Məlumat

Zülallar üçün ion mübadiləsi və gel keçirici xromatoqrafiya

Zülallar üçün ion mübadiləsi və gel keçirici xromatoqrafiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Yumurtanın ağından Lizozim çıxarmaq üçün hansı üsulu tövsiyə edərdiniz və zəhmət olmasa bunun səbəbini anlamağa kömək edin.

Lizozim əksər zülallardan daha yüksək izoelektrik nöqtəyə (pH 10.5) və daha aşağı molekulyar kütləyə (14 307 Da) malikdir, buna görə də hər iki üsul bir qədər məna kəsb edir. Gel keçirici xromatoqrafiya üçün Sephahdax G100 və ion mübadiləsi üçün CM-Sephadex G25 ion dəyişdiricisindən istifadə edin.

Anladığım qədər, Gel Permeation yumurta ağını müxtəlif zülal və birləşmələrdən Mr əsasında ayıracaq. Cənab yumurta ağ zülallarında kifayət qədər variasiya var, lakin lizozim, əslində, Cystatin və Ovomucoid aşağı olduğundan, ən aşağı cənab yoxdur. Bundan əlavə, GPC üçün molekulyar çəkidə ən azı 10% fərq tələb olunur. piklərin ağlabatan həlli. Mr-in diapazonu da bu üsulda kifayət qədər genişdir. Bu, bəlkə də zərərli olacaq? Beləliklə, GPC-nin müsbət tərəfi var, çünki bütün saxlanılmamış analitlər üçün son elüsyon həcmi var.

İndi ion mübadiləsi xromatoqrafiyası, dəyişdiricinin ayrılan qarışıqla necə qarşılıqlı əlaqədə olmasının təbiətində çox spesifikdir. Lizozimin PI-sı 10,7-dir ki, bu da yumurta ağındakı zülalların qalan hissəsindən xeyli yüksəkdir. GPC ilə olduğu kimi biz standart olaraq 0,05M NaCl olan 0,05M Tris-EDTA, pH 8,2 istifadə edirik. Bu quraşdırma Gibbs Donan effekti və ya xromatofokusla nəticələnə bilərmi?

Mən hazırda təmiz məhsul əldə etmək üçün GPC-yə meyl edirəm, çünki G25 ilə daha sonra duzsuzlaşdırıla bilər.

Xahiş edirəm məni düzgün istiqamətə yönəltməyə kömək edin. Mən bu işdə tamamilə yeniyəm, lakin bacarıqlarımı öyrənməyə və genişləndirməyə hazıram və çox istəkliyəm.


Lizozim çox yaxşı öyrənildiyi üçün ən yaxşı seçiminiz ədəbiyyata baxmaq və başqalarının hansı üsullardan istifadə etdiyini görməkdir. Məsələn, bu kağıza baxın. Onlar bildirirlər ki, lizozim Sephadex-də yaxınlıqdan təmizlənə bilər, lakin onlar həm də girişdə baxa biləcəyiniz digər üsullara istinad edirlər.

Təsvir etdiyiniz hər iki üsul ağlabatan səslənir. Hansının daha yaxşı olduğunu bilməyin yeganə yolu onları sınamaq və görməkdir. Əslində, tətbiqinizdən asılı olaraq ən yaxşı yanaşma, optimal təmizlik üçün hər iki üsuldan istifadə etmək olardı. Mən bir zülalın saflığına yaxınlaşdığımda belə, cilalama addımı kimi tez-tez ion mübadiləsini həyata keçirəcəyəm.


Budur mən nə ilə gəldim. Bütün köməyinizə görə təşəkkür edirəm.

İon Mübadilə Xromatoqrafiyası (IEC) bir tətbiqdən təmiz məhsul verəcəkdir. Əsas səbəb, molekulyar kütlələrində Lizozim (14,3 KDa) və Sistatinin (12,0 KDA) yaxınlığı ilə Gel Permeation Xromatoqrafiyasının pozulmaması ilə bağlıdır. Sephadax G100 molekulyar kütlənin geniş diapazonunu ayırır, lakin geniş diapazonun mənfi tərəfi belə yaxınlıqda aşağı həssaslıqdır. Elüsyon zamanı bu iki zülal arasında ayrı-seçkilik edə bilməyəcək. Sistatin nümunənin yalnız 0,05%-ni itirdiyinə görə, böyük olmasa da, bu çirklənməni götürmək daha da çətin olacaq. Bundan əlavə, Sephadax G100 Lizozimi çox uzun müddət saxlayacaq, çünki o, nümunədəki ən kiçiklərdən biridir. Beləliklə, böyük miqdarda saxlanılacaq və seyreltilmiş nümunə istehsal olunacaq. Onu da nəzərə almaq lazımdır ki, GPC aşağı ayırdetmə qabiliyyətinə, aşağı tutuma malikdir və yüksək axın sürətinə imkan vermir. GPC, IEC ilə müqayisədə daha xam nümunə istehsal etmək üçün ən sürətli və ən sadə üsuldur. Bu halda IEC CM-Sephadex G25-dən istifadə edir, yəni hissəcik ölçüsü xüsusiyyətlərinə görə heç bir Lizozim itirilməyəcək və Cənab GPC-dən fərqli olaraq matrisdə tutulmasına imkan verir. Bu, daha konsentrasiya edilmiş nümunə ilə nəticələnir. Bütün zülalların pI-ni müqayisə etsək, Lizozim (10.7) və Avidin (10.0) hər ikisi ilkin pH 8.2-də yeganə kationlardır. Bu o deməkdir ki, lizozim asanlıqla çıxarıla bilər, çünki pH onu denatürasiya etmədən və ya hər hansı bir nümunə itirilmədən katyonik dəyişdiricinin istifadəsi ilə davamlı olaraq azalır. GPC yalnız duzsuzlaşdırma və dializ vasitəsilə nümunəni daha da təmizləmək üçün G25 istifadə edərək IEC-ə əlavə addım kimi faydalıdır.


Fəsil 6 Yüksək performanslı gel-filtrasiya xromatoqrafiyası (HPGFC)

Bu fəsildə yüksək performanslı gel-filtrasiya xromatoqrafiyası (HPGFC) müzakirə edilir. Gel keçirici xromatoqrafiya ilk dəfə sulu məhlullarda zülalların ayrılması üçün Flodin və Porat tərəfindən təklif edilmişdir. Molekulyar biologiya və bioaqnik kimyada son nailiyyətlər, fraksiya və analiz üçün sulu elüentlərin istifadə edildiyi GPC kimi gel-geçirmə xromatoqrafiyasının (GPC), gel filtrasiya xromatoqrafiyasının (GFC) və ya sulu GPC-nin əhəmiyyətli dərəcədə istifadəsi ilə əlaqədardır. biopolimerlərin. GPC və GFC arasında heç bir əsas fərq yoxdur və fərqli adlar ənənəyə görədir. Bununla belə, GFC bioloji obyektlərin yüksək polaritesi, hidrofilik təbiəti və qeyri-sabitliyi ilə bağlı bəzi xüsusiyyətlər nümayiş etdirir. Hazırda yüksək sürətli HPGFC mexaniki dayanıqlı makroməsaməli sorbentlərdən istifadə olunur. Onlar su ilə uyğun gəlir və biopolimerlərə qarşı az və ya heç bir fəaliyyət göstərmirlər. Sonuncu xüsusiyyət ya səthi aşağı adsorbsiya aktivliyi olan hidrofilik qruplarla dəyişdirilmiş sorbentlərdən (biopolimerlərin HPGFC üçün xüsusi sorbentlər) və ya aktiv mərkəzləri bloklayan adsorbsiya-aktiv komponentlərin elüentinə əlavə edilən adi silisium sorbentlərindən istifadə etməklə əldə edilir. silisiumlardan.


Gel filtrasiya xromatoqrafiyasının tərifi

Gel filtrasiya xromatoqrafiyası məsaməli istifadə edən xromatoqrafiya üsulu kimi müəyyən edilə bilər gel muncuqları xüsusi məsaməlilik komponentləri molekulyar ölçülərindən asılı olaraq təcrid etmək. Bu texnika əsasən hissəcikləri saxlayır və ya istisna edir ölçü fərqi, buna görə də ölçü istisnası və ya gel istisna xromatoqrafiyası kimi tanınır. Əsasən izolyasiyada kömək edir biomolekullar zülallar, peptidlər və oliqonukleotidlər kimi.

Gel filtrasiya xromatoqrafiyasında mərhələlər

Mobil mərhələ: The həlledici sütundan keçən mobil fazadır. Test nümunəsi müvafiq üzvi həlledicilərdə seyreltilməli, sonra süzülməli və nəhayət sütuna ötürülməlidir. Çoxkomponentli qarışığın ayrılması sütunda baş verir.

Stasionar mərhələ: The sütun ilə doludur mikroməsaməli gel muncuqlar stasionar faza rolunu oynayır. Hydroxypropylated Sephadex, cross-linked polyacrylamid, agarose gel və əsasən müxtəlif biomolekulları ayırmaq üçün istifadə olunur.

Prinsip

Ölçüdən kənar xromatoqrafiya prinsipi əsasən biomolekulların təcrid olunmasına əsaslanır. molekulyar çəki və ya ölçüsü. Gel filtrasiya texnikası kimi müəyyən məsaməliliyə malik sferik gel muncuqlarından istifadə edir qablaşdırma materialı xromatoqrafiya sütununda.

Gel filtrasiya xromatoqrafiyasında maye qarışığın tərkibindəki komponentlər məsaməli gel muncuq sütunundan keçir, burada bəziləri daha əvvəl süzün və ya sonra elüsiya həddindən asılı olaraq sütun vasitəsilə. The elüsyon həddi sütundan çıxarılan molekulların saxlanması və ya xaric edilməsinə qərar verən amildir.

Elüsyon həddi ilə müqayisədə yüksək molekulyar çəkiyə malik olan molekullar erkən, aşağı molekulyar çəkiyə və ya elüsiya limitindən daha böyük ölçüyə malik olan molekullar isə daha sonra süzülür. Buna görə də, bu şəkildə, hissəciklər gel filtrasiya xromatoqrafiyasında ayrılır.

Prosedur

Gel filtrasiya xromatoqrafiyası prosesi aşağıdakı ardıcıl addımları əhatə edir:

  1. Əvvəlcə gel filtrasiya xromatoqrafiyası üçün sferik gel muncuq sütunu hazırlanır.
  2. Doldurulmuş çarpayı tamponla tarazlaşdırılır.
  3. Sonra sınaq məhlulu (mobil faza) sütundan keçir.
  4. Bundan sonra sınaq nümunəsindəki hissəciklər məsaməli gel matrisinə daxil olacaq və ya ondan kənara çıxacaq (stasionar faza).
  5. Kiçik molekulyar ölçülərə malik olan molekullar gelin məsamələrinə daxil olacaq, yəni kiçik molekullar daha uzun bir yol keçəcək və ya sütunda daha uzun müddət qalacaqlar.
  6. Böyük molekulyar ölçülərə malik olan molekullar gel muncuqunun məsamələrinə daxil ola bilmir və ya sütundan asanlıqla keçə bilmir.
  7. Beləliklə, hissəciklərin ayrılması, ayrılan komponentlərin təcrid edilməsi və identifikasiyası ilə müxtəlif intervallarda baş verir.

Fraksiya və duzsuzlaşdırma, ölçü istisna xromatoqrafiyasında komponentlərin ayrılmasını həyata keçirən üsullardır.

Duzsuzlaşdırma: Ağır molekullar, gelin xaricetmə limitini daha kiçik saxlamaqla, daha kiçik molekulların gelin məsamələrinə girə bilməsi üçün elüt edilir, böyük hissəciklər isə ayrılır.

Fraksiyalaşdırma: Bu üsulda, molekulyar ölçüsü jelin fraksiya diapazonunda olması lazım olan gel matrisinin içərisində olan hədəf molekullar təcrid olunur.

Nəticələr

Gel filtrasiya xromatoqrafiya bölməsindən ayrılan molekullar mikroməsaməli gelin ölçü paylanmasından asılıdır. qurmağa kömək edir kalibrləmə əyrisi bu da öz növbəsində məlum analitlərin molekulyar çəkisini müqayisə edərək nümunədəki naməlum analitin molekulyar çəkisini təyin edir.

Proqramlar

  1. Gel keçirmə xromatoqrafiyası üçün etibarlı bir üsuldur təmizlənmə biomolekullar, məsələn, fermentlər, polisaxaridlər, nuklein turşuları, zülallar və s.
  2. Gel filtrasiya qurğusu işə salına bilər renaturasiya denatürləşdirilmiş zülalların.
  3. -də istifadə olunur protein fraksiyaları təcrübələr.
  4. Gel filtrasiya xromatoqrafiyasından istifadə etməklə, ayrılmış hissəciklərin molekulyar çəkisi tədqiq edilə bilər.
  5. Təmizlənmiş zülalların dördüncü quruluşunu tədqiq edə bilən üsuldur.

Üstünlüklər

  • Gel filtrasiyası müxtəlif pH, temperatur, metal ionlarının konsentrasiyası və s. həssas olan biomolekulları ayıra bilər.
  • Hissəciklər ion dəyişdirici xromatoqrafiyada olduğu kimi xromatoqrafiya mühitinə yapışmır.
  • Nəticənin izahı a daxilində edilə bilər minimal vaxt.
  • Yaxşı müəyyən edilmiş bir ayrılıq verir.
  • Nəticələri yekunlaşdırmaq üçün az miqdarda test nümunəsi kifayətdir.
  • Axın sürəti təyin edilə bilər.

Məhdudiyyətlər

  • Test nümunəsi gel filtrasiya sütunundan keçməzdən əvvəl süzülməlidir tıxanma alətin içindəki hissəciklərin.
  • Alət olmalıdır tozsuz və nəticənin şərhinə mane ola biləcək digər hissəciklər.

Nəticə

Buna görə gel filtrasiya xromatoqrafiyası ondan asılı olan bir texnikadır molekulyar çəki biomolekulun, ölçü bölgüsü gel muncuq və elusiya həddi. Məsamələrə sürətlə yayıldığı üçün kiçik molekulların hərəkəti böyük molekullardan daha yavaş olur. Əksinə, daha böyük hissəciklər məsamələrə keçə bilmir, buna görə də daha sürətli hərəkət edir və xaric olur.


Agaroza muncuqları və yaxınlıq gelləri

Agaroza muncuqları və yaxınlıq gelləri, muncuqlu agaroza ilə çarpaz əlaqəli liqandlardan istifadə edərək birləşmə etiketli zülalların təmizlənməsinə imkan verir. Doğma, denaturasiya edən və ya bir qədər azaldıcı şəraitdə kiçik və ya iri miqyaslı təmizləmə üçün yaxşı olan bu qatranlar qravitasiya axını sütununun təmizlənməsi, partiyanın emalında aşağı sürətli sentrifuqalama və aşağı təzyiqli xromatoqrafiya prosedurları üçün uyğundur, çünki muncuqlar və gellər aşağı təzyiq üçün nəzərdə tutulmuşdur. təzyiqlər. EZview™ yaxınlıq gelləri, istifadəçiyə qranulları supernatantdan asanlıqla fərqləndirməyə imkan verən qırmızı boya ehtiva edir ki, bu da partiyanın təmizlənməsi zamanı daha az protein itkisi ilə nəticələnir. İmmunopresipitasiya dəstlərinə yaxınlıq gelləri, mini-spin sütunları və lizis reagenti daxildir və immunopresipitatlardan zülalların maksimum bərpasını təmin etmək üçün xüsusi olaraq hazırlanmışdır.


İon Mübadilə Xromatoqrafiyası Mülahizələri

Yükləmə, yuyulma və elüsyon tamponlarının tərkibi ion mübadiləsi xromatoqrafiyası üçün vacib amildir. Tamponda yanlış əks-ion olduqda, o, maraq doğuran zülalın sütun qatranına bağlanmasının qarşısını ala bilər. Beləliklə, ion mübadiləsi xromatoqrafiyası üçün istifadə olunan tamponlardakı yüklü növlər ümumiyyətlə IEX qatranının yüklənmiş növləri ilə eyni işarəyə malik olmalıdır. Məsələn, fosfat tamponları adətən zülalların təmizlənməsi üçün istifadə olunsa da, onlar anion mübadiləsi xromatoqrafiyası üçün uyğun deyildir, çünki fosfat ionu müsbət yüklü anion dəyişdirici qatranlarla güclü qarşılıqlı təsir göstərir.

Ümumi tamponlar anion və kation mübadiləsi xromatoqrafiyası üçün:

İon dəyişdiricisinin növü Bufer Tamponlama Aralığı
Kation Sirkə turşusu 4.8&ndash5.2
Limon turşusu 4.2&ndash5.2
HEPES 6.8&ndash8.2
Laktik turşu 3.6&ndash4.3
FHN 5.5&ndash6.7
MOPS 6.5&ndash7.9
fosfat 6.7&ndash7.6
BORULAR 6.1&ndash7.5
TES 7.2&ndash7.8
Tricine 7.8&ndash8.9
Anion Bicine 7.6&ndash9.0
Bis-Tris 5.8&ndash7.2
Dietanolamin 8.4&ndash8.8
Dietilamin 9.5&ndash11.5
L-histidin 5.5&ndash6.0
İmidazol 6.6&ndash7.1
Piridin 4.9&ndash5.6
Tricine 7.4&ndash8.8
Trietanolamin 7.3&ndash8.3
Tris 7.5&ndash8.0

İon mübadiləsi xromatoqrafiyasının müsbət və mənfi cəhətləri

İon mübadiləsi xromatoqrafiyası yalnız preparativ xromatoqrafiya üçün deyil, həm də analitik xromatoqrafiya üçün istifadə olunan çox güclü bir ayırma üsuludur. Bununla belə, bütün digər xromatoqrafiya rejimləri kimi, IEX-in də bəzi məhdudiyyətləri var.

İon mübadilə xromatoqrafiyasının əsas çatışmazlıqlarından biri onun bufer tələbidir: IEX qatranlarına bağlanma maraq doğuran zülallar və stasionar faza arasında elektrostatik qarşılıqlı təsirlərdən asılı olduğundan, IEX sütunları az duzlu tamponlara yüklənməlidir. Bəzi tətbiqlər üçün bu məhdudiyyət ion mübadiləsi xromatoqrafiyasından əvvəl bufer mübadiləsi addımını tələb edə bilər.

Əksinə, nümunələrin aşağı ion gücü olan tamponlara yüklənməsi tələbi ion mübadiləsi xromatoqrafiyasını əla ikinci təmizlənmə mərhələsinə çevirir. hidrofobik qarşılıqlı xromatoqrafiya (HIC).

İon mübadiləsi xromatoqrafiyası, bəzi digər xromatoqrafiya üsullarından fərqli olaraq, bəzi hallarda aktiv zülalın bərpası üçün həlledici rol oynaya bilən yüksək axın sürətlərinə də imkan verir. Nəhayət, zəif ion dəyişdiricilərinin bir məhdudiyyəti onların pH-dan asılılığıdır. Optimal pH diapazonundan kənarda işləyərkən, bu qatranlar qabiliyyətini və daha da əhəmiyyətlisi, həllini sürətlə itirirlər.

IEX Pros IEX Cons
Yüksək axın sürətinə imkan verir Nümunə aşağı ion gücü ilə yüklənməlidir
Nümunələri konsentratlaşdırır Müsbət yüklü qalıqların çoxluğu xalis mənfi yüklü zülalın kation dəyişdiricisini bağlamasına səbəb ola bilər və əksinə
Yüksək produktivlik PH-da kiçik dəyişikliklər IEX qatranının bağlanma profilini əhəmiyyətli dərəcədə dəyişə bilər
Tamponlar denaturasiya olunmur Parçacıq ölçüsü həllediciliyə çox təsir edir

Bio-Rad ion mübadiləsi xromatoqrafiya qatranları

Bio-Rad geniş çeşiddə anion və kation dəyişdirici qatranları qablaşdırılmış sütun şəklində və ya toplu qatran şəklində daşıyır. Bəzi qatranlar analitik xromatoqrafiya üçün daha uyğundur, digərləri isə hazırlıq və/və ya proses xromatoqrafiyası üçün daha uyğundur. Nəzərdə tutulan tətbiqiniz üçün ən yaxşı medianı seçmək üçün Bio-Rad anion və kation mübadiləsi mühitinin daha ətraflı təsviri üçün aşağıdakı səhifələrə daxil olun:


Zülalların təmizlənməsi üsullarının müqayisəsi və onların üstünlükləri və mənfi cəhətləri

Zülalların ayrılması və təmizlənməsi daha mürəkkəbdir. Hüceyrələrdən çıxarılan zülallar və ya çökmə, gradient sentrifuqalama və tərkibində zülal olan məhlulların duzlanması ilə əldə edilən zülallar çox vaxt çirkləri ehtiva edir. Bu çirkləri aradan qaldırmaq üçün zülalın bioloji xassələrini saxlamaq lazımdır. Elmi fəaliyyətlər, məsələn, fermentlərin katalitik fəaliyyəti üçün, müvafiq strategiyaları formalaşdırmaq və müxtəlif zülallara uyğun olaraq müxtəlif üsulları qəbul etmək lazımdır. Elektroforez və xromatoqrafiya daha çox istifadə edilən üsullardır, xüsusən də xromatoqrafiya. Protein müalicəsi nisbətən yumşaqdır və çoxlu sayda bioloji aktiv təmizlənmiş zülallar hazırlana bilər, buna görə də hazırda ən çox istifadə olunan texniki üsuldur.

Protein səthində hidrofilik amin turşuları olduğu üçün suda həll olunur. Əgər məhlulun ion gücü zülalın izoelektrik nöqtəsində xüsusilə yüksək və ya aşağı olarsa, zülal məhluldan çökməyə meyllidir. Ammonium sulfat zülalın çökməsi üçün ən çox istifadə edilən duzdur, çünki soyuq tamponda yaxşı həll olur və soyuq tampon hədəf zülalın fəaliyyətini saxlamaq üçün faydalıdır. Ammonium sulfat fraksiyasından tez-tez laboratoriya zülallarının təmizlənməsində ilk addım kimi istifadə olunur. Zülalları kobud şəkildə çıxara və zülal olmayan komponentləri çıxara bilər. Zülallar ammonium sulfat çöküntülərində daha sabitdir və ara məhsullar bu vəziyyətdə qısa müddət ərzində saxlanıla bilər. Hal-hazırda, zülalların təmizlənməsi əsasən xam ayırma üçün bu üsuldan istifadə edir. Böyük miqyaslı istehsalda ammonium sulfat çökdürmə üsulunda hələ də bəzi problemlər var. Ammonium sulfat paslanmayan poladdan hazırlanmış cihazlar üçün çox aşındırıcıdır. Natrium sulfat kimi digər duzlarda bu problem yoxdur, lakin onun təmizləyici təsiri ammonium sulfat qədər yaxşı deyil. Zülallar duzlamaqdan əlavə, PEG kimi polimerlərdən istifadə edə bilərmi? Antifrizlə çökdürülmüş PEG inert maddədir, ammonium sulfat kimi zülala eyni stabilləşdirici təsir göstərir və yavaş qarışdırmaqla soyuq zülal məhlulunda PEG-in konsentrasiyasını tədricən artırır. Zülalın çökməsi sentrifuqa və ya filtrasiya yolu ilə əldə edilə bilər. Bu vəziyyətdə, zədələnmədən uzunmüddətli saxlama. Protein çökdürməsi zülalın təmizlənməsi üçün çox yaxşı bir üsul deyil, çünki o, yalnız bir neçə dəfə təmizlənmə effektinə nail ola bilər və məqsədə çatmazdan əvvəl minlərlə dəfə təmizlənməyə ehtiyacımız var. Üstünlük ondan ibarətdir ki, zülal mədəniyyət mühitindən və hüceyrə lizatından proteaz və digər zərərli çirklərlə qarışdırıla bilər.

Tamponun dəyişdirilməsi zülalın saflığını yaxşılaşdırmasa da, zülalın təmizlənməsi protokollarında son dərəcə mühüm rol oynayır. Müxtəlif zülalların təmizlənməsi üsulları fərqli pH və fərqli ion gücü tamponları tələb edir. Proteini çökdürmək üçün ammonium sulfatdan istifadə etsəniz, zülalın yüksək duzlu mühitdə olduğuna şübhə yoxdur və duzsuzlaşdırmanın bir yolunu tapmaq lazımdır. Mövcud üsullara yarımkeçirici membran dializindən istifadə və dializ mayesinin tez-tez dəyişdirilməsi ilə duzun çıxarılması daxildir. Bu üsul məqbuldur. Ancaq bir neçə saat çəkir, adətən bir gecədə və geniş miqyaslı təmizlənmədə istifadə etmək çətindir. Yeni tipli avadanlıq dializ membranını iki boşqab arasında sandviç edir. Lövhənin bir tərəfinə tampon məhlulu, digər tərəfinə isə duzsuzlaşdırılacaq zülal məhlulu əlavə edilir və zülal məhlulu nasosla təzyiqə məruz qalır. Daxili balans əldə edilir.Zülal məhlulu üzərində təzyiq artırsa, zülal konsentrasiyası məqsədinə nail olmaq üçün dializ membranı vasitəsilə dializata daha çox su və duz daxil edilə bilər. Satışda duzsuzlaşdıran kolonlar da var. Sütundakı qablaşdırma kiçik məsamə ölçüsü olan hissəciklərdir. Protein molekulları məsamələrə daxil ola bilməz və duz ionları yüksək konsentrasiyadan əvvəl sütundan axır, beləliklə ikisi ayrılır. Zülalın təmizlənməsinin hər bir addımı hədəf zülalın, xüsusən də tampon tarazlığının itirilməsinə səbəb olacaqdır. Zülal təmasda olduğu istənilən səthə bağlanacaq və kəsmə qüvvələri, köpüklənmə və ion gücündə sürətli dəyişikliklər zülalı asanlıqla təsirsiz hala gətirə bilər.

3. İon mübadiləsi xromatoqrafiyası

Bu, bütün zülalların təmizlənməsi və konsentrasiyası üsulları arasında ən təsirli üsuldur. Zülal və ion dəyişdirici qatran arasında qarşılıqlı yük qarşılıqlı təsirinə əsaslanaraq, müxtəlif tamponları seçməklə eyni zülal ya anion mübadilə qatranı (mənfi yüklü molekulları bağlaya bilər) və ya kation mübadilə qatranı ilə birləşdirilə bilər. Qatranda dörd növ yüklü qruplar istifadə olunur: zəif anion dəyişdirici qatran üçün dietilaminoetil, zəif kation mübadilə qatranı üçün karboksimetil, güclü anion mübadilə qatranı metilsulfonat Yu güclü kation dəyişdirici qatran üçün dördüncü ammonium. Zülallar müxtəlif pH mühitlərində fərqli ümumi yüklərə malik olan amin turşularından ibarətdir. Əksər zülallar fizioloji pH-da (pH 6-dan 8) mənfi yüklənir və anion mübadiləsi sütunu ilə təmizlənməlidir. Həddindən artıq pH-da zülal denatürasiya ediləcək və inaktivləşəcəkdir. Bundan mümkün qədər çəkinmək lazımdır. Müəyyən bir pH-da fərqli zülalların müxtəlif yük nömrələrinə görə, qatranla bağlama qüvvəsi də fərqlidir. Tamponda duz konsentrasiyası artdıqca və ya pH dəyişdikcə, zülal bağlanma qüvvəsinin gücünə uyğun olaraq sıralanır. Sənaye istehsalında duz konsentrasiyasını dəyişdirmək pH dəyərini dəyişdirməkdən daha çox olur, çünki birinciyə nəzarət etmək daha asandır. Laboratoriyada ion mübadiləsi sütunu demək olar ki, həmişə duz konsentrasiyası qradiyenti ilə yuyulur. Nasosun köməyi ilə sütuna axan tamponda duz konsentrasiyası davamlı olaraq artırıla bilər. İon gücü zülalın yükünü neytrallaşdıra bildikdə, zülal tutulur. Sütundan elute edin. Bununla belə, sənaye istehsalında duz konsentrasiyasına dəqiq nəzarət etmək çətindir, ona görə də davamlı artan duz gradienti üçün mərhələli elüsyon çox vaxt kifayət etmir. İstisna xromatoqrafiyası ilə müqayisədə ion mübadiləsi daha yaxşı spesifikliyə malikdir, ən yaxşı təmizləmə effektini əldə etmək üçün daha çox parametr tənzimlənə bilər və qatran daha ucuzdur. Qeyd etmək lazımdır ki, ən dəqiq idarə olunan şərtlərlə belə, tək bir ion mübadiləsi üsulu ilə təmiz zülal əldə edilə bilməz və digər təmizləmə mərhələləri tələb olunur.

4. Yaxınlıq xromatoqrafiyası

Yaxınlıq xromatoqrafiyası hədəf zülalın bərk fazalı liqandla xüsusi bağlanmasına əsaslanır və digər çirklənmiş zülallar sütundan axacaq. Bu metodun problemi ondan ibarətdir ki, monoklonal antikor çox bahalıdır və əvvəlcə təmizlənməlidir ki, monoklonal antikorun hədəf zülala bağlanma qabiliyyəti çox güclüdür. O, hədəf zülalını təsirsiz hala gətirəcək və monoklonal antikor qarışığını məhv edəcək ağır şəraitdə yuyulmalıdır. Proteazlar kimi digər zülallar da antikorları məhv edə və ya onları qeyri-spesifik bağlaya bilər. məhsula daxil edilir ki, bu da son məhsuldan çıxarılmalıdır. Yaxınlıq sütunları adətən təmizlənmə prosesində, nümunənin həcmi azaldıqda və çirklərin çoxu çıxarıldıqda istifadə olunur. Glutathione S-transferase (Glutathione S-transferase, GST) ən çox istifadə edilən yaxınlıq xromatoqrafiyasının təmizlənməsi etiketlərindən biridir. Bu etiketə malik rekombinant zülallar çarpaz bağlı glutatyon xromatoqrafiya mühiti ilə təmizlənə bilər, lakin bu metodun aşağıdakı çatışmazlıqları var: birincisi, zülaldakı GST bu üsulla təmizlənmək üçün glutatyonla birləşən məkan strukturu yaratmaq üçün düzgün şəkildə qatlanmalıdır. ikincisi, GST etiketində 220-ə qədər amin turşusu var, belə böyük bir etiket ola bilər. Bu, ifadə olunan zülalın həllinə təsir göstərir və zülalın təbii strukturunu məhv edəcək və strukturun təhlilini çətinləşdirəcək daxiletmə orqanları əmələ gətirir. Bəzən hətta təmizləndikdən sonra GST etiketi həzm yolu ilə çıxarılmaya bilər. Digər tətbiq olunan yaxınlıq təmizləmə etiketi 6-histidin etiketidir. Histidinin imidazol yan zənciri neytral və zəif qələvi şəraitdə histidinlə nikel, sink və kobalt kimi metal ionlarını yaxınlıqda bağlaya bilir. Etiketin hədəf zülalı nikel sütunu ilə birləşdirilir və aşağı pH-da imidazol ilə yuyulur. GST ilə müqayisədə histidin etiketləri bir çox üstünlüklərə malikdir. Birincisi, yalnız 6 amin turşusu olduğundan, molekulyar çəki çox kiçikdir və ümumiyyətlə fermentlərin həzm edilməsi ilə xaric edilməlidir. İkincisi, zülal denatürasiya şəraitində təmizlənə bilər və hələ də yüksək konsentrasiyalarda karbamid və guanidin istifadə edilə bilər. Bağlayıcı qüvvəni qoruyun, digər 6 histidin etiketi immunogen deyildir və rekombinant zülal immunoloji analizə təsir etmədən heyvanlara inyeksiya üçün birbaşa istifadə edilə bilər. Bir çox üstünlüklərə baxmayaraq, bu etiketin hələ də çatışmazlıqları var, məsələn, hədəf zülalın daxilolma orqanlarının əmələ gəlməsi asan, həll edilməsi çətin, sabitlik zəifdir və yanlış qatlanır. Nikel sütununun təmizlənməsi zamanı metal nikel ionları asanlıqla düşür və protein məhluluna sızır. Oksidləşmə nəticəsində hədəf zülalın amin turşusu yan zənciri təkcə məhv edilməyəcək, həm də sütun xüsusi olaraq proteini adsorbsiya edəcək və təmizlənmə effektinə təsir edəcəkdir. Hədəf zülal xüsusi olaraq müəyyən bir karbohidratla bağlana bilirsə və ya xüsusi bir kofaktora ehtiyac duyursa, karbohidrat və ya kofaktor yaxınlıq sütunu yaratmaq üçün bərk fazalı ola bilər. Bağlandıqdan sonra hədəf zülal yüksək konsentrasiyalı karbohidrat və ya kofaktor Faktor elüsyonu ilə istifadə edilə bilər.

Xromatoqrafik zülallar hidrofobik və hidrofilik amin turşularından ibarətdir. Hidrofobik amin turşuları zülalın məkan quruluşunun mərkəzində, səthdəki su molekullarından uzaqda yerləşir. Hidrofilik amin turşusu qalıqları zülalın səthində yerləşir. Hidrofilik amin turşuları bir çox su molekulunu cəlb etdiyindən, bütün zülal molekulu adətən su molekulları ilə əhatə olunur və hidrofobik amin turşuları məruz qalmır. Yüksək duz konsentrasiyası mühitində zülalın hidrofobik bölgəsi məruz qalacaq və hidrofobik mühitin səthindəki hidrofobik liqandla bağlanacaq. Fərqli zülallar fərqli hidrofobikliyə malikdir və hidrofobik qüvvənin böyüklüyü fərqlidir. Sütunun yuyulması üçün tamponda duz konsentrasiyasını tədricən azaltmaqla, duz konsentrasiyası çox aşağı olduqda, zülal öz təbii vəziyyətinə qayıdır və zəifləmiş hidrofobik qüvvə elüt edilir.

Hidrofob qatranın seçiciliyi hidrofobik liqandın quruluşu ilə müəyyən edilir. Ən çox istifadə olunan xətti liqandlar alkil liqandlar və arilliqandlardır. Zəncir nə qədər uzun olsa, zülalları bağlamaq qabiliyyəti bir o qədər güclüdür. İdeal qatran növünün seçimi hədəf zülalın kimyəvi xüsusiyyətlərinə əsaslanmalıdır. Çox güclü bağlama qüvvəsi olan qatranı seçmək mümkün deyil və çox güclü bağlama qüvvəsi olan qatranı təmizləmək çətin olacaq, buna görə də şərtləri araşdırmaq üçün başlanğıcda orta bağlama qüvvəsinə malik fenil qatranı seçilməlidir. Doğru mühiti seçməyi asanlaşdırmaq üçün Amersham Biosciences, müqayisə üçün 5 müxtəlif qatranı özündə birləşdirən hidrofobik qarşılıqlı rezin seçim dəstini işə saldı. Hidrofobik xromatoqrafiya ion mübadiləsinin təmizlənməsinin növbəti mərhələsi kimi çox münasibdir, çünki hidrofobik qarşılıqlı xromatoqrafiya yüksək duz konsentrasiyası ilə yüklənir və ion mübadiləsindən alınan məhsul tampon dəyişdirilmədən istifadə edilə bilər. Zülal az duzlu buferdə yuyulur və növbəti təmizlənmədən əvvəl tamponun dəyişdirilməsi mərhələsi buraxılır ki, bu da nəinki vaxta qənaət edir, həm də zülal itkisini azaldır.

6. İstisna xromatoqrafiyası

Gel filtrasiyası və ya molekulyar ələk də adlanır. İstisna xromatoqrafiya sütununun qablaşdırılmış hissəcikləri məsaməli mühitdir. Hissəcikləri əhatə edən sütunda ola bilən mayenin miqdarı mobil faza adlanır və bu da etibarsız həcm kimi tanınır. Həddindən artıq böyük olan zülallar hissəciklərin məsamələrinə daxil ola bilməz və yalnız səmərəsiz bir məhlul həcmində mövcud ola bilər, bu, ən erkən sütundan ayrılacaq və zülalın bu hissəsinə heç bir təmizləyici təsir göstərməyəcəkdir. Müxtəlif zülalların müxtəlif molekulyar ölçüləri səbəbindən müəyyən ölçülü məsamələrə yayılma qabiliyyəti də fərqlidir. Böyük zülal molekulları əvvəlcə süzüləcək. Molekul nə qədər kiçik olsa, bir o qədər gec süzüləcəkdir. Ən yaxşı təmizləmə effektini əldə etmək üçün məsamə ölçüsü elə seçilməlidir ki, hədəf zülal boşluq həcminin və ümumi sütun həcminin orta nöqtəsinə yaxın süzülə bilsin. İstisna xromatoqrafiyası digər üsulların malik olmadığı üstünlüklərə malikdir. Birincisi, təmizlənə bilən zülalın molekulyar çəkisi genişdir. Tosoh Biosep’s polimer qatranı 200.000 kD-lik istisna limitinə malikdir. İkincisi, qatran məsamələrinin forması sferik zülalların ayrılması üçün əlverişlidir. Həmçinin, təmizlənmə prosesində zülalın denatürasiyasına səbəb ola biləcək heç bir üzvi həlledicilərə ehtiyac yoxdur. Qeyd etmək lazımdır ki, bəzi zülallar gel filtrasiyası ilə təmizlənmə üçün uyğun deyil, çünki bu texnologiyada istifadə olunan qatran bir qədər hidrofilikdir və daha yüksək yük sıxlığı olan zülallar ona asanlıqla adsorbsiya olunur. İstisna xromatoqrafiyası təmizlənmə prosesinin ilkin mərhələsində heç vaxt istifadə edilmir, çünki bu üsul yüksək konsentrasiyalı nümunələr tələb edir və nümunə yükü sütunun həcminin yalnız 1%-4%-i arasında ola bilər. Yaxşı ayırma nəticələri əldə etmək üçün sütun nazik və uzun olmalıdır. Qatran özü nisbətən bahadır və o, iri sənaye istehsalı üçün uyğun deyil.

7. Elektroforez Akrilamid gel elektroforezi adətən zülal qarışığı nümunələrinin mürəkkəbliyinə baxmaq və təmizlənmənin effektivliyinə nəzarət etmək üçün istifadə olunur. Bu metodun ayırma effekti əladır, lakin təəssüf ki, dəqiqliyi itirmədən hazırlıq miqyasına çatmaq çətindir, çünki gelin qalınlığı artdıqca elektroforez zamanı istilik effekti zülalın üzməsinə ciddi şəkildə mane ola bilər. Əsas tədqiqatlarda bəzən zülalların ardıcıllığı və s. kimi tədqiqatlar üçün yalnız az miqdarda təmiz zülal tələb olunur. Bu zaman elektroforetik təmizləmə sadə və sürətli bir üsuldur. Akrilamid gel elektroforezi də zülalların təmizlənməsi prosesində mühüm analiz vasitəsidir. Bu, son illərdə müxtəlif fənlərin sürətli inkişafı ilə zülalların təmizlənməsi texnologiyasını təyin etmək üçün istifadə edilə bilən hədəf zülalın ion mübadiləsi sütunu duz elüentinin gradientini aşkar edə bilər. Tələbat artır, mövcud təmizləmə üsulları gündən-günə təkmilləşdirilir və bir-birinin ardınca yeni təmizləmə üsulları da meydana çıxır. Hidroksiapatit kalsium fosfat kristalıdır. Qeyri-sabit fiziki və kimyəvi xassələrinə və zəif bağlanma qabiliyyətinə görə xromatoqrafiya üçün istifadə etmək çətindir. Bu yaxınlarda, Bio-Rad müsbət yüklü kalsium ionları və mənfi yüklü fosfat ionları ilə sferik, məsaməli və sabit keramika hidroksiapatit hissəcikləri yaratmaq üçün kalsium və fosforun nisbətini artırmaq üçün onu təkmilləşdirdi. Zülalın karboksil və amin qrupları ilə birləşdirilə bilər. Tamponun pH dəyərini tənzimləməklə, turşu və əsas amin turşuları bu qatranla seçici şəkildə birləşdirilə bilər və zülalın süzülməsi və ayrılması üçün tamponun duz konsentrasiyası dəyişdirilə bilər. Məlumatlar göstərir ki, bu üsuldan istifadə etməklə eyni izoelektrik nöqtəyə, molekulyar çəkiyə və hidrofobikliyə malik iki zülal əldə etmək olar.


İon mübadiləsi xromatoqrafiyası iş prosesi

Natəmiz zülal nümunəsini ion dəyişdirici xromatoqrafiya sütununa yüklədikdən sonra, sütun arzuolunmaz zülalları və digər çirkləri təmizləmək üçün yuyulur və sonra maraq doğuran zülal(lar) ya da duz gradienti və ya a pH-da dəyişiklik.

Şəkil 3. Duz qradiyenti elüsyonu. zülalların elüsyonu ( mavi iz ) artan duz gradienti ilə ( qırmızı iz ).

Yüklənmiş duz ionları yüklənmiş qatran funksional qrupları üçün bağlı zülallarla rəqabət aparır. Az yüklü qrupları olan zülallar aşağı duz konsentrasiyalarında, çox yüklü qrupları olan zülallar isə daha çox saxlama müddətləri və yüksək duz konsentrasiyalarında süzülür.

Daha az rast gəlinsə də, a pH gradienti elüsyon üçün də istifadə edilə bilər. Burada maraq zülalına və rsquos pI-ə yaxınlaşan pH qradiyenti seçilir. Zülallar pH qradiyenti öz pI-yə çatdıqda süzüləcək, çünki onlar artıq sütun qatranı ilə qarşılıqlı əlaqədə olmağa imkan verən xalis yük daşımayacaqlar.

Zülalları anion dəyişdirici qatrandan ayırmaq üçün azalan pH qradiyenti seçilir, kation dəyişdiricilərdən elüsiya üçün isə artan pH gradienti seçilir.

Şəkil 4. Artan pH qradiyenti (qırmızı iz) ilə zülalın elüsyonu (mavi iz).

Təkrarlana bilən və dəqiq xətti pH qradiyenti yaratmaq çox çətin olduğundan, elüsyon üçün pH istifadə edildikdə adətən pilləli qradiyent seçilir.

Nəhayət, pH duz gradientindən istifadə edərkən elüsyonu təmizləmək üçün istifadə edilə bilər. Elüsyon tamponunun pH-nın dəyişdirilməsi metodun həllinə təsir göstərə bilər:

Şəkil 5. pH metodun həllini dəyişə bilər. Duz qradiyenti ilə elüsyon zamanı pH-ın 6,5-dən 8,5-ə dəyişdirilməsinin elüsyon profilini necə dəyişdirdiyini göstərən üç üst-üstə qoyulmuş xromatoqramma.

Qeyd: Bəzi zülallar öz pI-lərinə bərabər pH-da məhluldan düşürlər. Bu zülallar üçün pH gradienti ilə elüsyon mümkün olmaya bilər.


İon mübadiləsi xromatoqrafiyası iş prosesi

Natəmiz zülal nümunəsini ion dəyişdirici xromatoqrafiya sütununa yüklədikdən sonra, sütun arzuolunmaz zülalları və digər çirkləri təmizləmək üçün yuyulur və sonra maraq doğuran zülal(lar) ya da duz gradienti və ya a pH-da dəyişiklik.

Şəkil 3. Duz qradiyenti elüsyonu. zülalların elüsyonu ( mavi iz ) artan duz gradienti ilə ( qırmızı iz ).

Yüklənmiş duz ionları yüklənmiş qatran funksional qrupları üçün bağlı zülallarla rəqabət aparır. Az yüklü qrupları olan zülallar aşağı duz konsentrasiyalarında, çox yüklü qrupları olan zülallar isə daha çox saxlama müddətləri və yüksək duz konsentrasiyalarında süzülür.

Daha az rast gəlinsə də, a pH gradienti elüsyon üçün də istifadə edilə bilər. Burada maraq zülalına və rsquos pI-ə yaxınlaşan pH qradiyenti seçilir. Zülallar pH qradiyenti öz pI-ə çatdıqda süzüləcək, çünki onlar artıq sütun qatranı ilə qarşılıqlı əlaqədə olmağa imkan verən xalis yük daşımayacaqlar.

Zülalları anion dəyişdirici qatrandan ayırmaq üçün azalan pH qradiyenti seçilir, kation dəyişdiricilərdən elüsiya üçün isə artan pH gradienti seçilir.

Şəkil 4. Artan pH qradiyenti (qırmızı iz) ilə zülalın elüsyonu (mavi iz).

Təkrarlana bilən və dəqiq xətti pH qradiyenti yaratmaq çox çətin olduğundan, elüsyon üçün pH istifadə edildikdə adətən pilləli qradiyent seçilir.

Nəhayət, pH duz gradientindən istifadə edərkən elüsyonu təmizləmək üçün istifadə edilə bilər. Elüsyon tamponunun pH-nın dəyişdirilməsi metodun həllinə təsir göstərə bilər:

Şəkil 5. pH metodun həllini dəyişə bilər. Duz qradiyenti ilə elüsyon zamanı pH-ın 6,5-dən 8,5-ə dəyişdirilməsinin elüsyon profilini necə dəyişdirdiyini göstərən üç üst-üstə qoyulmuş xromatoqramma.

Qeyd: Bəzi zülallar öz pI-lərinə bərabər pH-da məhluldan düşürlər. Bu zülallar üçün pH gradienti ilə elüsyon mümkün olmaya bilər.


Western Blotting

Antikorlar zülal ifadə səviyyələrini təyin etmək və təmizlənmə zamanı zülalları yoxlamaq üçün faydalı olan Western blotting adlı metodda istifadə edilə bilər. Bu üsul adətən aşağıdakı addımları əhatə edir:

  1. Bir protein nümunəsi poliakrilamid gel elektroforezinə məruz qalır.
  2. Bundan sonra gel nitroselüloz vərəqinin üzərinə qoyulur və geldəki zülal elektroforetik yolla nitroselüloza ötürülür.
  3. Sonra nitroselüloz zülalları qeyri-spesifik bağlamaq qabiliyyətini "blok" etmək üçün jelatində isladılır.
  4. Nitroselüloz daha sonra maraq doğuran zülal üçün xüsusi antikorla inkubasiya edilir.
  5. Nitroselüloz daha sonra birinci antikor üçün spesifik olan ikinci antikorla inkubasiya edilir. Məsələn, əgər birinci antikor dovşanlarda yetişdirilibsə, ikinci antikor "keçi anti-dovşan immunoqlobulini" adlandırıla bilər. Bu o deməkdir ki, dovşan immunoqlobulinləri keçilərdə antikor reaksiyası yaratmaq üçün istifadə edilmişdir. Keçi antikorlarına (poliklonal) dovşan anticisimlərində qorunan bölgəni tanıyanlar daxildir. Fc bölgəsi qorunduğundan, nitroselüloz kağızı da daxil olmaqla, hər hansı və bütün dovşan antikorlarına bağlanacaq.
  6. İkinci antikor, adətən, xromogen substratla təmin edildikdə, rəng reaksiyasına səbəb olan kovalent şəkildə bağlanmış bir fermentə sahib olacaqdır.
  7. Beləliklə, istənilən proteinin molekulyar çəkisi və miqdarı digər zülalların mürəkkəb qarışığından (məsələn, xam hüceyrə ekstraktı) xarakterizə edilə bilər.

Yuxarıda göstərilənlərin bir variantında, zülal nümunəsi birbaşa nitroselüloz kağızı üzərində ləkələnə bilər. nöqtə ləkəsi ) əvvəlcə gel sürmədən. Əgər, məsələn, antikor monoklonaldırsa və yerli strukturdan asılı olan epitopu tanıyırsa, bu arzuolunan ola bilər (bu, SDS SƏHİFƏSİ işlədildikdə məhv ediləcək).

Müxtəlif istifadələrinə əlavə olaraq, antikorlar zülalları təmizləmək üçün də istifadə edilə bilər.

  • Nisbətən böyük miqdarda antikor əldə olunarsa, onlar xromatoqrafiya qatranına (məsələn, sephadeks muncuqları) kovalent şəkildə yapışdırıla bilər.
  • Xam hüceyrə ekstraktı belə bir sütunun üzərindən keçərsə, yalnız maraq doğuran zülal bağlanmalıdır və qalan hər şey axacaq.
  • Bağlanmış zülal sonra elüt edilə bilər. Buna adətən orta dərəcədə aşağı pH şəraiti (sirkə turşusu istifadə etməklə) nail olunur. Maraqlanan zülal bu cür şərtlərlə geri dönməz şəkildə denatürasiya edilmədiyi müddətcə, üsul kifayət qədər yaxşı işləyəcəkdir.
  • Potensial tələlərdən biri mutant zülalları təmizləmək üçün istifadə edilən monoklonal antikorların olmasıdır. Epitopu təşkil edən zülalın bölgələri, antikorun bağlanma qabiliyyətini məhv etmədən dəyişdirilə bilməz.Beləliklə, monoklonal antikorların təmizlənmə sxemində istifadəsi onun müəyyən mutantların təmizlənməsində istifadəsini istisna edə bilər.

Zülalların təmizlənməsi bir sıra kimi düşünülə bilər fraksiya mərhələləri nəzərdə tutulmuşdur ki:

  • Maraqlanan zülal demək olar ki, yalnız bir fraksiyada olur (və yaxşı məhsuldarlıqla)
  • Çirkləndiricilərin əhəmiyyətli bir miqdarı fərqli bir fraksiyada tapıla bilər

Təmizləmə zamanı bir neçə parametrə nəzarət etməlisiniz, o cümlədən:

  1. Ümumi nümunə həcmi
  2. Ümumi zülal nümunəsi (A. tərəfindən qiymətləndirilə bilər280 1.4

Bu əsas məlumat təmizlənmənin hər bir addımı zamanı aşağıdakı məlumatları izləməyə imkan verəcək:

  1. % gəlir hər təmizləmə addımı üçün
  2. Xüsusi fəaliyyət İstədiyiniz zülalın (vahid/mq ümumi protein)
  3. Təmizləmə gücləndirilməsi hər addımın (məsələn, "3,5x təmizləmə)

Təmizləmə sxemini tərtib edərkən, adətən balanslaşdırmalısınız təmizlənmə ilə məhsuldarlıq .

  • Məsələn, yaxşı məhsuldarlıqla 90% təmiz material əldə etmək nisbətən sadə ola bilər.
  • Bununla belə, bu təmizliyi yaxşı məhsuldarlıqla əlavə bir neçə faiz artırmaq çətin ola bilər.
  • Təmizlənmiş zülalın planlaşdırılmış tətbiqi hədəf təmizliyi müəyyən edir .
  • Zülal amin turşusu ardıcıllığı məlumatını təyin etmək üçün istifadə ediləcəksə, bəlkə də 90% məqbuldur. Bununla belə, əgər material klinik sınaqlarda istifadə olunacaqsa, 99,99+% hədəf təmizlik ola bilər.

Təmizləmədə ilkin addımlar

Şəkil 4.1.1:Təmizləmə addımları

  • Təmizləməyə çalışdığınız zülalın yalnız ümumi fiziki və kimyəvi xüsusiyyətləri haqqında deyil, həm də bəzi məlumatların olması son dərəcə faydalıdır. çirkləndirici komponentlər.
  • Məsələn, çoxlu E. coli zülallar ümumiyyətlə aşağı molekulyar çəki (<50,000 Da) və bir qədər turşulu izoelektrik nöqtədə

Adətən təmizlənmənin ilkin addımları həll olunan zülallar və digər hüceyrə komponentləri arasında ümumi fiziki və/və ya kimyəvi fərqlərdən istifadə edir.

  • Məsələn, həll olunan zülallar ümumi hüceyrə zibilindən və bütöv hüceyrələrdən ayrıla bilər sentrifuqalama.
  • Beləliklə, hüceyrə tərkibinin sərbəst buraxılmasına imkan vermək üçün hüceyrələr fiziki olaraq pozulur (homogenləşdirmə və ya hüceyrə presi ilə). Bundan sonra ümumiyyətlə həll olunan komponentləri həll olunmayanlardan ayırmaq üçün sentrifuqalama aparılır.
  • Məhz bu anda təmizlənməni izləmək üçün məlumatların toplanması başlayır.

kimi böyük katyonik birləşmələrin əlavə edilməsi ilə bəzən nuklein turşuları nümunədən asanlıqla çıxarıla bilər polietilen imin , və ya streptomisin sulfat .

  • Nuklein turşuları bu birləşmələrə elektrostatik qarşılıqlı təsirlər və kompleks vasitəsilə bağlanır çökür və sentrifuqa yolu ilə çıxarıla bilər.
  • Eyni ümumi nəticə ion dəyişdirici qatranları qarışdırmaqla əldə edilə bilər anion dəyişdiriciləri (yəni, qatranlar kationik qrupları ehtiva edir) və sonra süzgəcdən keçirin və ya sentrifuqalayın. Hər iki üsulda olduğu kimi, istədiyiniz zülalın olması təsdiqlənməlidir yox həm də bağlıdır.

Zülalların xam fraksiyalarına müxtəlif miqdarda çöküntülərin əlavə edilməsi ilə nail olmaq olar, məsələn ammonium sulfat , və ya polietilen qlikol (PEG).

  • Bu tip təmizləmə mərhələsi üçün çöküntü konsentrasiyası funksiyası olaraq məhlulda (və qranulda) qalan ümumi zülalın, eləcə də arzu olunan zülalın fraksiyasına nəzarət etmək üçün ilkin sınaq aparılır.

Ammonium sulfat (% doymuş)

Şəkil 4.1.2:Çöküntü konsentrasiyasının bir funksiyası kimi zülalların fəaliyyəti

  • Bu xüsusi nümunədə bəxtimiz gətirdi: təxminən 30% ammonium sulfatda nümunəmizdə ümumi protein konsentrasiyasının təxminən 80% -ni çökdürə bilərik, lakin istədiyimiz zülal üçün fəaliyyət analizimiz göstərir ki, istədiyimiz proteinin təxminən 95% -i hələ də həll olunur. .
  • 80% ammonium sulfatda bütün arzu etdiyimiz zülal çökdü. Beləliklə, bu nəticələrdən aşağıdakıları edəcəyik:
  1. Nümunəmizə ammonium sulfatı 30% doyma konsentrasiyasına əlavə edin
  2. Santrifüj edin və qranulları atın
  3. 80% doyma səviyyəsinə qədər ammonium sulfat əlavə edin
  4. Santrifüj edin və qranulları saxlayın. Proteini həll etmək üçün qranulları buferdə yenidən dayandırın.
  • Təxminən 95% məhsuldarlıqla təxminən 5 qat təmizlənmə gözləyərdik.

DNT, RNT və zülalların çıxarılması: keçmiş və indiki zaman

DNT, RNT və zülalın çıxarılması molekulyar biologiyada istifadə edilən əsas üsuldur. Bu biomolekullar sonrakı aşağı axın prosesləri, analitik və ya hazırlıq məqsədləri üçün istənilən bioloji materialdan təcrid oluna bilər. Keçmişdə nuklein turşularının çıxarılması və təmizlənməsi prosesi mürəkkəb, vaxt aparan, əmək tutumlu və ümumi ötürmə qabiliyyəti baxımından məhdud idi. Hal-hazırda, məhlul əsaslı və sütun əsaslı protokollar kimi təmiz biomolekulların çıxarılması üçün istifadə edilə bilən bir çox ixtisaslaşdırılmış üsullar mövcuddur. Nuklein turşusunu təcrid etmək üçün lazım olan komponentlərin əksəriyyətini ehtiva edən tam dəstləri özündə cəmləşdirən müxtəlif kommersiya təklifləri ilə əl üsulu, şübhəsiz ki, zamanla uzun bir yol keçmişdir, lakin onların əksəriyyəti təkrar sentrifuqalama addımlarını tələb edir, ardınca nümunənin növündən asılı olaraq supernatantların çıxarılması və əlavə mexaniki müalicə. Son illərdə orta və böyük laboratoriyalar üçün nəzərdə tutulmuş avtomatlaşdırılmış sistemlərə tələbat artmışdır. Bu, çox əmək tələb edən əl üsullarına alternativdir. Texnologiya nümunələrin yüksək ötürmə qabiliyyətinə imkan verməli, biomolekulların məhsuldarlığı, təmizliyi, təkrar istehsal oluna bilməsi və miqyaslılığı, həmçinin analizin sürəti, dəqiqliyi və etibarlılığı maksimum olmalıdır, eyni zamanda çarpaz çirklənmə riskini minimuma endirməlidir.

1. Biomolekulların çıxarılmasının tətbiqi

Biomolekulların, DNT, RNT və zülalların çıxarılması molekulyar biologiyada istifadə edilən ən mühüm üsuldur [1]. Bu, diaqnostik dəstlər daxil olmaqla, aşağı axın prosesləri və məhsul inkişafı üçün başlanğıc nöqtəsidir. DNT, RNT və zülal analitik və ya hazırlıq məqsədləri üçün canlı və ya konservləşdirilmiş toxumalar, hüceyrələr, virus hissəcikləri və ya digər nümunələr kimi istənilən bioloji materialdan təcrid oluna bilər [1].

DNT-nin təmizlənməsində iştirak edən iki kateqoriyaya plazmidlər və ya bakteriofaqlar kimi rekombinant DNT konstruksiyalarının təcrid edilməsi və prokaryotik və ya eukaryotik orqanizmlərdən xromosom və ya genomik DNT-nin təcrid edilməsi daxildir [2]. Ümumiyyətlə, nuklein turşusunun uğurlu təmizlənməsi üçün dörd mühüm addım tələb olunur: hüceyrələrin effektiv şəkildə pozulması və ya toxuma denaturasiyası nukleoprotein komplekslərinin nükleazların inaktivasiyası, məsələn, RNT ekstraksiya üçün RNase və DNT-nin çirklənmədən çıxarılması üçün DNaz [2]. Hədəf nuklein turşusu zülal, karbohidrat, lipidlər və ya digər nuklein turşusu daxil olmaqla çirkləndiricilərdən təmizlənməlidir, məsələn, RNT-siz DNT və ya DNT-dən azad RNT [3]. Təcrid olunmuş nuklein turşusunun keyfiyyəti və həmçinin bütövlüyü bütün sonrakı elmi tədqiqatların nəticələrinə birbaşa təsir edəcəkdir [4].

Digər tərəfdən, RNT qeyri-sabit bir molekuldur və hüceyrədən və ya toxumalardan çıxarıldıqdan sonra çox qısa bir yarı ömrünə malikdir [5]. Ribosomal RNT (rRNA) (80%–90%), messenger RNT (mRNA) (2,5%–5%) və transfer RNT (tRNA) daxil olmaqla, təbii olaraq meydana gələn bir neçə növ RNT var [3]. RNT-nin təcrid olunması üçün xüsusi qayğı və ehtiyat tədbirləri tələb olunur, çünki o, deqradasiyaya həssasdır [3, 6]. RNT qanda, bütün toxumalarda, həmçinin ətraf mühitdə əksər bakteriya və göbələklərdə mövcud olan fermentlər olan RNazların hər yerdə olması səbəbindən xüsusilə qeyri-sabitdir [3, 5].. Güclü denaturantlar həmişə endogen RNazları inhibə etmək üçün bütöv RNT izolyasiyasında istifadə edilmişdir [2]. RNT hasilatı yaxşı laboratoriya texnikasına və RNazsız texnikaya əsaslanır. RNTaz istiliyə davamlıdır və istilik denaturasiyasından sonra yenidən qatlanır. Kofaktorlar tələb olunmadığı üçün onları inaktivləşdirmək çətindir [2]. Ən çox yayılmış izolyasiya üsullarını iki sinfə bölmək olar: 4 M guanidinium tiosiyanatdan istifadə və fenol və SDS-dən istifadə [2].

Zülalın təmizlənməsi onların funksiyasını başa düşmək üçün zülal tədqiqatında ən vacib hissələrdən biridir, çünki onlar qismən və ya tamamilə hər hansı bir DNT sintezi fəaliyyətində iştirak edə bilərlər. Proteinin unikal xüsusiyyətlərini, o cümlədən ölçüsünü, yükünü, formasını və funksiyasını müəyyən etmək üçün zülalın təmizlənməsi tələb olunur [7]. Hüceyrə əsaslı ekstraksiya demək olar ki, bütün zülalların təmizlənməsi üçün başlanğıc addımdır. Protein yuyucu vasitənin parçalanması, kəsmə qüvvəsi, aşağı ion duzu ilə müalicə (tuzlama) və zülalların qaçmasına imkan vermək üçün hüceyrəni əhatə edən membranları zəiflətmək və qırmaq məqsədi daşıyan təzyiqdə sürətli dəyişikliklər kimi bir neçə üsulla çıxarıla bilər. ]. Zülallarla işləyərkən bəzi amillər nəzərə alınmalıdır. Normalda zülal çıxarılması çox aşağı temperaturda aparılır (

) çünki zülallar hüceyrələrdən ayrıldıqdan sonra asanlıqla denatürasiya olunur. Bufer vəziyyəti nəzərə alınmalı olan əsas amillərdən biridir. Zülalların ətraf mühitin pH dəyişikliklərinə həssaslığı səbəbindən xüsusi tampon şəraitinin saxlanması tövsiyə olunur [4]. Suyun saflığı son məhsulların məhsuldarlığına təsir göstərəcək, çünki təmizlənməmiş suda zülalın deqradasiyası ilə nəticələnəcək çoxlu mikroorqanizmlər və ya proteazlar var [4]. Məhlulda və ya tamponlarda mövcud ola bilən zülal inhibitoru zülalların hidrolizinə səbəb olur. Zülalın təmizlənməsində diqqətdən kənarda qalmayan digər mühüm amil olan yuyucu vasitə xətti və ya budaqlanmış karbohidrogen “quyruğu”nun hidrofobik hissəsindən və hidrofilik “başından” ibarətdir [4]. Onlar membran zülalını həll edir və zülalların hidrofilik başlığı ilə misellər əmələ gətirən amfifatik molekullardır [4]. Oksidləşmə nəticəsində zülalların və ya fermentlərin aktivliyinin itirilməsinin qarşısını almaq üçün zülalların çıxarılması və təmizlənməsi üçün məhlul və ya tampona azaldıcı maddələr əlavə ediləcək. Zülalların saxlanması vacibdir, çünki zülalın yarı ömrü adətən saxlama temperaturundan asılıdır [4].

Zülalın təmizlənməsi xüsusi analiz tələb edir. Zülalın təmizlənməsi üçün tez və asan analiz metodu məlum olmalıdır ki, müvafiq metoddan istifadə etməklə qeyri-enzimatik zülalın məlum molekulyar çəkisi, spesifik yaxınlığı və ya immunoafinitesi aşkarlana bilsin [7]. Zülalların təmizlənməsində geniş istifadə olunan bir neçə üsul var. Bunlar ion mübadiləsi xromatoqrafiyası, gel filtrasiyası, yaxınlıq xromatoqrafiyası və gel elektroforezidir [4].

2. Tarix

2.1. Nuklein turşularının çıxarılması

İlk DNT izolyasiyası 1869-cu ildə isveçrəli həkim Fridrix Mişer tərəfindən aparılmışdır [8]. O, həyatın əsas prinsiplərini həll etməyə, hüceyrələrin kimyəvi tərkibini təyin etməyə ümid edirdi. Təcrübə üçün limfa düyünlərindən hüceyrələri təcrid etməyə çalışdı, lakin lenfositlərin saflığını kifayət qədər miqdarda əldə etmək çətin və qeyri-mümkün idi. Buna görə də, o, toplanmış cərrahi sarğılardakı irindən əldə etdiyi leykositlərə keçdi.

Əvvəlcə Miescher leykositləri təşkil edən müxtəlif növ zülallara diqqət yetirdi və zülalların hüceyrə sitoplazmasının əsas komponentləri olduğunu göstərdi. Sınaqları zamanı o, turşu əlavə edildikdə məhluldan bir maddənin çökdüyünü, qələvi əlavə edildikdə isə yenidən həll olunduğunu müşahidə etdi. Bu, ilk dəfə DNT-nin xam çöküntüsünü əldə etdi.

DNT-ni hüceyrə ekstraktlarında olan zülallardan ayırmaq üçün Miescher hüceyrələrin nüvələrini sitoplazmadan ayırmaq üçün yeni protokol hazırladı və sonra DNT-ni təcrid etdi. Bununla belə, onun ilk protokolu əlavə təhlili davam etdirmək üçün kifayət qədər material verə bilmədi. O, daha böyük miqdarda təmizlənmiş nuklein əldə etmək üçün ikinci protokol hazırlamalı oldu ki, sonradan tələbəsi Riçard Altman [8] onu “nuklein turşusu” adlandırdı.

2.2. Protein çıxarılması

XVIII əsrdə zülallar Antoine Fourcroy və başqaları tərəfindən bioloji molekulların ayrı bir sinfi kimi tanınırdı. Onlar bu molekulu istilik və ya turşu ilə müalicə altında laxtalanma qabiliyyəti ilə fərqləndirdilər. Lakin zülalın ilk təsviri 1893-cü ildə holland kimyaçısı Gerhardus Johannes Mulder tərəfindən aparılmışdır [9]. Onun heyvan mənşəli maddələrin, əsasən fibrin, albumin və jelatinin tərkibinə dair tədqiqatları karbon, hidrogen, oksigen və azotun olduğunu göstərdi [9]. Bundan əlavə, o, kükürdün və fosforun bəzən çox sayda atomdan ibarət olan heyvan maddələrində olduğunu tanıdı və bu "maddələrin" makromolekullar olduğunu müəyyən etdi [9].

Erkən tədqiqatların əksəriyyəti böyük miqdarda təmizlənə bilən zülallara yönəldilmişdir. Məsələn, qan, yumurta ağı və müxtəlif toksinlər. Zülalların əksəriyyətini hətta bugünkü yüksək inkişaf etmiş üsullarla milliqramdan çox miqdarda təmizləmək çətindir. Zülalların təmizlənməsi üçün texnikaların əksəriyyəti İkinci Dünya Müharibəsi zamanı zülal alimi Edvin Cozef Konun rəhbərlik etdiyi layihədə hazırlanmışdır. O, qanın təmizlənməsinə cavabdeh idi və qan plazmasının serum albumin fraksiyasını təcrid etmək üsullarını işləyib hazırladı ki, bu da qan damarlarında osmotik təzyiqin saxlanmasında vacibdir, bu da əsgərin sağ qalmasına kömək edir [10].

3. Mövcud tendensiya

Miescherin hüceyrədən DNT əldə edə bildiyi taleyüklü hadisədən sonra bir çoxları DNT-nin təcrid edilməsi və təmizlənməsi protokolunda daha da irəliləyişlərə səbəb olan nümunəni izlədilər. DNT ekstraksiyasının ilkin rutin laboratoriya prosedurları sıxlıq qradiyenti sentrifuqasiya strategiyalarından işlənib hazırlanmışdır. Meselson və Stahl 1958-ci ildə DNT-nin yarımkonservativ replikasiyasını nümayiş etdirmək üçün bu üsuldan istifadə etdilər [3]. Sonrakı prosedurlar qələvi tamponda böyük xromosom DNT, plazmidlər və zülalların həllolma fərqlərindən istifadə etdi [3].

Hal-hazırda, təmiz DNT, RNT və ya zülal çıxarmaq üçün bir çox xüsusi üsul var. Ümumiyyətlə, onlar həll əsaslı və ya sütun əsaslı protokollara bölünür. Bu protokolların əksəriyyəti biomolekulların çıxarılması proseslərini asanlaşdıran kommersiya dəstləri şəklində hazırlanmışdır.

3.1. Nuklein turşusunun çıxarılması növü
3.1.1. Ənənəvi Metod

Quanidinium tiosiyanat-fenol-xloroformun çıxarılması
Duz nuklein turşusu nümunələrində ümumi çirkdir. Hər hansı aşağı axın prosesləri və təhlili aparılmazdan əvvəl nuklein turşusu nümunələrindən həmişə çıxarılması tələb olunub. Buna görə də, nuklein turşusundan ibarət nümunəni duzsuzlaşdırmaq üçün tək və ya çoxlu ayırma və/və ya təmizləmə mərhələləri tələb olunur [11]. Nuklein turşusunun təmizlənməsinin ümumi mərhələlərinə lizat yaratmaq üçün hüceyrə quruluşunu pozan hüceyrə lizisi, DNase və RNase kimi hüceyrə nukleazlarının inaktivasiyası və istənilən nuklein turşusunun hüceyrə zibilindən ayrılması daxildir [2]. Üzvi həlledici - fenol-xloroformun ekstraksiyası nümunələrdən biridir və nuklein turşusunun təcrid edilməsində geniş istifadə olunur.
Yanan, aşındırıcı və zəhərli karbol turşusu olan fenol zülalları sürətlə denatürasiya edə bilsə də, RNTaz fəaliyyətini tamamilə maneə törətmir [12]. Bu problemi fenol: xloroform: izoamil spirti (25:24:1) qarışığından istifadə etməklə həll etmək olar. Zülallar, lipidlər, karbohidratlar və hüceyrə qalıqları sulu fazanın fenol və xloroformun üzvi qarışığı ilə çıxarılması yolu ilə çıxarılır [12, 13]. Fenol və xloroform əlavə edildikdə ikifazalı emulsiya əmələ gəlir. Bundan sonra emulsiyanın hidrofobik təbəqəsi sentrifuqalama yolu ilə dibdə, hidrofilik təbəqə isə yuxarıda çökəcək [3]. Tərkibində DNT olan yuxarı faza toplanır və DNT 2:1 və ya 1:1 nisbətində etanol və ya izopropanol və yüksək konsentrasiyada duz əlavə etməklə supernatantdan çökdürülə bilər [3]. DNT çöküntüsü sentrifuqa ilə toplanır və artıq duz 70% etanol ilə yuyulur və etanol supernatantını atmaq üçün sentrifuqa edilir. DNT qranulları daha sonra TE tamponu və ya steril distillə edilmiş su ilə həll edilir [3].
RNT ekstraksiyasında guanidinium izotiosiyanatdan istifadə ilk dəfə Ulrich et al. (1977). Metod zəhmət tələb edirdi. Buna görə də, o, Chomczynski və Sacchi (1987) [12] tərəfindən Guanidinium tiosiyanat-fenol-xloroformun çıxarılması kimi tanınan bir addımlı texnika ilə dəyişdirilmişdir, bunun sayəsində homogenat aşağı pH-da fenol/xloroform ilə ekstraksiya edilmişdir. Guanidinium tiosiyanat zülalların parçalanmasında istifadə olunan xaotrop agentdir. Bu tək addımlı texnikanın prinsipi ondan ibarətdir ki, guanidinium tiosiyanat, natrium asetat, fenol və xloroformdan ibarət turşu məhlulu ilə ekstraksiya edildikdən sonra RNT DNT-dən ayrılır [13]. Turşu şəraitdə ümumi RNT bütün qarışığın yuxarı sulu fazasında, DNT və zülallar isə interfazada və ya aşağı üzvi fazada qalacaq. Ümumi RNT-nin bərpası daha sonra izopropanol ilə çökdürülməklə həyata keçirilir [12].

Qələvi çıxarma üsulu
Qələvi lizis plazmid DNT-ni təcrid etmək üçün istifadə edilmişdir və E. coli [12]. Bütün suşları ilə yaxşı işləyir E. coli və natrium dodesil sulfat (SDS) varlığında ölçüsü 1 ml-dən 500 ml-ə qədər dəyişən bakterial kulturalar ilə. Metodun prinsipi yüksək molekulyar ağırlıqlı xromosom DNT-nin seçici qələvi denaturasiyasına əsaslanır, kovalent qapalı dairəvi DNT isə ikiqat zəncirli qalır [14]. Bakterial zülallar, qırılan hüceyrə divarları və denatürləşdirilmiş xromosom DNT-si dodesil sulfatla örtülmüş böyük komplekslərə daxil olur. Plazmid DNT, denatürasiya olunmuş material sentrifuqa ilə çıxarıldıqdan sonra supernatantdan bərpa edilə bilər.

CTAB çıxarma metodu
Bitkinin çıxarılması üçün görülməli olan ilkin addım nümunəni maye azotla dondurduqdan sonra üyütməkdir. Bu addımı atmağın məqsədi nümunənin hüceyrə divarının materialını parçalamaq və zərərli hüceyrə fermentləri və kimyəvi maddələrin təsirsiz qaldığı halda nuklein turşusuna daxil olmaqdır. Nümunə üyüdüldükdən sonra CTAB kimi uyğun bir tamponda yenidən dayandırıla bilər.
Setiltrimetilammonium bromid (CTAB) qeyri-ion yuyucu vasitədir, nuklein turşularını və turşu polisaxaridləri aşağı ionlu məhlullardan çökdürə bilir [15]. Eyni zamanda, zülallar və neytral polisaxaridlər bu şərtlər altında məhlulda qalırlar. Yüksək ion gücünə malik məhlullarda CTAB nuklein turşularını çökdürmür və zülallarla komplekslər əmələ gətirir. Buna görə də CTAB nuklein turşusunun bitkilər və müəyyən qram-mənfi bakteriyalar kimi böyük miqdarda polisaxaridlər istehsal edən orqanizmlərdən təmizlənməsi üçün faydalıdır [15].
Bu üsul həm də sonrakı mərhələlərdə üzvi həlledicilərdən və spirt çöküntülərindən istifadə edir [12]. Həll olunmayan hissəciklər nuklein turşusunu təmizləmək üçün sentrifuqa vasitəsilə çıxarılır. Həll olunan zülallar və digər materiallar xloroformla qarışdırılaraq və sentrifuqa edilərək ayrılır. Bundan sonra nuklein turşusu supernatantdan çökdürülməlidir və çirkləndirici duzları çıxarmaq üçün hərtərəfli yuyulmalıdır. Təmizlənmiş nuklein turşusu yenidən dayandırılır və TE tamponunda və ya steril distillə edilmiş suda saxlanılır.

) Gradient sentrifuqasiya
gradient sentrifuqalama digər təmizləmə protokolları ilə müqayisədə mürəkkəb, bahalı və vaxt aparan üsuldur.Bunun üçün geniş miqyaslı bakterial mədəniyyət tələb olunur. Buna görə də plazmid DNT-nin minipreparasiyası üçün uyğun deyil [4]. Nuklein turşuları sentrifuqa ilə konsentrasiya edilə bilər

spirtin çökməsi və resuspenziyasından sonra gradient. İnterkalasiya molekulun yüksək molyarda üzmə sıxlığını dəyişir

Kovalent qapalı dairəvi molekullar qradiyentdə daha aşağı sıxlıqlarda toplanacaq, çünki onlar xətti molekullarla müqayisədə hər bir baza cütünə daha az daxil olurlar. Hidrofobik daha sonra çıxarıldıqdan sonra müvafiq hidrofobik həlledicilərlə çıxarılır. Təmizlənmiş nuklein turşusu spirtlə təkrar çökdürüləcəkdir [1].

Oligp(dT)-Selüloza Xromatoqrafiyası ilə RNT
Poly RNT zülal tərcüməsi üçün şablondur və eukaryotik mRNT-lərin əksəriyyəti onun traktlarını 3' uclarında daşıyır [4, 15]. O, ümumi RNT-nin 1-2%-ni təşkil edir və oliqo (dT)-selüloz üzərində yaxınlıq xromatoqrafiyası ilə ayrıla bilər. Poli (A) quyruqları müxtəlif dayaq matrislərinə birləşən qısa zəncirli oliqo (dT) ilə sabit RNT-DNT hibridləri əmələ gətirir [4, 15]. Nuklein turşusu duplekslərini sabitləşdirmək üçün xromatoqrafiya tamponuna yüksək duz əlavə edilməlidir, çünki yalnız bir neçə dT-A əsas cütü əmələ gəlir. Poliadenilləşməmiş RNT-lər matrisdən yuyulduqdan sonra az duzlu bufer istifadə olunur. Bu tampon ikiqat zəncirli strukturları destabilləşdirməyə və poli RNT-ləri qatrandan ayırmağa kömək edir [15].
Poli RNT-nin seçilməsində iki üsuldan istifadə olunur - oliqo (dT) sütunlarında sütun xromatoqrafiyası və toplu xromatoqrafiya. Sütun xromatoqrafiyası adətən böyük miqdarların təmizlənməsi üçün istifadə olunur (>25

g) məməli hüceyrələrindən təcrid olunmuş radioaktiv olmayan poli (A) + RNT. Kiçik miqdarda (<50 q) məməlilərin ümumi RNT-si ilə işləyərkən toplu xromatoqrafiya üstünlük verilən üsuldur. Radioaktiv olub-olmamasından asılı olmayaraq, bir çox RNT nümunəsi emal edilməli olduqda istifadə edilə bilər. Partiya xromatoqrafiyası bağlanma və elüsyon üçün optimal temperaturda incə dərəcəli oliqo (dT) selülozu ilə aparılır [15].

3.1.2. Bərk fazalı nuklein turşularının çıxarılması

Bərk fazalı nuklein turşusunun təmizlənməsi bazarda mövcud olan kommersiya ekstraksiya dəstlərinin əksəriyyətində tapıla bilər. Ənənəvi üsullarla müqayisədə tez və səmərəli təmizləməyə imkan verir [16]. Natamam faza ayrılması kimi maye-maye çıxarılması ilə əlaqəli bir çox problemlərin qarşısı alına bilər. Bərk faza sistemi buferin pH və duz tərkibindən asılı olaraq ekstraksiya prosesində nuklein turşusunu udacaq. Absorbsiya prosesi aşağıdakı prinsiplərə əsaslanır: xaotrop şəraitdə hidrofilik matrislə hidrogen bağlayan qarşılıqlı təsir, anion dəyişdirici vasitəsi ilə sulu şəraitdə ion mübadiləsi, yaxınlıq və ölçülərin xaric edilməsi mexanizmləri.

Bərk fazalı təmizlənmə adətən mərkəzdənqaçma qüvvəsi altında işləyən fırlanma sütunundan istifadə etməklə həyata keçirilir [17]. Bu üsul adi üsullarla müqayisədə nuklein turşusunu sürətlə təmizləyə bilir. Silisium matrisləri, şüşə hissəcikləri, diatomlu torpaq və anion mübadiləsi daşıyıcıları bərk fazalı ekstraksiya metodunda bərk dəstək kimi istifadə edilən nümunələrdir. Bərk faza ekstraksiyasında iştirak edən dörd əsas addım hüceyrə lizisi, nuklein turşularının adsorbsiyası, yuyulması və elüsyondur [6].

Bərk fazanın çıxarılması prosesində ilkin addım nümunənin adsorbsiyasına sütunu şərtləndirməkdir. Sütun kondisioneri bərk cismin səthini və ya funksional qruplarını müəyyən bir kimyəvi formaya çevirmək üçün müəyyən bir pH-da buferdən istifadə etməklə edilə bilər. [17]. Sonra, lizis buferindən istifadə edərək deqradasiya edilmiş nümunə sütuna tətbiq olunur. İstənilən nuklein turşusu bağlayıcı məhlulun yüksək pH və duz konsentrasiyası ilə sütuna udulacaqdır [17]. Zülal kimi digər birləşmələr də sütun səthi ilə güclü xüsusi əlaqəyə malik ola bilər. Bu çirkləndiricilər, rəqabətli agent olan yuyucu tampondan istifadə etməklə yuyulma mərhələsində təmizlənə bilər [17]. Elüsyon mərhələsi üçün sütundan istənilən nuklein turşusunu buraxmaq üçün TE tamponu və ya su daxil edilir ki, o, təmizlənmiş vəziyyətdə toplana bilsin [17]. Normalda təmizləmə prosesinin yuyulması və elüsyon mərhələləri zamanı sürətli sentrifuqa, vakuum filtrasiyası və ya sütunun ayrılması tələb olunur.

Qarışıq yataqlı bərk fazalı nuklein turşusunun çıxarılması və onun nuklein turşusunun təcridində istifadəsi açıqlanmışdır [18]. Bu ixtiranın qarışıq yataqlı bərk fazaları ən azı iki müxtəlif bərk fazanın qarışıqlarıdır, bərk və ya yarı bərk, məsaməli və ya məsaməli ola bilər. Hər bir bərk faza müxtəlif məhlul şəraitində hədəf nuklein turşusu ilə birləşə və oxşar elüsiya şəraitində nuklein turşusunu buraxa bilər [18].

Silisium matrisləri
Nuklein turşusunun təmizlənməsi ilə bağlı məhsulların əksəriyyəti üçün əsas seçici DNT bağlanması üçün silisium matrislərinin unikal xüsusiyyətləridir. Şüşə tozu, silisium hissəcikləri və şüşə lifli filtr kağızlarının üyüdülməsi ilə hazırlanmış şüşə mikroliflər kimi şüşə hissəcikləri, o cümlədən diatomlu torpaq [19] daxil olmaqla silisium materiallarının növləri. Silisium dioksidin natrium hidroksiddə və ya kalium hidroksiddə təxminən 2:1 ilə 10:1 arasında molyar nisbətdə ən azı təxminən 48 saat ərzində geri axını ilə hazırlanmış hidratlanmış silisium matrisi DNT təmizlənməsində tətbiq edilmişdir. DNT qeyri-üzvi matrisə bağlanır və qızdırılan suda buraxılır [20].
Silisium matrislərinin təmizlənməsi prinsipi mənfi yüklü DNT onurğasının müsbət yüklü silisium hissəciklərinə yüksək yaxınlığına əsaslanır [21]. Natrium nuklein turşusunun fosfat onurğasında mənfi yüklü oksigeni cəlb edən kation körpüsü rolunu oynayır [22]. Natrium kationları yüksək duz şəraitində (pH ≤7) sudakı hidrogen ilə silisiumdakı mənfi yüklü oksigen ionları arasındakı hidrogen bağlarını qırır [22]. DNT sıx bağlıdır və geniş yuyulma bütün çirklənmələri aradan qaldırır. Təmizlənmiş DNT molekulları daha sonra TE buferindən və ya distillə edilmiş sudan istifadə etməklə aşağı ion gücü (pH ≥7) altında elüt edilə bilər [21].
Silisium matrislərindən başqa, neylon matrislər kimi nitroselüloz və poliamid membranların da nuklein turşuları ilə birləşdiyi, lakin daha az spesifikliyi ilə məlumdur. Bu materiallar çox vaxt bərk fazalı nuklein turşularının ötürülməsi və hibridləşmə matrisləri kimi istifadə olunur [23]. Poliamid matrisləri nitroselülozdan daha davamlıdır və nuklein turşularını geri dönməz şəkildə bağladığı bilinir. Nuklein turşuları aşağı ion gücü olan buferdə poliamid matrislər üzərində hərəkətsizləşdirilə bilər [23].

Şüşə hissəcik
Şüşə hissəcikləri, toz və muncuqlar nuklein turşusunun təmizlənməsi üçün faydalıdır. Məsələn, agaroz gellərindən DNT izolyasiyası DNT-nin adi silikat şüşə, çaxmaq daşı şüşəsi və borosilikat şüşəyə (şüşə lif filtri) bağlanmasını asanlaşdırmaq üçün xaotrop duzların istifadəsini nəzərdə tuturdu. Nuklein turşusunun şüşə substrata adsorbsiyası çox güman ki, adsorbsiya xromatoqrafiyasına bənzəyən mexanizm və prinsip əsasında baş verir [24]. Nuklein turşusunun təmizlənməsi silisium gel və şüşə qarışığı üzərində də aparıla bilər [19]. Bu ixtira, silisium gel və şüşə hissəciklərinin qarışığının xaotrop duzların məhlulunun iştirakı ilə nuklein turşusunu digər maddələrdən ayırmaq üçün istifadə oluna biləcəyini aşkar etdi.

Diatomlu Yer
Kieselguhr və ya diatomit kimi də tanınan diatomlu torpaqda silisium 94%-ə qədər yüksəkdir [25]. Filtrləmə və xromatoqrafiya üçün istifadə edilmişdir və xaotrop agentin iştirakı ilə DNT-ni hissəciklərinə immobilizasiya etməklə plazmid və digər DNT-nin təmizlənməsi üçün faydalıdır. Nəticədə meydana gələn diatomlu torpağa bağlı DNT daha sonra spirt tərkibli tamponla yuyulur. Daha sonra spirt tərkibli tampon atılır və DNT aşağı duzlu tamponda və ya distillə edilmiş suda elüt edilir [25].

Maqnetik muncuq əsaslı nuklein turşularının təmizlənməsi
Maqnit ayırma hal-hazırda nuklein turşusunun təmizlənməsində istifadə olunan sadə və səmərəli üsuldur. İndi bir çox maqnit daşıyıcıları ticari olaraq mövcuddur. Maqnit yükü olan hissəciklər maqnit sahəsinin tətbiqi zamanı daimi maqnitdən istifadə etməklə çıxarıla bilər. Çox vaxt təcrid prosesi üçün immobilizasiya edilmiş yaxınlıq liqandları olan və ya hədəf nuklein turşusuna yaxınlıq göstərən biopolimerdən hazırlanmış maqnit daşıyıcılarından istifadə olunur. Məsələn, müxtəlif sintetik polimerlərdən, biopolimerlərdən, məsaməli şüşələrdən və ya səthi dəyişdirilmiş dəmir oksidi kimi qeyri-üzvi maqnit materiallarına əsaslanan maqnit hissəciklərindən əldə edilən maqnit hissəcikləri. Nuklein turşularının bağlanmasında böyük səth sahəsi olan materiallardan istifadə edilməsinə üstünlük verilir. Muncuq kimi maqnit hissəcikli materiallar daha böyük bağlama qabiliyyətinə görə izolyasiya prosesində dəstək olmaq üçün daha üstündür. Nuklein turşusunun bağlanması prosesinə nuklein turşusunun dəstəyi “ətrafına sarması” kömək edə bilər. Qabın divarına yaxın hissəcikləri toplamaq və nümunənin qalan hissəsini tökmək üçün nümunə qarışığı olan qabın yan tərəfinə maqnit tətbiq oluna bilər [26].
Maqnit və ya paramaqnit xassələri olan hissəciklər maqnitləşə bilən sellüloza kimi bir polimerdə kapsullaşdırıldıqları bir ixtirada istifadə olunur [27]. Duz və polialkilenqlikolun müəyyən konsentrasiyaları olduqda, maqnitləşən sellüloza nuklein turşularına bağlana bilər. Kiçik nuklein turşusu maqnitləşə bilən sellüloza hissəciklərinə güclü bağlanmaq üçün daha yüksək duz konsentrasiyası tələb edirdi. Buna görə də, duz konsentrasiyası maqnitləşə bilən sellülozaya bağlı nuklein turşusunun ölçüsü əsasında sərbəst buraxılması üçün seçici şəkildə idarə oluna bilər. Nuklein turşusu ilə birləşən maqnitləşə bilən sellüloza, istənilən nuklein turşusunu sellüloza ilə ayırmaq üçün uyğun elüsyon tamponu ilə təmas etməzdən əvvəl uyğun yuma tamponu ilə yuyulacaq. Bütün təmizlənmə mərhələləri zamanı maqnitləşə bilən sellülozanın supernatantdan ayrılması onları aşağı çəkmək və ya gəminin kənarına çəkmək üçün maqnit sahəsi tətbiq etməklə həyata keçirilə bilər [27]. Bu ixtirada istifadə edilən maqnitləşə bilən sellülozun tərkibində sellülozun ümumi kütləsinin təxminən 90%-ə qədər dəmir oksidi var. Sellülozanın maqnit komponenti həmçinin dəmir oksidi və ya nikel oksidi kimi digər maqnit birləşmələri ilə də əvəz edilə bilər [27].
Maqnit muncuq əsaslı nuklein turşusunun təmizlənməsi prinsipinə əsaslanan ekstraksiya dəsti bazarda ticari olaraq mövcuddur [28]. Bu dəstin xüsusi hissəsi ondan ibarətdir ki, verilən reagentlər maqnit alətləri ilə istifadə üçün nəzərdə tutulub. Mikroboru formatında işləyərkən bu maqnit aləti tövsiyə olunur. Maqnit hissəcik texnologiyasına əsaslanan ayırmaların aparılması üçün praktiki cihazdır. Kit heç bir üzvi həlledici tələb etmir və təkrar sentrifuqa, vakuum filtrasiyası və ya sütunun ayrılması ehtiyacını aradan qaldırır. Protokol nuklein turşusunun maqnit hissəciklərinə bağlanmasından sonra dəyişdirilmiş qələvi lizis proseduruna əsaslanır. Maqnit aləti bağlı nuklein turşusu ilə maqnit hissəciklərini tutmaq üçün istifadə olunur və çirkləndiricilər təmin edilən yuma tamponu ilə yuyulmaqla təmizlənir. Daha sonra nuklein turşusu elüsyon tamponu ilə maqnit hissəciklərindən təmizlənir [28].
Başqa bir ekstraksiya dəsti, nuklein turşusunun təmizlənməsi üçün maqnit-hissəcik texnologiyasından istifadə edən yuxarıda təsvir edilən ekstraksiya ilə eyni prinsipə malikdir [29]. O, silisium əsaslı DNT təmizlənmə sürətini və səmərəliliyini maqnit hissəciklərinin rahat idarə edilməsi ilə birləşdirir. Maqnit hissəciklərinin tutulması üçün çubuq örtüyü ilə qorunan bir maqnit çubuq istifadə olunur. O, nümunələri olan bir qaba daxil olur və maqnit hissəciklərini çəkir. Sonra maqnit çubuq örtüyü başqa bir qabın üstündə yerləşdirilir və maqnit hissəcikləri buraxılır [29].
Zirkon muncuqdan istifadə etməklə nuklein turşusunun təmizlənməsi maqnit muncuq əsasında təmizlənmənin başqa bir növüdür. Bu mikrosferik paramaqnit muncuqlar geniş mövcud bağlama səthinə malikdir və məhlulda səpələnə bilər. Bu xüsusiyyət nuklein turşusunun hərtərəfli bağlanmasına, yuyulmasına və elüsyonuna imkan verdi. Nuklein turşusunun təmizlənməsi üçün bu texnologiyadan istifadə edən ümumi nuklein turşusu təcrid dəsti, guanidinium tiosiyanat əsaslı məhlulda sirkon muncuqları ilə nümunələrin mexaniki pozulmasından istifadə edir, bu da yalnız nuklein turşusunu buraxmır, həm də nümunə matrisində nukleazı inaktivləşdirir. 30]. Lizis addımından sonra nümunələrin seyreltilməsi izopropanoldan istifadə etməklə aparılır. Paramagenetik muncuqlar nuklein turşusunu bağlamaq məqsədi ilə nümunələrə əlavə edilir. Muncuqların və nuklein turşusunun qarışığı maqnitlərdə hərəkətsizləşdirilir və zülal və çirkləndiriciləri çıxarmaq üçün yuyulur. Qalıq bağlayıcı məhlulun çıxarılması ikinci yuma məhlulu ilə aparılır və nəhayət, nuklein turşusu az duzlu tamponda elüt edilir [30].
Keyfiyyətli DNT-ni təqdim etmək üçün PCR təmizləmə sistemi üçün bərk fazalı reversiv immobilizasiya paramagenetik muncuq əsaslı texnologiyadan istifadə edilmişdir. Bu sentrifuqa və filtrasiya olmadan sadə protokol tələb edir. PCR amplikonları paramagenetik hissəciklərə bağlanaraq onları məhluldan çıxarır və dNTP-lər, primerlər və duzlar kimi çirkləndiricilərin yuyulmasına imkan verir [31].
Maqnit oliqo (dT) muncuq ümumi RNT nümunəsindən poli RNT-nin təmizlənməsi üçün digər oliqo (dT) matrislərə alternativdir [4]. Poli RNT oliqo (dT) ilə örtülmüş maqnit muncuqları tətbiq etməklə çıxarıla bilər. Poli-A quyruğu olan RNT oliqoya (dT) yapışır. Muncuqlar daha sonra mRNT-ni birbaşa ümumi RNT-dən çıxaran borunun dibinə çəkiləcək. Xüsusi işlənmiş maqnit muncuqları digər nuklein turşularının qeyri-spesifik bağlanmasını minimuma endirir və mRNT-nin saflığını təmin edir [32].

Anion mübadiləsi materialı
Anion dəyişdirici qatran anion mübadiləsi prinsipindən istifadə edən məşhur nümunələrdən biridir [33]. Bu, qatran səthində müsbət yüklü dietilaminoetil selüloz (DEAE) qrupları ilə DNT onurğasının mənfi yüklü fosfatları arasında qarşılıqlı təsirə əsaslanır. Anion dəyişdirici qatran böyük məsamə ölçüsünə, hidrofilik səth örtüyünə və yüksək yük sıxlığına malik olan müəyyən edilmiş silisium muncuqlarından ibarətdir [34]. Qatranın böyük səth sahəsi DEAE qruplarının sıx birləşməsinə imkan verir. Qatran, DNT-nin RNT və digər çirklərdən ayrılmasını optimallaşdıra bilən geniş pH şərtləri (pH 6-9) və/və ya duz konsentrasiyası (0,1-1,6 M) üzərində işləyir [34]. Buna görə də, duz konsentrasiyası və tamponların pH şərtləri nuklein turşusunun sütundan bağlandığını və ya ayrıldığını müəyyən edən əsas amillərdən biridir. DNT duz konsentrasiyasının geniş diapazonunda DEAE qrupuna bağlana bilər. Zülal və RNT kimi çirklər orta duzlu tamponlardan istifadə etməklə qatrandan yuyulur, DNT isə yüksək duzlu tamponla yuyulana qədər bağlı qalır [34].
Nuklein turşusunu təcrid etmək üçün anion mübadiləsi materiallarından istifadə üsulu [35] ixtirada açıqlanmışdır, burada kommersiyada mövcud olan güclü və ya zəif müsbət yüklü anion dəyişdirici materialları adsorbsiya və elüsyon üçün məlum ion gücünə malik seçilmiş məhlullarla istifadə edilmişdir. Zülal kimi suda həll olunan komponentlərin çoxu nuklein turşularının anion mübadilə sütunu materiallarına bağlanması üçün məlum ion gücünə malik məhluldan istifadə etməklə sütun vasitəsilə yuyula bilər. Elüsyon üçün ion gücü, pH gücünü idarə etmək üçün buferlə qarışdırılan məlum duz konsentrasiyasından istifadə etməklə yaradılır, ideal olaraq nuklein turşularının tamamilə süzüləcəyi ən aşağı ion gücünə uyğundur [35].

3.2. Proteinlərin çıxarılması metodunun növü

Zülalın təmizlənməsində ilk addım hüceyrə lizisidir. Zülalları effektiv şəkildə təmizləmək və təhlil etmək üçün onlar əvvəlcə ev sahibi hüceyrəsindən həll olunan formada buraxılmalıdırlar. Fosfolipidlərdən və zülallardan ibarət məməlilərin hüceyrələrinin plazma membranı asanlıqla pozulur [36]. Müqayisə üçün, göbələklərdən və bakteriyalardan protein çıxarılması onların plazma membranından daha güclü olan sabit hüceyrə divarına görə daha çətin görünür.

Bitki toxumalarında xassələri ilə fərqlənən çoxlu zülallar var. Bitki üçün zülal çıxarma protokolunu hazırlayarkən bəzi spesifik amillər nəzərə alınmalıdır [37]. Məsələn, hüceyrə tərkibini sərbəst buraxmaq üçün sərt sellüloza hüceyrə divarının olması kəsilməlidir. Fenoliklər və bir sıra proteinazlar kimi xüsusi çirkləndirici birləşmələr zülalın deqradasiyası və ya modifikasiyası ilə nəticələnə bilər. Buna görə də, zülalın bitkidən çıxarılması və təmizlənməsi üçün xüsusi şərtlər tələb olunur [38].

Hüceyrə divarını çıxarmaq üçün French Press və ya şüşə muncuq kimi mexaniki pozulma üsullarından istifadə edilir, ardınca deterjan əsasında ümumi zülal çıxarılır [39].

3.2.1. İon mübadiləsi xromatoqrafiyası

İon mübadiləsi xromatoqrafiyası müsbət yüklü və ya mənfi yüklü kimyəvi qruplarla dəyişdirilmiş qatrandan istifadə edərək zülalları səth ion yüklərinə əsasən ayırır [4, 7]. Əksər zülallar müəyyən bir pH-da izoelektrik nöqtəsindən (pI) asılı olaraq ümumi mənfi və ya müsbət yükə malikdirlər ki, bu da onların əks yüklü xromatoqrafik matrislə qarşılıqlı əlaqədə olmasını mümkün edir [7]. Əgər zülalın xalis yükü pI-dən aşağı pH-da müsbət olarsa, zülal pI-dən yuxarı pH-da kation dəyişdiricisinə bağlanacaq və zülalın xalis yükü mənfi olar və zülal anion dəyişdiricisinə bağlanacaqdır [38]. ].

Qatranlarla zəif qarşılıqlı əlaqədə olan zülallar, məsələn, mənfi yüklü qrupla dəyişdirilmiş qatran üzərindən keçən zəif müsbət yüklü zülal, az duzlu tamponda elüt edilir. Digər tərəfdən, güclü şəkildə qarşılıqlı əlaqədə olan zülallar daha çox duz tələb edirdi. Çox oxşar yük xarakteristikalarına malik zülallar, elüsyon tamponunda duzun konsentrasiyasını artırmaqla sütundan elüt edildiyi üçün müxtəlif fraksiyalara ayrıla bilər [7].

İon mübadilə sütunu ion mübadiləsi xromatoqrafiyası prinsipindən istifadə edən texnologiyalardan biridir [33]. Zülalları ayırmaq üçün xromatoqrafik matris kimi membran uducu texnologiyadan istifadə edir. Sütunlardakı membran absorbentləri zülalların yüklənmiş səthə asanlıqla çıxışını təmin edən yüksək məsaməli struktura malik stabilləşdirilmiş sellüloza əsaslıdır. Molekullar və membrandakı aktiv yerlər arasında qarşılıqlı əlaqə konvektiv məsamələrdə baş verir. Buna görə də adsorbsiya membranları böyük biomolekulları aşağı diffuziya ilə təmizləyərkən yüksək effektivliyi saxlamaq potensialına malikdir [33].

3.2.2. Gel filtrasiya xromatoqrafiyası

Gel filtrasiya xromatoqrafiyası, həmçinin ölçü istisna və ya gel keçirmə xromatoqrafiyası adlanır, zülalları molekulyar ölçülərə və formaya görə ayırır və molekullar xromatoqrafiya mühitinə bağlanmır [39]. Bu, böyük molekulların kiçik molekullardan daha sürətli sütundan keçdiyi bir prosesdir.Kiçik molekullar matrisin bütün kiçik dəliklərinə daxil ola və daha çox sütuna daxil ola bilər. Kiçik ölçülü zülallar həmin dəliklərdən keçəcək və bu dəliklərə girə bilməyən, lakin sütundakı boşluqdan birbaşa sütundan çıxan böyük ölçülü zülallarla müqayisədə sütundan çıxması daha çox vaxt aparacaq [4, 7].

Gel filtrasiya xromatoqrafiya dəsti gel filtrasiya xromatoqrafiyası prinsipini tətbiq edir [40]. Hədəf nümunəsi məsaməli muncuqlar olan sütunun üstünə tətbiq olunur, sütundakı matrisin nümunəsi. Molekullar məsaməli muncuqların sütunundan keçdikdə molekullar ayrılır. Molekulların ayrılması üç əsas növə bölünə bilər: ümumi istisna, seçici keçirmə və ümumi keçirmə həddi. Tam istisna böyük molekulların məsamələrə daxil ola bilmədiyi və sürətlə süzülə bilməyən hissəsidir. Seçici keçirmə bölgəsi üçün ara molekullar məsamələrə daxil ola bilər və onların ölçüsü və formasından asılı olaraq hissəciklərdə orta qalma müddətinə malik ola bilər. Ümumi keçirmə həddinə gəlincə, kiçik molekullar sütundakı məsamələrə daxil olduqdan sonra ən uzun qalma müddətinə malikdirlər [40]. Gel filtrasiyası əsaslı xromatoqrafiyanın üstünlüyü ondan ibarətdir ki, o, pH dəyişikliklərinə, metal ionlarının konsentrasiyasına və sərt ətraf mühit şəraitinə həssas ola bilən biomolekullar üçün uyğundur [39].

3.2.3. Yaxınlıq Xromatoqrafiyası

Yaxınlıq xromatoqrafiyası çirkləndiricilərdən ayrılmağa təsir etmək üçün zülal və bərk faza arasındakı xüsusi qarşılıqlı əlaqədən asılıdır. O, ion mübadiləsi xromatoqrafiyası ilə eyni mərhələlərdən ibarətdir [38]. O, zülalın bioloji funksiyası və ya fərdi kimyəvi quruluşu əsasında onu təmizləməyə imkan verir [41]. Liqandlar kimi xüsusi kimyəvi qruplara yüksək yaxınlığı olan zülallar kovalent olaraq sütun matrisinə bağlanır və digər zülallar sütundan keçir [38]. Elektrostatik və ya hidrofobik qarşılıqlı təsirlər, van der Waals qüvvələri və hidrogen bağı liqandlar və hədəf zülallar arasında bioloji qarşılıqlı təsirlərdir [41]. Bağlanmış zülallar liqandın yüksək konsentrasiyalı həll olunan formasını ehtiva edən məhlulla sütundan çıxarılacaq [36].

Xromatoqrafiya matrisinə kovalent şəkildə qoşula bilən biospesifik liqand, yaxınlığın uğurlu təmizlənməsi üçün tələblərdən biridir. Zülalların aktiv formada çıxarılmasına imkan vermək üçün liqand və hədəf zülal molekulları arasında bağlanma geri çevrilməlidir [41]. Çirkləndiriciləri yuduqdan sonra birləşdirilmiş liqand hədəf zülallara xüsusi bağlanma yaxınlığını saxlamalıdır. Yaxınlıq xromatoqrafiyasında adətən istifadə edilən bioloji qarşılıqlı təsirlərin bəzi nümunələri Cədvəl 1-də verilmişdir (bax [41]).

Muncuqlu məsaməli qatran üzərində hərəkətsizləşdirilmiş liqandlara diferensial yaxınlıq ilə xromatoqrafik ayrılma zülal tədqiqatı üçün əsasdır [42]. Yaxınlıq xromatoqrafiyası prinsipinə əsaslanan paketli muncuqlu afinite qatran sütunlarından ibarət tam dəst bazara təqdim edilmişdir [42]. Təcrübənin miqyasından və növündən asılı olaraq, yaxınlıq qatranı partiya və ya mikrosentrifuqa spin sütunu formatında istifadə edilə bilər. Bundan əlavə, o, bir növ daha böyük cazibə axını sütununa da qablaşdırıla bilər [42].

3.2.4. Gel elektroforezi

Gel elektroforezi zülalların ölçüsünə və yük xüsusiyyətlərinə görə ayrılması üsuludur. Xromatoqrafiya ayırmalarından qismən təmizlənmiş zülal denaturasiya etməyən poliakrilamid gel elektroforezi (PAGE) və ya yerli gel elektroforezi [4] ilə daha da təmizlənə bilər. PAGE-də zülallar jelləşdirilmiş matris vasitəsilə tətbiq olunan cərəyanla idarə olunur [43]. Zülalın bu gel vasitəsilə hərəkəti molekulların yük sıxlığından (kütlə vahidinə düşən yük) asılıdır. Yüksək sıxlıq yüklü molekullar sürətlə miqrasiya edirlər. Zülalın ölçüsü və forması PAGE fraksiyasına təsir edən digər iki vacib amildir [43]. Akrilamid məsamə ölçüsü müxtəlif ölçülü zülalları ayırmaq üçün molekulyar ələk rolunu oynayır [4]. Zülal nə qədər böyükdürsə, o qədər yavaş miqrasiya edir, çünki o, gelə daha çox qarışır [43]. Forma da amillərdən biridir, çünki kompakt qlobulyar zülallar müqayisə edilə bilən molekulyar kütləyə malik uzunsov lifli zülallardan daha sürətli hərəkət edir [43].

PAGE adətən natrium dodesil sulfat (SDS) [44] iştirakı ilə həyata keçirilir. SDS ilə müalicə olunan zülal adətən zülalın ikinci, üçüncü və dördüncü strukturunu aradan qaldırır [4, 7]. Birləşdirilmiş SDS molekulları arasında elektrostatik itələmə səbəbindən zülallar oxşar çubuq şəklində açılır. Zülala bağlanan SDS molekullarının sayı zülalın molekulyar kütləsi ilə təqribən mütənasibdir (təxminən 1,4 q SDS/q protein) [43]. Hər bir zülal növü ekvivalent yük sıxlığına malikdir və eyni qüvvə ilə geldən keçir [43]. Bundan əlavə, PAGE zülalların denatürasiyasını minimuma endirə bilər. SƏHİFƏ [7] işlədildikdən sonra bir çox zülallar hələ də bioloji fəaliyyətlərini saxlayırlar. Bununla belə, daha böyük zülallar kiçik zülallardan daha yüksək dərəcədə saxlanılır, çünki poliakrilamid yüksək dərəcədə çarpaz bağlıdır [43]. Nəticədə, zülallar molekulyar kütlələrinə görə SDS-PAGE ilə ayrılır. SDS-PAGE, zülallar qarışığının molekulyar kütləsini müəyyən etmək üçün istifadə oluna bilər, bu zolaqların mövqelərini məlum ölçülü zülallar tərəfindən istehsal olunanlarla müqayisə etməkdir [43]. Elektroforezdə istifadə edilən SDS ayrı-ayrı polipeptid zəncirlərinin uzunluğuna görə zülalların qarışığını həll edir [7].

İkiölçülü gel elektroforezi adlı texnika 1975-ci ildə Patrick O'Farrell tərəfindən işlənib hazırlanmışdır. O, iki fərqli texnikadan-izoelektrik fokuslama və SDS-PAGE [43] istifadə edərək zülalların mürəkkəb qarışıqlarını fraksiyalaşdırmaq üçün istifadə olunur. Birincisi, zülallar boruvari geldə izoelektrik nöqtəsinə görə ayrılır. Bu ayrıldıqdan sonra gel çıxarılır və SDS ilə doymuş poliakrilamid plitəsinin üstünə qoyulur. Zülallar plitə jelinə keçir və molekulyar kütlələrinə görə ayrılırlar [43]. İkiölçülü gel elektroforezi müxtəlif şəraitdə, inkişafın və ya hüceyrə siklinin müxtəlif mərhələlərində və ya müxtəlif orqanizmlərdə mövcud olan zülallarda dəyişiklikləri aşkar etmək üçün uyğundur [43].

3.2.5. Southwestern Blotting (İmmunoblotinq)

Southwestern blotting xüsusi oliqonukleotid zondlarına bağlanma qabiliyyətinə görə DNT bağlayan zülalları təcrid etmək, müəyyən etmək və xarakterizə etmək üçün istifadə edilən bir üsuldur [44, 45]. Hüceyrədəki DNT-ni bağlayan zülalların çoxunun gen funksiyasını təyin etmək üçün fərdi olaraq təcrid olunmalı və səciyyələndirilməlidir [44]. Bu üsul üç addımdan ibarətdir. Birincisi, nüvə protein ekstraktları SDS-PAGE elektroforezi ilə ayrılır. Sonra, ayrılmış zülallar nitroselüloz filtrinə, poliviniliden diflorid (PVDF) və ya kationik neylon membrana köçürülür [12]. Daha sonra filtr adsorbsiya edilmiş zülalları təhlil etmək üçün oliqonukleotid zondları ilə inkubasiya ediləcək [44, 45]. Bununla belə, bu texnika böyük miqdarda nüvə zülallarının tələb olunması (adətən 50-100 mq), təcrid zamanı zülalın deqradasiyası, səmərəli elektroforetik ayırma və zülalların geniş molekulyar ölçü diapazonunun ötürülməsində çətinliklərlə üzləşməsi kimi problemlərlə üzləşir [45] .

3.3. Hamısı bir yerdə biomolekulların çıxarılması

Ümumiyyətlə, bazarda mövcud olan ekstraksiya və ya təmizləmə üsulları və ya dəstləri hədəflənmiş orqanizmdən yalnız bir növ nuklein turşusunun, ya DNT və ya RNT və ya zülalın çıxarılmasına imkan verə bilər. Hüceyrə materialı məhdud olduqda, eyni mənbədən DNT, RNT və zülal çıxarmaq arzu edilir.

Chomczynski və Sacchi-nin (1987) tək addımlı izolyasiya metodunda bir dəyişiklik, guanidinium thycyanate homogenate fenol: xloroform ilə aşağı pH ilə ekstraksiya edilir, toxuma və ya hüceyrələrdən DNT, RNT və zülal hazırlamağa imkan verir. Bu üsul bir fazalı məhlulda guanidin izotiosiyanat və fenol ilə hüceyrələrin parçalanmasını nəzərdə tutur. İkinci faza xloroformun əlavə edilməsindən sonra meydana gəlir, burada DNT və zülallar çıxarılır və RNT sulu supernatantda qalır. DNT və zülallar üzvi fazadan etanol və ya izopropanol ilə çökdürülməklə, RNT isə sulu fazadan izopropanolla çökdürülməklə təcrid oluna bilər [15].

Hal-hazırda bazarda bir neçə hamısı bir yerdə çıxarma dəsti təqdim edilmişdir. Məsələn, fenol və ya xloroform kimi zəhərli maddələrin istifadəsi və spirt çöküntüsü olmadan eyni vaxtda tək bioloji nümunədən genomik DNT, ümumi RNT və ümumi proteini təmizləmək üçün nəzərdə tutulmuş sütun əsaslı ekstraksiya dəsti [46]. O, heyvan və insan mənşəli geniş çeşidli becərilmiş hüceyrələr və yığılmış toxumaların kiçik miqdarı ilə uyğun gəlir. DNT, RNT və zülalın təmizlənməsindən əvvəl hədəflənmiş nümunənin 3 hissəyə ayrılmasına ehtiyac yoxdur [46].

Bazarda mövcud olan məhlul əsaslı 3-ü 1-də ekstraksiya dəsti istənilən növ və ölçüdə müxtəlif orqanizmlərdən DNT, RNT və zülal çıxara və təmizləyə bilən qeyri-üzvi məhlullar dəstinin başqa bir nümunəsidir [47]. Təxminən 15-30 dəqiqə çəkən üç sadə addım protokolu müxtəlif biomolekulların çıxarılmasının sürətli və asan yolunu təmin edir. Buna görə də, daha yüksək məhsuldarlıq gözləmək olar, çünki daha az addım daha az itkiyə səbəb olur [47].

3.4. Avtomatlaşdırılmış çıxarma sistemi

Avtomatlaşdırılmış ekstraksiya sistemi, yüksək məhsuldarlıqlı nümunə emalı üçün nəzərdə tutulmuş böyük, bahalı və mürəkkəb cihaz, nuklein turşularının təcridini sadələşdirməyə kömək etmişdir [48]. Bu sistem son illərdə mövcudluğu artan orta və böyük laboratoriyalar üçün nəzərdə tutulmuşdur [49]. Nuklein turşusunun çıxarılması prosesinin avtomatlaşdırılması bir sıra səbəblərə görə potensial olaraq faydalıdır, o cümlədən iş vaxtını azaltmaq, əmək xərclərini azaltmaq, işçilərin təhlükəsizliyini artırmaq və ortada nəticələrin təkrar istehsalını və keyfiyyətini artırmaq imkanı verir [50]. Bundan əlavə, bu, laboratoriyanın səmərəliliyini artırmaq üçün əsas həll yoludur [48].

Klinik laboratoriyalarda DNT, RNT və zülal kimi yüksək keyfiyyətli biomolekulların müxtəlif başlanğıc materiallarından təmizlənməsi aşağı axın sınaq tətbiqlərində istifadə olunacaq. Təmizlənmiş nümunələrin kifayət qədər keyfiyyətdə və saflıqda əldə edilməsi çox vacibdir [48]. Buna görə də, avtomatlaşdırılmış çıxarışlar daha ardıcıl və təkrarlanmalıdır. Bütün hasilat prosesinin sürəti, dəqiqliyi və etibarlılığı maksimum olmalıdır və eyni zamanda çarpaz çirklənmə riskini minimuma endirməlidir [49]. Keyfiyyətdən ödün vermədən nümunənin hazırlanmasının səmərəliliyini artırmaq üçün həll yolu təqdim edilməlidir. Çarpaz çirklənmə ehtimalı azaldılmalı və sistemlər ştrix-kodlu nümunə izləmə imkanına malik olmalıdır [51].

Bazarda mövcud olan hasilat sistemi yuxarıda göstərilən tələblərə cavab verir. O, məhkəmə laboratoriyalarına yüksək keyfiyyətli avtomatlaşdırılmış DNT təmizliyi ilə yanaşı sürətli və etibarlı nümunə emalı təklif edir [52]. Nümunəni emal etmək və ardıcıl məhsuldarlıq və təmizliyi təmin etmək üçün paramaqnit hissəciklərlə işləmə sistemidir, çünki nümunələr arasında aşkar edilə bilən çarpaz çirklənmə yoxdur. Bütün ekstraksiya prosesi başlanğıcdan axıra qədər təxminən 20 dəqiqə çəkir, çünki yalnız üç sadə addım lazımdır: reagent patronuna maye nümunələri əlavə edin, reagent patronlarını maşına yerləşdirin, Start düyməsini basın. Prosesin sonunda DNT elüsyon tamponuna salınır [52].

Nuklein turşularının və zülalların çıxarılması üçün çevik və səmərəli olan avtomatlaşdırılmış sistemin başqa bir nümunəsi təqdim edilmişdir [53]. Kiçik və orta nümunə ötürmə qabiliyyəti üçün nəzərdə tutulmuş bu sistemdən istifadə etməklə müxtəlif başlanğıc materialları emal etmək olar. O, təcrid olunmuş nuklein turşusunu adsorbsiya etmək üçün səth funksiyalı paramaqnit hissəciklərdən istifadə etdi [53]. Bu sistemin çevikliyi eyni vaxtda on iki nümunədən nuklein turşusunun çıxarılmasına imkan verir. Çıxarma prosesi tətbiqdən asılı olaraq təxminən 20 ilə 40 dəqiqə çəkir. Bu sistem üçün optimallaşdırılmış dəstlər genomik DNT, hüceyrə RNT, viral və ya bakterial nuklein turşularını çıxara bilər [53].

4. Mümkün Gələcək İstiqamət

Biomolekulların çıxarılması sonrakı analiz və ya manipulyasiya prosesi üçün yerinə yetirilməli olan ilk addımdır. Maye ilə işləmə tələbi ən çətin aspektdir. Buna görə də, hər hansı bir avtomatik sistem yalnız hər bir hasilat mərhələsi üçün avtomatik avadanlıqları deyil, həm də maşınlar arasında mayenin ötürülməsini avtomatlaşdırmaq üçün avadanlıqları da əhatə etməlidir. Avtomatlaşdırma məhsuldarlığı artırmağa və prosesin etibarlılığını artırmağa kömək etdi, lakin bu sistemlər hələ də yalnız laboratoriya mühitində istifadə üçün nəzərdə tutulub. Bazarda mövcud olan bəzi nuklein turşusu ekstraksiya sistemləri böyükdür və texniki təcrübəyə malik laboratoriya işçiləri tərəfindən əl ilə əvvəlcədən emal mərhələlərini tələb edir [54]. Buna görə də, nuklein turşusunun çıxarılması üçün robotlaşdırılmış iş stansiyaları əsl “gəzinti” avtomatlaşdırmasını yerinə yetirməlidir ki, bu da tam avtomatlaşdırılmış proses deməkdir [49]. Hamısı bir yerdə biomolekulların çıxarılması məhlulunun və metodunun tam avtomatlaşdırılmış ekstraksiya sistemi ilə birləşməsi gələcəkdə perspektivli ixtira ola bilər. Müxtəlif orqanizmlərdən DNT, RNT və ya zülalın təmizlənməsi bu tip ekstraksiya sistemindən istifadə etməklə eyni vaxtda yalnız bir ekstraksiya üsulu ilə həyata keçirilə bilər.

Bir heyvandan, bitkidən və ya hətta klinik nümunədən məqsədyönlü biomolekullar nümunəsinin çıxarılması və təhlil edilməsi üçün laboratoriyaya göndərilməsi çox vaxt əlverişsizdir [54]. Nümunələr, xüsusilə qan kimi klinik nümunələr, soyudulmalı və ekstraksiya və analiz üçün ən yaxın laboratoriyaya köçürülməlidir. Beləliklə, azaldılmış əmək, azaldılmış tullantı və hasilat prosesinin sürəti kimi bir sıra üstünlüklər gətirən portativ biomolekulların çıxarılması sistemi gələcəkdə potensial inkişaf ola bilər [54]. Portativ ekstraksiya sisteminin DNT, RNT və ya zülal analizatoru ilə birləşməsi gələcəkdə tədqiqatçılara iş vaxtının azaldılmasında və iş səmərəliliyinin artırılmasında kömək etmək üçün yaradıla bilər.

Miniatürləşdirmənin davamlı təkmilləşdirilməsi laboratoriyada robot avtomatlaşdırmanın gələcək tendensiyası olacaqdır [28]. Bir çox klinik laboratoriya iş axınının təhlilini həyata keçirir və daha az ötürmə qabiliyyətinə malik daha kiçik sistemlərin klinik laboratoriya iş yükü ilə daha uyğun olduğunu aşkar edir. Bundan əlavə, bu avtomatlaşdırma sistemi nisbətən aşağı qiymətə həyata keçirilə bilər, işin dövriyyəsini yaxşılaşdırır və əmək xərclərini azaldır [55].

5. Nəticə

İlk DNT izolyasiyası 1869-cu ildə Friedrich Miescher tərəfindən uğurla həyata keçirildiyindən və 1958-ci ildə Meselson və Stahl tərəfindən sıxlıq qradiyenti sentrifuqa strategiyalarından inkişaf etdirilən ilk DNT ekstraksiyasından sonra, biomolekulların təmizlənməsi üçün bir çox texnika işlənib hazırlanmışdır. Quanidinium tiosiyanat-fenol-xloroform ekstraksiyasından DNT və RNT ekstraksiyasında geniş istifadə olunan sütun texnologiyasına və zülalların çıxarılması üçün istifadə edilən immunoblotinqin xromatoqrafiyasına qədər, biomolekulların çıxarılması tədqiqatçılara və alimlərə sonrakı molekulyar biologiya analizini manipulyasiya etməkdə kömək etdi. yerin bioloji materiallarını daha yaxşı başa düşmək.

Avtomatlaşdırılmış nuklein turşusu hasilatı sistemi müasir dövrdə avtomatlaşdırma texnologiyasının sürətli inkişafının təsiri ilə hazırlanmışdır. Nuklein turşusunun çıxarılması prosesinin avtomatlaşdırılması bir sıra səbəblərə görə potensial olaraq faydalıdır, o cümlədən iş vaxtını azaltmaq, əmək xərclərini azaltmaq, işçilərin təhlükəsizliyini artırmaq və eyni zamanda nəticələrin təkrar istehsalını və keyfiyyətini artırmaq imkanı verir. Bununla belə, bəzi alətlər üçün zəif cəhətlərin təkmilləşdirilməsi daima aparılmalıdır. Bu arada, hamısı bir yerdə biomolekulların çıxarılması sistemi və ya miniatür və portativ ekstraksiya sisteminin ixtirası gələcəkdə perspektiv inkişafa çevrilə bilər.

İstinadlar

  1. M. Wink, Molekulyar Biotexnologiyaya Giriş: Müasir Biotexnologiyada Molekulyar Əsaslar, Metodlar və Tətbiq, Wiley-VCH, Weinheim, Almaniya, 2006.
  2. K. Doyl, Kəşf mənbəyi: Protokollar və Tətbiqlər Bələdçisi, PROMEGA, Madison, Wis, ABŞ, 1996.
  3. L. Bukingem və M. L. Qüsurlar, Molekulyar Diaqnostika: Əsaslar, Metodlar, & Klinik Tətbiqlər, F.A. Davis, Filadelfiya, Pa, ABŞ, 2007.
  4. L. J. Cseke, P. B. Kaufman, G. K. Podila və C.-J. Tsai, Biologiya və Tibbdə Molekulyar və Hüceyrəvi Metodlar Kitabı, CRC Press, Boca Raton, Fla, ABŞ, 2-ci nəşr, 2004.
  5. G. Brooks, Səhiyyədə Biotexnologiya: Biofarmasevtiklərə Giriş, Pharmaceutical Press, London, Böyük Britaniya, 1998.
  6. K. Kojima və S. Ozawa, “Method for isolating and purifying nuklein acids”, Birləşmiş Ştatlar patenti US 2002/0192667 A1, dekabr 2002. Baxış: Google Scholar
  7. J. D. Watson, T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Lecine və R. Losick, Genin Molekulyar Biologiyası, Benjamin Cummings, San Francisco, Calif, USA, 5-ci nəşr, 2004.
  8. R. Dahm, Fridrix Mişer və DNT-nin kəşfi, Elsevier, Amsterdam, Hollandiya, 2004.
  9. D. Whitford, Zülallar: strukturu və funksiyası, John Wiley & Sons, London, Böyük Britaniya, 2005.
  10. J. T. Edsall, “Edvin Cozef Kon (1892�),” Bioqrafik xatirələr, cild. 35, səh. 47–83, Milli Elmlər Akademiyası, Vaşinqton, ABŞ, 1961. Baxış: Google Scholar
  11. S. V. Smarason və A. V. Smith, “Metod for desalting nuclein acids”, Birləşmiş Ştatlar patenti US 2003/0186247 A1, deCODE genetika ehf., Oktyabr 2003. Baxış: Google Scholar
  12. J. Sambrook və D. Russel, Molekulyar Klonlaşdırma: Laboratoriya Təlimatı, cild. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nyu-York, NY, ABŞ, 3-cü nəşr, 2001.
  13. P. Chomczynski və N. Sacchi, "Turşu guanidinium tiosiyanat-fenol-xloroformun çıxarılması ilə RNT təcridinin bir addımlı üsulu: iyirmi bir ildən sonra", Təbiət protokolları, cild. 1, yox. 2, səh. 581–585, 2006. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  14. H. C. Birnboim və J. Doly, "Rekombinant plazmid DNT-nin skrininqi üçün sürətli qələvi ekstraksiya proseduru" Nuklein turşularının tədqiqi, cild. 7, yox. 6, səh. 1513–1523, 1979. Baxın: Google Scholar
  15. J. Sambrook və D. Russel, Molekulyar Klonlaşdırma: Laboratoriya Təlimatı, cild.1, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nyu-York, NY, ABŞ, 3-cü nəşr, 2001.
  16. K.-H. Esser, W. H. Marx və T. Lisowsky, "Nuclein acid-free matrix: regeneration of DNT connecting columns" Biotexnika, cild. 39, yox. 2, səh. 270–271, 2005. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  17. D. T. Gjerse, L. Hoang və D. Hornby, RNT Təmizlənməsi və Təhlili: Nümunələrin Hazırlanması, Ekstraksiya, Xromatoqrafiya, Wiley-VCH, Weinheim, Almaniya, 1-ci nəşr, 2009.
  18. CE Smith, DL Holmes, DJ Simpson, J. Kayzhendler, RH Bitner, and JC Groseh, “Mixed-bed solid phase and its use in the izolyasiyası nuklein acids,” Birləşmiş Dövlət patenti ABŞ 2002/0001812 A1, Promega Corporation, yanvar 2002. Baxın: Google Scholar
  19. V. V. Padhye, C. York və A. Burkiewiez, “Silikat gel və şüşə qarışığı üzərində nuklein turşusu təmizləmə”, ABŞ patenti US 5658548, Promega Corporation, avqust 1997. Baxış: Google Scholar
  20. D. L. Woodard, A. J. Howard və J. A. Down, “Process for purifying DNT on hydrated silisium”, Birləşmiş Ştatlar patenti US 5342931, Becton, Dickinson and Company, avqust 1994. Baxış: Google Scholar
  21. K.-H. Esser, W. H. Marx və T. Lisowsky, "MaxXbond: DNT bağlayan silisium matrisləri üçün ilk regenerasiya sistemi" Təbiət üsulları, cild. 3, yox. 1, səh. 1–2, 2006. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  22. Davidson Kollecinin Biologiya Departamenti, “Geneclean ®,” http://www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/MolStudents/spring99/lauren/geneclean.html. Baxın: Google Scholar
  23. T. E. Arnold, M. T. Meyerinq və R. S. Çesterson, “Nuklein turşusu bağlama matrisi,” ABŞ patenti US 6869532 B2, CUNO Incorporated, Mart 2005. Baxış: Google Scholar
  24. D. A. Dederich, G. Okwuonu, T. Garner et al., "Məməli genomlarının yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı üçün plazmid şablon DNT-nin şüşə muncuq təmizlənməsi," Nuklein turşularının tədqiqi, cild. 30, yox. 7, məqalə e32, 2002. Baxın: Google Scholar
  25. M. C. Little, “DNT-nin diatomlu torpaqda təmizlənməsi prosesi”, ABŞ patenti US 5075430, Bio-Rad Laboratories Inc., dekabr 1991. Baxış: Google Scholar
  26. S. Berensmayer, “Nuklein turşularının ayrılması və təmizlənməsi üçün maqnit hissəcikləri”, Tətbiqi Mikrobiologiya və Biotexnologiya, cild. 73, yox. 3, səh. 495–504, 2006. Baxış: Nəşriyyat Saytı | Google Alim
  27. R. D. Nargessi, “Maqnit izolyasiyası və nuklein turşularının təmizlənməsi”, ABŞ patenti US 6855499 B1, Cortex Biochem, Inc., fevral 2005. Baxış: Google Scholar
  28. Bio-Nobile Oy, QuickPick TM Plazmid DNT, Bio-Nobile Oy, Turku, Findland, 2003.
  29. QIAGEN Inc., QAsifoniya ® DNT kitabçası, QIAGEN, Alameda, Kaliforniya, ABŞ, 2008.
  30. Tətbiqi Biosistemlər, MagMAX TM Total Nuklein Turşusu İzolyasiya Kiti, Applied Biosystems, Foster City, Calif, USA, 2008.
  31. Beckman Coulter, Inc. Agencourt ® AMPure ® Sistem: PCR Təmizləmə Sistemi, Beckman Coulter, Chaska, Minn, USA, 2009.
  32. BIOMOL GmbH, ArrayGrade mRNA Təmizləmə Dəsti İstifadəçi Təlimatı, BIOMOL GmbH, Hamburq, Almaniya, 2004.
  33. Thermo Scientific Inc., Pirs Güclü İon Mübadiləsi Spin Sütunları, Thermo Scientific, Nyu-Hempşir, NH, ABŞ, 2007.
  34. QIAGEN Inc., QIAGEN Genomik DNT Təlimatı, QIAGEN, Valensiya, Kaliforniya, ABŞ, 2001.
  35. D. B. Selinqson və E. J. Şrauder, “Bioloji nümunələrdən nuklein turşularının təcrid edilməsi və təmizlənməsi metodu”, Birləşmiş Ştatlar patenti US 4935342, Syngene Inc., iyun 1990. Baxış: Google Scholar
  36. QIAGEN Inc., Qproteome TM Məməli Zülalının Hazırlanması üzrə Təlimatlar, QIAGEN, Valensiya, Kaliforniya, ABŞ, 2006.
  37. R. J. Fido, E. N. Mills, N. M. Rigby və P. R. Shewry, "Bitki toxumalarından protein çıxarılması" Molekulyar Biologiyada Metodlar, cild. 244, səh. 21–27, 2004. Baxın: Google Scholar
  38. S. M. Wheelwright, Zülalların təmizlənməsi: Aşağı axın emalının dizaynı və miqyası, Carl Hanser, Nyu-York, NY, ABŞ, 1991.
  39. Gen Araşdırma Laboratoriyası, Gel filtrasiya tampon dəsti, Gen Araşdırma Laboratoriyası, Taypey, Tayvan, 2007.
  40. Bangalore Genei, GeNei TM Gel Filtrasiya Xromatoqrafiyası Tədris Dəsti Təlimatı, Bangalore Genei, Banqalor, Hindistan, 2007.
  41. Amersham Biosciences, Yaxınlıq Xromatoqrafiyası Prinsipləri və Metodları, Amersham Biosciences, Uppsala, İsveç, 2002.
  42. Thermo Scientific Inc., Muncuqlu Affinity Qatranını Sütunlara yığın, Thermo Scientific, Nyu-Hempşir, NH, ABŞ, 2008.
  43. G. Karp, Hüceyrə və molekulyar biologiya: anlayışlar və avadanlıqlar, John Wiley & Sons, London, Böyük Britaniya, 5-ci nəşr, 2008.
  44. B. Bowen, J. Steinberg, U. K. Laemmli və H. Weintraub, "DNT-ni bağlayan zülalların zülalların ləkələnməsi ilə aşkarlanması", Nuklein turşularının tədqiqi, cild. 8, yox. 1, səh. 1–20, 1980. Baxın: Google Scholar
  45. J. S. Handen və H. F. Rosenberg, "Cənub-qərb ləkələri üçün təkmilləşdirilmiş üsul", Bioscience-də sərhədlər, cild. 2, səh. 9–11, 1997. Baxın: Google Scholar
  46. QIAGEN Inc., Hamısına Hazırlıq ® DNT/RNT/Protein Mini Təlimat Kitabı, QIAGEN, Valensiya, Kaliforniya, ABŞ, 2007.
  47. “DeRiPRO, DNT, RNT və Zülalların Ekstraksiya Texnologiyası,” PCT/MY2008/000059, http://terra-ju.com/TLS.htm. Baxın: Google Scholar
  48. Promega Korporasiyası, Klinik Laboratoriyada İş axınının optimallaşdırılması üçün Personal Automation TM [pumflet], Promega, San Luis Obispo, Kaliforniya, ABŞ, 2008.
  49. J. Loeffler, K. D. Schmidt, H. Hebart və H. Einsele, "Avtomatlaşdırılmış nuklein turşusunun çıxarılması" Genomika və Proteomika Ensiklopediyası, səh. 93–96, 2004. Baxın: Google Scholar
  50. J. Boyd, “Robot laboratoriyasının avtomatlaşdırılması,” Elm, cild. 295, yox. 5554, səh. 517–518, 2002. Baxın: Google Scholar
  51. G. Watkins, “Automated DNT extraction,” http://www.ngrl.org.uk/Wessex/extraction.htm. Baxın: Google Scholar
  52. Promega Korporasiyası, Maksvell ® 16: Promega-dan Personal Automation TM, Promega, San Luis Obispo, Kaliforniya, ABŞ, 2006.
  53. Analitik Jena AG, InnuPure C12 Ekstraksiya Sistemi, Analytik Jena AG, Jena, Almaniya, 2007.
  54. D. Sadarangani, B. MacDonald, AG Rodrigo və D. Saul, “DNT analizi portativ robotik alətdən istifadə etməklə,” http://www.ele.auckland.ac.nz/~macdon/general/files/acra03- dsbmards.pdf. Baxın: Google Scholar
  55. A. Thomsin, “Insights into lab automation's future,” IVD Technology, yanvar 2007. Baxış: Google Scholar

Müəllif hüququ

Müəllif hüququ © 2009 Siun Chee Tan və Beow Chin Yiap. Bu, Creative Commons Attribution License əsasında paylanmış açıq giriş məqaləsidir və orijinal əsərə lazımi sitat gətirmək şərti ilə istənilən mühitdə məhdudiyyətsiz istifadəyə, paylanmağa və təkrar istehsala icazə verir.


Videoya baxın: Zülallar təsadüfən yarana bilərmi? (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Tayte

    Bunu demək olmaz.

  2. Nenos

    Remarkable, useful thought

  3. Kazigore

    Sən çox istedadlı insansan

  4. Mozes

    Aktualdır. Xahiş edirəm mənə deyin - bu mövzuda daha çox məlumat tapa bilərəm?

  5. Reed

    Təəssüf ki, sizə kömək edə bilmərəm. Düşünürəm ki, düzgün həll yolu tapacaqsınız.



Mesaj yazmaq