Məlumat

Bakteriya və Arxeyada müəyyən bir genin bolluğunu necə ölçmək olar?

Bakteriya və Arxeyada müəyyən bir genin bolluğunu necə ölçmək olar?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

16s rDNT metagenomik analizi üçün aşağıdakı addımları yerinə yetirməliyəmmi?

DNT çıxarılması-> Təmizləmə-> PCR gücləndirilməsi-> Klon -> Hər bir koloniyanı seçin-> PCR gücləndirin -> Ardıcıllıq -> Filogenetik Analiz

Müəyyən bir gen bolluğunun bolluğu üçün hansı addımları izləməliyəm? Klonlaşdırmaq lazımdırmı?

'


Giriş

Bir çox yerüstü yaşayış yerləri P və N əsas qida maddələrində məhduddur (Elser et al. 2007). Əsas qaya materialının P konsentrasiyası, daxili bağlanmış üzvi P-nin dövriyyəsi və P-nin torpaq hissəciklərinə sorbsiyası ən əsası meşə torpaqlarında P-nin mövcudluğunu müəyyən edir, çünki gübrə çətin ki, rol oynayır (Walker və Syers 1976). P hovuzlarındakı dəyişikliklər mikrob fəaliyyəti ilə güclü şəkildə idarə olunur və mikrob icmasının tərkibindən və onun fəaliyyət modelindən asılıdır (Richardson and Simpson 2011 Rodríguez et al. 2006). Əksinə, torpaqdakı P hovuzlarının tərkibi mikrob icmalarını formalaşdırır və onların funksional potensialını müəyyən edir (Bergkemper et al. 2016a). Bununla belə, təkcə P hovuzları və P-nin mövcudluğu P transformasiya proseslərinə təkan vermir, həm də ümumi qida stoxiometriyası mikroorqanizmlər öz biokütlələrində makronutrientlərin sabit nisbətini saxladıqları üçün mikrob P dövriyyəsinə güclü təsir göstərir (Klivlend və Liptzin 2007). Məsələn, Sorkau et al. (2018) müxtəlif mülayim meşə rayonlarının torpaqlarında mikrob P və N-nin müsbət korrelyasiyasını təsvir etmişdir. Üstəlik, torpaqda bioavailable P fraksiyaları və potensial olaraq N-ni təyin edə bilən mikroblar arasında müsbət korrelyasiya tapıldı (Bergkemper et al. 2016a). Əksinə, qeyri-üzvi P (Pi) məhdudiyyət müvafiq genlərin nəzarəti altında olduğu üçün N assimilyasiyasını sıxışdıra bilər Pho regulon, iki komponentli sistem tərəfindən idarə olunan bir neçə geni ehtiva edən, təsbit edən Pi ətraf mühitdə konsentrasiyalar (Santos-Beneit 2015). N, P və ya C kimi bitkilərdə mövcud olan qida maddələrinin ən yüksək dövriyyəsi torpaqda rizosfer və ya drilosfer kimi bioloji qaynar nöqtələr üçün təsvir edilmişdir (Hoang et al. 2016 Kuzyakov and Blagodatskaya 2015 Lipiec et al. 2016 Reinhold-Hurek 2015ulz et al. və başqaları 2013 Uksa və başqaları 2015). Belə qaynar nöqtələr kimi bioloji torpaq qabıqlarını (biocrusts) hesab etmək olar. Bioqrustlarda əsasən fototrofik siyanobakteriyalar, mikroyosunlar, likenlər və ya mamırlar kimi orqanizmlər üstünlük təşkil edir ki, bunlar sistemə qida maddələrinin daxil olmasını təmin edir. Arxeya, bakteriya və ya göbələk kimi əlaqəli heterotrof mikroorqanizmlərlə birlikdə, məsələn, polisaxaridlərin ifrazı ilə sabit mikrohabitatlar yaradırlar (Cania et al. 2020 Mugnai et al. 2018, Vuko et al. 2020). Bioloji qabıqlar daha çox quraq və qida maddələri olmayan yaşayış yerlərində tədqiq edilmişdir (Belnap və başqaları 2001), burada onlar üstünlük təşkil edən bitki formasıdır və onların böyüməsi su və qida maddələrinin mövcudluğu ilə məhdudlaşır. Bu bölgələrdən gələn bioqrustlar yerüstü N.-nin təxminən yarısını təşkil edir2 fiksasiya (Elbert et al. 2012). Üstəlik, Beraldi-Campesi et al tərəfindən nümayiş etdirildi. (2009) ki, bioqrustlar təkcə N ilə zəngin deyil, həm də Klivlend və Liptzin (2007) tərəfindən təklif edildiyi kimi balanslaşdırılmış qida konsentrasiyalarının əhəmiyyətini vurğulayan daha yüksək ümumi P konsentrasiyası ilə birlikdə gəlir. Mülayim bölgələrdə bioqrustları qida maddələrinin dövriyyəsi üçün qaynar nöqtələr kimi təsvir edən daha az şey məlumdur və yalnız bir neçə tədqiqat mövcuddur (Baumann et al. 2019 Brankatschk et al. 2013 Corbin and Thiet 2020 Gypser et al. 2016 Schaub et al. 2019). 2016 Szyja et al. 2018), xüsusən də meşələr kimi yaxşı inkişaf etmiş ekosistemlərdə (Baumann et al. 2017 Glaser et al. 2018 Williams et al. 2016). Meşələrdə quru və nəm çökmə ilə atmosfer P girişləri də öz töhfəsini verir, çünki meşələr suvarılan, yüksək mayalanmış kənd təsərrüfatı torpaqlarından gələn hissəciklər üçün də toz tələləridir (Aciego et al. 2017 Berthold et al. 2019) və onlar polimerik matrisdə sıxışdırıla bilər. bioqabıqlar. Bununla belə, P hovuzlarına nisbi qatqı böyük ölçüdə torpağın P konsentrasiyasından asılıdır (Aciego et al. 2017). Mülayim meşələrdə P transformasiyasında bioqrustların rolu Baumann və digərləri tərəfindən təsvir edilmişdir. (2017), quraq bölgələrdən olan bioqabıqlara bənzər olaraq, bioqrustlarda P konsentrasiyalarının bitişik toplu torpaqlarla müqayisədə zənginləşdiyini aşkar etmişlər. Bundan əlavə, onlar bioloji qabıqlarda toplu torpaqla müqayisədə xüsusilə P tərkibli mineralların konsentrasiyasının azaldığını və üzvi P konsentrasiyasının artdığını nümayiş etdirdilər. Beləliklə, biz fərz edirik ki, (i) bioqrustları kolonizasiya edən mikroorqanizmlər mineral P-nin həll edilməsində və onun biokütləyə çevrilməsində iştirak edir və beləliklə, həmin mikroorqanizmlərin bolluğu bioloji qabıqlarda toplu torpaqla müqayisədə daha yüksəkdir. (ii) P və N dövriyyəsinin bir-biri ilə sıx əlaqəli olduğu güman edildiyinə görə, biz daha sonra belə bir fərziyyə irəli sürürük ki, P minerallaşmasına bənzər, həmçinin N minerallaşması potensialı bioqrustlarda daha çox nəzərə çarpır, çünki daha yüksək mikrob bolluğu, enerji tələb edən fiksasiya isə Qida elementləri ilə zəngin olan meşə torpaqlarından olan bioqabıqlarda N az əhəmiyyət kəsb edir. (iii) N və P dövriyyəsi arasındakı korrelyasiyanın gücü böyük həcmdə qruntun N/P nisbətindən asılıdır.

Bu fərziyyələri yoxlamaq üçün mülayim fıstıq ağacından bioqrust və toplu torpaq nümunələrini müqayisə etdik (Fagus sylvatica L.) meşələr, torpaq teksturasında, qida maddələrinin konsentrasiyalarında və pH dəyərlərində bir gradient boyunca. Nümunələr bioqrustların biokütləsinin ən yüksək olduğu zaman bir dəfə götürülüb. Mülayim meşələrdə bioqabıqların ömrü qısa olduğundan (onlar adətən yalnız qış dövrünün sonunda ağacların yarpaqları əmələ gəlməzdən əvvəl baş verir) və bioqabıqların ölçüsü kiçik olduğundan onlar hər mövsüm yeni inkişaf edir, bu da eyni bioqrutun təkrar nümunə götürülməsini istisna edir, biz təkrar nümunələrdən çəkindik, əksinə təhlil edilən təkrarların sayını artırdıq. P mineralizasiyasını kataliz edən zülalları kodlayan bakterial genlər (qələvi fosfataz-PhD fosfonoasetaldehid hidrolaza -phnX), həllolma (quinoprotein qlükoza dehidrogenaz).-gcd) və qəbulu (fosfat ABC daşıyıcısının substrat bağlayan zülalı—pstS aşağı yaxınlıqlı Pi daşıyıcısı -pitA) həmçinin N minerallaşması (bakterial xitinaz qrupu A—chiA qələvi metalloproteaza -aprel) və N2 fiksasiya (nitrogenazanın dinitrogenaz reduktaza alt bölməsi)nifH) müvafiq funksional bakterial qrupların bolluğu üçün proksi kimi istifadə edilmişdir. P və N dövriyyəsində iştirak edən bakterial genlərin bolluğunu ölçmək üçün qPCR-dən istifadə etdik və məlumatları sabit və labil P və N hovuzları ilə əlaqələndirdik.


Giriş

Mikroorqanizmlər tərəfindən həyata keçirilən azotun biogeokimyəvi dövrü əvvəllər müxtəlif mühitlərdə, o cümlədən torpaqlarda, mənsəblərdə, çöküntülərdə, mərcan ekosistemlərində, şirin su və okean ekosistemlərində tədqiq edilmişdir. İndiyə qədər ən intensiv öyrənilmiş proses həm bakteriya, həm də arxelər tərəfindən həyata keçirilə bilən ilkin nitrifikasiya mərhələsi (ammonyak oksidləşməsi) olmuşdur (Prosser və Nicol, 2008). Arxeyanın kəşfindən bəri amoA Açıq okeanda (Venter et al., 2004) və torpaqda (Treusch et al., 2005) aparılan metagenomik tədqiqatlardan (ammiak monooksigenaz alt vahidi alfa) ammonyak oksidləşdirən arxeya (AOA) üstünlük təşkil edən ammonyak oksidləşdirici kimi tanınıb. müxtəlif mühitlərdə, o cümlədən torpaqlarda (Leininger və digərləri, 2006) və dəniz ekosistemlərində (Beman və digərləri, 2007) mikrob icması. Arxealın aşkarlanması amoA qələvi torpaq (Shen və s., 2008), isti bulaq çöküntüləri (Reigstad et al., 2008) və soyuq dərin dəniz suyu (Nakagawa et al., 2007) kimi sərt şəraitdə ardıcıllıqlar bütün dünyada hər yerdə mövcud olduğu haqqında ümumi fərziyyəni dəstəkləyir. AOA. AOA icması üçün müəyyənedici ətraf mühit amilləri aşağıdakılar ola bilər: ammonium səviyyələri, üzvi karbon, temperatur, duzluluq, həll olunmuş oksigen səviyyəsi, pH, sulfid və fosfat səviyyələri (Erguder et al., 2009). AOA ekologiyası haqqında çoxlu müfəssəl məlumatlar artıq tərtib edilmişdir (Erguder et al., 2009).

tərəfindən kodlanan nitrat reduktaza narGHJI operon nitratın nitritə çevrilməsindən məsuldur (Philippot və Hojberg, 1999). İki növ nitrit reduktaza nitritin azot oksidinə çevrilməsini kataliz edir: sitoxrom cd1 tərəfindən kodlanmışdır nirS, və ya ilə kodlanmış Cu tərkibli ferment nirK. Azot oksidi sonradan kodlaşdırılan azot oksidi reduktaza tərəfindən azaldılır. norB, güclü istixana qazı olan azot oksidi istehsal edir. Azot oksidi qlobal istiləşməyə və iqlim dəyişikliyinə karbon dioksid və ya metandan daha çox kömək edir. Denitrifikasiyanın son mərhələsi, azot oksidi reduktaza ilə kodlanan azot oksidinin qaz halında olan dinitrogenə çevrilməsidir. nosZ. Bununla belə, bəzi denitrifikatorlar tam denitrifikasiya üçün tələb olunan genlərin tam dəstlərini ehtiva etmir (Zumft, 1997).

Antarktikanın yerüstü ekosistemi də iqlim dəyişikliyinə məruz qalır. Səth temperaturu artım tempi son 50 ildə hər on ildə orta hesabla 0,1 °C-dən çox olmuşdur (Steig et al., 2009). İqlim dəyişikliyi modellərinin əksəriyyəti ümumi illik yağıntıların və temperaturun artacağını, həmçinin bu dəyişikliklərin təsirinin qütb bölgəsində daha çox olacağını proqnozlaşdırır (Maxwell, 1992). Torpağın rütubətindəki dəyişikliklər mikrob aktivliyinə, üzvi maddələrin dövriyyə sürətinə və minerallaşma yolu ilə ammoniumun mövcudluğuna təsir edəcəkdir. Buna görə də Antarktika torpaqlarında azot dövrü iqlim dəyişikliyindən təsirlənəcək. Azotun fiksasiyası bu prosesdə mənfi rəy kimi fəaliyyət göstərən azot mövcudluğunun artması ilə maneə törədilə bilər. Artan minerallaşma nitrifikasiyanı sürətləndirə bilər və öz növbəsində denitrifikasiyanı və azot oksidi istehsalını təşviq edə bilər (Paul və Clark, 1996). Bununla belə, qütb bölgəsində azot dövranı ilə bağlı tədqiqatlar ilk növbədə okean ekosistemlərində aparılmışdır və yalnız amoA azot fiksasiyası və ya denitrifikasiya genləri istisna olmaqla, bu halların bir çoxunda maraqlı olmuşdur. Azot dövrü və iqlim dəyişikliyinin təsirləri hələ Antarktika torpaqlarında adekvat qiymətləndirilməmişdir. Buna görə də, bu tədqiqatın əsas məqsədi azot yolunun hər bir addımında iştirak edən genlərin bolluğunu qiymətləndirərək azot dövrü potensialını qiymətləndirmək idi. Mikrobların istiləşmə effektlərinə reaksiyaları və qida maddələrinin mövcudluğu mikrokosmos miqyasında qiymətləndirilmişdir.


Təşəkkürlər

B.L. NERC Alqoritmi PhD Tələbəsindən (NE/F008864/1) və NERC tərəfindən maliyyələşdirilən Oceans 2025 proqramından (Mövzu 3: Sahil və şelf prosesləri) dəstəyi qəbul edir. RV-nin ekipajına təşəkkür edirik Sepiya çöküntülərin yığılmasında köməklərinə görə.

Şəkil S1. Qərbi İngilis Kanalında Jennycliff Körfəzində (5,3497 N, 04,1331 W) aylıq pelajik qida konsentrasiyalarının dəyişməsi. (A) nitrit, (B) nitrat, (C) ammonium, (D) silikat, (E) fosfat. Daxil edilmiş əfsanələr suyun dərinliyini metrlərlə göstərir. Məlumatlar PML Bentik Sorğu Məlumat İnventarındandır (Woodward və b., 2013). (F) Hər ay üçün orta dəyəri birləşdirən xətlərlə Qərbi İngilis Kanalında L4 sahəsi (50,225 N, 04,1944 W) üçün aylıq temperaturun (qapalı dairələr qara xətt) və duzluluğun (açıq almazların boz xətti) dəyişməsi. Məlumatlar Qərb Kanalı Rəsədxanasının Məlumat İnventarındandır (Fishwick, 2013).

Cədvəl S1. Çöküntü nümunəsi strategiyası.

Cədvəl S2. Kəmiyyət polimeraza zəncirvari reaksiya (q-PCR) analizləri üçün istifadə olunan primer cütləri və reaksiya şərtləri. Bütün analizlər üçün q-PCR gücləndirilməsi və aşkarlanması ABI 7000 ardıcıllıq aşkarlama sistemindən (Applied Biosystems, Carlsbad CA, ABŞ) istifadə edərək 95°C-də 5 dəqiqə ərzində ilkin denaturasiya və ardınca 15 üçün 95°C-də 40 dövrə ilə həyata keçirilib. s və 1 dəqiqə ərzində aşağıda sadalanan yumşalma temperaturları. Bütün reaksiyalar 25 μl son həcmdə aparılıb, bu reaksiya həcmi üçün son primer konsentrasiyaları göstərilib. Hər reaksiya üçün standart əyri ABI Prism 7000 ardıcıllıq aşkarlama proqramından istifadə etməklə hesablanmışdır. Standart əyridən, yamac (m), y kəsmə və təyin əmsalı (r 2 ) E = (10 1/) tənliyindən istifadə edərək gücləndirmənin effektivliyini (E) hesablamaq üçün qeydə alınmış və istifadə edilmişdir. m − 1) × 100. Hər bir reaksiyanın səmərəliliyinin hesablanması üçün qiymətlər, həmçinin hədd dövrünün qiyməti (CT), avtomatik analiz parametrlərindən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir.

Cədvəl S3. Burrow (B) və səth (S) çöküntülərində orta gen bolluğunda (gen nüsxəsi g -1 yaş çöküntü) mövsümi dəyişkənlik və oxşar dəniz mühitləri və oxşar gen primerlərindən istifadə üçün ədəbiyyatda bildirilmiş bolluqlarla müqayisə. Tam məlumat Dryad Digital Repository-dən əldə edilə bilər (doi: təsdiq edilməlidir). Mütləq gen bolluğu standart əyrilərdən istifadə edərək hesablanmışdır r 2 , y Cədvəl S2-də verilmiş kəsmə və səmərəlilik dəyərləri.

Nəşriyyatçı müəlliflər tərəfindən verilən hər hansı dəstəkləyici məlumatın məzmununa və ya funksionallığına görə məsuliyyət daşımır. İstənilən sorğu (çatışmayan məzmundan başqa) məqalə üçün müvafiq müəllifə ünvanlanmalıdır.


Mikrob populyasiyasının genomikası icma ekologiyasına necə məlumat verə bilər?

Populyasiyalar ekologiya və təkamülün əsas vahidləridir, lakin biz onları bioloji mənalı şəkildə bakteriya və arxeya üçün müəyyən edə bilərikmi? Burada populyasiya strukturunun mikroblarda niyə tanınmasının çətin olduğunu və müasir gen axınının ölçülməsində əldə edilən son nailiyyətlərin yaxından əlaqəli genom kolleksiyaları arasında aydın şəkildə müəyyən edilmiş populyasiyaları müəyyən etməyə imkan verdiyini nəzərdən keçiririk. Belə struktur bioloji mexanizmlərə əsaslanan populyasiyaları müəyyən edərək, birgəyaşayış və genetik oxşarlığın səbəb olduğu üstünlüklü gen axınından yarana bilər. Biz göstəririk ki, bu cür gen axını vahidləri xüsusi uyğunlaşmaların yayılması üçün kifayət qədər genetik olaraq təcrid olunub və onları həm də ən yaxın qohumları ilə müqayisədə diferensial uyğunlaşan ekoloji vahidlər halına gətirir. Bu müşahidələrin ətraf mühitdə bakterial və arxeal müxtəlifliyin ölçülməsi üçün təsirlərini müzakirə edirik. Biz göstəririk ki, 16S rRNA gen ardıcıllığı ilə müəyyən edilmiş əməliyyat taksonomik vahidləri ekoloji cəhətdən müəyyən edilmiş populyasiyalar üçün olduqca zəif həllediciliyə malikdir və metagenomikadan istifadə edən icma ekoloji tədqiqatlarında əhalinin xəritələşdirilməsi üçün alternativ tədbir kimi demək olar ki, eyni ribosomal protein genlərinin monofiletik klasterlərini təklif edir. Bu populyasiyaya əsaslanan yanaşmalar insan və ətraf mühit mikrobiomlarında geniş mikrob müxtəlifliyini şərh etmək üçün çox ehtiyac duyulan aydınlığı təmin etmək potensialına malikdir.

Bu məqalə “Mikrob icmalarının ekologiyasında konseptual problemlər” mövzusunun bir hissəsidir.

1. Giriş

Hər hansı bir giriş biologiya dərsliyini götürün və yəqin ki, populyasiyaların genetik quruluşunda dəyişiklik kimi müəyyən edilən təkamülü tapa bilərsiniz. Növlərin yerli olaraq birlikdə mövcud olan nümayəndələri kimi müəyyən edilərək, populyasiyalar praktikada həm də ekoloji qarşılıqlı əlaqəni, eləcə də ekosistemin sabitliyini və dayanıqlığını qiymətləndirmək üçün növ müxtəlifliyini ölçmək istədiyimiz zaman istifadə olunan müxtəliflik vahidləridir [1]. Mikroblar üçün isə populyasiyaları müəyyən etmək çox çətin olmuşdur [2] və biz icmaların genetik quruluşunu ölçmək üçün ixtiyari müxtəliflik vahidlərindən istifadə edirik [3]. Populyasiyaların müəyyən edilməsində bu çətinlik, təbii ki, bakteriya və arxeya üçün bioloji mənalı növ konsepsiyasının olmaması ilə bağlıdır [3-6]. Aydın şəkildə müəyyən edilmiş populyasiyalar olmadan, icma ekologiyasındakı ən fundamental sualların bir çoxuna cavab vermək çətindir. Məsələn, pozğunluqlar populyasiyalar daxilində genotipik tərkibində dəyişikliklərə və ya növ dövriyyəsinə səbəb olurmu? Bu imkanlar arasında fərq qoymaq mənalı sualdır, çünki populyasiya daxilində genotipdəki dəyişikliklər növlərin tərkibindəki topdan dəyişikliklərlə müqayisədə ekoloji şəbəkələri daha az poza bilər. Həqiqətən də, bu sual əsas mikrob icmalarının, o cümlədən insan mikrobiomunun dinamikasını başa düşmək üçün əsasdır.

Bakteriya və arxeal populyasiyaların və genişlənmə növlərinin müəyyən edilməsi, buna görə də icma ekologiyası üçün vacib bir cəhddir, lakin biz bunu edə bilərikmi? Mikrob müxtəlifliyi bioloji mənalı xassələri aid edə biləcəyimiz təbii vahidlərə təşkil olunubmu? Konkret olaraq, fundamental təkamül prosesləri bir yerdə mövcud olan genotipləri uyğunlaşmaların xüsusi şəkildə yayıla biləcəyi vahidlərə təşkil edirmi və aydın şəkildə fərqli dinamikləri olan ekoloji vahidlərə səbəb olurmu? Əgər biz mikrob populyasiyalarını belə müəyyən edə bilsək, onda heyvanlar və bitki populyasiyaları üçün işlənmiş zəngin təkamül və ekoloji nəzəriyyəni tətbiq edə bilərik [7,8] olmasa, o zaman əsaslı şəkildə fərqli nəzəriyyə və yanaşmalara ehtiyacımız ola bilər [2]. .

Burada bakteriyaların genetik olaraq aydın şəkildə müəyyən edilmiş, ekoloji cəhətdən fərqlənmiş populyasiyalarda təşkil edilib-edilməməsi sualını araşdırırıq. Biz iddia edirik ki, bakterial və arxeal rekombinasiya, həm homoloji, həm də qeyri-homoloji, biristiqamətli və qeyri-adi olsa da, ekoloji quruluş və seçmə ekoloji cəhətdən fərqlənmiş vahidlərin yaranması üçün gen axını kifayət qədər strukturlaşdırmaq potensialına malikdir. Sonra bu cür vahidlərin tanınmasının niyə bu qədər çətin olduğunu müzakirə edəcəyik və göstəririk ki, yalnız çox yeni gen axını təxmin etməklə, gen axını və ekologiyanın uyğun vahidləri həqiqətən bərpa olunur. Hələ çoxlu nümunələrə ehtiyac olsa da, bu vahidlər populyasiyaların bakterial və arxaeal ekvivalenti ola bilər və onların identifikasiyası son nəticədə mikrob növləri probleminin həllinə kömək edə bilər. Biz ətraf mühitdə bioloji mənalı müxtəlifliyin ölçülməsi üçün nəticələr çıxarmaqla yekunlaşdırırıq.

2. Bakteriyalar və arxeyalar arasında aydın şəkildə müəyyən edilmiş populyasiyalar tapacağımızı gözləməliyikmi?

Gen axını hər hansı bir mikrobun, prinsipcə, hər hansı digər [9,10] ilə genləri paylaşa bilməsi mənasında potensial pozğun olsa da, o, yalnız yerli ekoloji vahidlər kimi populyasiyalar üçün üstünlük təşkil edən uyğunlaşmaların yayılmasına imkan verəcək qədər strukturlaşdırılmalıdır. meydana çıxır [11,12]. Nəzərə alın ki, müəyyən yaşayış mühitini tutan populyasiyalar bir yerdə yaşadıqları və oxşar funksiyaları yerinə yetirdikləri üçün oxşar seçmə təzyiqləri altında olan fərdlərdən ibarətdir (şəkil 1). Belə yaşayış yerləri torpaqda və ya su mühitində kiçik üzvi hissəciklər və ya müəyyən fiziki və kimyəvi xassələri olan daha geniş su obyektləri ola bilər [13-15]. Bununla belə, əsas odur ki, yaşayış yerləri demək olar ki, həmişə yamaqsız və efemerdir və onlar icma daxilindəki bir qrup populyasiyanın üstünlüklü artım vasitəsilə bolluğun artmasına imkan verir [13,16-18].Nəticə olaraq, aktiv populyasiyaların genetik materialı paylaşma ehtimalı daha yüksəkdir, çünki homoloji rekombinasiya dərəcələri ardıcıllıq fərqi ilə eksponent olaraq azalır [19,20] və güzəştli mikrohabitat assosiasiyaları daha yüksək qarşılaşma nisbətlərini təmin edir (şəkil 1).

Şəkil 1. Mikrob populyasiyaları arasında gen axınının böyüklüyü əsasən həmin populyasiyaları təşkil edən ayrı-ayrı ştammların genetik oxşarlığı və ekoloji üst-üstə düşməsi ilə formalaşır. Homoloji rekombinasiyanın səmərəliliyi ardıcıllıq fərqi ilə eksponent olaraq azalsa da, oxşar fiziki boşluqları tutan suşlar arasında daha çox fiziki təmasda köçürmə ehtimalı artır. (Rəngli onlayn versiya.)

Aktiv böyüyən genotiplərin bu artan qarşılaşması və rekombinasiyası ekoloji birliyin yaradılması və saxlanması üçün mühüm nəticələrə malikdir [12]. Əgər populyasiya daxilində uyğunlaşma yaranarsa, uyğunlaşmanı daşıyan genotiplərdə üstünlüklü gen axını və uyğunluq artımının birləşməsi sayəsində populyasiyada daha asan yayılacaqdır [11]. Başqa sözlə, seçimin gücü və rekombinasiya sürəti arasındakı tarazlıqdan asılı olaraq, uyğunlaşma seçmə yolu ilə populyasiyaya yayıla bilər [12,21]. Uyğunlaşma digər birlikdə mövcud olan populyasiyalar üçün faydalıdırsa, onun müəyyən bir populyasiya üçün uyğunluq üstünlüyü qısa ömürlüdür, çünki üfüqi gen transferi, ehtimal ki, onu digər populyasiyalar üçün əlçatan edir [22]. Bununla belə, uyğunlaşmanın daşınması ilə uyğunlaşmalar əlaqəli olarsa, ssenari tamamilə fərqli ola bilər, yəni o, fərqli genomik və ya ekoloji fonda yaxşı işləməyə bilər [12,23,24]. Əgər belədirsə, uyğunlaşma daha uzun müddət populyasiyaya və ya növə xas qala bilər və ekoloji differensiasiyanı həyata keçirə bilər. Uyğunlaşmanı daşıyan genotiplər yeni yaşayış mühitinə daha uyğundur, lakin əcdadların yaşayış mühitinə daha az uyğundursa, uyğunlaşmalar da növləşmə prosesini başlata bilər [12,23]. Bu təsir fiziki ayrılmaya səbəb ola bilər və beləliklə, yeni yaranan populyasiyalar arasında gen axını maneəsi yarada bilər [12,25].

Yuxarıda müzakirə olunan mübadilələri müəyyən etmək çox vaxt çətindir, çünki onlar çox yaxınlarda müəyyən edilmiş populyasiyaların araşdırılmasını tələb edir. Daha fərqli növlər arasında çoxlu genetik dəyişikliklər adətən yığılıb, eləcə də mübadilə ilə əlaqəli xüsusiyyəti müəyyən etmək üçün itirilib. Bir bariz nümunə okeanda yenicə müəyyən edilmiş bakteriya populyasiyalarındandır [26]. Müqayisəli genomik yanaşma iki populyasiyanı müəyyən etdi Vibrio cyclitrophicus Okean nümunələrində diferensial şəkildə paylanmış, biri üzvi hissəciklərlə əlaqəli, digəri isə sərbəst yaşayan. Hər iki populyasiyada onları fərqləndirən genom bölgələri, o cümlədən spesifik allelin bu yaxınlarda araşdırıldığını göstərən çox azalmış nukleotid müxtəlifliyi olan bölgələr, həmçinin son populyasiyaya xas əlavələr və ya itkilərdən gözlənildiyi kimi diferensial gen mövcudluğunu göstərən bölgələr var idi. Bu fərqləndirici allel və genlərdən bəziləri biofilmin əmələ gəlməsi və bağlanması ilə açıq şəkildə əlaqələndirilmişdir ki, bu da zərrəciklərlə birləşmə qabiliyyətinin populyasiyalardan birində itirildiyi və ya qazanıldığı fərziyyəsinə səbəb olmuşdur [26].

Müşahidə olunan genetik fərqlərə əsaslanan diferensial uyğunlaşmanın bu fərziyyəsi sonradan iki populyasiyanın nümayəndələrinin davranış müşahidələri ilə təsdiqləndi ki, bu da rəqabət-dağılma mübadilə təklifini irəli sürdü [27]. Mikrofluidics okeanda kiçik hissəciklərin bakteriyaların bərk üzvi materialı birləşdirə və parçalaya biləcəyi yaşayış mühitini təmsil etdiyi şəraitə bənzəyən ekoloji mənzərə yaratmaq üçün istifadə edilmişdir [13,16]. Bu deqradasiya prosesinin özü həll olunmuş üzvi materialın yamaqlarının müvəqqəti yaşayış mühitini yaradır, çünki birləşmiş bakteriyalar üzvi polimerləri hüceyrədən kənarda parçalanma məhsullarını hüceyrəyə idxal edə bildiklərindən daha tez parçalayır [16]. Diffuziya yolu ilə hissəcik ətrafında mono- və ya oliqomerlərdən ibarət bulud əmələ gəlir və bu material hərəkətli bakteriyalar tərəfindən istehlak edilə bilər [28]. Belə şərtlər mikrofluidik sistemdə təqlid edildikdə, iki populyasiya müvafiq olaraq bərk və həll olunmuş resurslara differensial şəkildə uyğunlaşdırılmış göründü. Biri hissəciklərə yapışaraq və biofilmlərdə böyüyərək cavab versə də, digəri hissəciklər arasında səmərəli səpələnmə, onları sürətlə aşkar etmək və yeni hissəciklərə doğru üzmək qabiliyyətinə malik idi [27]. Bu onu göstərir ki, sonuncu populyasiya həqiqətən də efemer, həll olunan qida yamaqlarının istismarına daha yaxşı uyğunlaşır, birincisi isə bərk üzvi materialın deqradasiyasına yol verir. Sübut etmək çətin olsa da, genomik müqayisədən belə nəticəyə gəlindi ki, bu davranış fərqləri növləşmə prosesində iştirak edib, çünki diferensial uyğunlaşmalar genomlarda asanlıqla bir yerdə mövcud ola bilməyən ekoloji uyğunlaşmanı təmsil edir.

Baxmayaraq ki, yuxarıda göstərilən nümunə populyasiya genomikasının incə miqyaslı ətraf mühit nümunələri ilə birlikdə gücünü nümayiş etdirsə də, bu yaxınlarda müəyyən edilmiş populyasiyaların kəşfi yenə də təsadüfi idi. İzolyasiyaları diferensiallaşdırmaq üçün marker kimi istifadə edilən zülal kodlaşdıran genin əvvəlcə bir süpürgə bölgəsi ilə əlaqələndirilməsi və beləliklə, bu iki populyasiyanı aydın şəkildə fərqləndirməsi kömək etdi [26]. Əksər hallarda əhalinin strukturu haqqında nəticə çıxarmaq mümkün deyil a priori və bunun əvəzində belə nəticəyə gəlmək üçün bəzi müxtəliflik ölçüsünün ətraf mühit nümunələri üzərində xəritələndiyi yanaşma tələb olunur. Biz daha sonra yalnız genetik məlumatlara əsaslanaraq bakteriya və arxeya arasında populyasiya və ya növ sərhədlərini tanımaqda bu çətinliyin səbəblərini təsvir edəcəyik.

3. Nə üçün populyasiyaları müəyyən etmək bu qədər çətindir?

Bu yaxınlarda yazdığı rəydə Rocha [2] neytral təkamül nəzəriyyəsinin işığında bakterial (və arxeal) populyasiya genetikasında çətinlikləri qeyd etdi. Ən mühüm problemlərdən biri odur ki, tədqiqat obyektinin qeyri-səlis təbiətinə görə müəyyən edilməsi demək olar ki, qeyri-mümkün olmuşdur. Oxşar arqumentlər əvvəllər növ sərhədləri üçün də edilmişdir [29]. Bu cür qeyri-səlislik, müxtəlif topologiyalarla nəticələndiyi üçün genom üzrə çoxsaylı lokusların filogenetik ağaclarında müşahidə olunur. Yəni klasterləşmə müşahidə olunsa da, müxtəlif genlər nəzərə alındıqda, onların fərqli təkamül tarixini əks etdirən uyğunsuzluq olur [29,30]. Bu yaxınlarda çıxan bir kağız, hətta rekombinasiyanın bu qədər azğın olduğunu iddia etdi Escherichia coli çoxluq ağacı olmadığını təcrid edir, baxmayaraq ki, paradoksal olaraq, oxşar ağac həmişə fərqli daha böyük genom bölgələri üzərində orta hesabla çıxarılır [31]. Bir çox rekombinasiya qiymətləndirmə metodlarında olduğu kimi, fərdi genlər populyasiyanın klonal tarixini (yaxud klonal çərçivəni) əks etdirməli olan konsensus ağacı ilə müqayisə edildikdə bu, potensial problem yaradır. Ümumiyyətlə, bu müşahidələr filogenetik metodların populyasiyaların və növlərin müəyyənləşdirilməsində problemlərlə qarşılaşa biləcəyini göstərir.

Filogenetik üsullarla bağlı problem onların çox uzun təkamül zaman çərçivələri üzərində inteqrasiyası ola bilər ki, bu da əhalinin differensasiyası üçün faydalı olsun. Xüsusilə, son zamanlar təyin edilmiş populyasiyalar arasında genomun yalnız çox kiçik bir hissəsi onlar arasındakı fərqi dəstəkləyir [26]. Bu yaxınlarda qeyd olunan iki əsərin təhlilində yaxşı əks olunur V. siklitrofik paylaşdıqları hər bir genomik bölgənin özünəməxsus təkamül tarixinə malik olduğu və hər iki populyasiyanın tamamilə qarışmış göründüyü populyasiyalar [26]. Bu açıq-aydın paradoksdur: populyasiyaya xas süpürgələr müşahidə edilərkən əhali sərhədləri arasında rekombinasiya necə ola bilər? Cavab filogenetik müqayisələrin birləşdiyi zaman şkalasındadır. Yalnız ən son rekombinasiya hadisələrini təhlil etmək üçün metod işlənib hazırlandıqda, bunlar populyasiyalarda daha tez-tez baş verirdi. Bu, iki populyasiyanın ümumi rekombinasiya tarixini paylaşdığı halda, populyasiyadan sonrakı ən son rekombinasiya hadisələrinin populyasiyaya xas olduğunu göstərir [26].

Rekombinasiyanı ölçmək üçün nəzərdə tutulmuş bir çox üsul belə, spesifikasiya hadisələrini tutmaq üçün çox uzun olan təkamül zaman çərçivələri üzərində inteqrasiya problemindən əziyyət çəkə bilər. Bu yaxınlarda biz sadə bir təcrübə keçirdik, burada klonal olaraq inkişaf edən bir qrup genom arasında rekombinasiya partlayışını təqlid etdik və mutasiyalar yığıldıqca rekombinasiya siqnalının necə çürüdüyünü müşahidə etdik [32]. Rekombinasiya homoplaziyaların identifikasiyasına əsaslanan iki fərqli üsulla təhlil edildikdə, gen axını dayandırıldıqdan çox sonra hələ də xeyli siqnal var idi. Bunun səbəbi, homoplaziyaların təsadüfi mutasiya prosesi tərəfindən yavaş-yavaş silinməsidir, beləliklə onların ölçülməsinə əsaslanan metodlar uzun müddət ərzində inteqrasiya olunur və yalnız müasir rekombinasiya prosesini tutmur. Uzun müddət ərzində bu cür inteqrasiya, yaxından əlaqəli populyasiyalar və ya hətta növlər müqayisə edildikdə problemli olur və populyasiya və ya növlərin sərhədlərini düzgün bərpa etmək üçün daha müasir gen axını təhlil edə bilən metodlara ehtiyac olduğunu göstərir [32].

4. Müasir populyasiya strukturu kontekstində gen axınını qiymətləndirə bilərikmi?

Mövcud üsullar növləri və ya populyasiya sərhədlərini bərpa edə bilmirsə, bu cür sərhədləri düzgün müəyyən edə biləcək alternativ varmı? Biz bu yaxınlarda iki genom arasında rekombinasiyanın homogenləşdirici gücünün ölçülməsinə əsaslanan və digər üsullarla müqayisədə daha yeni gen transferini müəyyən etməyə qadir olan belə bir üsul təklif etmişik [32]. Gen köçürmə qrupları (PopCOGenT) kimi populyasiyalar adlanan bu üsul digərlərindən fərqlənir ki, o, paylaşılan eyni genom bölgələri vasitəsilə son gen transferini təxmin edir (şəkil 2). İki yaxından əlaqəli genom arasındakı bu cür eyni izlər şaquli irsiyyət və ya üfüqi gen transferi yolu ilə yarana bildiyi üçün PopCOGenT sadə şaquli (klonal) irsiyyət modelindən istifadə edərək ikisini fərqləndirir. Əgər iki genom rekombinasiya olmadan mutasiya yığılması ilə klonal şəkildə ayrılırsa, onlar tək nukleotid polimorfizmlərinin Poisson modeli ilə qiymətləndirilə bilən eyni bölgələrin xarakterik uzunluğu və tezlik paylanmasına malik olacaqlar [32]. Bu gözləntidən yuxarı olan eyni bölgələrdə əhəmiyyətli zənginləşmə gen transferinin təxmini kimi xidmət edə bilər (şəkil 2). Gen köçürmə siqnalı genomların 0,1% ayrılması üçün lazım olan müddət ərzində böyüklük sırası ilə parçalanır və buna görə də PopCOGenT digər üsullarla müqayisədə gen transferinin daha müasir ölçüsünü təmin edə bilər [32].

Şəkil 2. “Gen köçürmə qrupları kimi populyasiyalar” (PopCOGenT) metodu hər hansı iki genom tərəfindən paylaşılan eyni ardıcıllığın uzunluqlarının paylanmasını ölçməklə son üfüqi gen transferinin miqdarını təxmin edir. Bu paylanmanı klonal təkamülün sıfır modeli (i) ilə müqayisə edərək, PopCOGenT üfüqi gen transferi sayəsində “transfer meylini” müəyyən edir. Genomlar arasında üfüqi köçürmə dayandırıldıqdan sonra bu köçürmə meyli mutasiyaların yığılması səbəbindən sürətlə çürüyür. (Rəngli onlayn versiya.)

Əhəmiyyətli odur ki, PopCOGenT tərəfindən təmin edilən gen transferi ölçüsü rekombinasiyanın genetik müxtəlifliyi necə strukturlaşdırdığını araşdırmaq üçün şəbəkə qurmaq üçün istifadə edilə bilər (şəkil 3). Şəkil 3-də göstərilən nümunədə fərdi genomlar aralarında müxtəlif miqdarda gen axını göstərir. Bəzi təcridlər aydın şəkildə təcrid olunmuş çoxluq təşkil edir, digərləri isə xeyli gen axını ilə bağlı qalır, lakin daha zəif birləşmiş alt qruplara strukturlaşdırılır. Aşağıda təfərrüatlı olduğu kimi, xam gen axını şəbəkəsinə sadə klasterləşdirmə alqoritmini tətbiq etməklə belə alt qrupları müşahidə etmək olar. Üstəlik, PopCOGenT qoşa düzülmələrlə işlədiyinə görə, o, bütün paylaşılan bölgələri populyasiyada bütün təcridlər tərəfindən paylaşılıb-paylaşılmamasından asılı olmayaraq müqayisə edə bilər. Beləliklə, həm əsas, həm də çevik genomda bu yaxınlarda paylaşılan genetik material, yəni populyasiyada müvafiq olaraq bütün və ya izolatların alt qrupları tərəfindən paylaşılan gen tamamlayıcısı nəzərə alına bilər.

Şəkil 3. PopCOGenT ətraf mühitdən əldə edilən təcrid və ya tək hüceyrəli genomların cüt-cüt bütöv genom düzülüşü vasitəsilə populyasiyaları müəyyən edir. Çox vaxt ştammların çoxlu genom düzülüşündən və ya birləşdirilmiş marker genlərindən (solda) hazırlanmış filogenetik ağaclardan bioloji cəhətdən mənalı populyasiyalara necə qruplaşdırılması aydın deyil. Bundan əlavə, bu filogenetik ağaclardakı müxtəliflik yalnız əsas genomik bölgələrin təkamül tarixini təsvir edə bilər. PopCOGenT cüt-cüt uyğunlaşdırmalar həyata keçirməklə, hər hansı iki genom tərəfindən paylaşılan bütün bölgələr üzrə gen transferini təxmin edir və sərt şəxsiyyət kəsiklərinə (ortada) etibar etmədən populyasiya strukturunu müəyyən edir. Bəzi populyasiyalar gen axını ilə digər qruplardan tamamilə ayrılsa da, digərləri bir-birinə bağlı olaraq qalır və əsas populyasiya strukturu geniş şəkildə əlaqəli suşların alt qruplarını müəyyən edən klasterləşmə yolu ilə aşkar edilir (sağda). Genomların təcrid olunmuş çoxluqları, genetik təcridin bioloji növ anlayışının tərifi tələbi ilə paylaşdıqları xüsusiyyətlərə görə növ kimi hesab edilə bilər. (Rəngli onlayn versiya.)

Əhali strukturu təxmin edilən bir neçə bakterial və arxeal model sistemlərinə tətbiq edildikdə (ekoloji və fizioloji məlumatlar ilə birləşdirilmiş populyasiya genomikasından istifadə etməklə), PopCOGenT orijinal proqnozları təkrarlaya bildi [32]. Bu model sistemlər kritik testi təmsil edir, çünki hər birinin ətraf mühit nümunələrindəki diferensial dinamika da daxil olmaqla birləşən xassələri ilə seçilən yaxından əlaqəli bacı populyasiyalardan ibarət olduğu göstərilmişdir. PopCOGenT bu model sistemlərdən genomlar arasında gen axını şəbəkəsi qurmaq üçün istifadə edildikdə, xam şəbəkə əvvəllər müəyyən edilmiş genetik və ekoloji vahidlərə yüksək dərəcədə uyğun gələn gen axını çoxluqlarına strukturlaşdırılmışdır.

Xam gen axını şəbəkəsindəki bu ilkin klasterlərin digər bu cür çoxluqlarla heç bir əlaqəsi yox idi, bu, bir çox ekoloji populyasiyalar arasında son gen axınının mahiyyətcə aşkar edilmədiyini göstərir [32]. Sadə bir klasterləşdirmə alqoritmi tətbiq edildikdə, bəzi hallarda əlavə struktur aşkar edildi, yəni. Bu alt qruplar həmçinin son vaxtlar bir-birindən ayrılmış populyasiyaların iki modelini təkrarladılar V. siklitrofikSulfulobus icelandicus [26,33], göstərir ki, PopCOGenT daha zəif gen axını fasilələri ilə ayrılmış yeni yaranan populyasiyaları düzgün müəyyən edə bilir [32]. Məlumat dəstlərindən biri də əsasən okean siyanobakteriyasının tək hüceyrələrindən gücləndirilmiş genomlardan ibarət idi. Proxlorokokk. Belə bir hüceyrəli genomları ənənəvi üsullarla müqayisə etmək adətən çətindir, çünki təsadüfi sahələrdə natamamdır. Bununla belə, PopCOGenT natamam məlumatları idarə edə bilər, çünki o, cütlər arasında kifayət qədər üst-üstə düşmə mövcud olduğu müddətdə ikili müqayisələrə əsaslanır. Kifayət qədər məlumatı təşkil edən şey zəif tədqiq edilir və məlumat dəstləri də əlaqəli olmayan genomlar arasında gen transfer əlaqələri kimi qiymətləndirilə bilən DNT-ni çirkləndirməklə asanlıqla çaşdırıla bilər. Buna baxmayaraq, təkhüceyrəli genomlarla populyasiya genomikasını həyata keçirmək və beləliklə, yan addımlarla becərmə potensialı PopCOGenT-nin potensial üstünlüyüdür. Ümumiyyətlə, yaxından əlaqəli genomlar arasında çoxluqların və alt qrupların müşahidəsi göstərir ki, yalnız gen axınının təxminlərindən genetik və ekoloji vahidləri fərz etmək üçün istifadə edilə bilər. Ancaq bu vahidlər arasında düzgün sərhədlərin müəyyən edildiyinə necə əmin ola bilərik?

5. Proqnozlaşdırılan populyasiya strukturunun bioloji cəhətdən mənalı olub olmadığını necə yoxlaya bilərik?

Bu suala cavab vermək üçün genetik və ekoloji vahidlərin uyğun olması üçün uyğunlaşmaların növ və ya populyasiyaya xas şəkildə yayıla bilməsi arqumentinə qayıdırıq. Buna görə də kritik sınaq ən yaxın qohum olan bacı populyasiyalarını fərqləndirən xüsusiyyətlərin olub-olmamasıdır. Spesifikasiya modellərinin hər iki nümunəsi V. siklitrofikS. islandicus kimi xassələrin müəyyən oluna biləcəyini təklif edir [26,33]. Buna görə də biz gen axını analizinin məntiqini populyasiyaya xas şəkildə süpürülən allellərin və genlərin müəyyən edilməsinə qədər genişləndirdik [32] (şəkil 4). Yenidən təhlil etdik Ruminococcus gnavus sağlam fərdlərdən, həmçinin Crohn xəstəliyi və xoralı kolitli xəstələrdən təcrid olunmuş genomlar [34]. PoCOGenT-nin tətbiqi üç alt qrupa malik birləşdirilmiş şəbəkəni göstərdi, onlardan ikisi populyasiyaya məxsus allellər və ya genlər şəklində uyğunlaşmaları yoxlamaq üçün kifayət qədər nümunə götürülmüşdür [32]. Bu uyğunlaşmaların son vaxtlar populyasiyaya xas araşdırmalar nəticəsində meydana çıxması üçün, populyasiyaların genomları üzrə orta nukleotid müxtəlifliyi ilə müqayisədə onları kodlayan allellərdə və ya genlərdə xeyli azalmış müxtəliflik göstərməlidirlər.

Şəkil 4. Gen axını ilə müəyyən edilən populyasiyaların və növlərin əsas funksiyası onların adaptiv əlamətlərin yayıldığı və yayıldığı əsas vahidlər olmasıdır. Allellər populyasiya tərəfindən əldə edildikdə (ya de novo mutasiya və ya uzaq qohumdan üfüqi alınma yolu ilə), həmin allellər homoloji rekombinasiya yolu ilə eyni populyasiyanın digər üzvlərinə ötürülə bilər. Bundan əlavə, əgər bu əlamətlər ev sahibinin uyğunluğunu əhəmiyyətli dərəcədə artıran bir niş-spesifik fayda təmin edərsə, seçim sayəsində həmin populyasiyada sabitləşəcəklər. Nəticə etibarilə, genomları müqayisə edərkən bu bölgələrin əlamətdar xüsusiyyəti seçilmiş lokusda yerli olaraq azalmış nukleotid müxtəlifliyidir. Bu yaxınlarda selektiv yoxlamalardan keçmiş bu bölgələrin müşahidəsi proqnozlaşdırılan populyasiya strukturunun bioloji cəhətdən mənalı olduğunun faydalı təsdiqidir. Həqiqətən, təsadüfi əhali qrupları ardıcıl olaraq süpürülən bölgələrin müəyyən edilməsinə mane olur.

Orta populyasiya ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə azalmış nukleotid müxtəlifliyinə malik genom bölgələrini müəyyən etmək üçün boru kəməri hazırlandıqda (şəkil 4), əsas genomda bir neçə allel və elastik genomda olan genlər hər iki populyasiyanı fərqləndirən müəyyən edilmişdir [32]. Bu bölgələrin hamısı əlaqəsiz idi və genom üzrə paylanmışdı ki, bu da onların bir-birindən müstəqil şəkildə yarandığını göstərir. Bu allellərin və genlərin bir çoxunu şərh etmək mümkün deyildi, lakin bir neçə kodlanmış səth zülalları, onların ətraf mühitlə əlaqə formasında iştirak etdiyini göstərir. Buna görə də, bu nəticələr, gen axınının rekombinasiya yolu ilə uyğunlaşmaların yayılmasına imkan vermək üçün populyasiyaya xas şəkildə kifayət qədər qərəzli olduğunu göstərir və düzgün ekoloji vahidlərin müəyyən edilməsinin güclü təsdiqi kimi xidmət edir.

6. Üfüqi gen transferi altında populyasiya strukturu necə inkişaf edə bilər?

Müasir gen axınında aydın şəkildə müəyyən edilmiş çoxluqların müşahidəsi, bəzi hallarda “rampant” [35] adlandırılan üfüqi gen transferinin müşahidələri ilə necə uzlaşdırıla bilər? Divergent genetik materialın bakterial və arxeal genomlara davamlı qəbulu və daxil edilməsinə dair çoxlu sübutlar mövcuddur [25]. Yəni, hər bir hüceyrə hər hansı bir anda istənilən sayda başqa mikrobdan yeni əldə edilmiş genləri saxlaya bilər. Divergent genlərin belə birləşməsi təcridlərin filogenetik qruplaşmasına təsir göstərsə də, burada təklif etdiyimiz kimi, populyasiyalar daxilində gen axını onların arasında olduğundan xeyli yüksək olarsa, populyasiya strukturunu maskalamaq üçün gen axını şəbəkəsini kifayət qədər pozmayacaq. Üstəlik, əgər gen axını kifayət qədər təsadüfi olarsa, o, populyasiyalar arasında ştammları az və ya çox təsadüfi bir şəkildə əlaqələndirəcək, beləliklə əlaqələr kifayət qədər strukturlaşdırılmamış olacaqdır. Həqiqətən də, əldə edilmiş genlərin çoxu, ehtimal ki, alıcının genomuna ən azı bir qədər zərərli olarsa, kifayət qədər tez itirilə bilər [11]. Beləliklə, populyasiyalar və ola bilsin növlər üfüqi gen köçürülməsi sayəsində həqiqətən qeyri-səlis vahidlərdir, lakin gen axını uyğunlaşmaların müəyyən bir şəkildə süpürülməsinə imkan vermək üçün populyasiyadaxili rekombinasiyaya kifayət qədər qərəzli olarsa, bu cür qeyri-səlislik onların ekoloji vahidlər kimi müəyyən edilməsini istisna etmir.

Fərqli mənbələrdən genetik materialın daimi nümunəsi, əslində, uyğunlaşma üçün xammal təmin edə bilər [11]. Təkamül innovasiyasının genlərin genomuna üfüqi əlavə edilməsi ilə yarana biləcəyi geniş şəkildə qəbul edilsə də, hətta allelik süpürgələrin populyasiya daxilində mutasiya ilə deyil, üfüqi şəkildə yaranma dərəcəsi bu yaxınlarda differensiasiya olunmuş yeniliklərin son təhlilində təəccüblü idi. Ruminokokk yuxarıda müzakirə olunan populyasiyalar. Müəyyən edə bildiyimiz adaptiv allellərin böyük əksəriyyəti üfüqi olaraq fərqli mənbələrdən əldə edilmişdir [32]. Eynilə, eyni polisaxaridin müxtəlif fiziki formaları üçün okean bakteriyalarının yaxından əlaqəli populyasiyalarını fərqləndirən adaptiv şüalanma genlərin əldə edilməsi və itirilməsi dinamikasına əsaslanırdı [36]. Hətta eyni polisaxarid liyazların çoxsaylı nüsxələri, hər genomda yeddi nüsxədə mövcud olan bəzi fermentlər də daxil olmaqla, dublikasiyadan daha çox köçürmə yolu ilə yaranmışdır. Bu müşahidələr müxtəlif genomların əvvəlki analizinə uyğundur ki, bu da eyni genom daxilində genlərin təkrarlanmasının mikroblarda nadir olduğunu göstərdi [37]. Bu, duplikasiyaların ümumi olduğu və təkamül innovasiyasının genom daxilində mutasiya nəticəsində yarandığı eukariotlardan əsas fərqdir [38].

7. Əhali strukturunun proqnozlarına dair potensial xəbərdarlıqlar hansılardır?

Nəzərə alsaq ki, nəticələr indiyə qədər təəccüblü dərəcədə yüksək təcrid olunmuş gen axını qruplarının mövcudluğunu nümayiş etdirir, üfüqi köçürmənin populyasiya strukturunu maskalaya və ya silə biləcəyi potensial ssenarilər varmı? Bu aspekt zəif tədqiq edilir, lakin ən azı bir neçə ssenari təsəvvür edilə bilər. Mikroblar arasında rekombinasiya dərəcələri olduqca dəyişkəndir [32,39] və çox aşağı olarsa, başqa bir populyasiyadan daha böyük bir gen dəstinin daxil edilməsi nəzərdən keçirilən populyasiyada genomların alt dəsti ilə güclü əlaqə yarada bilər, bu da populyasiya strukturunun təhlilini çaşdırır. . Ən çox ehtimal olunan ssenari, həm donor, həm də alıcı populyasiyada müsbət seçim altında olan və beləliklə, genomların böyük bir hissəsini birləşdirən böyük mobil genetik elementi (MGE) alan aşağı rekombinasiya nisbətlərinə malik olan populyasiyadır. Belə bir hal, məsələn, antibiotik müqavimətli plazmidin güclü antibiotik seçimi altında mikrobiomdan keçdiyi halda baş verə bilər. Beləliklə, populyasiya strukturunun MGE ilə və ya onsuz sınaqdan keçirilməsi və ya antibiotik müalicəsinə məruz qalmamış nümunələrdən yaxından əlaqəli genomların daxil edilməsi məsləhət görülür. Üstəlik, ola bilsin ki, bir-biri ilə əlaqəli iki populyasiya birdən-birə bəzi ekoloji dəyişikliklərə görə oxşar nişlər tutur. Birgə baş verən bu cür dəyişiklik, xüsusən seçim altında olarsa, gen axınının artmasına imkan verə bilər və bəziləri üçün nəzərdə tutulduğu kimi despesiasiyaya səbəb ola bilər. Campylobacter heyvan mikrobiomlarında növlər [40]. Baxmayaraq ki, bu tip vəziyyətlər təhlil etdiyimiz model sistemlərdə müəyyən edilənlərdən daha az aydın olan populyasiya strukturuna səbəb ola bilər, gen axını nümunələri buna baxmayaraq, bioloji cəhətdən aktualdır və ətraf mühitin seçilməsi ilə bağlı maraqlı fərziyyələrə səbəb ola bilər.

Biz vurğulayırıq ki, hər hansı əhali strukturu proqnozu özlüyündə bir fərziyyədir və seçmə və digər amillərdən təsirlənə biləcəyi üçün diqqətlə təhlil edilməlidir. Bununla belə, biz hesab edirik ki, əgər populyasiyalar gen-spesifik süpürgələr kimi spesifik uyğunlaşma imzalarını daşıyırsa (şəkil 4), bunlar proqnozlaşdırılan populyasiyanın ekoloji vahidi və buna görə də icma ekologiyası üçün ən uyğun vahidi təmsil edən ən güclü sübut kimi xidmət edir. .

8. Gen axını ilə müəyyən edilən populyasiyaların əsas xüsusiyyətləri hansılardır?

Burada müəyyən edilən populyasiyaların diqqət çəkən cəhətlərindən biri onların əsas genomlarında, yəni hamı tərəfindən paylaşılan genlərdə nisbətən aşağı nukleotid müxtəlifliyinə malik olmasıdır. İndiyədək təhlil edilən həm bakteriyaların, həm də arxeyaların genomları, adətən, populyasiyalar daxilində nukleotid ardıcıllığında 98%-dən çox oxşardır ki, bu da populyasiya strukturunun proqnozlaşdırılması üçün fərqli yanaşmadan əldə edilən məlumatlara uyğundur [41]. Belə yüksək oxşarlıq həm də populyasiyalar daxilində homoloji rekombinasiyanın effektiv qalmasını təmin edərdi, çünki onun sürəti ardıcıllıq fərqi ilə eksponent olaraq azalır [19,20]. Onu da qeyd etmək lazımdır ki, bu aşağı dəyərlər heyvan və bitki növləri daxilində nukleotid müxtəlifliyi ilə kifayət qədər uyğundur. Məsələn, insan genomları insan istinad insan genomu ilə müqayisədə nukleotid yerlərinin ən çoxu 0,2%-i ilə fərqlənir [42].

Əgər gen axını ilə müəyyən edilən populyasiyalar növlərin yerli nümayəndələri kimi qəbul edilərsə, onlar populyar növ tərifinin əsasına çevrilmiş orta nukleotid eyniliyinin (ANI) müqayisəsi nəticəsində yarananlardan əhəmiyyətli dərəcədə daha dar müəyyən edilir [43,44]. . ANI müxtəlif genom qrupları arasında müqayisə edildikdə, bir qayda olaraq, ehtimal edilən növ sərhədi olan 95% ANİ səviyyəsində minimum müşahidə olunur [44]. Bununla belə, bu sərhəd bəzi rekombinasiya üsulları ilə təxmin edilən populyasiya sərhədləri ilə bağlı yuxarıda qeyd edilənlərə oxşar səbəblərə görə populyasiya və ya növ sərhədlərinə uyğun gəlmir. Gen axını spesifikasiyaya görə azaldıqdan sonra yeni yaranan növlər arasında genetik oxşarlıq pozulacaq, çünki rekombinasiya artıq homojenləşdirici qüvvə kimi çıxış etmir [25]. Bununla belə, bu çürümə yavaş bir prosesdir və genetik oxşarlıq siqnalının minimuma çatması xeyli vaxt tələb edir [32]. Beləliklə, populyasiya və ya növ sərhədi 95% oxşarlıq dəyəri daxilində ola bilər və ən əsası, son zamanlar müəyyən edilmiş populyasiyalar tanınmaya bilər, çünki onların genomları kifayət qədər fərqlənmir və bu yaxınlarda nümayiş etdirildiyi kimi ekoloji və ya xəstəlik birliklərini maskalayır [26,32,45] . Beləliklə, onların sadəliyi üçün müraciət edərkən, ANI minimumlarının bioloji mənalı növlərin sərhədlərini müəyyən edə biləcəyi sual altındadır.

Gen axını ilə müəyyən edilən populyasiyaların digər mühüm xüsusiyyəti pan-genomun kifayət qədər böyük ölçüdə qalmasıdır [46]. Yəni, genomların paylaşılan genlər arasında çox yaxından əlaqəli olmasına baxmayaraq, paylaşılmayan xeyli sayda gen nümayiş etdirirlər. Bu genlərin çoxu qeyd olunmamış qalır və populyasiya biologiyası üçün onların rolu qeyri-müəyyəndir. Bununla belə, çevik genomun ən azı qismən mənfi tezlikdən asılı seçim altında ola biləcəyini göstərən misalların sayı getdikcə artır. 46]. Bu təsir, ictimai sərvət istehsalı və yırtıcılıq kimi orqanizmin qarşılıqlı təsiri üçün xüsusilə güclü ola bilər. Məsələn, bəzi genotiplər tərəfindən sideroforların istehsalının istehsal genləri olmayan, lakin qəbuledici genləri saxlayan fırıldaqçıların təkamülü ilə müşayiət olunduğu göstərilmişdir [47,48]. Üstəlik, viral reseptorlar və müdafiə genləri tez-tez çevik genomla əlaqələndirilir ki, bu da onların populyasiyanı məhv edən spesifik viruslara qarşı qorunma kimi populyasiyalar daxilində yüksək bolluğa yüksələ bilməyəcəyini göstərir [46,49,50]. Nəhayət, artan sübutlar var ki, bu cür çevik genom bölgələri cinah bölgələrinin homoloji rekombinasiyası yolu ilə üstünlüklə populyasiyalar arasında paylaşıla bilər, belə ki, təkrar-təkrar de novo əldə etmək əvəzinə, bir çox çevik bölgələr populyasiyanın biologiyasının bir hissəsidir [46].

9. Ətraf mühitdə müxtəlifliyin ölçülməsi üçün hansı nəticələr var?

Gen axınına əsaslanan populyasiya strukturunun fərziyyə edilməsi və sonra populyasiyaya xas süpürgələrin identifikasiyası ilə fərziyyənin sınanması yanaşması yalnız genomik məlumatlardan ekoloji vahidləri proqnozlaşdıran tərs ekoloji yanaşmaya imkan verir [32,51]. Bu yolla, yanaşma güclü seçim altında allelləri və genləri vurğulamaqla mikrob populyasiyalarında şaxələnməyə səbəb olan mühüm dəyişənləri müəyyən etmək üçün qərəzsiz bir çərçivə təmin edə bilər. Beləliklə, bu yanaşma ştammların ətraf mühitin qradiyenti boyunca düşdüyü yeri dəqiq ölçə bilmək üçün aqnostik olan mikrob niş məkanını ayırd etmək üçün unikal obyektiv təqdim edir. Əlbəttə ki, hər hansı genomik yanaşmaya əsaslanan ekoloji differensiasiya ilə bağlı birbaşa fikirlər gen annotasiyalarının düzgünlüyündən çox asılıdır, bu da hal-hazırda ən yaxşı halda yamaqdır. Lakin əks ekologiya yanaşması eyni zamanda molekulyar genetika və ya struktur analiz kimi digər yanaşmalarla daha da xarakterizə edilməli olan müvafiq genlər üçün fərziyyələrin formalaşmasına kömək edə bilər və beləliklə, hər yerdə mövcud olan annotasiya probleminin həlli istiqamətində daha strukturlaşdırılmış yanaşmanın qurulmasına kömək edə bilər.

Seçim altında olan yerlər ətraf mühit nümunələrində populyasiyaların bolluğunu qiymətləndirmək üçün xüsusilə faydalıdır, çünki onların populyasiyadaxili müxtəlifliyi olduqca aşağıdır, populyasiyalar arasındakı müxtəliflik isə daha yüksəkdir, çünki indiyə qədər sübutlar göstərir ki, əksər lokuslar fərqli mənbələrdən üfüqi gen transferi nəticəsində yaranmışdır. 32]. Bu xüsusiyyətlər o deməkdir ki, süpürgə lokusları ətraf mühit nümunələrində çox yüksək dəqiqliklə aşkar edilə bilər və onların rekombinogen orqanizmlərin genomunda yayılması mürəkkəb icmalarda populyasiyaların bolluğunun qiymətləndirilməsində statistik güc əlavə edir. Müvafiq olaraq, mikrob icmalarından çıxarılan DNT-nin ov tüfəngi metagenomları çoxsaylı nümunələrdə çoxsaylı lokusların bolluğunu kəmiyyətcə qiymətləndirmək üçün əlverişli bir yol təqdim edir. Bununla belə, hədəf populyasiyalar öz mühitlərində nadir olduqda bu yanaşma məhdud istifadə olunur. Süpürmə yerləri, həmçinin, daha yüksək həssaslıq tələb olunarsa, tədqiqatçılara müxtəlif nümunələrdə populyasiyaların bolluğunu sürətlə ölçməyə imkan verən rəqəmsal polimeraza zəncirvari reaksiya kimi yüksək ayırdetmə analizləri üçün hədəf ola bilər. Bu bölgələr də flüoresans üçün hədəf ola bilər yerində hibridləşdirmə zondları ətraf mühitdə nə qədər yaxından əlaqəli populyasiyaların fərqli şəkildə paylandığını birbaşa vizuallaşdırmaq üçün. Biz nəzərdə tuturuq ki, bu, çox vaxt mikrob qruplarının kobud ətraf mühit dəyişənləri üzərində xəritələşdirilməsinə və sonra potensial fərqləri tapmaq üçün genomikadan istifadə etməyə əsaslanan ənənəvi irəli ekoloji yanaşmaların səmərəliliyini çox aşan incə miqyaslı ekoloji birliklərin daha məqsədyönlü sınaqdan keçirilməsinə imkan verəcəkdir [12].

Gen axını ilə müəyyən edilən populyasiyalar mikrob populyasiyalarını ətraf mühit nümunələri üzərində xəritələşdirmək üçün tez-tez istifadə edilən 16S rRNA gen ardıcıllığı ilə mikrob müxtəlifliyinin ənənəvi ölçülməsi ilə necə müqayisə edilir? Bu suala cavab vermək üçün biz təsvir etdiyimiz öz işimizdən nümunə götürürük Vibrionaceae bakteriya okean suyunda birlikdə yaşayan populyasiyalara çevrilir. Biz adətən təcridlərin incə miqyaslı ekoloji nümunələri, protein marker genlərinin ardıcıllığı və genetik müxtəlifliyi ətraf quruluşla əlaqələndirmək üçün riyazi modelləşdirmənin tətbiqi ilə müəyyən edilmiş təxminən 20 və ya daha çox birlikdə mövcud olan populyasiyaları tapırıq [52-55]. Bu populyasiya proqnozları bu yaxınlarda zülal marker genlərindən birinin birbaşa müqayisəsinə imkan verən daha sadə gen axını analizi [32] ilə təsdiq edilmişdir.hsp60) nümunələrdə ekoloji vahidləri fərqləndirmək potensialına görə əməliyyat taksonomik vahidlərini (OTU) müəyyən etmək üçün istifadə edilən müxtəlif 16S rRNA gen fraqmentləri ilə.

Bu müqayisə, gen axını ilə müəyyən edilmiş populyasiyalarla müqayisədə 16S rRNA genlərinin narahatedici dərəcədə aşağı rezolyusiyasını göstərir (şəkil 5). Xüsusilə yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığında istifadə olunan 16S rRNA etiketləri ekoloji populyasiyalar üçün mahiyyətcə sıfır ayırdetmə qabiliyyətinə malikdir. Tam uzunluqlu gen üçün bu, yalnız bir qədər yaxşıdır, bu da spesifikasiyanın 16S rRNA genlərinin ayırdetmə qabiliyyətini çox üstələdiyini göstərir. Bu o deməkdir ki, ətraf mühit nümunələrində populyasiyaların ekoloji dinamikasına gəldikdə genin çox məhdud məlumatı var və unikal ardıcıllıq bir çox ekoloji cəhətdən fərqlənmiş populyasiyaları maskalaya bilər, bu təsir, ardıcıllığın fərqliliyi baxımından daha geniş OTU-lar müəyyən olunduqca daha da pisləşir.

Şəkil 5. 16S rRNT gen ardıcıllığı çoxluqları ekoloji cəhətdən fərqlənən 14 gendən 0-7-ni ayırd edə bilir Vibrionaceae populyasiyalar ardıcıllığın uzunluğundan və klasterləşmə kəsikindən asılı olaraq, qruplar isə hsp60 marker gen hamısını və ya demək olar ki, hamısını ayırd edə bilir. Filogenez 52 birləşmiş ribosom zülalına əsaslanır. Kölgəli qutu bir taksonun verilmiş gen uzunluğu və klasterləşdirmə üsulu ilə unikal şəkildə fərqlənə biləcəyini, ağ qutu isə bir taksonun ən azı bir gen klasterində ən azı bir başqa taksonla birləşdirildiyini göstərir. Yaşayış yerlərinin paylanması təsvirləri Preheim tərəfindən üç müxtəlif nümunə dəsti üzrə populyasiyaların paylanmasının kəmiyyət təhlilindən əldə edilmişdir. və b. [54]. Yaşayış yeri təsviri olmayan taksonlar məhdud nümunə götürüldüyü üçün həmin analizdən çıxarılmışdır. (Rəngli onlayn versiya.)

Nəzərə alsaq ki, gen axını ilə populyasiya strukturunun proqnozlaşdırılması üçün izolatlar və ya tək hüceyrəli genomlar tələb olunur, metagenomlarda növlər və populyasiyaların identifikasiyası üçün hazırlana bilən bir proxy varmı? Potensial olaraq bəli. Müəyyən etdiyimiz populyasiyaların maraqlı bir xüsusiyyəti, onların təxminən eyni ribosomal zülal ardıcıllığı ilə kifayət qədər yaxşı yaxınlaşmasıdır [32,45]. Baxmayaraq ki, bunlar üçün bəzi strukturlar sürətli spesifikasiyaya görə maskalana bilər, lakin bu genlər populyasiya strukturu üçün daha dəqiq bir vəkil kimi xidmət edə bilər. Bu müşahidənin bir çox taksonda daha geniş olub-olmaması daha böyük verilənlər bazasında araşdırılmalı olacaq [56], lakin əsas odur ki, eyni ribosom zülalları metagenomik məlumat dəstlərindən çıxarıla bilər və onların dinamikası beləliklə asanlıqla təhlil edilə bilər [57]. Buna görə də, növlər və populyasiya dinamikası metagenomik nümunələrdə maraq doğurduqda, ribosom zülallarını hədəf almağı tövsiyə edirik.

10. Yekun nitq

Populyasiyaların eyni zamanda ekoloji vahidlər olan gen axını klasterləri kimi müəyyən edilməsi, uzun müddət populyasiyaların qeyri-səlis tərifindən əziyyət çəkən mikrobiologiya üçün böyük təsirlərə malikdir [2]. Biz təklif edirik ki, yaxından əlaqəli genomların kolleksiyalarından ölçülən son gen axını fərqləndirmənin nisbətən erkən mərhələlərində belə populyasiya sərhədlərini aydın şəkildə müəyyən edə bilər. Bu populyasiyalar, müsbət seçimin uyğunlaşmaları xüsusi və eksklüziv şəkildə yaya biləcəyini göstərən bu yaxınlarda fiksasiyaya keçmiş allellər və genlərlə xarakterizə olunur. Bu cür gen spesifik süpürgələrin müəyyən edilməsi həm populyasiyanın sərhədlərinə inamı təmin edir, həm də populyasiyaları bir-birindən fərqləndirən son uyğunlaşmaların fərziyyələrini yaradır. Beləliklə, bu populyasiyalar, makroekologiya və təkamüldə populyasiyalara necə baxıldığına bərabər olan adaptiv optimallaşdırılmış bakteriya və arxe vahidləri kimi qəbul edilə bilər. İcma ekologiyasını öyrənmək istədiyimiz zaman bu cür populyasiyalar əhəmiyyət kəsb edir, çünki onlar biotik və abiotik amillərlə assosiasiyaları daha dəqiq müəyyən etməyə imkan verir.

Nəhayət, burada müəyyən edilmiş bir çox populyasiyanın çox yüksək dərəcədə genetik izolyasiya nümayiş etdirdiyini nəzərə alsaq, növlərin reproduktiv olaraq təcrid olunmuş orqanizm qrupları olduğunu irəli sürən bioloji növ konsepsiyasına müraciət etmək cəzbedici görünür [58]. Bununla belə, vurğulayırıq ki, burada təqdim olunan bakteriya və arxeya üçün təhlillər, ilk növbədə, yüksək miqrasiya ilə əlaqəli ayrı yerlərdə yaşayan və ya bir yerdə yaşayan orqanizmləri nəzərdə tutur. Burada qeyd etdiyimiz kimi, bu cür populyasiyaların genetik təcrid edilməsi seçim yolu ilə həyata keçirilə bilər. Bununla belə, bir çox növlərin bir xüsusiyyəti, onların müxtəlif dərəcədə gen axını ilə əlaqəli coğrafi cəhətdən ayrı populyasiyalardan ibarət olmasıdır. Belə strukturun klasterlərin təsvirinə necə təsir etdiyi açıq sual olaraq qalır, lakin bu, bakteriya və arxeya üçün bioloji mənalı növ konsepsiyasının axtarışında müəyyən etmək üçün vacib olacaq.


3. NƏTİCƏLƏR

3.1. Mikrob bolluğunun məkan nümunələri və potensial nitrifikasiya

Adi kriginq süjetləri bakterial 16S rRNT, archaeal 16S rRNA və göbələk İTS genlərinin ümumi bolluğunun əhəmiyyətli dərəcədə olduğunu aşkar etdi.səh <਀.05) meşəlik nümunələrində keçid zonası boyunca fərqlə bitişik çəmənlik nümunələrinə nisbətən daha yüksəkdir (Şəkil   1 yuxarı panel Cədvəl  1 ). Ümumilikdə, bakteriya bolluğu qr quru torpaq üçün 10 7 və 10 8 arasında dəyişən gen nüsxələrinin sayı ilə grid boyunca ardıcıl olaraq yüksək idi. Əksinə, arxeal (10 5 � 7 ) və göbələk (10 4 � 7 ) bolluğu nüsxə saylarında daha böyük dəyişkənlik göstərmişdir. Hər üç mikrob krallığının bolluğunun yüksək olduğu keçidin yaxınlığında bir sıra kiçik sahələr tapıldı. Torpaq PNR bakterial ammonyak oksidləşdiricilərinin məkan nümunələrinə çox bənzəyirdi (Şəkil   1 aşağı panel). Ümumi mikrob bolluğuna bənzər, ammonyak oksidləşdiricilərinin bolluğu əhəmiyyətli dərəcədə olmuşdur (səh <਀.05) meşəlikdə çəmənlikdən daha yüksəkdir və vizual olaraq fərqli keçid zonası da qeyd edilmişdir. Bakterial amoA əhəmiyyətli dərəcədə (R 2 = 0.317 səh <਀.001) ekoton boyunca PNR ilə müsbət əlaqə (Dəstəkləyici Məlumat Şəkil S3). Bütün beş gen bolluğu və PNR yüksək məkan asılılığı nümayiş etdirdi (SPD =਀.631𠄰.999) və 14 m və 36 m (Dəstəkləyici Məlumat Cədvəli ) arasında işlədi. Sferik və Qauss modelləri əhəmiyyətli göstərdi (R 2  =਀,285𠄰,900 səh <਀.01) sınaqdan keçirilmiş bütün xüsusiyyətlər üçün məkan quruluşu. Bakterial amoA və PNR arxeyadan daha kiçik məkan diapazonunda (14.7º201323.7ºm) strukturlaşdırılmışdır. amoA, 㹐 m məkan diapazonuna malik idi.

Meşəlik otlaq ekotonu boyunca mikrob bolluğunun və potensial nitrifikasiyanın məkan nümunələrini göstərən geostatistik kriginq planları. Avstraliyanın Namadgi Milli Parkında meşəlik və çəmənliklər arasında 50 m m×ꀠ m şəbəkə yaradılmışdır. Adi kriginq yarımvariasiya təhlili və çarpaz doğrulamadan sonra həyata keçirilmişdir. Kriginq xəritələrindəki nöqtəli xətlər xəritənin yuxarı yarısında meşəlik və aşağı yarısında çəmənlik arasındakı sərhədi göstərir.

Cədvəl 1

Avstraliyanın Namadgi Milli Parkındakı meşəlik otlaq ekotonunda torpaq mikrob indeksləri və potensial nitrifikasiya dərəcəsi

Torpağın mikrobiotası və fəaliyyətiEkoton komponentləri
MeşəlikKeçidOtlaq
Bolluq (Log nüsxələri g 𢄡 quru torpaq)
Bakterial 16S rRNT8.40 (0.05) a 8.29 (0.08) a 7,84 (0,12) b
Arxeal 16S rRNT6,91 (0,11) a 6,96 (0,21) a 6.10 (0.16) b
Göbələk İTS7,69 (0,09) a 7.06 (0.16) a 5,39 (0,66) b
Bakterial amoA4,55 (0,25) a 4.82 (0.20) a 3,54 (0,34) b
Arxeal amoA5,86 (0,28) a 5.12 (0.20) a 5.51 (0.19) a
Zənginlik
Arxeya42.2 (7.71) a 21,5 (1,91) b 22.1 (1.30) b
Bakteriya1169 (43.10) b 1147 (96.03) b 1395 (21.87) a
Göbələklər374 (14.10) a 308 (27.03) b 337 (12.22) ab
Pielou bərabərliyi
Arxeya0,40 (0,04) a 0,09 (0,02) c 0,21 (0,03) b
Bakteriya0,77 (0,01) a 0,80 (0,01) b 0,82 (0,01) b
Göbələklər0,61 (0,04) a 0,68 (0,04) a 0,72 (0,03) a
Müxtəliflik (Shannon‐Weaver)
Arxeya1,45 (0,15) a 0,27 (0,07) c 0,66 (0,11) b
Bakteriya5,48 (0,08) b 5,67 (0,15) b 6.00 (0.03) a
Göbələklər3.57 (0.23) a 3,86 (0,19) a 4.22 (0.21) a
Fəaliyyət
Nitrifikasiya potensialı (PNR) (μg NO3‐NO2 g 𢄡  quru torpaq hr 𢄡 )0,13 (0,04) a 0,36 (0,078) b 0,08 (0,01) a

Şəbəkənin uzunluğu boyunca (50 m) ilk 20 m meşəlik, 10 m keçid, son 20 m çəmənlik idi, nəticədə (n) müvafiq olaraq 20, 15 və 20 nümunələrdə. Mikrob müxtəliflik indeksləri üçün, n =ਆ.

Torpağın mikrob xassələri, Duncan post hoc testi ilə bir ANOVA üsulu ilə meşəlik, keçid və çəmənlik arasında müqayisə edildi.

Fərqli hərflər statistik əhəmiyyəti göstərir < 0.05.

3.2. Mikrob icma quruluşu, taksonomik tərkibi və müxtəlifliyi

Arxeal, bakteriya və göbələk icmaları meşəlik və çəmənlik nümunələrinin fərqli qruplar əmələ gətirməsi və keçid zonasından olan nümunələrin qradient göstərməsi ilə əhəmiyyətli yaşayış mühiti effekti nümayiş etdirdi (Şəkil   2 yuxarı panel). PERMANOVA bakterial (Pseudo‐F =਄.79 səh <਀.001), arxaeal (Pseudo‐F =਄.42 səh <਀.001) və göbələk (Pseudo‐F =ਃ.43 səh <਀.001) icmaları. Əsas koordinatlar bakterial, arxeal və göbələk icmalarında müvafiq olaraq 52%, 81% və 30% variasiyanı izah etdi. İcma quruluşu kimi, taksonomik tərkibə də yaşayış mühitinin kənarı təsir göstərmişdir (Şəkil 2-in aşağı paneli). Bakteriyalar üçün, Acidobacteria, Aktinobakteriyalar,Alfaproteobakteriyalar ekotonda ümumi bakteriya bolluğunun 80%-dən çoxunu təmsil edən dominant üzvlər idi. AcidobacteriaAlfaproteobakteriyalar meşəlik nümunələri isə daha çox olmuşdur BetaproteobakteriyalarXlorofleksi keçid zonasında ən çox yayılmışlar (səh <਀.05). Nitrososphaerales Xüsusilə çəmənlik və keçid zonası nümunələrində üstünlük təşkil edən arxeal qrup idi, burada ümumi arxeyanın 99%-ni təşkil edirdi. Digər tərəfdən, bir sıra göbələk qrupları əhəmiyyətli (səh <਀.01) ekoton üzrə fərqlər. Misal üçün, AgaricomycetesLeotiomycetes Meşəlik nümunələrində keçid zonası və ya çəmənlik nümunələrinə nisbətən 2 dəfə çox idi. Oxşar, SakkaromisetlərDotideomisetlər əhəmiyyətli dərəcədə daha çox idi (səh <਀.05) keçid zonasında və Agaricostilbomycetes (səh <਀.001) çəmənlikdə. Mikrob alfa müxtəliflik indeksləri ekotonda ziddiyyətli nümunələr göstərdi (Cədvəl 1). Məsələn, bakteriyaların zənginliyi, bərabərliyi və müxtəlifliyi əhəmiyyətli dərəcədə (səh <਀.05) meşəlik nümunələrində keçid zonası və çəmənlikdən daha aşağıdır. Əksinə, arxeoloji zənginlik, bərabərlik və müxtəliflik əhəmiyyətli dərəcədə idi (səh <਀.05) meşəlikdə keçid zonası və ya otlaq nümunələrindən daha yüksəkdir. Bu onu göstərir ki, meşəlik nümunələrdə daha az müxtəlif bakteriya icması və çox müxtəlif arxeoloji icma var idi. Digər tərəfdən, nisbətən N‐ və P‐zəngin çəmənlik nümunələri müxtəlif bakteriya icmasını dəstəklədi (Dəstəkləyici Məlumat Cədvəli S1). Göbələklər də meşə nümunələrində əhəmiyyətli dərəcədə yüksək zənginliyə malik idi.

Meşəlik, çəmənlik və keçid zonasında bakteriya, arxeya və göbələklərin icma quruluşunu aşkar edən əsas koordinat analizi (yuxarı panel). Meşəlikdə, çəmənlikdə və keçid zonasında müxtəlif fila və bakteriya, arxeya və göbələk siniflərinin nisbi bolluğunu göstərən üst-üstə yığılmış bar diaqramı (alt panel)

3.3. Mikrobların birgə baş verməsi

Şəbəkə təhlili meşəlik, çəmənlik və keçid zonasında arxa, bakteriya və göbələk üzvlərinin fərqli birgə baş verməsini göstərdi (Şəkil 3). Ən yaxşı 1000 MIC skorunu daxil edən mikrob şəbəkəsi 324 qovşaqdan (260 bakteriya, dörd arxa və 60 göbələk OTU) ibarət idi Şəkil 4. Ən yaxşı 10 əsas daş taksası arasında altısı bakteriya və dördü göbələk idi (Cədvəl 2 Şəkil 3 a). Bakteriya əsas daşı taksonlarının yarısı sinfə aid idi Alfaproteobakteriyalar halbuki, göbələklərin əsas daşı taksonlarının əksəriyyəti üzvləri idi Ascomycetes. İki bakterial OTU aid idi RhizobialesBurkholderiales. Təsadüfi Meşə Təhlili göstərdi ki, ammonium, ümumi karbon və C:N nisbəti mikrob əsas daş taksonlarının bolluğunun əsas determinantlarıdır (Şəkil   3 b). Ekoton üzrə şəbəkə 193 qovşaqdan ibarət idi ki, bunlardan meşəlik və çəmənlik 116 və 74 qovşaqla, keçid zonası isə iki qovşaqla əlaqələndirilirdi (Şəkil 3 c). Ümumi şəbəkə 1767 qovşaqdan ibarət idi və diametri 6 və radiusu 4 idi (Dəstəkləyici Məlumat Şəkil  S3). Meşəlik və otlaqlar keçid zonasından uzaqda çoxluqlar əmələ gətirdi. Şəbəkədə bakteriyalar üstünlük təşkil etsə də, meşəlikdə göbələk və arxeal düyünlər də çox idi. Ümumilikdə, ekotonun üç yaşayış mühiti komponentində mikrob və birgə rast gəlinmələr əhəmiyyətli dərəcədə fərqli idi.

(a) Bakterial, arxeal və göbələk OTU-ların birgə baş verməsini göstərən mikrob şəbəkəsi. Ən yaxşı 1000 qarşılıqlı əlaqədən ibarət bu şəbəkə 324 qovşaqdan ibarət idi. Genişlənmiş qovşaqlar altı bakterial və dörd göbələk olan ilk on mikrob əsas daşı taksonunu təmsil edir. (b) Mikrob əsas daşı taksonlarının edafik sürücülərini göstərən Təsadüfi Meşə Analizinin nəticələri. MSE orta kvadrat xətaların vektorunu göstərir. (c) Meşəlikdə, çəmənlikdə və keçid zonasında mikrob birləşmələri. Bu şəbəkə 193 qovşaqdan ibarət idi. Ən vacib qarşılıqlı əlaqəni göstərmək üçün yalnız güclü müsbət (r >਀.8), güclü mənfi (r < 𢄠.8) və güclü qeyri-xətti ( MIC  – ρ şəbəkələrdə 2  >਀.8) əlaqə göstərilmişdir. Oval düyünlər bakterial OTU-ları, düzbucaqlı qovşaqlar göbələk OTU-larını, üçbucaqlı qovşaqlar isə arxa OTU-ları təmsil edir. Düyünlərin rəngi müxtəlif taksonomik qrupları, yaşıl, qırmızı və dalğalı xətlər isə müvafiq olaraq müsbət, mənfi və qeyri-xətti əlaqələri təmsil edir. Yalnız statistik əhəmiyyətli (səh <਀.05) əlaqələr göstərilir

Mikrobların birgə baş verməsi, torpağın xüsusiyyətləri və ekoloji proseslər arasında əlaqə. (a) Arxeal, bakteriya və göbələk OTU-ları torpaq kimyəvi xassələri ilə fərqli qruplar əmələ gətirdi. P kimi böyük klasterlər 164 qovşaqdan, C:N 76 qovşaqdan və pH 42 qovşaqdan ibarət idi. (b) Potensial nitrifikasiya və hüceyrədənkənar ferment fəaliyyətləri ilə əlaqəli mikrob OTU klasterləri. PNR çoxluğu 49 qovşaqdan ibarət idi. Ən vacib qarşılıqlı əlaqəni göstərmək üçün yalnız güclü müsbət (r >਀.8), güclü mənfi (r < 𢄠.8) və güclü qeyri-xətti ( MIC  – ρ şəbəkələrdə 2  >਀.8) əlaqə göstərilmişdir. Oval düyünlər bakterial OTU-ları, düzbucaqlı qovşaqlar göbələk OTU-larını, üçbucaqlı düyünlər isə arxa OTU-ları təmsil edir. Düyünlərin rəngi müxtəlif taksonomik qrupları, yaşıl, qırmızı və dalğalı xətlər isə müvafiq olaraq müsbət, mənfi və qeyri-xətti əlaqələri təmsil edir. Yalnız statistik əhəmiyyətli (səh <਀.05) əlaqələr göstərilir

Cədvəl 2

Şəbəkə xüsusiyyətləri və ilk on əsas daşı taksonun taksonomiyası. Ən yüksək dərəcəyə, ən yüksək yaxınlıq mərkəzliyinə və ən aşağı aralıq mərkəzliyinə malik OTU-lar əsas daşı taksonu kimi seçilmişdir.

OTUidŞəbəkə xüsusiyyətləriTaksonomiya
Aralıq mərkəzlikYaxınlıq mərkəzliyiDərəcəKrallıqFilum və ya sinifSifariş verin
Botu7810.0240.502265Bakteriya Acidobacteria Acidobacteriales
Fotu6710.0210.510254Göbələklər Eurotiomycetes Chaetothyriales
Fotu6950.0260.508250Göbələklər Dotideomisetlər Kapnodiales
Botu7060.0150.499246Bakteriya Alfaproteobakteriyalar Rhodospirillales
Fotu6260.0130.502241Göbələklər Zygomycota Mortierellales
Botu9140.0120.501238Bakteriya Verrukomikrobiya Pedosphaerales
Botu2570.0080.484227Bakteriya Alfaproteobakteriyalar Caulobacterales
Botu8900.0150.494220Bakteriya Alfaproteobakteriyalar Rhizobiales
Fotu5690.0110.486210Göbələklər Eurotiomycetes Chaetothyriales
Botu810.0050.476199Bakteriya Betaproteobakteriyalar Burkholderiales

3.4. Mikrobların birgə baş vermələri, torpağın xüsusiyyətləri və ekoloji proseslər arasında əlaqələr

Mikrobların çoxluğu torpağın xassələri və ekoloji proseslərlə əlaqələndirilmişdir, alt şəbəkələr əsasən bakterial OTU-lardan ibarətdir (Şəkil 4. Dəstəkləyici məlumat Şəkil Şəkil). Torpaq xüsusiyyətlərinə görə, ümumi torpaq P, maksimum düyünlərdən sonra C:N nisbəti və pH ilə çoxluq təşkil etdi (Şəkil   4 a). Mineral N, DON, C: N və P çoxluqları bir neçə qovşaq paylaşdı və əsasən müsbət və xətti kənarlarla birləşdirildi. Ümumiyyətlə, alt şəbəkələr üstünlük təşkil edirdi AlfaproteobakteriyalarAktinobakteriyalar Bakteriyalarda OTU. Torpağın ekoloji prosesləri üçün PNR torpaq fermentlərindən uzaqda böyük və fərqli bir çoxluq meydana gətirdi və əsasən bakterial düyünlərdən ibarət idi, lakin arxa düyünlər yoxdur, torpaq fermentləri isə fərdi klasterlər əmələ gətirdilər, lakin ortaq düyünlər vasitəsilə bir-birinə bağlandılar (Şəkil   4 b). Bu, xüsusilə böyük bir ortaq gildiyaya malik olan sellobiohidrolaz və fosfataz fəaliyyətləri üçün doğrudur. β‐qlükozidaza ən kiçik klasterə malik idi, lakin ona aid bir göbələk düyünü vasitəsilə həm sellobiohidrolaza, həm də fosfatazla əlaqəli idi. Dotideomisetlər. Torpağın P tərkibinə bənzər olaraq, fosfataz ən böyük qrupları meydana gətirdi. Torpaq fermentlərinin bu qruplarında bakterial OTU-lar da üstünlük təşkil edirdi. Potensial nitrifikasiya ardıcıl olaraq əhəmiyyətli olduğunu göstərdi (səh <਀.01) torpağın xassələri və hüceyrədənkənar fermentlərlə korrelyasiya (Dəstəkləyici Məlumat Cədvəli S3). Bakterial amoA Bu nisbətən az zəngin torpaqlarda gen nüsxə nömrəsinin PNR fəaliyyəti ilə güclü əlaqəsi var idi və bu, həmçinin bakterial amoA güclü idi (səh <਀.01) torpağın N tərkibi ilə əlaqələndirilir. Birlikdə götürüldükdə, mikrobların birgə baş vermələri torpağın xüsusiyyətləri və ekoloji proseslərdəki fərqləri əks etdirirdi.


Müzakirə

Proteomlar ToL boyunca necə genişləndi və bu genişlənməni dəstəkləmək üçün şaperonlar necə inkişaf etdi? Bu sualı həll etmək üçün biz bir neçə mənbədən məlumatları topladıq və onları bir dam altında təhlil etdik, beləliklə, Şəkil 4-də ümumiləşdirildiyi kimi sistematik, kəmiyyət müqayisəsinə imkan verdik. Ən sadə sərbəst yaşayan prokaryotlardan bitki və heyvanlara qədər proteomlar davamlı olaraq genişlənmişdir. həm təkrarlar, həm də yeniliklər. Bu, ilk növbədə, proteomun "mürəkkəbliyinin" davamlı olaraq müxtəlif yollarla artması ilə əlaqədardır və bu, artan şaperon hərəkətini tələb edir. ToL-də və xüsusən də prokaryotları eukariotlarla müqayisə edərkən hər proteomda daha çox zülal görürük (Şəkil 4).A) həmçinin daha böyük zülallar. Sonuncu, getdikcə daha çox təmsil olunan çoxdomenli zülallarla əlaqədardır. Çoxdomenli zülallarda fərqli qıvrımların sayı, eləcə də unikal qıvrım birləşmələrinin sayı artır. Proteomlar, həmçinin, təkrar zülallar və beta vərəqlərindən ibarət zülallar kimi yanlış qatlanmaya meyilli olan zülal növlərinin daha böyük bir hissəsini ehtiva edir və yüksək aqreqasiyaya meylli olacağı proqnozlaşdırılır. Yeni qatın və ya yeni domen birləşməsinin doğulması, ehtimal ki, zəif qatlama ilə nəticələnir. Vaxt keçdikcə mutasiya və seçim qatlanmağı yaxşılaşdıracaq (59) və nəticədə yeni doğulmuş şaperondan müstəqil zülal yarada bilər. Buna baxmayaraq, yeni inkişaf etmiş zülalların və müəyyən zülal növlərinin (təkrar və ya beta ilə zəngin zülallar) məcmu təsiri, ehtimal ki, şaperon qabiliyyətinin artırılmasını tələb edir.

Proteomların və şaperonların paralel genişlənməsini təsvir edən xülasə şəkli. bar hündürlükləri (y ox) elə miqyaslandı ki, hər bir parametrə görə ən yüksək dəyər eyni hündürlüyü qəbul etsin (mütləq dəyərlər çubuqların üstündə verilmişdir). (A) Qısaca proteomların genişlənməsini təsvir edən bar qrafikləri. Ən sadə sərbəst yaşayan arxeyalar, bakteriyalar, göbələklər, bitkilər və xordatlar üçün proteom başına zülalların sayı (açıq boz), median zülal uzunluğu (açıq sarı), unikal qıvrımların sayı (boz), unikal qatların sayı göstərilir. proteom başına birləşmələr (sarı), çoxdomenli zülalların faizi (proteomun narıncıdakı bütün zülallardan), təkrar zülallara uyğun gələn proteom uzunluğunun faizi (qalıq uzunluğu tünd boz ilə hesablanır), beta-superfold arxitekturasına malik olan zülalların faizi (şərab), yüksək aqreqasiyaya meylli (tünd sarı) kimi proqnozlaşdırılan zülalların faizi və mahiyyət etibarilə nizamsız olaraq proqnozlaşdırılan proteom uzunluğunun faizi (qırmızı). (B) Eyni ilə A, şaperonların genişləndirilməsi üçün. Proteomda (göy) nüvə (göy) və koxaperon ailələrinin sayı, proteomda (mavi) əsas şaperon genlərinin faizi, ribosomal zülallarla (yaşıl) müqayisədə əsas kaperonların nisbi mRNT bolluğu və nisbi zülal bolluğu göstərilir. əsas şaperonların bütün digər zülallarla müqayisədə (tünd yaşıl). (C) İnteqrasiya edilmiş şaperon şəbəkəsinin genişləndirilməsinin sxematik təsviri. Əsas şaperonlar müxtəlif rənglərdə və qara konturlarla, koşaperonlar isə kontursuz boz rəngdədir. HSP60, HSP70 və HSP90-ın ​​koşaperonları qara xətlərlə müvafiq əsas şaperona qoşulur. Əsas şaperonlar arasında əməkdaşlıq dairələr arasında üst-üstə düşmə ilə təmsil olunur və müxtəlif əsas şaperonlar arasında substrat paylaşımı qırmızı oxlarla göstərilir. Ox istiqaməti və eni substratın paylaşılmasının istiqamətini və böyüklüyünü təmsil edir. Qeyd edək ki, şəbəkə ən sadə sərbəst yaşayan arxeya, bakteriyalar, göbələklər və xordatlar üçün göstərilib.

Proteom mürəkkəbliyindəki bu dramatik artım və buna görə də şaperon fəaliyyətinə tələbat yeni əsas şaperonların meydana çıxması ilə qarşılanmadı. Eukaryotlar prokaryotlar kimi eyni beş əsas-şaperon ailəsinə malikdirlər və metazoanlar və xordatlar əslində HSP100-ü itirmişlər (Şəkil 4).B). Bundan əlavə, əsas-şaperon genlərinin nisbi təmsili prokaryotlar və eukaryotlar arasında fərqlənmir. Əksinə, artan şaperon fəaliyyətinə olan ehtiyac iki yolla qarşılandı: birincisi, əsas şaperonların hüceyrə bolluğu ilə, ikincisi, yeni koşaperonların meydana çıxması ilə - bakteriyalarda ~ 4 koxaperon ailəsi aşkar edilərkən, eukariotlarda onların Məməlilərdə sayı 15-ə, hətta 20-yə yüksəldi.

Genişlənən proteom xüsusiyyətlərinin əksəriyyəti, ehtimal ki, adaptiv təkamülün nəticəsidir (məsələn, yeni qıvrımların və domen birləşmələrinin yaranması). Bununla belə, genişlənmə driftlə, yəni populyasiya darboğazları səbəbindən təsadüfən genetik dəyişikliklərin fiksasiyası ilə də baş verə bilər. Həqiqətən, effektiv əhali ölçüsü (Ne) prokaryotlardan (adətən >10 8 ) birhüceyrəli eukariotlara (~10 7 ), onurğasızlara və quru bitkilərə (~10 6 ) və xordalılara (~10 5 ) (60) düşmüşdür. Nəticə etibarilə, prokaryotlarda təmizlənəcək neytral və ya hətta yüngül zərərli mutasiyalar çoxhüceyrəli eukariotlarda asanlıqla düzələ bilər. Məsələn, sürüşmə zülal-zülal qarşılıqlı potensialından asılı olmayaraq zülal səthlərində hidrofobik qalıqların yığılmasına səbəb ola bilər ki, bu da zülal stabilliyinin və oliqomerizasiyanın aşağı olmasına, eyni zamanda eukaryotik zülallarda aqreqasiya meylinin artmasına səbəb olur (61). Eynilə, sürüşmə ilə sabitlənmiş əlavələr nizamsız seqmentləri (62) və zülalları təkrarlaya bilər. Eukariotlarda daha yüksək şaperon səviyyələri (Şəkil 3 CD) bu cür yığılan mutasiyaların zərərli təsirlərinin yumşaldılması ilə bağlı ola bilər (63). Patogen bakteriyalar tez-tez ciddi əhali darboğazları yaşayır və onların şaperon ifadə səviyyələri ekstremofillərinki ilə müqayisə edilə bilər (Şəkil 3).C və Dataset S11). Ümumiyyətlə, sürüşmənin proteom və şaperonun təkamülünə təsiri əlavə araşdırmaya layiqdir.

Yuxarıdakı tendensiyalar şaperon mexanizminin əlamətlərini təşkil edən iki xüsusiyyəti vurğulayır: əsas şaperonların ümumi təbiəti və inteqrasiya edilmiş bir şəbəkə kimi koşaperonlarla birlikdə kooperativ rejimdə fəaliyyət göstərmə qabiliyyəti. HSP60, HSP70, HSP90 və HSP100, ölçüsündən [HSP60 (64) istisna olmaqla], strukturundan və funksiyasından (11) asılı olmayaraq, geniş çeşiddə müxtəlif yanlış qatlanmış və yığılmış zülal substratlarında işləyən ümumi açılma-qaytarma mexanizmləri kimi fəaliyyət göstərən əsas şaperonlardır (11). , 31).Əsas şaperonlar doğma qatlanmış vəziyyətdə bir neçə spesifik substrata yüksək yaxınlıqda bağlana bilsələr də, ümumiyyətlə hidrofobik səthləri anormal şəkildə ifşa edən səhv qatlanmış və yığılmış polipeptidləri bağlamağa meyllidirlər (31, 65, 66). Təkrarlanma və ixtisaslaşmanın əsas hərəkətverici qüvvəsi funksional mübadilədir – bir funksiyanın optimallaşdırılması digər funksiyaların hesabına baş verir (67). Bununla belə, "ümumi" funksiya rejimini nəzərə alsaq, getdikcə daha böyük və mürəkkəb proteomların keyfiyyətinə nəzarət yeni əsas şaperon ailələrinin meydana çıxması ilə deyil, mövcud əsas şaperonların bolluğu ilə əldə edilə bilər. Həqiqətən, əsas şaperonların gen nüsxə nömrələri həqiqətən genlərin təkrarlanması ilə artsa da, proteom ölçüsü ilə müqayisədə onların nisbi təmsili sabit qaldı (Şəkil 3).B) və nəticədə yaranan paraloq nüsxələr əsasən müxtəlif subcellular kompartmentlərə yerləşmiş və ya müxtəlif stres şəraitində ifadə edilmişdir (68). Parazitar mikroblarda və fotosintetik orqanizmlərdə HSP70 və HSP90-ın ​​dublikatları ev sahibinin immun reaksiyalarına və oksidləşdirici stresə qarşı durmaq üçün ixtisaslaşıb (54 ⇓ ⇓ –57). Lakin, onların ümumi təbiətinə uyğun olaraq, böyük, mürəkkəb proteomların saxlanması problemi (Şəkil 4)A) ilk növbədə yenilərinin de novo ortaya çıxması ilə deyil, əvvəlcədən mövcud olan əsas şaperonların bolluğunun artması ilə qarşılandı.

Sağlam hüceyrələrdə həm əsas, həm də koşaperonlardan ibarət inteqrasiya olunmuş şaperon şəbəkəsi zülal keyfiyyətinə nəzarət edir (69 ⇓ –71). Bu şəbəkədə (şək. 4C), çox bol olan əsas şaperonlar kooperativ şəkildə fəaliyyət göstərirlər, yəni onlar nəinki natamam işlənmiş səhv qatlanmış və ya açılmamış zülal substratlarını bölüşür və mübadilə edir, həm də bir-birinin fəaliyyətini tetikler. HSP70 digər əsas şaperonlar arasında əməkdaşlıq əlaqəsinə vasitəçilik edərək bu şəbəkədə mühüm rol oynayır. Məsələn, HSP70 HSP100-ün parçalanma aktivliyini tetikler və onlar birlikdə yığılmış zülalları parçalayır və onların sonrakı təkrar qatlanmasını təşviq edir (72 ⇓ –74). Başqa bir misalda, HSP20 səhv qatlanmış substratları ATP ilə idarə olunan açılma üçün HSP70-ə ötürə bilər, bundan sonra onlar yenidən doğma vəziyyətə son qatlanma üçün HSP60-a köçürülə bilər (75). Eyni şəkildə, HSP90 natamam işlənmiş HSP70 substratlarının yetişməsini təşviq edə bilər (76, 77). Əsas şaperonlar arasında kooperativlik və substrat paylaşımı Şəkil 4-də sxematik şəkildə təqdim edilmişdir.C. Birlikdə, bu ümumi, kooperativ əsas şaperonlar LUCA-da sadə iki komponentli sistemdən yaranan inteqrasiya olunmuş şaperon şəbəkəsinin nüvəsini təşkil edir (Şəkil 4).C).

Proteom mürəkkəbliyinin genişlənməsi ilə yanaşı, şaperon şəbəkəsi də genişləndi - ilk növbədə koşaperonların meydana gəlməsi ilə (şək. 4)C). Koşaperonların bu genişlənən sırası əsas şaperonların substratları səmərəli şəkildə bölüşmək və əməkdaşlıq etmək qabiliyyətini artırdı. Ümumi əsas şaperonlardan fərqli olaraq, koşaperonlar daha müxtəlifdir və müvafiq olaraq spesifik zülalları idarə edən koşaperonlar da daxil olmaqla, xüsusi rollarda alt ixtisaslaşırlar. Nümunələrə, göbələklərdə ortaya çıxan və metazoa skelet və ürək əzələlərində miyozin HSP90 vasitəçiliyi ilə saxlanmasını asanlaşdıran bir koşaperon olan UNC45 daxildir (78). Göbələklərdən törəyən başqa bir koxaperon, Tsc1/2 heteromeri, HSP90-a kinaz və bəzi qeyri-kinaz substratlarını cəlb etmək üzrə ixtisaslaşmışdır (79). Digər koxaperonlar zülal daşıma nümunələrinə vasitəçilik edən Tom70 və P23 daxildir ki, bu da Golgi və mitoxondrial membranlar vasitəsilə protein daşınmasını asanlaşdırır (80 ⇓ –82). Koxaperonların xüsusi funksiyası onların necə genişlənməsi ilə üst-üstə düşür, yəni qədim prokaryotlardan doğulmuş koxaperonların təkrarlanması və divergensiyası ilə, həm də vicdanlı yeniliklər, yəni eukariotlarda tamamilə yeni ixtisaslaşmış koxaperonların yaranması ilə. Burada göstərildiyi kimi, yeni koxaperonların meydana çıxması yeni zülalların meydana gəlməsi ilə üst-üstə düşür (yəni, əvvəllər mövcud olan zülalların təkrarlanması ilə deyil, de novo çıxma yolu ilə). Bununla belə, birgə baş vermə birgə təkamül demək deyil - həqiqətən də, sonuncu haqqında çox az şey bilirik. Müəyyən bir zülal və ya zülal sinifinin de novo ortaya çıxmasını dəstəkləmək üçün müəyyən koşaperonlar meydana çıxdı? Əgər belədirsə, şaperon asılılığı davam edirmi, beləliklə, kooperativ asılılığı “eqoist” geri dönməz xüsusiyyətə çevirir? Alternativ olaraq, bəzi yeni ortaya çıxan zülallar daha da təkamül etdikcə, onların qatlanma qabiliyyəti yaxşılaşdı və onlara şaperondan müstəqil olmağa imkan verdi.

Beləliklə, Həyat Ağacı boyunca proteomlar yalnız əvvəllər mövcud olan zülalların təkrarlanması ilə deyil, həm də tamamilə yenilərinin meydana gəlməsi ilə kütləvi şəkildə genişlənmişdir. Eukaryotik proteomlar xüsusilə böyüdülər və bükülmələri çətin olan təkrar, beta-zəngin və aqreqasiyaya meylli zülallarla xüsusilə zəngin oldular. Proteomun ölçüsü və tərkibindəki bu dəyişikliklər şaperon fəaliyyətinə tələbatı gücləndirdi. Maraqlıdır ki, bu artan tələbə cavab olaraq yeni əsas şaperonlar meydana çıxmadı. Bunun əvəzinə, hüceyrədəki bütün digər zülallara nisbətən bolca artdılar. Hər şeydən əvvəl, bazal əsas-şaperon fəaliyyətini asanlaşdıran bütün koşaperonlar şəbəkəsi inkişaf etmişdir.


1995-ci ildə J. Craig Venter və onun Genom Tədqiqatları İnstitutundakı həmkarlarının mühüm irəliləyişi genom analizində yeni bir dövrün müjdəçisi oldu. Onlar bakteriyanın genomunun tam ardıcıllığını bildirdilər Hemofil qripi, hamısı 1,830,137 bp (Fleischmann et al., Science, cild 269, s. 496-512, 1995). Bu üsulda genomik DNT təsadüfi olaraq təxminən 1000 bp ölçüsündə kiçik fraqmentlərə kəsilir, plazmidlərə klonlaşdırılır və təsadüfi seçilmiş klonların uclarından ardıcıllıq müəyyən edilir (Şəkil 4.10). Bu proses, genomdakı hər bir nukleotid orta hesabla bir neçə dəfə ardıcıllıqla sıralanana qədər dəfələrlə təkrarlanır. Əgər genom 3 milyon baza cütüdürsə, onda təsadüfi klonlardan 9 milyon əsas cüt ardıcıllığın müəyyən edilməsi genomu 3X əhatə edir. Bu, hesablama alətlərindən istifadə edərək, üst-üstə düşən ardıcıllıqları birləşdirərək bakterial genomun demək olar ki, tam ardıcıllığının yığıla biləcəyi kifayət qədər məlumatdır. Bəzi boşluqlar qalır və bunlar yönəldilmiş ardıcıllıqla doldurulur. Daha böyük genomlar daha yüksək əhatə dairəsinə keçməklə ardıcıllıqla (və ya ən azı onların böyük bir hissəsi) edilə bilər, məsələn. 8X - 10X. Bu yanaşma genlər və ya onların bakterial xromosomdakı mövqeləri haqqında əvvəlcədən məlumat tələb etmir. Bir neçə bakteriya genomu bu şəkildə ardıcıllıqla tərtib edilmişdir və Dr. Venter və həmkarları, demək olar ki, bütün genomların ardıcıllığı üçün eyni yanaşmadan istifadə etmişlər. Drosophila melanogaster(Onun şirkəti Celera və dövlət tərəfindən maliyyələşdirilən səy arasında əməkdaşlıqda) və Homo sapiens(dövlət tərəfindən maliyyələşdirilən səylə müsabiqədə). Bu mövzudakı varyasyonlar, həm kiçik (1 kb) və həm də böyük (10 kb) plazmidlərə daxiletmələrin klonlanması və ardıcıllaşdırılması və daha sonra ümumi ardıcıllığın yığılmasına kömək etmək üçün daha uzun əlavələrin uclarından ardıcıllığın istifadəsi kimi effektivliyi artırır. Bənzər bir fikir, böyük miqyaslı montaj üçün təxminən 100 kb ölçüsündə olan BAC əlavələrinin uclarından gələn ardıcıllıqdan istifadə edir.

Şəkil 4.10. Ov tüfənginin ardıcıllığı və yığılması.

Yaradanlar kimi digər böyük genom ardıcıllığı layihələri Sakkaromislər cerevisiaeE. colisekanslar, daha sonra istiqamətləndirilmiş şəkildə ardıcıllıqla sıralanan böyük bir xəritələnmiş klon dəsti ilə başladı. Bu yaxşı işləyir və birində genom ardıcıllığı tamamlanana qədər illər boyu yüksək dəqiqlikli genetik və fiziki xəritə var. Təsadüfi yanaşmadan daha yavaşdır, lakin böyük, mürəkkəb genomlar üçün daha çox tamlığa nail ola bilər. Bu, əslində, Beynəlxalq İnsan Genomu Sıralama Konsorsiumu (IHGSC) olaraq adlandırılan, dövlət tərəfindən maliyyələşdirilən beynəlxalq əməkdaşlığın izlədiyi yanaşmadır.

Bu layihənin ən son mərhələsində orta əlavə ölçüsü təxminən 100 kb olan BAC klonlarından geniş istifadə edilmişdir (Şəkil 4.11). İnsan DNT əlavələrini ehtiva edən BAC klonlarının kitabxanaları yüksək məhsuldarlıq xəritələşdirmə səyi ilə sifariş edilmişdir. Kitabxanadakı hər bir klonun məhdudlaşdırıcı həzmləri təhlil edildi və üst-üstə düşən klonlar ümumi fraqmentləri tapmaqla müəyyən edildi. BAC klonları daha sonra bitişik üst-üstə düşən massivlərdə təşkil edildi və ya contigs. Hər bir xromosomun ardıcıllığını müəyyən etmək üçün lazım olan minimal plitələr yolu quruldu və bu yoldakı BAC klonlarının ucları xromosom vasitəsilə sıx markerlər sırasını təmin etmək üçün ardıcıllıqla sıralandı. Daha sonra kontiglərdəki BAC klonları, bütün genomu (3,2 milyon kb) deyil, BAC daxiletməsinin (100 kb) ov tüfəngi ardıcıllığından istifadə edərək ardıcıllıqla sıralandı. Təxminən 3X əhatə dairəsində BAC klonlarının ardıcıllığı deyilir qaralama ardıcıllıqları, və istiqamətlənmiş ardıcıllıqla doldurulmuş boşluqlarla daha yüksək əhatə dairəsində olanlar nəzərə alınır bitmiş ardıcıllıqlar. Qaralama və bitmiş ardıcıllıq məlumatlarının kombinasiyası BAC son ardıcıllıqları və digər məlumatlardan istifadə etməklə yığılır. Assambleya Santa Cruzdakı Kaliforniya Universitetinin İnsan Genomu Brauzerində (http://genome.ucsc.edu/goldenPath/hgTracks.html) və Sanger Mərkəzindəki Ensembl saytında (http://www. ensembl.org/).

Şəkil 4.11. BAC kontiglərinin istiqamətləndirilmiş ardıcıllığı.

Celera və milçək ardıcıllığı ilə bağlı ictimai əməkdaşlığın nəticələri 2000-ci ilin əvvəlində nəşr olundu və insan genomu ardıcıllığının təsvirləri 2001-ci ildə Celera və IHGSC tərəfindən ayrıca nəşr olundu. Heç bir genom tamamilə ardıcıl deyil (2001-ci ilə qədər), lakin hər ikisi yüksək səviyyədədir. ardıcıllıqla həyata keçirilir və həyat elmlərində böyük bir inqilaba təkan verir.

Hansı yanaşmanın müdrikliyi hələ də müzakirə mövzusudur və müəyyən dərəcədə mürəkkəb bir genomun ardıcıllığını nə qədər diqqətlə izləmək lazım olduğundan asılıdır. Məsələn, bu yaxınlarda ov tüfəngi yanaşması ilə siçan genomunun 3X əhatə dairəsində ictimaiyyət üçün açıq olan ardıcıllığı yaradıldı. Digər genomlar çox güman ki, oxşar əhatə dairəsində &ldquo yüngül ardıcıllıqla&rdquo olacaq. Lakin tam, yüksək keyfiyyətli siçan ardıcıllığı, çox güman ki, daha istiqamətlənmiş yanaşmanın aspektlərindən istifadə edəcək. Həmçinin, Celera məclisi (əsasən ov tüfəngi ardıcıllığı) insan genomu ardıcıllığına dair ictimai məlumatlardan da istifadə etdi. Beləliklə, hazırkı səylər həm ov tüfəngi üsulları ilə sürətli ardıcıllıqla, həm də xəritələnmiş klonların ardıcıllığından istifadə edir.

Ardıcıl genomların tədqiqi

Genom ardıcıllığı təsirli bir filogenetik diapazonu əhatə edən bir çox növ üçün mövcuddur. Buraya 28-dən çox eubakteriya, ən azı 6 arxeya, bir göbələk (maya) daxildir. Saccharomyces cerevisiae), protozoa (Plasmodium falciparum), qurd (nematod Caenorhabditis elegans), həşərat (meyvə milçəyi Drosophila melanogaster), iki bitki (Arabadopsisvə düyü (tezliklə)) və iki məməli (insan Homo sapiensvə siçan Mus yerli). Bunlara dair bəzi məlumatlar Cədvəl 4.4-də verilmişdir.

Cədvəl 4.4.Ardıcıl genomlar. Bu cədvəl &ldquoKEGG Pathways (Kyoto Ensiklopediyası Gen və Genomlar) üzrə Xəritəçəkilən Tam Genomların siyahısından əldə edilmişdir&rdquo

Əlavə genomlar əlavə edildi, lakin yalnız bakterial ardıcıllığın nümunələri sadalanır.


Metodlar

Nümunənin hazırlanması və DNT-nin çıxarılması

Koreyanın bağırsaq mikrobiomu layihəsinə cəmi 897 subyekt daxil edilib. Tədqiqatdan əvvəl 3 ay ərzində antibiotik qəbul edən və ya əsas mədə-bağırsaq xəstəlikləri olan xəstələr istisna edildi. Subyektlər 203 kişi və 694 qadından ibarət idi və onların yaşı 20-90 arasında idi. Bütün subyektlər hərtərəfli demoqrafik və həyat tərzi məlumatlarını və qida tezliyi sorğusunu (FFQ) əhatə edən sorğu anketini doldurdular [49]. Subyektlər qan biokimyəvi testlərindən və antropometrik ölçmələrdən keçdi. Klinik ölçmələr və qida tezliyi təfərrüatları daxil olmaqla metaməlumatlar Lim və digərləri tərəfindən müstəqil araşdırmada mövcuddur. [50]. İştirakçıların nəcis nümunələri həm OMNIgene-GUT borusunda (DNT Genotek, Ontario, Kanada) həm də steril nəcis toplama konteynerində toplandı. Mikrob DNT-si QIAamp DNT nəcis mini dəsti (QIAGEN, Hilden, Almaniya) istifadə edərək əlavə muncuq döymə və qızdırma addımları ilə çıxarıldı [51]. Elüsyon tamponunun həcmi 200 μL idi və çıxarılan DNT nümunələri sonrakı istifadəyə qədər - 20 °C-də saxlanıldı.

Arxeal 16S rRNA geninin kitabxana hazırlanması və ardıcıllığı

Arxeal 16S rRNA genlərini gücləndirmək üçün MG 2X PCR mastermiksi (MGmed, Seul, Cənubi Koreya) və Accupower™ Hotstart PCR premiksindən (Bioneer, Daejeon, Cənubi Koreya) istifadə edərək, əvvəllər [28] təsvir edildiyi kimi yuvalanmış PCR birinci ( müvafiq olaraq 25 dövr) və ikinci PCR (25 dövr). Qısaca olaraq, ilk PCR-də SD-Arch-0344-aS-20 və SD-Arch-0911-aA-20 və SD-Arch-0349-aS-17 və SD-Arch-0519-aA- primer cütlərindən istifadə etdik. İkinci PCR-də Illumina adapter ardıcıllığını daxil edən 16. Primer ardıcıllıqları Əlavə fayl 2-də verilmişdir: Əlavə Cədvəl S3. Eyni şablona malik üç PCR məhsulu birləşdirilmişdir. Birinci və ikinci turda əldə edilən məhsulların təmizlənməsi üçün x-tracta™ Gel Extractor (Promega, Madison, WI, ABŞ) və Qiaquick PCR və gel təmizləmə dəsti (QIAGEN) istifadə edilmişdir. 897 nümunə arasından 381-i 1% agaroza gel üzərində elektroforezdən istifadə etməklə təsdiqləndi. PCR ilə zənginləşdirilmiş fraqmentlərin ölçüsünü yoxlamaq üçün Agilent Technologies 2100 bioanalizatoru və DNT 1000 çipindən istifadə edərək şablon ölçüsünün paylanması yoxlanılıb. Arxeal 16S rRNA gen ardıcıllığı üçün kitabxanalar istehsalçının göstərişinə əsasən Nextera DNA Flex kitabxana hazırlama dəstindən (Illumina, San Dieqo, CA, ABŞ) istifadə edilməklə qurulmuşdur. Multipleks indeksləri və Illumina sıralama adapterlərini əlavə etmək üçün sonrakı məhdud dövrəli gücləndirmə addımı yerinə yetirildi. Son məhsullar PicoGreen istifadə edərək normallaşdırıldı və birləşdi və kitabxanaların ölçüsü TapeStation DNT ekran lenti D1000 (Agilent, Santa Clara, CA, ABŞ) istifadə edərək təsdiqləndi. Ardıcıllıq HiSeq™ X platformasından (Illumina) istifadə etməklə həyata keçirilib. Biz həmçinin DNT çıxarılması üçün istifadə edilən bütün reagentlərdə mümkün DNT çirklənməsini araşdırdıq. Arxeal 16S rRNA genini hədəf alan PCR analizi (25 + 25 dövr reaksiyaları) heç bir aşkar çirklənmə aşkar etmədi (Əlavə fayl 1: Əlavə Şəkil S7a). “Boş” mənfi DNT ekstraksiyasından/PZR nəzarətindən əldə edilən PCR amplikonları (yəni, nəcis nümunəsi əlavə olunmayan saxta ekstraksiyadan alınmış şablonun PCR məhsulları n = 3) mənfi nəzarət kimi istifadə edilmişdir (Əlavə fayl 1: Əlavə Şəkil S7b).

16S rRNA gen ardıcıllığı məlumatlarının təhlili

bcl2fastq2 çevirmə proqramından istifadə edərək v. 2.20.0. (Illumina), adapter ardıcıllığı xam FASTQ oxunuşlarından kəsilmiş və kəsilmiş oxunuşlar nümunələrə uyğun olaraq demultipleksləşdirilmişdir. ASV funksiyalar cədvəlini yaratmaq üçün çeşidlənmiş oxunuşlar QIIME2 v. 2018.11 [52] istifadə edərək idxal edildi və emal edildi. Ümumilikdə, 275,909,328 idxal edilmiş qoşa oxunuş DADA2 plaginindən [53] istifadə edərək keyfiyyətli süzülmüş, denoizə edilmiş və birləşdirilmişdir. Ximerik ardıcıllıqlar və təkton ASV-lər sonrakı analizlərdə istisna edilmişdir. Nadirlik əyriləri QIIME2-də plagin müxtəlifliyi alfa-nadirdən istifadə etməklə qurulmuşdur. Taksonomik təsnifat üçün biz q2-feature-classifier plugin, classify-sklearn metodu [54] və 99% identifikasiya ilə əvvəlcədən hazırlanmış SILVA v. 132 verilənlər bazasından [55] istifadə etdik. İnsan bağırsağının arxeal 16S rRNA gen ardıcıllığı verilənlər toplusunun icmalı Əlavə fayl 2: Əlavə Cədvəl S4-də verilmişdir.

16S rRNA geninin ikincil quruluşla oxşarlıqlarını hesablamaq üçün ASV-lər RDP düzləşdiricisindən (https://pyro.cme.msu.edu/aligner/form.spr) istifadə edərək düzülmüşdür. Daha sonra MEGA X-də 1000 bootstraps olan Kimura 2-parametrli modelə əsaslanan qonşu birləşmə alqoritmindən istifadə edərək, hizalanmış ASV-lərdən filogenetik ağac qurmaq üçün istifadə edilmişdir [56]. Filogenetik ağacın vizuallaşdırılması iTOL v. 5 [57] istifadə edərək həyata keçirilmişdir. Haloarxeya tərəfindən təyin edilmiş ardıcıllığın filogenetik təhlili sinfə aid olan növ ştammların 16S rRNA gen ardıcıllığını əhatə etmişdir. Halobakteriyalar və Oxley və başqalarının klon ardıcıllığı. [36], halbuki metanogenlə təyin edilmiş ardıcıllıqlar cinsə aid tip ştammların 16S rRNA gen ardıcıllığını ehtiva edirdi. MetanobrevibakterMetanosfera və ailə Methanomethylophilaceae. Hər bir insan nəcis nümunəsində növ müxtəlifliyini müəyyən etmək üçün QIIME2 v. 2018.11-də q2-müxtəliflik plaginindən istifadə etməklə alfa və beta müxtəliflik təhlilləri aparılmışdır. Nadirlənmənin nəticələrinə əsasən, biz ardıcıllığı 10,000 nümunə dərinliyində subnümunə götürdük (Əlavə fayl 1: Əlavə Şəkil S1) və 381 arxeal ardıcıllıq-müsbət nümunədən 342-ni daxil etdik. Sonradan metadata əsasında qrup fərqi müəyyən edildi.

Arxeal enterotiplər əvvəllər təsvir edildiyi kimi müəyyən edilmişdir [58]. Qısaca olaraq, nümunələr ailə səviyyəsində Bray-Curtis fərqlilik matrisi [60] ilə PAM klasterindən [59] istifadə edərək qruplaşdırıldı. Klasterlərin optimal sayı siluet indeksindən istifadə etməklə müəyyən edilmişdir [61]. Enterotiplər PCoA süjeti ilə vizuallaşdırıldı. Digər nümunə kohortlarında haloarxeylərə təyin edilmiş ardıcıllığı tapmaq üçün biz EBI MGnify [62] istifadə edərək, həm ictimaiyyətə açıq olan insan metagenomik, həm də metataksonomik məlumat dəstlərini trol etdik. Bütün məlumatlar EBI MGnify verilənlər bazasından əldə edilmişdir.

Mənfi idarələr üçün HiSeq istifadə edərək yaradılan arxaeal 16S rRNA verilənlər bazası Əlavə fayl 2-də ümumiləşdirilmişdir: Əlavə Cədvəl S5. Mənfi idarələr üçün taksonomik annotasiya məlumatları Əlavə fayl 2-də göstərilir: Əlavə Cədvəl S6. Mənfi nəzarətlərdə təyin edilmiş oxunuşların əksəriyyətinin insan bağırsağında olma ehtimalı çox az idi və bu, arxeal 16S rRNA gen analizinə çirklənmənin heç bir (və ya çox az) təsirinin olmadığını göstərir.

Arxeylərin bolluğunun qiymətləndirilməsi

DNT yuxarıda göstərildiyi kimi nəcis nümunələrindən çıxarıldı. Ümumilikdə, 150 nümunə təsadüfi seçilmiş və üç təkrarda real vaxt kəmiyyət PCR [11]-ə məruz qalmışdır. Arxeal primer ardıcıllıqları Əlavə fayl 2-də verilmişdir: Əlavə Cədvəl S3. Nəzarət kimi bakterial 16S rRNA geni (primerlər Bac1055YF və Bac1392R) istifadə edilmişdir [63]. PCR CFX96™ real vaxt rejimində PCR aşkarlama sistemindən (Bio-Rad, Hercules, CA, ABŞ) istifadə edərək 10 μL TOPreal qPCR 2X premiksi (Enzynomics, Daejeon, Cənubi Koreya), 300 nM irəli və tərs primerlərin hər biri və 2 ng şablon DNT. Cq dəyərləri Bio-Rad CFX Manager proqram versiyası 3.1 istifadə edərək müəyyən edilmişdir. Escherichia coli K12 və Haloplanus salinus JCM 18368 T standart əyriləri qurmaq və kəmiyyət təhlilini aparmaq üçün istifadə edilmişdir. PCR səmərəliliyi və R 2 bakteriya üçün 96,92% və 0,9995, arxeya üçün isə müvafiq olaraq 97,57% və 0,9983 olmuşdur.

Floresans in situ hibridləşmə analizi

Flüoresan in situ hibridləşmə (FISH) analizi Hugenholtz [64] metoduna əsasən kiçik modifikasiya ilə aparılmışdır. Qısaca olaraq, haloarxeya üçün xüsusi zond (HALO775) ARB proqram təminatından istifadə etməklə dizayn edilmişdir [65]. HALO775-in spesifikliyi SILVA-da TestProbe əsasında qiymətləndirilib (SILVA SSU verilənlər bazası v.138) və ProbeMatch in ribosomal verilənlər bazası layihəsi (RDP, v. 11.5) verilənlər bazaları (Əlavə fayl 2: Əlavə Cədvəllər S1 və S2). Dizayn edilmiş zond, bakterial 16S rRNA gen hədəfləmə zondu EUB338 [66] və qeyri-spesifik zond NONEUB [67] 5′ ucunda Macrogen (Seul, Cənubi Koreya) tərəfindən müvafiq olaraq Cy3, Cy5 və FAM ilə sintez edilmiş və etiketlənmişdir. . Mümkün çarpaz bağlanma fəaliyyətini qiymətləndirmək üçün biz HALO775-in haloarxeona bağlanma fəaliyyətini sınaqdan keçirdik (Haloplanus salinus JCM 18368 T ), bakteriya (Escherichia coli K12) və başqa bir arxeon (Methanobrevibacter Smithii JCM 30028 T). Becərilmiş bakteriya və arxeylər PBS-də 4% paraformaldehid ilə 4 ° C-də 4 saat ərzində fiksasiya edildi və sabit nümunələr PBS-də yuyuldu və tədricən PBS-etanol məhlulunda susuzlaşdırıldı (son nisbət 1: 1, həcm/həcm) . Hibridləşmə 20% formamid hibridləşmə tamponu ilə 46 °C-də aparıldı. Daha sonra 48 °C-də yenidən yuyulma aparıldı. Hər ikisi məcburi olmayan zond (NONEUBFAM) və qeyri-zond nəzarətləri həmişə yanlış müsbətləri deşifrə etmək üçün daxil edilmişdir. Nümunələr konfokal mikroskop altında (LSM710 Carl Zeiss, Oberkochen, Almaniya) ZEN v. 3.1 (mavi nəşr, Carl Zeiss) təsvir proqramından istifadə edərək × 1000 böyüdücü ilə müşahidə edilmişdir.

Duzluluğun və qeyri-üzvi elementlərin ölçülməsi

Haloarxeylərin nisbi bolluğuna görə 20 nəcis nümunəsi seçilmişdir. Hər bir nümunə (200 mq) 1 ml distillə edilmiş suda seyreltildi və duzluluq duzluluq refraktometrindən (Ataqo, Yaponiya) istifadə edilərək ölçüldü. Bu nümunələrdən qeyri-üzvi elementlər əvvəllər təsvir edildiyi kimi ICP-MS istifadə edərək ölçüldü [68].

Statistik təhlil

Korrelyasiya əmsalı analizindən və çoxsaylı nümunələrin müqayisəsindən əvvəl normallıq testləri (Şapiro-Uilk) aparılmışdır. Korrelyasiya əmsalı təhlili pəhriz qidaları, klinik metadata və qida kateqoriyaları ilə bağlı mütənasib olaraq bol olan arxeal taksonların nisbi bolluğuna əsasən aparılmışdır. Çoxsaylı nümunələr qeyri-parametrik Kruskal-Vallis testindən, sonra isə Dunn çoxlu müqayisə testindən istifadə edilərək müqayisə edildi. PERMANOVA analizi Bray-Curtis və Jaccard fərqlilik matrisləri əsasında 999 permutasiya ilə aparılmışdır. Bütün statistik təhlillər GraphPad Prism proqram təminatı v. 7.05 (*) istifadə edərək aparılmışdır.P < 0,05, **P < 0,01 və ***P < 0,001).


Videoya baxın: Xoşqədəm sən Kəlbəcərin 1 nömrəli fahişəsisən. Yaxın otur sübut edirəm. Suleyman Suleymanli (Avqust 2022).