Məlumat

İstilik şoku və elektroporasiya

İstilik şoku və elektroporasiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən oliqonukleotidləri daxil etmək üçün E. coli-ni istilik şoku ilə dəyişdirdim (təxminən 50 nt); lakin bu günə qədər apardığım təcrübələrin heç biri müsbət nəticə verməyib. Xüsusilə qısa DNT fraqmentləri üçün kimyəvi çevrilmənin effektivliyini şübhə altına almağa başlayıram. Kimyəvi və elektro transformasiya arasında belə nəzərəçarpacaq fərq varmı?

DÜZENLE: Mən CRISPR massivinin genişləndirilməsini yoxlayıram, ona görə də mənim oliqoslarım protospacer uzunluğuna və quruluşuna malikdir. Mən ilk olaraq Cas1-Cas2 plazmidi ilə transformasiya etdiyim IPTG-induksiya edən T7 olan BL21(DE3) hüceyrələrindən istifadə edirəm. Sonra bu zülalları ifadə etmək, onları bacarıqlı hala gətirmək və yenidən oliqos və eGFP plazmidi ilə (bir növ seçim üçün) transformasiya etmək üçün hüceyrələri induksiya edirəm. Müsbət nəticələri yoxlamaq üçün mən CRISPR massivinin lider-təkrar qovşağını gücləndirirəm və onun uzunluğunu (elektroforez vasitəsilə) inteqranları olmayan adi massivlə müqayisə edirəm.


Potensial müsbət transfeksiyanı necə aşkar edirsiniz? Qısa fraqmentlər düzgün teriar strukturlara malik ola bilər ki, bu da onların gözlədiyinizdən fərqli davranmasına səbəb ola bilər. Həmçinin, qeyri-dairəvi DNT və RNT sağ baş və ya quyruq siqnalları yoxdursa, əksər hüceyrələrdə deqradasiya üçün daha sürətli hədəflənir.

Sualınıza: yaxşı hazırlanmış bakteriyalarla impulslu elektroporasiya (hal, tampon,… ) kimyəvi cəhətdən səlahiyyətli bakteriyalardan adətən 5-100 dəfə daha effektivdir.


Elektroporasiya üçün ligasiya reaksiyasını seyreltin - (18 iyun 2008)

Mən BL21 E.coli üçün elektroporasiyanı 1ul birbaşa ligasiya ilə çox vaxt edirəm, lakin elektroporatorda həmişə yanıb-sönür, ona görə də ligasiya reaksiyasını sulandırmaq vacibdir və onu seyreltməyin ən yaxşı yolu nədir.

Bəli, onunla seyreltin ddH20 10 dəfə və 1ul istifadə edin.

Elektroporasiya çox səmərəli üsuldur (istilik şoku), buna görə də seyreltilmiş bağlama reaksiyasından istifadə problem olmayacaq. Əslində, mənim təcrübəmə görə, bu, səmərəliliyi artırır.

Bəli, onunla seyreltin ddH20 10 dəfə və 1ul istifadə edin.

Elektroporasiya çox səmərəli üsuldur (istilik şoku), buna görə də seyreltilmiş bağlama reaksiyasından istifadə problem olmayacaq. Əslində, mənim təcrübəmə görə, bu, səmərəliliyi artırır.

Fikriniz üçün təşəkkür edirəm bu gün mən seyreltilmiş qarışıq ilə transformasiya etdim və flaş yoxdu və sabah yox yoxlayacam. koloniyadan sizə təşəkkür edirəm

Bəli, onunla seyreltin ddH20 10 dəfə və 1ul istifadə edin.

Elektroporasiya çox səmərəli üsuldur (istilik şoku), buna görə də seyreltilmiş bağlama reaksiyasından istifadə problem olmayacaq. Əslində, mənim təcrübəmə görə, bu, səmərəliliyi artırır.

Fikriniz üçün təşəkkür edirəm bu gün mən seyreltilmiş qarışıq ilə transformasiya etdim və flaş yoxdu və sabah yox yoxlayacam. koloniyadan sizə təşəkkür edirəm

daer mobil sayğacı
Mən xoşbəxt deyiləm, çünki nəzarət boşqabında belə koloniya yoxdur, mən nə edə bilərəm

Təklif. Kiçik milipor filtr kağızını petri qabında dd-suyun üzərinə sürüşdürün və sadəcə bir saat və ya daha çox müddətə 5-10uL bağlama qarışığınızın üzərinə qoyun. Bundan sonra ligasiya qarışığını pipetlə bərpa edin. və çevrilməyə gedin. İndiyə qədər təxmin etdiyiniz kimi prinsip duzsuzlaşdırma üçün "mikro" dializdir.. inşallah işləyir. mənə xəbər ver..

1. Səhv ola biləcək bir neçə başqa şey var, buna görə də digər aspektləri həll etməlisiniz. Bakterial süzgəcdən başlayaraq, media, antibiotiklər, elektroporator, kyuvetlər, inkubasiya müddətləri və s. hər ehtimala.

BL21 suşlarını birbaşa bağlama məhsulu ilə çevirməyə çalışmaq çox pis fikirdir. Əvvəlcə DH5a, DH10B və ya başqa bir klonlama ştamına çevrilməklə, miniprep etməklə və BL21-i plazmid DNT ilə transformasiya etməklə vaxtınıza və kədərinizə qənaət edəcəksiniz. BL21 çox zəif transformasiya səmərəliliyinə malikdir.


Molekulların, membranların və hüceyrə funksiyalarının elektrik şoku və istilik denaturasiyası və oksidləşməsinin bioloji təsiri

Süspansiyonda olan hüceyrələrin intensiv elektrik impulslarına birbaşa məruz qalmasının hüceyrə membranlarına və hüceyrələrin supramolekulyar təşkilatlarına zərər verdiyi və elektrik travması olan xəstələrdə görülən yaralanmalar və gözyaşları kimi makromolekulların denatürasiyası məlumdur. Beləliklə, sistem elektrik zədəsinin biokimyəvi əsaslarını araşdırmaq üçün laboratoriya modeli kimi istifadə edilmişdir. Güclü elektrik nəbzi hüceyrələrə iki əsas təsir göstərə bilər - biri sahə və ya elektrik potensialı, digəri isə cərəyan və ya elektrik enerjisi ilə. Sahənin yaratdığı transmembran potensialı ion kanallarının və ion nasoslarının elektrokonformasiya dəyişikliklərinə səbəb ola bilər və potensial hüceyrə membranının dielektrik gücünü aşdıqda (bir neçə ms impuls eni üçün təxminən 500 mV), elektrokonformasiya zədələri və membran zülallarının və lipid ikiqatlarının elektroporasiyası. Bu hadisələr elektrik cərəyanının membran gözenekli hüceyrələrdən keçməsinə və hüceyrə membranlarının və sitoplazmik məzmunun istiləşməsinə səbəb olur. Hüceyrə membranlarının və sitoplazmatik makromolekulların sonrakı denatürasiyası zülalların və lipidlərin oksidləşməsi də daxil olmaqla bir çox mürəkkəb biokimyəvi reaksiyalara səbəb olur. Qarışıq təsirlər hüceyrələri təmirdən kənarda şikəst edə bilər. Bu ünsiyyət elektrik şokunun istilik təsirlərinə diqqət yetirəcəkdir. Həll olunan fermentlərin və əzələ zülallarının termal denaturasiyası ilə bağlı mövcud biliklərin qısa icmalından sonra bu məqalədə nukleosomlar kimi hüceyrə komponentlərinin və funksiyalarının istilik denaturasiyası, elektron daşıma zənciri və ATP sintetik fermentləri üzrə təcrübələr təsvir olunacaq. mitoxondrial daxili membranlar. Məlumatlar göstərəcək ki, lipidlərin peroksidləşməsi və sonradan hüceyrələrin enerji ötürmə qabiliyyətinin itirilməsi hətta 40 dərəcə C və 45 dərəcə C arasında orta temperaturda da baş verə bilər. Bununla belə, lipidlərin peroksidləşməsinin qarşısı merkaptoetanol, ditiotreitol, və askorbin turşusu. Denatürləşdirilmiş hüceyrə zülallarının və funksiyalarının yenidən aktivləşdirilməsi də mümkün ola bilər və bunun üçün strategiya müzakirə edilir.


İstilik şoku üsulu ilə plazmid DNT-nin E.coli-yə çevrilməsi

Plazmid DNT-nin istilik şoku üsulu ilə E. coli-yə çevrilməsi molekulyar biologiyanın əsas texnikasıdır. Bu, bakteriyaya yad plazmid və ya bağlama məhsulunun daxil edilməsindən ibarətdir. Bu video protokol Genlantis-dən kommersiya baxımından əldə edilən kimyəvi cəhətdən səlahiyyətli bakteriyalardan istifadə edərək ənənəvi transformasiya metodunu təsvir edir. Buzda qısa bir inkubasiyadan sonra kimyəvi cəhətdən səlahiyyətli bakteriya və DNT qarışığı 45 saniyə ərzində 42 dərəcə C-də (istilik şoku) yerləşdirilir və sonra yenidən buza qoyulur. SOC mühiti əlavə edilir və çevrilmiş hüceyrələr 37 dərəcə C-də 30 dəqiqə çalkalanmaqla inkubasiya edilir. Transformasiyanın effektivliyindən asılı olmayaraq koloniyaların təcrid olunmasına əmin olmaq üçün iki miqdarda transformasiya edilmiş bakteriya örtülür. Bu ənənəvi protokol kommersiyada mövcud olan əksər səlahiyyətli bakteriyaları çevirmək üçün uğurla istifadə edilə bilər. Genlantis-dən olan turbosellər, təlimat kitabçasında təsvir edilən yeni 3 dəqiqəlik transformasiya protokolunda da istifadə edilə bilər.


İstilik Şoku Metodundan istifadə edərək Plazmid DNT-nin E. coli-yə çevrilməsi

Plazmid DNT-nin istilik şoku üsulu ilə E. coli-yə çevrilməsi molekulyar biologiyanın əsas texnikasıdır. Bu, bakteriyaya yad plazmid və ya bağlama məhsulunun daxil edilməsindən ibarətdir. Bu video protokol Genlantis-dən kommersiya baxımından əldə edilən kimyəvi cəhətdən səlahiyyətli bakteriyalardan istifadə edərək ənənəvi transformasiya metodunu təsvir edir. Buzda qısa bir inkubasiyadan sonra kimyəvi cəhətdən səlahiyyətli bakteriya və DNT qarışığı 45 saniyə ərzində 42ºC-də (istilik şoku) yerləşdirilir və sonra yenidən buza qoyulur. SOC mühiti əlavə edilir və transformasiya edilmiş hüceyrələr 37°C-də 30 dəqiqə çalkalanmaqla inkubasiya edilir. Transformasiyanın effektivliyindən asılı olmayaraq koloniyaların təcrid olunmasına əmin olmaq üçün iki miqdarda transformasiya edilmiş bakteriya örtülür. Bu ənənəvi protokol kommersiyada mövcud olan əksər səlahiyyətli bakteriyaları çevirmək üçün uğurla istifadə edilə bilər. Genlantis-dən olan turbosellər, təlimat kitabçasında təsvir edilən yeni 3 dəqiqəlik transformasiya protokolunda da istifadə edilə bilər.


Gen köçürmə üsulları: 6 üsul

Bu məqalə gen transferinin altı üsuluna işıq salır. Altı üsul bunlardır: (1) Transformasiya (2) Konjuqasiya (3) Elektroporasiya (4) Liposom Vasitəçiliyi ilə Gen Transferi (5) Transduksiya və (6) DNT-nin birbaşa ötürülməsi.

Metod # 1. Transformasiya:

Transformasiya yad DNT-nin bakteriya hüceyrələrinə (məsələn, E.coli) daxil edilməsi üsuludur. Plazmid DNT-nin E.coli tərəfindən mənimsənilməsi buz kimi soyuq CaCl-də həyata keçirilir2 (0-5°C) və sonrakı istilik şoku (təxminən 90 saniyə ərzində 37-45°C). Bu texnika ilə hüceyrə populyasiyasının köçürülə bilən hissəsinə aid olan transformasiya tezliyi kifayət qədər yaxşıdır, məsələn. 1000 (10 -3) hüceyrə üçün təxminən bir hüceyrə.

Transformasiya səmərəliliyi:

Bu, hər mikroqram əlavə edilmiş DNT üçün trans-formantların sayına aiddir. Plazmid ilə transformasiya olan E.coli üçün transformasiya səmərəliliyi bütöv plazmid DNT-nin mikroqramı üçün təxminən 10 7-10 8 hüceyrə təşkil edir. DNT-ni götürə bilən bakteriya hüceyrələri səlahiyyətli sayılır. Yetkinlik böyümə şərtlərini dəyişdirməklə artırıla bilər.

Transformasiya prosesinin mexanizmi tam başa düşülməyib. CaCI olduğuna inanılır2 hüceyrə divarına təsir edir, lokallaşdırılmış bölgələrdə parçalanır və həmçinin DNT-nin hüceyrə səthinə bağlanmasından məsuldur. Qısa istilik şoku (yəni temperaturun 5°C-dən 40°C-yə qəfil artması) DNT-nin udulmasını stimullaşdırır. Ümumiyyətlə, böyük ölçülü DNT-lər transformasiyada daha az effektivdir.

Transformasiya üçün digər kimyəvi üsullar:

Kalsium fosfat (CaCI əvəzinə2) DNT-nin mədəni hüceyrələrə köçürülməsi üçün üstünlük verilir. Bəzən kalsium fosfat hüceyrələr üçün çöküntü və toksiklik ilə nəticələnə bilər. Bəzi işçilər DNT transferi üçün dietil amin etil dekstrandan (DEAE -dekstran) istifadə edirlər.

Metod № 2. Konjuqasiya:

Konjugasiya təbii mikrob rekombinasiya prosesidir. Konjuqasiya zamanı iki canlı bakteriya (donor və alıcı) bir araya gəlir, sitoplazmatik körpülərlə birləşir və tək zəncirli DNT-ni (donordan alıcıya) köçürür. Resipient hüceyrənin daxilində yeni DNT xromosomla inteqrasiya edə bilər (olduqca nadir) və ya sərbəst qala bilər (plazmidlərdə olduğu kimi).

Konjugasiya müxtəlif bakteriya cinslərindən olan hüceyrələr arasında baş verə bilər (məsələn, Salmonella və Şigella hüceyrələri). Bu, bakteriya cinsinin hüceyrələri arasında baş verən transformasiyadan fərqlidir. Beləliklə, konjugasiya ilə iki fərqli və əlaqəsi olmayan bakteriyadan genlərin köçürülməsi mümkündür.

Konjuqasiyanın təbii hadisəsi gen transferi üçün istifadə olunur. Bu, plazmid-insert DNT-ni bir hüceyrədən digərinə köçürməklə əldə edilir. Ümumiyyətlə, plazmidlərin konyuqativ funksiyaları yoxdur və buna görə də onlar DNT-ni alıcı hüceyrələrə ötürmək qabiliyyətinə malik deyillər. Bununla belə, konyuqativ xüsusiyyətlərə malik bəzi plazmidlər hazırlana və istifadə edilə bilər.

Metod №3. Elektroporasiya:

Elektroporasiya yüksək gərginlikli elektrik impulslarının hüceyrə plazma membranlarını əritməyə vadar edə bilməsi prinsipinə əsaslanır. Beləliklə, elektroporasiya elektrik sahəsinin vasitəçiliyi ilə membran keçiriciliyini əhatə edən bir texnikadır. Elektrik şokları, həmçinin süspansiyon məhlulundan ekzogen DNT-nin (elektrik impulsları ilə əmələ gələn məsamələr vasitəsilə olduğu güman edilir) hüceyrənin udulmasına səbəb ola bilər.

Elektroporasiya müxtəlif orqanizmlərdən (mikroorqanizmlər, bitkilər və heyvanlar) hüceyrələrə genlərin daxil edilməsi üçün sadə və sürətli bir texnikadır.

Genlərin məməli hüceyrələrinə köçürülməsi üçün elektroporasiyanın əsas texnikası Şəkil 6.11-də təsvir edilmişdir. Hüceyrələr DNT olan bir məhlulun içinə yerləşdirilir və membranlarda deşiklər yaratmaq üçün elektrik şokuna məruz qalır. Xarici DNT fraqmentləri dəliklərdən sitoplazmaya, sonra isə nüvəyə daxil olur.

Elektroporasiya 100 kb-dən uzun insert DNT-ləri olan plazmidləri olan E.coli hüceyrələrini çevirmək üçün effektiv üsuldur. Transformasiyanın effektivliyi kiçik plazmidlər üçün (təxminən 3kb) DNT-nin hər mikroqramı üçün təxminən 109 transformant və böyük plazmidlər üçün (təxminən 130 kb) təxminən 10 6-dır.

Metod № 4. Liposom Vasitəçiliyi ilə Gen Transferi:

Liposomlar, nuklein turşularını daşıya bilən sulu daxili hissəyə malik dairəvi lipid molekullarıdır. Liposomlarda DNT-ni əhatə etmək üçün bir neçə üsul işlənib hazırlanmışdır. Lipofection kimi istinad edilən liposom-vasitəçili gen transferi Şəkil 6.12-də təsvir edilmişdir.

DNT fraqmentinin liposomlarla müalicəsi zamanı DNT parçaları liposomların içərisinə daxil olur. Bu liposomlar hüceyrə membranlarına yapışa və DNT fraqmentlərini köçürmək üçün onlarla birləşə bilər. Beləliklə, DNT hüceyrəyə, sonra isə nüvəyə daxil olur. Müsbət yüklü liposomlar çox effektiv şəkildə DNT ilə kompleksləşir, hüceyrələrə bağlanır və DNT-ni sürətlə köçürür.

Lipofection çox təsirli bir üsuldur və genlərin bakteriya, heyvan və bitki hüceyrələrinə köçürülməsi üçün istifadə olunur. T

Metod № 5. Transduksiya:

Bəzən yad DNT heyvan viruslarının içərisinə yığıla bilər. Bu viruslar təbii olaraq hüceyrələrə yoluxa bilər və DNT-ni ev sahibi hüceyrələrə daxil edə bilər. Bu yanaşma ilə DNT-nin ötürülməsinə transduksiya deyilir.

Metod № 6. DNT-nin birbaşa ötürülməsi:

DNT-ni birbaşa hüceyrə nüvəsinə köçürmək mümkündür. Mikroinyeksiya və hissəcik bombardmanı bu məqsəd üçün çox istifadə edilən iki üsuldur.

Mikroinyeksiya ilə DNT ötürülməsi ümumiyyətlə mədəniyyət hüceyrələri üçün istifadə olunur. Bu üsul həmçinin DNT-ni oositlər, yumurtalar və erkən embrionların hüceyrələri kimi böyük hüceyrələrə daxil etmək üçün faydalıdır. Transfeksiya termini müxtəlif fiziki və ya kimyəvi vasitələrlə DNT-ni eukaryotik hüceyrələrə köçürmək üçün istifadə olunur.


İstilik şoku və elektroporasiya - Biologiya

Siz verilənlər bazalarımızdan seçilmiş məzmunun maşın tərcüməsini tələb etmisiniz. Bu funksionallıq yalnız sizin rahatlığınız üçün təmin edilir və heç bir şəkildə insan tərcüməsini əvəz etmək üçün nəzərdə tutulmur. Nə BioOne, nə də məzmunun sahibləri və naşirləri, tərcümə funksiyasının funksionallığı və ya məzmunun dəqiqliyi və ya tamlığı ilə bağlı heç bir məhdudiyyət olmadan təqdimatlar və zəmanətlər daxil olmaqla, hər hansı bir açıq və ya nəzərdə tutulan ifadə və ya zəmanət vermir və açıq şəkildə rədd etmirlər. tərcümələr.

Tərcümələr sistemimizdə saxlanmır. Sizin bu funksiyadan və tərcümələrdən istifadəniz BioOne vebsaytının İstifadə Şərt və Qaydalarında olan bütün istifadə məhdudiyyətlərinə tabedir.

ŞİRİN PORTAKALIN ( SİTRUS SINENSIS (L.) OSBECK) EMBRİOGENİK PROTOPLASTLARININ ELEKTROPORASYONU VƏ TRANSFORMASINIYAN BİTKİLƏRİN REGENERASYASI

RANDALL P. NIEDZ, 1,2 W. L. McKENDREE, 1 R. G. SHATTERS Jr. 1

1 Kənd Təsərrüfatı Tədqiqat Xidməti, ABŞ Bağçılıq Tədqiqat Laboratoriyası, 2001 South Rock Road, Ft. Pirs, FL 34945-3030
2 Yazışmaların ünvanlanmalı olduğu müəllif: [email protected]

Mövcud olduqda PDF və HTML daxildir

Bu məqalə yalnız əlçatandır abunəçilər.
Fərdi satış üçün mövcud deyil.

Şirin portağalın embriogen hüceyrə xəttindən təcrid olunmuş protoplastların transfeksiyası üçün elektroporasiya şəraiti optimallaşdırılmışdır [ Citrus sinensis (L.) Osbeck cv. Hamlin]. Elektrik sahəsinin gücü (375–450 V sm −1 ), vektor DNT konsentrasiyası (100 μg ml −1 ), daşıyıcı DNT konsentrasiyası (100 μg ml −1 ), elektroporasiya buferi (pH 8) və protoplastların elektroporasiyadan əvvəlki istilik şoku (45°C-də 5 dəqiqə) optimallaşdırılmışdır. CaMV 35S promotorunun nəzarəti altında β-qlükuronidaza (GUS) kodlaşdırma ardıcıllığını ehtiva edən pBI221 plazmid vektorundan istifadə edildi və elektroporasiyadan 24 saat sonra GUS aktivliyi ölçüldü. Bütün dəyişənlər transfeksiyanın səmərəliliyinə əhəmiyyətli dərəcədə təsir etdi və hər biri üçün optimal şərtlər birləşdirildikdə, GUS aktivliyi 7714 pmol 4-metilumbelliferon (MU) mg -1 (protein) min -1 idi. Daha sonra protoplastlar yaşıl flüoresan zülalın (GFP) ifadə vektorlarının pARS101 və ya pARS108 iştirakı ilə elektroporasiya edilmişdir. Yaşıl flüoresan embrionlar seçildi, bitkilər regenerasiya edildi və transgenin inteqrasiyası Southern blot analizi ilə təsdiqləndi. Hər iki plazmid wtGFP-dən 35 dəfə daha parlaq, tək, qırmızıya sürüşdürülmüş həyəcan zirvəsinə malik olan və insanların kodon istifadəsi üçün optimallaşdırılmış GFP variantı olan EGFP istifadə edərək qurulmuşdur. pARS101 EGFP-ni yonca mozaika virusundan 33 bp çevrilməmiş lider ardıcıllığını ehtiva edən 35S-35S promotorun nəzarəti altına yerləşdirməklə qurulmuşdur. endoplazmatik retikulumun lümenində EGFP-nin daşınması və saxlanması üçün ardıcıllıqlar əlavə olunduğu istisna olmaqla, pARS108 oxşar şəkildə qurulmuşdur.

RANDALL P. NIEDZ , WL McKENDREE və RG SHATTERS Jr. "ŞİRİN PORTAKALIN EMBRİOGENİK PROTOPLASTLARININ ELEKTROPORASYONU ( SİTRUS SINENSIS (L.) OSBECK) VƏ DÖNDÜRÜLMÜŞ BİTKİLƏRİN REGENERASYASI (Vitro39, Bioloji Plan) 586-594, (1 noyabr 2003-cü il). https://doi.org/10.1079/IVP2003463

Alınma tarixi: 4 fevral 2003 Qəbul tarixi: 1 may 2003 Nəşr tarixi: 1 noyabr 2003

Bu məqalə yalnız əlçatandır abunəçilər.
Fərdi satış üçün mövcud deyil.


Esse: Gen transferi üsulları – müsbət və mənfi cəhətləri

Gen transferi funksional genləri (adətən klonlaşdırılan) hədəf hüceyrələrə sabit və səmərəli şəkildə daxil etmək üçün bir texnikadır. Genetik köçürmə, DNT-nin donordan alıcıya ötürülməsi mexanizmidir. Donor DNT-si alıcının içərisinə daxil olduqdan sonra keçid baş verə bilər. Nəticə, donor və ya alıcıdan fərqli genomu olan rekombinant hüceyrədir. Genomdakı dəyişikliyin irsi (növbəti nəsillərə ötürülməsi) üçün transferdən sonra rekombinasiya hadisəsi baş verməlidir. Genlər bədənimizdə bütün bioloji funksiyaları yerinə yetirən bütün zülalları yaratmaq üçün vacib planlardır. Beləliklə, bir gen ev sahibinin hədəf hüceyrəsinə effektiv şəkildə daxil edildikdə, bu gen tərəfindən kodlanan zülal istehsal olunur.
Gen transfer texnologiyaları əvvəlcə gen ifadəsini və onun funksiyasını öyrənmək üçün tədqiqat vasitəsi kimi inkişaf etdirildi. Gen transferi üçün bir sıra texnika və təbii proseslərdən istifadə edilir.
Gen funksiyasını və tənzimlənməsini öyrənmək və ya böyük miqdarda rekombinant zülal istehsal etmək üçün mədəniyyətdə bir çox müxtəlif hüceyrə tiplərinə DNT-nin daxil edilməsi üçün üsullar mövcuddur.
Hüceyrə kulturalarından immunizasiya üçün antikorlar, hormonlar, böyümə faktorları, sitokinlər və viral örtük zülalları kimi məhsulların sintezi üçün kommersiya miqyasında istifadə edilmişdir. Bu texnologiyanın ən mühüm tətbiqi in vivo gen terapiyasıdır, yəni DNT-nin orqanizmə daxil edilməsidir. xəstəliyi müalicə etmək üçün canlı heyvanların hüceyrələri. Dəyişmiş DNT molekulunun fövqəladə potensialı, yaşamaq üçün daha yaxşı mənimsənilən yeni həyat formalarının yaranmasına səbəb olmaqdır. DNT-nin əsas ardıcıllığında dəyişiklik, gen manipulyasiyası ilə düzəldilə bilən xəstəlik vəziyyətinə səbəb olan zülalın dəyişməsinə səbəb olur. Ürək-damar xəstəlikləri, parkinson xəstəliyi, lizosomal pozğunluqlar, göz gen terapiyası və osteoartritdə gen manipulyasiyasına çox diqqət yetirilmişdir.
Gen köçürmə strategiyalarına ümumi baxış:
Gen ötürülməsi əsasən üç marşrutla həyata keçirilə bilər. Ən sadəsi birbaşa DNT transferidir, yad DNT-nin birbaşa hüceyrəyə fiziki yeridilməsidir. Məsələn, becərilmiş hüceyrələrdə bu mikroinyeksiya ilə edilə bilər, halbuki hüceyrələrdə in vivo birbaşa transfer çox vaxt kiçik DNT ilə örtülmüş metal hissəcikləri ilə bombardman etməklə həyata keçirilir. İkinci yol transfeksiya adlanır və bu, hüceyrələri ətraflarından DNT almağa inandırmaq üçün istifadə edilə bilən bəzi kimyəvi və bəzi fiziki üsulları əhatə edir. Üçüncüsü, DNT-nin içərisinə qablaşdırılmasıdır
heyvan virusu, çünki viruslar hüceyrələrə təbii yoluxdurmaq və öz nuklein turşusunu təqdim etmək üçün mexanizmlər inkişaf etdirmişdir. Xarici DNT-nin hüceyrəyə bu yolla ötürülməsinə transduksiya deyilir.
DNT köçürmə üsullarının seçimi transformasiyanın aparılacağı hədəf hüceyrələrdən asılıdır. Bu da gen manipulyasiyasının məqsədlərindən asılıdır. Transfeksiya sabit və ya keçici ola bilər. DNT ötürmə metodunun seçilməsi çox vacib olsa da, digər vacib addımlar genin seçilməsi, genin təcrid olunması, rekombinant DNT-nin hazırlanması və transformasiya olunmuş hüceyrələrin seçilməsidir. Orqanizmin yeni xüsusiyyətlərlə bərpası da eyni dərəcədə vacibdir. In vitro genlərin çatdırılması hüceyrələri retrovirus və ya adenovirus, kalsium fosfat, liposomlar, hissəcik bombardmanı, incə iynə ilə çılpaq DNT inyeksiyası, elektroporasiya və ya bu üsulların hər hansı bir kombinasiyası kimi viruslarla müalicə etməklə həyata keçirilə bilər. Bunlar tədqiqat üçün güclü alətlərdir və gen terapiyasında mümkün tətbiqlərə malikdir.
GEN DƏSTƏKLƏMƏ ÜSULUNU SEÇərkən NƏZARƏ EDİLMƏLİ AMİLLƏR
Yeni texnologiyaların inkişafı genlərin çatdırılmasını həm daha səmərəli, həm də indi mövcud olan nəhəng reagentlər və üsulları nəzərə alaraq daha çaşdırıcı etdi. Hər hansı bir xüsusi təcrübə üçün ən yaxşı gen çatdırılma yanaşmasının müəyyən edilməsi aşağıda qeyd edildiyi kimi bir sıra müxtəlif amillərin diqqətlə nəzərdən keçirilməsini tələb edir.
1. Hüceyrə Kontekst və ya Ətraf Mühit – Hüceyrələrin konteksti və ya mühiti (yəni, in vivo və in vivo)
vitro vs. ex vivo) nuklein turşularının hansı yerə çatdırılacağı nə vaxt nəzərə alınmalı olan ilk amildir
gen transferi metoduna qərar vermək. Çatdırılmanın yaratdığı maneələr və çətinliklər
vitro hüceyrə mədəniyyətləri in vivo və ya ex vivo hüceyrələr tərəfindən yaradılanlardan çox fərqlidir və tələb olunur
onların aradan qaldırılması üçün müxtəlif vasitələr və üsullar. Məsələn, nuklein turşularının hədəflənməsi
digər hüceyrələrdən qaçarkən xüsusi hüceyrələr in vivo gen transferi üçün adətən böyük narahatlıq doğurur
tətbiqlər, bəzən ex vivo tətbiqlər üçün narahatlıq yaradır, lakin adətən in vitro üçün narahatlıq doğurmur
tətbiqlər.
In vivo (lakin in vitro deyil) geni planlaşdırarkən həll edilməli olan başqa bir vacib məsələ
çatdırılma tədqiqatları gen transfer sisteminin immunogenliyidir. Bu, yüksək immunogen ola bilən, əvvəllər müzakirə olunmuş müəyyən viral vektorların istifadəsini nəzərdən keçirərkən xüsusilə vacibdir. Həm eksperimentator, həm də transfeksiyadan istifadə edən hər hansı bir tədqiqat mövzusu üçün ümumi təhlükəsizlik məsələsi də immunogenliklə bağlıdır. Demək olar ki, həmişə viral vektorların istifadəsi sintetik transfeksiya üsullarından istifadə ilə müqayisədə çox geniş təhlükəsizlik tədbirləri tələb edir.
2. Hüceyrə və ya Toxuma Tipi – Nuklein turşularının daxil olacağı hüceyrə və ya toxumanın mənşəyi
ötürülməsi adətən gen çatdırılması seçilərkən nəzərə alınan ikinci parametrdir
üsul. Bir sıra müxtəlif səbəblərə görə, hüceyrə nuklein turşusunun çatdırılmasının çətinliyi dəyişir
hüceyrə tipindən hüceyrə növünə. Buna görə də ədəbiyyatı nəzərdən keçirmək həmişə vacibdir
maraqlandıran hüceyrə növünün əvvəllər gen transferi təcrübələri üçün istifadə edilib-edilmədiyini müəyyən etmək,
hansı dəqiq üsullardan istifadə edilib və hansı çatdırılma effektivliyinə nail olunub, yəni nə
hər bir üsulla faktiki olaraq transfeksiya edilmiş və ya transduksiya edilmiş hüceyrələrin faizləri.
Müəyyən hüceyrə növləri tez-tez ‘transfeksiyası çox çətin olan’ kimi təsvir edilir.
Bunlara bir çox növlərin ilkin hüceyrə mədəniyyətləri daxildir. Belə hüceyrələrə uğurlu gen transferi
adətən hər hansı bir xüsusi gen çatdırılma metodunu seçməzdən əvvəl yaxşı bir araşdırma tələb edir.
3. Çatdırılma Effektivliyi – Əksər proqramlar üçün, çox sayda hüceyrənin transfeksiyası və ya ötürülməsi
xüsusilə nadir transgenin mövcudluğunu aşkar etmək lazım olduqda mümkün üstünlük verilir
məhsullar. Beləliklə, verilən üçün tələb olunan çatdırılma səmərəliliyinin səviyyəsini müəyyən etmək vacibdir
Müəyyən bir gen köçürmə üsuluna qərar verməzdən əvvəl tətbiq. Əksər hallarda belə aşkar olunur
viral vektorlar ən yüksək çatdırılma effektivliyini təmin edir. Bəzi tez-tez istifadə olunan və asanlıqla transfeksiya edilən hüceyrə xətləri üçün katyonik lipidlər, daha təhlükəsiz və daha sürətli prosedurları təmin etməklə yanaşı, gen ötürmə effektivliyində virus vektorlarına demək olar ki, uyğun gəlir.
4. Stabil və Müvəqqəti Gen Çatdırılması – Gen köçürmə prosedurları tez-tez təsnif edilir
çatdırılan genin ev sahibi hüceyrə xromosomundan ayrı qalması və ya onun ana hüceyrə xromosomuna inteqrasiya edilib-edilməməsi ilə. Keçici gen çatdırılması kimi tanınan birinci halda, transgenin ifadəsi adətən müəyyən bir müddətdən sonra dağılır –
bir neçə gün –, çünki ifadə vektoru ya pisləşir, ya da ana hüceyrədən çıxarılır.
İkinci halda, sabit gen çatdırılması olaraq bilinən, köçürülən genin ifadəsidir
uzun və ya sabit, çünki vektor ev sahibi hüceyrə xromosomuna inteqrasiya olunur. Aydındır ki,
müxtəlif tətbiqlər transgen ifadəsinin müxtəlif vaxt dövrlərini tələb edir. Beləliklə, diqqətli
müxtəlif gen çatdırılması metodologiyaları arasında müqayisə uyğun seçim imkanı verəcək
İstənilən keçici və ya sabit ifadənin yaradılması.
Viral vektorlar vəziyyətində, müəyyən bir virusun sabit və ya keçici üçün uyğun olub olmadığını müəyyən etmək
transduksiya sadəcə vektorun ümumi xüsusiyyətlərini öyrənmək məsələsidir. Halda
kimyəvi və ya fiziki/mexaniki gen transferi, müəyyən bir metodun olub olmadığını müəyyən etmək
müvəqqəti və sabit çatdırılma üçün uyğun olan satış ədəbiyyatını oxumaq qədər asan ola bilər
istehsalçı və ya ilkin tədqiqat ədəbiyyatını yoxlamaq.
5. Təqdim olunan Molekulun Tipi – Bir gen ötürülməsini seçərkən nəzərə alınmalı başqa bir amil
metod hansı növ nuklein turşusunun və ya digər molekulun transfeksiya edildiyi və ya ötürüldüyüdür. üçün
məsələn, plazmidləri effektiv şəkildə çatdıran reagent DNT-ni effektiv şəkildə çatdırmaya bilər
oliqonukleotidlər. Hansı metodların uğurla istifadə edildiyini öyrənmək və maraq molekulunu çatdırmaq təcrübəsi olan digər tədqiqatçılarla əlaqə saxlamaq üçün ədəbiyyatı nəzərdən keçirmək çox vaxt asan olur.
6. Sitotoksiklik – Fərqli genlər arasında seçim edərkən tez-tez ortaya çıxan başqa bir məsələ
çatdırılma üsulları müxtəlif üsulların və reagentlərin sitotoksikliyidir. Bəzi üsullar, məsələn
elektroporasiya və gen silahları kimi, hüceyrələr üçün son dərəcə sərt ola bilər və çox vaxt ölümlə nəticələnə bilər
hüceyrələrin əksəriyyəti. Həmçinin, DEAE-dekstran xüsusilə bəzi hüceyrə növləri üçün olduqca sərt ola bilər
prosedurun bir hissəsi kimi bir DMSO və ya qliserol şok addımı istifadə edildikdə. Bəzi tətbiqlərdə,
məsələn, inadkar hüceyrə tipindən az sayda transfektant tələb olunduqda, bu
problem deyil. Tətbiqlərin əksəriyyətində hüceyrə ölümünün yüksək faizi sadəcə olaraq baş verir
qəbuledilməz. Mövcud katyonik lipidlərin və polimer reagentlərinin çoxluğu müxtəlifdir
müxtəlif hüceyrə növləri ilə toksiklik dərəcələri və onların transfeksiya zamanı konsentrasiyaları ola bilər
hüceyrə ölümünü minimuma endirmək üçün lazım olduqda optimallaşdırılır.
7. Asma və yapışan hüceyrələr – Ən çox transfeksiya olunmuş hüceyrələr böyüyür və
transfekte – bir növ dəstəyə bağlanarkən, o dəstəyin toxuma olub-olmaması
onların törəmələri, bəzi inert membran və ya iskele və ya toxuma mədəniyyətinin səthi
boşqab. Daha az rast gəlinən hüceyrələr, məsələn, mühitdə asılı vəziyyətdə böyüyən hüceyrələrdir
qan və digər bədən mayeləri. Asma hüceyrələrin transfeksiyası ümumiyyətlə daha çətindir
buna görə də, kimi daha sərt gen çatdırılma üsullarına etibar etmək lazım ola bilər
elektroporasiya, gen silahları, mikroinyeksiya və ya məqbul transfeksiya səviyyələri üçün viral vektorlar.
Həmçinin, bəzi kationik lipidlər süspansiyon hüceyrələrini effektiv şəkildə transfeksiya edə bilir və bu zaman sınaqdan keçirilməlidir
onların sadəliyi və qənaətcilliyi sayəsində mümkündür.
8. Ekspertiza – Müxtəlif transfeksiya üsullarını yerinə yetirməkdə çətinlik dərəcəsi
əhəmiyyətli dərəcədə dəyişir və buna görə də tədqiqatçının təcrübəsi və təcrübəsi adətən bir
nəzərə alınması vacib amildir. Məsələn, mikroinyeksiya və viral transfeksiya üsulları kimi üsullar həmişə kationik lipidlərdən və polimer reagentlərdən daha mürəkkəbdir. Həmçinin, kimyəvi üsullardan kalsium fosfatın birgə çökməsi eksperimental şəraitdə cüzi dəyişikliklərə həssaslığına görə olduqca çətin ola bilər.
9. Vaxt – Nəzərə alınmalı olan digər vacib amil genlərin çatdırılması üçün tələb olunan vaxtdır. Viral
üsullar yüksək effektiv olsa da, kifayət qədər vaxt apara bilər, başa çatdırmaq üçün adətən iki həftədən bir aya qədər vaxt tələb olunur. Əksinə, kimyəvi və fiziki/mexaniki üsullar adətən bir neçə gün ərzində tamamlana bilər, lakin tez-tez daha aşağı transfeksiya effektivliyini təmin edir. Beləliklə, daha sürətli nəticələrin və daha az əməyin faydalarını yüksək səmərəliliyin faydası ilə müqayisə etmək qeyri-adi deyil.
10 Xərc – Nəhayət, ən yaxşı gen çatdırılmasına qərar verərkən xərc əsas amil ola bilər.
müəyyən bir tətbiq üçün metod. Ən bahalı üsullar adətən olur
elektroporasiya və gen silahları kimi fiziki/mexaniki üsullar səbəbiylə ixtisaslaşdırılmışdır
onların tələb etdiyi avadanlıq. Viral genlərin çatdırılması bəlkə də ikinci ən bahalı üsuldur, çünki vektor reagentləri, uzun vektor hazırlama prosedurlarını başa çatdırmaq üçün çoxlu vaxt və əmək, həmçinin viral tullantı materiallarının lazımi şəkildə utilizasiyası tələb olunur.
Üçüncü ən bahalı gen çatdırılma üsulları, heç bir xüsusi avadanlıq və ya uzun viral vektor hazırlama addımlarını tələb etməyən polimerlərdən və katyonik lipidlərdən istifadə edir. Bu cür reagentlərin qiyməti adətən tamamlanacaq transfeksiyaların sayından asılı olaraq yüzlərlə dollara başa gəlir. Nəhayət, ən ucuz üsullar ucuz və bol mineral olan kalsium fosfatdan və açıq-aydın transfeksiya reagentinin xərcini tələb etməyən, lakin çox səmərəsiz ola bilən çılpaq DNT-dən istifadə edir.
GEN TRANSFER TEXNIKLARI
TRANSFORMASİYA
Transformasiya, genetik materialın hüceyrə membranı vasitəsilə hüceyrə tərəfindən udulmasını əhatə edən təbii olaraq baş verən gen transferi prosesidir və yad DNT-nin yerli DNT ilə birləşməsinə səbəb olur və bu, alınan DNT-nin genetik ifadəsi ilə nəticələnir. Transformasiya 'çılpaq' DNT-nin (xromosomlar kimi strukturlara daxil olmayan DNT) səlahiyyətli bakteriya hüceyrələri tərəfindən mənimsənilməsini əhatə edir. Hüceyrələr yalnız həyat dövrünün müəyyən bir mərhələsində, yəqin ki, hüceyrə divarının sintezi tamamlanmamışdan əvvəl səlahiyyətlidirlər (DNT götürə bilirlər).
Transformasiya adətən gen transferinin təbii üsuludur, lakin texnoloji tərəqqi nəticəsində süni və ya induksiya edilmiş transformasiya yaranmışdır. Beləliklə, təbii çevrilmə və süni və ya induksiya edilmiş çevrilmə adlanan iki növ var. Təbii transformasiyada yad DNT ev sahibi hüceyrənin DNT reseptoruna bağlanır və protein DNT translokazının köməyi ilə ana hüceyrəyə daxil olur. Nükleazların olması DNT-nin iki zəncirinin daxil olmasını məhdudlaşdırır, bir zəncirini məhv edir, beləliklə, yalnız bir zəncirinin ana hüceyrəyə daxil olmasına imkan verir. Xromosoma inteqrasiya olunmayan hər hansı DNT parçalanacaq. Bu tək zəncirli DNT ev sahibinin genetik materialı ilə uğurla qarışır.
Süni və ya induksiya edilmiş transformasiya metodu ya kimyəvi vasitəçiliyə malik gen transferi, ya da elektroporasiya yolu ilə həyata keçirilən laboratoriya şəraitində həyata keçirilir. Genetik mühəndislər hüceyrələri adətən kalsium duzları olan müəyyən məhlullara yerləşdirməklə səriştəliliyə səbəb ola bilirlər. Giriş yerində endonükleazlar DNT-ni 7000-10000 nukleotiddən ibarət fraqmentlərə ayırır və ikizəncirli DNT tək zəncirlərə ayrılır. Tək zəncirli DNT hüceyrə daxilində bir dəfə ev sahibinin xromosomu ilə birləşə bilər. Bu rekombinasiya ev sahibinin geni homolog – gen olsa da, bir variant – ilə əvəz edir.
çatışmazlıqlar:
Yaxın qohum cinsdən DNT əldə oluna bilər, lakin ümumiyyətlə, DNT uzaqdan qohum olan mikroblar arasında mübadilə olunmur.
Bütün bakteriyalar səlahiyyətli ola bilməz.
KONKUQASİYA
Konjugasiya bir çox bakteriya növlərində gen köçürmə vasitəsidir. F-pilus (və ya cinsi pilus) kimi tanınan xüsusi əlavə ilə hüceyrə-hüceyrə təması, F-plazmidin (məhsuldarlıq plazmidi) bir nüsxəsini plazmidi olmayan hüceyrəyə köçürməyə imkan verir. Nadir hallarda bir F-plazmid bakteriya sahibinin xromosomuna inteqrasiya olunaraq Hfr (yüksək rekombinasiya tezliyi) hüceyrəsi kimi tanınan hüceyrəni yarada bilər. Belə bir hüceyrə cinsi pilusun sintezini də idarə edə bilər. Hfr hüceyrəsinin xromosomu çoxaldıqca, plazmid və xromosom DNT-nin alıcı hüceyrəyə keçməsi üçün pilusu keçməyə başlaya bilər. Belə DNT yeni ev sahibi ilə rekombinasiya olunaraq yeni gen variantları təqdim edə bilər. Virulentlik faktorları və antibiotiklərə qarşı müqavimət üçün genləri kodlayan plazmidlər bakteriya populyasiyaları arasında və bir çox bakteriya növləri arasında konyuqasiya yolu ilə keçir.
Laboratoriyada konjugasiya pozulmuş genləri öz-özünə ötürülən plazmid üzərində köçürmək, mutant ştamm yaratmaq üçün istifadə edilə bilər. Resipiyent E. coli ştammından maraq doğuran gen öz-özünə ötürülən vektora klonlaşdırılır və genetik manipulyasiya üçün donor ştammında saxlanılır. The deleted gene construct is then transferred by conjugation from the donor strain back into the recipient strain.
TRANSDUCTION
Transduction is another method for transferring genes from one bacterium to another the transfer is mediated by bacteriophages. A bacteriophage infection starts when the virus injects its DNA into a bacterial cell. The bacteriophage DNA may then direct the synthesis of new viral components assembled in the bacterium. Bacteriophage DNA is replicated and then packaged within the phage particles. Early in the infective cycle the phage encodes an enzyme that degrades the DNA of the host cell. Some of these fragments of bacterial DNA are packaged within the bacteriophage particles, taking the place of phage DNA. As the number of phages increases it breaks open (lyse) the cell. When released from the infected cell, a phage that contains bacterial genes can continue to infect a new bacterial cell, transferring the bacterial genes.
Sometimes genes transferred in this manner become integrated into the genome of their new bacterial host by homologous recombination. Such transduced bacteria are not lysed because they do not contain adequate phage DNA for viral synthesis and these phages can enter an alternate life cycle called lysogeny. In this cycle, all the virus’s DNA becomes integrated into the genome of the host bacterium. The integrated phage, called a prophage, can confer new properties to the bacterium.
Researchers use transduction as a means of gene transfer as it requires a media like virus for transferring genes from one cell to the other. Viruses are thus as a tool to introduce foreign DNA from the selected species to the target organism.
There are two types of transduction called as generalized transduction in which any of the bacterial gene is transferred via the bacteriophage to the other bacteria and specialized transduction involves transfer of limited or selected set of genes.
Viral vectors for gene transfer:
The use of viruses as vectors for transduction, i.e. the introduction of genes into animal cells by exploiting the natural ability of the virus particle, within which the transgene is packaged, to adsorb to the surface of the cell and gain entry is being employed . Due to the efficiency with which viruses can deliver their nucleic acid into cells and the high levels of replication
and gene expression it is possible to achieve, viruses have been used as vectors not only for gene expression in cultured cells but also for gene transfer to living animals. Four classes of viral vector have been developed for use in human gene therapy and have reached phase 1 clinical trials. These are the retrovirus, adenovirus, herpesvirus and adenoassociated virus (AAV) vectors . Before introducing the individual vector systems,we discuss some general properties of viral transduction vectors. Transgenes may be incorporated into
viral vectors either by addition to the whole genome or by replacing one or more viral genes. This is generally achieved either by ligation (many viruses have been modified to incorporate unique restriction sites) or homologous recombination.
For many applications, it is favourable to use vectors from which all viral coding sequences have been deleted.These amplicons (also described as ‘gutless vectors’) contain just the cis-acting elements required for packaging and genome replication. The advantage of such vectors is their high capacity for foreign DNA and the fact that, since no viral gene products are made, the vector has no intrinsic cytotoxic effects. The choice of vector depends on the particular properties of the virus and the intended host, whether transient or stable expression is required and how much DNA needs to be packaged. For example, icosahedral viruses such as adenoviruses and retroviruses package their genomes into preformed capsids, whose volume defines the maximum amount of foreign DNA that can be accommodated. Conversely, rod-shaped viruses such as the baculoviruses form the capsid around the genome, so there are no such size constraints. There is no ideal virus for gene transfer ‘ each has its own advantages and disadvantages. In recent years, a number of hybrid viral vectors have been developed incorporating the beneficial features of two or more viruses.
Üstünlüklər:
1) viral vectors that especially efficient at transducing the intended cell type but not other cell types.
2) retroviruses are particularly proficient at delivering genes to dividing cells, such as cancer cells or immortalized cell lines
Limitations:
1) cannot deliver genes to terminally differentiated cells
2) viral vectors may be highly immunogenic
TRANSFECTION BY CHEMICAL METHODS
One of the methods of gene transfer where the genetic material is deliberately introduced into the animal cell in view of studying various functions of proteins and the gene is transfection. This mode of gene transfer involves creation of pores on the cell membrane enabling the cell to receive the foreign genetic material. When transformation is carried out in eukaryotic cells it is termed as transfection.
1) Calcium phosphate mediated DNA transfer
The process involves a mixture of isolated DNA (10-100ug) with solution of
calcium chloride and potassium phosphate. . When the two are combined, a fine precipitate of the positively charged calcium and the negatively charged phosphate will form, binding the DNA to be transfected on its surface .Cells are then incubated with precipitated DNA either in solution or in tissue culture dish. A fraction of cells will take up the calcium phosphate DNA precipitate by a process not entirely understood but thought to be endocytosis.
Transfection efficiencies using calcium phosphate can be quite low, in the range of 1-2 % . It can
be increased if very high purity DNA is used and the precipitate allowed to form slowly.
Məhdudiyyətlər
1. Frequency is very low.
2. Integrated genes undergo substantial modification.
3. Many cells do not like having the solid precipitate adhering to them
and the surface of their culture vessel.
4. Integration with host cell chromosome is random.
5, Due to above limitations transfection applied to somatic gene therapy
məhduddur.
Tətbiqlər:
This technique is used for introducing DNA into mammalian cells. This process has been a preferred method of identifying many oncogenes.
2)DNA transfer by DAE-Dextran method:
DNA can be transferred with the help of DAE Dextran also. DAE-Dextran may be used in the
transfection medium in which DNA is present. This is a polycationic, high molecular weight substance and is convenient for transient assays. The negatively charged DNA binds to the polycation and the complex is taken up by the cell via endocytosis.
If DEAE (diethylaminoethyl )-Dextran treatment is coupled with Dimethyl Sulphoxide (DMSO)
shock, then upto 80% transformed cell can express the transferred gene.
Üstünlüklər:
The advantage of this method is that, it is cheap, simple and can be used for transient cells
which cannot survive even short exposure of calcium phosphate.
The major advantages of the technique are its relative simplicity and speed, limited expense, and remarkably reproducible interexperimental and intraexperimental transfection efficiency.
Limitations:
Disadvantages include inhibition of cell growth and induction of heterogeneous morphological changes in cells.
Furthermore, the concentration of serum in the culture medium must be transiently reduced during the transfection.
It does not appear to be efficient for the production of stable transfectants.
For cells that grow in suspension, electroporation or lipofection is usually preferred, although DEAE-dextran-mediated transfection can be used.
Transfer of DNA by polycation-DMSO:
As calcium phosphate method of DNA transfer is reproducible and efficient but there is narrow range of optimum conditions. DNA transfer by
Another polycationic chemical,the detergent Polybrene is carried out to increase the adsorption of DNA to the cell surface followed by a brief treatment with 25-30% DMSO to increase membrane permeability and enhance uptake of DNA. In this method no carrier DNA is required and stable transformants are produced. This method works with mouse fibroblast and chick embryo.
LIPOSOME MEDIATED GENE TRANSFER
Liposomes are spheres of lipids which can be used to transport molecules into the cells. These are artificial vesicles that can act as delivery agents for exogenous materials including transgenes. They are considered as spheres of lipid bilayers surrounding the molecule to be transported and promote transport after fusing with the cell membrane.
Liposomes for use as gene transfer vehicles are prepared by adding an appropriate mix of bilayer constituents to an aqueous solution of DNA molecules. In this aqueous environment, phospholipid hydrophilic heads associate with water while hydrophobic tails self-associate to exclude water from within the lipid bilayer. This self-organizing process creates discrete spheres of continuous lipid bilayer membrane enveloping a small quantity of DNA solution. The liposomes are then ready to be added to target cells. Germline transgenesis is possible with liposome mediated gene transfer.Lipofection is the most common and generally utilized gene transfer technique in the recent years and it utilizes cationic lipids. The combined DNA and cationic lipids act instantaneously to form structures called as lipoplexes that are more complex in structure than the simple liposomes. Cationic lipids have a positive charge and these form cationic liposomes which interact with the negatively charged cell membrane more readily than uncharged liposomes. This leads to a fusion between cationic liposome and the cell surface resulting in quick entry by endocytosis and the delivery of the DNA directly across the plasma membrane. Cationic liposomes can be produced from a number of cationic lipids that are commercially available and sold as an in vitro-transfecting agent, termed lipofectin.
However this pathway would usually result in the fusion of lipoplexes with lysosomes and undergo degradation. This problem is overcome by utilizing the neutral helper lipids, which are generally included along with the cationic lipid. This allows entrapped DNA to escape the endosomes, reach the nucleus and get access to the cell’s transcriptional machinery.The endosomal structure is destroyed by increasing the osmotic pressure created by the lipids’ buffering action within the endosomes and by the fusion of the lipid with the endosomal membrane. The ability of a lipid to destroy endosomes is one of the main characteristics of a transfection reagent.
Üstünlüklər
1. Simplicity.
2. Long term stability.
3. Low toxicity.
4. Protection of nucleic acid from degradation.
5. particularly proficient at delivering genes to dividing cells, such as cancer cells or immortalized cell lines
6. cationic lipids effectively transfect suspension cells.
Limitations:
1) Cannot deliver genes to terminally differentiated cells
ELECTROPORATION
A rapid and simple technique for introducing genes into a wide variety of microbial, plant and animal cells, including E. coli, is electroporation. Electroporation uses electrical pulse to produce transient pores in the plasma membrane thereby allowing macromolecules into the cells. These pores are known as electropores which allow the molecules, ions and water to pass from one side of the membrane to another. The electropores reseal spontaneously and the cell can recover. The pores can be recovered only if a suitable electric pulse is applied .The formation of electropores depends upon the cells that are used and the amplitude and duration of the electric pulse that is applied to them. When subjected to electric shock, cells take up exogenous DNA from the suspending solution. Once inside the cell, the DNA is integrated and the foreign gene will express. A proportion of these cells become stably transformed and can be selected if a suitable marker gene is carried on the transforming DNA. The most critical parameters are the intensity and duration of the electric pulse, and these must be determined empirically for different cell types. Electric currents can lead to dramatic heating of the cells that can results in cell death. Heating effects are minimized by using relatively high amplitude, a short duration pulse or by using two very short duration pulses. However, once optimal electroporation parameters have been established, the method is simple to carry out and highly reproducible.
Many different factors affect the efficiency of electroporation, including temperature,
various electric-field parameters (voltage, resistance and capacitance), topological form of the DNA,
and various host-cell factors (genetic background, growth conditions) and post-pulse treatment.
General applications of electroporation.
1. Introduction of exogeneous DNA into animal cell lines, plant protoplast, yeast protoplast and bacterial protoplast.
2. Electroporation can be used to increase efficiency of transformation or transfection of bacterial cells.
3. Wheat, rice, maize, tobacco have been stably transformed with frequency upto 1% by this method.
4. Genes encoding selectable marker may be used to introduce genes using electroporation.
5. To study the transient expression of molecular constructs.
6. Electroporation of early embryo may result in the production of transgenic animals.
7. Hepatocytes, epidermal cells, haematopoietic stem cells, fibroblast, mouse T and B lymphocytes can be transformed by this technique.
8. Naked DNA may be used for gene therapy by applying electroporation device on animal cells.
Advantages of electroporation.
1. Method is fast.
2. Less costly.
3. Applied for a number of cell types.
4. Simultaneously a large number of cell can be treated.
5. High percentage of stable transformants can be produced.
DRAWBACKs
1)Limited effective range of

1 cm between the electrodes.
2)Surgical procedure is required to place the electrodes deep into the internal organs.
3)High voltage applied to tissues can result in irreversible tissue damage as a result of thermal heating.
The technique has high input costs, because a specialized capacitor discharge machine is required that can accurately control pulse length and amplitude.
4) Larger numbers of cells may be required than for other methods because, in many cases, the most efficient electroporation occurs when there is up to 50% cell death.
ULTRASONICATION
Sonication is the act of applying sound energy to agitate particles in a sample. Ultrasonic frequencies (>20 kHz) are usually used, leading to the process also being known as ultrasonication . Sonoporation, or cellular sonication, is the use of these ultrasonic frequencies for modifying the permeability of the cell plasma membrane. This technique is usually used in molecular biology and non-viral gene therapy in order to allow uptake of large molecules such as DNA into the cell, in a cell disruption process called transfection or transformation. Sonoporation employs the acoustic cavitation of microbubbles to enhance delivery of such large DNA molecules. Although the early results could achieve only 10- to 30-fold increases in transfection efficiency in vitro, technical refinements have lead to enhancements of up to several thousand fold in vitro ,sufficient to encourage ultrasonication mediated gene transfer in vivo.
Üstünlüklər:
1) It is non-invasive and well tolerated,
2)extraordinary safety record over a wide range of frequency and intensity
3)high levels of public acceptability and understanding.
there are highly sophisticated, flexible, cost-effective and readily available diagnostic and therapeutic systems that can achieve site-specific transfer of ultrasound energy almost anywhere in the body, except perhaps the lung.
4) The bioactivity of this technique is similar to, and in some cases found superior to, electroporation.
5) in vivo is relatively nontoxic.
Limitations:
1)Extended exposure to low-frequency (<MHz) ultrasound has been demonstrated to result in complete cellular death (rupturing) as well as microvascular hemorrhage and disruption of tissue structure, thus cellular viability must also be accounted for when employing this technique.
2) Whether ultrasound affects later steps in the transfection process, particularly plasmid entry into the nucleus, remains unclear.
Tətbiqlər:
Sonoporation is under active study for the introduction of foreign genes in tissue culture cells, especially mammalian cells. Sonoporation is also being studied for use in targetedGene therapy in vivo, in a medical treatment scenario whereby a patient is given modified DNA, and an ultrasonic transducer might target this modified DNA into specific regions of the patient’s body.
MICROINJECTION
In microinjection DNA can be introduced into cells or protoplast with the help of very fine needles or
glass micropipettes having the diameter of 0.5 to 10 micrometer. The DNA may be directly delivered into the nucleus or in the cytoplasm. Some of the DNA injected may be taken up by the nucleus. The desired gene in the form of plasmid or alone is injected directly into the plant protoplast.
Injection into the nucleus is more efficient than that into the cytoplasm. Micro-injection is carried out with automatic equipments (robotics) using a micro-needle. Computerized control of holding pipette, needle, microscope stage and video technology has improved the efficiency of this technique.
Advantages of microinjection.
1. Frequency of stable integration of DNA is far better as compare to other methods.
2. Method is effective in transforming primary cells as well as cells in established cultures.
3. The DNA injected in this process is subjected to less extensive modifications.
4. Mere precise integration of recombinant gene in limited copy number can be obtained.
Məhdudiyyətlər
1. Costly.
2. Skilled personal required.
3.Has not been successful for many plant cells .
4. Embryonic cells preferred for manipulation.
5. Knowledge of mating timing, oocyte recovery is essential.
6. Method is useful for protoplasts and not for the walled cells.
7. Process causes random integration.
8. Rearrangement or deletion of host DNA adjacent to site of integration are common.
9. The technique is laborious, technically difficult, and limited to the number of cells actually injected.
Applications of microinjection.
1. Process is applicable for plant cell as well as animal cell but more common for animal cells.
2. Technique is ideally useful for producing transgenic animal quickly.
3. Procedure is important for gene transfer to embryonic cells.
4. Applied to inject DNA into plant nuclei.
5. Method has been successfully used with cells and protoplast of
tobacco, alfalfa etc.
Fig: microinjection in mouse egg.
BIOLISTICS
(MICROPROJECTILE/GENE GUN)
Biolistics or particle bombardment is a physical method that uses accelerated microprojectiles to
deliver DNA or other molecules into intact tissues and cells. Biolistics transformation is relatively new and novel method amongst the physical methods for artificial transfer of exogenous DNA. The nucleic acid is delivered through membrane penetration at a high velocity, usually connected to microprojectiles like microscopic particles of tungsten or gold coated into cells using an electrostatic pulse, air pressure, or gunpowder percussion. As the particles pass through the cell, the DNA becomes free to integrate into the plant-cell genome.
The gene gun is a device that literally fires DNA into target cells . The DNA to be transformed
into the cells is coated onto microscopic beads made of either gold or tungsten. Beads are carefully
coated with DNA. The coated beads are then attached to the end of the plastic bullet and loaded into
the firing chamber of the gene gun. An explosive force fires the bullet down the barrel of the gun
towards the target cells that lie just beyond the end of the barrel. When the bullet reaches the end of
the barrel it is caught and stopped, but the DNA coated beads continue on toward the target cells.
Some of the beads pass through the cell wall into the cytoplasm of the target cells. Here the bead and
the DNA dissociate and the cells become transformed. Once inside the target cells, the DNA is
solubilised and may be expressed.
Proqramlar
1. Biolistics technique has been used successfully to transform soyabean,
cotton, spruce, sugarcane, papaya, corn, sunflower, rice, maize, wheat,
tobacco etc.
2. Genomes of subcellular organelles have been accessible to genetic
manipulation by biolistic method.
3. Mitochondria of plants and chloroplast of chlamydomonas have been
transformed.
4. Method can be applied to filamentous fungi and yeast (mitochondria).
5. The particle gun has also been used with pollen, early stage
embryoids, meristems somatic embryos, plant cells, root section, seeds and pollen.
6. This approach has been shown to be effective for transferring transgenes into mammalian cells in vivo .
Üstünlüklər
1. Requirement of protoplast can be avoided. Unlike electroporation and microinjection, this technique does not require protoplasts or even single-cell isolations and is applicable to even intact plant tissue
2. Walled intact cells can be penetrated.
3. Manipulation of genome of subcellular organelles can be achieved.
4. This is also a highly mechanized or robotic mediated technique in which the
speed of the micro-projectile particles is controlled by foolproof mechanisms
5) It is also gaining in use as a method for transferring DNA construct into whole animals.
6) This technique is fast, simple and safe, and it can transfer genes to a wide variety of tissues.
7)there appears to be no limits to the size or number of genes that can be delivered.
Məhdudiyyətlər
1. Integration is random.
2. Requirement of equipments.
3.It can be a challenge to obtain a sufficient number of cells modified by this method to see a biologically significant effect.
MICROLASER
A new technique is presented to incorporate exogeneous gene materials (DNA) into cells with a microbeam irradiation from an uv pulsed laser. A frequency-multiplied Laser, 355 m wavelength, 5 ns pulse duration, punches a self-healing hole of submicrometer aperture in cell membrane under selected irradiation conditions. At the site of the beam impact, due probably to local temperature changes, the cell membrane modifies its permeability. As a consequence of the hit, circular areas, whose radius may be apparently regulated by changing the irradiation time and/or the radiation intensity (energy), appear on the wall, last for a short time and fade spontaneously . It takes a fraction of a second for the aperture to close, long enough to allow the foreign DNA, contained in the medium, to slip into the cell.
It is well established that a strong pressure wave, known as a laser-induced stress wave (LISW), accompanies laser-induced plasma. We have extended their method to deliver macromolecules, such as genes. Plasmid DNA (circular DNA residing in bacterial cytoplasm) is used as a vector of the gene of interest. We inject the plasmid into target tissue, on which a laser target is placed, and subject the target to irradiation with a high-intensity, nanosecond laser pulse to induce plasma and hence an LISW. By placing optically transparent material on the target, the plasma is confined, resulting in an increase in the LISW’s impulse. Interaction of tissue cells with the LISW allows plasmid to enter the cytoplasm
Üstünlüklər
1) it only takes advantage of the presence of phenol-red, a normal cell medium component, with no need of addition of extraneous substances
(2) it is a very mild treatment virtually suitable for any cell type and
(3) it allows transfection of selected cells even in the presence of cells of different type (providing that they are morphologically distinguishable).
4) . it is rapidly replacing virus mediated techniques as they have serious side effects caused by immune response and limited targeting characteristics rendering them inappropriate for clinical application
5) The method offers a clear advantage over existing methods: increases the success rate of DNA transfection as well as the efficiency of cell modification by orders of magnitude.
6) . It enables minimally invasive tissue interaction.
CONCLUSION
Thus there are a number of ways by which the genes can be introduced into the cells. With the advent of molecular tools and technologies it is now comparatively easy to introduce gene into cells without losing its integrity and biological activity. Moreover the recent development in molecular biology has made the transfer of gene with great accuracy to the target cell. The transfer of gene through different gene transfer technologies has cured a number of diseases. Research is on progress to cure those diseases which cannot be cured by using drugs. Moreover the treatment of diseases by gene transfer provides better result for a prolong period of time. It is the need of hour to discover new and cheap method of gene transfer technologies so to make the treatment of the diseases a little easier and affordable. Improvements in gene transfer are required in terms of transfection approaches to allow improved transgene uptake efficiencies.
REFERENCES
1)Society of Applied Sciences.
Gene Transfer Technologies and their Applications: K.H.KHAN
Medical Biotechnology Division, School of Biosciences and Technology,
VIT University, Vellore-632014, Tamil Nadu, India.
2)Principles of gene manipulation: R.W.Old ,S.B. Primrose and R.M.Twymann ‘ sixth edition,chapter 10 and 11.
3) BIOTECHNOLOGY 2020-From the Transparent Cell to
the Custom-Designed Process–Prof. Gerhard Kreysa Dr.-Ing. E.h. Dr.h.c. & Dr. R??diger Marquardt
4) INTRODUCTION TOBIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING
-A.J. NAIR, PH.D.
5)From genes to genomes- concepts and applications of DNA technology–Jeremy W Dale, Malcom von Schantz
6) http://www.nature.com
7)www.learner.org

Essay Sauce is the free student essay website for college and university students. We've got thousands of real essay examples for you to use as inspiration for your own work, all free to access and download.

. (download the rest of the essay above)

About this essay:

If you use part of this page in your own work, you need to provide a citation, as follows:


Heat shock vs electroporation - Biology

Article Summary:

Tərif: -
Elektroporasiya, elektrik cərəyanını canlı səthdən, məsələn, hüceyrədən və ya molekuldan ötürmək üçün biotexnologiya prosesidir. Bu yolla canlı quruluşun səthində məsamələr yaranır və bioloji material ondan asanlıqla keçə bilir. Bu üsul adətən virusların və ya plazmidlərin vektor və ya plazmid şəklində hüceyrə membranındakı məsamələrdən hüceyrəyə daxil olması üçün istifadə olunur.

Elektroporasiya nədir: -
Elektroporasiya texnikası daha çox molekulyar biologiya sahəsində istifadə olunur. Bu üsul xarici mənbədən elektrik cərəyanı istifadə edərək hər hansı bir hüceyrəyə tətbiq edildikdə, hüceyrə membranı daha keçirici olur və yad cisimlərin içərisinə daxil olur. Alimlər molekulyar zond, kiçik DNT parçası və ya hüceyrənin funksiyasını dəyişdirə biləcək hər hansı bir dərman daxil etməli olduqda bu texnikadan istifadə edirlər.

Plazma membranının dielektrik gücünü keçməsinə imkan verən düzgün elektrik sahəsinə məruz qalana qədər hüceyrə membranında məsamələr yaratmaq asan deyil. Bütün təcrübə yaxşı idarə olunarsa, bir müddət sonra plazma membranının məsamələri yenidən bağlana bilər, lakin bu müddət ərzində molekullar və ya yad cisimlər hüceyrənin sitoplazmasına daxil ola bilər. Uzun müddət elektrik cərəyanına məruz qaldıqda hüceyrə üçün zərərlidir. Hüceyrə ölümü və ya apoptoz ilə nəticələnir.

Elektroporasiya prosesi əsasən bakteriyaların, bitki protoplastlarının və mayaların çevrilməsi üçün istifadə olunur. Bakterial hüceyrə divarı peptidoqlikan və onun törəmələrindən ibarətdir. Hüceyrə divarında təbii olaraq məsamələri var, buna görə plazmidlər bakteriya hüceyrəsinə daxil olmaq məcburiyyətində qaldıqda, plazmidin bakteriya hüceyrəsinə daxil olması üçün bu məqsədlə az miqdarda elektrik cərəyanı istifadə olunur. Bütün proses yaxşı idarə olunmalıdır ki, bakterial hüceyrələrin tərkibində plazmidlər olan yeni qız hüceyrələrə bölünə bilsin. Bu proses kimyəvi Elektroporasiyadan daha effektivdir. Bu proses həmçinin toxuma mədəniyyəti hüceyrələrinin yad genləri əsasən məməlilərin hüceyrələrinə daxil etmək üçün istifadə edilə bilər.

Elektroporasiya prosesi necə işləyir?
Elektroporatorlar adlanan Elektroporasiya prosesini həyata keçirmək üçün xüsusi növ cihazlardan istifadə olunur. Bu cihaz adətən bakteriya olan hüceyrənin məhlulundan keçir, lakin bu məqsədlə digər çağırış növləri də istifadə edilə bilər. Hüceyrə məhlulu şüşə və ya plastik küvetə qoyulur. Şüşə və ya plastik kyuvet, spektroskopik təcrübələr üçün nümunələri saxlamaq üçün xüsusi olaraq hazırlanmış kiçik dairəvi borudur. Tərkibində hər tərəfdən iki alüminium elektrod var. Əgər bakteriya hüceyrəsi Elektroporasiya prosesində istifadə olunursa, istifadə olunan suspenziya 50 mikrolitr olmalıdır. Proses başlamazdan əvvəl plazmidlər süspansiyona yerləşdirilir və bütün süspansiyon şüşə küvetə daxil edilir. Elektroporatorlarda gərginlik 240 volta təyin edilir və kyuvet elektroporatorun içərisinə yerləşdirilir. İnkubasiyadan əvvəl küvetə I mililitr maye mühit daxil edilir və sonra inkubasiya başlayır. Bir saatlıq inkubasiyadan sonra bütün məhlul agaroz gelə yerləşdirilir. Plazmid məhlulu id təmizdirsə, təcrübədən daha yaxşı nəticələr əldə etmək şansı var, əks halda bakterial hüceyrələr həddindən artıq partlama nəticəsində ölə bilər və proses yenidən başlaya bilər.

Tətbiqlər: -
Elektroporasiyanın elektroporasiya prosesi tibb sahəsində xərçəng hüceyrəsinə yeni genlər daxil etməklə xərçəng və ürək xəstəliklərini müalicə etmək üçün tətbiq edilir. Bəzi digər xəstəliklər də toxumaların çıxarılmasına ehtiyac olan Elektroporasiyanın köməyi ilə müalicə edilə bilər.

About Author / Additional Info:

Important Disclaimer: All articles on this website are for general information only and is not a professional or experts advice. We do not own any responsibility for correctness or authenticity of the information presented in this article, or any loss or injury resulting from it. We do not endorse these articles, we are neither affiliated with the authors of these articles nor responsible for their content. Please see our disclaimer section for complete terms.


Principle

Transformation process allows a bacterium to take up genes from its surrounding environment that is transformation involves the direct uptakes of fragments of DNA by a recipient cell and the acquisition of new genetic characteristics. There are two major parameters involved in efficiently transforming a bacterial organism. The first is the method used to induce competence for transformation. The second major parameter is the genetic constitution of the host strain of the organism being transformed. Competent cells are capable of uptaking DNA from their environment and expressing DNA as functional proteins. If a bacterium is said to be competent, it has to maintain a physiological state in which it can take up the donor DNA. Calcium chloride treatment is one of the best methods for the preparation of competent cells. Competence results from alterations in the cell wall that makes it permeable to large DNA molecules. This is a naturally occurring process and through this bacteria can transfer advantageous characteristics, such as antibiotic resistance. Bacteria can take DNA from the environment in the form of plasmid. Most of them are double stranded circular DNA molecules and many can exist at very high copy numbers within a single bacterial cell. Many naturally occurring plasmids carry an antibiotic resistant gene referred to as a marker.

In the process of transformation, the competent cells are incubated with DNA in ice. Then it is placed in a water bath at 42ºC and further plunging them in ice. This process will take up the DNA into the bacterial cell. Then it is plated in an agar plate containing appropriate antibiotic. The presence of an antibiotic marker on the plasmid allows for rapid screening of successful transformants. Blue &ndashwhite selection (Alpha complementation) can be used to determine which plasmids carry an inserted fragment of DNA and which do not. These plasmids contain an additional gene (lac Z) that encodes for a portion of the enzyme &beta &ndash galactosidase. When it transformed into an appropriate host, one containing the gene for the remaining portion of &beta &ndashgalactosidase, the intact enzyme can be produced and these bacteria form blue colonies in the presence of X &ndash gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-b-D-galactoside) and a gratuitous inducer called IPTG (Isopropyl &beta-D- Thiogalactopyronoside). These plasmids contains a number of cloning sites within the lac Z gene, and any insertion of foreign DNA into this region results in the loss of the ability to form active &beta &ndashgalactosidase. Therefore colonies that carry the plasmid with the insert, ie, Transformants will remain white and the colonies without the foreign DNA (Non-Transformants) will remain Blue. We can also calculate the efficiency of transformation by using the concentration of DNA and number of transformed colonies.