Məlumat

3.6: cDNT və Genomik Kitabxanalar - Biologiya


Müvafiq genetik məlumatın izolyasiyası

İstənilən geni sintez etmək əvəzinə, müvafiq genetik məlumatı birbaşa təcrid etmək üçün amin turşusu məlumatından istifadə edə bilərikmi?

  • Genetik məlumatın iki ümumi mənbəyi var:
  1. Genomik DNT
  2. mRNT

Əgər nəzərə alsaq genomik DNT eukariotlardan, onda nəzərə alınmalı bir neçə şey var:

  1. Maraqlanan bir genin kodlaşdırma bölgəsi ola bilər kəsildi bir və ya daha çox intron bölgələr və beləliklə, tam kodlaşdırma bölgəsi olduqca uzun ola bilər.
  2. Birinci təxminə görə, genomik məlumatı təcrid etmək üçün hansı toxumadan istifadə etməyimizin əhəmiyyəti yoxdur, yəni genomik məzmun bütün toxumalarda eynidir.

Eukariotlardan mRNT-ni nəzərdən keçirsək, aşağıdakı üstünlükləri dərk edə bilərik:

  1. İntronlar əlavə olunacaq və mRNT-də bitişik kodlaşdırma bölgəsi olacaqdır.
  2. Maraqlanan zülalın toxuma spesifik ifadəsi bizə müvafiq mRNT-ni gücləndirilmiş səviyyələrdə təcrid etməyə imkan verə bilər, yəni. zülalın ifadə olunduğu toxumalarda mRNT səviyyələri müvafiq genomik səviyyələrdən xeyli yüksəkdir (mRNT-nin molekulları genin nüsxələrindən daha çoxdur).

Kitabxanalar

"Kitabxana" genetik məlumatın rahat saxlanması mexanizmidir.

  • Onlar adətən ya "genomik" və ya "cDNA" (yəni DNT şəklində mRNT) genetik məlumatdır.
  • Müvafiq polipeptid məlumatından çıxarılan genetik ardıcıllıqlar kitabxana daxilində xüsusi genetik məlumatı müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər.

CDNA kitabxanasının qurulması

"Tərs transkripsiya" mRNT-də olan genetik məlumatın yenidən ikiqat zəncirli DNT formasına çevrildiyi mexanizmdir.

Bunun üçün məsul olan ferment RNT-dən asılı DNT polimeraza adlanır əks transkriptaza.

  • Əks transkriptazalar ənənəvi olaraq təcrid edilmişdir viruslar genomu əslində RNT şəklindədir və dupleks DNT-yə çevrilməlidir.
  • Bu viruslar hüceyrələrə yoluxduqda adətən mRNT genetik komponenti ilə birlikdə funksional tərs transkriptaza daşıyırlar.
  • Ticarətdə mövcud olan ən çox yayılmış tərs transkriptazalardan biridir Moloney fare leykoz virusudur (MMLV).
  • Bu RNT-dən asılı DNT polimeraza (bütün polimerazalar kimi) RNT-dən istifadə edərək 5'-3' istiqamətdə yeni bir polinukleotidə nukleotidlər əlavə edir. şablon. Tərkibində heç bir 3'->5' eksonükleaz (korrektor) fəaliyyəti yoxdur.

MMLV şablon kimi mRNA-dan istifadə edəcək, lakin tələb olunur primer (bir DNT primerini genişləndirə bilər, lakin birini sintez edə bilməz).

  • Eukaryotik mRNT-lər haqqında həqiqətən səliqəli şeylərdən biri də varlığıdır 3' poli A trekləri.
Buna görə də, müxtəlif eukaryotik mRNT-lər üçün poli dT-dən tək primer kimi istifadə edə bilərik.
Şəkil 3.6.1: Birinci zəncir sintezi
Qeyd edək ki, biz istehsal etmişik tamamlayıcı DNT (və ya cDNA) orijinal mRNT zəncirinə.

Əgər bu DNT/RNT dupleksinin RNT yarısına "nicklər" daxil edə bilsək, vəziyyət prokaryotik genomik DNT-nin "geri qalan zəncir" sintezində müşahidə olunan vəziyyətə çox oxşar olardı.

  • Molekulun RNT yarısında niklər RNTaz H fermentinin təsiri ilə daxil edilə bilər.
  • Bu ferment RNT/DNT hibridlərinin RNT hissəsinin endonükleolitik parçalanmasını, həmçinin 5'->3' və 3'->5' ekzoribonukleaz aktivliyini nümayiş etdirir.
  • Başqa sözlə, RNT-ni parçalayacaq və sonra hər iki istiqamətdə həzm etməyə davam edəcək:
Şəkil 3.6.2: mRNT-də niklər
  • Bu RNT fraqmentləri indi DNT sintezi üçün primer kimi xidmət edə bilər E. coli Pol I. Bu ferment RNT primerlərini effektiv şəkildə aradan qaldırmaq üçün "nikləri" də tərcümə edəcək:

Şəkil 3.6.3: DNT sintezi

Nəzərə alın ki, biz potensial olaraq ya qalıq 5' RNT qapağı bölgəsinə, ya da orijinal mRNA zəncirinin 5' ucunda boşluğa sahib olacağıq.

CDNT-nin plazmidə daxil edilməsi.

Faydalı cDNA kitabxanasının tikintisimizi başa çatdırmaq üçün bizə bir yol lazımdır saxlamaq və təbliğ etmək bizim cDNA.

  • Buna cDNA-nı uyğun bir yerə daxil etməklə nail ola bilərik plazmid.
  • Bu işi yerinə yetirməyin iki klassik yolu var:
  1. Homopolimer qalıq
  2. Bağlayıcı əlavə

Homopolimer qalıq

Terminal transferaz yalnız a adlı eukaryotik hüceyrə tipində olan qeyri-adi DNT polimerazadır prelimfosit.

  • iştirakı ilə a ikivalent kation ferment dNTP-lərin əlavə edilməsini katalizləyir 3'-hidroksil sonları DNT.
  • Əlavə ediləcək nukleotid purin olduqda, Mg2+ istifadə olunan katyondur.
  • Əlavə ediləcək nukleotid pirimidin olduqda, Co2+ istifadə olunur.
  • Reaksiya şəraitindən asılı olaraq üçdən bir neçə minə qədər baza əlavə olunacaq.

Şəkil 3.6.4: Terminal transferaz fəaliyyəti

Bunu plazmidə necə yerləşdirə bilərik?
  • Plazmidimizi kəsib terminal transferazla müalicə etsək, indi əlavə edirik tamamlayıcı baza cDNT-mizə əlavə etdiyimiz birinə cDNT-ni plazmidə birləşdirə və bağlaya bilərik.

Şəkil 3.6.5: cDNT-nin plazmidə bağlanması

  • C-quyruqlu cDNA insertinin vektorda G-quyruqlu Pst I sahəsinə daxil edilməsinin faydası aşağıdakı kimidir:
  1. Pst I tanınma ardıcıllığı və parçalanma yeridir
    5' C T G C A G 3'
    3' G A C G T C 5'
  2. Bu saytın Pst I tərəfindən parçalanması, ardından G-tailing istehsal edəcək
    5' C T G C A (G)n G 3'
    3' G (G)n A C G T C 5'
Beləliklə, Pst I-in tanınması parçalanma sahəsi bərpa olunur və C-quyruqlu cDNA əlavəsi Pst I ilə parçalanaraq yenidən kitabxana vektorundan çıxarıla bilər.

Bağlayıcılar

Kitabxana vektoruna cDNA fraqmentlərini daxil etmək üçün alternativ üsul "bağlayıcıların" əlavə edilməsidir.

  • Bağlayıcılar adətən qısa oliqonukleotidlərdir (~18-24 mers). palindromik və tək və ya təkrar məhdudiyyəti ehtiva edir endonükleazların tanınması ardıcıllığı.
  • Palindromik təbiət bağlayıcı oliqonukleotidə imkan verir özünü hibridləşdirir küt meydana gətirmək sona çatdı dupleks.
  • cDNT fraqmentlərinin ucları kütdürsə, onda faydalı terminal məhdudlaşdırma saytlarını təqdim etmək üçün bağlayıcı hər iki ucuna bağlana bilər.

Bağlayıcı əlavə etmək üçün addımlar aşağıdakılardır:

  1. cDNA-nın S1 nukleaza ilə müalicəsi (cDNA dupleksində qalan mümkün 5' qapaqlı mRNT fraqmentini çıxarmaq üçün
  2. Potensial "cırıq" ucları Pol I ilə müalicə etməklə küt hala gətirin (5' çıxıntıları dolduracaq və 3' çıxıntıları çeynəyəcək)
  3. Eco RI methylase (plus S-adenosyl metionin) ilə müalicə ilə potensial daxili Eko RI sahələrində cDNA-nı metilləşdirin
  4. T4 DNT liqazasından istifadə edərək küt, metilləşdirilmiş cDNA-ya bağlayın
  5. Eco RI məhdudlaşdırıcı endonükleaz ilə bağlayıcıları kəsin
  6. Agaroz gel elektroforezi ilə cDNA fraqmentlərindən bağlayıcı fraqmentləri çıxarın
  7. cDNA-nı vektor DNT fraqmentinə bağlayın (Eco RI məhdudlaşdırıcı endonükleaz tərəfindən açılır
İnsanla ilk uçuşdan Aya eniş arasındakı müddət (1902-1969):
67 il
DNT strukturunun kəşfi ilə bütün insan genomunun ardıcıllığının müəyyən edilməsi arasındakı müddət (1953-2010?)
57 il (?)

Redaksiya qeydi

Bu dərslik 1998-ci ildə nəşr edilmişdir. İnsan Genomu Layihəsi 2003-cü ildə tamamlanmışdır.

Genomik DNT kitabxanaları

Bəzi genomların və xromosomların ölçüsü:

Müqayisəli Sıra Ölçüləri
(Əsaslar)
(maya xromosomu 3)
350 min
Escherichia coli (bakteriya) genomu
4,6 milyon
Ən böyük maya xromosomu indi xəritələndi
5,8 milyon
Bütün maya genomu (tamamlanmış 5/96)
15 milyon
Ən kiçik insan xromosomu (Y)
50 milyon
Ən böyük insan xromosomu (1)
250 milyon
Bütün insan genomu
3 milyard
  • İnsan genomunda təxminən 23 cüt xromosomda səpələnmiş 3-4 milyard baza cüt DNT daxilində təxminən 50.000 unikal gen var.

Kitabxana tikintisi üçün genomik DNT-nin parçalanması

Endonükleaz həzminin məhdudlaşdırılması

  • Altı kəsici (məsələn, Eco RI) orta hesabla kəsəcək hər 4,1 Kb. İnsan DNT-sinin bu tip fermentlə tam həzm olunması təxminən 1 x 10 ilə nəticələnəcək6 unikal fraqmentlər.
  • Verilmiş kitabxanada klonun tapılma ehtimalı nədir?

Kitabxanada hər hansı bir DNT ardıcıllığının olmasının dəqiq ehtimalı tənlikdən hesablana bilər

N = ln(1 -P)/ln(1 - f)
P arzu olunan ehtimaldır
f tək rekombinantda genomun fraksiya nisbətidir
N rekombinantların zəruri sayıdır

Məsələn, 6 kəsici ilə həzm yolu ilə yaradılmış kitabxanada istədiyiniz ardıcıllığı tapmaq üçün 99% ehtimala sahib olmaq üçün sizə nə qədər böyük bir kitabxana (yəni neçə klon) lazımdır?

N = ln(1 - 0,99)/ln(1 - (4096/3x10)9))
N = 3,37 x 106 klonlar

Beləliklə, bu cür təhlildən görə bilərik ki, bizə aşağıdakıları əldə etməyə imkan verəcək bir texnologiya lazımdır:

  1. Klonlama vektorumuza nisbətən böyük DNT fraqmentlərinin sabit daxil edilməsi
  2. Yerləşdirmənin yüksək səmərəliliyi və çoxlu sayda klonları idarə etmək imkanı
  • Məsələn, örtük edərkən E. coli 3" petri plitəsində koloniyalar, ayrı-ayrı koloniyaların təcrid olunmasına imkan verən maksimum praktik sıxlıq təxminəndir. 100-200 boşqab başına koloniyalar.
  • 3.37 x 10 ölçüsündə olan kitabxanamızı örtməyə çalışsaydıq6 belə bir şəkildə təxminən 22.500 boşqab lazımdır.
  • Yalnız bu deyil, belə böyük DNT fraqmentləri tipik olaraq yaxşı tolere edilmir E. coli pBR322 kimi vektorların klonlanması.

Bakteriofaq lambda vektorları genomik kitabxanaların qurulması üçün geniş istifadə olunur

Bakteriofaq l bir E. coli viral genomu ehtiva edən bir növ ikosahedral faq hissəcikləri olan faj:

Şəkil 3.6.6: Bakteriofaza l

  • Replikasiya zamanı faj DNT-si konkatamerik formada istehsal olunur ki, bu da faj kapsidi daxilində tək genomun qablaşdırılmasına imkan vermək üçün müvafiq endonükleazlar tərəfindən parçalanır.
  • Müəyyən edilmişdir ki, fag genomunun fag replikasiyası üçün vacib olmayan daxili bölgələri çıxarıla və maraq doğuran DNT ilə əvəz edilə bilər.
  • Bu hibrid DNT səmərəli şəkildə qablaşdırıla bilər və yoluxucu bir faq meydana gətirə bilər.

Şəkil 3.6.7: Effektiv olmayan fagın yaradılması

Bu tip sistemin pBR322 kimi plazmidlərə qarşı üstünlükləri bunlardır:

  1. Fag genomu 20 Kb-a qədər DNT əlavələri ilə səmərəli şəkildə paketləyə bilir..
  2. Bundan əlavə, qablaşdırılmış faq yüksək yoluxucudur və plazmid çevrilmə üsullarından daha yüksək effektivliklə E. coli-ni yoluxdurur..

Genomik DNT-nin natamam həzmi ardıcıllıqla üst-üstə düşmələri müəyyən etməyə imkan verəcəkdir

Endonükleaz ilə tam həzm, ehtiva edən bir kitabxana ilə nəticələnəcək üst-üstə düşən fraqmentlər yoxdur:

Bununla belə, natamam həzm üst-üstə düşən fraqmentləri ehtiva edən kitabxana ilə nəticələnəcək:

  • Beləliklə, ardıcıllıqla əldə edilən məlumatlar bir klon ehtiva edən klonların təcrid olunmasına imkan verəcəkdir qonşu (üst-üstə düşən) ardıcıllıq məlumatları.
  • Bu, ardıcıl məlumatların böyük bitişik uzantılarını əldə etməyə imkan verə bilər ("Xromosom Gəzintisi").

Kitabxanaların araşdırılması

Kitabxana (cDNT və ya genomik) qurulduqdan sonra biz maraqlı DNT ehtiva edən klonları müəyyən etmək istəyirik.

  • Məsələn, zülal ardıcıllığı haqqında məlumat əldə edə bilərik müvafiq DNT ardıcıllığının mümkün uzantılarını çıxarmaq (ancaq kodonların degenerasiyası səbəbindən qeyri-müəyyənlik olacaq).
  • Maraqlanan DNT ardıcıllığımızı tamamlayan bir oliqonukleotidi sintez edə bilsək, onu kitabxanamızdakı müvafiq klona xüsusi hibridləşdirmək üçün istifadə edə bilərik (yəni. prob bizim kitabxana).

Standart metodologiyalarda oliqonukleotiddir fosforlanmış radioetiketli g ilə 5' sonunda32P-ATP və T4 polinükleotid kinaz.

  • Sonra zond nitroselülozaya bərkidilmiş və onların DNT-si baza ilə müalicə olunaraq denatürasiya edilmiş fərdi faj lövhələri ilə inkubasiya edilir.
  • Əgər lövhədə zond ardıcıllığı üçün tamamlayıcı DNT varsa, zond hibridləşəcək.
  • Nitroselüloz (bir çox fərdi lövhə ehtiva edir) rentgen filminə məruz qalırsa, yalnız hibridləşdirilmiş zondlu lövhələr görünəcək (qaranlıq ləkə kimi):

Şəkil 3.6.8: Radioaktiv lövhə

Qeyd edək ki, nitroselülozun rentgen filminə münasibətdə oriyentasiyasını izləmək vacibdir (adətən nitroselülozun oriyentasiyasını müəyyən etmək üçün radioaktiv mürəkkəbdən istifadə olunur).

Yanlış pozitivlər

Əgər zülal ardıcıllığı məlumatlarından DNT problarını tərtib etsək, əlimizdə olacaq mümkün qeyri-müəyyənlik probun dizaynı üçün istifadə etdiyimiz çıxarılmış DNT ardıcıllığında.

  • Adətən 14-24mer oliqonukleotidlər zondlar kimi istifadə olunur, 14-24mer zond bizə bir uzantıya ehtiyacımız olduğunu bildirir. 5-8 amin turşusu polipeptiddə.
  • Seçimi nəzərə alaraq, bir polipeptiddə axtarmaq üçün ən yaxşı amin turşusu ardıcıllığı olanlardır aşağı kodon degenerasiyası (yuxarıya bax).
  • Beləliklə, inşallah ehtiva edən polipeptid ardıcıllığının qısa bir hissəsini axtaracağıq Met və ya Trp, və ya ibarət qalan amin turşuları ilə Phe, Tyr, His, Gln, Asn, Lys, Asp, Glu və ya Cys.
  • Regionlar daxil olmaqla Leu, Arg və ya Ser olacaqlar qarşısını aldı (hər biri 6 kodon).

Oliqonukleotidlərin sintezi zamanı çoxlu əsaslar qeyri-müəyyən mövqelərə daxil ediləcək.

  • Beləliklə, bizim probumuz əslində a olacaq oliqonukleotidlərin qarışığı.
  • Degenerasiya nə qədər yüksək olarsa, "yanlış pozitivlərin", yəni hibridləşən, lakin istədiyimiz ardıcıllıqla əlaqəsi olmayan klonların olma ehtimalı bir o qədər çox olar.
  • Müsbət klonlar ardıcıllaşdırılır və çıxarılan amin turşusu ardıcıllığı düzgün klonları müəyyən etmək üçün polipeptid ardıcıllığı məlumatımızla müqayisə edilir.

Antikorlar (immunoqlobulinlər)

Əgər cDNA kitabxanasını qurmaq üçün istifadə olunan xüsusi vektor və ya faq a ehtiva edir təşviqatçı yerləşdirmə saytının yuxarı hissəsindəki bölgəni axtararaq istənilən klonları yoxlaya bilərik maraq zülalının ifadəsi.

  • Bu halda, bizə hər ikisi olan bir analiz lazımdır həssas (biz çox protein istehsal etməyəcəyik) və spesifik (biz hər hansı yanlış müsbətləri minimuma endirmək istəyirik).
  • Həm həssas, həm də spesifik olan ən yaxşı analizlərdən biri istifadə edir antikorlar.

Antigen, antikor, epitop

Onurğalıların müdafiə mexanizmlərindən biri də onları ayırd etmək qabiliyyətidir özüqeyri-mən molekullar.

  • Beləliklə, yad bir molekul (başqa bir növdən və ya bəzən bir növ içərisindəki başqa bir fərddən) onurğalı orqanizmi işğal edərsə, immunitet sistemi bu molekulu müəyyən etməyi öyrənmək üçün fəaliyyət göstərir.
  • Eyni molekulun gələcək işğallarında orqanizm özünəməxsus molekullar istehsal edərək ona qarşı müdafiə təşkil edir. antikorlar xaricini tanıyan və bağlayan antigen.
  • Antikorlar antigenə bağlandıqda, bəzi ağ qan hüceyrələri (makrofaqlar və monositlər) işğalçı bədəni yad olaraq tanıyır və onu məhv etməklə cavab verirlər.

Antikorlar iki eyni ağır zəncir və iki eyni yüngül zəncirdən ibarət “Y” formalı molekullardır.

  • 'Y' hərfinin kökü aşağıdakılardan ibarətdir Fc (sabit) domeni, və 'Y'nin 'qolları' ibarətdir Fab (dəyişən) domenlər.
  • Antigenlər bağlanır tamamlayıcılığı müəyyən edən bölgələr (CDR) Fab domenlərinin sonunda yerləşir.

Şəkil 3.6.9: Antikor quruluşu

Antikorlar B limfositləri tərəfindən sintez olunur. Hər bir B limfosit xüsusi struktur determinantına qarşı yönəlmiş bir növ antikor istehsal edə bilir və ya epitop, bir antigen üzərində.

  • Beləliklə, bir zülal antigeninə immun reaksiyası B limfositlərinin hər biri xarici zülalın fərqli struktur determinantını tanıyan antikorlar istehsal etməsi ilə nəticələnə bilər.
  • Epitop a ola bilər 5 və ya 6 amin turşusunun bitişik bölgəsi xarici polipeptiddə və ya epitopda yerli zülalda yan-yana gətirilən yarım onlarla və ya daha çox amin turşusu ola bilər, lakin polipeptid ardıcıllığında geniş şəkildə yerləşmişdir.
  • Beləliklə, bəzi antikorlar yerli tanıyacaq yad zülalın denatürasiya olunmuş formaları eyni dərəcədə yaxşı olar, digər antikorlar isə yalnız birini və ya digərini tanıya bilər.

Maraqlanan zülal təmizlənibsə, ondan istifadə etmək olar ev sahibi heyvanda immun cavabı yaradır.

  • Tipik ev sahibi heyvanlara siçan, toyuq, dovşan, keçi, qoyun, at və bəzən insan daxildir.
  • İlkin immunizasiyadan sonra, bir və ya bir neçə gücləndirici iynə vurulduqdan sonra, ev sahibi heyvanın B limfositləri antigenə qarşı yönəlmiş antikorlar istehsal edə bilər.
  • Antikorlar heyvandan alınan qan nümunələrindən təmizlənə bilər. Antikorların belə hazırlıqları olduğu deyilir poliklonal.
  • Bu, mövcud olan antikorların müxtəlif B limfositlərinin kolleksiyasından olduğuna və beləliklə, müxtəlif epitoplar antigen zülalı üzərində.
  • Qan nümunələrindən antikorları təcrid etmək qabiliyyəti o deməkdir ki, ev sahibi heyvanın məhv edilməsinə ehtiyac yoxdur.
  • Əlbəttə ki, heyvanın ölçüsü nə qədər antikor əldə edə biləcəyini müəyyənləşdirir. Məsələn, bir dovşan hər iki həftədə 5 ml qan verə bilər, siçan əhəmiyyətli dərəcədə az, at isə bir qədər çox qan verə bilər.

a-dan təcrid olunmuş anticisim tək B limfosit hüceyrə populyasiyası adlanır monoklonal.

  • tanıyır a tək epitop antigen zülal üzərində.
  • B limfositləri istehsal edən antikorlar dalaqdan və ya limfa düyünlərindən təcrid oluna bilər. Bununla belə, onların bir sonlu həyat qarışmədəniyyətdə, yəni müəyyən sayda hüceyrə bölünməsinə məruz qalacaq və sonra öləcəklər.
  • Bununla belə, bu hüceyrələr ölümsüz (xərçəngli miyelom) limfositlərlə birləşə bilər. hibridom hüceyrə.
  • Belə bir hüceyrə ölməz miyelom kimi və B limfositindən spesifik antikor istehsal edir. Mədəniyyətdə qeyri-müəyyən müddətə böyümək qabiliyyəti spesifik faydalı miqdarda təcrid etməyə imkan verir monoklonal antikorlar.

Bəzən maraq doğuran zülal ilə immunizasiya problemlidir: müvafiq miqdarda təmizlənmiş material istehsal oluna bilməz və ya zülalın özü immun reaksiya yaratmaq üçün lazım olan dozada zəhərlidir.

  • Qismən ardıcıllıq məlumatı məlumdursa, zülalın qısa fraqmentlərini təmsil edən böyük miqdarda polipeptidlər sintez edilə və heyvanı immunizasiya etmək üçün istifadə edilə bilər.
  • Çox vaxt bu polipeptidlər antigen reaksiyasını artırmaq üçün daşıyıcı zülala (adətən serum albumin) kovalent şəkildə bağlanır.
  • Belə peptidlərə qarşı istehsal edilən antikorlar yalnız polipeptid daxilindəki epitopları tanıyacaq. Beləliklə, hətta poliklonal antikorlar da epitopun tanınmasında kifayət qədər məhdud olardı.

Radioaktiv etiketli oliqonukleotidlərdə olduğu kimi, antikorlar maraq doğuran cDNA ehtiva edən kitabxana klonlarını müəyyən etmək üçün istifadə edilə bilər. Bu üsul, şübhəsiz ki, genomik DNT-nin daxil olduğu yerdən yuxarı bir promotoru ehtiva edən host vektoruna və ya faja əsaslanır..

  • Antikorlar nitroselüloza bağlanmış viral lövhələri və ya plazmid kloniyaları yoxlamaq üçün istifadə edilə bilər.
  • Bağlanmış antikorlar radioaktiv etiketli zülal A (immunoqlobulinlərə bağlanır) və ya boya və ya boya buraxan fermenti kovalent bağlanmış ikinci antikor (protein A kimi ümumi immunoqlobulinləri tanıya bilər) vasitəsilə müəyyən edilə bilər.

3.6: cDNT və Genomik Kitabxanalar - Biologiya

Bu ferment tərs transkriptaza bizə ikiqat zəncirli cDNA surəti yaratmaq üçün RNT şablonundan istifadə etməyə imkan verir. Əks transkriptaza H.Temin və D.Baltimor tərəfindən retrovirusları tədqiq edərkən aşkar edilmişdir. Retrovirusların tərkibində bir DNT nüsxəsinə çevrilən və replikativ dövrü ərzində ev sahibi genomuna inteqrasiya olunan bir RNT genomu var. Bu, çoxlu şiş virusları və QİÇS virusu HİV daxil olmaqla maraqlı viruslar toplusudur.

Əks transkriptaza RNT-dən asılı DNT polimerazdır. Şablon kimi RNT-dən istifadə edir, DNT polimerləşməsini başlatmaq üçün dNTP-lər və primer (sərbəst 3' OH) tələb edir.

İki növ astar ümumiyyətlə istifadə olunur.

Oliqo-dT mRNT-lərin 3' ucundan astarlanmağa başlayır.
Oliqo-dT ilə hazırlanmış cDNA-lar mRNA 3' ucları üçün zənginləşdirilmişdir.

Təsadüfi oliqonukleotidlər mRNT ardıcıllığı və əsas cDNT sintezi boyunca istənilən yerdə hibridləşə bilər. Təsadüfi olaraq hazırlanmış cDNA-lar şablonun uzunluğu boyunca paylanır və buna görə də mRNT populyasiyasını daha çox təmsil edir.

mRNA-lar adətən qısadır (genomla müqayisədə) - əksər mRNA-ların uzunluğu 6 kb-dan azdır və yalnız nadir mRNT-lərin uzunluğu 10 kb-dan çoxdur.
Bu kiçik ölçü o deməkdir ki, həm plazmid, həm də fag daxiletmə vektorları cDNT kitabxanalarının qurulması üçün uyğundur.
(fag əvəzedici vektorlarına üstünlük verilən genomik kitabxanalardan fərqli olaraq).

Genomik kitabxanalarla bağlı müzakirəmizdə biz genomun tam əhatə olunmasına diqqət yetirdik.
Təsadüfi genomik fraqmentlər tez-tez kəsici fermentlə qismən həzm yolu ilə yaradılmışdır.
Nəticədə təsadüfi ov tüfəngi kitabxanası tam genom ardıcıllığını əhatə edən çoxlu üst-üstə düşən klonları ehtiva edir.

cDNA kitabxanaları bir az fərqlidir.
Burada hər bir bakterial transformant və ya qablaşdırılmış faq unikal mRNT molekulunu təmsil edir.
Eyni DNT ardıcıllığını ehtiva edən rekombinantlar orijinal mRNT populyasiyasında mövcud olan müxtəlif şablon molekulları təmsil edir.

Məsələn, hüceyrədə müəyyən bir zamanda 100.000 mRNT molekulu var.
Onların 10%-i yüksək ifadəli mRNT-lərdir (deyək ki, aktin mRNA)
sonra 100.000 klondan ibarət ilkin cDNT kitabxanasında,
Onların 10%-i (10.000) aktin cDNA-ları olacaq.
Və ya sadəcə bir neçə yüz cDNA-nı yoxlaya və hələ də aktin cDNA-larını tapa bilərsiniz.

Aktini öyrənmək istəyirsinizsə, bu çox gözəldir.

Yalnız aşağı səviyyələrdə ifadə olunan bəzi nadir transkripsiya faktorunu öyrənmək istəyirsinizsə nə etməli?
100.000 mRNT-nizdə transkripsiya faktorunuzu kodlayan yalnız 10 mRNA ola bilər.
İndi 100.000 klondan ibarət bütün kitabxananızı ekranlaşdırmalısınız.

Transkriptiniz yalnız qısa müddətə aşağı səviyyələrdə ifadə edilibsə, o, daha aşağı səviyyələrdə mövcud ola bilər.

Standart cDNA kitabxanasındakı rekombinant faqların əksəriyyəti yüksək ifadə olunmuş ardıcıllıqları daşıyır.
Kitabxananız çox böyük olmadıqda nadir mRNA-ları tapmaq çətindir (rekombinantların sayı - 99% ehtimalla 100.000 transkriptdən ibarət mRNA populyasiyasını əhatə etmək üçün 10 6-dan çox müstəqil rekombinantdan ibarət olmalıdır).

Müstəqil rekombinantların sayının artmasının skrininqinə alternativ, əvvəllər müzakirə etdiyimiz kimi hibidizasiya kinetikasından istifadə edərək kitabxananı “normallaşdırmaq”dır.
Normallaşdırılmış kitabxanalarda yüksək ifadə olunmuş mRNA-ların daha az nüsxəsi (hibridləşmə zamanı çıxarılır) və nadir transkriptlərin daha çox nüsxəsi (nisbi mənada) olur.


DNT: Həyatın Tikinti Bloku

Dezoksiribonuklein turşusu (DNT) böyümədən maddələr mübadiləsinə, çoxalmaya qədər bir orqanizmin funksiyalarının bütün aspektləri üçün təlimatları daşıyan molekuldur. Canlı orqanizmlərdə DNT-nin çox hissəsi hər bir hüceyrədə nüvənin içərisində yerləşən xromosomlar adlanan sıx qıvrılmış strukturlarda yerləşir. DNT Şəkil 1-də göstərilən dörd azotlu əsasdan birindən ibarət olan nukleotidlər adlanan dörd müxtəlif tikinti blokundan ibarətdir. Bunlar purinlərdir: guanin (G) və adenin (A) və pirimidinlər: timin ( T) və sitozin (C). Bu nukleotidlər bir dezoksiriboza şəkəri ilə birləşir və bəziləri 100.000.000 molekuldan çox uzun ola bilən uzun zəncirlər yaratmaq üçün fosfat əlaqələri vasitəsilə digər dezoksiriboza şəkərlərinə bağlana bilirlər. DNT zəncirindəki hər bir dezoksiriboza dörd azotlu əsasdan (G, A, T və ya C) birinə bağlandığından, bu uzun zəncirlər məlumat daşıya bilər.

Üç nukleotiddən ibarət qruplar DNT dilində ən kiçik, lakin ən dəqiq müəyyən edilmiş “sözləri” təşkil edir. Bu "sözlərə" kodon deyilir. Kodonlar, zülalları meydana gətirmək üçün xüsusi amin turşularının bir-birinə bağlanmasını çağırmaq üçün istifadə olunur. Məsələn, adenozin-adenozin-guanozin (AAG) kodonu lizin amin turşusunun (lys) bir protein molekuluna daxil edilməsini tələb edir. AGG kodonu arginin (arg) amin turşusunu çağırır. Beləliklə, AAG-AGG böyüyən zülal zəncirində bir lizin bir arg ilə birləşməsini tələb edəcəkdir. Düzgün şəraitdə zülalın əmələ gəlməsini (başlanğıc kodonları) və ya zülal zəncirinin bitməsini (kodonların dayanmasını) tələb edən kodonlar da var. Bu sadə nümunədən də göründüyü kimi, DNT böyük miqdarda məlumat daşıya bilər.

Şəkil 1: Adenin timinlə birləşir Quanin sitozinə bağlanır.
Bu, DNT-nin ikiqat sarmal zəncirlərini yaradır (Təbiət Təhsili).


3.6: cDNT və Genomik Kitabxanalar - Biologiya

Məqalənin xülasəsi:

Gen Kitabxanası - Növlər və Tətbiqlər
Müəlliflər: Ghadage Nitin Chitrasen


Gen Kitabxanası

Gen kitabxanası təmizlənmə, saxlama və analiz asanlığı üçün vektora klonlaşdırılmış bir orqanizmin müxtəlif DNT ardıcıllığının toplusudur. Gen kitabxanası klonlanmış DNT toplusudur ki, kolleksiyada mənbə DNT-nin hər hansı xüsusi hissəsinin tapılma ehtimalı yüksək olsun. Gen kitabxanaları, adi kitabxanalar kimi, məlumatı DNT molekulları dəsti kimi toplamaq və saxlamaq üçün istifadə olunur. Bütün Gen kitabxanaları maraq doğuran xüsusi bioloji sistemi təmsil edən DNT fraqmentlərinin kolleksiyalarıdır.

İstifadə olunan DNT-nin mənbəyindən asılı olaraq iki növ gen kitabxanası yaradıla bilər.

Bu genlərdən hər hansı birini öyrənmək üçün tədqiqatçı əvvəlcə onu orqanizmin DNT-sindəki bütün digər genlərdən təcrid edir. Tədqiqatçılar əlavə tədqiqat üçün onları maraqlandıran DNT fraqmentlərini müəyyən edib təcrid edə bilərlər.

Bir gen müəyyən edildikdə və kopyalandıqda, onun “klonlaşdırıldığı”

Gen Kitabxanasının növləri: -

    Genomik kitabxana :- Orqanizmin bütün genomunu təmsil edən DNT fraqmentlərini ehtiva edir.
    A) Nüvə Genomik Kitabxanası
    B) Orqanellərin Genomik Kitabxanası

    Genomik Kitabxana: - Bir orqanizmin və ya növün ümumi nüvə DNT-sindən hazırlanır. DNT məhdudlaşdırıcı endonükleazdan istifadə edərək təsadüfi olaraq klonlaşdırıla bilən ölçülü parçalara kəsilir Genomik kitabxanalar gen ekzonları və intronlar, gen promotorları, intragenik DNT, replikasiya mənşəyi və s. o cümlədən bütöv genomik fraqmentlərdən ibarətdir.

  • Genomik kitabxananın yoxlanılması: - Genomik kitabxana yaradıldıqdan sonra maraq doğuran genləri müəyyən etmək üçün yoxlanılır. Ən çox yayılmış kitabxana seçim üsullarından biri koloniya hibridləşməsi adlanır. Kitabxananın qurulması prosesində faj vektorlarından istifadə olunur, sonra maraq doğuran genlərin identifikasiyası prosesi lövhələrin hibridləşdirilməsidir.
  1. Koloniyanın hibridləşməsi: - Koloniyanın hibridləşdirilməsi DNT, RNT, ferment, zülal və ya antikorun xüsusi ardıcıllığını müəyyən etmək üçün etiketli zond (radioaktiv və s.) ilə kitabxananın yoxlanılmasıdır.
  2. Lövhə hibridləşməsi: - Lövhələr hədəf DNT üçün oliqonukleotid zondunun hibridləşməsinə əsaslanan bir texnika ilə yoxlanılır. Bu halda DNT birbaşa Petri qabından filtrə köçürülür, sonra isə etiketli zondlarla inkubasiya edilir.
  • Genomik Kitabxananın Tətbiqləri: -
    1. Genomik kitabxananın qurulması istənilən DNT ardıcıllığı layihələrində ilk addımdır. 2. Genomik kitabxana yeni farmasevtik əhəmiyyətli genlərin müəyyən edilməsinə kömək edir. 3. Genomik kitabxana ev sahibində səssiz olan yeni genlərin identifikasiyasına kömək edir. 4. O, genomların mürəkkəbliyini anlamağa kömək edir. 5. Genetik mühəndislik vasitəsilə transgen heyvanların nəsli üçün genomik ardıcıllığın mənbəyi kimi xidmət edir. 6. Tənzimləyici ardıcıllıqların in vitro funksiyasının öyrənilməsi. 8. Xərçəng toxumalarında genetik mutasiyaların tədqiqi. 9. Müəyyən bir zamanda hansı genlərin ifadə olunduğunu müəyyən etmək üçün cDNT kitabxanaları yaradın.
  • cDNA Kitabxanası cDNA kitabxanası cDNA ehtiva edən klonlar toplusudur və müəyyən bir dövrdə müəyyən bir hüceyrə və ya toxuma növündə ifadə olunan genləri təmsil edir. cDNA tək tip hüceyrənin mRNT tamamlayıcılarının kolleksiyasını təmsil edir. cDNT kitabxanaları hər hansı post transkripsiya modifikasiyasından sonra ardıcıllığı təmsil edir (məsələn, intronların birləşdirilməsi). cDNT kitabxanasının üstünlüyü ondadır ki, o, yalnız genomun kodlaşdırma bölgəsini ehtiva edir.
  • cDNA Kitabxanasının tikintisi
  1. Hüceyrədən mRNT-nin təcrid edilməsi və bu eukaryotik funksional mRNT-dən cDNT-nin sintezi
  2. Plazmid və ya faq kimi uyğun vektorda sintez edilmiş cDNA-ların klonlaşdırılması.
  3. Bakteriya kimi uyğun ev sahibi ilə tanışlıq
  4. Tərkibində cDNA olan klonlar dəstinin skrininqi və saxlanması
  • cDNA Kitabxanasının tətbiqləri
  1. Kodlaşdırılmayan bölgələrin çıxarılması səbəbindən azalmış məlumat miqdarının saxlanması.
  2. cDNT birbaşa prokaryotik orqanizmlərdə ifadə edilə bilər.
  3. cDNT kitabxanaları əlavə genomik məlumatların daha az istifadə olunduğu tərs genetikada faydalıdır.
  4. cDNA kitabxanası xüsusi mRNT-ni kodlayan geni təcrid etmək üçün faydalıdır.
  5. cDNA kitabxanası biotexnologiya sahəsində güclü və faydalı vasitədir.
  6. Prokaryotların transkripsiya prosesinə kömək edən prokaryotlarda eukaryotik genlərin ifadəsində faydalıdır.
  7. mRNA-nı kodlaşdırmaq üçün DNT ardıcıllığını təcrid etmək üçün istifadə olunur.
  8. cDNT kitabxanasının üstünlüyü homoloji genləri təcrid etməkdir.
  9. O, həmçinin spesifik cDNA-nı təcrid etmək üçün genomik kitabxanaların yoxlanılması üçün istifadə olunur.
  10. Zülalların cDNT-si antikorların və monoklonal antikorların əmələ gəlməsini asanlaşdıra bilər.
  11. cDNA kitabxanasının ən mühüm tətbiqi mRNT ifadəsini öyrənməkdir.
  • cDNA Kitabxanasının çatışmazlıqları
  1. cDNT kitabxanasının dezavantajı ondan ibarətdir ki, o, yalnız yetkin mRNT-də mövcud olan ardıcıllığı ehtiva edir.
  2. Transkripsiyadan sonra dəyişdirilən intronlar və hər hansı digər se­quences mövcud ardıcıllıq deyil, məsələn, RNT-yə transkripsiya olunmayan promotorlar və gücləndiricilər də cDNA kitabxanasında mövcud deyildir.
  3. Onu da qeyd etmək lazımdır ki, cDNT kitabxanası yalnız RNT-nin təcrid olunduğu toxumada preslənmiş gen ardıcıllığını təmsil edir.
  4. Bundan əlavə, cDNT kitabxanasında par'tikulyar DNT ardıcıllığının tezliyi verilmiş toxumada müvafiq mRNT-nin bolluğundan asılıdır.
  • Genomik Kitabxana Vs. cDNA Kitabxanası

Buna görə də, gələcək istifadə üçün onu təhlükəsiz saxlamaq lazımdır. Kitabxanalar – 80°C-də saxlanılır.

Plazmid kitabxanasındakı bakteriya hüceyrələri qliserin tərəfindən dondurmanın mənfi təsirlərindən qorunur, fag kitabxanaları isə Di-metil sulfoksid (DMSO) ilə krioprotektura edilir.

http://www.biologyexams4u.com/2017/05/cdna-library-definition-and-steps-notes.html#.WjNFT9KWZdh
2. www.springer.com/in/book/9781617790645
3. Genetikanın əsasları B.D Sing Səhifə 500-502
4.https://passel.unl.edu/pages/informationmodule.php?idinformationmodule=959197140&topi corder=15&maxto=16


Müəllif haqqında / Əlavə məlumat:
Hazırda Junagadh Kənd Təsərrüfatı Universitetində, Junagadh, Gujarat 362001-də Genetika və Bitkiçilik üzrə Magistratura (Aqri) təhsili alıram

Vacib İmtina: Bu vebsaytdakı bütün məqalələr yalnız ümumi məlumat üçündür və peşəkar və ya ekspert məsləhəti deyil. Bu məqalədə təqdim olunan məlumatların düzgünlüyünə və ya həqiqiliyinə və ya onun nəticəsində yaranan hər hansı itkiyə və ya xəsarətə görə heç bir məsuliyyət daşımırıq. Biz bu məqalələri dəstəkləmirik, nə bu məqalələrin müəllifləri ilə bağlıyıq, nə də onların məzmununa görə məsuliyyət daşıyırıq. Tam şərtlər üçün imtina bölməmizə baxın.


Bir gen tapmaq üçün bir YAC cDNA kitabxanasına və genomik DNT-nin kosmid kitabxanasına qarşı necə yoxlanıla bilər?

oxuyuram fw2.2: Pomidor Meyvə Ölçüsünün Təkamülü üçün Kəmiyyət Xüsusiyyətinin Lokus Açarı (doi: 10.1126/science.289.5476.85).

Müəlliflər pomidorları böyüdən geni tapmağa çalışırlar. Mən başa düşdüyüm qədər, əvvəlki tədqiqatlar bunu genom bölgəsindəki "bir şeyə" daraltmışdı. fw2.2. Onlar cavabdeh olan faktiki genetik elementləri müəyyən etməyə çalışırlar (insan kimi bir gen olduğu ortaya çıxır) HRAS).

Güman ki, böyük meyvə alleli resessiv, kiçik meyvə alleli dominantdır.

Deyirlər (bölmədə fw2.2 ilə genetik tamamlama) ki:

  1. Onlardan ibarət YAC var fw2.2.
  2. Potensial olaraq uyğun olan transkriptləri tapmaq üçün YAC ilə "cDNA kitabxanasını yoxladılar". (Necə?)
  3. Onlar kosmidin gəldiyi genomun uzanmasını tapmaq üçün genomik fraqmentlərdən ibarət "kosmid kitabxanasını yoxladılar". (Necə?)

2 və 3-cü addımların necə işlədiyi mənə aydın deyil. Kimsə bu tədqiqatçıların təsvir etdiyi kimi, xüsusiyyətinizə cavabdeh olan bölgədə geni tapmaq üçün YAC, cDNA kitabxanası və kosmid kitabxanasını necə götürə biləcəyinizi izah edə bilərmi?


DNT nədir

DNT (dezoksiribonuklein turşusu) əksər orqanizmlərin irsi materialı kimi xidmət edən bir növ nuklein turşusudur. DNT əsasən eukariotların nüvəsində olur. Az miqdarda DNT də mitoxondriya və xloroplast kimi orqanoidlərin içərisində olur. Dörd azotlu əsas, adenin (A), guanin (G), sitozin (C) və timin (T) DNT-də genetik məlumatın saxlanmasında iştirak edir. Hər bir azotlu əsas özü bir fosfat qrupuna bağlı olan deoksiriboza şəkər qrupuna bağlıdır. Bu, nukleotidlər adlanan DNT-nin əsas tikinti bloklarını təşkil edir.

Şəkil 1: DNT ikiqat sarmal

Bir orqanizmin ümumi DNT-si həmin orqanizmin genomu adlanır. İnsan genomunda 3 milyard nukleotid var. Bu nukleotidlər bir-birini tamamlayan iki zəncirdə düzülür. Bir zəncirinin adenin əsasları digər zəncirinin timin əsasları ilə hidrogen bağları yaradır. Eynilə, sitozin əsasları guanin əsasları ilə hidrogen bağları yaradır. Bu proses tamamlayıcı baza cütləşməsi adlanır və bu, DNT-nin ikiqat zəncirli strukturunu əmələ gətirir. DNT ikiqat zəncirində ikiqat sarmal quruluş əmələ gəlir. The DNA double helices are arranged in chromosomes and are tightly packed inside the nucleus. DNA molecules are capable of self-replicating to make new copies of DNA from the existing copies. The structure of the DNA double-helix is shown in rəqəm 1.


Notes on Genomic Libraries | DNA Libraries

In this article we will learn about Genomic Libraries:- 1. Meaning of Genomic Libraries 2. Principle of Genomic Libraries 3. Vectors used for the Construction 4. Size 5. Types 6. Procedure in the Construction 7. Creation 8. Problems in Construction 9. Storage 10. Disadvantages 11. Applications.

  1. Meaning of Genomic Libraries
  2. Principles of Genomic Libraries
  3. Vectors used for the Construction
  4. Size of Genomic Library
  5. Types of Genomic Library
  6. Procedure in the Construction of Genomic Library
  7. Creation of a Genomic Library using the Phage-λ Vector EMBL3A
  8. Problems Associated with the Construc­tion of Genomic Library
  9. Storage of Genomic Library
  10. Disadvantages of Genomic Library
  11. Applications of Genomic Library

1. Meaning of Genomic Libraries:

Genomic libraries are libraries of genomic DNA sequences. These can be produced using DNA from any organism.

2. Principle of Genomic Libraries:

A genomic library contains all the sequences present in the genome of an organism (apart from any sequences, such as telomeres that cannot be readily cloned). It is a collection of cloned, restriction-enzyme-digested DNA frag­ments containing at least one copy of every DNA sequence in a genome. The entire genome of an organism is represented as a set of DNA fragments inserted into a vector molecule.

3. Vectors used for the Construction of Ge­nomic Library:

The choice of vectors for the construction of genomic library depends upon three param­eters:

1. The size of the DNA insert that these vectors can accommodate.

2. The size of the library that is necessary to obtain a reasonably complete representa­tion of the entire genome.

3. The total size of the genome of the target organism.

In the case of organism with small genomic sizes, such as E. coli, a genomic library could be constructed by using a plasmid vector. In this case only 5000 clones (of average DNA insert size 5kb) would give a greater than 99% chance of cloning the entire genome (4.6 x10 6 bp).

Most libraries from organisms with larger genomes are constructed using lambda phage, BAC or YAC vectors. These accept DNA inserts of approximately 23,45,350 and 1000kb respectively. Due to this, fewer recombinants are needed for complete genome coverage in comparison to the use of plasmids.

4. Size of Genomic Library:

It is possible to calculate the number (N) of recombinants (plaques or colonies) that must be in a genomic library to give a particular probability of obtaining a given sequence.

where ‘P’ is the desired probability and ‘f is the fraction of the genome in one insert. For example, for a probability of 0.99 with insert sizes of 20kb this values for the E. coli (4.6 x 10 6 bp) and human (3 x 10 9 bp) genomes are:

Ng coli = In (1 – 0.99) / In [1 – (2 x 10 4 /4.6 x 10 6 )] = 1.1 x 10 3

Ninsan = In (1 – 0.99)/ In [1 – (2 x 10 4 /3 x 10 9 )] = 6.9 x 10 5

These values explain why it is possible to make good genomic libraries from prokaryotes in plasmids where the insert size is 5-10 kb, as only a few thousand recombinants will be needed.

5. Types of Genomic Libraries:

Depending on the source of DNA used forced construction of genomic library it is of follow­ing two types:

(a) Nuclear Genomic Library:

This is ge­nomic library which includes the total DNA content of the nucleus. While mak­ing such a library we specifically extract the nuclear DNA and use it for the mak­ing of the library.

(b) Organelle Genomic Library:

In this case we exclude the nuclear DNA and targets the total DNA of either mitochondria, chloroplast or both.

6. Procedure in the Construction of Genomic Library:

The key to generating a high-quality library usually lies in the preparation of the insert DNA. The first step is the isolation of genomic DNA. The procedures vary widely according to the organism under study. Care should be taken to avoid physical damage to the DNA.

If the intention is to prepare a nuclear ge­nomic library, then the DNA in the nucleus is isolated, ignoring whatever DNA is present in the mitochondria or chloroplasts. If the aim is to make an organelle genomic library, then it would be wise to purify the organelles away from the nu­clei first and then prepare DNA from them.

2. Fragmentation of DNA:

The DNA is then fragmented to a suitable size for ligation into the vector. This could be done by complete digestion with a restriction endonuclease. But this has a demerit. Digestion by the use of restriction endonu­clease produces DNA fragments which are not intact.

To solve this problem we use partial digestion with a frequently cutting enzyme (such as Sau3A, with a four-base-pair recognition site) to generate a random collection of fragments with a suitable size distribution.

Once prepared, the fragments that will form the inserts are often treated with phosphate, to remove terminal phos­phate groups. This ensures that separate rate pieces of insert DNA cannot be ligated together before they are ligated into the vector. Ligation of separate fragments is undesirable, as it would generate clones containing non-contiguous DNA, and we would have no way of knowing where the joints lay.

This will depend on the kind of vector used. The vector needs to be digested with an enzyme appropri­ate to the insert material we are trying to clone.

4. Ligation and Introduction into the Host:

Vector and insert are mixed, ligated, packaged and introduced into the host by transformation, infection or’ some other technique.

This is not always re­quired. Libraries using phage cloning vec­tors are often kept as a stock of packaged phage. Samples of this can then be plated out on an appropriate host when needed. Libraries constructed in plasmid vectors are kept as collections of plasmid-containing cells, or as naked DNA that can be transformed into host cells when needed.

With storage, naked DNA may be de­graded. Larger molecules are more likely to be degraded than smaller ones, so larger re­combinants will be selectively lost, and the average insert size will fall.

7. Creation of a Genomic Library using the Phage-λ Vector EMBL3A:

High-molecular-weight genomic DNA is par­tially digested with Sau3Al. The fragments are treated with phosphatase to remove their 52 phosphate groups. The vector is digested with Bam/HI and EcoRI, which cut within the poly-linker sites.

The tiny BamHI/EcoRl poly-linker fragments are discarded in the iso-propanol precipitation, or alternatively the vector arms may be purified by preparative agarose gel electrophoresis. The vector arms are then ligated with the partially digested genomic DNA.

The phosphatase treatment prevents the genomic DNA fragments from ligating together. Non-recombinant vector cannot reform because the small poly-linker fragments have been discarded. The only package able molecules are recombinant pha­ges. These are obtained as plaques on a P2 lysogen of sup+ E. coli. The Spi” selection en­sures recovery of recombinant phage plaques.

8. Problems Associated with the Construc­tion of Genomic Library:

In the making of a genomic library we digest the total genomic DNA with a restriction endonuclease, such as EcoRl, insert the frag­ments into a suitable phage X vector, and then attempt to isolate the desired clone. How many recombinants would we have to screen in or­der to isolate the right one?

Let us assume that EcoRI gives an average of about 4kb of DNA fragment, and given that the size of the hu­man haploid genome is 2.8 x 106kb, it is clear that over 7 x 10 5 independent recombinants must be prepared and screened in order to obtain a desired sequence. In other words, we have to obtain a very large number of recom­binants, which is a very labour intensive pro­cedure.

There are three problems associated with the above approach:

1. The gene may be cut internally one or more times by Eco RI so that it is not ob­tained as a single fragment. This is likely if the gene is large.

2. Many times while making a library we want to obtain extensive regions flanking the gene or whole gene clusters. Frag­ments averaging about 4 kb are likely to be inconveniently short.

3. The obtained gene fragment may be larger than the size which the vector can accept. In this case the appropriate gene would not be cloned at all.

These problems can be overcome by clon­ing random DNA fragments of a large size. Since the DNA is randomly fragmented, there will be no exclusion of any DNA sequence. Also in this case the clones will overlap one another allowing the sequence of very large genes to be assembled. Because of the larger size of each cloned DNA fragment fewer clones are required for a complete or nearly complete library.

Now again we have a problem. How can appropriately sized random fragments be produced? Various methods are available of which random breakage by mechanical shearing is the most appropriate one. This is because the average fragment size can be controlled. Along with this the insertion of the resulting frag­ments into vectors requires additional modifi­cation steps.

To achieve this the strategy de­vised by Maniatis et al. (1978) is the most fol­lowed one. In this method the target DNA is digested with a mixture of two restriction en­zymes. These enzymes have tetra-nucleotide recognition sites which occur frequently in the target DNA. The restriction digestion by us­ing these enzymes produces fragments hav­ing an average size of less than 1 kb.

How­ever, only a partial restriction digest is car­ried out, and therefore the majority of the frag­ments are large (in the range 10-30 kb). Given that the chances of cutting at each of the avail­able restriction sites are more or less equiva­lent, such a reaction effectively produces a ran­dom set of overlapping fragments.

These can be separated from each other on the basis of their size (size fractionation), e.g., by gel elec­trophoresis. This results in the generation of a random population of fragments of about 20kb which are suitable for insertion into a e replacement vector.

9. Storage of Genomic Library:

Once a genomic library has been made it forms a useful resource for subsequent experiments as well as for the initial purpose for which it was produced. Therefore, it is necessary to store it safely for future use. A random library will consist of a test tube containing a suspension of bacteriophage particle (for a phage vector).

The libraries are stored at – 80°C. Bacterial cells in a plasmid library are protected from the adverse effects of freezing by glycerol, while phage libraries are cryoprotected by dimethyl sulfoxide (DMSO).

10. Disadvantages of Genomic Library:

The main reason behind making a genomic library is to identify a clone from the library which encodes a particular gene or genes of interest. Genomic libraries are particularly useful when you are working with prokaryotic organisms, which have relatively small genomes.

On the face of it, genome libraries might be expected to be less practical when you are working with eukaryotes, which have very large genomes containing a lot of DNA which does not code for proteins.

A library rep­resentation of a eukaryotic organism would contain a very large number of clones, many of which would contain non-coding DNA such as repetitive DNA and regulatory regions. Also, eukaryotic genes often contain introns, which are un-translated regions interrupting the coding sequence.

These regions are nor­mally copied into mRNA in the nucleus but spliced out before the mature mRNA is ex­ported to the cytoplasm for translation into protein. Prokaryotic organisms are unable to do this processing so the mature mRNA can­not be made in E. coli and the protein will not be expressed.

If your screening method re­quires that the gene be expressed it will not work with a genomic library from a eukary­otic organism.

12. Applications of Genomic Library:

Genomic library has following applications:

1. It helps in the determination of the com­plete genome sequence of a given organ­ism.

2. It serves as a source of genomic sequence for generation of transgenic animals through genetic engineering.

3. It helps in the study of the function of regu­latory sequences in vitro.

4. It helps in the study of genetic mutations in cancer tissues.

5. Genomic library helps in identification of the novel pharmaceutical important genes.


Table of contents (17 chapters)

Isolation of Fungal Infection Structures from Plant Tissue by Flow Cytometry for Cell-Specific Transcriptome Analysis

Preparation of a High-Quality cDNA Library from a Single-Cell Quantity of mRNA Using Chum-RNA

Construction of a Full-Length cDNA Library from Castor Endosperm for High-Throughput Functional Screening

Full-Length Transcriptome Analysis Using a Bias-Free cDNA Library Prepared with the Vector-Capping Method

Construction of Improved Yeast Two-Hybrid Libraries

Normalization of Full-Length-Enriched cDNA

Bogdanova, Ekaterina A. (et al.)

Bioinformatic Methods for Finding Differentially Expressed Genes in cDNA Libraries, Applied to the Identification of Tumour Vascular Targets

Enzymatic Production of RNAi Libraries from cDNAs and High-Throughput Selection of Effective shRNA Expression Constructs

Construction of Small RNA cDNA Libraries for High-Throughput Sequencing

Focusing Mutations Within Random Libraries to Distinct Areas: Protein Domain Library Generation by Overlap Extension

Generation of Families of Construct Variants Using Golden Gate Shuffling

Application of Full-Length cDNA Resources to Gain-of-Function Technology for Characterization of Plant Gene Function

Construction of Yeast Surface-Displayed cDNA Libraries

Identification of Protein/Target Molecule Interactions Using Yeast Surface-Displayed cDNA Libraries

SNP Discovery by Transcriptome Pyrosequencing

RNA-Seq Analysis of Gene Expression and Alternative Splicing by Double-Random Priming Strategy

Generation of a Large Catalog of Unique Transcripts for Whole-Genome Expression Analysis in Nonmodel Species


Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)

In RT-PCR, an RNA population is converted to cDNA by reverse transcription (RT), and then the cDNA is amplified by the polymerase chain reaction (PCR) (Şəkil 1). The cDNA amplification step provides opportunities to further study the original RNA species, even when they are limited in amount or expressed in low abundance. Common applications of RT-PCR include detection of expressed genes, examination of transcript variants, and generation of cDNA templates for cloning and sequencing.

Since reverse transcription provides cDNA templates for PCR amplification and downstream experiments, it is one of the most critical steps for experimental success. The reverse transcriptase selected should offer the highest efficiency even with challenging RNA samples, such as those that are degraded, have carryover inhibitors, or possess a high degree of secondary structure. (White paper:Engineered reverse transcriptase)

In performing RT-PCR, one-step and two-step methods are the two common approaches, each with its own advantages and disadvantages (Şəkil 2). As the name implies, one-step RT-PCR combines first-strand cDNA synthesis (RT) and subsequent PCR in a single reaction tube. This reaction setup simplifies workflow, reduces variation, and minimizes possible contamination. One-step RT-PCR allows easier processing of large numbers of samples, making it amenable to high-throughput applications. However, one-step RT-PCR uses gene-specific primers for amplification, limiting the analysis to a few genes per RNA sample. Since the reaction is a compromise between reverse transcription and amplification conditions, one-step RT-PCR could be less sensitive and less efficient in some scenarios. Nevertheless, use of a gene-specific primer in RT-PCR can help maximize the yield of the target cDNA and minimize background amplification. (White paper:Improved one-step RT-PCR system)

Two-step RT-PCR entails two separate reactions, beginning with first-strand cDNA synthesis (RT), followed by amplification of a portion of the resulting cDNA by PCR in a separate tube. Therefore, two-step RT-PCR is useful for detecting multiple genes in a single RNA sample. The separation of RT and PCR reactions allows for optimization of reaction conditions for each step, as well as flexibility with reverse transcription priming(oligo(dT) primers, random hexamers, or gene-specific primers) and PCR setup (e.g., DNA polymerase choice and PCR components). Compared to one-step RT-PCR, the disadvantages of two-step RT-PCR include multiple steps for an extended workflow, additional sample handling and processing, and increasing the chance of contamination and variation in results.

Table 1. Comparison of one-step and two-step RT-PCR

One-step RT-PCRTwo-step RT-PCR
QurmaqCombined reaction under conditions that support both reverse transcription and PCRSeparate optimized reactions for reverse transcription and PCR
PrimersGene-specific primersChoice of oligo(dT), random hexamers, or gene-specific primers
Ideal useAnalysis of one or two genes high-throughput platformsAnalysis of multiple genes
AdvantageConvenient, high-throughputÇevik

1-step vs. 2-step RT-PCR

Learn about differences between one-step vs. two-step RT-PCR and how to choose between them for your applications.

How to achieve highly specific one-step RT-PCR results

Learn about the mechanism of one-step RT-PCR, its challenges, and how to overcome them.

Daha ətraflı

Related products


CORRECT ANSWERS

Genomic libraries are collections of recombinant vector molecules each containing a piece of the genomic DNA from which the library has been constructed. If plasmids are used as vectors, the library is propagated in the host cells by transformation and selection of plasmid-carrying cells is based on antibiotic resistance (MCQ 1: D). 1 1 The abbreviation used is: MCQ, multiple-choice question. Library A of this experiment is enriched for nonsatellite DNA sequences (MCQ 9: A MCQ 13: B): DNA fragments carrying satellite DNA are either too large to fit into the plasmid (məs. centromeric DNA) or, besides that, carry EcoRI sticky ends at one end only (telomeric DNA). Library B mostly contains rapidly renaturing (yəni. highly repeated) sequences: ultrasound shearing of DNA introduces random breaks, while denaturation/renaturation and nuclease S1 digestion select for repetitive sequences (MCQ 2: A MCQ 3: E MCQ 4: A). Proteins and nuclease S1 digestion products were removed from the sample by phenol/chloroform extraction and gel filtration, respectively (MCQ 5: C MCQ 6: B). Ligation of oligo(dC) and oligo(dG) fragments to the ends of genomic and plasmid DNA fragments, respectively, facilitated the generation of recombinant vector molecules (MCQ 7: C). Because of nuclease S1 treatment, the original EcoRI sites are no longer present in the plasmids, but the genomic inserts retained their internal EcoRI cleavage sites (MCQ 8: D). Library B is thus enriched for highly repetitive sequences (MCQ 10: D MCQ 11: B MCQ 12: A MCQ 14: E).

The structure of pBR322 showing the unique EcoRI cleavage site. Antibiotic resistance genes and the origin of replication (ori) are also indicated.


Videoya baxın: İlin kitabxanaçısı müsabiqəsinin qalibi Şərəf Əliyeva adına kitabxana filialı (Yanvar 2022).