC parametrlərinin dəyişdirilməsi ilə bütün məlumatlar dərhal yenidən hesablanır. Üstəlik, “klon eksperimenti” seçimi eyni təcrübəni müxtəlif QC parametrləri ilə təhlil etməyə və beləliklə, parametr parametrlərinin dəyişdirilməsinin yekun nəticələrə təsirini birbaşa müqayisə etməyə imkan verir.

Fərdi gen hesablamalarının ekran görüntüsü. Hesablamalar üç mərhələdə aparılır. 1) QC parametrləri CqLOQ, CqExtC, yamac diapazonu və yamac fərqi və hesablama rejimi istifadəçi tərəfindən müəyyən edilir. 2) Standart əyri mümkün kənar reaksiyalar üçün nəzərdən keçirilir. 3) Nümunə reaksiyaları nəzərdən keçirilir. Pipetləmə xətası (qırmızı dairə) əvvəlcədən təyin edilmiş QC parametrlərindən sapmalara səbəb olur (qırmızı oxlar). Hesablamalar üçün istifadə olunan bütün düsturlara baxmaq olar (mavi ox)

quantGenius bütün QC ilə bağlı məsələlərin və qərarların şəffaf icmalına imkan verir. Əvvəlcədən müəyyən edilmiş QC hədlərindən kənara çıxan dəyərlərin vurğulanması standart əyridə və ya hədəf nümunə reaksiyalarında pipetləmə xətalarını, eləcə də kəmiyyət diapazonundan kənarda olan standart əyri seyreltmələrini müəyyən etməyə imkan verir. istifadəçi (Şəkil 3).

Tətbiq edilmiş DSS-ə əsasən, məlumatların kəmiyyət diapazonundan kənarda olması, hesablanması və ya hesablanmış rəqəmlər etibarsız hesab edildikdə, verilməməsi halında yekun nəticə olacaqdır. Hər iki halda, istifadəçini QC problemləri barədə xəbərdar edən xəbərdarlıqlar verilir. Qərar ağacı sadə (bir qatılma) və ya iki qatılmalı hesablama yanaşmasının seçilməsindən asılı olaraq bir qədər fərqlənir (Şəkil 4) və iyerarxik olaraq aşağıdakı amilləri nəzərə alır:

quantGenius keyfiyyətə nəzarət əsaslı qərara dəstək sistemi (DSS). Qərar ağacı halı (a) sadə (bir qatılma) hesablama və (b) iki qatılmanın hesablanması. Aşağıdakı QC nəzarət addımları iyerarxik olaraq həyata keçirilir: 1) ekstraksiya nəzarəti, 2) aşkarlama həddi 3) kəmiyyət həddi və 4) gücləndirmə nəzarətinin fərdi nümunə səmərəliliyi. DSS əsasında yekun nəticə hesablanır (mavi qutular), dəyişdirilmiş (narıncı qutular) və ya verilməmişdir (qırmızı qutular) və xəbərdarlıqlar verilir. İxtisarlar: Cq – kəmiyyət dövrü, CqExtC – hasilat nəzarətinin Cq dəyəri, №. – ədəd, CqLOQ – Kəmiyyət limitinin Cq qiyməti, dil. – qatılma, QC – keyfiyyətə nəzarət, CV – variasiya əmsalı

Ekstraksiya nəzarəti. Hər bir istinad gen analizi üçün CqExtC, bir Cq etibarlı nuklein turşusunun (DNT və ya RNT) çıxarılması prosedurunu göstərən dəyər hesablamalar üçün yalnız keyfiyyətli məlumatlardan istifadə edilməsini təmin edən istifadəçi tərəfindən müəyyən edilir. Varsayılan olaraq, CqExtC 34 olaraq təyin edilir, buna görə də nadir hallarda kəmiyyətə təsir göstərir. İstinad genlərinin yüksək şəkildə ifadə edildiyi fərziyyəsinə əsaslanaraq, istifadəçilər kənar nümunələri müəyyən etmək üçün bu həddi aşağı sala bilərlər. Əgər bütün istinad genləri bu meyara uyğun gəlmirsə, hədəf genin yekun nəticəsi hesablanmır (Şəkil 4).

Kəmiyyət limiti (LOQ). Hər bir hədəf gen analizi üçün Cq LOQ-da (CqLOQ), təhlilin kəmiyyət göstəricisinin aşağı həddinin müəyyən edilməsi istifadəçi tərəfindən ya əvvəlki daxili doğrulama məlumatlarına (əgər varsa) əsaslanaraq və ya təcrübənin standart əyrisindən təxmin edilir.Digər tərəfdən, LOQ quantGenius tərəfindən əsl pipetləmə xətalarının əvvəllər əl ilə silindiyini fərz etməklə, təkrarların nüsxə nömrələri arasında yüksək dəyişkənlik (CV > 30) kimi qəbul edilə bilər. Sadə hesablamada LOQ-dan aşağı olan nümunələr üçün yekun nəticə C əsasında hesablanırqLOQ və bütün nümunə istinad gen məlumatları (Şəkil 4a, Əlavə fayl 2, Tənlik 24). İki qatılmalı hesablamada LOQ QC addımı iki mərhələdə yerinə yetirilir: a) əgər birinci seyreltmə (daha az seyreltilmiş reaksiyalar) LOQ altında olarsa, yekun nəticə sadə hesablamada olduğu kimi hesablanır (yuxarıda təsvir edilmişdir), b) əgər yalnız ikinci qatılma (daha çox seyreltilmiş reaksiyalar) LOQ altındadır, birinci qatılma yekun nəticənin hesablanması üçün istifadə olunur (şək. 4b).

Aşkarlama limiti (LOD). Hədəf gen üçün nümunənin bütün reaksiyalarında C yoxdursaq dəyərlər, nümunədəki hədəf DNT səviyyələrinin analizin LOD altında olduğunu göstərir, sonra yekun nəticə C əsasında hesablanır.qLOQ bütün nümunə istinad gen məlumatlarının nömrələrini kopyalayın (Şəkil 4, Əlavə fayl 2, Tənlik 25). Buna görə də, son nəticə çox kiçik rəqəmdir (LOQ tərəfindən hesablanmış dəyərdən aşağıdır, lakin sıfır deyil) bu, əlavə məlumat hesablanması olmadan əlavə məlumat təhlilini mümkün edir. LOD təyini yalnız hədəf genlər üçün həyata keçirilir, çünki istinad genləri LOQ-dan xeyli yuxarı olmalıdır.

Fərdi nümunə gücləndirmə səmərəliliyinə nəzarət. Bu QC addımı yalnız iki qatılmalı hesablama zamanı həyata keçirilir və standart əyrilərdən biri ilə müqayisədə zahirən uyğun olmayan gücləndirmə effektivliyi olan kənar nümunələri müəyyən etmək üçün istifadə olunur [6]. Əgər fərdi nümunə mailliyi (Əlavə fayl 2, Tənlik 9) əvvəlcədən müəyyən edilmiş yamac diapazonundan kənara çıxırsa və ya onun standart əyrinin yamacından fərqi (Əlavə fayl 2, Tənlik 10) əvvəlcədən müəyyən edilmiş maksimum yamac fərqindən böyükdürsə, istinad və ya hədəf gen surəti nömrələri bu nümunə üçün hesablanmır (Şəkil 4b).

Əlavə məlumat təhlilinə imkan verən ixrac

Bütün məlumatlar, idxal edilmiş nümunə adları, miqdarlar və Cq dəyərlər, aralıq hesablamalar və QC parametrləri, həmçinin yekun nəticələr üçüncü tərəf proqram alətlərində əlavə təhlil və vizuallaşdırma imkanı vermək üçün quantGenius-dan ixrac üçün mövcuddur. Fərdi gen üzrə bütün məlumatlar Excel (.xls) formatında ixrac edilə bilər (Əlavə fayl 4-dəki nümunəyə baxın). Digər tərəfdən, eksperimentdəki bütün hədəf genlər üçün yekun nəticələr tab-delimited.txt və ya.xls formatlarında nümunə gen matrisi şəklində də ixrac edilə bilər. Sonuncuda, nəticələr QC xəbərdarlıqları ilə tamamlanır, beləliklə istifadəçi nümunə məlumatlarından və ya hesablanmış dəyərlərdən birbaşa hesablanmış dəyərləri ayırd edə bilər.

Xüsusiyyətlərin qabaqcıl qPCR analiz proqram vasitələri ilə müqayisəsi

QuantGenius-un kəmiyyətləşdirmə yanaşması və mühüm QC xüsusiyyətləri qPCR məlumatlarının təhlili üçün eyni dərəcədə təkmil proqram vasitələri ilə müqayisə edilmişdir: REST [14], qPCR analizi üçün ilk proqram vasitələrindən biri, iki məşhur kommersiya paketi qBASE+ (Biogazelle NV, [10]) və GenEx (MultiD Analyzes AB), eləcə də açıq mənbə aləti DAG Expression [15], standart əyri əsaslı kəmiyyətləşdirmədən istifadə edən nadir alətlərdən biri (Cədvəl 1). Qeyd etmək vacibdir ki, müqayisə edilən proqram vasitələri quantGenius-a daxil edilməyən əlavə xüsusiyyətlərə malikdir, məsələn, keyfiyyətli QC parametrləri (müsbət və mənfi nəzarət, genomik DNT-nin çıxarılmasına nəzarət və s.) təhlil, qrafikin tərtibi və s. Bu xüsusiyyətlər quantGenius-a daxil edilməyib, çünki o, qPCR məlumat analizi kəmərinin kəmiyyət aspektinə diqqət yetirir.

Performansın yoxlanılması

Tətbiqin cari versiyası kodlaşdırma səhvlərini aşkar etmək və aradan qaldırmaq üçün bir il ərzində daxili sınaqdan keçirilmişdir. Bundan əlavə, biz müxtəlif layihələrdən 50 təcrübəni təhlil etdik, burada 40-ı 384 quyulu lövhələrə, 10-u isə Fluidigm 48.48 Dinamik Massivlərə quraşdırılmışdır. QuantGenius və Microsoft Excel proqramlarında əvvəlcədən formatlaşdırılmış düsturlardan istifadə etməklə kəmiyyətin təyini və QC paralel olaraq həyata keçirilmişdir. Müqayisənin alt dəsti müvafiq olaraq Əlavə fayllar 4 və 5-də göstərilmişdir. Hər iki yanaşmadan istifadə edərək, bütün aralıq və son nüsxə nömrələri, eləcə də hesablanmış QC parametrləri eyni idi.

QuantGenius qərara dəstək sisteminin əhəmiyyətini göstərən hallardan istifadə edin

Kəmiyyət analizlərində düzgün QC-nin əhəmiyyətini göstərmək üçün biz quantGenius, gen ifadə araşdırması və genetik cəhətdən dəyişdirilmiş orqanizmin (GMO) kəmiyyət təhlilindən istifadə edərək müxtəlif qPCR tətbiqlərindən iki məlumat dəstini yenidən təhlil etdik.

Gen ifadəsindən istifadə halı üçün, əvvəllər dərc olunmuş təcrübəmizdən [16] qPCR məlumatlarının alt çoxluğu, kartofun virus aşılanmasına reaksiyasında iki hədəf geni təhlil edir. Xam məlumatlar (Cq dəyərlər) və əsas eksperimental təfərrüatlar Əlavə fayl 6-da, eksperimental təfərrüatlar isə orijinal nəşrdə mövcuddur [16]. Üç kəmiyyət yanaşması müqayisə edilmişdir:

Standart QC parametrləri ilə quantGenius iki qatılmalı kəmiyyət

heç bir QC-DSS olmadan standart əyri kəmiyyət yanaşması

tez-tez istifadə olunan ΔΔCq yanaşma [17], nümunələrin yalnız bir durulmasından istifadə etməklə

Üç yanaşmada əldə edilən nisbi nüsxə nömrələri Şəkil 5 və Əlavə fayl 7-də təqdim edilmişdir. Metodların ümumi nəticələri yüksək nisbətdə (r > 0.99) hər iki hədəf gen üçün. Buna baxmayaraq, quantGenius-un gücü aşağı gen ifadə dəyərləri və sub-optimal gücləndirmə effektivliyi olan fərdi nümunələrdə göstərilir.

Gen ifadəsi istifadə vəziyyətində göstərildiyi kimi həyata keçirilən QC-DSS-nin əhəmiyyəti. İki hədəf genin ifadəsi (PR1-b, yuxarı panelGlu-II, alt panel) infeksiyadan sonra bir, üç və altı gün ərzində saxta və virusla aşılanmış kartof bitkilərində təhlil edilmişdir (dpi). EF-1 və COX normallaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir [16], (Əlavə fayl 6). quantGenius tərəfindən əldə edilən nisbi ifadə dəyərləri (xaç) QC yerinə yetirilmədən standart əyri kəmiyyətləşdirmə ilə əldə edilənlərlə müqayisə edilir (std əyrisi, dairə) və ΔΔCq kəmiyyət yanaşması (ΔΔCq, almaz). Üç yanaşmada müqayisə edilə bilən dəyərlər əldə etmək üçün hər bir yanaşmanın nəticələri nümunələrdən birinə (virus 3dpi 2) normallaşdırıldı və sonra birinci eksperimental qrupun orta ifadəsinə (mock 1dpi) miqyaslandı. bir oxlar - C ilə nümunələrin nümunələriq istifadə edilən kəmiyyət yanaşmaları arasında yüksək dəyişkənliyi göstərən LOQ-a yaxın dəyərlər. b oxları - Nəticələrin quantGenius-da hesablanmadığı hədəf və ya istinad genində effektivlik problemi aşkar edilən kənar nümunələrin nümunələri

PR-1b geninin ifadəsi saxta peyvənd edilmiş nümunələrdə LOQ-a yaxın idi (C kimi nümayiş etdirildi)q C-yə yaxın dəyərlərqLOQ və yüksək replikasiyalı CV-lər), bu da müxtəlif kəmiyyət yanaşmaları (Şəkil 5, yuxarı panel, oxlar, Əlavə fayl 7) arasında yüksək nüsxə sayı dəyişikliyi (CV > 50) ilə nəticələndi. QuantGenius ilə LOQ-dan aşağı olan surət sayı dəyərləri LOQ yaxınlığındakı digər nümunələr üçün hesablanmış dəyərlər diapazonunda olan kiçik dəyər nömrəsi ilə hesablanır. İstifadəçi xəbərdarlıqla xəbərdar edilir və nəticələri şərh edərkən bunu nəzərə alacaq. Digər tərəfdən, yalnız daha çox seyreltilmiş reaksiyaların LOQ altında olduğu nümunələrdə kəmiyyətin təyini üçün yalnız daha az seyreltilmiş reaksiyalar istifadə edilmişdir.

Hər iki hədəf genində, fərdi nümunələrdə gücləndirmənin inhibə edilməsi halları var idi, nəticədə ən yüksək nəticələr əldə edildi, bu da Glu-II gen nəticələrində xüsusilə aydın görünür (Şəkil 5, b oxları). Bu hallarda, quantGenius son nəticəni hesablamır və beləliklə, kəmiyyət göstəricilərinin nəticələrinin etibarlılığını yenidən artırır.

İkinci məlumat toplusu GMO diaqnostikasındandır, burada nümunələrdəki GMO-nun (Round-up-ready soya, RRS) miqdarı transgen və istinad geninin (soya lektin) nüsxə nömrələrinin nisbəti kimi ölçülür, hər ikisi standartdan hesablanır. GMO tərkibi məlum olan istinad materialının əyrisi [3]. Təqdim olunan nümunədə eyni nümunədən analiz edilmiş DNT ekstraksiyalarının hər ikisində həm referans gen, həm də transgen analizləri üçün güclü inhibə müşahidə edildi, bu da daha az C-yə malik daha çox seyreltilmiş DNT reaksiyaları ilə nəticələndi.q daha az seyreltilmiş dəyərlərdən (Əlavə fayl 8). QC olmasaydı, GMO-nun hesablanmış faizi istifadə edilən DNT təcridindən və seyreltmədən asılı olaraq 56 ilə 1090% arasında dəyişərdi. Digər tərəfdən, quantGenius iş prosesində bu nümunə üçün nəticələr, ilk növbədə, istinad geninin qəbuledilməz səmərəliliyi səbəbindən verilmir (Şəkil 4-də qərar ağacına baxın). Bu nümunə üçün DNT izolyasiyası və qPCR analizi təkrarlandı və o, QC-dən keçdi və GMO tərkibinin 33% olduğu müəyyən edildi (məlumatlar göstərilmir).


Mücərrəd

Model analitin aşkarlanması üçün iki ekzogen daxili standartla son nöqtə kəmiyyət nuklein turşusu ardıcıllığına əsaslanan gücləndirmə (NASBA) reaksiyası E. coliclpB mRNT hazırlanmış və statistik təhlil edilmişdir. Elektrokemilüminesans istifadə olunan daxili standartların diqqətlə qiymətləndirilməsinə imkan verən yüksək həssas aşkarlama vasitəsi kimi seçilmişdir. Tədqiq olunan iki daxili standart daha əvvəl yeni və sürətli NASBA-a əsaslanan metoddan istifadə etməklə tərtib edilmişdir. Əvvəlcə hər bir standart NASBA reaksiyasında ayrıca istifadə edildi, sonradan fərqli konsentrasiyalarda bir reaksiyaya iki daxili standart əlavə edildi. Əldə edilmiş məlumatların dəqiqliyi və dəqiqliyi xətti və çoxlu reqressiya analizindən istifadə etməklə təhlil edilmişdir. Tək standartlı reaksiyalar zamanı dəqiqlik >95% və dəqiqlik >98,5% olmuşdur. İkili standart reaksiyalar zamanı dəqiqlik >97%-ə yüksəldi. Vahid daxili standartla, bir daxili standartın üç müxtəlif konsentrasiyasından istifadə etməklə hədəf ardıcıllığının 3 böyüklüyü sırası ölçülə bilər, dinamik diapazon 5 böyüklük sırasına yüksəldi. Hər iki halda, hədəf ardıcıllığının 0,14 pg kimi aşağı aşkarlama limiti əldə edilmişdir. İkiqat daxili standart reaksiyalar halında, 5 böyüklük sırası və aşkarlama həddi 1,76 pg olan dinamik diapazon müəyyən edilmişdir. Daxili standartların yüksək performanslı keyfiyyətinin qismən ənənəvi klonlaşdırma üsullarından daha çox iki NASBA reaksiyasından istifadə edərək unikal sintez prosesi ilə əlaqədar olduğu güman edilirdi.

Yazışmalar kimə ünvanlanmalıdır. E-poçt: [email qorunan]


Elemente und Quantifizierung: Ein Nucleinsäure-Assay, der auf einer Elementmarkierungsstrategie mit magnetischen Micropartikeln (MMPs) beruht, ermöglicht die Quantifizierung mehrfacher DNA-Ziele. Seltenerdelemente, Indium and stabile Isotope connten mit Oligonucleotiden, die alls DNA-Sonden, markiert westerden. Die kəmiyyət Analyze wurde dann mit den entworfenen Systemen (siehe Bild) və Massenspektrometrie durchgeführt.

İnsan xəstəlikləri ilə əlaqəli ardıcıllıqla spesifik və ya mutasiyaya uğramış genlərin sürətli, multipleks və kəmiyyətcə aşkarlanması molekulyar diaqnostika və genomika tədqiqatlarının müasir klinik müalicələrində mərkəzi rol oynamışdır. 1 Son onilliklər ərzində yeni texnologiyaların və metodların bir sıra irəliləyişləri əldə edilmişdir. 2 Bununla belə, analitik imkanların təkmilləşdirilməsi, xüsusən də siqnalın çoxaldılması 3 və dəqiq kəmiyyətin müəyyən edilməsi üçün getdikcə artan tələblər var. 4 İndiki vaxtda müxtəlif optik yanaşmalar arasında flüoresan əsaslı üsul daha çox tətbiq olunur. 5 Mövcud flüoroforların sayını əsaslı şəkildə məhdudlaşdıran spektral üst-üstə düşmə və çoxdalğalı həyəcanlanmanın çatışmazlıqlarından əziyyət çəkdiyinə görə, bir analizdə ondan çox DNT hədəfinin eyni vaxtda aşkarlanması hətta kvant nöqtələrindən istifadə etməklə çətin ki, həyata keçirilsin. 6 Son zamanlarda çoxlu sayda mövcud kodlaşdırma boncuklarından istifadə edərək bu problemi həll etmək üçün rəng kodlayan mikrohissəcik texnologiyaları hazırlanmışdır. 7 Problemlərdən biri onların mikrometr ölçülərinə malik olduğundan onların polidispersliyi və bikomuyğun olmaması səbəbindən dəqiq və dəqiq kəmiyyətin müəyyən edilməsidir. Bundan əlavə, mürəkkəb istehsal prosesi onların geniş istifadəsinə mane ola bilər. 8 Buna görə də, etiketləmə prosesini sadələşdirməyə və yüksək səviyyəli multipleksləşdirməni və dəqiq təyini təmin etməyə qadir olan qeyri-optik etiketləmə və aşkarlama metodunun tədqiqinə maraq yaranmışdır.

Bioanalizlər üçün elementar etiketləmə strategiyası, böyük biomolekulların elementar etiketlərlə etiketləndiyi və sonradan induktiv şəkildə birləşdirilmiş plazma kütlə spektrometriyası (ICP-MS) kimi elementar kütlə spektrometriyası ilə aşkar edildiyi yeni yaranan üsul kimi qəbul edilmişdir. 9 Digər üsullarla müqayisədə onun iki xas üstünlüyü var: 1) Elementar etiketlər kimi potensial olaraq istifadə edilən çoxlu sayda element və ya izotopun (100-ə qədər) üstünlükləri, həmçinin əla kütlə ayırdetmə qabiliyyəti və ICP-nin çox elementli detektorları sayəsində -MS, yüksək səviyyəli multipleksləşdirilmiş analiz spektral üst-üstə düşmə məhdudiyyəti olmadan uğurla əldə edilə bilər 10 2) ICP-MS izotop nisbətini yaxşı dəqiqlik və dəqiqliklə ölçməyə imkan verdi, beləliklə izotopların seyreltmə analizi (IDA), mütləq-kəmiyyət ölçmə ilə birlikdə molekulyar kütlə spektrometriyasının tamamlayıcı istifadəsi kimi həyata keçirilə bilər. 11 Son on ildə elementar etiketləmə bioanalizi fermentlə əlaqəli immunosorbent analizi (ELISA), 12 kəmiyyət protomika, 13 və tək hüceyrəli biologiya sahələrində uğurla tətbiq edilmişdir. 14 Təəssüf ki, nuklein turşusu analizində elementlərin etiketlənməsinin dəyəri tam başa düşülməmişdir və əvvəlki nəşrlərdə yalnız bir neçə müvafiq tədqiqat var. 15 Fikrimizcə, bunun səbəbi nuklein turşusunu elementar etiketlərlə etiketləmək üçün yüksək spesifik və effektiv yanaşmaların olmaması ola bilər. Başqa bir cəhət ola bilər ki, mövcud mütləq kəmiyyətin təyini üsulları adətən ICP-MS-ni xromatoqrafiya və ya gel elektroforezi kimi vaxt və əmək tələb edən ayırma prosedurları ilə birləşdirməyi tələb edir. 16 Beləliklə, elementar etiketləmə bioanalizlərinin bu çatışmazlığını aradan qaldırmaq və onun tətbiqlərini kəmiyyət nuklein turşusu analizinə genişləndirmək üçün böyük səylər göstərilməlidir.

Burada biz ilk dəfə olaraq elementar etiketləmə strategiyasına əsaslanan, xüsusi tanınma üçün DNT hibridləşmə reaksiyalarından, multipleks etiketləmə üçün nadir torpaq elementlərindən, sürətli ayrılma üçün maqnit mikrohissəciklərindən və ultrahəssaslıq üçün ICP-MS üstünlüklərindən istifadə edən multipleks nuklein turşusu analizlərini təqdim edirik. aşkarlanması. Əhəmiyyətli odur ki, DNT hədəflərinin multipleks analizi üçün həm mütləq, həm də nisbi kəmiyyət müəyyən edilə bilər. Yüksək səviyyəli multipleksləşdirmənin konseptual tədqiqatı olaraq, klinik xəstəliklərlə əlaqəli 15 DNT hədəfi eyni vaxtda Y, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho elementar etiketləmə etiketləri ilə aşkar edilmişdir. , Er, Tm, Yb və Lu. Nisbi kəmiyyət daxili kalibrləmə əyrilərindən istifadə etməklə aparılmışdır. Əlavə olaraq, xromatoqrafiyasız hibridləşmə izotoplarının seyreltmə analizi (HIDA) ilə mütləq kəmiyyət təyini hazırlanmışdır. Süni şəkildə 161 Dy ilə zənginləşdirilmiş və 168 Er ilə zənginləşdirilmiş izotopların seyreltmə zondları ilə etiketlənməsindən istifadə edərək, iki DNT hədəfi mütləq və eyni vaxtda təhlil edilmişdir.

Sxem 1 a-da göstərildiyi kimi, ardıcıllıqla xüsusi oliqonukleotidlərin elementar işarələrlə etiketlənməsi proseduru iki addımı əhatə edir: 1) tiol ( SH) qrupları ilə son funksionallaşdırılmış 3′ oliqonukleotidlər, xüsusi olaraq 1,4-dən ibarət malemid qrupları ilə törədilib, 7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7-tris-asetikasid-10-maleimidoetilasetamid (MMA-DOTA), zülalların və ya peptidlərin kimyəvi etiketlənməsi üçün adətən istifadə edilən birləşmə 17 2) nadir torpaq elementləri (REEs) yüksək konsentrasiya ilə xelatlaşdırılmışdır. kinetik və termodinamik sabitlik (reaksiya şərtləri (pH, MMA-DOTA-nın DNT-yə mol nisbəti, vaxt və temperatur) üçün Dəstəkləyici Məlumata baxın). DNT-də yalnız bir  SH qrupu olduğundan, REE etiketli DNT komplekslərində DNT və REE ionları arasında stokiometriya 1:1 mol nisbəti idi. REE-ləri elementar etiketlər kimi istifadə edən fərqləndirici xüsusiyyət onların oxşar kimyəvi xassələrə, bioloji nümunələrdə aşağı fona və ICP-MS-də yüksək həssaslığa malik olmasıdır. Əhəmiyyətli olan, etiketləmə reagentləri kimi DOTA-REE xelatları suda həll olunur və biouyğundur.

Elementar etiketləmə strategiyasına əsaslanan multipleks DNT analizləri. a) DNT-nin elementar işarələrlə etiketlənməsi. SH qrupu olan oliqonukleotid MMA-DOTA ilə konyuqasiya olundu, sonra nadir torpaq elementləri, stabil izotoplar və indium DOTA makrosiklində xelatlaşdırıldı. b) Multipleks DNT analizi prosedurları. Əvvəlcə DNT hədəfləri tutma-zond funksiyalı maqnit mikrohissəciklərinin (MMP) asma sırasına əlavə edildi və elementar etiketli DNT zondları ilə qarışdırıldı. Sonradan MMP-DNT-element komplekslərinin sendviç konjuqatları hibridləşmə reaksiyaları ilə sintez edilmişdir. Daha sonra, maqnit ayrılması və temperaturun ərimə temperaturundan yuxarı artması (Tm), elementar etiketləmə DNT zondları ICP-MS ilə kəmiyyətcə ölçülən supernatant üçün buraxıldı.

Etiketləmə prosedurları matrislə dəstəklənən lazer desorbsiya/ionlaşma vaxtı-uçuş kütlə spektrometriyası (MALDI-TOF-MS) ilə izlənildi. Hər bir mərhələnin məhsulları yüksək performanslı maye xromatoqrafiya (HPLC) ilə təmizləndi. Nəhayət, elementar etiketləmə məhsullarının spesifikliyi ICP-MS ölçülməsi ilə təsdiq edilmişdir. Məsələn, hepatit A virusunun (HAV) hədəf zondu (ardıcıllıq Dəstəkləyici Məlumat, Cədvəl S2-də verilmişdir) La elementi ilə etiketlənmişdir. Şəkil 1a MALDI-TOF-MS nəticələrini göstərir. HAV zondunun müəyyən edilmiş molekulyar çəkisi (DW) 7878,2, nəzəri molekulyar çəkisi (TW) 7873,2, birinci pillə məhsulunun DW, 8406,9, DNT-DOTA kompleksi TW 8401,7, ikincinin DW-nə uyğundur. addım məhsulu 8541,4 olub, 8537,6 olan DNT-DOTA-La kompleksi TW-yə uyğundur. Ölçülmüş və nəzəri molekulyar çəki arasında 4-5 kütlə fərqi istifadə edilən MALDI-TOF-MS-in kütlə ölçmə xətaları ilə əlaqədar idi. Nəhayət, HPLC ilə təmizləndikdən sonra (Şəkil 1 b) DNT-DOTA-La kompleksinin məhsulu ICP-MS profil spektrləri ilə təsdiq edilmişdir (m/z 135-dən 180-ə qədər) Şəkil 1 c (HAV-La). Digər 13 sekans-spesifik DNT zondunun müvafiq olaraq 13 müxtəlif REE ilə uğurla etiketləndiyi də təsdiqləndi. MALDI-TOF-MS nəticələri Dəstəkləyici Məlumatda, Şəkil S2-də verilmişdir. Eyni prosedurdan istifadə etməklə ümumilikdə 15 REE, o cümlədən Y və iki stabil izotop (161 Dy-zənginləşdirmə və 168 Er-zənginləşdirmə), həmçinin indium (In) müvafiq olaraq ardıcıllıqla xüsusi DNT zondları ilə uğurla etiketləndi. .

Nadir torpaq etiketli DNT zondlarının xarakteristikası. a) La-etiketli HAV zondlarının MALDI-TOF-MS nəticələri. Müəyyən edilmiş kütlə 7878.2 tiol-funksionallaşdırılmış DNT-dən, 8406.9-u DNT-DOTA komplekslərinin məhsulundan və 8541.4-ü DNT-DOTA-La komplekslərinin məhsulundan idi. b) HPLC ilə DNT-DOTA-La komplekslərinin təmizlik testi. Saxlama müddəti 13.55 dəqiqə idi. c) La-dan Lu-a qədər müxtəlif REE-lərlə etiketlənmiş 14 DNT zondunun ICP-MS profil spektrləri. Hər bir təmizlənmiş məhsulun təyin edilməsində ICP-MS tarama bölgəsindən idi m/z 135 - 180, qalma müddəti 100 ms.

Multipleksləşdirilmiş DNT analizlərinin nisbi kəmiyyəti ilk dəfə tədqiq edilmişdir və prinsip Sxem 1 b-də təsvir edilmişdir. Təcrübələrdə model sistemlər kimi klinik xəstəliklərə (xərçəng, heredopatiya və virus) aid 25-30 əsaslı 15 DNT hədəfi və daxili standart üçün nəzarət hədəfi istifadə edilmişdir. Bu DNT hədəflərinin ardıcıllığı və onların tərtib edilmiş tutma və hesabat zondları Dəstəkləyici Məlumat, Cədvəl S2-də verilmişdir. 2,8 μm maqnit mikrohissəciklərinin (MMPs) dayandırılması maraq hədəflərinin bir yarısına tamamlayıcı olan 16 tiollaşdırılmış tutma zondları ilə funksionallaşdırıldı. Sonra onlar DNT hədəflərinin qarışığı və 15 REE etiketli hesabat zondları (HAV-La, HBV-Ce, HCV-Pr, HIV-Nd, HPV-Sm, EV-Eu, TP-Gd, VV-Tb, BA-Dy, FT-Ho, SRAS-Er, BC-Tm, AD-Yb, SCD-Lu, PC-Y), eləcə də digər yarım bölgəni tamamlayan In-etiketli hesabat zondları (IS-In) hədəflərdən. Sendviçin hibridləşməsi reaksiyaları MMP-hədəf element komplekslərinin əmələ gəlməsinə səbəb oldu. Sonradan, maqnit ayırma istifadə edərək, artıq REE-lər etiketli hesabat zondları çıxarıldı. Nəhayət, temperaturu 95 °C-ə qədər artıraraq, REE etiketli hesabat zondlarının MMP-hədəf element komplekslərindən supernatant üçün buraxılmasına icazə verildi və ICP-MS ilə ölçüldü (eksperimental təfərrüatlar üçün Dəstəkləyici Məlumata baxın).

Bu analizdə, hər bir DNT hədəfinin tanınması ilə müəyyən edilmişdir m/z öz etiketli REE-lərinin spektri və kəmiyyəti ICP-MS ilə kəmiyyətcə ölçülən ion həssaslığından asılı idi. REE-lərin əksəriyyətində birdən çox sabit izotop var idi, onlardan bəziləri kütləvi spektral üst-üstə düşür (Şəkil 1 c-də göstərildiyi kimi). Bununla belə, onların aşkarlanması üçün ən azı bir üst-üstə düşməyən izotopu var idi (izotoplar və onların hər bir REE-nin bolluğu Dəstəkləyici Məlumat, Cədvəl S3-də verilmişdir). Beləliklə, bir analizdə 15 REE eyni vaxtda aşkar edilə bilər. Bu yanaşmada 89 Y, 139 La, 140 Ce, 141 Pr, 146 Nd, 147 Sm, 153 Eu, 158 Gd, 159 Tb, 163 Dy, 165 Ho, 166 Er, 169 Tm, 172 və izotopları Kütləvi spektral üst-üstə düşmədən 15 DNT hədəfinin eyni vaxtda aşkarlanması üçün 175 Lu istifadə edilmişdir. Nəticədə, DNT hədəflərinin miqdarı ICP-MS-də bu izotopların siqnallarına istinad edirdi. Şəkil 2 a dörd səviyyəli konsentrasiyaya (5, 10, 15 və 20 pmol) malik 15 DNT hədəfinin analitik nəticələrini göstərir. Spektrlərdə hər bir unikal izotop bir DNT hədəfi təyin etdi və izotopların kanal sayı DNT hədəflərinin miqdarına uyğun olaraq artdı. Bununla belə, eyni konsentrasiyaya malik müxtəlif DNT hədəfləri arasında fərqli intensivliklər əldə edilmişdir. Səbəb ölçülən izotopların müxtəlif bolluğa malik olması idi.

a) Dörd səviyyəli konsentrasiyaya malik 15 DNT hədəfinin ICP-MS profil spektrləri. Bəzi kütləvi üst-üstə düşmələri nəzərə alaraq, 89 Y, 139 La, 140 Ce, 141 Pr, 146 Nd, 147 Sm, 153 Eu, 158 Gd, 159 Tb, 1665y daxil olmaqla, eyni vaxtda təyin etmək üçün REE-lərin izotopları seçilmişdir. , 166 Er, 169 Tm, 172 Yb və 175 Lu. Təcrübələrdə daxili standart olaraq 115 In monitorinq edildi. Bundan əlavə, müvafiq olaraq HAV, HBV, HCV, HİV, HPV, EV, TP, VV, B. anthracis, F. tularensis, SARS, koronavirus, döş xərçəngi, prostat xərçəngi, Alzheimer xəstəliyi ilə əlaqəli 15 klinik əhəmiyyətli genetik hədəf, həmçinin oraq hüceyrə xəstəliyi kimi, eyni vaxtda 5, 10, 15 və 20 pmol olan dörd konsentrasiya ilə analiz edilmişdir. Daxili standart hədəf 10 pmol idi. b) SCD hədəflərinin konsentrasiyalarına qarşı 175 Lu/ 115 nisbi intensivliklərin daxili kalibrləmə əyriləri (boş nümunə ehtiva edir). Digər kalibrləmə əyriləri üçün Dəstəkləyici Məlumata, Şəkil S3-ə baxın.

Kalibrləmə əyriləri ilə kəmiyyətin təyini prosedurunda nümunələrlə birlikdə zondu In elementi ilə işarələnmiş sabit konsentrasiyalı (10 pmol) daxili standart (IS) hədəfi təhlil edilmişdir. Hər bir analizdə IS hədəfi nümunə həllərinə əlavə edildi və digər hədəflərlə eyni şəraitdə işlədilib. Beləliklə, o, nümunə itkilərini və nümunə hazırlama və ayırma mərhələlərindəki dəyişikliyi hesablaya bilər və ICP-MS-nin qərəzli ölçülməsini düzəldə bilər. Nəticədə, DNT hədəflərinin konsentrasiyasına qarşı REE-lərin nisbi intensivliklərinin (REE və In arasındakı siqnal nisbətinə uyğun) kalibrləmə əyriləri yaxşı xəttiliklə əldə edilmişdir. Məsələn, Şəkil 2 b SCD hədəfinə qarşı 175 Lu/ 115 In kalibrləmə əyrilərini təsvir edir. Bu üsulda DNT hədəflərinin əldə edilmiş aşkarlama həddi 0,5-2 pmol qədər aşağı idi. Xətti diapazon 0,5-dən 20 pmol-a qədər idi və MMP-lərin dozasını artırmaqla genişləndirilə bilər. Bundan əlavə, REE-lərin 40-a yaxın izotopu olduğundan, təklif olunan metodun multipleksləşdirmə qabiliyyəti daha da təkmilləşdirilə bilər.

Yuxarıda qeyd edildiyi kimi, nisbi kəmiyyət yanaşması müqayisəli təhlil idi və hədəflərin ardıcıllığı ilə mükəmməl uyğunlaşan məlum miqdar standart nuklein turşularından istifadə etməklə kalibrləmə əyriləri ilə DNT nümunələrinin analitik məlumatlarını kəmiyyətləndirdi. Bununla belə, hədəflərə əsaslanan heç bir standart istinad tələb etməyən mütləq kəmiyyət bioanalizi birbaşa hədəflərin dəqiq miqdarını təmin edə bilər. 18 Son tədqiqatlarda bu tip mütləq kəmiyyət metodunda ardıcıllığa xüsusi və multipleks DNT analizinə dair nümunələr olmamışdır. Bu problemi həll etmək üçün biz izotopların seyreltmə analizini DNT hibridləşmə reaksiyaları ilə birləşdirərək mütləq DNT-nin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün yeni üsul təklif edirik. Prinsip Sxem 2-də göstərilmişdir. Görünür ki, süni zənginləşdirilmiş izotoplarla işarələnmiş seyreltmə zondları (DP) DNT hədəflərindən asılı olmayaraq MMP-lərdə hərəkətsizləşdirilmiş tutma zondları (CP) ilə birbaşa hibridləşə bilər. Bunun əksinə olaraq, təbii REE-lərlə etiketlənmiş hesabat zondları (RP) DNT hədəflərinin hibridləşdirilməsi yolu ilə CP-lərlə birləşdirilir. Sabit miqdarda DP və artıq miqdarda RP üçün DNT hədəfləri RP/DP nisbətini təyin etdi (RRP/DP) CP-lərin hibridləşdirilmiş komplekslərində. RRP/DP nisbəti ilə göstərilə bilər m2/m1 (R). Buna görə də, DP-lərin miqdarının kəmiyyətini müəyyən etməklə, eləcə də hibridləşdirilmiş CP-lərdə, RP-lərdə və DP-lərdə R-ni ölçməklə, DNT hədəflərinin miqdarı izotopların seyreltmə funksiyalarına uyğun olaraq hesablana bilər (Dəstək Məlumata baxın).

Hibridləşmə izotoplarının seyreltmə analizi (HIDA) strategiyası. HIDA sistemi dörd hissədən ibarət idi: tutma zondları, hesabat zondları, seyreltmə zondları və DNT hədəfləri. Tutma zondlarının iki bölgəsi var idi: birinci bölgə seyreltmə zondları ilə birbaşa hibridləşdirilmiş, ikincisi isə DNT hədəfləri və hesabat zondları ilə sendviç hibridləşməsindən əldə edilən ikinci bölgə. Ln təbii nadir torpaq elementi, *Ln isə süni zənginləşdirilmiş izotop idi. Bənzər kimyəvi və fiziki xassələrə malik idilər, lakin izotopların kütlə sayı baxımından çoxluğu m1m2. İzotop nisbətinin ölçülməsi ICP-MS tərəfindən izotop nisbətinin dəyişməsini təhlil etmək üçün aparılmışdır m2/m1 DNT hədəflərinin hibridləşməsi nəticəsində yaranır.

Multipleks DNT analizi üçün HIDA metodunun məqsədəuyğunluğunu nümayiş etdirmək üçün Şəkil 3-də göstərildiyi kimi iki zəncirli sistem tərtib edilmişdir, burada müvafiq olaraq BA və SARS hədəfləri ilə eyni vaxtda hibridləşmə üçün iki ardıcıllığa məxsus CP istifadə edilmişdir. Təbii Dy və Er öz RP-ləri ilə, 161 Dy ilə zənginləşdirilmiş və 168 Er ilə zənginləşdirilmiş izotoplar isə DP-ləri ilə etiketlənmişdir. 161, 163, 166 və 168 kütlə nömrələri izotop nisbətinin ölçülməsi üçün ICP-MS tərəfindən izlənilmiş və Dy və Er elementlərində onların kütləvi spektral üst-üstə düşməsi müşahidə edilməmişdir. Təcrübələrdə 100 μL MMP (1–2×10 9 mL −1) əvvəlcə 500 pmol BA və SRAS hədəf CP ilə qarışdırıldı, otaq temperaturunda yumşaq silkələnmə ilə 4 saat reaksiya verməyə icazə verildi, sonra birləşmə ilə yuyuldu. reaktiv olmayan CP-ləri aradan qaldırmaq üçün bufer. Tutma-zond-funksionallaşdırılmış MMP-lər hazırlandıqdan sonra, 200 pmol artıq BA və SRAS hədəf RP-ləri və müəyyən miqdarda nümunələr əlavə edildi. Sonradan, əvvəllər ICP-MS ilə kəmiyyətcə ölçülən 161 Dy etiketli DP-dən 159,89±0,35 ng və 168 Er etiketli DP-dən 171,89±0,28 ng qarışıqlara hopdurulmuşdur. Bundan sonra, DNT hibridizasiyası, nümunənin ayrılması və ICP-MS ölçülməsi nisbi kəmiyyət göstəricisinə oxşar şəkildə həyata keçirildi.

BA (üst) və SARS (alt) hədəfləri üçün DNT ardıcıllıqları və HIDA etiketli elementləri. BA hesabat zondu 3′ ucu təbii Dy (161, bolluq 18,91 % 163, bolluq 24,90 %) ilə etiketlənmişdir BA seyreltmə zondu 3′ ucu 161 Dy ilə zənginləşdirilmiş izotopla (161, bolluq 95,73 % 163) işarələnmişdir. bolluğu 0,90 % təşkil edir. SRAS hesabat zondunun 3′ ucu təbii Er (166, bolluq 33,61 % 168, bolluq 26,78 %) ilə etiketlənmişdir SRAS seyreltmə zondu 3′ ucu 168 Er ilə zənginləşdirilmiş izotopla (166, bolluq 0,62 % 168, bolluğu 97,76 % təşkil edir. Hər bir tutma zondunun 47 əsası var idi, burada 10 əsaslı poli A oliqonukleotidin həm 5′ ucunda, həm də ortasında boşluq kimi istifadə edilmişdir.

Şəkil 4-də BA və SARS hədəflərinin müxtəlif konsentrasiyalarını ehtiva edən üç nümunənin ICP-MS profil spektrlərinin nəticələri göstərilmişdir (miqdar 1-dən 3-ə qədər artır). Nəticədə, DNT hədəflərinin artması ilə 163 və 166 kütlə nömrəli siqnallar 161 və 168-dən daha diqqətəlayiq artdı. Orijinal izotop nisbəti 161/163 (R161/163) təbii Dy və 161 Dy ilə zənginləşdirilmiş izotopda müvafiq olaraq 0,76 və 106,37 idi, orijinal izotop nisbəti 168/166 (R168/166) təbii Er və 168 Er ilə zənginləşdirilmiş izotopda müvafiq olaraq 0,80 və 157,68 olmuşdur. Onlarla müqayisədə, nümunə 1, 2 və 3-ün HIDA analizlərində, R161/163 8,21±0,05, 4,18±0,04, 2,78±0,05 və R168/166 11,29±0,07, 5,42±0,04-dən 3,20±0,05-ə dəyişib. Buna görə də, DNT hədəfləri RP-ləri CP-lərlə birləşdirdi və onların dəyişməsi ilə nəticələndi RRP/DP. Cədvəl 1, ölçülmüş izotop nisbətlərinə, artan DP-lərin miqdarına və izotopun seyreltmə tənliklərinə (Dəstəkləyici Məlumat, Tənliklər S1 və S2) uyğun olaraq 1, 2 və 3 nümunəsində BA və SARS hədəflərinin mütləq kəmiyyətinin nəticələrini göstərir. . HIDA metodunun düzgünlüyünü təsdiqləmək üçün 260 nm-də optik sıxlığı ölçməklə nümunələrdə BA və SARS hədəflərinin miqdarını ölçmək üçün UV absorbsiya spektroskopiyası tətbiq edilmişdir. Bu nəticələr referans dəyərlər kimi qəbul edilə bilər və HIDA metodu ilə əldə edilən nəticələr onlarla yaxşı uyğun gəlirdi. Bərpa 93,7-106,5 % təşkil etmişdir ki, bu da təklif olunan yanaşmanın dəqiq metod olduğunu göstərir. Bundan əlavə, bu metodun multipleksləmə qabiliyyəti eyni vaxtda REE-lərin daha çox izotopunu aşkar etməklə genişləndirilə bilər. Bununla belə, bir DNT hədəfi mütləq analiz üçün REE-lərin iki izotopunu tələb etdiyindən, yuxarıda qeyd olunan nisbi yanaşma ilə müqayisədə onun multipleksləmə qabiliyyəti azalmışdır. Bundan əlavə, proteomikada növə xas və ya qeyri-spesifik izotopların seyreltmə üsulları ilə müqayisədə ardıcıllıqla spesifik hibridləşmə reaksiyalarından istifadə edərək DNT analizi üçün HIDA, xromatoqrafik və ya elektroforetik ayırma üsullarından istifadə etmədən mütləq kəmiyyətin müəyyənləşdirilməsinə gətirib çıxardı.

Üç nümunənin ICP-MS profil spektrləri (1, 2, 3). Tarama bölgələri edildi m/z 160,5–161,5, 162,5–163,5, 165,5–166,5 və 167,5–168,5, qalma müddəti 50 ms. Orta hesablanmış beş təyinatın izotop nisbətlərinin nəticələri: I161/I163=8,21±0,05 (1), 4,18±0,04 (2), 2,78±0,05 (3) və I168/I166=11.29±0.07 (1), 5.42±0.04 (2), 3.20±0.05 (3).


Məhsul haqqında ətraflı məlumat

General

Xüsusiyyətlər

Komponent Təsvir Məbləğ Konsentrasiya(a)
A TE-4 tamponunda anonim tək mənbəli qadın genomik DNT 50 &muL 1,1 &ndash 2,1 ng/&muL
B TE-4 tamponunda anonim tək mənbəli kişi genomik DNT 50 &muL 1,1 &ndash 2,1 ng/&muL
C TE-4 tamponunda anonim tək mənbəli kişi genomik DNT 50 &muL 1,1 &ndash 2,1 ng/&muL
D TE-4 tamponunda qarışıq mənbəli (A və C komponentləri) genomik DNT 50 &muL 1,1 &ndash 2,1 ng/&muL
E Anonim tək mənbəli qadın hüceyrələr 903 kağızda tapıldı 6 mm-lik iki zımba Hər yumruq üçün 7,5 və dəfə 10 4 hüceyrə
F Anonim tək mənbəli kişi hüceyrələri FTA kağızında tapıldı 6 mm-lik iki zımba Hər yumruq üçün 7,5 və dəfə 10 4 hüceyrə

İstifadə istiqamətləri və keyfiyyətə nəzarət spesifikasiyası üçün NIST Analiz Sertifikatı ilə tanış olun.

Qanuni imtinalar

Məhsul "OLDUĞU KİMİ" təmin edilir və ATCC ® məhsullarının həyat qabiliyyətinə göndərilmə tarixindən etibarən 30 gün müddətində zəmanət verilir, bir şərtlə ki, müştəri məhsulu məhsul məlumat vərəqində, internet saytında və veb-saytda daxil edilmiş məlumata əsasən saxlayıb idarə etsin. Analiz sertifikatı. Canlı mədəniyyətlər üçün ATCC məhsul üçün təsirli olduğu müəyyən edilmiş media formulalarını və reagentləri sadalayır. Digər qeyri-müəyyən media və reagentlər də qənaətbəxş nəticələr verə bilsə də, ATCC və/və ya depozitor tərəfindən tövsiyə olunan protokollarda dəyişiklik məhsulun bərpasına, böyüməsinə və/və ya funksiyasına təsir göstərə bilər. Alternativ mühit formulundan və ya reagentindən istifadə edilərsə, ATCC-nin həyat qabiliyyətinə dair zəmanəti artıq etibarlı deyil. Burada açıq şəkildə qeyd olunan hallar istisna olmaqla, hər hansı digər hər hansı digər zəmanət verilmir, açıq və ya nəzərdə tutulmur, o cümlədən, lakin bunlarla məhdudlaşmayaraq, satıla bilmə, müəyyən məqsəd üçün uyğunluq, cGMP standartlarına uyğun istehsal, tipiklik, təhlükəsizlik, dəqiqlik. və/və ya pozulmamaq.

Bu məhsul yalnız laboratoriya tədqiqatı üçün nəzərdə tutulub. Hər hansı bir heyvan və ya insan terapevtik istifadəsi, hər hansı insan və ya heyvan istehlakı və ya hər hansı diaqnostik istifadə üçün nəzərdə tutulmayıb. ATCC lisenziyası olmadan hər hansı təklif olunan kommersiya istifadəsi qadağandır.

ATCC bu məhsul vərəqinə dəqiq və aktual məlumat daxil etmək üçün ağlabatan səylərdən istifadə etsə də, ATCC onun düzgünlüyünə dair heç bir zəmanət və ya təqdimat vermir. Elmi ədəbiyyatdan və patentlərdən sitatlar yalnız məlumat məqsədləri üçün verilir. ATCC bu cür məlumatların dəqiq və ya tam olmasının təsdiqlənməsinə zəmanət vermir və hər hansı belə məlumatın düzgünlüyünü və tamlığını təsdiqləmək üçün yalnız müştəri məsuliyyət daşıyır.

Bu məhsul, müştərinin ATCC məhsulunun qəbulu, daşınması, saxlanması, utilizasiyası və istifadəsi ilə bağlı bütün risk və məsuliyyəti öz üzərinə götürməsi və bununla əlaqədar olaraq, sağlamlıq vəziyyətini minimuma endirmək üçün bütün müvafiq təhlükəsizlik və rəftar tədbirlərinin görülməsi şərtilə göndərilir. və ya ekoloji risk. Materialın alınması şərti olaraq, müştəri ATCC məhsulu və hər hansı nəsil və ya modifikasiya ilə həyata keçirilən hər hansı fəaliyyətin bütün qüvvədə olan qanunlara, qaydalara və təlimatlara uyğun aparılacağına razılaşır. Bu məhsul "OLDUĞU KİMİ" təmin edilir, burada açıq şəkildə qeyd olunan hallar istisna olmaqla, heç bir nümayəndəlik və ya zəmanət verilmir və heç bir halda ATCC, onun valideynləri, törəmə şirkətləri, direktorları, məmurları, agentləri, işçiləri, təyinatları, varisləri və filialları dolayısı ilə məsuliyyət daşımır. , müştərinin məhsuldan istifadəsi ilə əlaqədar və ya ondan irəli gələn hər hansı növ xüsusi, təsadüfi və ya nəticəli zərərlər. Depozitdə olan materialların həqiqiliyini və etibarlılığını təmin etmək üçün ağlabatan səylər göstərilsə də, ATCC belə materialların yanlış müəyyən edilməsi və ya yanlış təqdim edilməsi nəticəsində yaranan zərərlərə görə məsuliyyət daşımır.


11.4: Nuklein turşusunun kəmiyyət ölçülməsi - Biologiya

İlk rəqəmsal PCR kağızı:

Məhdudlaşdırıcı seyreltmədən istifadə etməklə PCR üçün hədəflərin kəmiyyəti.
Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA.
Biotexnika. 1992 13(3): 444-449

1985-ci ildə polimeraza zəncirvari reaksiyanın (PZR) ixtirasından bəri PCR genetik xəstəliklərin, patogenlərin, onkogenlərin və məhkəmə-tibbi identifikasiyanın molekulyar diaqnostikasında mühüm rol oynamışdır. Son üç onillikdə PCR real vaxt rejimində PCR vasitəsilə son nöqtə PCR-dən mütləq kəmiyyət rəqəmsal PCR (dPCR) olan hazırkı versiyasına çevrilmişdir. Bu icmalda biz ilk növbədə dPCR-nin bütün əsas addımlarının prinsiplərini, yəni nümunənin yayılması, gücləndirilməsi və kəmiyyətini müzakirə edirik, kommersiyalaşdırılmış aparatları və hələ də laboratoriyada inkişaf etdirilən digər cihazları əhatə edirik. Bu addımlara əsaslanan müxtəlif texnologiyaların üstünlüklərini və çatışmazlıqlarını vurğulayırıq və dPCR-nin yaranan biotibbi tətbiqlərini müzakirə edirik. Nəhayət, biz dPCR üçün mövcud problemlər və gələcək perspektivlərə nəzər salırıq.



Valeri Taly, Jim Huggett
Biomolekulyar aşkarlama və kəmiyyət, cild 10,
Səhifə 1

Rəqəmsal PCR (dPCR) üzərində fokuslanan Biomolekulyar Təsbit və Kəmiyyətin bu xüsusi buraxılışını sizə təqdim etməkdən çox məmnunuq. 1999-cu ildə [1] yaradılmış dPCR metodu əslində qPCR-dən [2] əvvəldir və təkmilləşdirilmiş həssaslıq, dəqiqlik və reproduktivlik təklif edə bilən güclü texnikadır [3]. İndi bu metod üçün maraqlı vaxtdır və təkmilləşdirilmiş təkrarlanma qabiliyyətinin klinik olaraq tətbiq oluna biləcəyi və yüksək həssaslıq və dəqiqliyin PCR və ya bir çox hallarda ardıcıllıqdan istifadə etməklə sadəcə mümkün olmayan ölçmələri həyata keçirməyə imkan verdiyinə dair çoxsaylı nümunələr var.

Bu xüsusi buraxılışda biz müxtəlif mövzularda dPCR-ni müzakirə edən və təqdim edən yeddi əlyazma seçmişik. Dhillon et al. Bu vəziyyətdə Clostridium difficile toksinlərinə diqqət yetirərək, xəstəlik üçün vacib markerlər olan zülalların aşkar edilməsini və kəmiyyətini yaxşılaşdırmaq üçün məhdudlaşdırıcı seyreltmədən istifadə imkanını açan yaxınlıq liqasiya analizi (PLA) şəklində dPCR-nin yeni tətbiqini təqdim edir. Matthew Butchbach dPCR-nin uşaq başlanğıcı pozğunluqları ilə əlaqəli genləri müəyyən etmək üçün möhkəm bir üsul kimi tətbiqinə dair icmalı təqdim edir. Bu araşdırma həmçinin dPCR-nin xəstəliyin irəliləməsi ilə genomik biomarkerlərdəki dəyişiklikləri izləmək üçün güclü texnologiya təklif edə biləcəyini vurğulayır. O, həmçinin iddia edir ki, dPCR gələcək nəsil ardıcıllığı ilə müəyyən edilmiş mutasiyaların yoxlanılması, surətlərin sayının müəyyən edilməsi və həmçinin qeyri-invaziv prenatal skrininq üçün seçim vasitəsi olmaq potensialına malikdir.

Növbəti dörd əlyazma tətbiqi və təhlili dPCR ilə məşğul olur. Balina və başqaları. dPCR ilə multipleksləşdirməni müzakirə edin və dPCR tərəfindən təklif olunan unikal yanaşmaları vurğulayaraq tətbiq oluna bilən müxtəlif yanaşmaları təsvir edin. Onlar həmçinin, tək nukleotid variantları və ya polimorfizmləri ölçərkən ümumi olduğu kimi, eyni primerlərdən, lakin müxtəlif zondlardan istifadə edən multipleks analizlərə həddlər tətbiq edilərkən nəzərə alınmalı olan dPCR xarakteristikasını, yəni bölməyə xüsusi rəqabəti (PSC) bildirir və adlandırırlar. Debski və Garstecki xəstə nümunələri ilə işləyərkən istənilən dəqiqliyin əldə edilməsini təmin etmək üçün dPCR təcrübələrinin necə tərtib olunacağını təsvir edir. Bu, hər hansı molekulyar metodun performansını müzakirə edərkən vacib və tez-tez diqqətdən kənarda qalan bir məsələdir. Jones və həmkarları dPCR-nin dinamik diapazonunu araşdıran qısa hesabat təqdim edirlər ki, bu da tez-tez qPCR ilə müqayisədə əlverişsiz vəziyyətdədir. Bu araşdırmada onlar nümayiş etdirirlər ki, kifayət qədər arakəsmələriniz varsa, qPCR-ə yaxınlaşan altı böyüklük sırasına qədər dinamik diapazonla dPCR həyata keçirmək mümkündür. Nəhayət, Madic et al. EGFR geninin üç mutasiyasının multipleks analizi üçün ilk üç rəngli dPCR alətinin tətbiqini təsvir edir.Bu damcı əsaslı platforma PCR reaksiyasından sonra birbaşa təsvir oluna bilən 𔄚D damcı massivindən” istifadə etməklə unikal nümunə bölməsi formatını tətbiq edir.

Son məqalə nuklein turşusunun kəmiyyətinin müəyyən edilməsi kontekstində dəqiqlik, etibarlılıq və təkrar istehsaldan bəhs edir və istinad materiallarının kəmiyyətini müəyyən etmək üçün dPCR-nin necə istifadə oluna biləcəyini vurğulayır. Bhat və Emslie həmçinin bir çox biokimyəvi analitin ölçülməsi zamanı artıq müəyyən edilmiş istinad materiallarının və sertifikatlaşdırılmış istinad materiallarının istifadəsinin BCR-ABL1 [4] kimi molekulyar hədəflərin izlənilə bilən analizini necə dəstəkləyə biləcəyini müzakirə edirlər. Bu cür materialların kəmiyyətini müəyyən etmək üçün dPCR artıq istifadə olunsa da, onlar qeyri-müəyyənlik və qeyri-müəyyənlik mənbələrini daha yaxşı başa düşmək üçün əlavə işin tələb olunduğunu vurğulayırlar.

Ümid edirik ki, bu kifayət qədər yeni və unikal molekulyar metodun potensialını göstərən bu məqalələrdən zövq alacaqsınız. Biz belə hesab edirik ki, dPCR klinik tədqiqatları və müntəzəm diaqnozu inkişaf etdirəcək və dəqiqlik və fərdiləşdirilmiş səhiyyə kimi sahələrdə seçim metoduna çevrilə biləcək bir üsul kimi əhəmiyyətli potensial təklif edir. Bu xüsusi buraxılış gündəlik laboratoriya təcrübələrində rəqəmsal PCR-dən istifadəyə dair hesabatların getdikcə artan ədəbiyyat toplusuna əlavə olunacaq və qarşılaşa biləcək bəzi problem və tələlərin həlli yollarını təklif edəcəkdir.


Clostridium difficile toksinləri A və B-nin aşkarlanması üçün homojen və rəqəmsal yaxınlıq ligasyonu testləri.
Harvinder S. Dhillon, Gemma Johnson, Mark Shannon, Christina Greenwood, Doug Roberts, Stephen Bustin
Biomolekulyar aşkarlama və kəmiyyət, cild 10, Səhifələr 2-8


Rəqəmsal PCR ilə multipleksləşdirmənin əsasları.
Səhifələr 15-23
Alexandra S. Whale, Jim F. Huggett, Svilen Tzonev
Biomolekulyar aşkarlama və kəmiyyət, cild 10, Səhifələr 15-23


Rəqəmsal PCR dinamik diapazonu real vaxt kəmiyyət PCR diapazonuna yaxınlaşır.
Gerwyn M. Jones, Eloise Busby, Jeremy A. Garson, Paul R. Grant, Eleni Nastouli, Alison S. Devonshire, Alexandra S. Whale
Biomolekulyar aşkarlama və kəmiyyət, cild 10, Səhifələr 31-33


Üç rəngli kristal rəqəmsal PCR.
J. Madiç, A. Zoçeviç, V. Senlis, E. Fradet, B. Andre, S. Müller, R. Danqla, M. E. Droniou
Biomolekulyar aşkarlama və kəmiyyət, cild 10, Səhifələr 34-46

Şərh -- Transplantasiya resipiyentlərinin dövriyyəsində donor DNT-nin sürətli kəmiyyətinin təyini üçün qraft zədəsinin potensial universal biomarkeri kimi rəqəmsal damcı PCR.
İnsan sitomeqalovirus DNT-nin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün müxtəlif rəqəmsal PCR platformalarının laboratoriyalararası qiymətləndirilməsi.
Pavšič J, Devonshire A, Blejec A, Foy CA, Van Heuverswyn F, Jones GM, Schimmel H, Žel J, Huggett JF, Redshaw N, Karczmarczyk M, Mozioğlu E, Akyürek S, Mg , Milavec M.
Anal Bioanal Kimya. 2017 409(10): 2601-2614

Kəmiyyətli PCR (qPCR) patogenin aşkarlanmasında mühüm vasitədir. Bununla belə, müxtəlif qPCR komponentlərinin, kalibrləmə materiallarının və DNT çıxarma üsullarının istifadəsi laboratoriyalar arasında müqayisəliliyi azaldır ki, bu da yanlış diaqnoz və xəstə baxımında uyğunsuzluqlarla nəticələnə bilər. Nuklein turşusu testləri üçün metroloji çərçivənin daha geniş şəkildə yaradılması patogenin aşkarlanmasının standartlaşdırma dərəcəsini və klinik kontekstdə tətbiq edilən kəmiyyətləşdirmə üsullarını yaxşılaşdıra bilər. Buna nail olmaq üçün istinad ölçmə prosedurları kimi dəqiq metodlar hazırlanmalı və tətbiq edilməlidir və uyğun sertifikatlaşdırılmış istinad materiallarının xarakteristikasını asanlaşdırmaq lazımdır. Rəqəmsal PCR (dPCR) artıq nuklein turşularını təhlil edərək patogenin miqdarını təyin etmək üçün istifadə edilmişdir. dPCR nuklein turşularının möhkəm və dəqiq kəmiyyətini təmin etmək potensialına malik olsa da, metroloji çərçivədə həyata keçirilməzdən əvvəl onun faktiki performans xüsusiyyətlərinin əlavə qiymətləndirilməsi və ölçmə qeyri-müəyyənliklərinin adekvat qiymətləndirilməsinə imkan vermək lazımdır. Burada dörd laboratoriya ümumi istinad materialına kalibrləmə olmadan insan sitomeqalovirusundan DNT-nin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün dPCR-nin təkrar istehsal qabiliyyətini (15%-dən aşağı genişlənmiş ölçmə qeyri-müəyyənlikləri) nümayiş etdirdi. Bütün virus materialından və ekstraksiya edilmiş DNT-dən istifadə edərək, ardıcıl üç təcrübə arasında aralıq dəqiqlik (dəyişiklik əmsalları 25%-dən aşağı) qeyd edildi. Bundan əlavə, laboratoriyalar arasında təxmin edilən orta DNT nüsxə sayı konsentrasiyalarındakı uyğunsuzluqlar, dəyişkənliyin əsas mənbəyi kimi DNT hasilatı ilə iki dəfədən az idi. Bu məlumatlar göstərir ki, dPCR viral DNT-nin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün təkrarlanan və təkrarlana bilən bir üsul təklif edir və qənaətbəxş performansına görə metroloji çərçivədə həyata keçirmək üçün istinad metodları üçün namizəd kimi qəbul edilməlidir.


Mitoxondrial DNT (mtDNA) mutasiyaları ilkin mitoxondrial pozğunluqların ümumi səbəbidir və yaşlanma, neyrodegenerasiya və xərçəng də daxil olmaqla geniş bir şərait toplusunda rol oynamışdır. Bu patogen variantlar arasında mtDNA delesiyaları üstünlük təşkil edir ki, bunlar replikasiyanın ağır və yüngül zəncirlərinin mənşəyi arasında əsas qövsdə ardıcıllığın itirilməsi üçün güclü meyl göstərir, lakin bunlar daxil deyil. Ayrı-ayrı mtDNT delesiyaları fokus olaraq toplana bildiyindən, çoxsaylı qarışıq qırılma nöqtələri ilə baş verə bilər və normal mtDNT ardıcıllıqlarının mövcudluğunda həssaslığı artırılmış və məhdud xərclərlə geniş spektrli mutasiyaları aşkar edən üsullar həm tədqiqat, həm də klinik tətbiqlərə malikdir. Bu işdə biz iki telli istinad şablonları və ya bioloji nümunələrdən istifadə edərək mtDNA silinməsinin aşkarlanmasının yarı kəmiyyət və rəqəmsal PCR əsaslı üsullarını qiymətləndirdik. Məqsədimiz məhdud yalan-müsbət aşkarlama ilə xəstəliyin inkişafı zamanı mtDNA silinmə yükündə aşağı səviyyələrin və ya kiçik fərqlərin təhlilinə imkan verəcək əsas eksperimental analiz parametrlərini təsvir etmək idi. Müəyyən etdik ki, rəqəmsal PCR metodu mütləq kəmiyyətləşdirmə, təkmilləşdirilmiş dəqiqlik və analiz standart xətası vasitəsilə mtDNA silinməsinin aşkarlanması həssaslığını əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırdı.
İnsan Genomik DNT-nin Kəmiyyəti üçün Damcı Rəqəmsal Polimeraza Zəncirvari Reaksiyasının Qiymətləndirilməsi: İzləmə Dumanının Qaldırılması.
Kline MC və Duewer DL
Anal Kimya. 2017 89(8): 4648-4654

Rəqəmsal polimeraza zəncirvari reaksiya (dPCR) son nöqtə platformaları birbaşa reaksiya bölməsi üzrə DNT hədəf nüsxələrinin sayını təxmin edir, burada arakəsmələr sabit yerləşmiş kameralar (cdPCR) və ya yağda üzən sulu damcılardır (ddPCR). İlkin kalibrlə təsdiq edilmiş istinad materiallarında (CRM) hədəf konsentrasiyasının sertifikatlaşdırılmasında istifadə üçün həm λ, həm də bölmənin həcmi, V bəzi əlçatan istinad sistemi, ideal olaraq Beynəlxalq Vahidlər Sistemi (SI) üçün metroloji cəhətdən izlənilə bilən olmalıdır. CDPCR kameralarının sabit məkan paylanması PCR gücləndirilməsinin real vaxt rejimində monitorinqinə imkan verir. Yaranan reaksiya əyrilərinin təhlili SI izlənilməsinin λ-in qurulması üçün vacib olan kritik dPCR fərziyyələrinin təsdiqlənməsinə imkan verir. Biz ddPCR platformaları üçün bu fərziyyələri təsdiqləmək üçün birbaşa üsul bilmirik. Bizdə mövcud olan cdPCR və ddPCR sistemlərinin istehsalçıları izlənilə bilən bölmə həcminin spesifikasiyalarını təmin etmir. Milli Standartlar və Texnologiya İnstitutundakı (NIST) həmkarlarımız ddPCR damcı həcminin müəyyən edilməsi üçün etibarlı metod işləyib hazırlamışlar və müxtəlif ddPCR reagentlərinin bir qədər fərqli ölçüdə damlacıqlar verdiyini nümayiş etdirmişlər. Beləliklə, heç bir dPCR platforması tək başına hədəf konsentrasiyasının metroloji olaraq izlənilə bilən təxminlərini təmin etmir. Biz burada göstəririk ki, həm cdPCR, həm də ddPCR platformaları ilə bölünmüş nümunələrin qiymətləndirilməsi cdPCR analizinin λ izlənmə xüsusiyyətlərini onun ddPCR analoquna köçürərək, CRM hədəf konsentrasiyasının tam izlənilə bilən ddPCR təxminlərini təyin edə bilər.
Rəqəmsal PCR üçün Model əsaslı Təsnifat: Yağış üçün çətiriniz.
Jacobs BKM, Goetghebeur E, Vandesompele J, De Ganck A, Nijs N, Beckers A, Papazova N, Roosens NH, Clement L
Anal Kimya. 2017 89(8): 4461-4467

Rəqəmsal PCR üçün standart məlumat təhlili boru kəmərləri avtomatlaşdırılmış sərt hədddən istifadə edərək paralel mikro-PZR reaksiyalarının son nöqtə flüoresansını rəqəmləşdirərək hədəf nuklein turşusunun konsentrasiyasını təxmin edir. Yanlış təsnifatın konsentrasiyanın qiymətləndirilməsinə böyük təsir göstərdiyi və dəqiqliyi əhəmiyyətli dərəcədə aşağı saldığı məlum olsa da, bu təsnifatın qeyri-müəyyənliyi adətən nəzərə alınmır. Şablonsuz nəzarət nümunələrində müşahidə olunan flüoresandan və paylanma formasından şərti olaraq bölmədə hədəfin mövcud olması (olmaması) ehtimalını qiymətləndirmək üçün model əsaslı klasterləşdirmə metodunu təqdim edirik. Bu metodologiya təsnifata xas qeyri-müəyyənliyi qəbul edir və həm fərdi bölmə səviyyəsində, həm də qlobal konsentrasiya səviyyəsində təbii dəqiqlik ölçüsünü təmin edir. Biz metodumuzu genetik cəhətdən dəyişdirilmiş orqanizm, inhibə, dinamik diapazon və mutasiyaların aşkarlanması təcrübələri üzərində təsvir edirik. Biz göstəririk ki, bizim metodumuz daha real dəqiqlik ölçüsü ilə yanaşı, oxşar və ya cari standartdan daha yaxşı konsentrasiya təxminlərini təmin edir. Fərdi arakəsmə ehtimalları və diaqnostik sıxlıq planları əlavə olaraq bəzi keyfiyyətə nəzarət etməyə imkan verir. Umbrella adlı metodumuzun R tətbiqi mövcuddur və mütləq dPCR kəmiyyəti üçün daha obyektiv və avtomatlaşdırılmış məlumatların təhlili prosedurunu təmin edir.
Döş xərçəngi xəstələrində HER2 statusunun kəmiyyət və avtomatik təhlili üçün damcı rəqəmsal PCR-dən istifadə.
Otsuji K, Sasaki T, Tanaka A, Kunita A, İkemura M, Matsusaka K, Tada K, Fukayama M, Seto Y.
Döş Xərçəngi Müalicəsi. 2017 162(1): 11-18

MƏQSƏD: Rəqəmsal polimeraza zəncirvari reaksiyası (dPCR) nuklein turşusu konsentrasiyalarının mütləq ölçüsünü əldə etmək üçün istifadə edilmişdir. Bu yaxınlarda, DNT amplifikasiyasını ölçmək üçün daha dəqiq və daha az subyektiv bir analiz kimi damcı rəqəmsal PCR (ddPCR) kimi istinad edilən yeni bir üsul diqqət çəkdi. Döş xərçənginin HER2 geninin gücləndirilməsini təyin etmək üçün ddPCR-nin faydalılığını nümayiş etdirdik.
Üsullar: Bu tədqiqatda 41 əsas döş xərçəngi xəstəsinin klinik formalinlə sabitlənmiş parafinə daxil edilmiş nümunələrində HER2 geninin surətinin sayını ölçmək üçün ddPCR istifadə etdik. ddPCR analizinin dəqiqliyini artırmaq üçün biz hər bir nümunə üçün şiş məzmun nisbətini (TCR) də qiymətləndirdik.
NƏTİCƏLƏR: TCR ilə birləşdirilmiş ddPCR nisbətindən (ERBB2:ch17cent surət sayı nisbəti) istifadə edərək HER2 geninin gücləndirilməsi üçün təyin üsulumuz ASCO-CAP (Amerika Klinik Onkologiya Cəmiyyəti/Amerika Kolleci) uyğun olaraq şərti olaraq müəyyən edilmiş HER2 gen statusu ilə yüksək uyğunluq göstərdi. Patoloqlar) təlimatları (P<0.0001, Fisher's exact test). Mürəkkəb sahə hüceyrə xətti analizləri ilə əldə edilən 99% etibarlılıq intervallarını qəbul etməklə müəyyən edilmişdir ki, bu da bizim metodumuzla bütün şərti HER2-müsbət halları müəyyən etməyə imkan verdi. Bundan əlavə, biz DNT-nin çıxarılmasından HER2 gen statusunun müəyyən edilməsinə qədər prosesin əsas hissəsini avtomatlaşdırmağa müvəffəq olduq.
NƏTİCƏLƏR: Döş xərçəngində HER2 gen statusunu təyin etmək üçün ddPCR-nin tətbiqi klinik praktikada istifadə üçün mümkündür və gələcəkdə ənənəvi müayinə üsullarını tamamlaya və ya hətta əvəz edə bilər.

Standart real vaxt PCR cihazlarında kalibrləməsiz analizlər.
Debski PR, Gewartowski K, Bajer S, Garstecki P
Sci Rep. 2017 227: 44854

Kəmiyyət Polimeraza Zəncirvari Reaksiya (qPCR) molekulyar biologiyada mərkəzi üsullardan biridir və tibbi diaqnostikada mühüm vasitədir. Qızıl standart olsa da, qPCR üsulları istinad ölçmələrindən asılıdır və reaksiya effektivliyindəki kiçik dəyişikliklər və ya adətən azalmış dəqiqliklə qeyd olunmayan şərtlər nəticəsində yaranan böyük səhvlərə həssasdır. Rəqəmsal PCR (dPCR) texnologiyaları, tək hədəf molekulunun müsbət siqnala gücləndirilməsi ilə bağlı əsas fərziyyənin təmin edilməsi şərti ilə bölmələrdən ikili (bəli/xeyr) siqnallardan istifadə edərək mütləq kəmiyyət təyinini təmin etməklə kalibrləmə ehtiyacını azaltmalıdır. Yenə də rəqəmsal texnikalara çıxış məhduddur, çünki onlar yeni alətlər tələb edir. Biz standart (real vaxt) qPCR cihazlarında icra oluna bilən analoq-rəqəmsal metodu göstəririk. Kalibrləməsiz qiymətləndirməni təmin edən real vaxt rejimində oxunuşdan faydalanır. Metod qPCR və dPCR-nin üstünlüklərini birləşdirir və onların çatışmazlıqlarını aradan qaldırır. Protokollar standart quyu lövhəsi formatında quraşdırıla bilən kiçik sadələşdirilmiş bölmələri təmin edir. Biz nümayiş etdiririk ki, sinergetik analiz dizaynından istifadə etməklə standart qPCR cihazları normal qPCR protokolları dəqiq təxminləri təmin edə bilmədikdə mütləq kəmiyyət hesablama qabiliyyətinə malikdir. Tələb olunan parametrlər üçün təhlillərin necə tərtib ediləcəyini və konsentrasiyanı qiymətləndirmək üçün siqnalların necə təhlil ediləcəyini praktik reseptlər sadalayırıq.
Sirkulyasiya edən nuklein turşularının rəqəmsal PCR analizi.
Hudecova İ
Clin Biochem. 2015 oktyabr 48(15): 948-956

Plazmada sirkulyasiya edən nuklein turşularının (CNA) aşkarlanması son dərəcə həssas və dəqiq metodların istifadəsini tələb edir. Geniş istifadə olunan kəmiyyət real vaxt polimeraza zəncirvari reaksiyası (PZR) CNA-ların dəqiq ölçülməsi ilə əlaqədar müəyyən texniki məhdudiyyətlər yaradır, halbuki kütləvi paralel ardıcıllığın xərcləri hələ də nisbətən yüksəkdir. Rəqəmsal PCR (dPCR) indi bir çox kəmiyyət metodlarını üstələyən performansla az miqdarda genetik materialı aşkar etmək üçün əlverişli və güclü tək molekul sayma strategiyasını təmsil edir. Mikrofluid (çip) və emulsiya (damcı) əsaslı texnologiyalar artıq yüzlərlə milyonlarla nanolitr və hətta pikolitr miqyaslı reaksiya bölmələri təklif edən platformalara inteqrasiya olunub. Xərçəng tədqiqatları, prenatal testlər, transplantasiya təbabəti və virusologiya sahəsində bildirilən cəlbedici müşahidələr bu texnologiyanın gündəlik istifadəyə çevrilməsini dəstəkləyir. Homoloji ardıcıllığın geniş fonunda şiş və ya plasental hüceyrələrdən yaranan nadir mutasiyaların son dərəcə həssas plazma aşkarlanması xərçəngin erkən mərhələlərinin açılmasını və ya fetal mutasiyaların aşkarlanmasını asanlaşdırır. Xərçəng və ya transplantın rədd edilməsi ilə əlaqəli plazma CNA-larında kəmiyyət dəyişikliklərinin rəqəmsal ölçülməsi xəstəlik yükünün və ya resipientin immun reaksiyasının monitorinqi və sonrakı terapiya müalicəsi haqqında dəyərli məlumat verir. Bundan əlavə, virus yükünün diqqətli kəmiyyət qiymətləndirilməsi immunosupressiv və ya transplantasiya olunmuş xəstələr üçün antiviral terapiyanın effektiv monitorinqi üçün böyük dəyər təklif edir. Hazırkı icmal CNA-ların dəqiq və həssas ölçülməsində onu müstəsna dərəcədə möhkəm edən dPCR-nin xas xüsusiyyətlərini təsvir edir. Bundan əlavə, mən tədqiqatçılar tərəfindən bu günə qədər hazırlanmış potensial klinik tətbiqlərin növləri haqqında məlumat verirəm.


Son bir neçə ildə klinik viral diaqnostika üçün birbaşa nuklein turşusunun gücləndirilməsi üsulu kimi rəqəmsal PCR (dPCR) inkişafına maraq artmışdır. dPCR-nin qPCR ilə müqayisədə əsas üstünlüklərinə aşağıdakılar daxildir: kalibrləmə əyrisi olmadan nuklein turşusu konsentrasiyalarının kəmiyyətinin müəyyən edilməsi, müqayisə edilə bilən həssaslıq, üstün kəmiyyət dəqiqliyi, inhibitorlar tərəfindən pozulmalara qarşı daha böyük müqavimət və hədəf ardıcıllığın dəyişkənliyinə qarşı artan möhkəmlik. Bu icmalda biz dPCR-nin klinik tətbiqlərdə və nuklein turşusunun kəmiyyət göstəricilərinin standartlaşdırılması üçün viral nuklein turşusunun kəmiyyətinin müəyyən edilməsinə tətbiqini nəzərdən keçiririk. Klinik diaqnostik tətbiqlərdə virus yükünün ölçülməsi üçün geniş istifadəsini həyata keçirmək üçün dPCR-nin mövcud məhdudiyyətlərini aradan qaldırmaq üçün əlavə inkişaf tələb olunur.
Maksimum həssaslıq, dinamik diapazon və ölçmə dəqiqliyi üçün rəqəmsal PCR modelləşdirmə.
Majumdar N, Wessel T, Marks J
PLoS One. 2015 10(3): e0118833

Rəqəmsal PCR-in böyük vədi genetik kəmiyyətin təyini üçün dəqiq ölçmələrə imkan verən misilsiz dəqiqlik potensialıdır. Rəqəmsal PCR təcrübələri ilə əlaqəli problem, naməlum nümunələri sınaqdan keçirərkən, bir və ya daha çox maraq hədəfini istənilən dəqiqlik səviyyəsində aşkar etməyə imkan verən seyreltmələrdə təcrübələr aparmaqdır. Nəzəriyyə optimal dəqiqliyin (Po) hədəfləmə ilə əldə edildiyini bildirir

Bölmə başına 1,59 orta nüsxə (λ) və bu dinamik diapazona (R) bölmələrin ümumi sayından (n) bir müsbət (λL) ilə bir mənfi (λU) nəticəni əhatə edən boşluq daxildir. laboratoriyada rəqəmsal PCR təcrübələri qurmaq istəyən hekim üçün temperləşdirilir. Rəqəmsal PCR-də dəqiqlik, dinamik diapazon, bölmələrin sayı, sorğulanan həcm və həssaslıq arasındakı əlaqələri aydınlaşdıran riyazi çərçivə təqdim olunur. Yanlış reaksiya çağırışlarının və həcm dəyişikliyinin həssaslıq və dəqiqliyə təsiri daha sonra nəzərdən keçirilir. Həssaslıq və dəqiqliklə nəticələnən təsirlər, laboratoriyada belə ssenarilərlə qarşılaşmanın real dünya ehtimalını əks etdirən Monte Karlo simulyasiyaları vasitəsilə müəyyən edilir. Simulyasiyalar təcrübəçiyə bu şərtlərdən hər hansı birinə qarşı çıxmaq üçün eksperimental yükləmə konsentrasiyalarını necə uyğunlaşdırmaq barədə fikir verir. Çərçivə, seyreltmələrin istifadəsi ilə n-i artırmaqla və artırmadan rəqəmsal PCR-in dinamik diapazonunu genişləndirmək üsulu ilə genişləndirilir. Çərçivənin imkanlarını nümayiş etdirən nümunə sınaq nüsxə konsentrasiyasının başlanğıcının 3,33 qeydində aşkarlanmasına imkan verir.
Pikoliter Damlacıq Əsaslı Rəqəmsal PCR ilə Nadir Mutasiyaların Multipleks Aşkarlanması: Həssaslıq və Spesifiklik Mülahizələri.
Zonta E, Garlan F, Pécuchet N, Perez-Toralla K, Caen O, Milbury C, Didelot A, Fabre E, Blons H, Laurent-Puig P, Taly V
PLoS One. 2016 11(7): e0159094

Xərçəng tədqiqatlarında biomarkerlərin aşkarlanması üçün istifadə olunan texnologiyanın dəqiqliyi olduqca vacibdir. Bu kontekstdə rəqəmsal PCR şişin mutasiya vəziyyətinin təhlili üçün uyğun alət kimi xidmət edə bilən yüksək həssas və təkrarlana bilən metodu təmsil edir. Xüsusilə, plazmada dolaşan DNT daxilində şişə xas mutasiyaya uğramış allellərin aşkarlanması üçün damcı əsaslı rəqəmsal PCR yanaşmaları işlənib hazırlanmışdır. Bu cür yanaşma olduqca bahalı və vaxt aparan çox əhəmiyyətli miqdarda analizlərin işlənib hazırlanmasını və təsdiqini tələb edir. Burada, xərçənglərdə tez-tez səhv tənzimlənən üç gendə baş verən müxtəlif mutasiyaların aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün analizləri qiymətləndirdik: epidermal böyümə faktoru reseptoru (EGFR), v-Ki-ras2 Kirsten siçovul sarkoması viral onkogen homoloqu (KRAS) və şiş zülalı p53 (TP53) genləri. Xüsusilə, kommersiya rəqabətli allele-spesifik TaqMan® PCR (castPCR™) texnologiyası, eləcə də TaqMan® və ZEN™ analizləri EGFR p.L858R, p.T790M, p.L861Q nöqtə mutasiyaları və çərçivə daxilindəki mutasiyalar üçün qiymətləndirilmişdir. Del19. Spesifiklik və həssaslıq hüceyrə xətlərinin DNT-si, ağciyər xərçəngi xəstələrinin plazmatik dövran edən DNT-si və ya Horizon Diaqnostika Referans Standartlarında müəyyən edilmişdir. Bu texnologiyanın multipleksləşdirmə imkanlarını göstərmək üçün ağciyər xərçəngi xəstələri üçün yeni "istifadəyə hazır" testlər təklif edən EGFR üçün bir neçə multipleks panel (bir neçə üç və dörd pleks) hazırlanmışdır.
Mikrofluidik cihazlarda polimeraza zəncirvari reaksiya.
Ahrberg CD, Manz A, Chung BG
Laboratoriya çipi. 2016 16(20): 3866-3884

Polimeraza zəncirvari reaksiyasının (PZR) ixtirası molekulyar biologiyada inqilaba səbəb oldu və dezoksiribonuklein turşusunun (DNT) molekullarını bir neçə böyüklükdə gücləndirmə metoduna çıxış imkanı verdi.Mikrofluidik cihazda PCR-nin ilk tətbiqi 1998-ci ildə inkişaf etdirildiyindən, artan sayda tədqiqatçılar mikrofluidik PCR sistemlərinin inkişafını davam etdirirlər. Bu icmalda biz mikrofluidik əsaslı məkan və zaman domen cihazlarında son inkişafları təqdim edirik, həmçinin nümunənin hazırlanması və aşkarlanması üçün çoxlu funksiyalarla inteqrasiya olunmuş müxtəlif dizaynları müzakirə edirik. Son beş ildə izotermik nuklein turşusunun gücləndirilməsi və rəqəmsal PCR mikrofluidik cihazlarının inkişafı da vurğulanır. Bundan əlavə, biz müxtəlif kommersiya mikrofluidik PCR cihazlarını təqdim edirik.
RT-qPCR və RT-Digital PCR: Xroniki Miyeloid Lösemidə Qalıq Xəstəliyin Qiymətləndirilməsi üçün Müxtəlif Platformaların Müqayisəsi.
Alikian M, Whale AS, Akiki S, Piechocki K, Torrado C, Myint T, Cowen S, Griffiths M, Reid AG, Apperley J, White H, Huggett JF, Foroni L
Clin Chem. 2017 63(2): 525-531

MƏLUMAT: Tirozin kinaz inhibitorları (TKI) xroniki miyeloid lösemi (KML) olan xəstələrin uğurlu klinik müalicəsinin təməl daşıdır. Ters transkripsiya-kəmiyyət PCR (RT-qPCR) ilə BCR-ABL1 (qırılma nöqtəsi klaster regionu-c-abl onkogen 1, reseptor olmayan tirozin kinaz) BCR-ABL1IS (%BCR-ABL1IS) sintez transkriptinin faizinin kəmiyyət monitorinqi aparılır. xəstənin TKI-lərə reaksiyasını qiymətləndirmək üçün qızıl standart strategiya və proqnostik alt qruplara təsnifat. Bununla belə, bu yanaşma təkrarlana bilən şəkildə yerinə yetirmək üçün çətin ola bilər. Əks transkripsiya rəqəmsal PCR (RT-dPCR) bu metodun uyğunlaşdırılmasıdır və həqiqətən standartlaşdırılmış xəstə təbəqələşməsi üçün lazım olan möhkəm və standartlaşdırılmış iş axını təmin edə bilər.
ÜSULLAR: BCR-ABL1 və ABL1 transkript nüsxə nömrələri cəmi 102 nümunədə TKI terapiyası keçirən 70 KML xəstəsi və 32 qeyri-KML fərdində ölçüldü. Kommersiyada mövcud olan 3 rəqəmsal PCR platforması (QS3D, QX200 və Raindrop) EAC (Avropa Xərçəngə Qarşı) analizindən istifadə edərək klinikada RT-qPCR üçün müntəzəm olaraq istifadə edilən platforma ilə müqayisə edildi.
NƏTİCƏLƏR: %BCR-ABL1IS 𕟲,1% olduqda bütün alətlər üzrə ölçmələr yaxşı korrelyasiya etdi. Bu səviyyədən aşağı qalıq xəstəliyi olan xəstələrdə, müqayisə edilə bilən performansı 4 log dinamik diapazonla məhdudlaşdıran alətlər daxilində və arasında daha böyük fərqlər ölçüldü.
NƏTİCƏLƏR: RT-dPCR aşağı səviyyəli BCR-ABL1 transkript nüsxələrinin kəmiyyətini müəyyən edə bildi, lakin RT-qPCR ilə əldə edilən aşkarlama səviyyəsindən aşağı həssaslığı yaxşılaşdıra bilmədi. Bununla belə, RT-dPCR bu həssas ölçmələri kalibrləmə əyrisindən istifadə etmədən həyata keçirə bildi. Ölçülmüş RNT miqdarını artırmaq üçün protokola uyğunlaşmalar, çox güman ki, dPCR platformasında BCR-ABL testinin analitik həssaslığını yaxşılaşdırmaq üçün lazımdır.




Rəqəmsal PCR ilə hüceyrədənkənar RNT-nin təhlili.
Takahashi K, Yan IK, Kim C, Kim J, Patel T
Ön Oncol. 2014 4: 129 -- eCollection 2014.

Hüceyrələrarası RNT-nin ötürülməsi hüceyrələrarası əlaqə üçün mühüm mexanizm kimi ortaya çıxır. Ekzosomlar kimi veziküllər daxilində funksional aktiv RNT molekullarının bir hüceyrədən digərinə ötürülməsi qabiliyyəti hüceyrəyə hüceyrə siqnalını və alıcı hüceyrələrdə bioloji prosesləri modulyasiya etməyə imkan verir. Hüceyrədənkənar RNT-nin tədqiqi bu molekulların aşkarlanması üçün həssas üsullar tələb edir. Bu üsullar məqaləsində biz rəqəmsal PCR kimi həssas aşkarlama texnologiyalarından istifadə edərək hüceyrədənkənar RNT-nin aşkarlanması üçün protokolları təsvir edəcəyik. Bu protokollar hüceyrədənkənar RNT-nin rolu və şiş hüceyrə biologiyasına töhfəsi ilə maraqlanan tədqiqatçılar üçün dəyərli olmalıdır.
Sertifikatlaşdırılmış istinad materialından istifadə etməklə DNT surətlərinin sayı konsentrasiyalarının kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün rəqəmsal PCR metodunun təsdiqi.
Liesbet Deprez, Philippe Corbisier, Anne-Marie Kortekaas, Stéphane Mazoua, Roksana Beaz Hidalgo, Stefanie Trapmann, Hendrik Emons
Biomolekulyar aşkarlama və kəmiyyət, cild 9, səh. 29-39

Rəqəmsal PCR, müxtəlif tətbiqlər üçün nuklein turşularının ardıcıllıqla xüsusi aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün yeni yaranan texnikaya çevrilmişdir. Ötən illər ərzində yeni rəqəmsal PCR üsullarının inkişafı ilə bağlı çoxsaylı hesabatlar dərc edilmişdir. Bu inkişafların diaqnostik və ya digər müntəzəm sınaq məqsədləri üçün uyğun olan etibarlı analitik metodlara çevrilməsi onların təyinatı üzrə istifadə üçün təsdiqini tələb edir.
Burada damcı rəqəmsal PCR metodunun daxili yoxlamasının nəticələri təqdim olunur. Bu üsul nuklein turşusu fonu ilə məhlulda təmizlənmiş xəttiləşdirilmiş plazmidin mütləq surət nömrəsi konsentrasiyasının kəmiyyətini müəyyən etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur. Ölçmə prosesində hansı amillərin ölçmə nəticələrinə əhəmiyyətli təsir göstərdiyi araşdırılmış və ümumi ölçmə qeyri-müəyyənliyinə töhfə təxmin edilmişdir. Rəqəmsal PCR metodunun daxili metodunun təsdiqini həyata keçirərkən tədqiq edilməli olan bütün aspektlərə dair hərtərəfli icmal təqdim olunur.
Normal və mürəkkəb hamiləliklərdə hüceyrəsiz DNT-nin miqdarının təyini -- bioloji və texniki problemlərin aradan qaldırılması.
Manokhina I, Singh TK, Peñaherrera MS, Robinson WP.
PLoS One. 2014 9(7): e101500 -- eCollection 2014

Ana plazmasında plasental trofoblastdan yaranan hüceyrəsiz DNT (cfDNT)-nin xarakteristikası fetal və mamalıq ağırlaşmalarının qeyri-invaziv diaqnostikası üçün güclü vasitədir. Plasenta mənşəli olduğuna görə, bu DNT-nin spesifik epigenetik xüsusiyyətlərindən (ümumiyyətlə hüceyrəsiz fetal DNT kimi tanınır) ana plazmasında universal "fetal" markerlərin yaradılmasında istifadə oluna bilər, beləliklə, cins və ya rhesus-spesifik olanların məhdudiyyətlərini aradan qaldırmaq olar. Bu tədqiqatın məqsədi hamiləlik boyu (7.2-39.5 həftə) ana plazmasında cfDNA miqdarını qiymətləndirən müvafiq yanaşmaların və təhlillərin performansını müqayisə etmək idi. İki texnologiyadan, real vaxt kəmiyyət PCR (qPCR) və damcı rəqəmsal PCR (ddPCR) istifadə edilməklə iki fetal və ya plasenta spesifik dupleks analiz (RPP30/SRY və RASSF1A/β-Actin) tətbiq edilmişdir. Hər iki üsul öyrənilən dinamik diapazonda oxşar performans parametrlərini aşkar etdi. Bu analizlər üçün qPCR və ddPCR istifadə edərək əldə edilən məlumatlar müsbət korrelyasiya edildi (ümumi cfDNA (RPP30): R =𔁤.57, p =𔁤.001/plasental cfDNA (SRY): R =𔁤.0020. .0001 plasental cfDNA (RASSF1A): R =𔁤.75, p<0.0001). qPCR (R =𔁤.68, p =𔁤.013) və ddPCR (R =𔁤.56, p =𔟐.) ilə ölçülən SRY və RASSF1A nəticələrində əhəmiyyətli korrelyasiya var idi. Müxtəlif yanaşmalar, həmçinin plasental cfDNA konsentrasiyasının hamiləlik yaşı və patoloji nəticə ilə əlaqəsi ilə bağlı müqayisəli nəticələr verdi. Biz belə nəticəyə gəldik ki, ddPCR praktiki yanaşmadır, mövcud qPCR analizlərinə uyğunlaşdırıla bilər və plazmada hüceyrəsiz DNT-nin təhlili üçün yaxşı uyğun gəlir. Bununla belə, qPCR performansını üstələmək üçün əlavə optimallaşdırma tələb oluna bilər.
RT-qPCR ilə birbaşa müqayisə ilə RNT və DNT ekstraktlarından Damcı Rəqəmsal PCR-nin optimallaşdırılması: Oseltamivirə davamlı alt populyasiyaların kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün klinik nəticələr.
Taylor SC, Carbonneau J, Shelton DN, Boivin G
J Virol Metodları. 2015 Noyabr 224: 58-66

Damcı Rəqəmsal PCR (ddPCR) bu yaxınlarda tətbiqi tədqiqatçılara RT-qPCR-ə qarşı artan dəqiqlik və həssaslıqla geniş çeşidli nümunələrdən nuklein turşularının birbaşa kəmiyyətini təyin etməyə imkan verən alət təqdim etdi. Cq və ΔCq dəyərlərinin ölçülməsindən irəli gələn RT-qPCR-nin nümunə qarşılıqlı asılılığı standart əyrilər olmadan hər bir nümunə üçün mütləq nuklein turşusu konsentrasiyasının müstəqil ölçülməsini təmin edən ddPCR ilə aradan qaldırılır və bununla da quyulararası və boşqablararası dəyişkənliyi azaldır. 2009-cu il qripi A (H1N1) pandemiyası virusunun H275-yabanı tip (WT) və H275Y-nöqtəli mutasiyaya uğramış (MUT) neyraminidazasından təmizlənmiş yaxşı səciyyələndirilmiş RNT aşağı axın analizi üçün etibarlı məlumatları təmin etmək üçün ddPCR optimallaşdırma iş axını nümayiş etdirmək üçün istifadə edilmişdir. ddPCR reaksiya qarışığı həmçinin RT-qPCR ilə sınaqdan keçirildi və optimallaşdırılmış MUT/WT dupleks analizi ilə əla reaksiya effektivliyi (90% və 100%) verdi, beləliklə, eyni reaksiya qarışığından və istilik dövriyyəsi protokolundan iki platformanın birbaşa müqayisəsinə imkan verdi. . ddPCR xəstədən alınan RT-qPCR ilə müqayisədə təmizlənmiş MUT və WT RNT qarışığından istifadə edərək mutasiya bolluğu üçün həssaslıqda (>30 qat) nəzərəçarpacaq təkmilləşdirmə və artan dəqiqlik (>10 qat, həm də analizdaxili dəyişkənlik üçün p<0.05) verdi. bərpa zamanı qalıq mutant virus populyasiyasını dəqiq müəyyən etmək üçün nümunələr. Ümumiləşdirilmiş xətti qarışıq modellərdən istifadə edərək rəqəmsal PCR təcrübələrinin çevik təhlili.
Matthijs Vynck, Jo Vandesompele, Nele Nijs, Björn Menten, Ariane De Ganck, Olivier Thas
Biomolekulyar aşkarlama və kəmiyyət, cild 9, səh. 1-13

Nuklein turşularının miqdarının təyini üçün rəqəmsal PCR-dən istifadə sürətlə artır. Əsas çatışmazlıq çevik məlumatların təhlili vasitələrinin olmamasıdır. Nəşr edilmiş təhlil yanaşmaları ya xüsusi problem parametrlərinə uyğunlaşdırılır, ya da dəyişkənlik mənbələrini nəzərə almır. Geniş çeşidli təcrübələrin təhlili üçün çevik alət kimi ümumiləşdirilmiş xətti qarışıq modellər çərçivəsini təklif edirik. Biz həmçinin surət sayının və nisbi ifadə təxminlərinin dəqiqliyini və dəqiqliyini yaxşılaşdırmaq üçün istinad geninin sabitliyini qiymətləndirmək üçün bir üsul təqdim edirik. Biz mürəkkəb eksperimental quruluşda metodologiyanın faydalılığını nümayiş etdiririk.
Ana dövriyyəsində hüceyrəsiz fetal DNT istifadə edərək qeyri-invaziv prenatal test.
Liao GJ, Gronowski AM, Zhao Z.
Clin Chim Acta. 2014 428: 44-50

Ana dövriyyəsində hüceyrəsiz fetal DNT-nin (cffDNA) müəyyən edilməsi qeyri-invaziv prenatal testi (NIPT) mümkün etmişdir. Ananın plazma hüceyrəsiz DNT-si ana və fetal DNT-nin qarışığıdır ki, onlardan fetal DNT ana plazmasında kiçik bir populyasiyanı təmsil edir. Buna görə də, fetal DNT-ni ana DNT-nin böyük fonundan aşkar etmək və fərqləndirmək üçün yüksək həssaslıq və dəqiqliyə malik üsullar tələb olunur. Son illərdə, fetal DNT-nin molekulyar analizində texniki irəliləyişlər (məsələn, rəqəmsal PCR və kütləvi paralel ardıcıllıq (MPS)) dölün cinsinin qiymətləndirilməsi, RhD genotiplənməsi və fetal xromosom kimi qeyri-invaziv testlərin klinik praktikada uğurla həyata keçirilməsinə imkan verdi. anevloidiyanın aşkarlanması. Ananın plazma DNT-sindən bütün dölün genomunu deşifrə etmək imkanı ilə biz yaxın gələcəkdə bir çox tək gen pozğunluqlarını aşkar etmək üçün qeyri-invaziv prenatal testlərin sayının artacağını proqnozlaşdırırıq. Bu icmal NIPT-nin texniki aspektlərini və NIPT-nin klinik praktikada tətbiqini qısa şəkildə ümumiləşdirir. Rəqəmsal PCR-də kəmiyyət dövrünün (Cq) paylanmasından şablon konsentrasiyasının birbaşa çıxarılması.
Mojtahedi M, Fouquier d'Hérouël A, Huang S.
Nuklein turşuları Res. 2014 42(16): e126

Rəqəmsal PCR (dPCR) bir şablonun bir sıra PCR reaksiyalarına məhdudlaşdırılmasından istifadə edir. Bu massivdən ilkin şablon konsentrasiyasını çıxarmağa imkan verən ən azı bir (sıfırdan fərqli olaraq) ilkin şablonu ehtiva edən reaksiyaların sayı müəyyən edilir. Burada bir neçə hədəflənmiş qPCR analizindən nümunənin konsentrasiyasını və onun dPCR üçün optimal seyreltilməsini səmərəli şəkildə çıxarmaq üçün yeni bir protokol təqdim edirik. Standart dPCR-də olduğu kimi son nöqtə PCR qiymətləndirməsinə əsaslanmaq əvəzinə, qPCR-nin real vaxt gücləndirmə xüsusiyyətindən istifadə edərək şablon konsentrasiyası haqqında əvvəlcədən məlumat tələb olunmur. Bu, ayrıca titrasiyada ardıcıl seyreltmələrə ehtiyacı aradan qaldırır və lazımi reaksiyaların sayını azaldır. Biz yanaşmamızın altında yatan nəzəriyyəni təsvir edirik və qeyri-müəyyənliyə töhfə verən eksperimental məqamları müzakirə edirik. Biz ilkin şablon konsentrasiyasının prinsipin sübutu kimi tanındığı idarə olunan təcrübədən əldə edilən məlumatları təqdim edirik və hüceyrə diferensasiyası zamanı transkript səviyyəsinin dəyişməsini birbaşa izləmək, eləcə də əvvəlcədən gücləndirildikdən sonra cDNT nümunələrində amplikon nömrələrini ölçmək üçün metodumuzu tətbiq edirik. Çoxsaylı rəqəmsal PCR təcrübələrinin müqayisəsi üsulları.
Burdukiewicz M, Rödiger S, Sobczyk P, Menschikowski M, Schierack P, Mackiewicz P
Biomol Detect Quantif. 2016 Avqust 109: 14-19 -- eCollection 2016.

Bölmə üzrə təxmin edilən orta nüsxə (λ) rəqəmsal PCR (dPCR) təcrübəsinin əsas məlumatıdır, çünki λ nümunədə hədəf konsentrasiyanı hesablamaq üçün istifadə edilə bilər. Bununla belə, çoxlu qaçışların və ya təkrarların dPCR işlərinin statistik müqayisəsi haqqında az məlumat mövcuddur. Bir neçə əməliyyatdan λ dəyərlərin müqayisəsi dPCR məlumatlarının binar strukturundan istifadə etməklə həll edilə bilən çoxsaylı müqayisə problemidir. Rəqəmsal PCR təcrübələrinin müqayisəsi üçün Ümumiləşdirilmiş Xətti Modellər (GLM) və Çox Nisbət Testləri (MRT) əsasında iki yeni metod təklif edir və qiymətləndiririk. MRT çərçivəmizi çoxsaylı dPCR qaçışlarını müqayisə etmək üçün uyğun olan eyni vaxtda etibarlılıq intervallarının hesablanması ilə zənginləşdirdik. Hər iki statistik metodun qiymətləndirilməsi MRT-nin geniş miqyasda həyata keçirilən dPCR təcrübələri üçün daha sürətli və daha möhkəm olduğunu təsdiqləyir. Nəzəri nəticələrimiz seyreltmə seriyalarının dPCR ölçmələrinin təhlili ilə təsdiqləndi. Hər iki üsul açıq mənbəli R statistik hesablama mühiti üçün dpcR paketində (v. 0.2) tətbiq edilmişdir. Bakteriyaların aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün damcı rəqəmsal PCR analizi yanaşmalarının optimallaşdırılması: yanğın zərərvericisi və kartof qəhvəyi çürükünün bir nümunəsi.
Dreo T, Pirc M, Ramšak Z, Pavšič J, Milavec M, Zel J, Gruden K.
Anal Bioanal Kimya. 2014 406(26): 6513-6528

Burada Rosaceae və Solanaceae ailələrinin bir çox növlərini: Erwinia amylovora və Ralstonia solanacearum-u yoluxduran iki karantin bitki patogen bakteriyalarının aşkarlanması və mütləq kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün damcı rəqəmsal PCR (ddPCR) ilk qiymətləndirilməsi haqqında məlumat veririk. ddPCR məlumat təhlili üçün açıq mənbəli R skripti yazılmışdır. Sağlamlıq vəziyyəti məlum olan nümunələr dəstinin təhlili optimal diaqnostik spesifikliyə səbəb olan müxtəlif hədd parametrlərinin (QuantaSoft analizi, müəyyən boru kəməri və əllə həddi) seçilməsinə və qiymətləndirilməsinə kömək etdi. E. amylovora ddPCR-nin təfsiri sadə idi və təhlil yanaşması son nəticələrə və müəyyən edilmiş konsentrasiyalara az təsir göstərmişdir. Həssaslıq və xətti diapazon həm bakterial suspenziyaların, həm də bitki materialının təhlili üçün real vaxt rejimində PCR (qPCR) üçün olanlara bənzəyirdi ki, bu da həm aşkarlama, həm də kəmiyyətin müəyyən edilməsi istənildikdə ddPCR-ni əlverişli seçim etdi. R. solanacearum ddPCR ilə, bəzən sağlam bitki materialında müşahidə olunan yalan-müsbət reaksiyaları istisna etmək üçün yüksək qlobal hədddən istifadə etmək lazım idi. ddPCR qPCR ilə müqayisədə analitik həssaslığı əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırdı və kartof kök yumruları nümunələrində R. solanacearum-un aşağı konsentrasiyalarının aşkarlanmasını yaxşılaşdırdı. Təmiz kulturada bu bakteriyaların hər ikisinin dəqiq və sürətli mütləq kəmiyyəti birbaşa ddPCR ilə əldə edilmişdir. Məlumatlarımız bu ddPCR analizlərinin bitki patogenlərinin müntəzəm aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi və məlum hədəf konsentrasiyaları ilə müəyyən edilmiş daxili istinad materiallarının hazırlanması üçün uyğunluğunu təsdiqləyir. Multipleksləşdirilmiş damcılı rəqəmsal PCR analizi inhibisyona meylli nümunələrdə qPCR-dən daha yaxşı işləyir.
Sedlak RH, Kuypers J, Jerome KR.
Diaqnoz Microbiol Infect Dis. 2014 S0732-8893 (14) 00366-6

Biz insan sitomeqalovirusu (CMV), insan adenovirus növü F üçün multipleks damcılı rəqəmsal PCR analizinin və PCR inhibisyonuna meylli klinik nümunələr üçün faydalı ola biləcək daxili plazmid nəzarətinin inkişafını nümayiş etdiririk. Bu analiz CMV üçün kəmiyyət PCR analizindən daha inhibe meylli nəcis nümunələrində daha yaxşı işləyir və daxili nəzarəti özündə birləşdirən ilk nəşr edilmiş klinik virusologiya damcılı rəqəmsal PCR testidir. Yüksək məhsuldarlıqlı gen ifadə profili və biomarker kəşfi üçün mikrofluidik damcı əsaslı PCR cihazları.
Kristofer J. Hayes, Tara M. Dalton
Biomol Detect Quantif. 2015(4): 22-32

PCR müxtəlif tətbiqlər üçün tibbi və bioloji tədqiqat laboratoriyalarında istifadə edilən ümumi və tez-tez əvəzedilməz bir texnikadır. Real vaxtda kəmiyyət PCR (RT-qPCR) nümunələr arasında gen ifadə səviyyələrindəki fərqlərin kəmiyyətini müəyyən etmək üçün qəti bir üsula çevrilmişdir. Bununla belə, bu vacibliyə baxmayaraq, nuklein turşusunun miqdarını yüksək ötürmə qabiliyyəti ilə ölçmək üçün etibarlı üsullar çətin olaraq qalır. Aşağıdakı məqalədə, davamlı axın sistemində nanoölçülüdə gen ifadə səviyyələrinin kəmiyyətini təyin etmək üçün unikal dizayn təqdim olunur. Tam avtomatlaşdırılmış, yüksək məhsuldarlığa malik, damcı əsaslı mikro-maye sistemində deoksinukleotidlərin (DNT) aşağı həcmdə gücləndirilməsi təsvir edilmişdir. İnteqrasiya edilmiş maye sxemləri və ya boşqab massivlərindən istifadə edən bəzi adi qPCR cihazlarından fərqli olaraq, alət qPCR-ni damcı əmələ gəlməsi, fərqli reagent qarışığı, termal dövriyyə və optik aşkarlama platformaları ilə fasiləsiz, mikro damcı axını prosesində həyata keçirir. Ümumi həcmi 300 nl-dən az olan reaksiyaların təfərrüatlı eksperimental profili dinamik diapazonun 4 sifariş jurnalı və ardıcıl alət həssaslığını nümayiş etdirən platformadan istifadə etməklə əldə edilir. Bundan əlavə, pipetləmə addımlarının 90%-ə qədər azaldılması və əllər-sərbəst avtomatlaşdırmanın unikal dərəcəsi bu cihaz üçün analitik imkanları genişləndirir. Sonda, yeni, davamlı yüksək məhsuldarlıqlı bioloji ekranların həyata keçirilməsi üçün bu yanaşmanın ilk nümayişlərinin müzakirəsi təqdim olunur. Alətdən əldə edilən nəticələr, kommersiya alətləri ilə müqayisə edildikdə, əlavə ötürmə qabiliyyəti və iqtisadi fayda ilə klinik əhəmiyyətə malik əlavə tədqiqatların aparılması üçün alətin etibarlılığını və möhkəmliyini nümayiş etdirir. Rəqəmsal PCR istifadə edərək mütləq kəmiyyətin etibarlılığına variasiya komponentlərinin təsiri.
Jacobs BK, Goetghebeur E, Clement L.
BMC Bioinformatika. 2014-cü il, avqust 2215: 283

MƏLUMAT: Rəqəmsal polimeraza zəncirvari reaksiyası (dPCR) hədəf nuklein turşularının aşkarlanması və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün getdikcə populyarlaşan texnologiyadır. Onun reklam gücü, istinad əyrilərinə ehtiyac duymadan yüksək dəqiqlikli mütləq kəmiyyətdir. Standart verilənlərin analitik yanaşması sadə görünən nəzəri çərçivəni izləyir, lakin məlumatların yaradılması prosesində variasiya mənbələrinə məhəl qoymur. Bunlar həm texniki, həm də bioloji amillərdən qaynaqlanır, burada biz 1) avadanlıqda bərkidilmiş, 2) istifadəçidən asılı olan və 3) istehsalçılar tərəfindən təmin edilən, lakin istifadəçi tərəfindən uyğunlaşdırıla bilən xüsusiyyətləri ayırırıq. Ədəbiyyatda təqdim olunan hədəf konsentrasiya qiymətləndiricilərinin düzgünlüyünə və dəqiqliyinə uyğun dispersiya komponentlərinin təsiri simulyasiya vasitəsilə öyrənilir.
NƏTİCƏLƏR: Biz sistemə xas texniki amillərin konsentrasiya təxminlərinin dəqiqliyinə və dəqiqliyinə necə təsir etdiyini aşkar edirik. Biz tapırıq ki, yaxşı seçilmiş nümunənin seyreltmə səviyyəsi və hədəf nüsxəsinin aşkarlanması üçün flüoresans kəsimi kimi dəyişdirilə bilən parametrlər etibarlılığa əhəmiyyətli dərəcədə təsir edir və vacib olan üsullarla təhlil edilən nümunəyə uyğunlaşdırıla bilər. Pipetlərin qeyri-dəqiqliyi və nümunənin heterojenliyinin xüsusi mənbələri daxil olmaqla istifadəçidən asılı texniki variasiya təxmin edilən konsentrasiyaların qeyri-müəyyənliyinin kəskin artmasına səbəb olur.İstifadəçilər bunu təkrar təcrübələr və əldə edilmiş variasiya qiymətləndirməsi vasitəsilə aşkar edə bilərlər. Nəhayət, aşkarlama performansı flüoresans intensivliyinin kəsilmə nöqtəsini optimallaşdırmaqla yaxşılaşdırıla bilər, çünki suboptimal həddlər konsentrasiya təxminlərinin dəqiqliyini əhəmiyyətli dərəcədə azaldır.
NƏTİCƏLƏR: Hər hansı digər texnologiya kimi, dPCR təbii pozğunluqlar, sistematik parametrlər və istifadəçidən asılı protokollar tərəfindən törədilən dəyişkənliyə məruz qalır. Müvafiq qeyri-müəyyənlik uyğunlaşdırılmış eksperimental dizaynla idarə oluna bilər. Bizim tapıntılarımız dPCR dizaynı və düzgün dəqiqlik sərhədləri ilə məlumatların təhlili üzrə təlimatların hazırlanması üçün mühüm başlanğıc nöqtəsi təşkil edən dəyişdirilə bilən əsas qeyri-müəyyənlik mənbələrinə işarə edir. Nümunə qatılma səviyyələrinin ağıllı seçimlərindən başqa, maşın parametrlərinin eksperimentə uyğun tənzimlənməsi nəticələri xeyli yaxşılaşdıra bilər. Xüsusilə məlumatlara əsaslanan yaxşı seçilmiş flüoresan intensivlik hədləri hədəf varlığın aşkarlanmasında böyük təkmilləşdirmələrlə nəticələnir. Biz istehsalçıları istifadəçilərə öz parametrlərində metodun potensialını maksimum dərəcədə artırmağa və təcrübələri üçün yüksək dəqiqlik və dəqiqlik əldə etməyə imkan verən kifayət qədər təfərrüatlı çıxış məlumatları təqdim etməyə çağırırıq.
Bir addımlı RT-damcılı rəqəmsal PCR: su ilə daşınan RNT viruslarının kəmiyyətinin müəyyən edilməsində irəliləyiş.
Rački N, Morisset D, Qutierrez-Aguirre I, Ravnikar M.
Anal Bioanal Kimya. 2014 406(3): 661-667

Suyun viruslarla çirklənməsi bütün dünyada insan sağlamlığına artan təsir göstərir və dəqiq və kəmiyyətli molekulyar alətlərə olan tələblərə səbəb olur. Burada, müxtəlif növ səth suyu nümunələrində RNT virusunun (rotavirus) ilk bir addımlı əks transkripsiya damcılı rəqəmsal PCR-əsaslı mütləq kəmiyyət göstəricisi haqqında məlumat veririk. Bu kəmiyyət müəyyənləşdirmə üsulu, müqayisəli əks transkripsiya real vaxt PCR (RT-qPCR) ilə müqayisədə inhibitor maddələrə daha dəqiq və daha dözümlü olduğunu sübut etdi və standart əyriyə ehtiyac yoxdur. Bu yeni alət adətən su nümunələrində aşkar edilən xüsusilə aşağı konsentrasiyalarda virusların miqdarını təyin etmək üçün tam uyğundur.
Kəmiyyət molekulyar mikrob profilinin düzgünlüyünün qiymətləndirilməsi.
O'Sullivan DM, Laver T, Temisak S, Redshaw N, Harris KA, Foy CA, Studholme DJ, Huggett JF
Int J Mol Sci. 2014 Noyabr 2115(11): 21476-21491

Mikrob icmalarının profilləşdirilməsində yüksək məhsuldarlıqlı ardıcıllığın tətbiqi mikrobiomları araşdırmaq üçün görünməmiş bir qabiliyyət təmin edir. Bu cür tədqiqatlar adətən iki üsuldan birini tətbiq edir: konservləşdirilmiş ortoloji ardıcıllığı (adətən 16S ribosomal RNT geni) və ya bütöv (meta)genom ardıcıllığını (WGS) hədəfləmək üçün PCR istifadə edərək amplikon ardıcıllığı. Hər iki üsul nümunədə mövcud olan mikrob taksonlarını kataloqlaşdırmaq və onların müvafiq bolluğunu ölçmək üçün istifadə edilmişdir. Bununla belə, müxtəlif ardıcıllıq yanaşmalarının xas dəqiqliyi və ya meylinin müqayisəsi aparılmamışdır. Biz əvvəllər müxtəlif ardıcıllıq strategiyalarını yerinə yetirərkən səhvləri araşdırmaq üçün metagenomik nəzarət materialı (MCM) hazırlamışdıq. Dörd fərqli primer strategiyası və iki 16S rRNA bölgəsindən istifadə edərək amplikon ardıcıllığı araşdırıldı (Roche 454 Junior) və WGS (Illumina HiSeq) ilə müqayisə edildi. Bütün ardıcıllıq üsulları ümumiyyətlə müqayisəli şəkildə və orqanizmə xas rəqəmsal PCR (dPCR) WGS ilə yaxşı uyğunluq təşkil edərək, xüsusilə çox yüksək dəqiqlik nümayiş etdirdi. Nisbi bolluqlar arasında uyğunsuzluqlar baş verdikdə, onlar iki dəfədən az fərqlənməyə meyllidirlər. Əldə etdiyimiz tapıntılar göstərir ki, mikrobial molekulyar profilləşdirmə üçün alternativ ardıcıllıq yanaşmalarından istifadə edildikdə, onlar yaxşı təkrarlanma qabiliyyəti ilə çıxış edə bilər, lakin fərqli metodlar arasında kiçik fərqləri müqayisə edərkən diqqətli olmaq lazımdır. Bu iş nümunələr arasında nisbi fərqləri və hasilat üsullarının təsirini müqayisə edən gələcək iş üçün zəmin yaradır. Mikrobial profilləşdirmə tədqiqatlarını etalon metodlarla apararkən və müvafiq hədləri təyin edərkən nəzarət materiallarının dəyərini də vurğulayırıq. Ağciyər xərçənginin diaqnozu üçün bəlğəmdə miRNA-ların rəqəmsal PCR miqdarı.
Li N, Ma J, Guarnera MA, Fang H, Cai L, Jiang F.
J Cancer Res Clin Oncol. 2014 Yanvar140(1): 145-150

MƏQSƏD: MikroRNA-lar (miRNA) ağciyər xərçənginin başlanmasında və inkişafında mühüm rol oynayır. Bəlğəmdə miRNT ifadə səviyyələrinin ölçülməsi ağciyər xərçənginin diaqnozu üçün potensial bir yanaşma təmin edə bilər. Yaranan rəqəmsal PCR nuklein turşularının dəqiq, birbaşa və mütləq kəmiyyətinin təyini üçün sadə bir üsuldur. Tədqiqatın məqsədi ağciyər xərçəngi diaqnozu üçün bəlğəmdə miRNA-ların miqdarını təyin etmək üçün rəqəmsal PCR-dən istifadə oluna biləcəyini araşdırmaq idi.
Üsullar: Biz ilk olaraq beş sağlam şəxsin bəlğəmindən təcrid olunmuş RNT-dən istifadə edərək miRNT-nin kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün rəqəmsal PCR və adi kəmiyyət tərs transkriptaz PCR (qRT-PCR) dinamik diapazonlarını təyin etdik və müqayisə etdik. Daha sonra 35 ağciyər xərçəngi xəstəsində və 40 xərçəngsiz nəzarətdə ağciyər xərçəngi ilə əlaqəli iki miRNA-nın (miR-31 və miR-210) surətlərinin sayını müəyyən etmək üçün rəqəmsal PCR-dən istifadə etdik.
NƏTİCƏLƏR: Rəqəmsal PCR ilə ölçülən miRNA-ların nüsxə sayı yeddi böyüklük sırası üzərində ikiqat seyreltmə seriyasında daxil edilən cDNA miqdarına xətti reaksiya göstərdi. Rəqəmsal PCR analizi ilə müəyyən edilən miRNA kəmiyyət göstəricisi bəlğəmdə qRT-PCR analizindən əldə edilən göstərici ilə yaxşı uyğunluq təşkil edirdi. Bundan əlavə, miR-31 və miR-210 nüsxə nömrəsinin rəqəmsal PCR-dən istifadə etməklə, xəstələrin və nəzarət orqanlarının bəlğəmində 65,71% həssaslıq və 85,00% spesifiklik təmin etdi.
NƏTİCƏ: Rəqəmsal PCR daha çox qurulduqca, ağciyər xərçənginin diaqnozu üçün bəlğəmdəki miRNT nüsxə sayının kəmiyyətcə qiymətləndirilməsi üçün möhkəm bir vasitədir.

Hüceyrə mRNA-larının rəqəmsal kodlaşdırılması, tək molekullu hesablama ilə dəqiq və mütləq gen ifadəsinin ölçülməsinə imkan verir.
Fu GK, Wilhelmy J, Stern D, Fan HC, Fodor SP.
Anal Kimya. 2014 Mart 1886(6): 2867-2870

Biz tək hüceyrələrdə messenger ribonuklein turşusu (mRNT) gen transkriptlərinin həssas aşkarlanması və dəqiq miqdarının təyini üçün yeni yanaşma təqdim edirik. Birincisi, əks transkripsiya zamanı mRNA-ların bütün populyasiyası molekulyar barkodlarla kodlanır. Maraqlanan gen hədəflərinin gücləndirilməsindən sonra molekulyar barkodlar ardıcıllıqla hesablanır və ya başlanğıc nümunədəki molekulların sayını aşkar etmək üçün sadə hibridləşmə detektorunda xallanır. Mütləq kəmiyyətlər ölçüldüyü üçün standartlara uyğun olaraq kalibrləmə lüzumsuzdur və polimeraza zəncirvari reaksiya (PZR) meyli kimi bir çox nisbi kəmiyyət problemlərinin qarşısı alınır. Biz metodu kiçik nümunə kəmiyyətlərinin gen ifadə analizi üçün tətbiq edirik və tək hüceyrə səviyyələrinə qədər həssaslıqla dəqiq ölçmələr nümayiş etdiririk. Metod standart termal cycler və PCR reagentlərindən istifadə edən asan, tək borulu, son nöqtəli analizdir. Dəqiq və dəqiq ölçmələr dövrdən dövrə intensivliyə əsaslanan real vaxt monitorinqinə və ya çoxsaylı reaksiyalara fiziki bölməyə (məsələn, rəqəmsal PCR) ehtiyac olmadan əldə edilir. Bundan əlavə, bütün mRNT molekulları molekulyar ştrix kodlarla kodlandığından, gücləndirmə çoxlu ölçmələr üçün daha çox material yaratmaq üçün istifadə edilə bilər və məhdud nümunələrdə texniki təkrarlamalar həyata keçirilə bilər. Metod xüsusilə kiçik nümunə kəmiyyətləri üçün faydalıdır, məsələn, tək hüceyrəli təcrübələr. Hüceyrə məzmununun rəqəmsal kodlaşdırılması həqiqi bolluq səviyyələrini qoruyur və gücləndirmə nəticəsində yaranan təhrifləri aradan qaldırır.


Klinik mikrobiologiya laboratoriyaları sürəti, həssaslığı, spesifikliyi və istifadəsi asanlığı üçün kəmiyyət PCR-ə əsaslanır. Bununla belə, kəmiyyət PCR kəmiyyəti standart əyrinin istifadəsini və ya genlərə istinad etmək üçün normallaşdırma tələb edir. Damcılı rəqəmsal PCR kalibrləmə əyrilərinə ehtiyac olmadan mütləq kəmiyyəti təmin edir. Həm insanlarda, həm də heyvanlarda qastritin mühüm səbəbi olan bağırsaq paraziti Cryptosporidium üçün damcı rəqəmsal PCR və kəmiyyət PCR əsaslı analizlər arasında müqayisə aparılmışdır. İki lokus (18S rRNA və aktin) bir sıra Cryptosporidium DNT şablonlarından, o cümlədən rekombinant plazmidlərdən, təmizlənmiş hemositometrlə hesablanmış oosistalardan, kommersiya axını sitometriyası ilə hesablanmış ookistlərdən və qoyun, mal-qara və insanlardan alınan nəcis DNT nümunələrindən istifadə etməklə təhlil edilmişdir. Hər bir üsul xəttilik, dəqiqlik, aşkarlama həddi və qiymət baxımından qiymətləndirilmişdir. Eyni aşkarlama diapazonunda hər iki üsul standartlar (R2𚣬,999) və nəcis nümunələri (R2𚣬,9750) üçün yüksək dərəcədə xəttilik və müsbət korrelyasiya göstərmişdir. Orta Nisbi Standart Sapma (RSD%) ilə ölçülən damcı rəqəmsal PCR dəqiqliyi kəmiyyət PCR ilə müqayisədə, xüsusən 18S rRNA lokusu üçün ardıcıl olaraq daha yaxşı idi, lakin DNT konsentrasiyası azaldıqca daha zəif idi. Kəmiyyət PCR-nin kəmiyyət aşkarlanmasına DNT konsentrasiyası təsir etməmişdir, lakin kəmiyyət PCR ilə müqayisədə damlacıqlı rəqəmsal PCR kəmiyyət PCR inhibitorların mövcudluğundan daha az təsirlənmişdir. Kriptosporidium-müsbət nəcis DNT də daxil olmaqla təhlil edilən əksər şablonlar üçün damcı rəqəmsal PCR ilə müəyyən edilən şablonun surətinin nömrələri kəmiyyət PCR ilə müqayisədə ardıcıl olaraq aşağı olmuşdur. Bununla belə, kəmiyyət PCR ilə əldə edilən kəmiyyət göstəriciləri standart əyrinin düzgünlüyündən asılıdır və kəmiyyət PCR məlumatları pipetləmə və DNT itkiləri üçün düzəldildikdə (damcılı rəqəmsal PCR ilə müəyyən edilir), onda hər iki metodun həssaslığı müqayisə edilə bilər. 96 nümunəyə əsaslanan xərc təhlili aşkar etdi ki, damcı rəqəmsal PCR-nin ümumi dəyəri (istehlak materialları və əmək) kəmiyyət PCR-dən iki dəfə yüksəkdir. Kəmiyyət PCR ilə yüksək məhsuldarlıq və sərfəli gücləndirmə üçün istifadə edilən standart seyreltmələrin dəqiq miqdarını təyin etmək üçün damcı rəqəmsal PCR-dən istifadə iki texnologiyanın üstünlüklərini birləşdirməyin bir yolu olardı.
Tək hüceyrə həlli ilə damcı rəqəmsal PCR istifadə edərək kəmiyyət telomeraza fermenti aktivliyinin müəyyən edilməsi.
Ludlow AT, Robin JD, Sayed M, Litterst CM, Shelton DN, Shay JW, Wright WE.
Nuklein turşuları Res. 2014 42(13): e104

İnsanın əks transkriptazası, telomeraz üçün telomer təkrar gücləndirmə protokolu (TRAP) iki onillik əvvəl hazırlanmış PCR-əsaslı analizdir və hələ də telomeraz fəaliyyətinin müntəzəm təyini üçün istifadə olunur. TRAP analizi yalnız ∼ 2-qat fərqləri təkrar istehsal edə bilər və daxili standartlar və istinad hüceyrə xətləri ilə müqayisədə yalnız kəmiyyətdir. Metod ümumiyyətlə zəhmətli radioaktiv gel elektroforezini əhatə edir və yüksək məhsuldarlıqlı analizlər üçün əlverişli deyil. Bu yaxınlarda PZR-dən sonra daxil olan dezoksiribonuklein turşusu molekullarının mütləq kəmiyyətini müəyyən etməyə imkan verən damcı rəqəmsal PCR (ddPCR) texnologiyaları mövcud olmuşdur. Biz reproduktivliyi təsvir edirik və telomeraz fəaliyyəti üçün damcı rəqəmsal TRAP (ddTRAP) analizinin bir neçə nümunəsini təqdim edirik, o cümlədən tək hüceyrələrdə telomeraz aktivliyinin kəmiyyəti, bir neçə ümumi telomeraz müsbət xərçəng hüceyrələri xətti boyunca telomeraz fəaliyyəti və mitogendən sonra insan periferik qanının mononüvə hüceyrələrində. stimullaşdırma. TRAP analizinin rəqəmsal formata uyğunlaşdırılması bir HeLa hüceyrəsindəki telomerazla genişləndirilmiş məhsulların (yəni telomeraz aktivliyi 57,8 & plusmn 7,5) sayını dəqiq və təkrarlana bilən kəmiyyətləşdirməyə imkan verir. Bu tədqiqatda hazırlanmış alətlər telomeraz ferment aktivliyindəki dəyişiklikləri tək hüceyrə əsasında izləməyə imkan verir və telomerazanı hədəf alan yeni terapevtik yanaşmaların layihələndirilməsində faydalı ola bilər.
GMO-nun kəmiyyətinin müəyyən edilməsi: gələcək üçün dəyərli təcrübə və fikirlər.
Milavec M, Dobnik D, Yang L, Zhang D, Gruden K, Zel J.
Anal Bioanal Kimya. 2014 oktyabr 406(26): 6485-6497

Geni dəyişdirilmiş orqanizmlərin (GMO) yetişdirilməsi və marketinqi bütün dünyada qeyri-bərabər şəkildə qəbul edilmişdir. Beynəlxalq ticarəti asanlaşdırmaq və istehlakçılara məlumat vermək üçün bir çox ölkələrdə etiketləmə tələbləri müəyyən edilmişdir. Kəmiyyət real vaxt polimeraza zəncirvari reaksiyası (qPCR) hazırda GMO-ların aşkarlanması, identifikasiyası və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün seçim üsuludur. Bu, tənqidi şəkildə qiymətləndirilmiş və metodun icrasına dair tələblər müəyyən edilmişdir. Buna baxmayaraq, DNT-nin kəmiyyət və keyfiyyətinin ölçülməsi və qPCR effektivliyinin müəyyən edilməsi, mümkün ardıcıllıq uyğunsuzluqları, takson-spesifik genlərin xüsusiyyətləri və müvafiq ölçü vahidləri kimi hələ də vurğulanmalı olan problemlər var, çünki bunlar potensial ölçmə mənbələri olaraq qalır. qeyri-müəyyənlik. Bu problemləri aradan qaldırmaq və GMO-ların sayının və çeşidinin davamlı artmasının öhdəsindən gəlmək üçün yeni yanaşmalara ehtiyac var. Rəqəmsal PCR-in inkişafı ilə kəmiyyətin müəyyənləşdirilməsinin statistik strategiyaları artıq təklif edilmiş və genişləndirilmişdir. Yeni nəsil ardıcıllığından kəmiyyət məqsədləri üçün də istifadə etmək üçün ilk cəhdlər edilmişdir, baxmayaraq ki, bu texnologiyadan istifadə edərək GMO-ların tərkibinin dəqiq kəmiyyətinin müəyyən edilməsi gələcək üçün, xüsusən də qarışıq nümunələr üçün hələ də problemdir. Yığınların kəmiyyətinin müəyyən edilməsi və yeni bitki yetişdirmə üsulları ilə istehsal olunan orqanizmlərin potensial kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün də yeni yanaşmalara ehtiyac var.
Qidaların təhlükəsizliyinə nəzarətdə nuklein turşusu əsaslı mikrobioloji üsullarla onillik.
Kuchta T, Knutsson R, Fiore A, Kudirkiene E, Höhl A, Horvatek Tomic D, Gotcheva V, Pöpping B, Scaramagli S, To Kim A, Wagner M, De Medici D.
Lett Appl Microbiol. 2014 59(3): 263-271

Son on ildə nuklein turşusuna əsaslanan üsullar qidaya nəzarətlə məşğul olan adi laboratoriyalarda mədəni əsaslı metodları və immunokimyəvi analizləri tədricən əvəz etməyə və ya tamamlamağa başladı. Xüsusilə, real vaxt polimeraza zəncirvari reaksiyası (PZR) texniki cəhətdən yaxşı sürət, həssaslıq və təkrar istehsal mərhələsinə qədər işlənib hazırlanmışdır ki, bu da daşıyıcı çirklənmə riskini minimuma endirmişdir. Nuklein turşusuna əsaslanan metodların təmin etdiyi əsas üstünlüklər daha yüksək sürət və əlavə məlumatdır, məsələn, alt növlərin identifikasiyası, virulentlik və ya antibiotik müqaviməti üçün vacib olan genlərin olması haqqında məlumat. Nuklein turşusuna əsaslanan üsullar, klassik analoqları olmayan vacib qida patogenlərini, yəni qida yolu ilə yoluxan patogen virusları aşkar etmək üçün də cəlbedicidir. Bu icmal yaxın onillikdə mikrobioloji molekulyar üsullara cəlb olunmaq üçün namizəd ola biləcək hazırda mövcud olan və ya inkişaf etməkdə olan molekulyar texnologiyaları qısa şəkildə ümumiləşdirir. Floresan in situ hibridləşdirmə, alternativ PCR kimyaları, alternativ gücləndirmə texnologiyaları, rəqəmsal PCR və nanotexnologiyalar da daxil olmaqla, gücləndirmə üsulları ilə yanaşı gücləndirilmənin potensialı müzakirə olunur.
Rəqəmsal PCR öz addımını atdı
Monya Baker tərəfindən
Təbiət Metodları 9, 541� (2012)

Bir neçə il əvvəl Ramesh Ramakrishnan rəqəmsal PCR-nin nə olduğunu izah etməyə o qədər çox vaxt sərf etməli oldu ki, görüşlərdə çıxışlar edərkən tətbiqləri izah etməyə tələsməli oldu. İndi o deyir ki, əksər tamaşaçılar texnikanı özləri ifa etməsələr də, ən azı bu terminlə tanışdırlar. “Bu, artıq ekzotik bir şey deyil,”, Fluidigm Korporasiyasının R&D direktoru Ramakrishnan deyir.
Rəqəmsal PCR (dPCR) strategiyası “böl və qalib gəl” kimi ümumiləşdirilmişdir: nümunə seyreltilir və yüzlərlə və hətta milyonlarla ayrı-ayrı reaksiya kameralarına bölünür ki, hər birində maraq ardıcıllığının bir və ya heç nüsxəsi olsun. Elm adamları "müsbət" bölmələrin (ardıcıllığın aşkar edildiyi) və "mənfi" bölmələrinin (olmayan) sayını hesablayaraq, orijinal nümunədə DNT molekulunun neçə nüsxəsinin olduğunu dəqiq müəyyən edə bilərlər. Digər tətbiqlər arasında tədqiqatçılar allellərin diferensial ifadəsini ayırd etmək1, hansı virusların ayrı-ayrı bakterial hüceyrələrə2 yoluxmasını izləmək, xəstə nümunələrində xərçəng genlərini ölçmək3 və dövran edən qanda fetal DNT-ni aşkar etmək üçün rəqəmsal PCR-dən istifadə etmişlər4.
Rəqəmsal PCR-in arxasında duran konsepsiya ilk dəfə 1992-ci ildə təsvir edilmişdir (istinad 5). Bir neçə il sonra Johns Hopkins Universitetində Bert Vogelstein və Ken Kinzler texnikanın adını verdilər və kolorektal xərçəngi olan xəstələrin nəcisindəki xəstəliklərlə əlaqəli mutasiyaların miqdarını təyin etmək üçün istifadə edilə biləcəyini göstərdilər. Nəzəriyyə sadə olsa da, həyata keçirilmədi. İlkin nümayişlər hər bölməyə 5 mikrolitr olan, kommersiyada mövcud olan 384 quyu boşqablarda aparıldı və bu, əksər tədqiqatçıları çaşdıracaq reagentlərin həcmini tələb etdi6.
Nanofabrikasiya və mikrofluidika sahəsindəki irəliləyişlər indi yüzlərlə milyonlarla nanolitr və hətta pikolitr miqyaslı arakəsmələr istehsal edən sistemlərə gətirib çıxardı. Akademik texnologiya tərtibatçıları bir neçə tətbiqi təsvir etdilər, lakin indiyə qədər yalnız bir ovuc şirkət məhsulları kommersiyalaşdırdı və ya bunu etmək planlarını elan etdi (Cədvəl 1). Fluidigm və Life Technologies xüsusi hazırlanmış çiplər və ya lövhələr içərisində reaksiya kameraları yaradır. Bio-Rad və RainDance reagentlərini fərdi damcılara ayırır. . . . . . .

Rəqəmsal polimeraza zəncirvari reaksiya dövründə virus diaqnostikası.
Sedlak RH, Jerome KR.
Laboratoriya Tibb Fakültəsi, Vaşinqton Universiteti, Seattle, WA, ABŞ.
Diaqnoz Microbiol Infect Dis. 2013 75(1): 1-4

Kəmiyyət polimeraza zəncirvari reaksiyasından (qPCR) fərqli olaraq, rəqəmsal PCR (dPCR) standart əyriyə ehtiyac olmadan DNT nümunəsinin həssas və dəqiq mütləq kəmiyyətinə nail olur. Tək bir PCR reaksiyası hər birinin müsbət və ya mənfi siqnalı olan bir çox ayrı reaksiyalara bölünür. Poisson statistikasını tətbiq etməklə, orijinal nümunədəki DNT molekullarının sayı birbaşa müsbət və mənfi reaksiyaların sayından hesablanır. Çoxsaylı kommersiya dPCR platformalarının son mövcudluğu, dPCR-nin ənənəvi qPCR-dən üstün ola biləcəyi aşağı virus yükünün aşkarlanması və aşağı bolluqlu mutantların aşkarlanması kimi klinik diaqnostik tətbiqlərə marağın artmasına səbəb oldu. Burada dPCR-nin viral diaqnostikada potensial faydasını nümayiş etdirən cari ədəbiyyatı nəzərdən keçiririk, xüsusən də hədəf DNT ardıcıllığının mütləq kəmiyyətinin müəyyən edilməsi və nadir mutant allellərin aşkarlanması yolu ilə.
Damcı mikrofluidikası üçün analitik aşkarlama üsulları - baxış.
Zhu Y, Fang Q.
Mikroanalitik Sistemlər İnstitutu, Kimya Departamenti, Zhejiang Universiteti, Hançjou, Çin.
Anal Chim Acta. 2013 (787): 24-35

Son onillikdə damcı əsaslı mikrofluidika təkhüceyrəli analiz, rəqəmsal PCR, zülal kristallaşması və yüksək məhsuldarlıq skrininqi sahələrində sürətli irəliləyiş əldə etmişdir. O, ultra kiçik həcmli (pikolitrdən nanolitrədək) və ultra yüksək ötürmə qabiliyyəti ilə kimyəvi və bioloji təcrübələrin aparılması üçün perspektivli platforma olduğu sübut edilmişdir. Damcıdakı məzmunu keyfiyyətcə və kəmiyyətcə təhlil etmək qabiliyyəti damcı əsaslı mikro-maye sistemlərinin inkişafı və tətbiqində artan rol oynayır. Bu icmalda damcı sistemlərində istifadə olunan analitik aşkarlama üsullarını ümumiləşdirdik və tətbiqi vasitəsilə hər bir texnikanın üstün və mənfi cəhətlərini müzakirə etdik. Bu yazıda qeyd olunan analitik üsullara parlaq sahə mikroskopiyası, flüoresan mikroskopiya, lazer induksiyalı flüoresans, Raman spektroskopiyası, elektrokimya, kapilyar elektroforez, kütləvi spektrometriya, nüvə maqnit rezonans spektroskopiyası, udulmanın aşkarlanması, kimyalüminessensiya, nümunələr və üsullar daxildir. Yeni tətbiqlərin işə salınmasında analitik aşkarlama üsullarının əhəmiyyəti vurğulanır.Biz həmçinin damcı əsaslı mikrofluidik sistemlər üçün analitik aşkarlama üsullarının gələcək inkişaf istiqamətlərini müzakirə edirik.
Analoq real vaxt PCR-ə qarşı damcılı rəqəmsal PCR ilə mütləq kəmiyyət.
Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA, Gallicotte EN, Ruf IK, Hindson BJ, Vessella RL, Tewari M.
Rəqəmsal Biologiya Mərkəzi, Bio-Rad Laboratories, Inc., Pleasanton, Kaliforniya, ABŞ.
Nat Metodları. 2013-cü il, 1 sentyabr.

Rəqəmsal PCR (ddPCR) ilə qoşalaşmış nanolitr ölçülü damcı texnologiyası yüksək dəqiqlikdə, mütləq nuklein turşusunun miqdarının təyini üçün vəd verir. ddPCR və real vaxt PCR ilə mikroRNT kəmiyyətinin müqayisəsi daha yüksək dəqiqlik (dəyişmə əmsalları 37-86% azaldı) və ddPCR-nin gündəlik təkrar istehsal qabiliyyətini (yeddi faktorla) yaxşılaşdırdı, lakin müqayisə edilə bilən həssaslıqla. Serum mikroRNT biomarker analizinə ddPCR tətbiq etdikdə, bu, xərçəng xəstələrini müəyyən etmək üçün üstün diaqnostik performansa çevrildi.
Damcı-Rəqəmsal PCR və Real-Time Kəmiyyətli PCR-in inhibitor maddələrə qarşı dözümlülüyü.
Dingle TC, Sedlak RH, Cook L, Jerome KR.
Clin Chem. 3 sentyabr 2013.

Redaktora: Real vaxtda kəmiyyət PCR (qPCR)1 bir çox klinik diaqnostik testlər üçün əsas təşkil edən sürətli və həssas bir üsuldur. Damcılı rəqəmsal PCR (ddPCR) bu keyfiyyətləri qPCR ilə bölüşür, lakin reaksiyanın bölünməsi sayəsində ddPCR müdaxilə edən maddələrə qarşı artan dözümlülük nümayiş etdirmək təklif olunur ki, bu da onu diaqnostik tətbiqlər üçün qPCR-ə cəlbedici alternativ edir (1, 2). Bu fenomeni və onun mexanizmini dəstəkləyən məlumatlar, lakin hazırda ədəbiyyatda yoxdur. Burada, biz klinik cəhətdən müvafiq inhibitorlar panelini (SDS, EDTA və heparin) birbaşa PCR-ə daxil etməklə laboratoriyada hazırlanmış CMV qPCR və ddPCR (Bio-Rad Laboratories, QX-100) analizlərinin inhibə tolerantlığını müqayisə etmək üçün bir sıra təcrübələri təsvir edirik. reaksiyalar (4). Sonra ortaya çıxan inhibə əyrilərindəki fərqlər və yarı-maksimum inhibitor konsentrasiyalar (IC50) qiymətləndirildi.
Damcı rəqəmsal PCR ilə HİV DNT-nin yüksək dəqiq ölçülməsi.
Strain MC, Lada SM, Luong T, Rought SE, Gianella S, Terry VH, Spina CA, Woelk CH, Richman DD.
Kaliforniya Universiteti San Dieqo, La Jolla, Kaliforniya, Amerika Birləşmiş Ştatları.
PLoS One. 20138(4): e55943

İnsan immunçatışmazlığı virusunun (İİV) deoksiribonuklein turşusu (DNT) effektiv kombinə edilmiş antiretrovirus terapiyası (CART) alan xəstələrdə qalıq infeksiyanın ən həssas ölçülməsini təmin edir. Damcı rəqəmli PCR (ddPCR) bu yaxınlarda DNT nüsxə nömrəsinin yüksək dəqiqliklə ölçülməsini təmin etdiyi göstərilmişdir, lakin onun HİV DNT-nin və ya digər eyni dərəcədə nadir hədəflərin kəmiyyətinin müəyyən edilməsinə tətbiqi barədə məlumat verilməmişdir. Bu yazı yoluxmuş xəstələrdən təcrid olunmuş hüceyrələrdə ümumi HİV DNT (bir milyon hüceyrəyə nüsxə) və epizomal 2-LTR (uzun terminal təkrar) dairələrinin tezliyini ölçmək üçün ddPCR tətbiqini nümayiş etdirir və təhlil edir. 300-dən çox klinik nümunənin, o cümlədən üç nüsxədə ddPCR və real-vaxt PCR (qPCR) ilə yoxlanılmış 150-dən çox klinik nümunənin təhlili, polikopiya nömrələrinin dəyişmə əmsalında orta hesabla 5 dəfə azalma ilə dəqiqliyin əhəmiyyətli dərəcədə artdığını nümayiş etdirir. və 2-LTR dairələr üçün >20-qat dəqiqlik təkmilləşməsi. ddPCR təhlilinin qPCR üzərindən əlavə üstünlükləri xarici standarta əsaslanmadan mütləq kəmiyyətin təyin edilməsi və primer və zond ardıcıllığında uyğunsuzluqlara nisbi həssaslığın olmamasıdır. Bu xüsusiyyətlər rəqəmsal PCR-ni klinik nümunələrdə HİV DNT-nin ölçülməsi üçün cəlbedici alternativ edir. Bu nadir hadisələrin təkmilləşdirilmiş həssaslığı və ölçü dəqiqliyi gizli HİV rezervuarını xarakterizə etmək üçün ölçmələri və onun aradan qaldırılması üçün müdaxilələri asanlaşdırmalıdır.
Aşağı nüsxə DNT nümunələrində dəqiq rəqəmsal PCR analizinin tətbiqi üsulları.
Whale AS, Cowen S, Foy CA, Huggett JF.
Molecular and Cell Biology Team, LGC Ltd, Teddington, Birləşmiş Krallıq.
PLoS One. 20138(3): e58177

Rəqəmsal PCR (dPCR) bir sıra unikal imkanlar təklif edən, dəqiq ölçmə qabiliyyətinə malik yüksək dəqiqlikli molekulyar yanaşmadır. Bununla belə, hazırkı formatında dPCR təhlil edilə bilən nümunənin miqdarı ilə məhdudlaşdırıla bilər və nəticədə multipleks reaksiyaların yerinə yetirilməsi və ya əvvəlcədən gücləndirmə kimi əlavə mülahizələr nəzərə alına bilər. Bu tədqiqat bir model şablonunu (Arabidopsis thaliana spirt dehidrogenaz geninin bir hissəsi) hədəfləyən üç fərqli analizdən istifadə edərək dupleksləşdirmə və əvvəlcədən gücləndirmənin dPCR analizinə təsirini araşdırdı. Biz həmçinin müxtəlif şablon növlərinin (xəttiləşdirilmiş plazmid klonu və daha mürəkkəb genomik DNT) dPCR istifadə edərək ölçmə dəqiqliyinə təsirini araşdırdıq. Biz nümayiş etdirə bildik ki, dupleks dPCR uniplex dPCR-dən daha dəqiq ölçmə təmin edə bilər, halbuki əvvəlcədən gücləndirmə və ya dəyişən şablon növünün tətbiqi dPCR dəqiqliyini əhəmiyyətli dərəcədə azalda bilər. Bundan əlavə, biz həmçinin nümayiş etdiririk ki, gücləndirmə öncəsi addım nümunə və ya analiz üçün eksperimentlər arasında uyğun olmayan ölçmə meylini təqdim edə bilər və buna görə də bu məlumat dəstinin təhlili zamanı kompensasiya edilə bilməz. Biz həmçinin molekulyar düşmənin yayılmasının qiymətləndirilməsi üçün bir modeli təsvir edirik və bunu dPCR qeyri-dəqiqliyinin mənbəyi kimi müəyyən edirik. Məlumatlarımız nümayiş etdirdi ki, aşağı nümunə konsentrasiyasında dPCR-nin verdiyi dəqiqlik, gücləndirmədən əvvəl eyni şablonun dəqiqliyini üstələyə bilər və bununla da bu əlavə addıma ehtiyacı rədd edir. Bizim tapıntılarımız eyni ardıcıllığı ehtiva edən müxtəlif şablon növləri arasındakı texniki fərqləri də vurğulayır, əgər plazmid DNT genomik DNT kimi daha mürəkkəb şablonları qiymətləndirmək və ya nəzarət etmək üçün istifadə ediləcəksə nəzərə alınmalıdır.
Mikrofluidik yuvalanmış rəqəmsal PCR istifadə edərək nadir translokasiyaların tək molekullu kəmiyyəti və ardıcıllığı.
Şuga J, Zeng Y, Novak R, Lan Q, Tang X, Rothman N, Vermeulen R, Li L, Hubbard A, Zhang L, Mathies RA, Smith MT.
İctimai Səhiyyə Məktəbi, Kaliforniya Universiteti, Berkeley, CA 94720, ABŞ, Kimya Departamenti, Kaliforniya Universiteti, Berkeley, CA 94720, ABŞ, Kimya Departamenti, Kanzas Universiteti, Lawrence, KS 66045, ABŞ, UC San Francisco/ UC Berkeley Bioloji Mühəndislik üzrə Məzun Proqramı, Kaliforniya Universiteti, Berkeley, CA 94720, ABŞ, Xərçəng Epidemiologiyası və Genetika Bölməsi, Milli Xərçəng İnstitutu, NIH, Sağlamlıq və İnsan Xidmətləri Departamenti, Bethesda, MD 20852, ABŞ, Guangdong Poison Control Center, Guangzhou 510300, Çin və Ətraf Mühitin Epidemiologiya Bölməsi, Risklərin Qiymətləndirilməsi Elmləri İnstitutu, Utrext Universiteti, Utrext, NL-3508, Hollandiya.
Nuklein turşuları Res. 2013 41(16): e159

Xərçənglər heterojen və genetik cəhətdən qeyri-sabitdir. Xərçəngin inkişafını təmin edən genetik lokuslarda tək hüceyrələrin araşdırılması üçün həssaslıq və spesifikliyi təmin edən yeni üsullara ehtiyac var və bununla da tədqiqatçılara fərdi şişlərin inkişafını öyrənməyə imkan verir. Burada, son dərəcə aşağı səviyyələrdə (<10-6) somatik olaraq əldə edilmiş kanserogen translokasiyaların "kəmiyyətcə" ölçülməsinə və tək molekul ardıcıllığına nail olmaq üçün muncuq əsaslı yarım yuvalı mikro-maye damcılı rəqəmsal PCR (dPCR) texnologiyasının inkişafı və tətbiqi haqqında məlumat veririk. sağlam subyektlər. Follikulyar lenfoma ilə güclü əlaqəli olan t(1418) translokasiyasının ümumi konsentrasiyasını müəyyən etmək üçün sağlam tədqiqat əhalimizdə bu texnikadan istifadə edirik. Daxili dPCR yanaşması analizin səmərəliliyini və spesifikliyini qoruyarkən aşkarlama limitini 1 və 10-7 və ya daha aşağı səviyyəyə qədər yaxşılaşdırır. Bundan əlavə, muncuq əsaslı dPCR bizə bu subyektlərdə t(1418) translokasiyasının müxtəlif klonal formalarının nisbi miqdarını təcrid etməyə və kəmiyyətini müəyyən etməyə imkan verdi və tək molekullu həssaslıq və dPCR-nin həlli yeni klonal formaların kəşfinə səbəb oldu. t(1418) adi kəmiyyət PCR ölçmələri ilə başqa cür maskalanmışdır. Bu şəkildə, biz bu sağlam populyasiyada bu kanserogen mutasiya üçün kəmiyyət xəritəsi yaratdıq və bu t(1418) hadisələrin böyük əksəriyyətinin baş verdiyi 14 və 18-ci xromosomlardakı mövqeləri müəyyən etdik.
Fərdi tibb üçün molekulyar biomarkerlərin inkişafı və təhlilində rəqəmsal PCR strategiyaları.
Gün E, Hörmətli PH, McCaughan F.
MRC Molekulyar Biologiya Laboratoriyası, Kembric, Böyük Britaniya
Metodlar. 2013 59(1): 101-107

Fərdi dərmanların səmərəli şəkildə çatdırılması növbəti onillikdə səhiyyənin əsas məqsədidir. Çox güman ki, PCR strategiyaları bu məqsədin həyata keçirilməsində mühüm rol oynayacaq. Rəqəmsal PCR daha ənənəvi PCR protokollarına nisbətən müəyyən üstünlüklərə malikdir. Bu yazıda biz rəqəmsal PCR-nin mövcud vəziyyətini müzakirə edəcəyik, onun üstünlüklərini vurğulayacağıq və fərdi biomarkerlərin istifadəsi də daxil olmaqla biomarkerlərin inkişafı və təhlilində necə istifadə oluna biləcəyinə diqqət yetirəcəyik. Biz bu sahədə son inkişafları araşdıracağıq, o cümlədən rəqəmsal PCR-nin həqiqətən fərdiləşdirilmiş dərmanı çatdırmaq üçün gələcək nəsil ardıcıllıqla necə inteqrasiya edə biləcəyinə dair nümunələr. Növbəti nəsil qPCR və ardıcıllıq platformalarının mRNA biomarker analizinə tətbiqi.
Devonshire AS, Sanders R, Wilkes TM, Taylor MS, Foy CA, Huggett JF.
Molecular and Cell Biology, LGC Limited, Queens Road, Teddington, Middlesex TW11 0LY, UK.
Metodlar. 2013 Yanvar59(1): 89-100

Son illər transkripsiya biomarkerlərinin təhlilini daha geniş kliniki tətbiqlərə çatdırmaq və transkriptom haqqında anlayışımıza artan dərinliyi təmin etmək potensialına malik yeni yüksək məhsuldarlıqlı PCR və ardıcıllıq platformalarının meydana çıxdığını gördü. Biz RNT-nin çıxarılması və mRNT-nin zənginləşdirilməsi baxımından RNT biomarker analizi üçün klinik nümunələrin necə emal ediləcəyinə dair icmalı və nano-mayeli real vaxt PCR platformalarından istifadə edərək RT-qPCR və rəqəmsal PCR ilə nümunə analizi üçün təlimatları təqdim edirik. Bu yanaşmalar üçün bioinformatika mülahizələri ilə yanaşı, kəmiyyət gen ifadəsi profili və gələcək nəsil ardıcıllığı ilə bütün transkriptom ardıcıllığı üçün seçimlər nəzərdən keçirilir. Transkriptom analizi üçün indi mövcud olan müxtəlif texnologiyaları nəzərə alaraq, onların diaqnostik təsirini maksimuma çatdırmaq üçün platformalar arasında ölçmələrin standartlaşdırılması üsulları əsas olacaq. Buna görə də RNT standartlarının və digər istinad materiallarının istifadəsi də müzakirə olunur.
Kiçik RNT rəqəmsal gen ifadə profilinin məhdudiyyətləri və imkanları.
Linsen SE, de Wit E, Janssens G, Heater S, Chapman L, Parkin RK, Fritz B, Wyman SK, de Bruijn E, Voest EE, Kuersten S, Tewari M, Cuppen E.
Nat Metodları. 2009 iyul 6(7): 474-476

Redaktora: Yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı (HTS) çoxsaylı növlər üzrə minlərlə mikroRNT geninin kəşfi üçün əvəzolunmaz vasitə olduğunu sübut etdi1,2. Hazırda HTS platformalarının ötürmə qabiliyyəti kəşfi rəqəmsal gen ifadəsi (DGE) profilinə3 imkan verən kəmiyyət ifadə analizi ilə birləşdirmək üçün kifayətdir. Müşahidə etdik ki, kiçik RNT DGE profilləşdirmə üsulları müəyyən kiçik RNT-lərə qarşı güclü şəkildə qərəzlidir və kiçik RNT-lərin mütləq sayının dəqiq müəyyən edilməsinə mane olur. Müşahidə olunan qərəz, ardıcıllıq platformasından böyük ölçüdə müstəqildir, lakin kiçik RNT kitabxanasının hazırlanması üçün istifadə olunan üsulla güclü şəkildə müəyyən edilir. Bununla belə, qərəzlər sistematik və yüksək dərəcədə təkrarlana bilən olduğundan, DGE profili nümunələr arasında nisbi ifadə fərqlərini müəyyən etmək üçün uyğundur.
Kolorektal Xərçəng Xəstələrinin Plazmasında DNT-də KRAS mutasiyalarını aşkar etmək üçün Multipleks Pikodroplet Rəqəmsal PCR.
Taly V, Pekin D, Benhaim L, Kotsopoulos SK, Le Corre D, Li X, Atochin I, Link DR, Griffiths AD, Pallier K, Blons H, Bouché O, Landi B, Hutchison JB, Laurent-Puig P.
Université Paris Sorbonne Cité, INSERM UMR-S775, Center Universitaire des Saints-Pères, Paris, Fransa
Clin Chem. 12 avqust 2013-cü il.

Multipleks rəqəmsal PCR (dPCR) dövriyyədə olan şiş DNT-nin qeyri-invaziv və həssas aşkarlanmasına, cari molekulyar aşkarlama yanaşmaları ilə mümkün olmayan performansla imkan verir. Bundan əlavə, pikodroplet dPCR eyni nümunədən çoxsaylı mutasiyaların eyni vaxtda skrininqini asanlaşdırır. ÜSULLAR: Biz KRAS-ın 12 və 13-cü kodonlarında (Kirsten siçovul sarkoması viral onkogen onkogen homoloqu) 7 ən çox yayılmış mutasiyaların skrininqi üçün multipleks dPCR-nin faydasını araşdırdıq. metastatik kolorektal xərçəngi olan xəstələrin plazma nümunələri. İlkin şiş biopsiyası toxuma DNT-si kəmiyyət PCR ilə xarakterizə edilən xəstələrdən əlli plazma nümunəsi sınaqdan keçirildi. NƏTİCƏLƏR: Şişin səciyyələndirilməsi 19 xəstə şişində KRAS mutasiyalarının olduğunu aşkar etdi. Bu nümunələrdən hazırlanmış plazma DNT-nin multipleks dPCR analizi şişdə müəyyən edilmiş mutasiyaya uyğun gələn 14 nümunəni müəyyən etdi, 1 nümunədə fərqli KRAS mutasiyası var və 4 nümunədə aşkar edilə bilən mutasiya yox idi. KRAS üçün vəhşi tip olan şiş nümunələri arasında müvafiq plazma nümunələrində 2 KRAS mutasiyası müəyyən edilmişdir. Dupleks dPCR (yəni, vəhşi tipli və tək mutasiya analizi) həmçinin KRAS-mutasiyaya uğramış şişləri olan xəstələrdən alınan plazma nümunələrini və BRAF (v-raf fare sarkoması viral onkogen homoloqu B) V600E mutasiyasını ehtiva etməsi gözlənilən 5 nümunəni təhlil etmək üçün istifadə edilmişdir. Dupleks analizin nəticələri KRAS-mutasiyaya uğramış nümunələr üçün multipleks analiz nəticələrinə uyğun gəlirdi və onun daha yüksək həssaslığı sayəsində KRAS-mutasiyaya uğramış DNT-nin aşağı səviyyələri olan 2 əlavə nümunənin aşkarlanmasına imkan yaradıb. BRAF mutasiyaları olan bütün 5 nümunə aşkar edilmişdir. NƏTİCƏLƏR: Bu iş qeyri-invaziv qan toplanması ilə əldə edilən dövriyyədə olan DNT-də mutasiyaları aşkar etmək üçün kifayət qədər həssaslıqla eyni vaxtda çoxsaylı mutasiyaların skrininqi üçün multipleks dPCR-nin klinik faydasını nümayiş etdirir.
Yüksək məhsuldarlıqlı mikrofluidik tək hüceyrəli rəqəmsal polimeraza zəncirvari reaksiya.
White AK, Heyries KA, Doolin C, Vaninsberghe M, Hansen CL.
Yüksək Təsirli Biologiya Mərkəzi və ‡Fizika və Astronomiya Departamenti, British Columbia Universiteti, 307-2125 East Mall, Vancouver, British Columbia, Kanada V6T 1Z4.
Anal Kimya. 2013 Avqust 685(15): 7182-7190

Burada tək hüceyrələrin yüksək məhsuldarlıqlı rəqəmsal polimeraza zəncirvari reaksiyası (dPCR) analizi üçün inteqrasiya olunmuş mikrofluidik cihaz təqdim edirik. Bu cihaz tək hüceyrələrin paralel işlənməsinə imkan verir və hüceyrələrin tutulması, yuyulması, lizis, əks transkripsiya və dPCR analizi daxil olmaqla bütün analiz mərhələlərini həyata keçirir. Hər bir hüceyrədən cDNT səthi gərginliyə əsaslanan nümunə bölməsindən istifadə edərək hər birinin həcmi 25 pL olan 1020 kameradan ibarət xüsusi dPCR massivinə paylanır. Bu dPCR formatının yüksək sıxlığı (118� kamera/sm(2)) 10 sm(2) cihaz izi istifadə edərək, cəmi 204� PCR reaksiyası üçün hər bir dövrədə 200 tək hüceyrənin təhlilinə imkan verir. RNT seyreltmələrindən istifadə edilən təcrübələr göstərir ki, bu cihaz 10(4) dinamik diapazonu ilə tək molekulların kəmiyyətinin müəyyən edilməsində səs-küy-məhdud performansa nail olur. Biz 1200-dən çox təkhüceyrəli ölçmə apardıq, bu platformanın həm yüksək, həm də az bolluqlu mRNT transkriptlərinin, eləcə də alternativ hibridləşdirmə üsulları ilə asanlıqla ölçülməyən mikro-RNT-lərin mütləq kəmiyyətinin müəyyən edilməsində istifadəsini nümayiş etdirdik. Tək hüceyrəli dPCR-nin spesifikliyini və həssaslığını tək hüceyrələrdə RNT redaktə hadisələrinin ölçülməsi üçün daha da tətbiq edirik. Yüksək məhsuldarlıqlı dPCR sürət, dəqiqlik, həssaslıq və spesifikliyin unikal kombinasiyası ilə tək hüceyrəli analiz metodlarının arsenalında yeni alət təqdim edir. Güman edirik ki, bu yanaşma transkripsiya səs-küyü, allel balanssızlığı və RNT emalının təhlili də daxil olmaqla yüksək performanslı tək hüceyrəli ölçmələrin vacib olduğu yeni tədqiqatlara imkan verəcək. Klinik nümunələrdə DNT bütövlüyünün kəmiyyət qiymətləndirilməsi üçün multipleks pikolitr-damcılı rəqəmsal PCR.
Didelot A, Kotsopoulos SK, Lupo A, Pekin D, Li X, Atochin I, Srinivasan P, Zhong Q, Olson J, Link DR, Laurent-Puig P, Blons H, Hutchison JB, Taly V.
Université Paris Sorbonne Cité, INSERM UMR-S775, Paris, Fransa.
Clin Chem. 2013 May59(5): 815-823

MƏLUMAT: DNT bütövlüyünün və kəmiyyətinin qiymətləndirilməsi yüksək məhsuldarlıqlı molekulyar genotipləşdirmə texnologiyaları, o cümlədən növbəti nəsil ardıcıllığı üçün darboğaz olaraq qalır. Xüsusilə, şiş DNT-sinin əsas potensial mənbəyi olan parafinə daxil edilmiş toxumalardan çıxarılan DNT keyfiyyətcə geniş şəkildə dəyişir və gözlənilməz ardıcıllıq məlumatlarına səbəb olur. DNT bütövlüyünü və gücləndirilə bilən DNT-nin miqdarını eyni vaxtda aşkar etməyə imkan verən pikolitr damcı əsaslı rəqəmsal PCR metodunu təsvir edirik.
ÜSULLAR: Multipleks analizindən istifadə edərək 4 müxtəlif hədəf uzunluqları (78, 159, 197 və 550 bp) aşkar etdik. Təhlillər 170 bp ilə 3000 bp ölçülərinə parçalanmış insan genomik DNT ilə təsdiq edilmişdir. Texnika 1 ng qədər aşağı DNT miqdarı ilə təsdiqləndi. Parafinə daxil edilmiş ağciyər adenokarsinoma toxumalarından çıxarılmış 12 DNT nümunəsini qiymətləndirdik.
NƏTİCƏLƏR: Bir nümunədə gücləndirilə bilən DNT yox idi. Digər 11 nümunə üçün gücləndirilə bilən DNT fraksiyaları 78-bp fraqmentləri üçün 0,05% ilə 10,1%, daha uzun fraqmentlər üçün isə ≥88041% arasında idi. Zənginləşdirmə və növbəti nəsil ardıcıllığı üçün dörd nümunə seçilmişdir. Ardıcıllıq məlumatlarının keyfiyyəti DNT-nin bütövlüyü testinin nəticələrinə uyğun idi. Konkret olaraq, aşağı bütövlükdə olan DNT daha aşağı əhatə dairəsi və vahidlik səviyyəsi ilə ardıcıllıq nəticələri verdi və daha yüksək səviyyələrdə yalançı-müsbət variantlara sahib oldu.
NƏTİCƏLƏR: DNT-keyfiyyət analizlərinin inkişafı tədqiqatçılara nümunələri aşağı seçməyə və ya daha çox DNT-ni emal etməyə imkan verəcək ki, qiymət və səyin mümkün olan ən yüksək səmərəliliyi ilə etibarlı genom ardıcıllığına nail olsun, həmçinin qiymətli nümunələrin israfını minimuma endirsin.


İddialar

1. Ən azı bir hədəf nuklein turşusu molekulunun tədqiqi üçün metod, aşağıdakılardan ibarətdir:

(a) ən azı bir şablon nuklein turşusu molekulu, primer cütü və polimerazı ehtiva edən nuklein turşusu nümunəsindən ibarət reaksiya qarışığının təmin edilməsi, burada adı çəkilən primer cütünün qeyd olunan şablon nuklein turşusu molekulu ilə ardıcıl tamamlayıcılığı var və burada adı çəkilən primer cütü məhdudlaşdırıcı elementdən ibarətdir. primer və artıq primer (b) sözügedən reaksiya qarışığının sözügedən şablon nuklein turşusu molekulunun gücləndirici məhsulu kimi ən azı bir hədəf nuklein turşusu molekulunu və sözügedən məhdudlaşdırıcı primer əldə etmək üçün kifayət olan şərtlər altında nuklein turşusunun gücləndirilməsi reaksiyasına məruz qalması. ən azı bir hədəf nuklein turşusu molekulu sözügedən məhdudlaşdırıcı primerdən (c) sözügedən reaksiya qarışığını (i) müxtəlif fərdi ünvanlı yerlərdə qeyd olunan substratın səthinə hərəkətsizləşdirilmiş çoxlu zondlardan ibarət substrata malik olan sensor massivi ilə təmasda saxlamaqdan ibarətdir, burada qeyd olunan zondlar sözügedən məhdudlaşdırıcı primer ilə ardıcıl tamamlayıcılığa malikdir və qeyd olunan limiti tuta bilir ing primer və (ii) qeyd olunan ünvanlı yerlərdən ən azı bir siqnalı aşkar etmək üçün konfiqurasiya edilmiş detektorlar sırası, burada qeyd olunan ən azı bir siqnal sözügedən məhdudlaşdırıcı primerin qeyd olunan çoxlu sayda zonddan (d) istifadə edərək, qeyd olunan məhdudlaşdırıcı primerin bağlanmasının göstəricisidir. Sözügedən nuklein turşusunun gücləndirilməsi reaksiyası zamanı birdən çox vaxt nöqtəsində bir və ya bir neçə qeyd olunan ünvandan ən azı bir siqnalı aşkar etmək üçün detektorlar sırası və (e) sözügedən məhdudlaşdırıcı primer bağlanmasının göstəricisi olan qeyd olunan ən azı bir siqnal əsasında sözügedən hədəf nuklein turşusu molekulunun aşkarlanması qeyd olunan çoxsaylı probların sözügedən fərdi probu ilə.

2. İddia 1-in metodu, burada qeyd olunan ən azı bir siqnal sözügedən zondların sözügedən məhdudlaşdırıcı primerə bağlanması zamanı istehsal olunur.

3. İddia 1-in metodu, burada sözügedən reaksiya qarışığı müxtəlif nuklein turşusu ardıcıllığına malik olan çoxlu məhdudlaşdırıcı primerlərdən ibarətdir və sözügedən zondlar qeyd olunan məhdudlaşdırıcı primerlərin çoxluğuna xüsusi olaraq bağlanır.

4. İddia 1-in metodu, burada sözügedən reaksiya qarışığı sözügedən reaksiya qarışığını saxlamaq və qeyd olunan zondların sözügedən məhdudlaşdırıcı primerə bağlanmasına icazə vermək üçün konfiqurasiya edilmiş reaksiya kamerasında təmin edilir.

5. İddia 1-in metodu, bundan əlavə, sözügedən zondların sözügedən məhdudlaşdırıcı primerlə bağlanma sürətini təhlil edərək, qeyd olunan ən azı bir şablon nuklein turşusu molekulunun orijinal konsentrasiyası ilə bir çox zaman nöqtələrində aşkar edilmiş ən azı bir siqnalın əlaqələndirilməsini əhatə edir.

6. 1-ci bəndin metodu, burada qeyd olunan zondlar oliqonukleotidlərdir.

7. İddia 1-in metodu, burada sözügedən hədəf nuklein turşusu molekulu fərdi zondla hibridləşdirildikdə saç tıxacının ilgəsi əmələ gətirir.

8. İddia 1-in üsulu, burada sözügedən sensor massivi ən azı 100 inteqrasiya edilmiş sensordan ibarətdir.

9. İddia 1-in metodu, burada qeyd olunan ən azı bir siqnal enerji qəbuledicisi ilə enerji donoru arasında qarşılıqlı əlaqənin göstəricisi olan optik siqnaldır.

10. İstem 9-un metodu, burada sözügedən enerji qəbuledicisi qeyd olunan artıq primer və/və ya sözügedən məhdudlaşdırıcı primerlə birləşdirilir.

11. İstem 9-un metodu, burada sözügedən enerji qəbuledicisi sözügedən hədəf nuklein turşusu molekuluna birləşdirilir.

12. İstem 9-un metodu, burada sözügedən enerji qəbuledicisi söndürücüdür.

13. İstem 9-un metodu, burada sözügedən enerji donoru flüorofordur.

14. İddia 1-in metodu, burada qeyd olunan ən azı bir siqnal elektrod və redoks etiketi arasında qarşılıqlı əlaqənin göstəricisi olan elektrik siqnalıdır.

15.14-cü bəndin metodu, burada sözügedən redoks etiketi qeyd olunan artıq primer və/və ya sözügedən məhdudlaşdırıcı primerlə birləşdirilir.

16. İstem 14-ün metodu, burada sözügedən redoks etiketi qeyd olunan hədəf nuklein turşusu molekuluna birləşdirilir.

17. 1-ci bəndin metodu, burada (d) fona nisbətən qeyd olunan ən azı bir siqnalda artımın ölçülməsini əhatə edir.

18. 1-ci bəndin metodu, burada (d) fona nisbətən qeyd olunan ən azı bir siqnalın azalmasının ölçülməsini əhatə edir.

19. 1-ci bəndin metodu, burada sözügedən hədəf nuklein turşusu molekulu ən azı təxminən 90% həssaslıqla aşkar edilir.

20. İddia 1-in metodu, burada sözügedən hədəf nuklein turşusu molekulundan ibarət sözügedən reaksiya qarışığı sözügedən sensor massivi ilə maye təmasda olarkən qeyd olunan ən azı bir siqnal aşkar edilir.

21. Ən azı bir hədəf nuklein turşusu molekulunun təhlili üçün sistem, aşağıdakılardan ibarətdir:

(a) ən azı bir şablon nuklein turşusu molekulunu ehtiva edən nuklein turşusu nümunəsindən, sözügedən şablon nuklein turşusu molekulunu tamamlayan ardıcıllığa malik primer cütündən və sözügedən primer cütünün məhdudlaşdırıcı primerdən ibarət olduğu polimeraza malik reaksiya qarışığından ibarət reaksiya kamerası və sözügedən reaksiya qarışığından ibarət sözügedən reaksiya kamerası sözügedən reaksiya qarışığı üzərində nuklein turşusunun gücləndirilməsi reaksiyasını asanlaşdırmaq üçün konfiqurasiya edilmiş, adı çəkilən şablon nuklein turşusunun gücləndirilməsi məhsulu kimi ən azı bir hədəf nuklein turşusu molekulu (b) sensor massivi. (i) ayrı-ayrılıqda ünvanlana bilən müxtəlif yerlərdə sözügedən substratın səthinə hərəkətsizləşdirilmiş çoxlu zondlardan ibarət bir substratdan ibarətdir ki, burada qeyd olunan zondlar qeyd olunan məhdudlaşdırıcı primerlə ardıcıl tamamlayıcı xüsusiyyətlərə malikdir və sözügedən məhdudlaşdırıcı primeri və (ii) bir sıra detektorları tuta bilir. qeyd olunan ünvanlı yerlərdən ən azı bir siqnal aşkar etmək üçün konfiqurasiya edilmişdir, burada deyilən a ən azı bir siqnal qeyd olunan məhdudlaşdırıcı primerin sözügedən çoxlu zondlardan ibarət fərdi zondla və (c) sözügedən sensor massivinə qoşulmuş və (i) sözügedən reaksiya qarışığını sözügedən nuklein turşusunun gücləndirilməsi reaksiyasına məruz qoymaq üçün proqramlaşdırılmış kompüter prosessoru ilə bağlanmasının göstəricisidir. (ii) sözügedən nuklein turşusunun gücləndirilməsi reaksiyası zamanı birdən çox vaxt nöqtəsində qeyd olunan ünvanlı yerlərin birindən və ya bir neçəsindən ən azı bir siqnal aşkar edin.

22. 1-ci bəndin metodu, burada (b) sözügedən şablon nuklein turşusu ilə ardıcıl tamamlayıcılığa malik olan çoxlu hədəf nuklein turşusu molekullarının yaradılmasını əhatə edir.

23. 22-ci bəndin metodu, burada sözügedən detektorlar massivi adı çəkilən ünvanlı yerlərdən çoxlu siqnalları aşkar etmək üçün konfiqurasiya edilir, burada qeyd olunan çoxlu siqnalların hər biri sözügedən çoxlu zondların fərdi zondu ilə sözügedən məhdudlaşdırıcı primerin bağlanmasının göstəricisidir.

24. 23-cü bəndin metodu, burada (d) qeyd olunan çoxsaylı vaxt nöqtələrində qeyd olunan ünvanlı yerlərdən çoxlu siqnalları aşkar etmək üçün detektorların sözügedən massivindən istifadə edilməsini əhatə edir, burada qeyd olunan çoxlu siqnalların hər biri sözügedən məhdudlaşdırıcı primerin bir ilə bağlanmasının göstəricisidir. qeyd olunan çoxlu zondların fərdi zondu.

25. 1-ci bəndin metodu, burada (e) sözügedən məhdudlaşdırıcı primerin eyniləşdirilməsini əhatə edir.


Videoya baxın: DNA ve Genetik Kod. 2021 LGS Kampı (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Mukus

    Həm də sonsuzluğa çox uzaq deyil :)

  2. Tautilar

    Bravo, hansı sözlər ..., parlaq bir fikir

  3. Armando

    Olduqca doğru! Mənə yaxşı bir fikir kimi görünür. Mən səninlə razıyam.

  4. Chess

    Hmm ... lazımlı olacaq ...

  5. Fakih

    Səhvini etiraf edirsən.

  6. Ashquar

    Bu da belə olur :)

  7. Armaan

    Nə deyirsən

  8. Reece

    I can't join the discussion right now - very busy. Osvobozhus - necessarily their observations.

  9. Atwell

    Bu çox yaxşı fikir məqsədyönlü olmalıdır



Mesaj yazmaq