Məlumat

Artritli siçanların dözümlülüyünü ölçmək üçün protokol

Artritli siçanların dözümlülüyünü ölçmək üçün protokol


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bəzi siçanları artritlə xəstələndirəcəyəm. Nəzarət olaraq sınaqdan keçirdiyim dərmanın həddindən artıq yorğunluğa səbəb olduğu bilinir. Düşünürəm ki, onu təkmilləşdirmişəm. Morfin kimi bir şeyin varlığında onların dözümlülüyünü insancasına ölçmək istərdim. Bunu etik olaraq necə edərdim?


İnanıram ki, standart pilləli sürətli qaçış yolu testidir. Bir nümunə pub:

Yeddi inbred siçan suşlarında məcburi və könüllü dözümlülük məşq performansında genetik dəyişkənlik

Əgər xüsusi etik narahatlıq varsa, siz həmişə institusional baxış panelinizdə onu nəzərdən keçirməlisiniz. Heyvan resursları departamentinizə (və ya müəssisənizdə nə ad verilirsə) zəng etsəniz, onlar demək olar ki, həmişə üstünlük verilən LOP-ların siyahısını verəcəklər.

Başqa bir seçim, davranış nəzarəti altında olduqda, yuxuya vaxt ayırmaq olardı. Bununla bağlı problem, hətta yüksək sürətlə lentlərə baxmaq üçün tələb olunan çox sayda insan saatıdır. Bunun əvəzinə bu kağızı yoxlamağı məsləhət görürəm:

Tərəfdaş üstünlük testlərini təhlil etmək üçün iki avtomatlaşdırılmış metrikanın qiymətləndirilməsi

Sonra dəqiq xal almaq üçün kompüterin onu götürməsi üçün küncə güclü rəngli yataq dəsti qoyurdum. Yataq dəstini ən azı bir həftə əvvəl qoyduğunuzdan əmin olun ki, siçanlar buna öyrəşsinlər və əslində yatsınlar.


Əgər siçanlar qaçış yolu ilə yeriyə bilməyəcəklərsə, bu onların çox xəstə olacağını göstərirsə, sadəcə onların ev kafesindəki fəaliyyətini ölçə bilərsiniz. Qəfəsdə müəyyən normal, ilkin fəaliyyət səviyyəsi var. Nəzarətləri plasebo ilə eksperimentallarla müqayisə edə bilərsiniz. Əgər sınaqdan keçirdiyiniz dərman ev kafesi aktivliyini artırırsa, o zaman təsirli görünür. Xie və başqaları. kifayət qədər əhatəli sistemi təsvir edin.

Budur bir nümunə. Əsasən bu, siçanın qəfəsdə olduğunu xy məkanında müəyyən etmək üçün nəzərdə tutulmuş çox həssas, 4 postlu miqyasdır.


Siçan testislərinə cinsi hüceyrə transplantasiyası proseduru

Məqsəd: Siçan testislərinin seminifer epitelinə mikrob hüceyrələrinin transplantasiyasını təhlil etmək üçün izlənilən addım-addım protokolu göstərmək üçün.

Dizayn: Reproduktiv və regenerativ təbabətdə tədqiqat üçün heyvan modelinin video təqdimatı.

Parametr: Tədqiqat laboratoriyası.

Heyvan(lar): Erkək çılpaq siçanlar (NU-Foxn1(nu)).

Müdaxilə(lər): Siçanlar alkilant birləşmələri (busulfan) ilə kimyəvi sterilizasiya edildi, sonra donor mikrob hüceyrələrini yeritmək üçün cinsiyyət orqanlarının mikrocərrahiyyəsi aparıldı.

Əsas nəticə ölçüləri: Donor hüceyrələri yaşıl flüoresan zülal (GFP), laktoza operon (LacZ) kimi məruzəçi genlərlə etiketlənməlidir və ya alternativ olaraq, alıcı testislərdə onları izləmək üçün xüsusi antikorlarla effektiv strategiya tərtib etməlidir. Eyakulyasiyada sperma aşkarlanması da oxunuş kimi istifadə edilə bilər. Lakin bu halda spermada donor genotipinin aşkar edilməsi onların mənşəyini aydınlaşdırmaq üçün məcburidir.

Nəticələr): Bu işdə resipient siçanların hazırlanması, mikrob hüceyrə transplantasiyası üçün əməliyyat və alıcı testislərin təhlili daxil olmaqla, efferent kanal inyeksiyası ilə mikrob hüceyrəsi nəqli üçün tam protokolu təsvir edirik. Bu texnikanın əsas gücü ondan ibarətdir ki, o, germ hüceyrə potensialının funksional testi üçün qızıl standart təşkil edir, çünki yalnız spermatoqonial kök hüceyrələr seminal lümeni düzgün şəkildə kolonizasiya edə bilir. Həm təzə, həm də dondurulmuş/ərimiş testis hüceyrələri donor mikrob hüceyrələri kimi bu texnika üçün uyğundur. Həmçinin, transplantasiyadan əvvəl canlı spermatoqonial kök hüceyrələrin zənginləşdirilməsi kolonizasiyanın effektivliyini artırır. Mikrob hüceyrələrinin düzgün kolonizasiyası üçün niş mövcud olmalıdır və beləliklə, adətən W/W(v) mutant siçanları kimi endogen spermatogenezi olmayan siçan suşlarından istifadə olunur. Uyğun olmayan donor hüceyrələr vəziyyətində, immunsupressiyaya məruz qalmış alıcı siçanların seminifer epiteli transplantasiyadan əvvəl germ hüceyrəsi tükənməlidir. Bu texnikanın bir məhdudiyyəti prosedurun 3 aya qədər çəkə bilməsidir. Həmçinin, siçan-siçan transplantasiyasında spermatogenezin tam bərpasından fərqli olaraq, filogenetik cəhətdən uzaq növlərdən, məsələn, insanlardan siçan alıcılarına ksenotransplantasiya, donor hüceyrələrin kolonizasiyası və spermatoqonial genişlənmə ilə nəticələnir, lakin onların spermatogen inkişafında uğursuzluqla nəticələnir. alıcı niş ilə təkamül uyğunsuzluqlarına görə. Siçan sahiblərinin dərisi altında donor testis toxumasının parçalarının ksenoqraflanması bu məhdudiyyəti həll etmək üçün hazırda araşdırılan alternativ bir yanaşmadır.

Nəticə(lər): Spermatoqonial kök hüceyrələrin siçan testislərinin seminal lümeninə transplantasiyası bu hüceyrə subpopulyasiyasını kolonizasiya etmək qabiliyyəti ilə müəyyən edən funksional analizdir. Bu texnika transplantasiyadan əvvəl donor hüceyrələrin genetik manipulyasiyası yolu ilə transgen heyvanlar istehsal etmək, spermatozoidal kök hüceyrələrin anlayışlarını aydınlaşdırmaq üçün bir model kimi istifadə edilə bilər, eyni zamanda iri heyvanlarda mümkün olduğu üçün mal-qara və insanlarda məhsuldarlığın qorunmasında potensial tətbiqlərə malikdir. son hesabatlar, allogenik transplantasiyadan sonra spermatogenezi bərpa edən rhesus meymunları ilə nümayiş etdirildiyi kimi, hətta insan kadavra testislərindən də. Beləliklə, alkilant kimyaterapiyası ilə müalicə olunan prepuberal oğlanlardan təcrid olunmuş spermatoqonial kök hüceyrələr gələcəkdə spermatogenezi bərpa etmək üçün xayalarına qaytarıla bilər.

Açar sözlər: Spermatoqonial kök hüceyrələrin seminifer epitelinin kolonizasiyası germ hüceyrə transplantasiyası spermatogenezin bərpası.

Copyright © 2014 Amerika Reproduktiv Tibb Cəmiyyəti. Elsevier Inc tərəfindən nəşr edilmişdir. Bütün hüquqlar qorunur.


Giriş

Romatoid artrit (RA) oynaqlarda və ağciyər kimi digər orqanlarda xroniki iltihaba səbəb olan otoimmün xəstəlikdir. Ağciyər ağırlaşmaları tez-tez rast gəlinir (19% və RA xəstələrində ikinci əsas ölüm səbəbidir (1). RA xəstələrindən alınan klinik məlumatlar, bronxoalveolar yuyulma mayelərində sitrulinləşdirilmiş zülallara qarşı avto-antikorların (auto-Abs) oynaqların iltihabı və məhv edilməsindən əvvəl klinikadan əvvəlki fazada uzun müddət (5-x0201315 il) aşkar edildiyini göstərir. - selikli qişanın otoimmünitetinin RA-da otoimmün xəstəliyin digər sistemli inkişafından əvvəl ola biləcəyinə dair daimi fərziyyə (4). Bu tapıntılar ağciyərin RA ilə əlaqəli otoimmünizm üçün başlanğıc yeri ola biləcəyini göstərir (4). Müvafiq olaraq, zəif başa düşülən mövzu olan RA ilə əlaqəli ağciyər patogenezini müəyyən etmək və onu sakitləşdirə biləcək agentləri müəyyən etmək həm RA ilə əlaqəli ağciyər və oynaq xəstəlikləri üçün böyük terapevtik imkanlar təklif edir.

K/BxN siçanları, transgenik KRN T hüceyrələrinin MHC sinif II I-A g7 molekulları tərəfindən təqdim edilən öz-antigen (Ag) olan qlükoza-6-fosfat izomerazanı (GPI) tanıdığı otoimmün artrit modelidir. İnsan RA xəstələrində olduğu kimi, auto-abs K/BxN siçanlarında xəstəliyin patogenezi üçün çox vacibdir (5). Əhəmiyyətli olan odur ki, K/BxN siçanlarının ağciyərlərində induksiyalı bronxla əlaqəli limfoid toxuma (iBALT) kimi strukturlar (6), RA xəstələrində ağciyər toxumasının zədələnməsi ilə əlaqəli olduğu bilinən ektopik limfoid toxumalar (7) inkişaf etdirdiyi göstərilmişdir. T follikulyar köməkçi (Tfh) hüceyrələri B hüceyrələrinə yüksək yaxınlıq və yüksək titrli Abs (8�) əmələ gətirməyə kömək edən CD4 + T hüceyrələrinin mühüm alt dəstidir və həddindən artıq Tfh hüceyrə reaksiyası RA da daxil olmaqla bir çox otoimmün vəziyyətə gətirib çıxara bilər. 11). T helper 17 (Th17) hüceyrələri, bir çox otoimmün xəstəliklərdə iştirak edən T effektor hüceyrə növü, auto-Ab istehsalını və iltihabı təşviq edir (12). Əvvəlki məlumatlarımız göstərdi ki, bağırsaq mikrobiotasının seqmentli filamentli bakteriyaları (SFB) səbəb olduğu Tfh və Th17 hüceyrələri K/BxN siçanlarında avto-Ab istehsalına əhəmiyyətli dərəcədə kömək edir və hər iki T-efektor hüceyrə növünün olmaması auto-Ab istehsalını və otoimmün fəaliyyətini güclü şəkildə yaxşılaşdırır. artrit inkişafı (13, 14).

A vitamininin bir metaboliti olan retinoik turşu immun reaksiyaları tənzimləmək də daxil olmaqla geniş bioloji aktivliyə malikdir (15). AM80, retinoid metabolitlərinin ən aktiv fizioloji üzvlərindən biri olan all-trans retinoik turşusu ilə müqayisədə daha yüksək sabitlik və daha az potensial mənfi təsirlərlə xarakterizə olunan sintetik retinoik turşudur (16, 17). Məlumat verilmişdir ki, retinoik turşu və AM80 eksperimental otoimmün miyozit, eksperimental otoimmün ensefalit və kollagenin səbəb olduğu artrit daxil olmaqla bir çox otoimmün reaksiyaları yaxşılaşdırır (18�). Retinoik turşunun ağciyərdəki təsirlərinə gəldikdə, retinoik turşu ilə müalicənin ağciyər amfizemini ləğv etdiyi göstərilmişdir (22, 23), lakin onun otoimmünlə əlaqəli ağciyər xəstəliklərində təsiri haqqında çox az şey məlumdur. In vitro retinoik turşunun kulturası bağırsaq reseptoru inteqrininin T hüceyrələrində ifadəsini artırır (24-x0201326). 㬔㬧 integrin reseptorları Peyer yamaqlarından (PP) və mezenterik limfa düyünlərindən (LN) dendritik hüceyrələr (DC) tərəfindən lenfositlərə həkk olunur (26, 27). Bu yaxınlarda aparılan bir araşdırma, ağciyər DC-lərinin də bağırsaq-homing inteqrinini tənzimləyə biləcəyini aşkar etdi ” in vitroin vivo (28). Retinoik turşunun antiinflamatuar təsirlərinin əsas hissəsi Th17-nin inhibə edilməsindən və Foxp3 + tənzimləyici T hüceyrəsi (Treg) cavablarının təşviqindən asılıdır (15, 29). Retinoik turşunun selikli qişada iştirakının güclü təsiri olmasına baxmayaraq, selikli qişada Th17 və Treg reaksiyalarında onun rolu ilə bağlı çox az şey məlumdur. in vivo məsələn, ağciyər və nazik bağırsaq-lamina propriasında (SI-LP). Bundan əlavə, Tfh reaksiyasında retinoik turşunun rolu böyük ölçüdə naməlum olaraq qalır.

Burada, sintetik retinoid AM80-in otoimmünlə əlaqəli ağciyər xəstəliklərini basdırıb basdırmadığını araşdırırıq. Onun potensial terapevtik mexanizmini aydınlaşdırmaq üçün biz AM80-in patoloji T effektor hüceyrələrinə, Tfh və Th17 hüceyrələrinə, həmçinin həm selikli qişada, həm də qeyri-mukozal immun bölmələrində Treglərə təsirini müqayisə etdik. Biz AM80-in Tfh hüceyrələri və Th17 hüceyrələri kimi patoloji T effektor hüceyrələrini bağırsağa və beləliklə, sistemik (qeyri-bağırsaq) iltihablı toxumalardan uzaqlaşdıraraq otoimmün reaksiyaları boğduğunu soruşaraq retinoik turşunun yeni terapevtik mexanizmini müəyyən edirik. . Qeyd etmək lazımdır ki, bu araşdırmaya retinoik turşunun RA ilə əlaqəli ağciyər xəstəliyinə təsirinə diqqət yetirməklə başlasaq da, təhlilimizə AM80-in birgə xəstəliklərə təsirini də daxil etdik. Bu təhlillər göstərir ki, ağciyərdə əldə etdiyimiz tapıntılar oynaq xəstəliklərinə asanlıqla tətbiq olunur, çünki biz RA ilə əlaqəli oynaq və ağciyər xəstəliklərində AM80-in immunorequlyasiya təsirləri arasında güclü korrelyasiya göstəririk.


Apoptozun və hüceyrə ölümünün digər formalarının ölçülməsi

Proqramlaşdırılmış hüceyrə ölümü (PCD) və ya apoptoz çoxhüceyrəli orqanizmlərdə inkişafın və homeostazın mühüm tənzimləyicisi kimi meydana çıxdığından, apoptozu kəmiyyətcə təyin etmək və onu nekrozdan ayırmaq üçün üsullar işlənib hazırlanmışdır. Bu bölmə bu məqsədlər üçün bir sıra analizlər təqdim edir, onların çoxu texniki cəhətdən çox sadədir və hematopoetik hüceyrələrin öyrənilməsi üçün idealdır. Birinci əsas protokol işıq və ya flüoresan mikroskopiyadan istifadə edərək limfosit hüceyrə mədəniyyətlərində apoptozun keyfiyyət və kəmiyyət qiymətləndirilməsinə imkan verir. Nüvə DNT fraqmentasiyasını aşkar etmək üçün nəzərdə tutulmuş üç protokol və dəstək protokolları sınaqdan keçirilməli olan hüceyrələrin DNT və sitoplazmasını radiolabelləşdirmə üsullarını təsvir edir. Axın sitometriyasından istifadə edərək apoptotik hüceyrələrin miqdarını təyin edən üsullar daha sonra təsvir edilir və dəstək protokolları T hüceyrə reseptorunun (TCR) səbəb olduğu apoptoz üçün müvafiq olaraq T-hüceyrə klonlarının və təzə təcrid olunmuş limfa düyünlərinin hüceyrələrinin hazırlanması üsullarını təmin edir. Apoptotik hüceyrələrdə DNT parçalanmasının kəmiyyətcə aşkarlanması da təsvir edilmişdir. TdT vasitəçiliyi ilə həyata keçirilən dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) üsulları apoptotik hüceyrələrin aşkarlanması üçün TUNEL və TUNEL-dən istifadə edərək apoptotik hüceyrələrin axınının sitometrik kəmiyyətinin təyin edilməsi prosedurları ilə yanaşı, apoptotik hüceyrələri müəyyən etmək üçün toxuma hissələrinin rənglənməsi ilə təmin edilir. Proqramlaşdırılmış ölümün molekulyar yolları haqqında çox şey natamam başa düşülmədiyindən və apoptotik hüceyrə ölümünün müşahidəsini təsdiqləmək üçün əsas protokollardan birdən çoxunu yerinə yetirmək daha yaxşı olar.


NƏTİCƏLƏR

Klinik müayinənin nəticələri

Ümumilikdə, kollagen yeridilmiş 12 eksperimental siçandan 6-da artritin induksiyasından 30 gün sonra ayaq oynaqlarında qızartı, şişkinlik və axsaqlıq, eləcə də yüksəlmiş limfosit:qranulosit nisbəti kimi nəzərə çarpan klinik təzahürlərlə ağır artrit inkişaf etdirdi (əlavə məlumat). sorğu əsasında müvafiq müəllifdən əldə edilə bilər). Normal limfosit:qranulosit nisbəti ~3:1 olan sağlam nəzarət siçanında RA-nın klinik təzahürləri müşahidə edilməmişdir.

In vivo görüntüləmənin nəticələri

L-selektin/P-selektin-hədəfləndirici kontrast agent dPGS-NIR-in siçan əzalarına yeridildikdən 2 saat 30 dəqiqə sonra MSOT, 240-a qədər müxtəlif vaxt nöqtələrindəki ilə müqayisədə sağlam ayaqlar və artritli ayaqlar arasında optimal kontrastı təmin etdi. dəqiqə (nəticələr göstərilmir). İşlənmiş MSOT şəkilləri kollagen enjeksiyonu almış və iltihab əlamətləri inkişaf etdirmiş heyvanların sağ (sağlam) və sol (artrit) tərəfləri arasında aydın fərqi aşkar etdi. Artritin irəliləmə dərəcəsindən və onun klinik xüsusiyyətlərindən asılı olaraq, MRT-də sinovitin aşkar olduğu bütün siçanların artrit oynaqlarında MSOT siqnalında >35% əhəmiyyətli artım müşahidə oluna bilər, halbuki yalnız bir sağlam siçan anormal yığılma göstərmişdir. zond yalnız bir əzada (P Normal oynaqlarda ölçülmüş siqnalın ortasına qarşı iltihablı oynaqlarda ölçülmüş siqnalın orta göstəricisi üçün = 0,023).

Şəkil 1-də kliniki müayinə zamanı aşkar olunan şişlik, qızartı və əzanın sərtliyi olan artritin inkişaf etmiş mərhələsində olan heyvan nümunəsi göstərilir. 860 nm tək işıqlandırma dalğasından istifadə edən MSOT görüntülərində sol oynaq sağ oynaqdan daha böyük görünürdü (Şəkil 1A və D). Multispektral qarışdırmadan sonra müəyyən edilmiş siqnalın, yəni dPGS-NIR-in yığılmasının daha çox piksel tutduğu və həmçinin sol oynaqda daha sıx olduğu ortaya çıxdı (Şəkil 1B və E).

Ayaq biləyinin multispektral optoakustik tomoqrafiyası (MSOT)An) və dizlər (K) polianion dendritik poligliserol sulfat (dPGS) kontrast agenti ilə yaxın infraqırmızı (NIR) görüntüləmədən istifadə edərək, artritin inkişaf etmiş mərhələsində nümayəndəsi siçanın. A–F, Sol və sağ ayaq biləyinin MSOT şəkilləri (A) və dizlər (D) anatomik kontrast üçün 860 nm işıqlandırma dalğa uzunluğunda əldə edilmişdir. Ayaq biləklərində dPGS-NIR yığılması və oksigenli hemoglobin üçün MSOT siqnalları (BC) və dizlərdə (EF) anatomik şəkillərdə flüoresan örtüklər kimi göstərilir. Sidik kisəsinin bir hissəsi də görünür. Barlar = 5 mm. GH, Sagittal T1-çəkili maqnit rezonans görüntüləri əvvəl eyni siçanın sol diz oynağından əldə edilmişdir. (G) və sonra (H) gadolinium enjeksiyonu. BV = qan damarı.

Artritin diaqnostikası, iltihablı nahiyənin səhnələşdirilməsi və müalicəni potensial olaraq dəqiq izləmək üçün sırf vizual müşahidə kifayət etmədiyi üçün biz heyvan modelimizdə sol (artrit) və sağ (sağlam) oynaqların müqayisəsi üçün kəmiyyət üsulunu hazırladıq. Şəkil 1-də göstərilən nümayəndəsi heyvanda, bu, sol və sağ oynaqlar arasında ~72% siqnal artımına çevrilir, sağlam tərəfdən gələn siqnal ilə müqayisədə 83 ixtiyari vahid (AU) dPGS-NIR siqnal dəyəri təqdim olunur. >140 AU artrit dizdə. Eyni heyvanın ayaq biləklərində sağlam tərəflə artrit tərəfi arasında nisbət 600%-ə çatdı, dPGS-NIR siqnal dəyəri sağ oynaqda 42 AU, sol oynaqda 300 AU ilə müqayisədə.

Heyvanda qan dövranının yaxşı göstəricisi olan oksigenlə zəngin hemoglobinin tərkibinin MSOT görüntüləməsi göstərdi ki, görüntüləmə zamanı zond ekstravazasiya edilib və topuq və dizlərdə qan axınından demək olar ki, tamamilə yox olub (Şəkil 1B, C, E və F). Üstəlik, MSOT görüntüləməsi, kəskin iltihab şəraitində gözlənildiyi kimi, iltihablı oynağın yaxınlığında dolaşan qanın həcminin sağlam ayaqlara nisbətən daha yüksək olduğunu göstərdi. Dizin eninə təsvirində (Şəkil 1F), sağlam ayaqda 0,65 mm 2 ilə müqayisədə safen vena və arteriya artritli ayaqda ~2,6 mm 2 lümen səthini göstərir.

Ümumilikdə, orta dərəcədə iltihabı olan artritli heyvanlar, sol dizdəki dəyərlər adətən 110 AU ilə 132 AU arasında dəyişən, lakin sağ dizdəki dəyərlərə yaxın olan 48 ± 11% prob yığılmasında orta ± SD fərq nümayiş etdirdi. sağlam heyvanlar (84 AU). Daha ekstremal hallarda, prob yığılmasında fərq demək olar ki, 80% -ə çatdı.

3 ölçülü bir həcm yaratmaq üçün 2 ölçülü şəkillər istifadə edildikdə, oynaqlarda və ətrafında iltihabın dərəcəsini və intensivliyini vizual olaraq görmək daha asan oldu. Bu texnikadan istifadə edərək, dPGS-NIR-in bazal səviyyəsi siçanın sağlam sağ ayağında görünə bilər. Bunun əksinə olaraq, kollagen induksiyası alan ayaqda kontrast agent siqnalının həm həcmində, həm də intensivliyində artım bütün oynaqların ətrafında, eləcə də ayaq biləyinin üstündə müşahidə edilə bilər (video http://www.cbi. ei.turn.de/index.php?id=109).

Paralel olaraq, gadolinium kontrast agentinin yeridilməsindən əvvəl və birbaşa sonra diz oynağının sagittal görünüşünə nail olmaq üçün eyni siçanlarda MRT aparılmışdır. Klinik təzahürlər və MRT nəticələrinin kombinasiyası ilə müəyyən edilən RA inkişaf etdirən siçanlarda biz adətən induksiya birləşməsinin vurulduğu yerə yaxın sol ayağın dizində, sağlam sağ dizdə isə (kollagen induksiyası olmadan) sinovit aşkar edə bildik. RA ilə əlaqəli hər hansı bir tapıntı yox idi. Əlavə olaraq, bəzi artritli siçanlarda oynağın qızartı, şişkinliyi və ya axsaqlığı ilə müşayiət olunan MRT vasitəsilə oynağı əhatə edən nahiyənin yumşaq və ya şiddətli yumşaq toxuma şişməsi, həmçinin oynaq yaxınlığında ödem nəzərə çarpırdı.

Klinik simptomların şiddəti MRT vasitəsilə görünən patoloji dəyişikliklərin dərəcəsi ilə əlaqələndirilir və beləliklə, iltihablı sahənin mərhələlərini təyin etməyə imkan verir. Şəkil 1-də təqdim olunan xüsusi heyvan MRT-də gadolinium inyeksiyasından sonra (Şəkil 1G və H) aşkar klinik simptomlarla vurğulanan çox geniş sinovit nümayiş etdirdi. Baldır və tibia boyunca da şişlik müşahidə edildi və limfosit:qranulosit nisbəti 1,8 idi, bu da kəskin iltihab vəziyyətinin mövcud olduğunu təsdiqləyir.

Bunun əksinə olaraq, sağlam oynaqda (kollagen inyeksiyası və ya inyeksiya edilmiş heyvanın sağ tərəfindəki əza olmadan) diz və ayaq biləyində MSOT tərəfindən yalnız aşağı, lakin fərqlənən siqnal aşkar edilmişdir ki, bu da dPGS- kimi müəyyən edilə bilər. Spektral qarışdırma yolu ilə NIR (Şəkil 2). Hər tərəfdəki artikulyasiyalardan alınan siqnalın miqdarı vizual olaraq müqayisə edilə bilərdi, bu da yalnız L-selektinlərin və P-selektinlərin bazal iltihabının olduğunu göstərirdi, bu da iltihabın olmadığını və sidik kisəsindən bəzi siqnalların da göründüyünü göstərir. ilkin flüoresan təcrübələrində görünən birləşmənin ifrazat yolunu təsdiq edən (nəticələr sorğu əsasında müvafiq müəllifdən əldə edilə bilər). Sağlam heyvanlarda 2 tərəfin dPGS-NIR siqnal intensivliyi arasındakı fərqin mütləq dəyəri hər bir heyvanda <30% olub, sağ tərəfdə əldə edilənə bənzər orta ± SD siqnal gücü ~84 ± 17 AU olub. enjekte edilmiş heyvanlardan.

topuqların MSOT görüntüsü (An) və dizlər (K) dPGS kontrast agenti ilə NIR təsvirindən istifadə edən sağlam siçanın nümayəndəsi. A–F, Sol və sağ ayaq biləyinin MSOT şəkilləri (A) və dizlər (D) anatomik kontrast üçün 860 nm işıqlandırma dalğa uzunluğunda əldə edilmişdir. Ayaq biləklərində dPGS-NIR yığılması və oksigenli hemoglobin üçün MSOT siqnalları (BC) və dizlərdə (EF) anatomik şəkillərdə flüoresan örtüklər kimi göstərilir. sidik kisəsinin bir hissəsi (Bl) də görünür. Barlar = 5 mm. GH, Sagittal T1-çəkili maqnit rezonans görüntüləri əvvəl eyni siçanın sol diz oynağından əldə edilmişdir. (G) və sonra (H) gadolinium enjeksiyonu. BV = qan damarı.

Bundan əlavə, sağlam siçanların hər iki tərəfindəki oynaqlarda qan miqdarı və qan damarlarının həcmi eyni idi ki, bu da iltihabın olmadığını təsdiqləyir. Diz yaxınlığında görünən safen qan damarlarının lümeni hər iki tərəfdən müqayisə edilə bilər, sol tərəfdə 0,65 mm 2 və sağ tərəfdə 0,59 mm 2 idi və bu dəyərlər sağlam insanların dizlərində müşahidə olunanlara oxşar idi. siçanlar (Şəkil 2). Sağlam heyvanlardan alınan MR görüntülərində nə sinovit, nə də şişlik görünmürdü (Şəkillər 2G və H).

Bu heyvan kohortunda istifadə olunan metodların səmərəliliyini qiymətləndirmək üçün klassik mərhələ üsulları ilə MSOT nəticələri arasında iltihabın mərhələlərinin sistematik müqayisəsini apardıq. Mərhələlər iltihabın olmaması, aşağı iltihab və ya yüksək iltihab kimi müəyyən edilmişdir (Şəkil 3-də göstərildiyi kimi). Sağlam oynaqların MSOT nəticələri (yəni, dPGS-NIR kontrast agenti ilə qeyri-artritik olaraq təyin olunanlar) eyni oynaqların MR görüntülərində klinik simptomların olmamasına və sinovitin olmamasına uyğun gəlir. Aşağı iltihablı olduğu müəyyən edilən heyvanlar MR görüntülərində məhdud klinik simptomlar və yüngül və orta dərəcəli sinovitlər nümayiş etdirdilər. MSOT şəkilləri yüksək iltihabı göstərən heyvanların MR görüntülərində geniş klinik simptomlara və orta-ağır sinovitlərə malik olduğu aşkar edilmişdir. Sağlam heyvanların hər iki tərəfində oxşar səviyyədə dPGS-NIR yığılması olduğu təsdiq edilmişdir, halbuki aşağı və ya orta dərəcəli iltihabı olan heyvanlarda dPGS-NIR yığılmasında tərəflər arasında fərq təxminən 50% təşkil edirdi və heyvanlarda >70%-ə qədər yüksəlir. yüksək iltihab. Bu fərqin hesablanmış standart sapması əhəmiyyətli olsa da (aşağı iltihab üçün 7%-dən sağlam heyvanlar üçün 15%-ə qədər), panelimizdəki heyvanları ayırd etmək və təsnif etmək üçün kifayət qədər aşağı qaldı.

Klinik müayinə və maqnit rezonans görüntüləmə ilə iltihabın qiymətləndirilməsi ilə müqayisədə bir sıra heyvanlarda sağlam və iltihablı tərəflər arasında MSOT dPGS-NIR siqnalındakı fərq. MSOT-da sağlam (qeyri-artritik) oynaqlara malik olduğu müəyyən edilən siçan qrupu heç bir görünən iltihab əlaməti və normal qan hüceyrələrinin sayı göstərməyib. Aşağı iltihablı siçanlar qrupunda daha az şiddətli sinovit və dəyişdirilmiş qan hüceyrələrinin sayı var idi. Yüksək iltihablı siçanlar qrupu sinovitin şiddətini və aşağı limfosit:qranulosit nisbətini nümayiş etdirdi. Barlar əzalar arasında dPGS-NIR yığılmasında fərqin mütləq dəyərlərini təmsil edən orta ± SD faizini göstərir. Təriflər üçün Şəkil 1-ə baxın.

Histopatoloji analizin nəticələri

Sağlam siçanların üzvlərinin və artritli siçanların sağ üzvlərinin hematoksilin və eozinlə boyanması heç bir patoloji dəyişikliyi aşkar etməyib, artritli siçanların sol ətraflarında isə kapsulda iltihablı infiltratlar aşkar edilib. Şəkil 4A-D-də göstərildiyi kimi, sağlam oynaqlar hematoksilin və eozinlə boyanma ilə göstərildiyi kimi normal morfoloji strukturları və diz oynağında kontrast maddənin çox az və diffuz yığılmasını göstərdi. Bunun əksinə olaraq, iltihablı oynaqlar, hematoksilin və eozin boyanması ilə təsdiqləndiyi kimi, kontrast agentin artrit bölgəsində böyük dərəcədə yığılmasını göstərdi, beləliklə, MSOT-da makroskopik olaraq in vivo müşahidə edilən zondun yığılmasını təsdiqləyir. Bu tapıntılar ərazidə L-selektinlərin və P-selektinlərin artan ifadəsinin göstəricisidir. Bundan əlavə, iltihablı oynaqlar artritin klassik morfoloji və fizioloji xüsusiyyətlərini göstərirdi. Xüsusilə, sinovial mayenin həcmi daha yüksək, kapsul formasının pozulması ilə ortaya çıxdı. Qığırdağın sümüyə aşınması, kapsula daxil olan geniş infiltratlar görünə bilər. İltihabi hüceyrələr, xüsusən də leykositlər bütün artikulyasiyada mövcud idi və yayılmışdır.

Siçan diz eklemlerinin mikroskopiya analizi. Sağlam bir siçanın diz oynaqları (AC) və kollagenin səbəb olduğu artritli siçan (BD) histopatoloji analiz üçün hematoksilin və eozin ilə boyanmışdır (AB) və kontrast agent (qırmızı kanal) kimi flüoresan indokarbosiyanin konjugatı ilə DAPI (mavi kanal) və polianion dendritik poliqliserol sulfatdan istifadə edərək flüoresan görüntüləmə ilə qiymətləndirilir. (CD). Barlar = 100 μm.


TARAZ SABİTLƏRİNİN ÖLÇÜLMƏSİ ÜÇÜN İKİ STRATEGIYA

Yaxınlıqları ölçmək üçün iki ümumi seçim mövcuddur. 1) bir tarazlıq təcrübəsi, biri reaktivlərdən birinin konsentrasiyasından asılı olaraq reaksiyanın dərəcəsini təyin edir. Bu məlumatların təhlili tarazlıq sabitini verir. 2) a kinetik təcrübə, biri reaktivlərdən birinin konsentrasiyasından asılı olaraq irəli və əks reaksiyaların sürətlərini təyin edir. Bu məlumatların təhlili irəli və əks reaksiyalar üçün sürət sabitlərini verir. Bu sürət sabitlərinin nisbəti tarazlıq sabitini verir.

Kinetik yanaşma daha aşkardır, çünki o, təkcə termodinamik parametri, tarazlıq sabitini deyil, həm də sistemin dinamikasını xarakterizə edən sürət sabitlərini verir. Qeyd edək ki, küçə sürət sabitlərindən tarazlıq sabitlərinə qədər bir yoldur. Bir tarazlıq təcrübəsindən yalnız yaxınlığı bilmək aşkar edir heç nə İrəli və ya əks reaksiyaların sürətləri haqqında. Ümumiyyətlə tarazlıq təcrübələrindən daha güclü olsa da, kinetik təcrübələr çox vaxt daha çox reagentlər və daha mürəkkəb analizlər tələb edir.


Kövrəkliyin yeni siçan modeli: Cu/Zn superoksid dismutaz nokaut siçanı

Kəskinlik ABŞ-da yaşayan yaşlı insanlar üçün mühüm ictimai sağlamlıq problemi olan geriatrik sindromdur. İnsanlarda zəifliyi ölçmək üçün bir neçə üsul işlənib hazırlansa da, onun etiologiyası haqqında çox az anlayışımız var. Kövrəkliyin molekulyar əsasları zəif başa düşüldüyünə görə, siçan modelləri kövrəkliyin inkişafına hansı yolların töhfə verdiyini müəyyən etməkdə böyük dəyərə malik olardı. Daha da əhəmiyyətlisi, siçan modelləri zəifliyi müalicə etmək və ehtimal ki, qarşısını almaq üçün potensial müalicələrin sınaqdan keçirilməsində kritik rol oynayacaqdır. Bu yazıda Cu/Zn superoksid dismutaz antioksidant fermenti olmayan Sod1KO siçanlarının mükəmməl bir zəiflik modeli olduğunu göstərən məlumatları təqdim edirik və Sod1KO siçanlarını yalnız digər zəiflik modeli olan siçanlarla müqayisə edirik. IL-10 genindən. Sod1KO siçanları insan zəifliyini təyin etmək üçün istifadə edilən dörd xüsusiyyət nümayiş etdirir: çəki itkisi, zəiflik, aşağı fiziki fəaliyyət və tükənmə. Bundan əlavə, Sod1KO siçanları artan iltihab və sarkopeniya göstərir ki, bu da insan zəifliyi ilə güclü şəkildə əlaqələndirilir. Sod1KO siçanları həmçinin zəifliyin etiologiyasında rol oynaması təklif edilən yollarda dəyişikliklər göstərir: oksidləşdirici stress, mitoxondrial disfunksiya və hüceyrə qocalması. Sod1KO siçanlarından istifadə edərək, pəhriz məhdudiyyətinin siçanlarda zəiflik xüsusiyyətlərini gecikdirə / qarşısını ala biləcəyini göstəririk.

Açar sözlər: Cu/Zn superoksid dismutaz Kövrəklik İltihab Oksidləşdirici stress Sarkopeniya Qocalıq.

Rəqəmlər

Əzələ kütləsi azalır...

Sod1KO siçanlarında əzələ kütləsi azalır. a WT-nin arxa əzələ kütləsi...

Əzələ gücü azalır…

Sod1KO siçanlarında əzələ gücü azalır. a 9 aylıq oğlanın tutma gücü...

Könüllü təkər qaçışı, rotarod performansı,…

Sod1KO siçanlarında könüllü təkər qaçışı, fırlanma performansı və qaçış yolu dözümlülüyü azalır.

İltihabın ölçüləri artır...

Sod1KO siçanlarında iltihabın ölçüləri artır. a NFκB-nin bağlanma fəaliyyəti...

Oksidləşdirici stress, mitoxondrial disfunksiya və…

Sod1KO siçanlarında oksidləşdirici stress, mitoxondrial disfunksiya və hüceyrə qocalması artır. a…


IVIS Metodları və Protokolları

  1. Heyvanların və təsvir məhsullarının optimal birləşməsini müəyyən etmək üçün təcrübənizi əsas direktorla müzakirə edin.
  2. Plitə a qara in vivo təcrübələrə cəhd etməzdən əvvəl siqnalınızın aşkar edilməsini təmin etmək üçün in vitro görüntü məhsulunuzun seyreltmələri ilə quyu boşqabını (boşqab alış məlumatı).
  3. Tövsiyə olunan heyvanlar: siçanlara üstünlük verilir, çünki siçovullardan istifadə edirsinizsə, hazırda bu heyvanlar üçün avadanlıq daşıyırıq, tədqiqatçılar XGI-8 Anesteziya Sistemini istifadə etmək istəyirlərsə, öz burun konuslarını gətirməlidirlər.
  4. IVIS Əsasımızda biz hələ dovşanlar, pişiklər və ya şinşillalar kimi daha böyük məməlilərdən istifadə etməmişik, lakin bu heyvanlardakı dayaz toxumadan istifadə etmişik.

2) Alma: Optimallaşdırma və Görüntüləmə Protokolu

Bioluminesans

Qeyd: əgər siz həm bioluminescent, həm də flüoresan müxbirlərdən istifadə edərək təcrübə həyata keçirirsinizsə, bioluminessensiyadan ƏVVƏL həmişə flüoressensiyanı təsvir edin, çünki lüminesans bəzi flüoroforlarla (xüsusilə qırmızılar) eyni diapazonda yayıla bilər və flüoresan siqnala müdaxilə edə bilər.

  1. Optimalınızı müəyyənləşdirin in vivo artımlı şəkillər alaraq görüntüləmə vaxtı. Tipik olaraq atəşböcəyi lusiferazası üçün lüminesans 10 dəqiqədən sonra aşkar edilə bilən parlaqlığa çatmır.
  2. Görüntü parametrlərini avtomatik təyin etmək üçün ya əl ilə qurmaq üçün idarəetmə panelindən istifadə edin və ya proqram təminatının Təsvir Sihirbazını (ardıcıllıqla quraşdırma altında) istifadə edin. Qeyd edək ki, luminescent təsvirlər çox vaxt flüoresan təsvirlərə nisbətən daha uzun ekspozisiya müddəti və daha aşağı Fstop tələb edir (daha geniş apertura CCD-yə daha çox işığın daxil olmasına imkan verir). İdeal olaraq, şəkillər 5 dəqiqədən çox çəkməməlidir. CCD kamera tərəfindən avtomatik təyin olunan optimal ekspozisiya şərtlərini tapmaq üçün avtomatik ekspozisiya tövsiyə olunur. Caliper-dən şəkil
  3. Hər şəkil üçün bir parametr dəyişdirərkən birdən çox şəkil çəkmək üçün Sequence Setup-dan istifadə edin.
    Ümumi foton axınının "yaylalarında" ölçülmüş siqnal dəyərinin (təxminən eyni dəyərdə qaldığı) aşağıdakı şəkildəki kimi vaxt nöqtəsini seçin.

Floresensiya

  1. Maksimum siqnal gücünü əl ilə və ya avtomatik olaraq Görüntüləmə Sihirbazından istifadə edərək təyin edin. Qeyd edək ki, flüoresan təsvirlər tez-tez daha sürətli ekspozisiya müddəti, daha böyük Fstop və xüsusi emissiya və həyəcan filtrləri tələb edir. Həmçinin unutmayın ki, heyvan toxuması avtoflüoressensiya yarada bilər, ona görə də fonun çıxarılması lazım ola bilər
  2. Şəkillərin ardıcıllığını çəkin (sehrbaz artıq bunu etməyi sizə təklif etməyibsə)
  3. Təhlil üçün ən yaxşı filtr dəsti şəklini seçin (ardıcıllıqla bütün şəkillərin siqnal ilə səs-küy nisbətlərini müqayisə etməklə) və ya fonda çıxma funksiyalarına keçin:

– Adaptiv FL çıxarma
– Şəkil Riyaziyyat Aləti
– Spektral Qarışdırma

Qabaqcıl Təsvir Məsləhətləri

3D Yenidənqurma

  1. Living Image 3.2 proqramının 3D rekonstruksiya funksiyasından istifadə edərək, hüceyrə nömrə kəmiyyətlə müəyyən edilə bilər. Bunu etmək üçün kameradan istifadə edərək sabit şəkildə inteqrasiya olunmuş hüceyrə xəttinin in vitro ölçülməsi aparılmalıdır. Proqramda toxuma maneəsini düzəldən alqoritmlər sayəsində bu in vitro ölçü daha sonra 3D rekonstruksiyadan əldə edilən siqnalın ölçülməsi ilə əlaqələndirilə bilər.
  2. Living Image 3.2 proqramı 3D rekonstruksiya üçün yaradılan heyvan topoqrafiyasına nisbətən xüsusi olaraq siqnalın “kütlə mərkəzini” tapmaq imkanına malikdir. Tipik olaraq, bir təcrübənin sonunda, siqnal yerini təsdiqləmək üçün heyvanı kisələmək və parçalamaq vacibdir. Proqram heyvanın müxtəlif səthlərindən gələn siqnalın dərinliyini müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilən yan panellərdə millimetr ölçmələrini təmin edir.
  3. Organs can be imaged separately after dissection for comparison with in vivo images and for confirmation of source location.
  4. Remember that animals may be euthanized in the IVIS Core Facility (W914), but dissections must take place elsewhere.

To schedule equipment time or services please use the Cores Equipment Scheduler (CES). For new users click here.

Əlaqə

Francesca Seta, PhD
Core Director
Evans Biomedical Research Center, X-Building
650 Albany St. 7th Floor, Room X-720
Boston, MA 02118
(617) 358-7814| [email protected]

Məkan

IVIS Imaging Core
Boston University Medical Campus
Center for Advanced Biomedical Research, W-Building
700 Albany St., 9th Floor
Boston, MA 02118


Metodlar

Mice and collagen-induced arthritis (CIA) model

PR-flox mice were obtained from Baylor College of Medicine (Houston, TX, USA). A targeting vector designed to replace part of exon 2 of the PR gene with a selectable marker was employed to create a strain of mice carrying a conditional null PR allele [40]. Prx1-Cre mice were purchased from the Jackson Laboratory. Eight-week-old female and male mice were immunized with 100 μg chicken collagen in completed Freund’s adjuvant (CFA) (Chondrex Inc. Redmond WA USA). On day 21, the mice were boosted with 100 μg chicken collagen in in-completed Freund’s adjuvant (IFA) subcutaneously. On day 24, all mice received 50 μg LPS E. coli O111: B4 (Sigma St. Louis, MI USA) via intraperitoneal injection (i.p.) in normal saline. The mice were euthanized on day 50. The onset of the CIA usually occurs on day 26, after initial immunization, and the disease model generally lasts 40 days [41,42,43,44,45].

PCR-based strategies were used for genotyping mouse genomic DNA. All animal work was done in compliance with the guiding principles of UC Davis’s “Care and Use of Animals.” Mice were housed in the animal facility under strictly controlled environmental conditions (12-h light/dark cycle, room temperature 22 °C), and fed ad libitum (food and water). The Institutional Animal Care and Use Committee of the University of California Davis approved the animal protocol.

T cell stimulation for FACS

Total mononuclear cells were collected from peripheral blood using the Ficoll-Paque density gradient method. The cells were then incubated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) in combination with ionomycin for 3 days before running fluorescence-activated cell sorting (FACS). We used the following key markers for activated T cells CD3/PerCP-Cy5.5 (Total T), CD25/PE-CF594, and CD45RO/PE-Cy7 (R &D Systems, Minneapolis, MN, USA).

Measurements of inflammation, bone erosion, and cartilage damage

Whole knee and ankle joints were fixed, decalcified, embedded in paraffin, and stained with hematoxylin or Safranin-O. Inflammation was scored semi-quantitatively from 0 to 5: 0 = normal 1 = minimal infiltration of inflammatory cells and/or mild edema 3 = moderate infiltration 4 = marked infiltration and 5 = severe infiltration. For bone erosion, joint sections were stained for tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and counterstained with hematoxylin (Sigma St Louis, IL, USA). A score of 0–5 was assigned for bone erosion: 0 = normal 1 = minimal (small areas of bone resorption, not readily apparent on low magnification) 2 = mild (more areas of resorption in trabecular and cortical bone) 3 = moderate (obvious bone resorption of trabecular and cortical bone, without defects in cortex or loss of trabeculae) 4 = marked (full-thickness defects in cortical bone and marked trabecular bone loss) and 5 = severe (defects in the entire cortex, marked trabecular bone loss) [46,47,48]. Total TRAP+ cells within the subchondral area were counted and presented as TRAP+ cell/bone surface. Cartilage damage was calculated by the loss of Safranin-O staining that was scored on a semi-quantitative scale from 0 to 4: 0 = intact 1 = minor (< 10%) 2 = moderate (10–50%) 3 = high (50–80%) and 4 = severe (80–100%) [49, 50]. Two blinded observers performed all the scorings. Data are presented as the average of the scores of both observers.

Bone mass measurements by microCT

The right knee joints including both the distal femurs (DFM) and the proximal tibiae were scanned and analyzed using VivaCT 40 (Scanco Medical, Bassersdorf, Switzerland) with a voxel resolution of 10 μm in all three spatial dimensions and a mono-energetic (70 Kev) X-ray source. We evaluated the entire knee covering a total of 645 mm in length centered around the knee joint to obtain total knee bone volume/tissue volume (BV/TV) ratio [34, 51, 52] using 3D image-registration schemes Gaussian filters of sigma = 0.8, support = 1, and threshold = 180 for total knee and DFM. Gaussian filters of sigma = 1, support = 2, and threshold = 280 were applied to register the paw.

Knee histopathology

The left knee joints were fixed in 10% phosphate-buffered saline formalin for 2 days, decalcified in 10% EDTA for 3 weeks, and embedded in paraffin. Sections were stained with Safranin-O—Fast green for measurement of articular cartilage thickness, subchondral bone plate thickness, subchondral trabecular bone number and diameter, and cartilage content using Bioquant Imaging software (Bioquant Imaging System, Nashville, VA USA) [51, 52].

Statistik təhlil

The results are expressed as mean ± standard deviation for bone structure measures, bone turnover, and bone strength variables. Two-way ANOVA was used to account for genotype and sex. If significant differences were observed, then a Sidak’s multiple comparisons test was used to assess pairwise comparisons. A value of səh < 0.05 was considered statistically significant. Data were analyzed using the GraphPad Prism 8 software package (La Jolla, CA, USA).


İçindəkilər

The typical ADCC involves activation of NK cells by antibodies in a multi-tiered progression of immune control. [5] A NK cell expresses Fcγ receptors. These receptors recognize and bind to the reciprocal portion of an antibody, such as IgG, which binds to the surface of a pathogen-infected target cell. The most common of these Fc receptors on the surface of an NK cell is CD16 or FcγRIII. Once the Fc receptor binds to the Fc region of the antibody, the NK cell releases cytotoxic factors that cause the death of the target cell.

During replication of a virus, some of the viral proteins are expressed on the cell surface membrane of the infected cell. Antibodies can then bind to these viral proteins. Next, the NK cells which have reciprocal Fcγ receptors will bind to that antibody, inducing the NK cell to release proteins such as perforin and proteases known as granzymes, which causes the lysis of the infected cell to hinder the spread of the virus.

Large parasites like helminths are too big to be engulfed and killed by phagocytosis. They also have an external structure or integument that is resistant to attack by substances released by neutrophils and macrophages. After IgE coat these parasites, the Fc receptor (FcɛRI) of an eosinophil will recognize IgE. Subsequently, interaction between FcεRI and the Fc portion of helminth-bound IgE signals the eosinophil to degranulate.

Several laboratory methods exist for determining the efficacy of antibodies or effector cells in eliciting ADCC. Usually, a target cell line expressing a certain surface-exposed antigen is incubated with antibody specific for that antigen. After washing, effector cells expressing Fc receptor CD16 are co-incubated with the antibody-labelled target cells. Effector cells are typically PBMCs (peripheral blood mononuclear cell), of which a small percentage are NK cells (Natural Killer cell) less often they are purified NK cells themselves. Over the course of a few hours a complex forms between the antibody, target cell, and effector cell which leads to lysis of the cell membrane of the target. If the target cell was pre-loaded with a label of some sort, that label is released in proportion to the amount of cell lysis. Cytotoxicity can be quantified by measuring the amount of label in solution compared to the amount of label that remains within healthy, intact cells.

The classical method of detecting this is the Chromium-51 [ 51 Cr] release assay the Sulfur-35 [ 35 S] release assay is a little used radioisotope-based alternative. Target cell lysis is determined by measuring the amount of radiolabel released into the cell culture medium by means of a gamma counter or scintillation counter. A variety of non-radioactive methods are now in widespread use. Fluorescence-based methods include such things as direct labelling with a fluorescent dye like calcein or labelling with europium that becomes fluorescent when released Eu 3+ binds to a chelator. Fluorescence can be measured by means of multi-well fluorometers or by flow cytometry methods. There are also enzymatic-based assays in which the contents of the lysed cells includes cellular enzymes like GAPDH that remain active supplying a substrate for that enzyme can catalyze a reaction whose product can be detected by luminescence or by absorbance.

NK cells are involved in killing tumor cells and other cells that may lack MHC I on their surface, indicating a non-self cell. NK cells have been shown to behave similarly to memory cells due to their ability to react to destroy non-host cells only after interacting with a host cell. As NK cells are not themselves specific to certain pathways of immune control, they are utilized a majority of the time in ADCC as a less discriminate cell destroyer than antibody-specific apoptosis mechanisms. The ability of activated ex vivo NK cells has been a topic of interest for the treatment of tumors. After early clinical trials involving activation through cytokines produced poor results and severe toxicological side effects, more recent studies have produced success in regulating metastatic tumors using interleukin proteins to activate the NK cell. [6]

The effects against solid tumors of trastuzumab and rituximab monoclonal antibodies have been shown in experiments with mice to involve ADCC as an important mechanism of therapeutic action. [7] In the clinic, the FcgRIII 158V/F polymorphism interfere with the ability to generate ADCC responses in vitro during trastuzumab treatment.

Multiple myeloma can be treated with daratumumab (Darzalex) monoclonal antibody. [8] Studies with in vitro materials and patient materials indicate that ADCC is an important mechanism, along with CDC (Complement-dependent cytotoxicity). [9]

ADCC as used in immune control is typically more useful for viral infections than bacterial infections due to IgG antibodies binding to virus-related antigens over prokaryotic cells. [10] Instead of ADCC removing outside toxins, immunoglobulins neutralize products of infecting bacteria and encase infected host cells that have had bacterial toxins directly inserted through the cell membrane.

ADCC is also important in the use of vaccines, as creation of antibodies and the destruction of antigens introduced to the host body are crucial to building immunity through small exposure to viral and bacterial proteins. Examples of this include vaccines targeting repeats in toxins (RTX) that are structurally crucial to a wide variety of erythrocyte-lysing bacteria, described as hemolysins. [11] These bacteria target the CD18 portion of leukocytes, which has historically been shown to impact ADCC in adhesion-deficient cells. [12]


Quantitative polymerase chain reaction

Firestein, G.S. 2003. Evolving concepts of rheumatoid arthritis. Təbiət 423(6937): 356–361.

McInnes, I.B., and G. Schett. 2011. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine 365(23): 2205–2219.

Smolen, J.S., and G. Steiner. 2003. Therapeutic strategies for rheumatoid arthritis. Təbiət rəyləri. Drug Discovery 2(6): 473–488.

Isaacs, J.D., and G. Ferraccioli. 2011. The need for personalised medicine for rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases 70(1): 4–7.

van der Pouw Kraan, T.C., F.A. van Gaalen, P.V. Kasperkovitz, N.L. Verbeet, T.J. Smeets, M.C. Kraan, et al. 2003. Rheumatoid arthritis is a heterogeneous disease: evidence for differences in the activation of the STAT-1 pathway between rheumatoid tissues. Arthritis and Rheumatism 48(8): 2132–2145.

Schena, M., D. Shalon, R. Heller, A. Chai, P.O. Brown, and R.W. Davis. 1996. Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes. Amerika Birləşmiş Ştatları Milli Elmlər Akademiyasının Materialları 93(20): 10614–10619.

Nolan, T., R.E. Hands, and S.A. Bustin. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols 1(3): 1559–1582.

Heid, C.A., J. Stevens, K.J. Livak, and P.M. Williams. 1996. Real time quantitative PCR. Genom Tədqiqatı 6(10): 986–994.

Bustin, S.A., and T. Nolan. 2004. Pitfalls of quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. Journal of Biomolecular Techniques: JBT 15(3): 155–166.

Udvardi, M.K., T. Czechowski, and W.R. Scheible. 2008. Eleven golden rules of quantitative RT-PCR. The Plant Cell 20(7): 1736–1737.

Peters, I.R., C.R. Helps, E.J. Hall, and M.J. Day. 2004. Real-time RT-PCR: considerations for efficient and sensitive assay design. Journal of Immunological Methods 286(1–2): 203–217.

Fleige, S., and M.W. Pfaffl. 2006. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine 27(2–3): 126–139.

Nolan, T., R.E. Hands, W. Ogunkolade, and S.A. Bustin. 2006. SPUD: a quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Analytical Biochemistry 351(2): 308–310.

Rieu, I., and S.J. Powers. 2009. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. The Plant Cell 21(4): 1031–1033.

Tricarico, C., P. Pinzani, S. Bianchi, M. Paglierani, V. Distante, M. Pazzagli, et al. 2002. Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction: normalization to rRNA or single housekeeping genes is inappropriate for human tissue biopsies. Analytical Biochemistry 309(2): 293–300.

Vandesompele, J., K. De Preter, F. Pattyn, B. Poppe, N. Van Roy, A. De Paepe, et al. 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genom Biologiyası 3(7), RESEARCH0034.

Pfaffl, M.W., A. Tichopad, C. Prgomet, and T.P. Neuvians. 2004. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnology Letters 26(6): 509–515.

Andersen, C.L., J.L. Jensen, and T.F. Orntoft. 2004. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Xərçəng Araşdırması 64(15): 5245–5250.

Libus, J., and H. Storchova. 2006. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. BioTechniques 41(2): 156. 158, 160 passim.

Verweij, C.L. 2009. Transcript profiling towards personalised medicine in rheumatoid arthritis. The Netherlands Journal of Medicine 67(11): 364–371.

Pombo-Suarez, M., M. Calaza, J.J. Gomez-Reino, and A. Gonzalez. 2008. Reference genes for normalization of gene expression studies in human osteoarthritic articular cartilage. BMC Molekulyar Biologiya 9: 17.

Hanafy, S., and F. Jamali. 2011. Adjuvant arthritis influences expression of housekeeping genes. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society … [et al.] 60(6): 521–523.

Jiang, C., L. Meng, W. Zhu, M. Shahzad, X. Yang, and S. Lu. 2009. Housekeeping gene stability in pristane-induced arthritis and antigen-induced pulmonary inflammation of rats. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society 58(9): 601–609.

Kouskoff, V., A.S. Korganow, V. Duchatelle, C. Degott, C. Benoist, and D. Mathis. 1996. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Hüceyrə 87(5): 811–822.

Ditzel, H.J. 2004. The K/BxN mouse: a model of human inflammatory arthritis. Trends in Molecular Medicine 10(1): 40–45.

Lee, D.M., D.S. Friend, M.F. Gurish, C. Benoist, D. Mathis, and M.B. Brenner. 2002. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Elm 297(5587): 1689–1692.

Monach, P.A., P.A. Nigrovic, M. Chen, H. Hock, D.M. Lee, C. Benoist, et al. 2010. Neutrophils in a mouse model of autoantibody-mediated arthritis: Critical producers of Fc receptor gamma, the receptor for C5a, and lymphocyte function-associated antigen 1. Arthritis and Rheumatism 62(3): 753–764.

Matzelle, M.M., M.A. Gallant, K.W. Condon, N.C. Walsh, C.A. Manning, G.S. Stein, et al. 2012. Resolution of inflammation induces osteoblast function and regulates the Wnt signaling pathway. Arthritis and Rheumatism 64(5): 1540–1550.

Montero-Melendez, T., H.B. Patel, M. Seed, S. Nielsen, T.E. Jonassen, and M. Perretti. 2011. The melanocortin agonist AP214 exerts anti-inflammatory and proresolving properties. The American Journal of Pathology 179(1): 259–269.

Patel, H.B., K.N. Kornerup, A.L. Sampaio, F. D’Acquisto, M.P. Seed, A.P. Girol, et al. 2012. The impact of endogenous annexin A1 on glucocorticoid control of inflammatory arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases 71(11): 1872–1880.

Savli, H., A. Karadenizli, F. Kolayli, S. Gundes, U. Ozbek, and H. Vahaboglu. 2003. Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. Journal of Medical Microbiology 52(Pt 5): 403–408.

Chen, M., E. Boilard, P.A. Nigrovic, P. Clark, D. Xu, G.A. Fitzgerald, et al. 2008. Predominance of cyclooxygenase 1 over cyclooxygenase 2 in the generation of proinflammatory prostaglandins in autoantibody-driven K/BxN serum-transfer arthritis. Arthritis and Rheumatism 58(5): 1354–1365.

Patel, H.B., M. Bombardieri, A.L. Sampaio, F. D’Acquisto, M. Gray, P. Grieco, et al. 2010. Anti-inflammatory and antiosteoclastogenesis properties of endogenous melanocortin receptor type 3 in experimental arthritis. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 24(12): 4835–4843.

Al-Kashi, A., T. Montero-Melendez, N. Moradi-Bidhendi, J.P. Gilligan, N. Mehta, and M. Perretti. 2013. The calcitonin and glucocorticoids combination: mechanistic insights into their class-effect synergy in experimental arthritis. PloS One 8(2): e54299.

Dabek, J., J. Wilczok, A. Kulach, and Z. Gasior. 2010. Altered transcriptional activity of gene encoding GAPDH in peripheral blood mononuclear cells from patients with cardiac syndrome X—an important part in pathology of microvascular angina? Archives of Medical Science AMS 6(5): 709–712.

Della Beffa, C., F. Klawonn, J.P. Menetski, H.R. Schumacher Jr., and F. Pessler. 2011. Evaluation of glyceraldehyde-3-phosphate, prolylpeptidyl isomerase A, and a set of stably expressed genes as reference mRNAs in urate crystal inflammation. BMC Research Notes 4: 443.

Waxman, S., and E. Wurmbach. 2007. De-regulation of common housekeeping genes in hepatocellular carcinoma. BMC Genomics 8: 243.

Glare, E.M., M. Divjak, M.J. Bailey, and E.H. Walters. 2002. beta-Actin and GAPDH housekeeping gene expression in asthmatic airways is variable and not suitable for normalising mRNA levels. Thorax 57(9): 765–770.

Wan, G., K. Yang, Q. Lim, L. Zhou, B.P. He, H.K. Wong, et al. 2010. Identification and validation of reference genes for expression studies in a rat model of neuropathic pain. Biokimyəvi və Biofiziki Tədqiqat Əlaqələri 400(4): 575–580.

Foldager, C.B., S. Munir, M. Ulrik-Vinther, K. Soballe, C. Bunger, and M. Lind. 2009. Validation of suitable housekeeping genes for hypoxia-cultured human chondrocytes. BMC Molekulyar Biologiya 10: 94.

Perez, S., L.J. Royo, A. Astudillo, D. Escudero, F. Alvarez, A. Rodriguez, et al. 2007. Identifying the most suitable endogenous control for determining gene expression in hearts from organ donors. BMC Molekulyar Biologiya 8: 114.

Mori, R., Q. Wang, K.D. Danenberg, J.K. Pinski, and P.V. Danenberg. 2008. Both beta-actin and GAPDH are useful reference genes for normalization of quantitative RT-PCR in human FFPE tissue samples of prostate cancer. The Prostate 68(14): 1555–1560.

Arenas-Hernandez, M., and R. Vega-Sanchez. 2013. Housekeeping gene expression stability in reproductive tissues after mitogen stimulation. BMC Research Notes 6: 285.


Videoya baxın: Prof İbrahim Saraçoğlu İltihaplı Eklem Romatizması Romatoid Artrit için Mucize Kür Tarifi (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Yozshular

    Müdaxilə üçün üzr istəyirəm ... bu vəziyyətdən xəbərdaram. Müzakirə edəcəyik.

  2. Vuzil

    Bənzər bir vəziyyətim var. Gəlin müzakirə edək.

  3. Shiro

    Düşünürəm ki, haqlı deyilsən. Müzakirə edəcəyik. PM-də mənə yaz.

  4. Ruarc

    Nə edəcəyini söyləmək daha asandır.

  5. Misar

    Bu problemə fərqli bir baxımdan baxsaq nə edərik?

  6. Meztim

    Məsləhət görürəm ki, sizi maraqlandıran mövzuda məqalələr olan bir sayt axtarın.

  7. Jarvis

    Əla variantdır

  8. Araktilar

    Hesab edirəm ki, səhv edirsən. Gəlin müzakirə edək. PM-də mənə yazın, danışacağıq.



Mesaj yazmaq