Məlumat

Bir fermentin plazmidi neçə dəfə kəsəcəyini necə hesablamaq olar

Bir fermentin plazmidi neçə dəfə kəsəcəyini necə hesablamaq olar


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bunu anlamaq üçün lazım olan düsturun necə tapılacağına dair bir az çaşqınlıq içindəyəm.

Məndə 7.3Kb olan plazmid var və onun 4bp-lik bir fermentlə kəsildiyi deyilir. Nədənsə bunu anlamaq üçün lazım olan düsturun belə olduğunu düşündüm:

(1/4)^4 x 7300

Amma mənə o qədər aşağı rəqəm verir ki, mən bunu düzgün hesab etmirəm, ona görə də bir az çaşıb qalıram.


4$4$-lıq 4 kəsici var, yəni 4 kəsici verildikdə, onun orta hesabla hər 256 bazadan bir kəsilməsini gözləyirsiniz. $7300/256 = 28.5$, buna görə də siz plazmiddə 28 və ya 29 kəsilmiş yer gözləyirsiniz. Bu, hesabladığınızla eynidir.


Bir fermentin plazmidi neçə dəfə kəsəcəyini necə hesablamaq olar - Biologiya

1.a. Verilmiş məhdudlaşdırıcı ferment üçün təsadüfi DNT ardıcıllığında kəsilmə tezliyi hər 4 n-də bir dəfədir, burada n məhdudlaşdırıcı fermentlərin tanınması ardıcıllığında əsasların sayıdır. 4 hər hansı bir mövqeyə (G, A, T və ya C) daxil edilə bilən dörd müxtəlif mümkün nukleotidin olması faktından irəli gəlir.

Eko RI və Hin dIII altı əsaslı tanınma sahəsinə malikdir, buna görə də hər 4 6 və ya 4096 bazaya bir dəfə kəsiləcək.

Hin dII-nin beş əsaslı tanınma sahəsi var, buna görə də hər 4 5 və ya 1024 bazada bir dəfə kəsiləcək.

Hpa II dörd əsaslı tanınma sahəsinə malikdir, ona görə də hər 4 4 və ya 256 bazada bir dəfə kəsiləcək.

b. Sahələrin sayını müəyyən etmək üçün DNT-dəki əsasların sayını verilmiş fermentdən yaranan məhdudlaşdırıcı fraqmentlərin orta uzunluğuna bölün. l ölçüsü 48,502 əsas cütdür, buna görə də gözlənilən saytların sayı:

2a. ilə kəsmə Hin dIII 1, 2 və 2,5 kilobazlıq fraqmentlər verəcəkdir. ilə kəsmə Eko RI 1,5, 2 və 3,5 kilobazlıq fraqmentlər verəcəkdir. Hər ikisi ilə kəsmə Hin dIII və Pvu II 1, 1.5 və 2 kilobazlıq fraqmentlər verəcəkdir.

b. pBR322-dəki cDNA yalnız uclarında EcoRI ilə əhatə olunan iki ekzondan ibarət olacaq. EcoRI tərəfindən kəsildikdə cDNA 0,5, 1,5 və 2 kilobaza fraqmentləri verəcəkdir. Həm EcoRI, həm də HindIII ilə həzm edildikdə, 0,5, 1 və 1,5 kilobaza fraqmentləri əldə ediləcək.

c. 1 kb radio ilə işarələnmiş zond cDNT-dəki ikinci ekzondandır. EcoRI-yə həzm olunmuş genomik DNT ilə hibridləşərsə, 3,5 kilobaza fraqmentinə hibridləşəcəkdir.

d. Vəhşi tip cDNA-dan əldə edilən radioetiketli zond yalnız birinci eksonu ehtiva edən genomik DNT bölməsinə hibridləşə biləcək. Genomik DNT HindIII ilə kəsildikdə bu fraqment 2,5 kilobaza uzunluğunda olur.

e. Çünki uzunluğu Pvu Mutantdakı II məhdudlaşdırma fraqmenti vəhşi tiplə eynidir, ikisi arasında heç bir silinmə yoxdur. PvuII saytlar. Buna görə də mutasiya d hissəsindəki ilə eyni deyil. Buradakı mutasiya çox güman ki, nöqtə mutasiyasıdır.

b. Ən azı bir intron var, çünki radio ilə işarələnmiş cDNT 1,5 və 0,5 fraqmentlərə hibridləşməmiş, lakin cinah fraqmentlərinə hibridləşmişdir. Digər intronlar 2.5 və 4.5 fraqmentlərdə yerləşə bilər.

c. Laboratoriya cDNA-ları üçün istifadə edilə bilən iki üsul primer genişləndirilməsi və nick tərcüməsidir. Primer uzantısı etiketli DNT zəncirini sintez etmək üçün oliqonukleotid primeri və Klenow fraqmentindən istifadə edir. Nikin tərcüməsində dDNT-də nick yaratmaq üçün az miqdarda DNaz istifadə olunur. Etiketli oliqonukleotidlər daha sonra nickləri doldurmaq üçün DNT Polimeraz I ilə əlavə olunur.

4.a. Fermentlərlə həzm nəticəsində yaranan "yapışqan uclar" eynidir, lakin faktiki məhdudlaşdırma yerləri fərqlidir.

b. Plazmidi təcrid etdikdən sonra onu hər iki fermentlə həzm edin, 4,5 kb fraqmenti təmizləyin, fraqmenti öz-özünə bağlayın, yeni plazmidi bakteriyalara çevirin.

c. Yox olacaq Bamsalam ya BglII saytlar.

d. Bağlamadan sonra hər iki fermentlə yenidən kəsə bilərsiniz - bu, yalnız hər iki bölgədə olmayan plazmidin bakteriyaları çevirməsini təmin edər.

5. Translokasiya və ya silinmənin sonunu üst-üstə düşən klona doğru gedin (bu, Cənubi ləkələrin genetik anormalliyi olan və olmayan orqanizmlərdən fərqini göstərəcək). Mutant ştammında birləşmə fraqmentini götürmək üçün vəhşi tipli bir klondan istifadə edin. Vəhşi kitabxanadan xromosom anormallığının digər ucunda bir klonu götürmək üçün bu fraqmentdən istifadə edin.

6.a. Parçanın məhdudlaşdırma xəritəsi aşağıda göstərilmişdir:

b. Heyvandan mRNT və genomik DNT-ni təcrid edin. mRNT-ni bir gel üzərində işlədin və onu ləkəyə köçürün (buna Şimal ləkəsi deyilir). Primer uzantısından və ya nik tərcüməsindən istifadə edərək, təcrid olunmuş genomik DNT-ni etiketləyin və onu ləkəyə hibridləşdirmək üçün zond kimi istifadə edin. Zond özünə uyğun mRNT ilə hibridləşməlidir və zondun ləkədəki yeri sizə mRNT-nin ölçüsünü bildirməlidir.

c. Yuxarıda baxın cDNA |/////////| ilə təyin edilmiş ərazilərə xəritə verəcəkdir

7.a. Yalnız DNT-ni təcrid etmək üçün RNase (və ya baza) istifadə edin. RNT-ni təcrid etmək üçün Dnase istifadə edin.

b. Məhdudlaşdırıcı fermentdən istifadə edin, geli yenidən işə salın və birdən çox DNT-dən çox olan zolaq ölçülərini əlavə edin, onlar orijinal zolaqdan daha böyük olmalıdır.

c. İzolyasiya üçün bir üsul a D. melanoqaster genin homoloqu klonlanmışdan etiketli bir zond yaratmaqdır C.elegans gen və kitabxanaya hibridləşdirin D. melanoqaster DNT. Digər üsul C. elegans genindəki ardıcıllıqlardan primerlər yaratmaq və ondan homoloqu PCR etmək üçün istifadə etməkdir. D. melanoqaster genomik DNT.

d. mRNT-ni bir gel üzərində işlədin, RNT-ni ləkəyə köçürün və sonra gendən yaradılan etiketli zond ilə Şimal ləkəsini hibridləşdirin.

e. Qoy vəhşi tipli nəsil öz-özünə yoldaş olsun. Əgər mutasiya natamam penetranlıq nümayiş etdirirsə, o zaman vəhşi tipli nəsil bəzi mutant nəsil verməlidir.

8 . mRNT-dən cDNT yaratmaq üçün tərs transkripsiya, onu gücləndirmək üçün isə PCR istifadə olunur.

9 . a. i) Bam salam ii) Hin dIII iii) Eko RI (iv) Hin dIII və Eko Ri?

b. Yalnız 4 və 5 kb Bam HI fraqmentləri (eksonları ehtiva edir) Şimal ləkələrində hibridləşəcək (6 kb mRNT-yə) və bu, yalnız qaraciyər zolağında tapılacaq.

c. Ləkədə yalnız 2 kb və 3 kb diapazon tapılacaq ki, bunlar bir zəncirli nuklein turşularını parçalayan S1 nukleazı tərəfindən həzm olunmayan DNT/RNT hibrid bölgələrinin nəticəsidir.

d. İlkin 6 kb-ni ləğv etməklə HindIII bölgəsində transkripsiya üçün lazım olan tənzimləyici elementlər buraxılmışdır.

10. Yalan, əksi doğrudur.

11. YAC-lar (maya süni xromosomları) maya ARS elementlərini (replikasiya üçün), telomer seqmentlərini və CEN elementlərini (centromere seqmentləri) ehtiva edir, onlar bir neçə yüz Kb DNT ehtiva edə bilər. Kosmidlər, faj lambdasının cos (yaxış ucları) və plazmid ardıcıllığına (replikasiya və dərman seçimi üçün) malik olan, 20-40 Kb DNT ehtiva edə bilən dəyişdirilmiş plazmidlərdir.


Maraq Plazmidinizlə Tanışlıq

Klassik plazmidlə başlayaq: pBR322 1 . O, tez-tez törəmə vektorlar üçün onurğa sütunu kimi istifadə olunur, çünki uğurlu klonlaşdırma üçün lazım olan bütün xüsusiyyətlərə malikdir (Şəkil 1). Xəritənin mərkəzindən gördüyünüz kimi, xəttiləşdirilmiş plazmidin ölçüsü 4361 əsas cütdür. Hər hansı bir plazmidlə işləməyə başlamazdan əvvəl, elan edilən ölçüsün təxminən gözlənilənlə eyni olduğunu yoxlamaq üçün onu unikal məhdudlaşdırıcı fermentlə kəsərək xəttiləşdirmək məsləhətdir.

Qara oxlar klonlama üçün vacib olan transkripsiyanın istiqamətini göstərir. Əgər maraqlandığınız geninizi başqa bir genin ortasında klonlayırsanız, onların hər ikisinin eyni istiqamətdə transkripsiya edildiyinə əmin olun. Əks halda, yerli promotor gen ifadənizə müdaxilə edə bilər.


1. Plazmidi yalnız bir yerdə kəsəcək bir ferment tapmaq nə üçün vacib idi? Plazmid birdən çox yerdə kəsilsə nə baş verə bilər? Siz sadəcə olaraq dairəvi DNT-ni açmaq istəyirsiniz ki, insan DNT-si dairəyə daxil edilsin. Əgər fermentlər bir neçə nöqtədə kəsilsə, onda siz çoxlu fraqment alacaqsınız.

2. Hansı məhdudlaşdırıcı fermentdən istifadə etmisiniz? __ bir neçə mümkündür __ Digər qruplardan nə istifadə etdiklərini soruşun və son transgen plazmidləri müqayisə edin. Niyə müxtəlif uzunluqlar ola bilər? bu, fermentin insan DNT-sini harada kəsdiyindən asılıdır, daha uzun bir parça yarada bilərdi

3. Replikasiya yerində plazmidi kəsən hər hansı fermenti atmaq nə üçün vacib idi? DNT-nizin kopyalanmasını istəyirsinizsə, o zaman çoxalmaq üçün bakteriyalara ehtiyacınız var, replikasiya sahəsi lazımdır

4. Plazmid və insan DNT-ni eyni məhdudlaşdırıcı fermentlə kəsmək nə üçün vacibdir? ucları uyğun olmalıdır ki, onları bir-birinə birləşdirə biləsiniz

5. Restriksiya fermentləri orqanizmlərdə təbii olaraq mövcuddurmu? Əgər belədirsə, onların məqsədi nədir? viruslar kimi işğalçılara hücum edir və onları məhv edirlər

6. Niyə "köt" uclarını yaradan məhdudlaşdırıcı fermentlər yapışqan uclar yaradanlar qədər rekombinasiyada faydalı olmayacaq? küt ucları digər DNT-yə yapışmayacaq

7. Fəaliyyətdə siz rekombinant bakteriya orqanizminin yaradılmasını simulyasiya etdiniz. Aşağıdakı materialların hər biri üçün nəyi təmsil etdiklərini göstərin?
Qayçı ______ məhdudlaşdırıcı ferment_ ___
Lent ______ ligaza _________


Ənənəvi DNT Klonlama İstifadələri

Məhdudlaşdırıcı endonükleazlardan istifadə edərək ənənəvi DNT klonlanmasının bir çox istifadəsi var. İfadə edilmiş rekombinant DNT (zülal sintezini kodlayan DNT ardıcıllığı), bakteriyaların genetik məlumatlarına daxil edildikdə, hədəf zülal istehsal etmək üçün bakteriyaları stimullaşdırır.

Bu, əczaçılıq şirkətlərindəki genetik mühəndislərin insan insulinini, insan albuminini, bəzi peyvəndləri, monoklonal anticisimləri və insan böyümə hormonunu çoxhüceyrəli orqanizmlərdən bu məhsulları çıxarmaqdan daha aşağı qiymətə istehsal etdiyi üsuldur. Rekombinant DNT də irsi xəstəliklərin diaqnozu və geniş miqyasda antibiotiklər istehsal etmək üçün istifadə olunur.

Gen analizi, gen mühəndislərinin spesifik genlərin nə etdiyini anlamaqda bizə kömək etmək üçün parçalanmış rekombinant DNT ardıcıllıqlarını (rDNT) daxil etdikləri geniş bir sektordur. Genləri anlayaraq, potensial olaraq xəstəliyi aradan qaldıra biləcək düzəlişlər etmək üçün lazım olan məlumatlara sahibik.

Genetik cəhətdən dəyişdirilmiş məhsullar böcəklərə və herbisidlərə qarşı müqavimətin və hər kvadrat hektardan daha çox məhsulun əsas məqsədləri olduğu ənənəvi molekulyar klonlaşdırma üsullarının nəticəsidir. Bu üsul həmçinin bitkilərdə və əkinlərdə azot fiksasiyasını yaxşılaşdırır.

İctimai iaşə sənayesi fermentasiya və pendir istehsalı proseslərində, həmçinin qida hazırlamaq üçün istifadə olunan səthlərdə patogen bakteriyaların və göbələklərin mövcudluğunu aşkar etmək üçün rekombinant DNT-dən istifadə edir.

Bununla belə, sağlamlığımızı və ya qida mənbələrimizi yaxşılaşdıra biləcək nəticələr əldə etmək üçün hər bir genin funksiyası haqqında məlumatımız vacibdir. Yalnız bir DNT ardıcıllığının funksiyası aşkar edildikdən sonra ondan düzgün istifadə etmək olar. Ənənəvi DNT klonlaşdırılması, uzun illər ərzində bizə genlərin necə ifadə olunduğunu öyrədən genom xəritələşdirilməsi sahəsində istifadə edilən ilk texnika idi. Yeni süni məhdudlaşdırıcı fermentlərlə gen mühəndisliyinin yalnız növbəti bir neçə onillikdə irəliləyəcəyini gözləmək olar.


Baxış-icmal

Terminlər və anlayışlar

  • Xəttiləşdirin
  • Molekulyar çəki markeri
  • Məhdudiyyət fermenti
  • Məhdudiyyət saytı
  • Supercoiled vs xətti DNT

Sualları nəzərdən keçirin

  1. Bir geldəki DNT-nin həddindən artıq bükülməsi nə üçün vacibdir?
  2. Məhdudiyyət həzmini qurarkən fermenti sonuncu əlavə etmək nə üçün vacibdir?
  3. Viktorinada bu səhifədə göstərildiyi kimi məhdudiyyət həzmindəki bütün inqrediyentlərin miqdarını hesablamağa hazır olun.

Sıralanma¶

Bu bölmə vektorun necə tərtib ediləcəyini və DNT-nin daxil edilməsini ümumi şəkildə izah edir.

Prosedur¶

Bu, bağlanmış plazmid DNT-ni çıxarmaq üçün ən azı dörd gün çəkir.

Nümunələrin hazırlanması (bir neçə saat)

Görmək PCR gücləndirilməsi ətraflı bölmə. Gücləndirildikdən sonra məhsul DNT-ni təmizləməlisiniz, çünki polimeraza/endonükleaza mövcuddur və bu zülal aşağı axın addımlarına təsir göstərə bilər.

Plazmiddən alınmış DNT-dən istifadə etmək istəyirsinizsə, nümunənin konsentrasiyasının kifayət qədər olduğundan əmin olun.

Təxmini nümunə konsentrasiyası (1 saat)

Həzm üçün tələb olunan kütləni hesablamaq üçün aşağıdakı düsturdan istifadə edin

Sistem Mesajı: ERROR/3 (/home/docs/sites/readthedocs.org/checkouts/readthedocs.org/user_builds/molecular-biology-protocols/checkouts/latest/DNA.rst, sətir 562)

Naməlum LaTeX əmri: nöqtələr

Nümunə DNT-nin uyğun kütləsini həzm edin. Həzm məhlulunun həcmini |ddH2O| ilə tənzimləyin . Görmək Məhdudiyyət həzmi ətraflı bölmə. Bölmə bu prosedurun eyni şərtini qəbul etdi.

Həzm olunduqdan sonra 10 |ul|-a qədər çökdürün tərəfindən Etanolun çökməsi

Görmək DNT liqasiyası ətraflı bölmə. Bölmə bu prosedurun eyni şərtini qəbul etdi.

Transformasiya (bir gecədə)

Görmək |E.coli| üçün protokollar ətraflı məlumat üçün protokollar. 37 |C|-də inkubasiya edin bir gecədə

Görmək |E.coli| üçün protokollar ətraflı məlumat üçün protokollar. Çox vaxt hər bir nümunə üçün 5 koloniya seçmək kifayətdir (bağlamanın çətinliyindən asılıdır)

Tək Koloniya İzolyasiyası (bir gecədə)

Təcrid olunmuş koloniyanı orta yerə köçürün (bir gecədə)

Plazmid DNT-ni çıxarmaq üçün bir koloniya seçin və onu 2 |ml|-ə qədər seyreltin SOC və 37 |C|-də inkubasiya edin bir gecədə


Məhdudiyyət fermentinə əsaslanan klonlama metodu

Məhdudiyyət fermentinə əsaslanan klonlama iki şeydən asılıdır: Birincisi, məhdudlaşdırıcı fermentlərin hər iki DNT fraqmentini, yəni fraqmenti və vektoru “kəsmək” qabiliyyətindən asılıdır. İkincisi, məhdudlaşdırıcı ferment əsasında klonlaşdırma DNT fraqmentini vektora “yapışdırmaq” üçün DNT liqaz fermentini tələb edir. Bu üsul digər klonlama üsulları ilə müqayisədə nisbətən ucuzdur.

Məhdudlaşdırıcı ferment əsaslı DNT klonlaşdırılması. 1. Məhdudiyyət yerləri olan qısa ardıcıllıqlar PCR ilə DNT amplifikasiyası zamanı primerlərin 5' uclarına əlavə edilir. 2. Həm vektor, həm də DNT fraqmenti birləşdirici uclar yaratmaq üçün məhdudlaşdırıcı fermentlərlə həzm olunur. 3. Vektor və DNT fraqmenti bağlanır. 4. Transformasiya zamanı rekombinant DNT ev sahibi hüceyrəyə daxil olur.


PGLO Laboratoriya Təhlili

Plazmidlər bakteriyalarda olan və bakteriyaların əlavə “xüsusiyyətlərə” malik olmasına səbəb ola biləcək genləri kodlaya bilən dairəvi DNT parçalarıdır. pGLO plazmidi ilə bu əlavə "xüsusiyyət" bakteriyaların parlamasına səbəb olur (daxil edilmiş Yaşıl Floresan Zülaldan) və həmçinin ampisillinə (beta-laktamaza zülalından) müqavimət göstərir. pGLO plazmidini əlavə etməklə E.coli bakteriyaları arabinoza şəkəri və ampisilin olan agarda inkişaf edə biləcək. Bu laboratoriya ilə məşğul olmağın əsas səbəbi genlərin xüsusiyyətləri necə idarə etdiyini daha yaxşı başa düşməkdir, bunun ən yaxşı yolu mutagenez etməkdir. Mutagenezi qabaqcadan formalaşdırmağın bir neçə fərqli yolu var və bu laboratoriyada pGLO plazmidinə transpozon əlavə etmək və sonra transpozonun bakteriyanın görünüşünə və böyüməsinə necə təsir etdiyinə baxmaqla həyata keçirilir. Bakteriyaların necə böyüdüyünə və görünüşünə baxaraq, transpozonun hara daxil edildiyini müəyyən edə bilərik ki, bu, genlərin xüsusiyyətləri necə idarə etdiyini daha yaxşı başa düşməyə kömək edir. Mutagenləşdirilmiş bakteriyalarla işlədiyimiz nümunədə ultrabənövşəyi şüa altında yaşıl rəngdə parlamadı, bu da transpozonun araC geninə daxil edildiyini və elektroforez gelində təsdiqləndiyini bildirir.

Plazmidlər 1952-ci ildə Coşua Lederberq tərəfindən kəşf edildikdən sonra genetik tədqiqatlarda öyrənilir. Onlar müəyyən bakteriyaların müxtəlif növ antibiotiklərə necə reaksiya verdiyini anlamaq və plazmidlərə əşyalar əlavə edərək bakteriyaların necə fəaliyyət göstərdiyini dəyişmək üçün istifadə edilmişdir. Bu laboratoriyada diqqət etdiyimiz plazmid pGLO plazmidi idi. Bu plazmidin nəzərdən keçirəcəyimiz üç əsas kodlaşdırma bölgəsi var. Birinci gen bölgəsi beta-laktamaz (bla) fermentini kodlayan bölgədir. “Beta-laktamaz zülalı plazmidi olan bakteriyalar tərəfindən istehsal olunur və ifraz olunur. Beta-laktamaza LB qidalı agarda mövcud olan ampisillini təsirsiz hala gətirir və bakteriyanın böyüməsinə imkan verir. Yalnız tərkibində plazmid və beta-laktamazanı ifadə edən transformasiya edilmiş bakteriyalar ampisilin olan lövhələrdə yaşaya bilər. (Leatherman 2011). Yaşıl Flüoresan Zülal (GFP), araC geninin köməyi ilə UV işığı altında yaşıl rəngdə parıldaması üçün pGLO plazmidinə daxil edilən bir gen kodudur. AraC geni arabinoza və promotor bölgəyə, həmçinin arabinozun iştirakı ilə bağlanan bir zülalı kodlayır, GFP geninin promotor bölgəsinə bağlandıqda, bakteriyaların yaşıl parıldamasını təmin edəcək zülalı tərcümə edir.

Mutagenez təbiətdə çox tez-tez baş vermir, lakin bakteriyaların və plazmidlərin müxtəlif funksiyalarını öyrənmək üçün genetik laboratoriyalarda müntəzəm olaraq istifadə edilə bilər. Bakteriyalar üzərində mutagenez etməklə biz bakteriyaların genləri necə tərcümə etdiyini və bir şey dəyişdikdə onların ətraf mühitə necə reaksiya verdiyini daha yaxşı anlaya bilərik. Kimyəvi maddələrdən və ya rentgen şüalarından istifadə kimi mutagenezi meydana gətirməyin bir neçə yolu var. Bu təcrübədə mutagenez pGLO plazmidinə transpozon daxil etməklə həyata keçirilir. Tn5 transpozonu, Tn5 transpozonunun kanamisinin müqavimətinə səbəb olan zülal üçün kodlaşdırdığı pGLO geninə daxil ediləcək və bu, transpozonun düzgün daxil edilib-edilmədiyini görməyə kömək edəcək.

Transpozon pGLO plazmidinə daxil edildikdən sonra transformasiya yolu ilə E.coli bakteriyaları tərəfindən qəbul ediləcək. Transformasiya, bakteriyaların ətraflarından sərbəst DNT almasıdır. Plazmidlər bakteriyalara qəbul edildikdən sonra mutant bakteriyaların transpozondan necə təsirləndiyini görmək üçün nəzarət qrupları ilə birlikdə ampisilin, kanamisin və arabinozanın müxtəlif kombinasiyaları olan qidalı agarlarda yetişdirildi.

Bakteriyalar ya öz əmələ gətirdikləri zülalları kəsərək, ya da birbaşa fagı kəsərək bakteriofaqlardan xilas olmaq üçün özbaşına məhdudlaşdırıcı fermentlərdən istifadə edirlər (Aude). Biz bakteriyalara daxil edilmiş plazmidləri kəsmək üçün məhdudlaşdırıcı ferment həzm etmək üçün bu məhdudlaşdırıcı fermentlərdən istifadə edə bilirik. “Məhdudiyyət fermentləri adətən müəyyən nukleotid ardıcıllıqlarında DNT-ni kəsmək üçün istifadə olunur. Çox vaxt bu, yeni "rekombinant DNT parçası" yaratmaqdır və bunun ardınca iki parça bir-birinə bağlanır. (Leatherman 2011). Plazmidlər plazmidin məlum yerlərində Nde 1 və EcoR1 fermentləri ilə kəsildi. Plazmiddə olan baza cütlərinin miqdarını (5400 bp) və məhdudlaşdırıcı fermentlərin harada kəsildiyini bilməklə, transpozonun hara daxil edildiyini öyrənmək üçün kəsilmiş plazmidin müxtəlif hissələrini araşdıra bilərik.

Tn5 transpozonunu pGLO plazmidinə daxil etmək üçün Tn5 daxiletmə dəstindən istifadə edin. İlk addım 6,4 mikrolitr su, 1 mikrolitr EZ Tn5 10X reaksiya tamponu, 1 mikrolitr .2 mikroqram/mikrolitr pGLO plazmidi, 0,6 mikrolitr Tn5 transpozonu və 1 mikrolitr EZ-Tn5 transpozasını (transpozon əlavəsinə kömək edir) qarışdırmaq idi. ) bu ardıcıllıqla və burulğanla qarışdırın, sonra sentrifuqa edin. Borunu 37 dərəcə Selsi temperaturunda 50 dəqiqə inkubasiya edin, sonra borunu çıxarın və yenidən fırladın və borunu başqa 50 dəqiqə inkubatora qaytarın. Bir dəfə daha fırladın və boruya 1 mikrolitr dayandırıcı məhlul əlavə edin və yaxşıca qarışdırın və mayeni yenidən borunun altına fırladın. Borunu 10 dəqiqə 70 dərəcəyə qədər qızdırın, növbəti dəfə dondurucuda saxlayın.

1,5 mL E.coli-ni üç mikrosentrifüj borusuna köçürün və 10 dəqiqə buz üzərinə qoyun. Boruları 1 dəqiqə sentrifuqa edin və bütün supernatantı çıxarın. 300 mikrolitr buz kimi CaCl əlavə edin2 hər üç boruya pipetləmə yolu ilə pelleti tamamilə həll edin və boruları 2 dəqiqə buzun üzərinə qoyun. Boruları 1 dəqiqə sentrifuqa edin və supernatantı atın. 60 mikrolitr CaCL əlavə edin2 yenidən hər boruya və pelleti yumşaq bir şəkildə yenidən dayandırın və 10 dəqiqə buz üzərinə qoyun. Üç borunu etiketləyin, DNT yoxdur, pGLO wt və pGLO mutant. Hər bir boruya müvafiq olaraq 1 mikrolitr pGLO DNT və 1 mikrolitr Tn5 mutagenez pGLO reaksiyası əlavə edin. Borulara toxunaraq yumşaq bir şəkildə qarışdırın və 15 dəqiqə buzun üzərinə qoyun. Boruları tam 90 saniyə ərzində 42 dərəcə istiliklə şoklayın və dərhal 2 dəqiqə ərzində buza qayıdın. Borulara 1 mL LB bulyonu əlavə edin, sonra hər bir borunun içindəkiləri bir sınaq borusuna köçürün və silkələməklə 37 dərəcə 30 dəqiqə inkubasiya edin. Cədvəl 1-də göstərildiyi kimi 5 müxtəlif agar boşqabını alın və etiketləyin və onları etiketləyin. Bakteriyaları yeni mikrosentrifüj borularına köçürün və onları 1 dəqiqə fırladın və 500 mikrolitr supernatantı çıxarın, bakteriyaları bulyonda yenidən dayandırın. Hər reaksiyadan 200 mikrolitr onların müvafiq agar plitələrinə əlavə edin və bakteriyaları agar plitələrinin üzərinə yayın. Plitələri bir gün ərzində hazırlıq otağında 37 dərəcə inkubasiya edin.

Cədvəl 1. Müxtəlif lövhələrə və proqnozlara əlavə edilən DNT.

5 mL LB bulyonu, biri ampisilin və digəri kanamisin olan iki steril kultura borusu hazırlayın, etiketi hansıdır. Plitələri yoxlayın və yabanı tipli koloniyanı seçin və koloniyanı ampisilinlə LB bulyona qoyun. pGLO mutantının olduğu boşqaba baxın və koloniyalardan hər hansı birinin UV işığı altında yaşıl rəngdə parıldadığını yoxlayın. Bu təcrübə üçün seçilmiş koloniya ağ idi. Koloniya götürün və kanamisin ilə LB bulyonuna qoyun. Boruları 37 dərəcə istilikdə inkubatora qoyun və bir gecədə inkubasiya edin. Bütün lövhələrə baxın və nəticələri proqnozlarınızla müqayisə edin. Kulturaları inkubatordan alın və sentrifuqa etmək üçün 15 ml-lik boruya köçürün. Soyudulmuş sentrifuqada 3000 rpm-də 5 dəqiqə fırladın və supernatantı atın. Hər bir bakteriya qranuluna 250 mikrolitr P1 tamponu əlavə edin (RNT-ni xaric edir) və pelleti yenidən dayandırın və dərhal mikrosentrifüj borusuna köçürün. 250 mikrolitr P2 buferi (hüceyrələrin lizisi) əlavə edin və 5 dəqiqədən çox olmayan müddətə ters çevirərək qarışdırın. 350 mikrolitr N3 buferi əlavə edin (sütunların bağlanması üçün ideal pH) və borunu tərsinə çevirərək dərhal qarışdırın. Ağ qranul əmələ gələnə qədər 10 dəqiqə fırladın. Süpernatantı ayrı fırlanma sütunlarına pipetləyin və 30 saniyə fırladın, sonra axını atın. 750 mikrolitr PE buferi (DNT-ni yuyur) sütuna əlavə edin və 30 saniyə fırladın və axını atın. Sütunu yeni 1,5 ml mikrosentrifüj borusuna yerləşdirin və fırlanan sütuna 50 mikrolitr su (DNT-nin elüsyonu) əlavə edin və 1 dəqiqə dayanmasına icazə verin. 1 dəqiqə fırladın, sonra fırlanma sütununu atın və axını saxlayın. İki DNT nümunəsinin konsentrasiyasını ölçün, sonra gələn həftə üçün dondurucuya qoyun. Vəhşi tipli DNT-nin konsentrasiyası 68,2 nano qram/mikrolitr, 1,84 təmizlik və mutant DNT-nin konsentrasiyası 81,9 nanoqram/mikrolitr, 1,64 saflığı ilə o qədər də saf deyildi.

Müxtəlif yerlərdə kəsilmiş vəhşi tipli plazmidlərdə zolaqların sayını müəyyən etmək üçün məhdudiyyət xəritəsindən istifadə edin.

Cədvəl 2. Müxtəlif kəsiklərə malik vəhşi tipli plazmidlərin zolaq ölçüləri.

Hər bir borunun ehtiyacına uyğun olaraq hər həlli qarışdırın. Hər boruya nə qədər DNT əlavə edilməli olduğunu müəyyən etmək üçün DNT konsentrasiyasından istifadə edin (500/konsentrasiya=nə qədər DNT lazımdır).

Kəsilməmiş wt Kəsilməmiş mutant Nde1 wt Nde1 mutant EcoR1 wt EcoR1 mutant Nde1 + EcoR1 wt Nde1 + EcoR1 mutant
Su 12.67 13.9 10.17 11.4 10.17 11.4 10.12 11.4
10X tampon Heç biri Heç biri 2 Bufer 4 2 Bufer 4 2 EcoR1 tamponu 2 EcoR1 tamponu 2 EcoR1 tamponu 2 EcoR1 tamponu
DNT: 5 milliqram 7.33 6.1 7.33 6.1 7.33 6.1 7.33 6.1
Nde1 fermenti (20 vahid/mikrolitr) Heç biri Heç biri .5 .5 Heç biri Heç biri .5 .5
EcoR1 fermenti (20 vahid/mikrolitr) Heç biri Heç biri Heç biri Heç biri .5 .5 .5 .5

Cədvəl 3. Hər bir borunun qarışıqları. (hamısı mikrolitrlə)

Səkkiz borunu 1,5 saat ərzində reaksiyanın davam etməsi üçün 37 dərəcə istilikdə inkubatora qoyun, 1,5 saat bitdikdən sonra boruları növbəti dəfə dondurucuya qoyun.

50X tamponu 1X buferə seyreltin, dərəcə silindrinə 20 mililitr 1X TAE tamponu əlavə edin və sonra silindrə 980 mili litr su əlavə edin. 1,2% agaroza gel hazırlayın, 6 qram toz agarozunu çəkin və kolbaya boşaltın, sonra 50 mL 50X TAE buferini götürün və kolbaya əlavə edin. Agaroza və tamponu qarışdırın, sonra onu mikrodalğalı sobaya təxminən bir dəqiqə və ya məhlul şəffaf olana qədər qoyun. Özünüzü yandırmadan kolbaya toxuna bilənə qədər şüşəni soyudun. Tabağı hər iki tərəfi yuxarı və daraq yerində olmaqla işləyən qutuya qoyun və agaroza məhlulunu qaba tökün. Agaroza südlü ağ rəngə çevrilənə və sərtləşənə qədər otursun. Gözləyərkən hər boruya 2 mikrolitr 10X yükləmə boyası yükləyin və pipetlə qarışdırın. Tabağın kənarlarını aşağı salın və sonra jelin üst hissəsini örtənə qədər işləyən qutunu TAE tamponu ilə doldurun. Ən sol tərəfdəki 1kb nərdivanı 10 mikro litr 1kb nərdivanla yükləyin. Əvvəlki həftədən alınan PCR reaksiyalarını götürün və ardıcıl olaraq 20 mikrolitr məhdudlaşdırıcı həzm reaksiyaları ilə geldə növbəti 8 boşluğu doldurun. Jel yükləndikdən sonra jeli təxminən 45 dəqiqə 100 voltda işlədin, boyaların geldən aşağı hərəkət edib-etmədiyini yoxlamaq üçün vaxtaşırı yoxlayın. Boya jelin yarısına qədər getdikdən sonra onu işlək qutudan çıxarın və jeli rəngləmə qutusuna qoyun. SYBR yaşıl rəngi gelin üst hissəsini əhatə edənə qədər boya qutusuna SYBR yaşıl tökün, qutunu hər 5 dəqiqədən bir çevirin. SYBR yaşılı DNT-yə bağlanır və bizə UV işığı altında DNT-yə baxmağa imkan verir. 15 dəqiqədən sonra geli qutudan çıxarın və SYBR yaşılını yenidən şüşəsinə tökün. Gelinizi götürün və bir UV qutusuna qoyun və PCR-nin nəticələrini görmək üçün gelinizin şəklini çəkin.

Bakteriyalar ilk dəfə tədqiq edildikdə, mutagenləşdirilmiş bakteriyalar UV işığına qoyulduqda yaşıl rəngdə parlamadı, bu o deməkdir ki, transpozon özünü ya araC geninə, ya da GFP geninə daxil edə bilərdi.

Cədvəl 4. Aqar plitələrinin nəticələri.

Məhdudiyyət fermentlərini qarışdırarkən mutant borulara əlavə edilərkən məhdudlaşdırma fermenti buferlə səhv salınıb və bu, mutant boruların geldə oxunmaz olmasına gətirib çıxarır.

Şəkil 2. 1-ci sıra 1kb nərdivandır. 2 yabanı tip kəsilməmiş plazmid. 3 yabanı tipli kəsilmiş. 4 vəhşi tipli eko kəsim. 5 vəhşi tipli eko/nde kəsim. 6 mutant kəsilməmiş. 7 mutant kəsilmiş. 8 mutant eko kəsim. 9 mutant eco/nde cut

Bu geldən görə bilərik ki, vəhşi tipli kəsilməmiş və EcoR1 kəsikləri gözlənilənlə eynidir. 300 və 500 bölgədə və 1000 və 2000 ərazilərdə vəhşi tipli EcoR1/Nde1 kəsiklərində dörd zolaq var. Və Nde1-də üç lent 300, 1000 və 2000 sahəni kəsdi. Beləliklə, bütün vəhşi tipli nümunələr proqnozlaşdırılan yerdə idi. Təəssüf ki, mutant nümunələri oxumaq mümkün deyil.

Şəkil 3. 1-ci sıra 1kb nərdivandır. 2 yabanı tip kəsilməmiş plazmid. 3 yabanı tipli kəsilmiş. 4 vəhşi tipli eko kəsim. 5 vəhşi tipli eko/nde kəsim. 6 mutant kəsilməmiş. 7 mutant kəsilmiş. 8 mutant eko kəsim. 9 mutant eco/nde cut.

Bu şəkildə siz görə bilərsiniz ki, 6-cı cərgədə o, transpozonun nümunədə olduğunu bildirərək 2-ci cərgədə kəsilməmiş vəhşi tipə qədər getməyib. 7 və 9-cu sıraya baxdıqda, 3 və 5-ci sətirlərdə olduğu kimi təxminən 1800 baza cütlüyündə çatışmayan çubuq var. Bu, transpozonun Nde1-dən birində olan araC geninə daxil edildiyi yerdir ki, bu, təxminən 1800 bazadır. - cütlər. Geldə bu bölgəyə transpozonun əlavə edilməsi 1800 barın 2800 əsas cüt çubuqun olduğu yerdə qalmasına səbəb olur və onu geldə sadəcə bir çubuq kimi göstərir.

Transpozon, gel nəticələrindən pGLO plazmidinin araC genində tapıldı. AraC genində olan transpozon, GFP geninin promotor bölgəsinə bağlanan zülalı yaratmır və nəticədə mutagenləşdirilmiş bakteriyalar UV işığı altında yaşıl rəngdə parılmır. AraC geninə transpozonun daxil edilməsi, mutant bakteriyaların yerləşdirildiyi boşqabda niyə bu qədər az mutant böyüməsinin olduğunu da izah edə bilər. Orijinal gellə bağlı problem, mutant nümunələri geldə oxunmaz hala gətirən borulara daha çox ferment əlavə edilməsi idi.

Aude A Bourniquel, Thomas A Bickle, Kompleks məhdudlaşdırıcı fermentlər: NTP ilə idarə olunan molekulyar mühərriklər, Biochimie, Cilt 84, Buraxılış 11, 1 Noyabr 2002, Səhifələr 1047-1059, ISSN 0300-9084, 6/S02001 (10-9020) 2.

Leatherman J. 2011 Genetika Laboratoriyası Təlimatı. Şimali Kolorado Universiteti


DNT-nin molekulyar çəkisini necə hesablayırsınız?

Böyük bir DNT molekulunuz varsa, ehtimal ki, sözdə DNT məhdudlaşdırıcı fermentdən istifadə edərək onu daha kiçik parçalara ayıracaqsınız.

Addım 2. Gel elektroforezi

Sonra nuklein turşusu məhlulunun düzgün hazırlanmış nümunələrini agaroz gel elektroforez sisteminin quyularına yerləşdirəcək və müəyyən bir müddət ərzində gərginlik tətbiq edəcəksiniz.

Quyulardan birində siz həmçinin "DNT nərdivanı" yerləşdirirsiniz: baza cütlərinin sayı məlum olan DNT fraqmentlərini ehtiva edən nümunə.


(www.slideshare.net saytından)

Bitmiş gel belə görünə bilər:

Hər tərəfdəki zolaqlar nərdivanlardır. Qət olunmuş məsafələr fraqmentlərin molyar kütlələri ilə mütənasibdir.

Addım 3. Fraqmentlərinizdə əsas cütlərin sayını hesablayın

Giriş (əsas cütlər) (bp) və qət edilən məsafə (d) ilə müqayisə edərək nərdivanlarınızdan standart əyri yaradın.

Belə bir qrafik alacaqsınız:

Əgər fraqmentlərinizdən biri 1,80 sm miqrasiya etsəydi, siz hesablayardınız

#log("bp")= "-0,4637×1,80 + 4,3366" = 3,501#

Addım 4. Parçanın molyar kütləsini hesablayın.

Baza cütünün orta kütləsi 650 u-dur.

Beləliklə, fraqmentin kütləsi

#3176 rəng(qırmızı)(ləğv et(rəng(qara)("bp"))) × "650 u"/(1 rəng(qırmızı)(ləğv et(rəng(qara)("bp")))) = 2,06 × 10^6rəng(ağ)(l) "u"#


Videoya baxın: ماهوالبلازميد شرح plasmid (BiləR 2022).