Məlumat

16.11: DNT ardıcıllığı - Biologiya

16.11: DNT ardıcıllığı - Biologiya



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

1990-cı illərə qədər DNT-nin ardıcıllığı (DNT ardıcıllığının oxunması) nisbətən bahalı və uzun bir proses idi. Fred Sanger bu gün geniş şəkildə istifadə edilən insan genomunun ardıcıllaşdırılması layihəsi üçün istifadə edilən sekvensləşdirmə metodunu inkişaf etdirdi (Şəkil 1).

Sangerin işinin nəticəsi olan DNT ardıcıllığını oxuma texnikasını izah edən videoya baxmaq üçün bu sayta daxil olun.

Metod dideoksi zəncirinin kəsilməsi metodu kimi tanınır. Ardıcıllıq metodu zəncirvari terminatorların, dideoksinukleotidlərin (ddNTP) istifadəsinə əsaslanır. Dideoksinukleotidlər və ya ddNTPS-lər deoksinukleotidlərdən beş karbonlu şəkərdə sərbəst 3′ OH qrupunun olmaması ilə fərqlənir. Artan bir DNT zəncirinə bir ddNTP əlavə edilərsə, zəncir daha da uzadılmır, çünki başqa bir nukleotid əlavə etmək üçün lazım olan sərbəst 3′ OH qrupu mövcud deyil. Dezoksiribonukleotidlərin dideoksinukleotidlərə əvvəlcədən müəyyən edilmiş nisbətindən istifadə etməklə müxtəlif ölçülü DNT fraqmentləri yaratmaq mümkündür.

Ardıcıllaşdırılacaq DNT nümunəsi yüksək temperatura qədər qızdırılaraq denatürasiya edilir və ya iki zəncirlə ayrılır. DNT bir primer, DNT polimeraza və bütün dörd nukleotidin (A, T, G və C) əlavə olunduğu dörd boruya bölünür. Dörd borunun hər birinə əlavə olaraq hər bir boruya dörd dideoksinukleotiddən biri məhdud miqdarda əlavə edilir. Əlavə edilmiş ddNTP-yə uyğun olaraq borular A, T, G və C kimi etiketlənir. Aşkarlama məqsədləri üçün dörd dideoksinukleotidin hər biri fərqli bir flüoresan etiket daşıyır. Zəncirin uzanması flüoresan dideoksi nukleotidi daxil edilənə qədər davam edir, bundan sonra heç bir uzanma baş vermir. Reaksiya bitdikdən sonra elektroforez aparılır. Hətta tək bir baza uzunluğu fərqi də aşkar edilə bilər. Ardıcıllıq lazer skanerindən oxunur. DNT ardıcıllığı üzrə işinə görə Sanger 1980-ci ildə kimya üzrə Nobel mükafatı aldı.

Artıq qeyd edildiyi kimi, gel elektroforez (Şəkil 2) müxtəlif ölçülü DNT fraqmentlərini ayırmaq üçün istifadə edilən bir texnikadır. Adətən gel agaroza adlı kimyəvi maddədən hazırlanır. Agaroza tozu buferə əlavə edilir və qızdırılır. Soyuduqdan sonra gel məhlulu tökmə qabına tökülür. Gel bərkidikdən sonra DNT gelə yüklənir və elektrik cərəyanı tətbiq olunur. DNT xalis mənfi yükə malikdir və mənfi elektroddan müsbət elektroda doğru hərəkət edir. Elektrik cərəyanı DNT-nin ölçüsünə görə ayrılmasına kifayət qədər vaxt verilir; ən kiçik fraqmentlər quyudan (DNT-nin yükləndiyi yerdən) ən uzaqda, daha ağır molekulyar çəki fraqmentləri isə quyuya ən yaxın olacaq. DNT ayrıldıqdan sonra gel onu görmək üçün DNT-yə xas boya ilə boyanır.

Sangerin genom ardıcıllığı insan genomlarını sürətli bir sürətlə və aşağı qiymətə ardıcıllıqla sıralamaq yarışına gətirib çıxardı ki, bu da tez-tez bir günlük ardıcıllıqla 1000 dollar adlandırılır. Burada Sürətlə Sıralama animasiyasına baxaraq daha çox məlumat əldə edin.

Neandertal genomu: necə əlaqəliyik?

Neandertal genomunun ilk qaralama ardıcıllığı Richard E. Green et al. 2010-cu ildə.[1] Neandertallar müasir insanların ən yaxın əcdadlarıdır. Onların təxminən 30.000 il əvvəl fosil qeydlərindən yoxa çıxmadan əvvəl Avropa və Qərbi Asiyada yaşadıqları bilinirdi. Qrin komandası dünyanın hər yerindən seçilmiş 40.000 illik fosil qalıqlarını tədqiq etdi. Sümüklərin kövrək təbiəti və ağır mikrob çirklənməsi səbəbindən nümunənin hazırlanması və DNT ardıcıllığının son dərəcə mürəkkəb vasitələrindən istifadə edilmişdir. Tədqiqat zamanı alimlər təxminən dörd milyard baza cütünü ardıcıllıqla sıralaya biliblər. Neandertal ardıcıllığı dünyanın hər yerindən indiki insanların ardıcıllığı ilə müqayisə edildi. Ardıcıllığı müqayisə etdikdən sonra tədqiqatçılar Neandertal genomunun Afrikadakı insanlara nisbətən Afrikadan kənarda yaşayan insanlarla 2-3 faiz daha çox oxşarlığa malik olduğunu müəyyən ediblər. Mövcud nəzəriyyələr bütün müasir insanların Afrikadakı kiçik bir əcdad əhalisinə aid edilə biləcəyini irəli sürsə də, Neandertal genomundan əldə edilən məlumatlar bu fikirlə ziddiyyət təşkil edə bilər. Qrin və həmkarları həmçinin Avropa və Asiyadakı insanlar arasında digər müasir insan ardıcıllıqlarından daha çox Neandertal ardıcıllığına bənzəyən DNT seqmentlərini kəşf etdilər. Başqa bir maraqlı müşahidə, neandertalların Çin və ya Fransadan olanlarla olduğu kimi Papua Yeni Qvineyadan olanlarla da yaxın qohum olması idi. Bu təəccüblüdür, çünki Neandertal fosil qalıqları yalnız Avropa və Qərbi Asiyada yerləşir. Çox güman ki, Avropalılar, Şərqi Asiyalılar və Papua Yeni Qvineyalıların fikir ayrılığından əvvəl müasir insanlar Afrikadan çıxdıqları üçün neandertallarla müasir insanlar arasında genetik mübadilə baş verib.

İndiki insanların təkamülü zamanı bir neçə gen neandertallardan dəyişmiş kimi görünür. Bu genlər kəllə quruluşunda, maddələr mübadiləsində, dəri morfologiyasında və koqnitiv inkişafda iştirak edir. Xüsusi maraq doğuran genlərdən biri də RUNX2, müasir insanlarda və neandertallarda fərqlidir. Bu gen Neandertallarda görünən ön sümük, zəng formalı qabırğa qəfəsi və diş fərqlərindən məsuldur. Təkamüllə dəyişikliyin olduğu ehtimal edilir RUNX2 müasir insanların mənşəyində mühüm əhəmiyyət kəsb edirdi və bu, kəllə sümüyünə və bədənin yuxarı hissələrinə təsir edirdi.

2011-ci ildə illik TED (Texnologiya, Əyləncə, Dizayn) konfransında Svante Pääbonun Neandertal genomu araşdırmasını izah edən çıxışına baxın.

YouTube elementi mətnin bu versiyasından çıxarılıb. Onu onlayn olaraq burada görə bilərsiniz: pb.libretexts.org/biom1/?p=566



Tək Hüceyrə Sıralaması

00:00:07.14 Salam, mənim adım Eric Chow,
00:00:09.20 və mən San Fransisko Kaliforniya Universitetindənəm.
00:00:12.08 Və bu gün sizə tək hüceyrə sıralaması haqqında danışacağam.
00:00:15.28 Beləliklə, qısa bir kontur.
00:00:18.00 Biz tək hüceyrə ardıcıllığının nə olduğunu əhatə edəcəyik
00:00:20.12 RNT ardıcıllığına böyük diqqət yetirməklə.
00:00:22.11 Biz boşqab əsaslı metodları, mikrofluidik üsulları,
00:00:25.07 kombinator indeksləşdirmə üsulları,
00:00:27.21 və sonra əlaqəsi olmayan digər tək hüceyrə sıralama üsulları haqqında danışın.
00:00:30.28 mütləq RNT ilə əlaqəlidir.
00:00:33.05 Beləliklə, ortaya çıxan böyük bir sual,
00:00:35.15 niyə tək hüceyrə sıralaması edir?
00:00:37.08 Bunun yaxşı bir bənzətməsi bu meyvə smoothie analogiyasıdır.
00:00:40.17 Beləliklə, deyək ki, bir qan nümunəsi ilə işləyirsiniz,
00:00:44.01 və ifadə profilinə nəzər salmaq istəyirsiniz.
00:00:47.08 həmin qan nümunəsində.
00:00:49.03 Beləliklə, qan bir çox müxtəlif hüceyrə növlərinin kompleks qarışığıdır.
00:00:52.03 Sizdə B hüceyrələri, T hüceyrələri, makrofaqlar və neytrofillər var,
00:00:55.14 çoxlu müxtəlif meyvə növlərinin olduğu bir smoothie kimi.
00:00:59.00 Və deyək ki, siz həqiqətən xüsusiyyətləri ilə maraqlanırsınız, deyək ki,
00:01:02.11 moruq və ya portağal.
00:01:04.08 Lakin o moruq və ya portağalı təhlil etmək əvəzinə,
00:01:06.06 siz onu ananas, banan və bir az çiyələk ilə qarışdırırsınız,
00:01:09.20 hamısını birləşdirin,
00:01:11.12 və sonra daddığınız şey budur.
00:01:13.08 Bunu anlamaq çox çətin olacaq
00:01:15.12 o moruqdan hansı dadlar gəlir.
00:01:17.20 Və beləliklə, təhlil etməyə çalışdığınız zaman eyni şey
00:01:20.16 toplu nümunəyə qarşı tək hüceyrədən alınan məlumatlar.
00:01:24.09 Əgər məlumat əldə edə bilsəniz, həqiqətən də faydalıdır
00:01:27.05 xüsusi olaraq ayrı-ayrı hüceyrələrdən,
00:01:29.04 toplu ölçmə aparmaqdan fərqli olaraq.
00:01:32.06 Və tək hüceyrə sıralaması haqqında həqiqətən gözəl bir şey
00:01:34.10 məlumatlarla müəyyən edə bilərsiniz
00:01:37.12 çoxlu müxtəlif hüceyrə növləri.
00:01:39.03 Beləliklə, bu a-nın bir təmsilidir.
00:01:41.08 qan nümunəsindən alınan məlumat dəsti.
00:01:44.17 Və bu halda, minlərlə tək hüceyrə
00:01:47.20 paralel olaraq birlikdə işlənmişdir.
00:01:51.02 Bu göstəricilərin hər biri. fərdi tək hüceyrə transkriptləri
00:01:54.15 ardıcıllıqla və təhlil edildi.
00:01:56.13 Və siz bilirsiniz,
00:01:58.23 İnsan genomunda mövcud olan 20.000 müxtəlif gen.
00:02:02.08 Və beləliklə, məlumatları təsvir etmək həqiqətən çətindir
00:02:04.18 20.000 müxtəlif ölçüdə,
00:02:06.19 buna görə də ümumi bir üsul bunu çökdürməkdir
00:02:09.17 Ölçü azaldılmasından istifadə edərək iki ölçüyə.
00:02:12.00 Və çoxlu müxtəlif üsullar var,
00:02:13.23 bu gün keçə bilməyəcəyimiz,
00:02:15.13 ancaq belə görünən bir süjetlə başa çatacaqsınız,
00:02:17.09 burada hər kiçik nöqtə tək bir hüceyrəni təmsil edir,
00:02:19.20 və bu nöqtələr qruplaşdırılıb,
00:02:22.03 və bir-birinə daha sıx yığılmış hüceyrələr
00:02:25.04 bir-birinə daha çox bənzəyir.
00:02:26.27 Beləliklə, siz bu çoxluqlarla başa çatacaqsınız
00:02:28.26 təmsil olunan müxtəlif hüceyrə qrupları
00:02:31.18 bu süjetdə.
00:02:33.24 Və beləliklə, bunun özü faydalı deyil.
00:02:35.24 Orada fərqli hüceyrə tipləriniz olduğunu söyləyə bilərsiniz,
00:02:37.14 lakin onların nə olduğu barədə heç bir fikriniz yoxdur.
00:02:39.07 Ancaq məlumatı qaza bilərsiniz.
00:02:41.15 Və. məsələn, bu klasterlərin hər birinə girib soruşa bilsəniz,
00:02:43.06 fərqləndirən transkriptlər hansılardır,
00:02:45.23 deyin ki, bu çoxluq yuxarıdakı bu klasterin yanındadır?,
00:02:48.12 və siz bunu müxtəlif genlər üçün edirsiniz,
00:02:50.17 siz bu məlumatı daha sonra təsnif etmək üçün istifadə edə bilərsiniz
00:02:52.28 müxtəlif klasterləri və onları müəyyənləşdirin.
00:02:55.15 Beləliklə, məsələn, mavi rəngdə B hüceyrələriniz var
00:02:57.28 qırmızı, siz CD8 T hüceyrələrini aktivləşdirdiniz
00:03:00.28 Bu bənövşəyi rəngdə dendritik hüceyrələriniz var
00:03:03.15 CD4 monositləri yaşıl rəngdədir
00:03:05.11 Boz rəngli NK hüceyrələri.
00:03:07.25 Və bilirsiniz, siyahı davam edir.
00:03:09.24 Siz çoxlu müxtəlif hüceyrə növlərini müəyyən edə bilərsiniz
00:03:11.25 transkripsiya profillərinə baxaraq
00:03:14.04 həmin klasterlərin hər birində.
00:03:16.17 Beləliklə, əgər siz iBiology-də axın sitometriyasının bəzi videolarına baxmış olsanız,
00:03:20.14 Eyni məlumatı əldə edə biləcəyinizi qeyd edəcəksiniz
00:03:22.14 axın sitometriyasından,
00:03:24.07 bəs niyə tək hüceyrə ardıcıllığı edilir?
00:03:26.01 Bunun bir səbəbi də bu klasterlərin daha da parçalana bilməsidir
00:03:29.22 və həmin genlər tərəfindən təhlil edilir.
00:03:31.14 Və beləliklə, yenə də ölçmələr edə bilərik
00:03:33.22 20.000-ə qədər fərqli şəkildə ifadə olunan genlər
00:03:36.04 mövcud olanlar. nümunələrdə mövcud ola bilər,
00:03:38.20 Axın sitometriyası və kütləvi sitometriya ilə,
00:03:40.20 bir neçə onlarla markerlə məhdudlaşa bilərsiniz,
00:03:42.11 və budur.
00:03:43.26 Və beləliklə, məsələn, bu klasteri parçalayacaq olsaq,
00:03:45.27 və qalan qruplara məhəl qoymayın,
00:03:47.25 və sadəcə bu klasteri təhlil edin
00:03:49.23 və bunu bir az daha fərqləndirməyə çalışın,
00:03:52.15 və məlumatları böyüt və yenidən qruplaşdır,
00:03:54.17 biz o yaşıl klasteri götürə bilərik, daha yaxşı bir ayrılıq əldə etmək üçün yenidən qruplaşdıra bilərik,
00:03:57.27 və sonra soruşun, bunları ayıran genlər hansılardır?
00:04:00.28 Və siz bu prosesi təkrar-təkrar keçə bilərsiniz.
00:04:03.21 Beləliklə, maraqlı bir çoxluq müəyyən etsəniz,
00:04:05.11 bir gen ifadəsi imzasının olub olmadığını görmək üçün aşağı qaza bilərsiniz
00:04:08.17 çoxluq daxilində alt çoxluq üçün xüsusidir.
00:04:11.11 Və bu, həqiqətən tək hüceyrə sıralamasının gücüdür,
00:04:13.27 məlumatların çox yüksək ölçülü oxunuşunu əldə etməyinizdir
00:04:16.24 digər üsullarla əldə edə bilməyəcəyiniz.
00:04:20.04 Və beləliklə, tək hüceyrə sıralama üsullarının çıxışı
00:04:21.26 həqiqətən əhəmiyyətli dərəcədə artdı
00:04:23.26 son on ildə.
00:04:25.12 Beləliklə, əvvəlcə, 2009-cu ildə ilk araşdırma oldu
00:04:27.20 bir hüceyrəni sıraladıqları yerdə,
00:04:30.02 və bu belə idi.
00:04:31.18 Və illər keçdikcə eksponensial artım olduğunu görə bilərsiniz
00:04:33.22 müxtəlif tədqiqatlarda işlənmiş hüceyrələrin sayında,
00:04:37.25 bu dairələrin hər biri ilə
00:04:39.24 fərqli bir nəşr və təhlil edilən hüceyrələrin sayı.
00:04:42.19 Beləliklə, biz istifadə olunan texnikalara baxmağa başlayacağıq,
00:04:45.09 bilirsiniz, haqqında. uhh. bilirsiniz, beş il sonra.
00:04:48.18 əvvəl və daha əvvəl,
00:04:51.03 həqiqətən fərdi hüceyrələri təhlil edən
00:04:53.05 onları bir boşqabın ayrı quyularına ayıraraq,
00:04:54.26 həmin fərdi hüceyrələrin hər birindən kitabxanalar hazırlamaq,
00:04:57.19 və sonra onları sıralamaq.
00:04:59.29 Ən çox yayılmış üsul bu lövhə əsaslı SMART-seq texnikası idi.
00:05:03.03 Və bu texnikada siz axın sitometrindən istifadə edirsiniz,
00:05:05.16 və siz maraqlandığınız hüceyrələri sıralayırsınız,
00:05:07.09 96 və ya 384 quyu boşqabının hər quyusuna bir hüceyrə.
00:05:10.17 Siz o hüceyrəni parçalayırsınız və sonra edirsiniz
00:05:13.01 SMART-seq-stil kitabxana hazırlığından istifadə edərək əks transkripsiya reaksiyası.
00:05:16.13 Və bu kitabxana hazırlama üsulu ilə,
00:05:18.21 sizdə oliqo-dT var
00:05:21.09 Bu, əks transkripsiya reaksiyasına səbəb olacaq
00:05:23.13 poliadenilləşmiş mRNA-lardan kənar.
00:05:26.23 Bu oliqo-dT ucunda bir qolu var.
00:05:29.08 Və əks transkripsiya prosesi zamanı,
00:05:31.12 DNT RNT-dən [şablon] istifadə edərək hazırlanır.
00:05:35.20 Və sonunda, müəyyən tərs transkriptazlarla,
00:05:38.15 Onlar bir neçə şablon olmayan C əsasını əlavə edəcəklər.
00:05:40.12 Və bu C əsasları birlikdə istifadə olunur
00:05:43.02 şablon açarı oliqosu ilə
00:05:45.06 sonunda bu G-ləri var.
00:05:46.21 Beləliklə, bu şablon açarı oliqosu, üstündə,
00:05:49.08 bu şablonlaşdırılmamış C-lərə hibridləşir
00:05:52.01 əlavə edildi,
00:05:53.20 və əks transkriptaz bu şablon keçid oliqosundan istifadə edə bilir
00:05:55.18 daha çox polimerləşmə üçün şablon kimi.
00:06:00.08 Və sonunda bir cDNA ilə bağlanırsınız
00:06:02.15 hər iki ucunda PCR tutacaqları olan.
00:06:06.03 Bunlar gücləndirməyə məruz qalır
00:06:08.02 hər cDNA-nın çoxlu nüsxəsini əldə etmək üçün,
00:06:10.23 və sonra bu, nümunə hazırlığına keçir.
00:06:13.27 tamamlamaq üçün bir DNT kitabxanası hazırlama üsulu
00:06:17.01 kitabxanaya hazırlıq prosesi.
00:06:18.18 Və burada təsvir edilmişdir.
00:06:20.11 Ən çox istifadə edilən bu Nextera DNT kitabxanası hazırlama üsuludur,
00:06:23.03 burada gücləndirilmiş cDNA-nız olacaq
00:06:26.05 Nextera transposazı cDNA-nı daha kiçik bitlərə parçalayacaq
00:06:30.15 qismən Illumina adapterlərini əlavə edin
00:06:32.09 və sonra PCR vasitəsilə,
00:06:34.01 siz bu materialı gücləndirirsiniz
00:06:36.00 və kitabxanaya hazırlıq prosesini tamamlayın.
00:06:38.24 Və beləliklə, bu üsullarla,
00:06:41.12 bir neçə yüz emal edə bilərsiniz,
00:06:43.08 bəlkə bir neçə min nümunə
00:06:45.18 çox iş ilə,
00:06:47.19 çünki hər bir hüceyrəni emal edirsiniz
00:06:49.28 boşqab quyusunun ayrı bir borusunda.
00:06:51.23 Beləliklə, bunun üçün çoxlu pipetləmə tələb olunur,
00:06:53.11 çox əl işi,
00:06:54.28 və olduqca bahalı idi,
00:06:56.26 çünki siz əslində ayrı bir nümunə edirsiniz.
00:06:58.25 Hər bir hüceyrə üçün DNT kitabxana nümunəsinin hazırlanması.
00:07:00.16 Beləliklə, bir neçə il əvvəl,
00:07:02.12 Bu prosesi paralelləşdirən bir neçə üsul ortaya çıxdı,
00:07:05.18 müxtəlif texnikalardan faydalanmaq
00:07:07.29 ki, biz bundan sonra gedəcəyik.
00:07:09.21 Və əhatə edəcəyimiz ilk metod DropSeq üsuludur.
00:07:11.09 Beləliklə, bu, mikrofluidiklərdən və ya mahiyyətcə istifadə edən bir üsuldur.
00:07:16.17 Çox, çox kiçik həcmli damlacıqların yaradılmasının müxtəlif üsulları
00:07:20.15 və bu damcıların içərisində molekulyar biologiya edir.
00:07:24.10 Və bu üsulda bir çipiniz var,
00:07:26.13 sol tərəfdən axan muncuqların olduğu yerdə,
00:07:28.25 hüceyrələr bu ilk qovşaqdan axacaq,
00:07:32.11 və buna görə də onlar bir-birinə qarışacaqlar.
00:07:34.08 Növbəti qovşaqda içərinizdə axan neft var.
00:07:36.18 Və bu yağ bu sulu fazaya səbəb olacaq
00:07:39.17 çimdikləmək və emulsiya yaratmaq.
00:07:42.02 Və sistemin işləmə üsuluna görə,
00:07:45.06 sonunda çoxlu damlacıqlarla dolaşırsan.
00:07:48.14 Bu damcıların çoxu boş olacaq.
00:07:50.12 Bəzi damcılar bir muncuq ehtiva edir
00:07:52.00 bəzi damlacıqlarda hüceyrə olacaq
00:07:53.26 və kiçik bir fraksiya həm muncuq, həm də hüceyrəni ehtiva edəcəkdir.
00:07:57.04 Və burada təsvir edilmişdir.
00:07:58.18 Və yenə də bu, damlacıqların kiçik bir azlığıdır
00:08:01.28 həm bir hüceyrə, həm də bir muncuq ehtiva edəcək.
00:08:06.14 Bu muncuqların özəlliyi budur
00:08:07.00 Bu muncuqların hər birində çoxlu var
00:08:09.11 Səthdə barkodlu oliqo-dT oliqos.
00:08:11.27 Bu, RNT-ni tutmağa imkan verəcək
00:08:13.27 birgə kapsullaşdırılmış hüceyrələrin hər birindən gəlir.
00:08:16.05 Və yenə də bu muncuqların hər biri
00:08:18.07 bütün digər muncuqlardan fərqli bir barkoda malikdir.
00:08:21.07 Və beləliklə, nə baş verir ki, tutulacaqsınız
00:08:23.14 RNT-nin muncuqlara.
00:08:25.04 Bundan sonra siz boncukları aşağı çəkin
00:08:27.09 həll yolu,
00:08:28.26 və siz əks transkripsiya reaksiyası edirsiniz,
00:08:31.01 yenidən bu şablon dəyişdirmə prosesi ilə.
00:08:32.23 Və bu nöqtədə,
00:08:34.17 hər bir hüceyrənin bütün məzmunu bir muncuqla yapışdırılır,
00:08:37.24 və bu cDNA-ların hamısı eynidir
00:08:41.06 barkod, çünki onlar eyni muncuqla bağlanırlar
00:08:43.13 və yenə də o muncuqda çoxlu oliqo-dT var
00:08:45.23 orada eyni barkod ilə.
00:08:48.20 Siz cDNA-nı gücləndirə bilərsiniz,
00:08:50.04 daha əvvəl müzakirə etdiyimiz kimi,
00:08:51.28 PCR istifadə edərək.
00:08:53.13 Və sonra bir DNT sıralama kitabxanası hazırlaya bilərsiniz
00:08:55.18 bu, bütün bu transkriptlərin uclarını ardıcıllıqla sıralayacaq.
00:08:58.27 Və biz bu transkriptlərin hər birini işarələdiyimiz üçün
00:09:01.14 hüceyrəyə uyğun gələn barkod ilə,
00:09:05.00 mahiyyətcə biz emal edə bildik
00:09:07.28 bir neçə boruda paralel olaraq çoxlu, çoxlu hüceyrələr.
00:09:11.03 Və bu üsulla siz minlərlə, hətta on minlərlə,
00:09:14.21 nümunələrin və ya hüceyrələrin tək nümunədə,
00:09:17.21 yalnız bir neçə boru istifadə edərək.
00:09:19.15 Beləliklə, ehtiyacınız olmayacaq,
00:09:21.13 bilirsiniz, 30.000 müxtəlif quyu,
00:09:22.27 inanılmaz zəhmətkeş və maddi-texniki baxımdan.
00:09:24.25 Bunu etmək demək olar ki, mümkün deyil.
00:09:27.08 Beləliklə, bu, uhhdan çıxan bir kommersiya səyi idi.
00:09:30.21 akademik laboratoriyadan çıxan.
00:09:33.18 Və bu metodla bağlı bir məsələ odur ki,
00:09:36.13 yenə də o damcıların əksəriyyətində heç bir şey yoxdur.
00:09:39.00 Və bu damlacıqların yalnız kiçik bir hissəsi
00:09:41.17 həm bir hüceyrə, həm də bir muncuq ehtiva edir.
00:09:42.27 Və bunun səbəbi, çünki
00:09:45.01 bu hüceyrələr və muncuqlar təsadüfi
00:09:47.05 o damlacıqlara daxil olun.
00:09:49.09 Beləliklə, belə bir şey görünür,
00:09:51.13 boş olan çoxlu arakəsmələrə malik ola bilərsiniz,
00:09:53.22 boz,
00:09:55.02 və sonra bir kəsriniz var
00:09:57.22 tək boncuk və ya tək hüceyrə.
00:09:59.04 Və sonra, təsadüfi təbiətə görə,
00:10:01.04 quyuların və damcıların çoxu olmasa da
00:10:05.07 hüceyrə və ya muncuqla doldurulmuş,
00:10:06.28 bəzi damlalarınız var
00:10:09.12 iki və ya daha çox muncuq ehtiva edən,
00:10:11.16 və ya iki və ya daha çox hüceyrə.
00:10:13.23 Beləliklə, bir şey edə bilərsiniz
00:10:15.12 burada hüceyrələrin və muncuqların konsentrasiyasını artırırsınız
00:10:17.15 ki, daha çox tək damcı əldə edəsiniz.
00:10:20.11 tək hüceyrə və ya tək muncuq ehtiva edən damcılar,
00:10:22.19 lakin ikiqat nisbətiniz çox artır.
00:10:25.09 Bunu ardıcıllıq məlumatlarından həqiqətən fərqləndirmək üçün heç bir yol yoxdur.
00:10:29.01 Beləliklə, bunun səbəbi,
00:10:30.23 bu DropSeq texnikası ilə,
00:10:32.11 həm hüceyrələr, həm də muncuqlar
00:10:34.14 aşağı konsentrasiyada yüklənir --
00:10:36.17 bu çoxluqların qarşısını almaq üçün.
00:10:38.17 Beləliklə, DropSeq çıxdıqdan təxminən bir və ya iki il sonra,
00:10:42.01 10X Genomics, kommersiya şirkəti,
00:10:44.08 çox, çox oxşar bir üsul ortaya çıxdı.
00:10:46.24 Əgər ona nəzər salsanız, son dərəcə oxşar görünür.
00:10:48.26 Yan tərəfdən axan barkodlu muncuqlarınız var
00:10:51.16 hüceyrələr və reagentlər daxil olur
00:10:53.05 və sonra bunlar qarışır
00:10:55.08 və sonra yağ emulsiya yaratmaq üçün daxil olur.
00:10:57.08 Ancaq bu şəkildə görə bilərsiniz,
00:11:00.00 Bu damcıların əksəriyyətində muncuq var,
00:11:01.24 və bunun səbəbi mühəndislik edə bilmələridir
00:11:03.28 həm onların mikrofluidik cihazı, həm də bu muncuqlar
00:11:06.12 belə ki, bilirsiniz ki, damcıların 90%-dən çoxu
00:11:08.02 bir muncuq və yalnız bir muncuq ehtiva edir.
00:11:10.26 Beləliklə, bu, səmərəliliyi çox artırdı,
00:11:13.24 çünki onlar muncuqları yükləməli deyillər
00:11:15.17 aşağı konsentrasiyada.
00:11:17.07 Bu texnika ilə başqa bir fərq budur
00:11:19.13 Bu damlacıqların içərisində sadəcə tuta bilməzsiniz,
00:11:21.17 ancaq siz də əks transkripsiyadan keçirsiniz
00:11:23.07 bu damcıların içində,
00:11:24.22 başqa bir fərqdir.
00:11:26.29 Beləliklə, bu əks transkripsiya reaksiyasının sonunda,
00:11:29.26 emulsiyanı qırırsınız,
00:11:31.15 cDNA-nı götürürsünüz və onu gücləndirirsiniz
00:11:33.18 tək boruda,
00:11:35.06 və sonra ardıcıllıq kitabxananızı qurursunuz,
00:11:36.23 yenə bir boruda,
00:11:38.09 və sonra bunu ardıcıllıqla sıralaya bilərsiniz.
00:11:40.27 Və platformada neçə hüceyrə yüklədiyinizdən asılı olaraq,
00:11:44.13 25.000-ə qədər xana sıralaya bilərsiniz
00:11:47.01 bu çipin hər bir zolağında.
00:11:49.25 Və bu çipin 8 zolağı var,
00:11:51.25 potensial olaraq, bir çipdə,
00:11:53.23 200.000 hüceyrə emal edə bilərsiniz.
00:11:55.17 Və çipdəki bu proses əslində cəmi 15 dəqiqə çəkir.
00:11:58.27 Buradakı aşağı axın hissələri günün təxminən yarısını çəkir,
00:12:02.00 lakin bu olduqca təsir edicidir
00:12:03.27 əslində bir uzun gündə,
00:12:06.03 eyni anda 200.000 hüceyrə emal edə bilərsiniz --
00:12:08.24 və ya daha çox çip işlədirsinizsə.
00:12:12.14 Beləliklə, bu prosesi paralelləşdirmək üçün başqa bir üsul
00:12:15.16 tək hüceyrə ardıcıllığı kitabxanalarının yaradılması
00:12:17.16 mikro quyulardan istifadə etməkdir.
00:12:19.00 Beləliklə, bir emulsiya istifadə etmək əvəzinə
00:12:20.29 hüceyrələrinizi bir-birindən ayırmaq üçün,
00:12:22.14 həqiqətən çox kiçik bir quyularınız var.
00:12:26.00 Beləliklə, bu quyuların hər biri yalnız ola bilər
00:12:28.10 diametrdə bir neçə onlarla bir neçə yüz mikron.
00:12:33.20 Beləliklə, bir neçə açıq mənbə və həmçinin kommersiya platforması var
00:12:36.28 bunu edənlər, məsələn SeqWell, Celsee,
00:12:39.21 və biri BD-dən.
00:12:42.25 Və mahiyyətcə, bunların işləmə üsulu budur ki, sizdə bu mikro quyu sırası var,
00:12:46.21 və minlərlə, on minlərlə ola bilər,
00:12:48.23 və ya hətta bir çipdə yüz minlərlə quyu.
00:12:50.15 Barkodlu DNT muncuqlarını qoyursunuz
00:12:53.20 -- bu halda bunlar mavi rəngdədir.
00:12:55.00 Və bu muncuqlar mühəndisdir
00:12:57.06 ki, çox vaxt quyuya bir və yalnız bir muncuq alırsınız.
00:13:00.04 Onlar bu sıra mikroquyuları örtürlər.
00:13:02.23 Və sonra hüceyrələrinizi üstünə tətbiq edirsiniz.
00:13:05.05 Bu halda, Celsee-dən bu nümunədə,
00:13:07.06 bu hüceyrələr qırmızı rənglə etiketlənir ki, onları görə biləsiniz.
00:13:10.01 Və yenə də bu quyuların əksəriyyətində,
00:13:11.26 Sizdə mövcud olan mavi rəngli muncuq var.
00:13:14.10 Və sonra hüceyrələr yalnız quyulara yerləşəcəklər.
00:13:17.18 Və sonra lizisdən keçirsən
00:13:20.02 və bütün enzimatik reaksiyalar
00:13:22.24 Bu hüceyrələrin hər birindən RNT-ni işarələmək
00:13:25.10 unikal barkod ilə,
00:13:26.21 və hüceyrələr yaratmaq üçün bu kitabxananın hazırlanması prosesindən keçin.
00:13:29.08 Və beləliklə, nə var. nümunə kitabxanalar yaratmaq.
00:13:33.00 Və bu üsullardan bəziləri ilə yenə quyuları var,
00:13:36.04 yüz minlərlə quyusu olan,
00:13:37.26 və potensial olaraq bir çipdə bir milyon və ya daha çox quyu
00:13:40.13 çoxlu, çoxlu nümunələri emal edə biləsiniz.
00:13:42.29 Beləliklə, keçən il ərzində,
00:13:45.21 olan bir kağız çıxdı
00:13:47.29 Tədqiqatda bir milyondan çox hüceyrə işlənmişdir.
00:13:49.15 Və bu [kağız] əslində
00:13:52.05 kombinator indeksləşdirmə adlı metoddan istifadə etdi,
00:13:54.07 bundan sonra keçəcəyəm.
00:13:56.03 Beləliklə, kombinator indeksləşdirmə ilə,
00:13:58.05 baş verənlər, bir çox yerində reaksiyalar edirsiniz,
00:14:01.02 bu o deməkdir ki, siz hüceyrəni bölmə kimi istifadə edirsiniz.
00:14:04.07 Və siz fərdi hüceyrələrlə işləmirsiniz
00:14:06.28 istənilən anda,
00:14:08.14 lakin siz barkodlamanın bir çox dövrünü edirsiniz
00:14:10.21 və qarışdırma
00:14:13.29 belə ki, bu kombinator barkodları yaradasınız
00:14:15.15 bu, tək hüceyrə məlumatı yaratmağa imkan verəcəkdir.
00:14:21.16 Və bu, akademik laboratoriyadan bir üsuldur
00:14:24.10 Vaşinqton Universitetində
00:14:26.04 kombinator indeksləşdirmə metodundan istifadə etdi.
00:14:28.02 Və bunun işləmə üsulu odur ki, sağda sabit hüceyrələriniz var
00:14:31.28 -- deməli, bunlar sabit və keçirici hüceyrələrdir
00:14:34.02 belə ki, reagentlər hüceyrələrin içərisinə və xaricə axsın.
00:14:36.18 Bəlkə bir neçə onlarla hüceyrəni sıralayırsınız
00:14:39.02 bu 96 quyu boşqabının hər quyusuna.
00:14:40.18 Beləliklə, tək hüceyrələrlə məşğul deyilsiniz.
00:14:41.29 Plitənin hər quyusunda hələ də çoxlu hüceyrələr var.
00:14:44.24 Siz əks transkripsiya reaksiyasına məruz qalırsınız
00:14:47.10 barkodlu oliqo-dT ilə.
00:14:48.28 Beləliklə, bu quyuların hər birində,
00:14:50.12 fərqli bir barkodlu oliqo-dT var.
00:14:53.05 Beləliklə, hər bir quyudakı bütün hüceyrələr
00:14:55.03 bu addımda eyni barkoda sahib olacaq, tamammı?
00:14:57.03 Və bu burada bu rənglərlə təsvir edilmişdir.
00:14:59.15 Beləliklə, deyək ki, siz qoyursunuz.
00:15:01.05 üç quyudan çıxarıldı,
00:15:03.01 və beləliklə, bilirsiniz,
00:15:04.28 Yaşıl, mavi və ya qırmızı olan bir çox hüceyrə.
00:15:07.14 Siz bu hüceyrələri birləşdirirsiniz və ya qarışdırırsınız,
00:15:09.23 və siz onları təsadüfi olaraq yenidən paylayırsınız
00:15:12.12 96 quyu boşqabının yeni quyu dəstinə.
00:15:14.24 Bu addımda cDNA-nızı götürürsünüz
00:15:17.29 bu hüceyrələrin hər birində mövcuddur,
00:15:19.12 və sonra fərqli bir reaksiya verirsiniz
00:15:21.27 sonra ikinci bir barkod əlavə edəcək.
00:15:24.10 Yenə də hər quyudakı hüceyrələrin hər biri
00:15:27.10 eyni ştrix kodu alacaq,
00:15:28.28 lakin bu quyuda hər hüceyrənin şansı var
00:15:31.18 bu ilk boşqabda fərqli bir quyudan gəldi.
00:15:34.22 Və beləliklə, barkodların bu birləşməsi ilə
00:15:36.22 -- bilirsiniz, 96 və 96 ilə,
00:15:38.13 təxminən 10 000 kombinasiyanız var --
00:15:39.29 Əgər siz yalnız minə yaxın hüceyrəni ardıcıllıqla tərtib edirsinizsə,
00:15:42.04 iki hüceyrəyə sahib olmaq şansınız çox yüksək deyil
00:15:45.17 eyni barkod ilə.
00:15:48.22 Və bu, mahiyyətcə, son kitabxanaya bənzəyir.
00:15:51.25 RT ştrix kodunuz və ya əks transkripsiya barkodunuz var.
00:15:56.07 Həmçinin iki fərqli barkodunuz var
00:15:57.29 Illumina adapterlərində olan
00:15:59.19 bu da istifadə edilə bilər.
00:16:00.25 Beləliklə, siz potensial olaraq üç dəfəyə qədər barkod edə bilərsiniz
00:16:02.25 bu üsulla.
00:16:04.09 Və bu texnikanın gücü
00:16:06.21 Bu səviyyələrin daha çoxunu əlavə etdiyiniz zaman həqiqətən gəlir.
00:16:09.12 Beləliklə, məsələn, yenidən,
00:16:11.17 iki dəst 96 quyu boşqabınız olsaydı
00:16:13.23 və siz onları barkod edirdiniz,
00:16:15.17 demək olar ki, 10.000 kombinasiyanız var.
00:16:17.06 Əgər 384 quyulu lövhələrlə işləyəcəksinizsə,
00:16:18.24 demək olar ki, 150.000 kombinasiyanız olacaq.
00:16:22.23 Və hər addımda bir neçə 384 quyulu lövhə ilə işləmək əslində gülünc deyil.
00:16:25.29 Beləliklə, hər addımda dörd 384 quyu boşqabınız varsa
00:16:29.17 -- və ya 1536. hər addımın birləşməsi --
00:16:32.08 təxminən 2,4 milyon müxtəlif kombinasiya yarada bilərsiniz.
00:16:35.02 Beləliklə, bu, yalnız iki tur ştrix kodlaşdırma ilə.
00:16:37.10 Əgər üç raund ştrix kodlama etsəniz
00:16:39.08 və başqa bir barkod əlavə edin
00:16:40.28 -- bu halda, üçüncü səviyyə üçün 96 və ya 384 --
00:16:45.05 həqiqətən rəqəmləri miqyaslandırırsınız.
00:16:47.04 Beləliklə, bu halda,
00:16:48.24 Mən əslində bu rəqəmləri milyonlarla təmsil edirəm,
00:16:50.26 rəqəmlər bu diaqrama sığmaq üçün çox böyük olacağı üçün.
00:16:53.15 Və beləliklə, bu halda, əgər etsəniz
00:16:56.02 üç səviyyəli 96 x 96 x 96,
00:16:58.11 təxminən bir milyon kombinasiyanız olacaq.
00:17:00.05 Əgər 384 x 384 x 384 etdinizsə,
00:17:03.08 demək olar ki, 60 milyon kombinasiyanız olacaq.
00:17:05.25 Beləliklə, bunun tərəzisinin səbəbi budur
00:17:07.25 həqiqətən çox yaxşı,
00:17:09.11 xüsusilə üçüncü səviyyəli barkod əlavə etsəniz.
00:17:13.09 Beləliklə, dişliləri bir az dəyişdirərək,
00:17:14.26 biz əsasən RNT ardıcıllığına diqqət yetirdik,
00:17:16.23 lakin başqa şeylər etmək mümkündür
00:17:18.29 tək hüceyrə sıralama platformaları ilə.
00:17:20.23 Və bunlardan biri zülalların miqdarını təyin etməkdir.
00:17:22.28 Beləliklə, soruşa bilərsiniz,
00:17:24.15 DNT ardıcıllığı ilə bir zülalın miqdarını necə təyin edə bilərəm?
00:17:26.15 Və istifadə olunan üsul,
00:17:29.11 CITE-seq adlanır,
00:17:31.01 antikorlarınız var
00:17:33.16 maraq zülallarına bağlanacaq.
00:17:35.03 Beləliklə, bu antikora bənzəyir
00:17:36.20 axın təhlili üçün istifadə edə biləcəyiniz,
00:17:38.15 ancaq flüoroforu birləşdirmək əvəzinə
00:17:40.24 axınla oxunacaq,
00:17:42.15 və ya CyTOF üçün izotop,
00:17:44.21 bir DNT ştrix kodunda birləşirsiniz.
00:17:47.06 Beləliklə, DNT ştrix kodunun sonunda PCR qolu var,
00:17:50.12 hansı antikora bağlı olduğunu bildirən barkod
00:17:53.00 -- yenə də, bu sadəcə DNT ardıcıllığının ştrix kodudur,
00:17:56.00 sizin A, C, G və T-ləriniz
00:17:57.20 hər bir antikor üçün unikal ardıcıllığınız var --
00:17:59.28 və sonra polyA quyruğu.
00:18:02.09 Beləliklə, bu polyA quyruğu bu antikor ardıcıllığına imkan verəcəkdir
00:18:04.22 tək hüceyrə sıralama üsulları ilə tutulmaq,
00:18:06.21 və sonra barkodu oxuya bilərsiniz,
00:18:09.28 mahiyyətcə a. transkript kimi
00:18:11.27 bu antikorun neçə nüsxəsini sizə xəbər verəcəkdir
00:18:14.01, bilirsiniz, həmin hüceyrəyə bağlı idilər.
00:18:16.09 Beləliklə, bu müqayisə edilən bəzi məlumatlardır
00:18:18.28 Zülal analizi ilə RNT analizi,
00:18:20.24 sadəcə insan və siçan hüceyrələrindən istifadə edir
00:18:23.11 bir növ qarışdırılmış,
00:18:24.26 metodun işlədiyini sizə göstərmək üçün.
00:18:27.11 Hal-hazırda antikor panelləri var
00:18:29.12 -- təxminən 100 və ya daha çox antikor --
00:18:31.15 tək hüceyrə ardıcıllığı ilə birlikdə istifadə edə bilərsiniz.
00:18:34.19 Və burada gözəl şey budur
00:18:36.23 Siz yalnız protein bolluğu əldə edə bilməzsiniz
00:18:38.14 antikorlarınız olan zülallar üçün,
00:18:40.15 ancaq transkripsiya oxunuşunu da əldə edirsiniz
00:18:42.16 genlərin də açılıb-söndürülməsi baxımından
00:18:45.15 bu hüceyrələrin hər birində.
00:18:46.28 Beləliklə, bu cür a alırsınız. multi-omomik yanaşma,
00:18:48.08 burada həm zülal, həm də RNT təhlil edə bilərsiniz.
00:18:53.05 Beləliklə, sizə əvvəllər söylədiyim bir məsələ
00:18:54.24 bu üsullardan bəziləri ilə
00:18:56.12 bu çoxlu saydadır.
00:18:58.06 Beləliklə, yalnız muncuq çoxalmasına məhəl qoymuruq
00:19:00.06 və yalnız hüceyrə çoxlularına diqqət yetirin,
00:19:01.28 Bu, məhdud olmağımızın bir səbəbidir
00:19:04.02 in terms of the number of cells that come out of these.
00:19:07.12 both these microfluidic and microwell platforms.
00:19:09.27 And again, you don't want to load very many cells
00:19:13.00 because you want most of these droplets
00:19:15.05 to be empty so that you avoid these doublets.
00:19:17.08 So, again, if you were to increase the concentration of cells
00:19:21.13 that you load in to maximize the number of singlets
00:19:23.17 -- so, for instance, over here you have four singlets --
00:19:28.03 you do increase the rate of your doublets
00:19:30.24 -- so, these increase here and here.
00:19:32.19 Now, if there's some way to identify these doublets,
00:19:34.28 you could remove them computationally
00:19:37.02 from your data analysis.
00:19:38.18 And so, for instance,
00:19:40.00 if you had two differentially labeled samples
00:19:42.24 that you pooled together,
00:19:44.14 and then you flowed into your microfluidic device
00:19:46.25 at a high concentration,
00:19:48.11 you would get multiplets.
00:19:49.24 But if the multiplets came from two different cell types,
00:19:51.08 and you can identify that,
00:19:52.26 you can exclude those from analysis,
00:19:54.12 and then actually get more single cells for the same cost.
00:19:59.06 And so, one.
00:20:01.06 the first strategy to do this was a method called demuxlet.
00:20:03.16 And this is multiplexing by genotype.
00:20:05.22 So, this group, here at UCSF,
00:20:07.20 was working with different patient samples,
00:20:10.04 and with different humans,
00:20:12.02 we all have different DNA sequences.
00:20:14.05 And some of these sequences are found in our transcripts,
00:20:17.03 and those can be detected by single cell RNA sequencing.
00:20:20.18 And so, in this example,
00:20:22.10 they had eight different donors that had different genotypes,
00:20:25.03 depicted by different colors here,
00:20:26.22 that got combined and then run
00:20:28.25 in a single cell sequencing platform.
00:20:30.13 So, you get a whole bunch of single cell data.
00:20:32.11 And if you take a look at each individual cell
00:20:34.27 -- let's take a look at one cell, here --
00:20:36.19 we see a certain genotype in the transcripts,
00:20:38.26 and we can match that with one of the original donors.
00:20:42.03 So, we can tell that this sample.
00:20:44.16 or, this cell came from this patient sample.
00:20:46.02 And you can do this for most of the cells in.
00:20:48.27 in the. in the data set.
00:20:50.22 What's really cool about this method
00:20:53.14 is that if you have a doublet
00:20:55.06 -- two cells in a single droplet --
00:20:56.26 and you have eight different samples,
00:20:58.22 chances are those two cells came from different samples,
00:21:01.16 and they'll have two different genotypes.
00:21:03.26 So, if you analyze the data within those cells,
00:21:06.09 if you see the presence of two different genotypes,
00:21:08.15 you know that's a doublet,
00:21:09.28 and we can remove those from analysis.
00:21:11.20 So, this allows you to bump up that concentration
00:21:13.19 and get more single cell data
00:21:15.18 for the same cost.
00:21:17.18 So, if you're not working with genetically distinct individuals,
00:21:20.06 this method won't work,
00:21:21.26 and so there are a couple of non-genetic strategies
00:21:23.27 that came out.
00:21:25.08 The first one was from the same group that developed CITE-seq.
00:21:27.08 They realized that if they used an antibody
00:21:29.08 that binds to some type of universal surface antigen on cells,
00:21:34.14 they could take that antibody
00:21:36.17 and split it up into a couple of different aliquots.
00:21:38.17 And with each aliquot,
00:21:40.07 you can give it a different barcode.
00:21:42.15 Then, you can take your different samples
00:21:44.11 and then add them to these different aliquots of antibodies
00:21:47.18 to allow them to bind.
00:21:49.07 At that point, you can pool them all together,
00:21:51.03 run them in the single cell sequencing platform,
00:21:53.15 and you look for the presence
00:21:55.17 of which barcoded antibody showed up.
00:21:58.13 And this will allow you to set.
00:22:00.10 assign each of these individual cells
00:22:02.10 to a particular starting sample,
00:22:03.22 because you knew which barcode.
00:22:05.11 the antibody used for each sample.
00:22:08.04 And again, this also has the advantage
00:22:10.09 where, if you have two or more cells in a droplet,
00:22:12.08 you can detect those,
00:22:14.00 because you'll see two different barcode sequences
00:22:16.08 assigned to a single droplet.
00:22:18.02 And you can exclude that from analysis.
00:22:20.06 More recently,
00:22:22.05 in collaboration with other group at UCSF,
00:22:23.22 we developed a method that is a universal method
00:22:25.27 that uses lipidated DNA
00:22:28.13 that embeds into the membranes of cells.
00:22:30.00 So, this doesn't depend on the surface antigen.
00:22:32.01 It just depends on an accessible membrane
00:22:35.17 that this barcoding DNA molecule can insert into.
00:22:39.23 So, it inserts into the membrane of cells.
00:22:41.26 You can insert a different barcode into each pool of samples,
00:22:44.21 and then pool them together.
00:22:46.08 In this case, we were able to barcode
00:22:48.15 96 different samples, pool them together,
00:22:49.28 and we can identify all the singlets and the doublets.
00:22:52.19 And you can see all the different 96 samples
00:22:55.11 represented here, in this plot.
00:22:58.21 So, in conclusion,
00:23:00.27 there are actually many different types of single cell sequencing.
00:23:03.13 I've only focused on RNA today,
00:23:04.26 but there's DNA, there's protein,
00:23:06.24 there's chromatin accessibility.
00:23:08.11 And many, many new methods coming out,
00:23:10.09 you know, every few weeks.
00:23:11.24 So, it's an exciting field to be in.
00:23:14.08 Single cell sequencing also generates
00:23:17.02 high dimensional data,
00:23:18.26 especially if you're looking at RNA,
00:23:20.26 because you're probing the quantity, or the expression level,
00:23:22.24 of all 20,000 different genes that can be expressed in cells.
00:23:24.26 And so, this can reveal biology
00:23:27.00 that's hidden from lower dimensional techniques.
00:23:29.14 So, single cell sequencing does have some disadvantages.
00:23:31.29 It is lower throughput and more expensive
00:23:33.22 compared to flow cytometry and mass cytometry.
00:23:35.08 You know, with those methods,
00:23:37.02 you can easily analyze hundreds of thousands
00:23:39.00 or millions of cells at a time.
00:23:40.27 And I also didn't mention single cell analysis
00:23:44.02 that doesn't use sequencing.
00:23:45.21 So, there are microscopy-based techniques
00:23:47.29 that are out there as well
00:23:49.23 that have some very interesting, you know, properties,
00:23:52.09 including the ability to give you some spatial information.
00:23:54.21 So, if you're working with tissues,
00:23:57.19 with most single cell sequencing techniques right now,
00:23:59.12 you have to dissociate those tissues
00:24:01.04 into a single cell suspension
00:24:02.29 and then run them.
00:24:04.11 So, you lose a lot of that spatial context
00:24:05.29 that might be important for the biological question
00:24:07.22 that you're trying to answer.
00:24:09.15 And some of these microscopy methods
00:24:11.09 can offer you some additional information that might be valuable.
00:24:14.14 And so, again, thank you for watching today.
00:24:16.27 And I hope you enjoyed this video.

  • Educators of H. School / Intro Undergrad
  • tələbə
  • Educators of Adv. Undergrad / Grad
  • Researcher
  • Educators

Microdeletion associated with the integration process of hepatitis B virus DNA

Hepatitis B virus (HBV) DNA is often found in integrated form in hepatocellular carcinomas (HCC) and in non-cancerous liver cells of chronic carriers of HBV. However, the process of integration has not been well understood. Analyses of integrant DNA was expected to give clues. However, the majority of the integrants are products of multistep rearrangements following integrations, and analysis of randomly selected samples do not give clues for understanding the process of primary integrant formation. Therefore, one must select an appropriate integrant(s) that has a simple structure. We surveyed a collection of integrants prepared from many HCC's, and found one integrant that has the simplest structure so far studied: The viral genome is almost complete, is joined to cellular DNA using the cohesive end of the viral DNA, and furthermore, the "left" and "right" flanking cellular DNA's are almost contiguous. Analysis of the unoccupied sites in cellular DNA showed that, although almost contiguous, it has generated a microdeletion (15 base pairs) in the target sequence. This target sequence has a short region of homology to the sequence in the viral genome located close to the junction. One integrant with strikingly similar features has been reported independently. Two similar, but not identical cases from literatures could be added to this category. Therefore, the integrants with these properties may represent a unique category among those prepared from hepatocellular carcinomas. Based on these findings, we propose that this integrant represents the primary product of integration, and discuss the intermediate acting in the process of integration.


16.11: DNA Sequencing - Biology

All the cells of one organisms share the genome. However, during development, some cells develop into skin cells while others develop into muscle cells. How can the same genetic instructions result in two different cell types in the same organism? Thoroughly explain your answer.

  1. When lactose and glucose are present in the medium, transcription of the lac operon is induced.
  2. When lactose is present but glucose is absent, the lac operon is repressed.
  3. Lactose acts as an inducer of the lac operon when glucose is absent.
  4. Lactose acts as an inducer of the lac operon when glucose is present.
  1. Mutation in structural genes will stop transcription.
  2. Mutated lacY will produce an abnormal β galactosidase protein.
  3. Mutated lacA will produce a protein that will transfer an acetyl group to β galactosidase.
  4. Transcription will continue but lactose will not be metabolized properly.

In some diseases, alteration to epigenetic modifications turns off genes that are normally expressed. Hypothetically, how could you reverse this process to turn these genes back on?

  1. In new seedlings, histone acetylations are present upon cold exposure, methylation occurs.
  2. In new seedlings, histone deacetylations are present upon cold exposure, methylation occurs.
  3. In new seedlings, histone methylations are present upon cold exposure, acetylation occurs.
  4. In new seedlings, histone methylations are present upon cold exposure, deacetylation occurs.
  1. Mutated promoters decrease the rate of transcription by altering the binding site for the transcription factor.
  2. Mutated promoters increase the rate of transcription by altering the binding site for the transcription factor.
  3. Mutated promoters alter the binding site for transcription factors to increase or decrease the rate of transcription.
  4. Mutated promoters alter the binding site for transcription factors and thereby cease transcription of the adjacent gene.
  1. The transcription rate would increase, altering cell function.
  2. The transcription rate would decrease, inhibiting cell functions.
  3. The transcription rate decreases due to clogging of the transcription factors.
  4. The transcription rate increases due to clogging of the transcription factors.

The wnt transcription pathway is responsible for key changes during animal development. Based on the transcription pathway shown below. In this diagram, arrows indicate the transformation of one substance into another. Square lines, or the lines with no arrowheads, indicate inhibition of the product below the line. Based on this, how would increased wnt gene expression affect the expression of Bar-1?

  1. RBPs can bind first to the RNA, thus preventing the binding of miRNA, which degrades RNA.
  2. RBPs bind the miRNA, thereby protecting the mRNA from degradation.
  3. RBPs methylate miRNA to inhibit its function and thus stop mRNA degradation.
  4. RBPs direct miRNA degradation with the help of a DICER protein complex.
  1. UV rays can alter methylation and acetylation of proteins.
  2. RNA binding proteins are modified through phosphorylation.
  3. External stimuli can cause deacetylation and demethylation of the transcript.
  4. UV rays can cause dimerization of the RNA binding proteins.
  1. Phosphorylation of proteins can alter translation, RNA shuttling, RNA stability or post transcriptional modification.
  2. Phosphorylation of proteins can alter DNA replication, cell division, pathogen recognition and RNA stability.
  3. Phosphorylated proteins affect only translation and can cause cancer by altering the p53 function.
  4. Phosphorylated proteins affect only RNA shuttling, RNA stability, and post-translational modifications.
  1. UV rays could cause methylation and deacetylation of the genes that could alter the accessibility and transcription of DNA.
  2. The UV rays could cause phosphorylation and acetylation of the DNA and histones which could alter the transcriptional capabilities of the DNA.
  3. UV rays could cause methylation and phosphorylation of the DNA bases which could become dimerized rendering no accessibility of DNA.
  4. The UV rays can cause methylation and acetylation of histones making the DNA more tightly packed and leading to inaccessibility.
  1. These drugs maintain the demethylated and the acetylated forms of the DNA to keep transcription of necessary genes “on”.
  2. The demethylated and the acetylated forms of the DNA are reversed when the silenced gene is expressed.
  3. The drug methylates and acetylates the silenced genes to turn them back “on”.
  4. Drugs maintain DNA methylation and acetylation to silence unimportant genes in cancer cells.
  1. Understanding gene expression patterns in cancer cells will identify the faulty genes, which is helpful in providing the relevant drug treatment.
  2. Understanding gene expression will help diagnose tumor cells for antigen therapy.
  3. Gene profiling would identify the target genes of the cancer-causing pathogens.
  4. Breast cancer patients who do not express EGFR can respond to anti-EGFR therapy.
  1. Personalized medicines would vary based on the type of mutations and the gene’s expression pattern.
  2. The medicines are given based on the type of tumor found in the body of an individual.
  3. The personalized medicines are provided based only on the symptoms of the patient.
  4. The medicines tend to vary depending on the severity and the stage of the cancer.
  • You are here:  
  • Ev
  • Andover biologiya bölməsi dərslikləri
  • Openstax Biology for AP Courses (textbook for Bio58x sequence)
  • Bio581
  • Chapter 16 Gene Regulation
  • 16.11 Critical Thinking Questions

Bu mətn AP Kursları üçün Openstax Biologiyasına əsaslanır, Böyük Əməyi olan Müəlliflər Julianne Zedalis, La Jolla, CA-dakı Yepiskop Məktəbi, John Eggebrecht, Cornell Universitetinin töhfə verən müəllifləri Yael Avissar, Rhode Island College, Jung Choi, Corciya Texnologiya İnstitutu, Jean DeSaix , Şimali Karolina Universiteti Chapel Hill, Vladimir Jurukovski, Suffolk County Community College, Connie Rye, East Mississippi Community College, Robert Wise, Wisconsin University, Oshkosh

Bu iş heç bir əlavə məhdudiyyət olmadan Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 Unported License ilə lisenziyalaşdırılıb.


Müzakirə

A fundamental assumption underlying the use of cultured cells in biological research is that cell lines retain and mimic the molecular characteristics of the tissue from which they were derived, allowing observations made in vitro to be directly translated to an in vivo context. Cell lines have been extensively used to investigate the normal and pathogenic role of DNA methylation, particularly its dysregulation in cancer [20]. However, over 20 years ago, Antequera, Boyes and Bird [11] noted aberrant de novo CGI methylation at 14 loci in mouse NIH3T3 and L cells, which was interpreted as cell culture-induced changes in DNA methylation. Subsequently, using restriction landmark genomic scanning, a comparison of six human ES cell lines derived and cultured in various conditions showed widespread inter-line differences in DNA methylation, which could be further altered by changing serum levels in culture [43]. Mouse ES cells are derived from E3.5 blastocyst cells that are globally hypomethylated, but once grown in serum they become hypermethylated [44]. In analogous observation to our adaptation experiment, there is a massive deposition of DNA methylation during ES cell establishment in serum [45]. However, cultivating ES cells in the presence of small molecule inhibitors (2i medium) leads to reversible global hypomethylation [46]. Molecular analysis suggests there is a high degree of similarity between the hypomethylated E3.5 blastocyst cells and 2i ES cells, as well as between hypermethylated E6.5 blastocyst cells and serum ES cells [44,47,48]. This demonstrates that the correct culturing conditions can lead to ‘epigenetic’ equivalence between cells propagated in culture and their embryo/animal counterparts.

Restriction landmark genomic scanning was also used to reveal that CGI hypermethylation was 5-fold to 90-fold more common in cancer cell lines compared with primary malignancies, and that approximately 60% of the loci methylated in cancer cell lines were never methylated in the 114 primary malignancies studied [49]. A recent large-scale genome-wide study of DNA methylation re-emphasized the effect of cell culture on the epigenome [50]. Using reduced-representation bisulfite sequencing, Varley and colleagues [50] found that normal human tissues and primary cell lines form two separate and robust clades based on genome-wide DNA methylation patterns. That is, the methylome of primary cell lines from multiple different tissues more closely resembled each other than the normal tissues from which they were derived [50]. How and why cell lines accumulate CGI methylation in culture is unknown, but in their seminal paper in 1990, Antequera, Boyes and Bird proposed that the observed CGI hypermethylation was consistent with a loss of DNA demethylase activity in culture, 20 years prior to the characterization of a robust mammalian demethylation pathway based on 5hmC/Tet [11].

By studying the establishment of MEFs in culture we found that adaptation by mammalian cells resulted in a rapid and comprehensive re-programming of the transcriptome and epigenome, indicative of an altered cell state. Re-programming involved almost complete loss of 5hmC in cultured cells, consistent with loss of a methylcytosine dioxygenase activity in culture in the absence of Tet enzymatic activity, 5hmC lost by dilution during each round of DNA replication cannot be restored. This loss was observed genome-wide and was not restricted to particular genomic compartments, again consistent with a general loss of Tet-mediated demethylase activity. In the absence of a demethylase activity, de novo methylation events cannot be erased and would result in progressive accumulation of methylation at methylation-prone loci, which over time is likely (perhaps through spreading) to affect gene expression, imprinting, chromatin structure and genome stability. Indeed, even at the early time-points assayed here, we observed increased CGI methylation at several loci known to be prone to hypermethylation in cancer, such as the Hox clusters [51,52].

The epigenetic remodeling we observed was paralleled by extensive gene expression changes in culture. Up-regulated genes were linked to cell adhesion and extracellular matrix organization, possibly reflecting adaptation to growth on a two-dimensional plastic surface. However, a recent study has suggested that these genes are regulated directly by Tet1 in MEFs [37]. A highly significant down-regulation of genes involved in a variety of epigenetic processes, including nucleosome assembly, chromatin modification, DNA methylation and DNA demethylation, were also observed. Bunlara daxildir Tet1 and three components of the PRC2 complex, which deposits the repressive histone modification H3K27me3, namely Ezh2, Suz12Rbbp4. Tet1 directly interacts with Suz12 in mouse ES cells, and loss of Suz12 results in a global loss of 5hmC in mouse ES cells similar in scale to that reported here [35]. It is tempting to speculate that CGIs marked by H3K27me3 are actively maintained in an unmethylated state by Tet1 and may thus be particularly susceptible to aberrant methylation upon loss of the Tet1 interaction with the PRC2 complex, or methylcytosine dioxygenase activity in culture.

A 50% reduction in Tet1 gene expression is unlikely to fully account for the significant global loss of 5hmC observed, particularly as expression of Tet2Tet3 were relatively unchanged in culture. All Tet enzymes require 2-oxoglutarate and vitamin C as cofactors to efficiently catalyze hydroxylation of canonical 5mC to 5hmC [24]. Most cell culture media do not contain vitamin C, and several recent studies have shown that addition of vitamin C increases Tet enzyme activity and 5hmC levels in MEFs and mouse ES cells [23,37]. We observed a partial yet substantial recovery of global 5hmC levels upon addition of 1,000 μM vitamin C during establishment of MEF cultures. This result suggests that the observed loss of 5hmC results from both a reduction of Tet1 levels and general loss of Tet activity due to limiting co-factors. Significantly, addition of vitamin C to mouse ES cells resulted in greater Tet-dependent demethylation at methylated CGIs, resulting in a more blastocyst-like state in the ES cells [23]. This finding, in combination with our observations reported here, suggest that optimization of culture media with regard to enzymatic co-factors may ameliorate the scale of epigenetic changes occurring in culture. The identification of suitable substrates for culturing cells, probably in three dimensions, will also lead to improvements in generating in vitro equivalents of in vivo cellular morphologies. As vitamin C is an essential co-factor for a growing list of enzymes, including the epigenetic modifiers JHDM1B, KDM3 and KDM4, and regulates hypoxic inducible factor (HIF)-1 activity through asparagine and proline hydroxylases and is also critical to collagen metabolism, caution may need to be applied when assessing the effect of vitamin C on individual molecular pathways such as DNA demethylation [53-55].

Our findings reinforce a growing realization that cell line models of human diseases, particularly cancer, can be poor surrogates for many aspects of in vivo biology, as emphasized in a recent study of multi-drug resistance genes in ovarian cancer, in which no correlation in expression was found between primary ovarian cancer samples and established cancer cell lines [56]. Though novel, the findings presented here do not address cause and effect of the observed reprogramming during the process of adaptation of cells to culture. That is, are the observed changes driven by epigenome dynamics or is the epigenome responding to changes in transcription factor networks? Are the observed gains in 5mC due to loss of 5hmC or independent of this deficit? A system in which Tet1 expression can be induced during the process of adaptation to culture would help to address some of these questions. It is worth noting that Tet1 can replace Oct4 to initiate somatic cell reprogramming in conjunction with Sox2, Klf4, and c-Myc [57]. This requires an active form of the enzyme that results in altered DNA methylation and hydroxymethylation profiles in the derived pluripotent cells.


Next-generation DNA Sequencing Techniques and Applications

Thursday, 31 May 2012 at 11:45

Add to Calendar ▼ 2012-05-31 11:45:00 2012-05-31 12:45:00 Europe/London Next-generation DNA Sequencing Techniques and Applications SELECTBIO [email protected]

Next generation DNA sequencing techniques are opening fascinating opportunities in life sciences. Commercially available DNA sequencing platforms, Single molecule Real-time methods, Nanopores (also Graphene), as well as other techniques under development are described and applications in bio-medical fields discussed.


Fon

Repetitive sequences present many difficulties for genome sequencing and analysis. The presence of large numbers of repeats often confounds sequence assembly, especially if the repeats are long and highly conserved. The presence of low copy-number repeats can also confound assembly, especially for whole-genome shotgun sequencing projects [1]. Once a genome has been assembled, repeats take on a new and more important role involving their biological function. Certain classes of repeats, such as transposons, perform a function by allowing mobile elements to move around a genome. Other classes belong to less well-defined categories with respect to their role, though they may be even more ubiquitous. Repetitive sequences appear to dominate the centromeres of many eukaryotes [2], and telomeric and subtelomeric repeats extend for thousands or tens of thousands of nucleotides at the ends of chromosomes. These repeats also appear elsewhere in the genome, for reasons as yet unknown. For these and other reasons, it is critical to both the assembly and analysis of genomic sequences to identify and characterize repetitive sequence elements.

There are numerous computational methods for detecting repeats, in one form or another, in genomic DNA sequences. These include algorithms that locate repeated substrings, including tandem repeats [3,4,5,6], as well as programs for identifying known repeats, such as the widely-used RepeatMasker [7]. RepeatMasker uses a database of known repeat sequences and implements a string-matching algorithm to find copies of those repeats in a new sequence. A more rapid implementation of the same approach is MaskerAid [8], a wrapper for WU-BLAST [9,10] that uses the BLAST engine instead of the CrossMatch algorithm. Most of these tools have some restriction on the maximum length of the input sequence, which limits their use to sequences considerably smaller than the size of a eukaryotic chromosome. Recently, however, new systems based on suffix trees, such as RepeatMatch (based on MUMmer [11]) and REPuter [12,13], have overcome this size limitation, at least for biologically realistic input sizes. Both RepeatMatch and REPuter are highly efficient computational tools that can find all exact repeats in sequences as long as complete eukaryotic chromosomes - 10–100 megabases (Mb). The output of these systems, however, while accurately representing the long list of positions of exact repeats, does not provide any overview or summary of the repetitive structure of the sequence. The REPuter system includes a visualization tool to generate repeat graphs, which are useful for identifying the positions of repeats, but this does not provide an overview of the exact and non-exact repeats in a genome. Figure 1 shows an example of a repeat graph [12] for a short DNA sequence.

Exact repeats. An example sequence of 180 bp and graphical depiction of exact repeats, using minimal repeat length 6 bp. This example shows forward and reverse complemented repeats. In the repeat graph [12], both of the horizontal lines correspond to the example sequence, and diagonal lines connect the two occurrences of each repeat. REPuter includes a visualization tool to provide similar graphics.

Examining the output of REPuter and RepeatMatch for a complete bacterial genome, it quickly becomes obvious that many exact repeats are non-exact copies of one another. Whether a genome is a few or hundreds of megabases in length, the task of recognizing and describing how repeats resemble one another at this scale is too complicated to accomplish manually.

Here we describe a new system for the recognition of repeat classes in genome sequences. This system, RepeatFinder, is freely available from our website [14]. In contrast to approaches that cluster together the results of BLAST searches (for example, Z.H. Bao and S. Eddy, unpublished data) our algorithm uses a comprehensive set of exact repeats as the basis for constructing repeat classes. It relies on the efficient suffix tree data structure for identification of exact repeats, which permits rapid identification of repeat classes even in sequences containing tens of millions of nucleotides. The algorithm does not make any prior assumptions about the number or structure of the classes. At its core is a merging procedure that produces the actual members of each repeat class using merging criteria described below, and it also builds a repeat map of the genome sequence.

We have applied this system to several complete microbial genomes [15,16,17,18,19,20,21], to the complete Arabidopsis thaliana genome [2], and to a large collection of rice bacterial artificial chromosome (BAC) end sequences [22,23]. The results of this analysis are described below. The output of the system gives a clear picture of all repeat classes identified in a genome or a sequence collection. It provides straightforward access to the actual repeat sequences as a multi-fasta file, simple statistical analyses of the results, and a procedure for identifying each class's most representative element. We describe here the computational techniques used in the system and demonstrate its use on several different genome sequences.


Labs and Facilities

Burroughs AM, Kaur G, Zhang D, Aravind L. Novel clades of the hu/ihf superfamily point to unexpected roles in the eukaryotic centrosome, chromosome partitioning, and biological conflicts. Hüceyrə dövrü. 2017, 16(11):1093-1103.

Li J, Bonkowski MS, Moniot S, Zhang D, Hubbard BP, Ling AJ, Rajman LA, Qin B, Lou Z, Gorbunova V, Aravind L, Steegborn C, Sinclair DA. A conserved NAD+ binding pocket that regulates protein-protein interactions during aging. Elm. 2017, 355(6331):1312-1317.

Zhang D, Burroughs AM, Vidal ND, Iyer LM, Aravind L. Transposons to toxins: the provenance, architecture and diversification of a widespread class of eukaryotic effectors. Nuklein turşularının tədqiqi. 2016, 44(8):3513-3533.

Iyer LM, Zhang D, Aravind L. Adenine methylation in eukaryotes: Apprehending the complex evolutionary history and functional potential of an epigenetic modification. BioEssays. 2016, 38(1):27-40.

Burroughs AM, Zhang D, Schäffer DE, Iyer LM, Aravind L. Comparative genomic analyses reveal a vast, novel network of nucleotide-centric systems in biological conflicts, immunity and signaling. Nuklein turşularının tədqiqi.2015, 43(22):10633-10654.

Aravind L, Zhang D, de Souza RF, Anand S, Iyer LM. The natural history of ADP-ribosyltransferases. Mikrobiologiya və İmmunologiyada aktual mövzular. 2015, 384: 3-32.

Aravind L, Burroughs AM, Zhang D, Iyer LM. Protein and DNA modifications: evolutionary imprints of bacterial biochemical diversification and geochemistry on the provenance of eukaryotic epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology.2014, 6(7):a016063.

Zhang D, Iyer LM, Burroughs AM, Aravind L. Resilience of biochemical activity in protein domains in the face of structural divergence. Current Opinion in Structural Biology. 2014, 26:92-103

Pusapati GV 1 , Hughes CE 1 , Dorn KV 1 , Zhang D 1 , Sugianto P, Aravind L, Rohatgi R. EFCAB7 and IQCE regulate hedgehog signaling by tethering the EVC-EVC2 complex to the base of primary cilia. İnkişaf hüceyrəsi. 2014, 28(5):483-496. ( 1 co-first authors)

Iyer LM 1 , Zhang D 1 , de Souza RF, Pukkila PJ, Rao A, Aravind L. Lineage-specific expansions of TET/JBP genes and a new class of DNA transposons shape fungal genomic and epigenetic landscapes. Amerika Birləşmiş Ştatlarının Milli Elmlər Akademiyasının materialları. 2014, 111(5):1676-1683. ( 1 co-first authors)

Iyer LM, Zhang D, Burroughs AM, Aravind L. Computational identification of novel biochemical systems involved in oxidation, glycosylation and other complex modifications of bases in DNA. Nucleic Acids Research. 2013, 41(16):7635-7655.

Zhang D, Iyer LM, He F, Aravind L. Discovery of Novel DENN Proteins: Implications for the Evolution of Eukaryotic Intracellular Membrane Structures and Human Disease. Frontiers in Genetics: Bioinformatics and Computational Biology. 2012, 3:283.

Zhang D, Xi Y, Coccimiglio ML, Mennigen JA, Jonz MG, Ekker M, Trudeau VL. Functional prediction and physiological characterization of a novel short trans-membrane protein 1 as a subunit of mitochondrial respiratory complexes. Physiological Genomics.2012, 44(23):1133-1140.

Zhang D, Aravind L. Novel transglutaminase-like peptidase and C2 domains elucidate the structure, biogenesis and evolution of the ciliary compartment. Hüceyrə dövrü. 2012, 1(20):3861-3875.

Zhang D, Iyer LM, Aravind L. Bacterial GRAS domain proteins throw new light on gibberellic acid response mechanisms. Bioinformatika. 2012, 28(19):2407-2411.

Zhang D, de Souza RF, Anantharaman V, Iyer LM, Aravind L. Polymorphic toxin systems: Comprehensive characterization of trafficking modes, processing, mechanisms of action, immunity and ecology using comparative genomics. Biology Direct.2012, 7:18.

Iyer LM, Zhang D, Rogozin IB, Aravind L. Evolution of the deaminase fold and multiple origins of eukaryotic editing and mutagenic nucleic acid deaminases from bacterial toxin systems. Nuklein turşularının tədqiqi.2011, 39(22):9473-9497.

Zhang D, Iyer LM, Aravind L. A novel immunity system for bacterial nucleic acid degrading toxins and its recruitment in various eukaryotic and DNA viral systems. Nuklein turşularının tədqiqi. 2011, 39(11):4532-4552.

Zhao E, Grey CL, Zhang D, Mennigen JA, Basak A, Chang JP, Trudeau VL. Secretoneurin is a potential paracrine factor from lactotrophs stimulating gonadotropin release in the goldfish pituitary. American Journal of Physiology - Regulatory,Integrative and Comparative Physiology.2010, 299(5):R1290-R1297.

Zhang D, Aravind L. Identification of novel families and classification of the C2 domain superfamily elucidate the origin and evolution of membrane targeting activities in eukaryotes. Gen. 2010, 469(1-2):18-30.

Zhang D, Popesku JT, Martyniuk CJ, Xiong H, Duarte-Guterman P, Yao L, Xia X, Trudeau VL. Profiling neuroendocrine gene expression changes following fadrozole-induced estrogen decline in the female goldfish. Physiological Genomics. 2009, 38(3):351-361.

Zhang D, Xiong H, Mennigen JA, Popesku JT, Marlatt VL, Martyniuk CJ, Crump K, Cossins AR, Xia X, Trudeau VL. Defining global neuroendocrine gene expression patterns associated with reproductive seasonality in fish. PLoS One. 2009, 4(6):e5816.

Xiong H, Zhang D, Martyniuk CJ, Trudeau VL, Xia X. Using generalized procrustes analysis (GPA) for normalization of cDNA microarray data. BMC Bioinformatics. 2008, 9:25.

Zhang D, Xiong H, Shan J, Xia X, Trudeau VL. Functional insight into Maelstrom in the germline piRNA pathway: A unique domain homologous to the DnaQ-H 3'-5' exonuclease, its lineage-specific expansion/loss and evolutionarily active site switch. Biology Direct. 2008, 3:48.


Giriş

Cancer has a significant impact on public health worldwide. One strategy to lower its burden is through cancer screening and early diagnosis. It is well known that patients have a higher cure rate and 5-year survival if diagnosed at early stages [1]. Medical expense increases dramatically with the stage [2, 3]. Tissue biopsy is the most widely-used tool for cancer detection, staging, and prognosis, but sometimes tumor tissue can be difficult to obtain, especially in metastatic diseases like late-stage lung cancer. Moreover, it is unrealistic to use tissue biopsy for cancer screening and early diagnosis when the tumors have not formed yet. Currently, there are some screening methods proved to be useful for cancer prevention. For example, the mammogram is the best way to detect breast cancer Pap test is used for early detection of cervical cancer regular colorectal cancer screening and low-dose computed tomography are recommended to reducing mortality from colorectal cancer and lung cancer, respectively [4]. However, all of these screening methods have limited sensitivity and specificity and are only applicable to a unique cancer type. In order to perform large-scale cancer screening among healthy individuals in the future, a more general and cost-effective approach is needed. In recent years, many scientists and companies have cast their eyes on liquid biopsy [5,6,7,8]. Blood contains many types of biological materials like circulating cells, platelets, extracellular vesicles, mRNA, miRNA, protein, and cell-free DNA (cfDNA) [9]. From the blood of cancer patients, a portion of the cfDNA is released by tumor cells through apoptosis, necrosis, or active release [10], and this DNA is called circulating tumor DNA (ctDNA). The tumor-specific mutations in ctDNA sequence can act as a new type of cancer biomarker and help to identify cancer patients from a group of healthy individuals. Compared to traditional cancer diagnosis using tissue biopsy, liquid biopsy is more feasible and less invasive and is more comprehensive than tissue biopsy to evaluate tumor heterogeneity [11] because all tumor sites will release ctDNA into the blood. Facilitated by the rapid development of next-generation sequencing (NGS) technologies, nowadays, ctDNA sequencing can achieve much higher sensitivity than tissue biopsy and can be designed for different purposes [12].


Ethics declarations

Rəqabət edən maraqlar

A.D.E is cofounder and advisor at GRO Biosciences, Inc, which is using computational protein design and synthetic biology to develop protein therapeutics. A.D.E has filed intellectual property disclosures that reference Compartmentalized Partner Replication: 6761ELL ‘Thermostable reverse transcriptase based on a thermostable DNA polymerase,’ US 15/410, 211, Japan 2018-538718 and EP 17741900.9, filed on 1/19/17 and 7151 ELL ‘A method for screening metabolites and their receptors’ PCT/US2018/037818, filed on 6/15/18.


Videoya baxın: Summativlerin suallarini ve ya cavablarini nece onceden oyrenmek olar.. (Avqust 2022).