Məlumat

Protein kinaz həm treonin, həm də tirozin qalığını fosforlaşdıra bilərmi?

Protein kinaz həm treonin, həm də tirozin qalığını fosforlaşdıra bilərmi?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən bilirəm ki, bəzi kinazlar struktur oxşarlıqlarına görə həm serin, həm də treonin qalıqlarını fosporilləyə bilər, lakin belə bir kinaz tirozin qalığını da fosforlaşdıra bilərmi?

Yoxdursa, niyə?


Bir neçə zülal kinaza hər üç amin turşusunu fosforlaşdıra bilər - bunlar ikili spesifik kinazalar kimi təsnif edilir (EC 2.7.12.1). Nümunələr Arabidopsisdən APK1 və ya məməlilərdə MEK kinazalardır.

Digər fermentlərdə olduğu kimi, substratın bağlanma yerindəki qalıqlar orada hansı substratların yerləşdirilə biləcəyini müəyyən edir. Əgər siz onları araşdırmaq istəsəniz, strukturlar və ya Ser-Thr- və Tyr-kinazlar yoxlama üçün mövcuddur.


Əsas tənzimləyici qalıqlarda bakterial serin/treonin və tirozin protein kinazalarının çarpaz fosforilasiyası


Lei Şi 1, Nathalie Pigeonneau 2, Vaişnavi Ravikumar 3, Paula Dobriniç 4, Boris Macek 3, Damjan Franjevic 4, Marie-Francoise Noirot-Gros 2 və İvan Miyakoviç 1 *
  • 1 SysBio, Kimya və Biologiya Mühəndisliyi Departamenti, Chalmers Texnologiya Universiteti, Göteborg, İsveç
  • 2 UMR1319 Micalis, Institut National de Recherche Agronomique, Jouy-en-Josas, Fransa
  • 3 Proteome Center T࿋ingen, Fakültələrarası Hüceyrə Biologiyası İnstitutu, T࿋ingen Universiteti, T࿋ingen, Almaniya
  • 4 Biologiya Bölməsi, Elmlər Fakültəsi, Zaqreb Universiteti, Zaqreb, Xorvatiya

Bakteriyalar bir çox substratı fosforlaşdırmaq qabiliyyətinə görə eukarial kinazlara bənzəyən protein serin/treonin və tirozin kinazlara malikdir. Bənzətmənin daha da uzana biləcəyini və bakterial kinazların da hazırda eukarial kinaz şəbəkələrinin əlaməti hesab edilən qarşılıqlı fosforlaşma və aktivləşməyə məruz qala biləcəyini fərz etdik. Bu fərziyyəni yoxlamaq üçün biz möhkəm model orqanizmdə mövcud olan dörd müxtəlif sinif serin/treonin və tirozin kinazların bütün üzvlərinin imkanlarını araşdırdıq. Bacillus subtilis bir-birini fosforilləşdirmək in vitro və bir-biri ilə qarşılıqlı əlaqədə olurlar in vivo. İnteraktomik məlumatlar bütün növ kinazlar arasında yüksək dərəcədə əlaqəni təklif etdi, fosforlaşma analizləri isə eyni dərəcədə geniş yayılmış çarpaz fosforlaşma hadisələrini aşkar etdi. Əldə etdiyimiz tapıntılar göstərir ki, Hanks tipli kinazlar PrkC, PrkD və YabT digərlərini fosforlaşdırmaq üçün ən yüksək qabiliyyət nümayiş etdirirlər. B. subtilis kinazlar, BY-kinaz PtkA və iki komponentli kinazlar RsbW və SpoIIAB isə digər kinazlar tərəfindən fosforilləşməyə ən yüksək meyl göstərirlər. Bir neçə seçilmiş resipient kinazlar üzərində fosforlanmış qalıqların təhlili göstərir ki, ən çox çarpaz fosforlaşma hadisələri əsas tənzimləyici qalıqlara aiddir. Buna görə də, çarpaz fosforlaşma hadisələri, siqnal ötürülməsi kaskadında aşağı axınındakı substratları fosforilləşdirmək üçün alıcı kinazların tutumuna təsir göstərə bilər. Buna görə də belə nəticəyə gəlirik ki, bakterial serin/treonin və tirozin kinazlar, ehtimal ki, əvvəllər yalnız eukarial hüceyrələrdə təsvir edilən şəbəkə tipli davranışda iştirak edirlər.


Ras Protein və MAPK Yolu | Hüceyrə siqnalı |Biologiya

Bu məqaləni oxuduqdan sonra siz müxtəlif hüceyrə fəaliyyətini tənzimləyən Ras proteini və MAPK yolları haqqında öyrənəcəksiniz.

Ras gen ailəsi hüceyrə siqnalının ötürülməsində iştirak edən kiçik GTPazları kodlayır. Zülalların super ailəsi olan Ras, hüceyrə böyüməsi, fərqlilik və utancaqlıq və sağ qalma kimi müxtəlif hüceyrə davranışlarını tənzimləyir. Ras hüceyrə xaricindən gələn siqnalları nüvəyə çatdırdığından, ras genlərindəki mutasiyalar onu qalıcı olaraq aktivləşdirə və hüceyrədənkənar siqnallar olmadıqda belə hüceyrə daxilində uyğun olmayan ötürülməyə səbəb ola bilər. Bu siqnallar hüceyrələrin böyüməsi və bölünməsi ilə nəticələndiyi üçün nizamsız Ras siqnalı son nəticədə onkogenez və xərçəngə səbəb ola bilər.

Ras zülalları hüceyrədaxili siqnal şəbəkələrini idarə edən ikili molekulyar açarlar kimi fəaliyyət göstərir. Ras ilə tənzimlənən siqnal yolları aktinsitoskeletal bütövlük və şirlik, proliferasiya, diferensiallaşma, hüceyrə yapışması, apoptoz və hüceyrə miqrasiyası kimi prosesləri idarə edir. Xərçənglərdə Ras və Ras ilə əlaqəli zülallar tez-tez tənzimlənir, bu da invaziyanın və metastazın artmasına və apoptozun azalmasına səbəb olur. Aktivləşdirilmiş Ras RAF kinazın protein kinaz aktivliyini aktivləşdirir. RAF kinaz MEK-i fosforilləşdirir və aktivləşdirir. MEK mitogenlə aktivləşdirilmiş protein kinazı (MAPK) fosforilləşdirir və aktivləşdirir.

Mitojenlə aktivləşdirilmiş zülal (MAP) kinazlar hüceyrədənkənar stimullara (mitogenlər, osmotik stress, istilik şoku və proin&şiflamatuar sitokinlər) cavab verən və gen ekspres və utancaqlıq, mitoz, diferensiallaşma kimi müxtəlif hüceyrə fəaliyyətlərini tənzimləyən serin/treoninə spesifik zülal kinazlarıdır. proliferasiya və hüceyrə sağ qalması/apoptoz. MAPK yolları “MAPK şəlaləsi” adlanan zülal kinaz kaskadları daxilində aktivləşdirilir. Hər biri ardıcıl olaraq aktivləşdirilən MAP kinaz, MAP kinaz kinaz (MKK, MEKK və ya MAP2K) və MAP kinaz kinaz kinazdan (MKKK və ya MAP3K) üç fermentdən ibarətdir. Serin və treonin qalıqlarında MAP2K-nı fosforilləşdirən hüceyrədənkənar qıcıqlarla aktivləşdirilən MAP3K və bu MAP2K MAP kinazını serin və tirozin qalıqlarında fosforlaşma yolu ilə aktivləşdirir.

Tirozinin fosforlaşması treoninin fosforlaşmasından əvvəl baş verir, baxmayaraq ki, hər iki qalığın fosforlaşması digəri olmadıqda baş verə bilər. MAP kinazlarını aktivləşdirmək üçün həm tirozin, həm də treonin fosforilasiyası tələb olunduğundan, hər iki sahədən fosfatı çıxaran fosfatazalar onları təsirsiz hala gətirir. Bu MAP kinaz siqnal kaskadı mayadan məməlilərə qədər təkamül yolu ilə yaxşı qorunub saxlanılmışdır. Kaskadlar məlumatı effektorlara ötürür, digər siqnal yollarından daxil olan məlumatları əlaqələndirir, siqnalları gücləndirir və müxtəlif cavab nümunələrinə imkan verir.

MAP kinaz yollarının aşağı tənzimlənməsi serin/treonin fosfatazlar, tirozin fosfatazlar və ya ikili spesifik fosfatazlar tərəfindən defosforilasiya yolu ilə və yuxarı axın kinazalarının fosforilləşməsini əhatə edən əks əlaqə inhibitor mexanizmləri vasitəsilə baş verə bilər. MAP kinaz kaskadlarını selektiv şəkildə aşağı tənzimləyən dərmanlar bədxassəli xəstəliyin idarə edilməsində terapevtik agentlər kimi dəyərli və utancaq ola bilər.


Giriş seçimləri

1 il ərzində jurnala tam giriş əldə edin

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.
ƏDV daha sonra ödəniş zamanı əlavə olunacaq.
Vergi hesablanması yoxlama zamanı yekunlaşacaq.

ReadCube-da vaxt məhdud və ya tam məqaləyə giriş əldə edin.

Bütün qiymətlər NET qiymətləridir.


Nəticələr

Həm E-kaderin, həm də PKD1-in ektopik ifadəsi β-katenin/TCF fəaliyyətini aşağı tənzimləyir. Əvvəlki tədqiqatlar göstərdi ki, E-kaderinin həddindən artıq ifadəsi, Topflash analizi ilə müəyyən edildiyi kimi, β-katenin vasitəçiliyi ilə Wnt siqnalını azaldır (26-28). Bastırma E-kaderinin β-katenin bağlama qabiliyyətini tələb edir, lakin E-kaderinin yapışma funksiyasından asılı deyil.

E-kaderin β-katenin ilə bir zülal kompleksi meydana gətirdiyi üçün biz PKD1-in β-katenin transkripsiya aktivliyinə təsir edib-etmədiyini sınaqdan keçirdik. β-katenin ifadəsi NIH 3T3 hüceyrələrində Topflash analizində TCF transkripsiya aktivliyini artıra bildi (Şəkil 1).A ). E-kaderin və ya PKD1-in ektopik ifadəsi fərdi olaraq β-katenin/TCF transkripsiya fəaliyyətini maneə törədir. Kinaz-ölü PKD1-in (PKD1-KD) ifadəsi vəhşi tip PKD1-dən daha az inhibitor təsirə malikdir. Əksinə, shRNA-ların PKD1 (siPKD1) və ya E-kaderinə (siEcad) qarşı ifadəsi β-katenin/TCF transkripsiya aktivliyini artırır. Oxşar nəticələr adenomatoz polipoz koli üçün mənfi olan və yüksək səviyyədə β-katenin olan kolon xərçəngi SW480 hüceyrə xəttindən və prostat xərçəngi C4-2 hüceyrə xəttindən (məlumatlar göstərilmir) əldə edilmişdir. Məlumatlar güclü şəkildə göstərir ki, həm PKD1, həm də E-kaderin β-katenin/TCF siqnalını mənfi şəkildə tənzimləyir.

PKD1 β-katenin ilə əlaqələndirilir və β-katenin/TCF transkripsiya fəaliyyətini mənfi tənzimləyir. A, həm PKD1, həm də E-kaderin β-katenin/TCF transkripsiya fəaliyyətini mənfi tənzimləyir (Topflash analizi). Əlli nanoqramlıq Topflash plazmidi, 2,5 ng Renilla lusiferaza və 50 ng vəhşi tip β-katenin 100 ng PKD1, kinaz-ölü PKD1 və ya E-kaderin konstruksiyaları ilə və ya 25 ng Rsh konstruksiyaları ilə kotransfeksiya edilmişdir. E-cadherin (siEcad) və ya PKD1 (siPKD1) NIH 3T3 hüceyrələrinə. Atəşböcəyi lusiferaza fəaliyyəti Promega ikili reportyor analiz reagentləri ilə transfeksiyadan 48 saat sonra ölçüldü və atəşböcəyi lusiferazının fəaliyyəti Renilla lusiferaza fəaliyyəti ilə normallaşdırıldı. PKD1 və ya E-kaderinin həddindən artıq ifadəsi β-katenin transkripsiya fəaliyyətini maneə törədir. Bunun əksinə olaraq, PKD1 və ya E-kaderinin siRNA tərəfindən yıxılması β-katenin transkripsiya aktivliyini artırır. PKD1-in yıxılması β-kateninin həddindən artıq ifadəsi nəticəsində yaranan inhibitor təsirləri aradan qaldırır və əksinə. barlar, Üçlü nümunələrə əsaslanan SD. Bu shRNA konstruksiyalarının effektivliyi ref-də göstərilmişdir. 20. B üçün D, kolokalizasiya və in vivo PKD1 və β-katenin birliyi. B, PKD1 və β-katenin əsasən E-kaderin müsbət olan LNCaP hüceyrələrində plazma membranında kolokallaşır. C, PKD1 və β-katenin normal prostat toxumasında birləşir. D, PKD1 və β-katenin əsasən E-kaderin mənfi olan sidik kisəsi xərçəngi JCA hüceyrələrində sitozolda kolokallaşır.

PKD1 və E-kaderinin β-katenin/TCF funksiyası üzrə oxşar fenotipləri bizi onların epistatik əlaqəsini öyrənməyə vadar etdi. PKD1-in yıxılmasının Topflash fəaliyyətində E-kaderin repressiyasını aradan qaldıra biləcəyini və ya əksinə soruşduq. SiPKD1 siçan 3T3 hüceyrələrinə E-kadherin ifadə vektoru və ya PKD1 ifadə vektoru ilə siEcad ilə kotransfeksiya edilmişdir. PKD1-in yıxılması E-kaderinin həddindən artıq ifadəsi nəticəsində yaranan inhibəni aradan qaldıra bilər və əksinə (Şəkil 1).A), PKD1 və E-kaderinin β-katenin/TCF fəaliyyətini eyni yolla tənzimlədiyini təklif edir.

PKD1 prostat xərçəngi hüceyrələrində və insan toxumasında β-kateninlə birləşir və əlaqələndirilir. LNCaP prostat xərçəngi hüceyrələrində PKD1 və β-kateninin subcellular lokalizasiyasını araşdırdıq (Şəkil 1).B). PKD1 plazma membranında və sitozolda lokallaşdırıldığı halda, β-katenin əsasən plazma membranında lokallaşdırılır. Birləşdirilmiş şəkil göstərir ki, iki zülal yalnız hüceyrə yapışan qovşaqlarında birləşir. Maraqlıdır ki, PKD1 digər hüceyrələrlə təmasda olmayan hüceyrə səthlərində mövcud deyil, β-katenin isə bütün hüceyrə səthində mövcuddur (şək. 1).B, ağ oxlar). Oxşar nəticələr C4-2 hüceyrələrindən əldə edilmişdir (məlumatlar göstərilmir). Bundan əlavə, PKD1 və β-katenin tədqiq edilən beş normal insan prostat toxumasının parafin nümunəsinin hamısında hüceyrə membranında kolokallaşdırılır (Şəkil 1).C). E-kaderin plazma membranında E-kadherin/β-katenin kompleksini bağladığından və PKD1 β-kateninlə birləşdiyindən, E-kaderinin PKD1 membranının lokalizasiyasına vasitəçilik edib-etmədiyini bilmək maraqlıdır. E-cadherin-mənfi JCA sidik kisəsi xərçəngi hüceyrə xəttinin istifadəsi (Şəkil 1D) və SW480 hüceyrələri (məlumatlar göstərilmir), biz PKD1-nin plazma membranında deyil, sitozolda β-kateninlə kolokallaşdığını göstəririk ki, bu da kolokalizasiyanın E-kaderin olmadıqda baş verə biləcəyini göstərir.

PKD1 β-kateninlə bağlanır və onu fosforlaşdırır. PKD1 və β-katenin birlikdə kolokallaşdığından, biz immunoprecipitation təcrübələri ilə iki zülalın qarşılıqlı təsirini araşdırdıq. Şəkil 2A PKD1 və β-katenin eyni protein kompleksində olduğunu təsdiqləyir. PKD1 və β-kateninin birbaşa qarşılıqlı təsir göstərə biləcəyini sübut etmək üçün maya iki hibrid analizindən istifadə edilmişdir. PKD1 iki sisteinlə zəngin domenə malikdir, C1a və C1b, PH domeni və katalitik domen. Şəkil 2B β-katenin PKD1-in katalitik və C1b domenləri ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqədə olduğunu göstərir, bu da PKD1-in E-kaderin olmadıqda birbaşa β-katenin ilə qarşılıqlı əlaqədə ola biləcəyini göstərir. β-katenin PKD1 kinaz domeni ilə güclü şəkildə qarşılıqlı əlaqədə olduğundan, biz bir in vitro aktiv PKD1-in β-katenini fosforlaşdıra bildiyini, katalitik qeyri-aktiv PKD1-in isə bunu edə bilməyəcəyini göstərən fosforlaşma analizi (Şəkil 2).C).

PKD1 ilə β-kateninin birbaşa qarşılıqlı təsiri və fosforlaşması. A, LNCaP hüceyrəsindən PKD1 və β-kateninin qarşılıqlı koimmunopresipitasiyası. üst, PKD1 antikoru ilə koimmunopresipitasyon və β-katenin antikoru ilə blotting. zolaq 1, nəzarət antikoru ilə immunopresipitasiya zolaq 2, yalnız bütün hüceyrə lizatları zolaq 3, PKD1 antikoru ilə immunopresipitasiya. alt, β-katenin antikoru ilə koimmunopresipitasiya və PKD1 antikoru ilə blotting. zolaq 1, nəzarət antikoru ilə immunopresipitasiya zolaq 2, β-katenin antikoru ilə immunoprecipitation. B, maya iki hibrid testi. Sınaq üçün üç ayrı koloniya istifadə edilmişdir. Yalnız PKD1 katalitik domeni β-kateninlə qarşılıqlı təsir göstərir. C, in vitro fosforlaşma. Təmizlənmiş tam uzunluqlu glutatyon S-transferaza (GST) – etiketli β-katenin zülalından E. coli [γ- 32 P]ATP varlığında ya aktiv, ya da kinaz-ölü PKD1 ilə inkubasiya edilmişdir. β-Katenin aktiv PKD1 ilə fosforlaşdırıldı. D, β-katenin üzərində PKD1 fosforlaşma sahələrinin xəritələşdirilməsi in vitro. Vəhşi tipli və mutasiyaya uğramış GST etiketli tam uzunluqlu β-kateninlər ifadə edildi və onlardan təmizləndi. E. coli. Təmizlənmiş zülallar [32 P]ATP varlığında təmizlənmiş aktiv PKD1 ilə inkubasiya edilmişdir. İnkubasiyadan sonra zülallar SDS-PAGE ilə ayrıldı, Coomassie mavisi ilə boyandı və filmlərə məruz qaldı. Mutant nomenklaturası üçün Materiallara və Metodlara baxın.

PKD1 fosforlaşma sahəsinin xəritəsini çıxarmaq üçün in vitro fosforlanmış β-katenin zülalı tripsinizləşdirildi və nəticədə peptid fraqmentləri yüksək performanslı maye xromatoqrafiya ilə ayrıldı. 32 P tərkibli “isti” peptid təcrid olunmuş və Edmanın deqradasiyası ilə daha da təhlil edilmişdir. İlk beş amin turşusu qalığı 95-99-cu β-katenin amin turşusu ardıcıllığına uyğun gələn RAAMF idi. Bu peptid (amin turşusu qalıqları 95-123) üç treonin qalığı və bir serin qalığı ehtiva etdiyi üçün dəyişdirmək üçün sahəyə məxsus mutagenezdən istifadə edilmişdir. bu qalıqlardan iki və ya üçünün tək və ya birləşməsi. Bakterial ifadə sistemindən təmizlənmiş vəhşi tipli və mutasiyaya uğramış β-katenin zülalları təmizlənmiş aktiv PKD1 kinaz ilə inkubasiya edilmişdir. Şəkil 2-də göstərildiyi kimiD, vəhşi tipli β-katenin fosforilləşdiyi halda, hər üç treoninin (Thr 102, Thr 112 və Thr 120) qalıqlarının mutasiyası fosforlaşmanı ləğv edir və bu, serin qalığının PKD1 fosforlaşma yeri olmadığını göstərir. Yalnız bir treonin qalığı dəyişdirildikdə, Thr 112 və Thr 120 dəyişdirildikdə β-katenin hələ də fosforlaşdırıla bilər, β-katenin artıq fosforlaşdırılmır. Beləliklə, Thr 112 və Thr 120-nin PKD1 fosforlaşma yerləri olduğu qənaətinə gəldik. Bu iki qalıq α-katenin bağlama bölgəsindədir. Həqiqətən də, Thr 112 CKII fosforilasiya yeri olaraq təyin olundu və Thr 112 mutasiyası α-kateninə olan yaxınlığın azalması ilə nəticələndi (9). Əvvəlki araşdırma göstərdi ki, Thr 120-nin mutasiyası α-katenin bağlama qabiliyyətini ləğv etdi, baxmayaraq ki, Thr 120 fosforlaşması üçün heç bir xüsusi kinaz müəyyən edilməmişdir (29).

Fosforlaşmanı təsdiqləmək üçün in vivo, iki COOH-terminal kəsilmiş β-kateninlər, vəhşi tipli və β-kateninin ilk 150 amin turşusu qalıqlarını ehtiva edən T112R/T120I analoqu hazırlanmışdır. NH ifadə edən bu vektorlar2β-kateninin terminal bölgəsi aktiv və ya kinaz-ölü PKD1 ilə 293T hüceyrələrinə kotransfeksiya edilmişdir. Hüceyrə lizatları immunoblotinq üsulu ilə təhlil edilmişdir. Şəkil 3A vəhşi tipli β-katenin T112R/T120I mutantının deyil, aktiv PKD1-in iştirakı ilə elektroforetik hərəkətliliyin dəyişməsi ilə göstərildiyi kimi fosforilənə biləcəyini göstərir, bu da Thr 112 və Thr 120-nin fosforilləşdiyini göstərir. in vivo. Bunun əksinə olaraq, vəhşi tipli β-katenin NH-nin hərəkətliliyi dəyişmir2-aktiv olmayan PKD1 ilə inkubasiya edildikdə terminal bölgəsi (şək. 3A). Aşağı molekulyar çəki zolağının fosforlanmış β-katenin olduğunu daha da təsdiqləmək üçün PKD1 tərkibli β-katenin lizat λ fosfataza ilə inkubasiya edilmişdir (Şəkil 3).A). Fosfatazanın iştirakı ilə aşağı molekulyar çəki bandı yox oldu. Bununla belə, əgər fosfataza fosfataz inhibitorları ilə əvvəlcədən inkubasiya edilibsə, aşağı molekulyar çəki zolağı qalıb və bu, aşağı molekulyar çəki zolağının fosforilləşmiş β-katenin olduğunu göstərir.

PKD1 β-katenini fosforlaşdırır in vivo. A, üst, in vivo kəsilmiş β-katenin fosforlaşması. β-kateninin ilk 150 amin turşusu qalıqlarını ehtiva edən COOH-terminal kəsilmiş konstruksiya (β-pişikN) PKD1 və ya kinaz-ölü PKD1 (qeyri-aktiv) ilə NIH 3T3 hüceyrələrinə kotransfeksiya edilmişdir. Hüceyrə lizatları transfeksiyadan 2 gün sonra toplandı və anti-GFP antikoru ilə immunoblotlaşdırıldı. Vəhşi tipli β-katenin aktiv PKD1 ilə inkubasiya edildikdə əlavə sürətli mobil zolağa malikdir, lakin qeyri-aktiv PKD1-in mövcudluğunda bant görünmür. Thr 112 və Thr 120 mutasiyaya məruz qaldıqda, sürətli mobil zolaq hətta aktiv PKD1 varlığında yoxa çıxdı, bu iki treonin sahəsinin PKD1 fosforlaşması üçün zəruri olduğunu göstərir. T112R/T120I vəhşi tipdən daha yavaş hərəkət edir, çünki o, T112R mutasiyasında əlavə müsbət yük daşıyır. alt, fosfataz müalicəsi. Yabanı tipli β-catN və PKD1 ilə müvəqqəti transfeksiya edilmiş hüceyrələr 1 saat ərzində 10 nmol/L bryostatin 1 ilə müalicə olundu. Hüceyrələr TBST buferində parçalandı. Hüceyrə lizatları ya λ fosfataz, ya da λ fosfataz plus fosfataz inhibitor kokteyli ilə müalicə olundu (PI AG Scientific-dən). λ fosfatazla müalicədən sonra aşağı molekulyar çəkili band yox oldu. B, PKD1-in aktivləşdirilməsi β-katenin fosforlaşmasını artırır. üst, yabanı tipli β-catN və PKD1 ilə müvəqqəti transfeksiya edilmiş hüceyrələr 10 nmol/L bryostatin 1 ilə müalicə olundu. Müalicə müddəti göstərildi. Fosforlanmış bant zamanla artdı. alt, PKD1 aktivləşdirilməsi zamanı endogen β-katenin fosforlaşması artır. C4-2 çox aşağı PKD1 aktivliyinə malikdir (31). Bryostatin 1 tərəfindən stimullaşdırıldıqda, C4-2 hüceyrələrində endogen β-katenin əsasən dəyişməz qaldı. Bunun əksinə olaraq, PKD1-i sabit şəkildə ifadə edən C4-2 hüceyrələrində endogen β-katenin, aşağı molekulyar çəki zolağının artması ilə göstərildiyi kimi fosforilləşdi. C, fosforlaşmamış mutant yabanı tipli β-kateninlə oxşar zülal sabitliyinə malikdir. Tam uzunluqlu vəhşi tipli və T112R/T120I mutant 2 gün ərzində NIH 3T3 hüceyrələrinə transfeksiya edilmişdir. Hüceyrələr toplanmadan əvvəl göstərilən vaxtlarda ya proteosom inhibitoru olan 2 μmol/L MG132, ya da zülal sintezi inhibitoru olan 20 μmol/L sikloheksimid ilə müalicə olundu. İmmunoblotinq anti-β-katenin ilə aparıldı. Yükləmə nəzarəti kimi endogen β-katenin istifadə edilmişdir. Zülal sabitliyində vəhşi tip və T112R/T120I mutantları arasında aşkar edilə bilən fərq yox idi. D, fosforilləşməmiş β-katenin hüceyrəaltı yeri dəyişdirmişdir. HA etiketli vəhşi tip və T112R/T120I mutant ayrı-ayrılıqda C4-2/PKD1 hüceyrələrinə transfeksiya edilib. Hüceyrələr anti-HA etiket antikoru ilə boyandı. Mutant β-katenin nümunəsi vəhşi tipdən fərqli idi, nüvələrdə daha çox idi.

Hüceyrəvi PKD1 bryostatin 1 ilə müalicə edildikdə aktivləşdirilə bilər (30). PKD1-in aktivləşdirilməsi PKD1-də Ser 916-nın avtofosforilasiyasını tanıyan pS916 fosfoserin antikoru ilə izlənilə bilər. PKD1 və kəsilmiş β-katenin ilə kotransfeksiya edilmiş hüceyrələr 1 saata qədər müxtəlif müddətlərdə 10 nmol/L bryostatin 1 ilə müalicə olundu. Hüceyrə lizatları Western blot ilə təhlil edildi. Şəkil 3-də göründüyü kimiB, aktiv PKD1 zamanla fosforlanmış β-katenin yığılması ilə birlikdə toplanır.

Endogen β-katenin PKD1 tərəfindən fosforilləşdiyini təsdiqləmək üçün biz onların ana LNCaP hüceyrələrindən daha aşağı PKD1 aktivliyinə malik olduğu bilinən C4-2 hüceyrələrindən istifadə etdik (19). C4-2 hüceyrələrində və sabit olaraq PKD1 (C4-2/PKD1) ifadə edən C4-2 hüceyrələrində endogen β-kateninin fosforilasiyası müqayisə edilmişdir. Şəkil 3-də göründüyü kimiB, PKD1-in bryostatin 1 tərəfindən aktivləşdirilməsindən sonra, endogen β-katenin yalnız PKD1 ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələrdə fosforilləşir.

PKD1 ilə fosforlaşma β-katenin hüceyrəaltı lokalizasiyasını dəyişdirir. Çünki NH2-β-kateninin terminal bölgəsi onun zülal dayanıqlığının tənzimlənməsində iştirak edir, vəhşi tip və T112R/T120I mutantlarının sabitliyi tədqiq edilmişdir. Müvəqqəti olaraq transfeksiya edilmiş 3T3 hüceyrələri 0, 1 və 4 saat ərzində ya proteosom inhibitoru olan MG132, ya da zülal sintezi inhibitoru olan sikloheksimidlə müalicə olundu. Zülalların miqdarı immunoblotlarda müqayisə edilmişdir. Vəhşi tip və mutant bu inhibitorların iştirakı ilə çox oxşar nümunələr nümayiş etdirdi və bu, fosforlaşdırılmamış mutantın vəhşi tip β-kateninlə oxşar zülal sabitliyinə malik olduğunu göstərir (şək. 3).C).

Fosforlaşmayan β-kateninin hüceyrəaltı paylanmasını öyrənmək üçün ekzogen HA ilə işarələnmiş vəhşi tip və T112R/T120I mutasiyaya uğramış β-katenin müvəqqəti olaraq C4-2/PKD1 hüceyrələrinə transfeksiya edilmiş və anti-HA etiket antikoru ilə boyanmışdır. Yabanı tipli β-katenin əsasən sitozolda və nüvədə kiçik bir hissə ilə plazma membranında paylanır (şək. 3).D). T112R/T120I mutantının bəziləri plazma membranında lokallaşdırılsa da, nüvədə artan miqdarda T112R/T120I aşkar edilmişdir (şək. 3).D).

PKD1 β-katenin transkripsiya fəaliyyətini modullaşdırır. PKD1-in β-katenin transkripsiya fəaliyyətinə təsirini qiymətləndirmək üçün β-katenin hədəf genlərinin ifadəsini araşdırdıq, o cümlədən siklin D1c-Mycβ-katenin/TCF nəzarəti altında olan və şiş metastazı bastırıcı KAI1 metastatik prostat xərçəngi hüceyrələrində β-katenin/κB P50 tərəfindən inhibə edilən gen (8). Valideyn C4-2 hüceyrələri ilə müqayisədə, KAI1 mRNT səviyyəsi PKD1-i həddindən artıq ifadə edən C4-2 hüceyrələrində daha yüksək idi (şək. 4).A ), lakin ifadəsi siklin D1c-Myc valideyn C4-2 hüceyrələrində daha yüksək idi, bu da PKD1-in β-katenin transkripsiya fəaliyyətini azaltdığını göstərir. Aşağı tənzimləmənin nəticələri siklin D1c-Myc PKD1 tərəfindən verilən məlumatlar Şəkil 1-də Topflash reportyor analizində müşahidəmizə və əvvəlki nəşrimizə uyğundur (21). PKD1-in siRNA tərəfindən yıxılmasının siklin D1 və c-Myc zülal ifadəsini artırdığı, PKD1-in β-katenin transkripsiya fəaliyyətini repressiya etdiyini göstərən nəticəni də dərc etdik (21).

PKD1 β-katenin transkripsiya fəaliyyətini modullaşdırır. A, β-katenin hədəf genlərinin ifadəsi siklin D1, c-Myc, və KAI1PKD1 varlığında. Valideyn C4-2 hüceyrələrindən və C4-2/PKD1 hüceyrələrindən ümumi RNT yarı kəmiyyətli əks transkripsiya-PCR ilə gücləndirildi. C4-2 hüceyrələrində siklin D1 və c-Myc ifadəsi daha yüksəkdir, KAI1 isə C4-2/PKD1 hüceyrələrində daha yüksəkdir. B üçün D, PKD1 fosforilasiyası β-katenin transkripsiya aktivliyini artırır (Topflash analizi). B, fosforilləşməmiş β-katenin mutantlarının transkripsiya aktivliyi azalmışdır. Əlli nanoqram Topflash plazmidi, 2,5 ng Renilla lusiferaza və 25, 50 və 100 ng vəhşi tipli β-katenin NIH 3T3 hüceyrələrinə transfeksiya edilmişdir. Luciferase analizi 2 gün sonra aparıldı. C, Konstitutiv fosforlaşmanı təqlid edən β-katenin mutantı transkripsiya aktivliyini artırmışdır. D, β-katenin transkripsiya fəaliyyəti üzrə PKD1 və CKII fosforlaşmanın müqayisəsi. Topflash analizləri vəhşi tipli β-katenin ilə aparıldı və mutantlar tək başına və ya tam uzunluqlu E-kaderinin iştirakı ilə göstərildi. Thr 102 /Thr 112-də CKII fosforlaşması β-katenin transkripsiya aktivliyinə təsir göstərmir. E-kaderin bütün β-katenin izoformlarına bağlana bilər, çünki onun Topflash analizində inhibitor təsiri göstərilir. Məlumatlar normallaşdırıldı və bütün təcrübələr üç nüsxədə aparıldı. barlar, SD.

Vəhşi tip və T112R/T120I mutasiyaya uğramış β-katenin Topflash analizi ilə transkripsiya aktivliyi üçün sınaqdan keçirilmişdir. Təəccüblüdür ki, Thr 112 və Thr 120-nin tək mutasiyaları β-katenin/TCF transkripsiya fəaliyyətini azaldır, fosforlaşmayan mutant T112R/T120I nəzarət vəhşi tipli β-kateninlə müqayisədə β-katenin/TCF aktivliyində kəskin azalmaya malikdir (Şəkil 4).B). Nəticələr Şəkil 1-də PKD1-in β-katenin/TCF fəaliyyətini funksional repressiya etdiyi müşahidəmizlə ziddiyyət təşkil edir. Tapıntını təsdiqləmək üçün konstitutiv fosforlaşmanı təqlid edən və Topflash analizində sınaqdan keçirilmiş mutant T112E/T120E hazırladıq. T112E/T120E vəhşi tipli β-kateninlə müqayisədə daha yüksək β-katenin/TCF transkripsiya aktivliyinə malikdir (şək. 4).C). Beləliklə, β-katenin/TCF transkripsiya fəaliyyətini saxlamaq üçün PKD1 fosforilasiyası tələb oluna bilər və PKD1-in β-katenin subhüceyrəvi lokalizasiyası və transkripsiya funksiyalarını tənzimləməkdə çoxlu rolu var (Müzakirəyə baxın).

Həm PKD1, həm də CKII kinazları β-katenin Thr 112-ni fosforlaşdıra bildiyinə görə biz CKII fosforlaşmayan mutant T102I/T112R ilə PKD1 fosforlaşmayan mutant T112R/T120I ilə β-katenin/TCF transkripsiya aktivliyini müqayisə etdik. CKII mutantı T102I/T112R β-katenin/TCF aktivliyinə aşkar edilə bilən təsirə malik deyil (şək. 4).D). Birləşdirilmiş CKII/PKD1 mutant T102I/T112R/T120I, PKD1 fosforlaşmayan T112R/T120I mutantı ilə müqayisədə β-katenin/TCF transkripsiya fəaliyyətini qismən bərpa edir (Şəkil 4).D), Thr 102-də CKII fosforilləşməsinin PKD1 fosforlaşma təsirini neytrallaşdıra biləcəyini göstərir.

E-kaderinin əlavə edilməsi sitoplazma β-katenin (26) sekvestr edərək β-katenin transkripsiya fəaliyyətini azalda bilər. Fosforilləşməmiş β-katenin mutantları, həmçinin Topflash analizlərində E-kaderin bağlama qabiliyyətinə görə sınaqdan keçirilmişdir. PKD1 və CKII qeyri-fosforilləşmə mutantları da daxil olmaqla sınaqdan keçirilmiş bütün β-katenin izoformları β-katenin məruzəçi fəaliyyətinə təsir göstərmir və bu, E-kaderin ilə bağlanmanın təsirlənmədiyini göstərir (Şəkil 4).D).

PKD1 fosforilasiyası β-katenin vasitəçiliyi ilə hüceyrə proliferasiyasını və hərəkətliliyini tənzimləyir. E-kaderinin həddindən artıq ekspressiyası hüceyrə böyüməsinin dayandırılmasına və dozadan asılı olaraq apoptoza səbəb olur (26-28). β-kateninin E-kaderin ilə birgə ifadəsi E-kaderin vasitəçiliyi ilə hüceyrə böyüməsinin dayandırılmasına qarşı çıxır. Biz mutasiyaya uğramış β-kateninin E-kaderinin səbəb olduğu hüceyrə böyüməsinin dayandırılmasını aradan qaldırmaq qabiliyyətini sınaqdan keçirdik. Təcrübə şərtləri seçilmişdir ki, vəhşi tipli β-katenin miqdarı LNCaP hüceyrəsinin böyüməsində E-kadherin vasitəçiliyi ilə inhibəni marjinal şəkildə xilas etdi (Şəkil 5).A ). Ektopik E-kaderinin iştirakı ilə əvəzlənmiş tək treonin qalığı (T112R və ya T120I) ilə β-katenin əlavə edilməsi hüceyrə böyüməsinin inhibəsini aradan qaldırmadı. Bununla belə, ikiqat qeyri-fosforilasiya T112R/T120I β-katenin mutantının vəhşi tipli β-kateninlə müqayisədə daha yüksək xilasetmə potensialı var idi ki, bu da PKD1 fosforilasiyasının β-katenin vasitəçiliyi ilə yayılma funksiyasını maneə törətdiyini göstərir.

Fosforlaşma β-katenin vasitəçiliyi ilə hüceyrə proliferasiyasını və hərəkətliliyini tənzimləyir. A, fosforilləşməmiş β-katenin E-kaderini həddindən artıq ifadə edən LNCaP hüceyrələrini xilas etmək üçün daha çox potensiala malikdir. LNCaP hüceyrələri 100 ng tam uzunluqlu E-kaderin və ya PKD1 ifadə vektoru ilə transfeksiya edilmişdir. 50 nanoqram β-katenin konstruksiyaları (vəhşi tip və ya göstərildiyi kimi mutantlar) və ya 25 ng siPKD1 və ya siE-kadherin fərdi olaraq E-kaderin və ya PKD1 ilə kotransfeksiya edilmişdir. Hüceyrə canlılığı MTS üsulu (Promega) ilə transfeksiyadan 48 saat sonra ölçüldü. Təcrübə şərtləri optimallaşdırılmışdır ki, vəhşi tipli β-katenin konstruksiyasının marjinal xilasetmə gücü var. T112R/T120I olan hüceyrələr E-kaderinin iştirakı ilə vəhşi tip β-katenin olan hüceyrələrdən daha sürətli böyüyürdü. siRNA tərəfindən PKD1-in yıxılması E-kaderinin həddindən artıq ifadəsi ilə maneə törədilən hüceyrə böyüməsini bərpa edə bilər və əksinə. barlar, Üçlü nümunələrə əsaslanan SD. P dəyər birtərəfli ANOVA istifadə etməklə müəyyən edilmişdir. B, fosforillənməmiş β-katenin hüceyrə miqrasiyasını artırır. Vəhşi tip və ya T112R/T120I ifadə edən müvəqqəti transfeksiya edilmiş 3T3 hüceyrələri transfeksiyadan 2 gün sonra yaraların sağalma analizinə məruz qaldı. Şəkil yara yarandıqdan 18 saat sonra çəkilib. C, Hüceyrə işğalının Matrigel analizi. Tam uzunluqlu vəhşi tipli və T112R/T120I mutant β-katenin ifadə vektorları Matrigel ehtiva edən transwelllərə əlavə edilməzdən əvvəl 2 gün ərzində 3T3 hüceyrələrinə transfeksiya edilmişdir. Hüceyrələr 2 gün ərzində Matrigel üzərində yetişdirildi. Əlavə edilmiş hüceyrələr Diff Quick dəsti ilə rəngləndi (üst). Sütunlar, üç nüsxə nümunə əsasında hər filtrə əlavə edilmiş hüceyrələrin orta sayı barlar, SD (alt).

E-cadherin kimi, PKD1-in həddindən artıq ifadəsi də hüceyrə proliferasiyasını maneə törədə bilər (Şəkil 5).A refer. 21). SiPKD1-in E-kaderin ifadə vektoru ilə kotransfeksiyası və ya siEcad-ın PKD1 ifadə vektoru ilə kotransfeksiyası E-kadherin və ya PKD1-in həddindən artıq ifadəsi nəticəsində yaranan böyümə inhibəsini aradan qaldıra bilər (Şəkil 5).A). Məlumatlar PKD1 və E-kaderinin eyni siqnal yolunda β-katenin fəaliyyətini tənzimlədiyi fərziyyəsini daha da dəstəkləyir.

PKD1 fosforilasiyasının hüceyrə hərəkətliliyinə təsirini də öyrəndik. Ya vəhşi tipli β-katenin və ya T112R/T120I mutantı ilə transfeksiya edilmiş siçan 3T3 hüceyrələri yara sağalma testi ilə sınaqdan keçirilmişdir. Şəkil 5-də göründüyü kimiB, T112R/T120I mutantı vəhşi tipdən daha yüksək hərəkət qabiliyyətinə malikdir. Matrigel analizi həmçinin T112R/T120I mutantının vəhşi tip β-kateninlə müqayisədə daha yüksək invaziv qabiliyyətə malik olduğunu təsdiqlədi (Şəkil 5).C).


Ser/Thr və Tyr protein kinaz ailəsi daxilində və arasında konservasiyanın müqayisəsi: epidermal böyümə faktoru reseptorunun katalitik sahəsi üçün təklif olunan model

Protein kinaz ailəsi Ser/Thr və ya Tyr substratlarını fosforilləşdirmək qabiliyyətinə görə iki əsas qrupa bölünə bilər. Bu funksional fərqin əsasını başa düşmək üçün biz Ser/Thr və Tyr protein kinazlarının daxilində və arasında ardıcıllığın qorunmasının müqayisəli təhlilini apardıq. 86 protein kinaz ardıcıllığının çoxsaylı ardıcıl düzülüşü yaradıldı. Düzəlişdə hər mövqe üçün biz Ser/Thr, Tyr və hər iki kinaz alt ailəsində qalıq növünün saxlanmasını hesabladıq. Konservasiyanın struktur və/və ya funksional əsasını başa düşmək üçün biz bu qorunma xüsusiyyətlərini cAMP-dən asılı olan Ser/Thr kinazın bu yaxınlarda müəyyən edilmiş strukturunun onurğa sütununa yerləşdirdik. Nəticələr göstərir ki, kinaz strukturu konservasiya əsasında üç zonaya bölünə bilər. Daxili zona bütün kinaz ailəsində yüksək dərəcədə qorunan qalıqları ehtiva edir və substrat və ATP bağlanması və kataliz üçün vacib olan qalıqlarla birlikdə fermentin hidrofobik nüvəsini təsvir edir. Xarici zona bütün kinazlarda yüksək dərəcədə dəyişən qalıqları ehtiva edir və zülalın həlledici təsirə məruz qalmış səthini təmsil edir. Üçüncü zona ya Ser/Thr və ya Tyr kinazlarında və ya hər ikisində qorunan, lakin onlar arasında qorunmayan qalıqlardan ibarətdir. Bunlar hidrofobik nüvə ilə həllediciyə məruz qalmış səth arasında sıxışdırılır. Kinaz ailəsində ümumi konservasiyanı təhlil etməklə yanaşı, onun substratının və ATP bağlanma yerlərinin qorunmasına da baxdıq. ATP sahəsi bütün kinazlarda yüksək dərəcədə qorunur, substratın bağlanma sahəsi isə daha dəyişkəndir. Aktiv sahə Ser/Thr və Tyr kinazları arasında fərqlənən bir neçə mövqedən ibarətdir və hidroksil daşıyan yan zəncirlər arasında ayrı-seçkiliyə cavabdeh ola bilər. Bu məlumatdan istifadə edərək, Tyr substratının epidermal böyümə faktoru reseptorunun (EGFR) katalitik sahəsinə bağlanması üçün bir model təklif edirik.


Protein kinaz həm treonin, həm də tirozin qalığını fosforlaşdıra bilərmi? - Biologiya

MDPI tərəfindən nəşr olunan bütün məqalələr açıq giriş lisenziyası altında dərhal bütün dünyada mövcuddur. MDPI tərəfindən dərc edilmiş məqalənin, o cümlədən rəqəmlər və cədvəllər də daxil olmaqla, hamısının və ya bir hissəsinin təkrar istifadəsi üçün xüsusi icazə tələb olunmur. Açıq giriş Creative Common CC BY lisenziyası altında dərc olunan məqalələr üçün məqalənin hər hansı bir hissəsi orijinal məqaləyə aydın şəkildə istinad etmək şərti ilə icazəsiz təkrar istifadə edilə bilər.

Feature Papers sahədə yüksək təsir üçün əhəmiyyətli potensiala malik ən qabaqcıl tədqiqatları təmsil edir. Bədii məqalələr elmi redaktorlar tərəfindən fərdi dəvət və ya tövsiyə əsasında təqdim olunur və dərc edilməzdən əvvəl ekspert rəyindən keçir.

Bədii məqalə ya orijinal tədqiqat məqaləsi, tez-tez bir neçə texnika və ya yanaşmanı özündə cəmləşdirən əsaslı yeni tədqiqat işi, ya da elmi sahədə ən maraqlı nailiyyətləri sistematik şəkildə nəzərdən keçirən sahədəki ən son irəliləyişlərə dair qısa və dəqiq yenilikləri olan hərtərəfli icmal sənədi ola bilər. ədəbiyyat. Bu tip kağız tədqiqatın gələcək istiqamətləri və ya mümkün tətbiqlər haqqında dünyagörüşünü təqdim edir.

Redaktorun Seçimi məqalələri dünyanın hər yerindən MDPI jurnallarının elmi redaktorlarının tövsiyələrinə əsaslanır. Redaktorlar jurnalda bu yaxınlarda dərc edilmiş az sayda məqaləni seçirlər ki, onlar müəlliflər üçün xüsusilə maraqlı və ya bu sahədə vacib olacaq. Məqsəd jurnalın müxtəlif tədqiqat sahələrində dərc edilmiş ən maraqlı işlərdən bəzilərinin şəklini təqdim etməkdir.


Giriş

Zülalların translyasiyadan sonrakı modifikasiyası zülal funksiyasına nəzarət etmək üçün çoxlu və müxtəlif yollar təklif edir. Zülalların hüceyrələrdə keçə biləcəyi post-translational modifikasiyalardan fosforlaşma bəlkə də bu günə qədər ən yaxşı öyrənilənlərdən biridir. Protein kinazları, zülal substratlarında ilk növbədə serin, treonin və tirozin qalıqlarının fosforlaşmasını kataliz edən fermentlər [1,2], siqnal ötürülməsi yollarının çoxluğuna nəzarət etməkdə əsas rol oynayır və buna görə də terapevtik müdaxilə üçün mühüm hədəfləri təmsil edir [3-] 5]. Protein substratlarını fosforlaşdıraraq, kinazlar bu substratın funksiyasının müxtəlif aspektlərinə kritik məkan-zaman tənzimləməsini verə bilirlər, məsələn, onun fəaliyyətinin və ya sabitliyinin dəyişməsini təşviq etmək, onun digər effektorlarla bağlanmasını dəyişdirmək və ya hüceyrəaltı paylanmasında dəyişiklik etmək [2] ]. Beləliklə, protein kinazları bioloji sistemlərdə mühüm rol oynayır.

In humans, the kinase superfamily has been classified into two principle groups, comprising the eukaryotic protein kinases, of which there are 497, and the atypical protein kinases, of which there are 58 [6]. The eukaryotic protein kinases can be further segregated into several families based on sequence similarities within their kinase domains [7]. A dendrogram encapsulating all human protein kinases is commonly referred to as the kinome tree, where each specific branch represents a family of similar kinases [7]. The serine/threonine (Ser/Thr) protein kinase CK1 family forms its own distinct branch of the kinome tree [7] (Figure 1A), and constitutes one of the first Ser/Thr protein kinase families to be discovered [8]. The CK1 branch includes the CK1 isoforms, and the closely related vaccinia-related kinases (VRKs) and tau tubulin kinase 1 (TTBK1) members [7,9]. Historically, CK1 and an unrelated protein belonging to the CMGC family of protein kinases named casein kinase 2 (CK2), were named for their ability to phosphorylate the milk protein casein in vitro [10]. However, it should be noted that CK1 members are not the physiological casein kinases [10,11]. The bona fide casein kinase was recently identified as FAM20C, a Golgi-resident protein kinase that is capable of phosphorylating many secreted proteins, including casein [11–15]. Due to this misnomer, many studies use CK2 as a control in experiments seeking to prove that the phosphorylation of the substrate of interest is specific to CK1, whereas they are in fact unrelated enzymes.

Domain architecture of CK1 isoforms.

(A) Phylogenetic tree of the CK1 family of protein kinases (based on [7]). (B) Schematic detailing the domain architecture for the CK1 isoforms. Percentage sequence similarity of the kinase domains for each CK1 isoform, relative to the CK1α kinase domain, is shown.

(A) Phylogenetic tree of the CK1 family of protein kinases (based on [7]). (B) Schematic detailing the domain architecture for the CK1 isoforms. Percentage sequence similarity of the kinase domains for each CK1 isoform, relative to the CK1α kinase domain, is shown.

Seven mammalian CK1 isoforms and their associated splice variants have been reported (Figure 1A). These include the α, α-like, γ1, γ2, γ3, δ and ɛ CK1 isoforms, which have been grouped together based on their high degree of homology within their N-terminal kinase domains (Figure 1B). Outside of the kinase domain, there is little homology between CK1 members. Importantly, CK1 kinases are encoded by distinct genes, and are not splice variants, although splice variants do exist for some CK1 isoforms [16]. For example, there are three transcript variants for human CK1δ [17], and two transcript variants for human CK1α [18]. Interestingly, zebrafish present with four CK1α variants [19]. Within the CK1 family, the α, α-like, δ and ɛ isoforms share a higher degree of sequence similarity in their kinase domains when compared with those of the γ isoforms [16,20,21]. To date, most investigations have focussed on the CK1α, δ and ɛ isoforms, whilst the functions and regulation of the α-like and CK1γ isoforms have remained somewhat elusive, although mounting evidence supports roles for CK1γ in the regulation of immune signalling pathways [22,23]. As such, the major focus of this review will concern CK1α, δ and ɛ.

All CK1 isoforms have been reported to act as monomeric enzymes and are classically thought to exist in a constitutively active state [16,20,21]. However, studies demonstrating constitutive activity of CK1 isoforms have largely been performed in vitro with purified catalytic domains, and as such fail to capture any potential regulation from accessory proteins or other enzymes. It is now becoming clear that certain CK1 isoforms can become activated through direct association with cellular proteins [24]. A comprehensive comparison between the enzyme kinetics of each CK1 isoform, and any associated splice variants, is lacking, but the basal activities are likely different for each isoform, and most likely depend on the substrate used. CK1 family members catalyse the transfer of phosphate on to Ser/Thr residues of their protein substrates by utilising ATP exclusively as the source of the phosphate donor [25,26]. That said, the yeast orthologue of CK1δ, Hrr25, has been reported to phosphorylate tyrosine (Tyr) residues in addition to Ser/Thr [27], and the Xenopus laevis orthologue of CK1α was shown to phosphorylate Tyr residue in synthetic peptide substrates [28]. As ubiquitously expressed kinases, CK1 isoforms have been reported to be involved in numerous, seemingly unrelated signalling pathways, and many proteins have been reported to be phosphorylated by CK1 isoforms [16,20,21,29]. In terms of conservation, the CK1 family are conserved throughout evolution, and several CK1 orthologues have been identified in other vertebrates, as well as yeast, plants, and protozoa [19,30–35].

Early attempts aimed at elucidating the substrate specificity of CK1 identified the requirement for a priming phosphorylation event in the -3 position of the CK1 phosphorylation site. This consensus sequence of pS/pT-X-X-S*/T*, where X is any amino acid and S*/T* denotes CK1-phosphorylation residues, has long since been suggested as the optimal CK1 phosphorylation motif [25,36,37]. Given this requirement for a priming phosphorylation event, CK1 isoforms were thought to act downstream of other kinases, and as such, this restricted their contribution within signalling cascades to one of a hierarchical manner, with CK1 isoforms phosphorylating substrates only when the substrate had been pre-phosphorylated by another priming kinase. However, it has since come to light that a cluster of acidic residues N-terminal to the target Ser/Thr phosphorylation sites, with an acidic amino acid at the −3 position, can effectively substitute for the priming phosphorylation event [38–42]. Furthermore, a non-canonical S-L-S motif with a concurrent cluster of C-terminal acidic residues has also been shown to be phosphorylated by CK1 isoforms, albeit less efficiently than the canonical phospho-primed sequence [16,43]. Such phosphorylation of S-L-S motifs is best showcased in two of the most robustly established CK1 substrates — nuclear factor of activated T-cells (NFAT) and β-catenin [16,43]. Intriguingly, a novel CK1 phosphorylation motif, K/R-X-K/R-X-X-S/T, was reported to be phosphorylated in several sulfatides and cholesterol-3-sulfate binding proteins [44]. These observations imply that CK1 isoforms can phosphorylate Ser/Thr residues that are not defined by a specific sequence motif, suggesting that the phosphorylation of specific substrates in cells is likely to be regulated by other factors, such as determinants of their subcellular distribution and substrate recruitment.


Müəllif xülasəsi

The activity of proteins can be finely and reversibly tuned by post-translational modifications. The attachment of phosphate groups to tyrosine residues is one of such modifications. While the existence of extracellular phosphoproteins has been known, the functional significance of extracellular phosphorylation is poorly understood. Here we describe a single extracellular tyrosine whose inducible phosphorylation may represent an archetype for a new class of mechanism mediating protein—protein interaction and regulating protein function. We show that the interaction between EphB2—which occurs upon receptor activation by its ligand ephrin-B—and the N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) depends on extracellular phosphorylation of EphB2. This interaction regulates the localization of the NMDA receptor to synaptic sites in neurons. In vivo, EphB2 is phosphorylated in response to injury, and the subsequent up-regulation of the interaction between EphB2 and NMDA receptors enhances injury-induced pain behavior and mechanical hypersensitivity in mice. Importantly, our study defines a specific extracellular phosphorylation event as a mechanism driving protein interaction and suggests that extracellular phosphorylation of proteins is an underappreciated mechanism contributing to the development and function of the nervous system and synapse.

Sitat: Hanamura K, Washburn HR, Sheffler-Collins SI, Xia NL, Henderson N, Tillu DV, et al. (2017) Extracellular phosphorylation of a receptor tyrosine kinase controls synaptic localization of NMDA receptors and regulates pathological pain. PLoS Biol 15(7): e2002457. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2002457

Akademik redaktor: Allan Basbaum, University of California, San Francisco, United States of America

Qəbul edildi: March 15, 2017 Qəbul edildi: June 12, 2017 Nəşr olundu: July 18, 2017

Müəlliflik hüququ: © 2017 Hanamura et al. Bu, Creative Commons Attribution Lisenziyasının şərtlərinə uyğun olaraq paylanmış açıq giriş məqaləsidir və orijinal müəllif və mənbənin qeyd edilməsi şərti ilə istənilən mühitdə məhdudiyyətsiz istifadə, paylama və reproduksiyaya icazə verir.

Məlumatın mövcudluğu: Bütün müvafiq məlumatlar kağızda və onun dəstəkləyici məlumat fayllarındadır. Mass spectrometry data, including raw files, are freely available upon request to Thomas Neubert ([email protected]). Raw confocal stacks are available upon request to Matthew Dalva ([email protected]).

Maliyyələşdirmə: National Institute of Mental Health (grant number MH100093). National Institute of General Medicine (grant number GM102575). National Center for Research Resources (grant number RR027990). 100 Women in Hedge Fund Foundation. National Institute on Drug Abuse (grant number DA022727). National Eye Institute Vision Training Grant (grant number EY007035). National Institute of Neurological Disorders and Stroke (grant number NS050276). National Institute of Neurological Disorders and Stroke (grant number NS065926). The Vicki and Jack Farber Foundation. Tədqiqatın dizaynında, məlumatların toplanmasında və təhlilində, nəşr etmək qərarında və ya əlyazmanın hazırlanmasında maliyyəçilərin heç bir rolu olmayıb.

Rəqabətli maraqlar: Müəlliflər heç bir rəqabət aparan maraqların olmadığını bəyan ediblər.

İxtisarlar: ACSF, artificial cerebrospinal fluid AU, arbitrary unit cFN3, C-terminal FN3 CIP, calf intestinal alkaline phosphatase Cys, cysteine-rich domain D-APV, D-2-amino-5-phosphonovalerate DIV, day in vitro EGFP, enhanced green fluorescent protein EPSC, excitatory postsynaptic current EYFP, enhanced yellow fluorescent protein FL, full length FN3, fibronectin type III IP, immunoprecipitation JM, juxtamembrane domain KD, kinase dead K–S, Kolmogorov–Smirnov LBD, ligand-binding domain LC-MS/MS, liquid chromatography tandem mass spectrometry LV, lentivirus mEPSC, miniature excitatory postsynaptic current MS/MS, tandem mass spectrometry nFN3, N-terminal FN3 NMDAR, N-methyl-D-aspartate receptor pA, picoampere PDZ, PSD-95/DLG1/ZO-1 domain PY99, α-phosphotyrosine RNAi, RNA interference Ro25, Ro 25–6981 RTK, receptor tyrosine kinase SAM, sterile α-motif shRNA, short hairpin RNA STED, stimulated emission depletion TK, tyrosine kinase domain TM, transmembrane domain TR, truncated VLK, vertebrate lonesome kinase WT, wild type


MÜZAKİRƏ

Roles of Protein Tyrosine Phosphatases in Yeast Meiosis and Sporulation

In S. cerevisiae, the involvement of Tyr phosphorylation in cellular signaling has been well established only in the regulation of MAP kinases. Much less is known about the tyrosine phosphorylation in regulation of other cellular responses in yeast. In this report, by analyzing the phenotypes of strains with phosphatase genes deleted, we have demonstrated that Ptp2 and Ptp3 are required for efficient meiosis and sporulation. Homozygous deletion of bothptp2Δ ptp3Δ causes no adverse growth defect but results in a significant reduction of sporulation efficiency. Inptp2Δ/ptp3Δ/− cells, the expression of sporulation-specific genes was significantly reduced, suggesting that Ptp2 and Ptp3 are required for the initiation of meiotic differentiation. The sporulation defect phentype can be affected by strain background. Double deletion of PTP2/PTP3in yeast strains dervied from SK background does not result in an apparent sporulation defect (our unpublished results). It is possible that in strains derived from SK background, which was selected for high sporulation effeciency, genetic variation has diminished the requirement of phosphatase in sporulation. The phosphatase activity of Ptp3 appears to be required for its function in sporulation, because a catalytically deficient Ptp3C814G mutant was unable to complement the sporulation defects of ptp2Δ/ptp3Δ in our strains. Because both Ptp2 and Ptp3 are Tyr-specific phosphatases, our results suggest an involvement of Tyr phosphorylation in regulation of meiosis and sporulation. One possible mechanism for PTPase action is that the phosphatases dephosphorylate a Tyr-phosphorylated regulator(s), thus allowing initiation of meiotic differentiation. Consistent with the notion that phosphatases are involved in the regulation of sporulation, Park və b. (1996) have recently reported that deletion of a dual-specificity phosphatase,YVH1, together with ptp2Δ resulted in a significant reduction in sporulation.

Regulation of Rim11 Tyr Phosphorylation

We have shown that there are at least three cellular proteins, p42, p43, and p52, that became Tyr phosphorylated inptp2Δ/ptp3Δ/− cells during sporulation. We presented data indicating that p42 is likely to be the MCK1 gen məhsulu. Mck1 was previously shown to undergo autophosphorylation on tyrosine residues (Lim və b., 1993). Because deletion of MCK1 results in a pleiotropic phenotype, whereas cells with a homologous GSK3 gene,RIM11, deleted only displays a sporulation defect, we investigated whether p43 is encoded by RIM11. silinməsiRIM11 abolished p43 Tyr phosphorylation. We observed that Rim11 is constitutively Tyr phosphorylated on the Tyr-199 residue, which is conserved among every member of the GSK3 family. Tyr phosphorylation of Rim11 was induced by shifting cells from glucose to acetate medium. However, Rim11 Tyr phosphorylation does not appear to be regulated by Ptp2 and Ptp3, because neither deletion nor overexpression of the PTPase genes had a significant effect on the Tyr phosphorylation of Rim11. Therefore, it is unlikely that Rim11 is the 43-kDa protein whose Tyr phosphorylation is up-regulated inptp2Δ/ptp3Δ/− cells during sporulation. Future studies are required to determine the identities of p43 and p52 and the role of tyrosine dephosphorylation of these proteins in sporulation.

In mammalian cells, GSK3 has been shown to be constitutively phosphorylated on Tyr (Hughes və b., 1993). However, it is unclear whether the Tyr phosphorylation is mediated by upstream kinases or by autophosphorylation. In our investigation on the regulation of Rim11 Tyr phosphorylation, we found that the in vivo Tyr phosphorylation of Rim11 is dependent on its own kinase activity, suggesting that autophosphorylation is responsible for the Tyr phosphorylation. It is formally possible that Rim11 Tyr phosphorylation was catalyzed by another kinase whose activity depends on Rim11 in vivo. Our data support a model that the tyrosine phosphorylation of Rim11 is autocatalytic. When kinase-deficient Rim11K68A is expressed in wild-type cells, its Tyr phosphorylation is mostly abolished, arguing against the dependence on another kinase. The autophosphorylation mechanism is further supported by the observation that purified recombinant GST-Rim11 undergoes tyrosine phosphorylation in vitro. Given the high degree of sequence homology between Rim11 and mammalian GSK3 (∼50∼60% homology), it is conceivable that the autophosphorylation mechanism may also be responsible for Tyr phosphorylation of mammalian GSK3 in vivo.

Function of Rim11 Tyr Phosphorylation

No kinase activity toward substrates was detected on Rim11Y199F mutant immunoprecipitated from yeast cells. Loss of kinase activity of Rim11Y199F could be due to either tyrosine phosphorylation-activating Rim11 kinase activity or the mutation causing an inappropriate global folding of Rim11. When Rim11Y199F mutant was purified as recombinant protein from E. coli, the autophosphorylation activity was intact, although no kinase activity toward substrates was detected. Given the efficient GST-Rim11Y199F autophosphorylation activity, we believe that Rim11Y199F should have a correct global structure compared with wild type. Thus our data support the model that phosphorylation of Tyr-199 is required for specific activity of Rim11 toward substrate, possibly playing a role in substrate recognition and phosphorylation rather than kinase activity per se. One of Rim11 in vivo function is to phosphorylate two key meiotic regulators, Ime1 (Bowdish və b., 1994) and Ume6 (Malathi və b., 1997). Phosphorylation of Ime1 and Ume6 by Rim11 promotes the complex formation of Ime1 and Ume6, which induces the expression of sporulation specific genes (Rubin-Bejerano və b., 1996 Malathivə b., 1997). We propose that the function of tyrosine phosphorylation is to activate Rim11 kinase, thereby enhancing the ability of Rim11 to phosphorylate physiological substrates, including Ume6 and Ime1. Consistent with the in vivo requirement of Tyr-199 phosphorylation for Rim11 activity, Y199F mutation, which eliminated the phosphorylation site, completely abolished in vivo functions of Rim11.

In summary, this report demonstrates essential roles of tyrosine phosphorylation in yeast meiosis and sporulation by both protein Tyr phosphatases and kinase. Our results show for the first time that Tyr phosphorylation of Rim11 is required for its kinase activity toward substrates and plays an essential role in the regulation of meiosis and sporulation. The functional significance of tyrosine phosphorylation may also apply to members of mammalian GSK3 family that tyrosine phosphorylation enhances the ability of GSK3 to phosphorylate physiological substrates.


Videoya baxın: Aminoasit Nedir? Aydınlanma Zamanı 1. Bölüm (Avqust 2022).