Məlumat

15.2: Gen ifadəsinin ölçülməsi üsulları - Biologiya

15.2: Gen ifadəsinin ölçülməsi üsulları - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Müəyyən bir fenotipi araşdırmağın ən intuitiv yolu hüceyrədə müəyyən bir zamanda mövcud olan funksional zülalların ifadə səviyyələrini ölçməkdir. Bu fəsildə biz gen ifadəsi məlumatlarını yaratmaq üçün iki texnikanı nəzərdən keçirəcəyik: mikroarraylar və RNT-seq.

Mikroarraylar

Mikroarraylar bir təcrübədə minlərlə əvvəlcədən seçilmiş genin ifadə səviyyələrini təhlil etməyə imkan verir. Mikroarrayların əsas prinsipi tamamlayıcı DNT fraqmentlərinin hibridləşdirilməsidir. Başlamaq üçün, zondlar kimi tanınan qısa DNT seqmentləri ümumiyyətlə gen çipi kimi tanınan bərk səthə yapışdırılır. Sonra, bir hüceyrədən götürülmüş maraq doğuran RNT populyasiyası əks transkriptaza vasitəsilə cDNA-ya (tamamlayıcı DNT) əks transkripsiya edilir, bu da primer kimi poli-A quyruğu istifadə edərək RNT-dən DNT sintez edir. Poli-A quyruğu olmayan intergenik ardıcıllıqlar üçün standart primer mRNT-nin uclarına bağlana bilər. Yaranan DNT, RNT-dən daha çox slayddakı DNT-ni tamamlayır. cDNA daha çox çip üzərində yuyulur və nəticədə hibridləşmə probları flüoresanasiya etməyə təhrik edir. Şəkil 15.2-də göstərildiyi kimi, bu, hədəfdə mRNT-nin nisbi bolluğunu müəyyən etmək üçün aşkar edilə bilər.

Hal-hazırda mikroarrayların iki əsas növü istifadə olunur. Affymetrix gen çiplərinin hər gen üçün bir nöqtəsi var və 100-lərlə nukleotid sırasına görə daha uzun zondlara malikdir. Digər tərəfdən, ləkələnmiş oliqonukleotidlər kafel genlərini sıralayır və onlarla əsas ətrafında daha qısa zondlara malikdir.

Mövcud metodlarda çoxsaylı səhv mənbələri var və gələcək metodlar prosesdəki addımları aradan qaldırmağa çalışır. Məsələn, əks transkriptaza uyğunsuzluqlar yarada bilər ki, bu da düzgün zond ilə qarşılıqlı əlaqəni zəiflədir və ya çarpaz hibridləşməyə və ya çoxsaylı zondlara bağlanmağa səbəb olur. Bunun bir həll yolu hər gen üçün birdən çox zonddan istifadə etmək olmuşdur, çünki çarpaz hibridləşmə hər gen üçün fərqli olacaqdır. Yenə də RNT-nin ikincil quruluşuna görə tərs transkripsiya lazımdır. DNT-nin struktur sabitliyi onun əyilmək və zondla hibridləşməmək ehtimalını azaldır. RNT-Seq kimi yeni nəsil texnologiyalar RNT-ni hüceyrədən çıxan kimi ardıcıllıqla sıralayır, mahiyyətcə genomun hər bir əsasını yoxlayır.

RNT seq

Bütün transkriptom ov tüfəngi ardıcıllığı kimi də tanınan RNT-Seq, DNT mikroarraylarının keçmişdə yerinə yetirmək üçün istifadə edildiyi eyni funksiyanı yerinə yetirməyə çalışır, lakin daha yüksək qətnamə ilə. Xüsusilə, DNT mikroarrayları xüsusi zondlardan istifadə edir və bu zondların yaradılması mütləq genom və istehsal olunan massivin ölçüsü haqqında əvvəlcədən biliklərdən asılıdır. RNT-seq, mikroarray təcrübələrində istehsal olunan bütün cDNA-nı sadəcə ardıcıllıqla sıralamaqla bu məhdudiyyətləri aradan qaldırır. Bu, növbəti nəsil ardıcıllıq texnologiyası sayəsində mümkün olur. Xərçəng kimi xəstəliklərin tədqiqatlarında bu texnika sürətlə tətbiq edilmişdir [4]. RNT-seq-dən alınan məlumatlar daha sonra mikroarraylardan alınan məlumatların normal olaraq təhlil edildiyi kimi qruplaşma yolu ilə təhlil edilir.

Gen ifadəsi matrisləri

Mikroarraylar və RNT-seq tez-tez müxtəlif şərtlər altında hüceyrələrin gen ifadə profillərini müqayisə etmək üçün istifadə olunur. Bu təcrübələrdən əldə edilən məlumatların miqdarı çox böyükdür. Mikroarraylar minlərlə geni təhlil edə bilər və RNT-seq, prinsipcə, aktiv şəkildə ifadə olunan hər bir geni təhlil edə bilər. Bu genlərin hər birinin ifadə səviyyəsi müxtəlif şərtlər, o cümlədən vaxt kursları, inkişaf mərhələləri, fenotiplər, sağlam və xəstə və digər amillərlə ölçülür.

Gen ifadə matrisinin istilik xəritəsinin (Şəkil 15.4) nəyi ifadə etdiyini başa düşmək üçün əvvəlcə ifadə məlumat matrisinin bizə nə dediyini başa düşməliyik. Mikroarraylar və RNT-seq istifadə edərək, biz təcrübədə kəmiyyət şəklində gen ifadə səviyyəsini əldə edə bilərik. Əgər bir neçə təcrübəmiz varsa, (T/R) log dəyərini təmsil edən dəyər matrisi (Şəkil 15.5) qura bilərik, burada T test nümunəsindəki gen ifadə səviyyəsi, R isə istinad nümunəsindəki gen ifadə səviyyəsidir.

İfadə Matrisi müəllif hüququ məhdudiyyətlərinə görə silindi.

Şəkil 15.4: Şəkil 4-ün istilik xəritəsinə çevrilməsi
Əgər matrisi istilik xəritəsi kimi təsəvvür etsək, onda aşağıdakı yeni rəngli matrisi əldə edirik:

Bu matrislər, optimal yarpaq sıralama alqoritmlərindən istifadə edərək sətirlərin və sütunların sıralana biləcəyi dendroqram yaradaraq, gen cütləri, cüt cütlər və s. arasındakı əlaqəni göstərən iyerarxik şəkildə qruplaşdırıla bilər.

Şəkil ictimai sahədə. Bu qrafik rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm saytından əldə edilə bilən Michael Eisen-dən Cluster proqramından istifadə edilməklə, gen ifadəsi məlumatlarının StemBase verilənlər bazasından çıxarılan verilənlərlə yaradılmışdır.

Genomun uzun bir seqmentinin gizli strukturunu aşkar etməklə, biz bir gen parçasının nə etdiyinə dair böyük fikir əldə edirik və sonradan naməlum xəstəliyin əsas səbəbi haqqında daha çox başa düşürük.

Bu proqnozlaşdırıcı və analitik güc verilənləri iki qruplaşdırmaq qabiliyyətinə görə artır; yəni matrisin hər iki ölçüsü boyunca qruplaşma. Matris genlərin ifadə profillərini müqayisə etməyə, həmçinin xəstəliklər kimi müxtəlif vəziyyətlərin oxşarlığını müqayisə etməyə imkan verir. Bununla belə, problem ölçülülüyün lənətidir. Məlumatların sahəsi artdıqca, nöqtələrin klasterləşməsi azalır. Bəzən, yaxınlığa əsaslanaraq hansı nöqtələrin bir-birinə aid olduğunu müəyyən etmək üçün klasterləşdirmədən istifadə edərək verilənlərin strukturunu tapmaq üçün məlumatlar daha aşağı ölçülü boşluqlara endirilə bilər.

Məlumatları şərh etmək də çətin ola bilər, çünki oyunda başqa bioloji hadisələr də ola bilər. Məsələn, zülal kodlayan ekzonlar daha yüksək intensivliyə malikdir, çünki intronlar sürətlə parçalanır. Eyni zamanda, bütün intronlar lazımsız deyil və alternativ birləşdirmədə qeyri-müəyyənliklər ola bilər. Qeyri-mənalı vasitəçi çürümə vasitəsilə aberrant transkriptləri deqradasiya edən hüceyrə mexanizmləri də var.


Gen ifadəsini ölçmək üçün istinad genlərinin seçilməsi və təsdiqlənməsi Toona ciliata kəmiyyət real vaxt PCR analizi ilə müxtəlif eksperimental şəraitdə

Müxtəlif orqanizmlərin gen ifadəsini öyrənməzdən əvvəl ən yaxşı istinad geni müəyyən etmək vacibdir. Hazırda gen ifadəsinin aşkarlanmasının ən dəqiq üsulu kəmiyyət real vaxtlı PCR-dir (RT-qPCR). Bu üsulla müxtəlif bioloji sistemlərdə və müxtəlif şəraitlərdə stabil olan istinad genləri əldə edilə bilər. Toona ciliata Roem (T. ciliata). qiymətli və tez böyüyən ağac növüdür. Bu araşdırmada gələcək gen ifadə analizi üçün əsas şərt kimi RT-qPCR istifadə edərək 20 istinad gen müəyyən edilmişdir. Müxtəlif şəraitlərdə müxtəlif toxumalarda 20 namizəd istinad geninin ifadə sabitliyini qiymətləndirmək üçün dörd fərqli üsuldan, geNorm, NormFinder, BestKeeper və RankAggreg istifadə edilmişdir.

Nəticələr

Eksperimental nəticələr bunu göstərdi TUB-α bütün nümunələrdə ən stabil ifadə edilmiş istinad geni idi və UBC17 altında yarpaq və gənc gövdələrdə ən sabit idi Hypsipyla robusta (H. robusta) və metil jasmonat (MeJA) müalicəsi. Əlavə olaraq, PP2C59UBC5B altındakı yarpaqlarda ən yaxşı performans göstərən genlər idi H. robusta müalicə zamanı HIS1ACT7 gənc gövdələrdə ən yaxşı istinad genləri idi. Ən yaxşı iki istinad genləri idi 60S-18TUB-α 4 ° C-də müalicədən sonra. ifadəsi HIS6MUB1 PEG6000 müalicəsi altında ən stabil idi. Seçilmiş istinad genlərinin dəqiqliyi MYB3 transkripsiya faktoru ilə yoxlanılıb (TcMYB3) gen.

Nəticələr

Bu, gen ifadəsini normallaşdırmaq üçün ən yaxşı istinad genlərini təsdiqləyən ilk hesabatdır T. ciliata müxtəlif şərtlər altında, bu növdə gen tənzimləmələrinin gələcəkdə aydınlaşdırılmasını asanlaşdıracaq.


Zülal kodlayan genlərin əsas məhsulu mRNA-lardır. Gen ifadəsini ölçmək haqqında danışarkən, hüceyrə daxilində xüsusi mRNT-nin sabit vəziyyət səviyyələrini təhlil etmək istəyirik. Bu, adətən çoxlu sayda hüceyrədən başlayaraq və bütün hüceyrələrdən bütün mRNA-ların yığılması ilə həyata keçirilir. Yalnız bir genin mRNT-nin ifadə səviyyəsini ölçməyin bir yolu Şimal Blotu həyata keçirməkdir. Digər həssas üsullara aşağıdakılar daxildir: S1 nukleaza mühafizəsi analizi, RNTaz mühafizəsi analizi və primer uzatma testi.

Mikroarraylar eyni zamanda minlərlə genin ifadə səviyyələrini tək bir təcrübədə ölçmək üçün geniş şəkildə istifadə edilmişdir.

RNT-Seq metodologiyasının meydana çıxması ilə bir təcrübədə transkriptlərin sayını hesablamaq mümkündür (ardıcıl istinad genomunuz varsa)

Növbəti nəsil məlumatlarına görə:

Mən heç vaxt mRNT ilə birbaşa işləməmişəm, lakin bioinformatikaçıdan əldə etdiyim şey belə idi: siz mRNT-ni çıxarırsınız, ardıcıllıqla, keyfiyyətə və uzunluğa görə süzgəcdən keçirirsiniz, yığırsınız və sizdə “transkriptlər” kimi bir şey olur. Hesab etdiyinizlər: transkript1-in xy və transkript2-nin yx. Siz daha sonra izoformları axtarırsınız və sonda hesabladığınız ilkin oxunuşlara uyğun olaraq bu sayları düzəldirsiniz. Transkriptləri nəzarətlə müqayisə edərək, onun yuxarı və ya aşağı tənzimləndiyini ölçə bilərsiniz (nəzarətin oxunuşlarını "sıfır" olaraq təyin etməklə, bir transkriptin 1234 oxunuşu normaldır. 2-ci nümunədə bu transkriptin 5000 oxunuşu var. gen görünür yuxarı tənzimlənir). Bildiyim qədəri ilə təxminən gen ifadəsi təxminlərinin / kəmiyyətlərinin necə edildiyi bir yoldur.


Tək bir hüceyrədə hər genin ifadə dinamikasını ölçmək üçün texnika

Allon M. Klein Harvard Tibb Məktəbinin Sistem Biologiyası Departamentindədir, Boston, Massaçusets 02115, ABŞ.

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Mürəkkəb sistemləri başa düşmək və idarə etmək üçün onların tərkib hissələrinin dinamikasını ölçməyi bacarmalıyıq. Biologiyada gen ifadəsi, yəqin ki, insan toxumalarının funksiyalarını idarə edən 20.000-dən çox genin olduğu mürəkkəb sistemin son nümunəsidir. Bununla belə, genlərin zamanla ayrı-ayrı hüceyrələrdə ifadədə necə dəyişdiyini ölçmək üçün alətlərimiz yoxdur. Bir kağızda Təbiət, La Manno və b. 1 tək hüceyrədəki hər bir gen üçün ifadənin dəyişmə səviyyəsini və sürətini eyni vaxtda hesablamağa imkan verən güclü metodu təsvir edir. Bu yanaşma hüceyrə dinamikasının öyrənilməsi üçün, xüsusən də xəstəliyin inkişafında və embrion inkişaf kimi mürəkkəb proseslərdə əhəmiyyətli təsirlərə malikdir.

Kağızı oxuyun: tək hüceyrələrin RNT sürəti

Bioloqlar hüceyrələr yaşlandıqca, fərqləndikcə və ya xəstələndikcə gen ifadəsində baş verən dinamik dəyişiklikləri anlamağa çalışarkən əməliyyat problemi ilə üzləşirlər. Bir tərəfdən, tədqiqatçılara müəyyən bir hüceyrədəki bütün genlərin ifadəsini geniş şəkildə ölçməyə imkan verən üsullar maraq hüceyrəsinin məhv edilməsini əhatə edir. Bu, zamanla təhlili qadağan edir və beləliklə, gen ifadəsinin yalnız bir görüntüsünü təqdim edir. Digər tərəfdən, canlı hüceyrələrdə gen ifadəsinin uzunmüddətli ölçülməsinə imkan verən üsullar yalnız məhdud sayda genləri izləmək üçün istifadə edilə bilər 2 .

Qrupum və bir çox başqaları əvvəllər tək hüceyrələrin dağıdıcı ölçmələrindən hüceyrədəki bütün genlərin ekspressiya dinamikasını təxmini ifadə dinamikasına uyğun gələn fasiləsiz “trayektoriyalara” ani ölçüləri təşkil etməklə çıxarmağa cəhd etdilər. Lakin, müxtəlif gen ifadə dinamikası eyni anlıq görüntülərə səbəb ola bildiyindən, hətta ən mürəkkəb alqoritmlər də səhv nəticələr verə bilər 3 .

La Manno və b. gen ifadəsinin mövcud anlıq görüntülərinin əslində vicdanlı dinamik məlumat verə biləcəyini dərk edərək bu əməliyyat problemini qismən dəf etdi. Müəlliflər təkhüceyrəli RNT ardıcıllığı ilə yaradılan məlumatları təhlil etdilər. Bu yanaşma adətən nümunənin hər hüceyrəsindəki hər bir gen üçün mesajçı RNT transkriptlərinin bolluğunu ölçmək üçün istifadə olunur. Lakin tədqiqatçılar göstərdilər ki, bu RNT ardıcıllıqları ölçmə aparıldığı anda hər bir genin ifadəsinin artıb-azaldığına dair də məlumat verir.

La Manno və b. təzə transkripsiya edilmiş mRNT-nin yetkin mRNT-nin formalaşması zamanı sonradan kəsilmiş (birləşdirilmiş) seqmentlərdən ibarət olması faktından istifadə etmişdir. Stabil şəkildə ifadə olunan bir gen üçün onun mRNT-nin kiçik bir hissəsi həmişə yetişməmiş, birləşməmiş formada tapılacaqdır, çünki köhnə transkriptlər davamlı olaraq yeniləri ilə əvəz olunur. Bir gen yenicə aktivləşdirildikdə, qısa müddət ərzində yetişməmiş transkriptlərin daha yüksək nisbəti olacaq. Əksinə, bir genin ifadəsi repressiya edildikdə, qısa ömürlü, bağlanmamış transkriptlərin nisbəti daha uzun ömürlü yetkin mRNT transkriptləri çürümədən əvvəl azalacaq. Buna görə də, hüceyrədəki hər bir gen üçün birləşməyən mRNT-nin birləşdirilmiş mRNT-yə nisbəti ani ifadə dinamikasını, yəni hər bir genin “RNT sürətini” birbaşa çıxarmaq üçün istifadə edilə bilər ki, bu da hüceyrə dəyişikliklərini çıxarmaq üçün istifadə edilə bilər. toxumada baş verir (şək. 1).

Şəkil 1 | Mürəkkəb toxumalarda gen ifadəsində dinamik dəyişikliklərin ölçülməsi. a, Messenger RNT yetkinləşdikcə, yetişməmiş transkriptin bölmələri çıxarılır - bu proses splicing adlanır. Bir genin ifadəsi artdıqda, hüceyrədə yetkin, birləşmiş transkriptlərlə müqayisədə yetişməmiş, bağlanmamış transkriptlərin nisbətində keçici artım müşahidə olunur. Bunun əksinə olaraq, genin ifadəsi azaldıqda (göstərilmir) qısa müddət ərzində birləşdirilmiş transkriptlərin daha yüksək nisbəti müşahidə olunur. La Manno və b. Şəkil 1, gen ifadəsinin necə dəyişdiyini göstərən RNT sürəti adlanan kəmiyyəti hesablamaq üçün tək bir hüceyrədəki hər bir gen üçün birləşdirilmiş transkriptlərin birləşdirilmiş transkriptlərə nisbətini ölçdü. b, Müəlliflər toxumadakı minlərlə hüceyrədə (burada, inkişaf etməkdə olan siçan beynindəki neyronlarda) RNT sürətini ölçməklə təkcə hüceyrələrin bir-biri ilə nə qədər yaxından əlaqəli olduğunu (oxşar rənglərlə göstərilən yaxınlıq ilə) göstərən xəritələr yarada bildilər. həm də məruz qaldıqları gen-ifadə dəyişikliklərinə görə gələcəkdə hansı hüceyrələrə bənzəyəcəkləri (oxlarla göstərilir). RNT sürəti, nəticədə bir sıra fərqli hüceyrə növlərinə (mavi kəsikli dairələr) səbəb olan erkən ataları (narıncı və sarı) uğurla izləyir. (b ref. 3c-dən uyğunlaşdırılmışdır. 1.)

Bu yanaşma artıq toplu RNT ardıcıllığı məlumat dəstlərində 4, 5 istifadə edilmişdir. La Manno və b. metodun bir hüceyrəli məlumatlara tətbiq oluna biləcəyini başa düşdü, bunun üçün daha faydalıdır. Bu məlumatlar dinamik proseslərin daha yüksək dəqiqlikli təsvirini təqdim edir - xüsusən də toplu analizlərdə birləşən müxtəlif gen ifadə nümunələri olan bir çox hüceyrə tiplərini ehtiva edən mürəkkəb toxumalarda. Müəlliflər müəyyən ediblər ki, təkhüceyrəli RNT ardıcıllığından əldə edilən məlumatların təhlili üçün mövcud alqoritmlər yetişməmiş, birləşməyən mRNT haqqında məlumatları müntəzəm olaraq rədd edir. Bu məlumatları xilas etmək üçün hesablama boru kəmərlərini tamamilə yenidən işləyərək, onlar hər bir transkriptin həm birləşdirilmiş, həm də əlavə edilməmiş formaları haqqında məlumatları bərpa edə və buna görə də RNT sürətini proqnozlaşdıra bilərdilər.

Tez-tez olduğu kimi, La Manno üçün çox səy və texniki ixtiraçılıq tələb olunurdu və b. ilkin ideyalarını möhkəm iş alqoritmlərinə çevirmək. Onların öhdəsindən gəlməli olduqları çətinliklər arasında tək hüceyrələrdə gen ifadəsini ölçməyin səs-küylü ola biləcəyi faktı var idi. Bunun səbəbi, hər bir hüceyrədəki mRNT molekullarının əksəriyyətinin onları ardıcıllıqla sıralamaq cəhdində itirilməsi və tədqiqatçılara gen ifadəsinin yalnız yamaqlı mənzərəsi ilə qalmasıdır. Başqa bir problem, sabit transkripsiyadan keçərkən hər bir gen üçün birləşdirilmiş və birləşdirilmiş transkriptlərin əsas nisbətini necə çıxarmağın müəyyən edilməsi idi. Müəlliflər bu problemləri həll etmək üçün statistikada və maşın öyrənməsində qabaqcıl yanaşmaları tətbiq etməli idilər.

La Manno və həmkarları həm dərc edilmiş, həm də yeni toplanmış məlumat dəstlərindən istifadə etməklə yanaşmalarının faydalılığını gözəl şəkildə nümayiş etdirirlər. Məsələn, onlar göstərdilər ki, RNT sürəti, embriondakı hüceyrələrin sinir hüceyrəsi adlanan hüceyrə tipindən adrenal bezlərin xromafin hüceyrələrinə diferensiallaşdığı məlum olan gen ifadəsindəki artım və azalmaları dəqiq müəyyən edə bilir. Müəlliflər həmçinin siçan beyninin inkişaf etməkdə olan hipokampusunda, bağırsağın kök hüceyrələrinin differensasiyası zamanı və s. zamanı gen ifadəsi dinamikasını araşdırmaq üçün RNT sürətindən istifadə ediblər. Bu nümunələr silsiləsi metodun geniş dəyərə malik olacağını göstərir. Qrupun ən mühüm nailiyyətləri arasında canlı insan embrionlarının öyrənilməsi ilə bağlı olan texniki və etik məsələlərə görə dinamik ölçmənin digər formalarının həyata keçirilməsi çox çətin və ya qeyri-mümkün olan insan embrion toxumasının təhlili idi.

Tək hüceyrələr üçün RNT sürətinin təhlilinin hazırlanması böyük bir irəliləyişdir. Ancaq təbii ki, məhdudiyyətləri var. Təbiətinə görə, RNT sürəti əslində müəyyən bir hüceyrəni zamanla izləyə bilmir, mRNT-nin öyrənilməsi ilə məhdudlaşır və hüceyrələrin məkan təşkili haqqında məlumat vermir. Bu məhdudiyyətlər kök hüceyrə biologiyasında, embrional inkişafda və ya xəstəliyin başlanğıcında, hüceyrələrin nəsil və düzülüşündən asılı olan və transkripsiyadan başqa mexanizmlər, o cümlədən protein fosforlaşması ilə idarə oluna bilən hadisələri araşdırarkən məhdudlaşdırıcı ola bilər. Metod yalnız ani sürətlərdən birləşən hüceyrə dinamikasının ehtimal təsvirini verir. Bu məhdudiyyətlərin nəticəsi olaraq, genlərin məkan-zaman ifadə dinamikasının canlı görüntüləmə kimi tamamlayıcı metodlardan istifadə etməklə öyrənilməyə davam edəcəyinə şübhə yoxdur.

Buna baxmayaraq, tək hüceyrələrdə həqiqi, ani RNT sürətlərini çıxarmaq qabiliyyəti bütün genom miqyasında gen ifadəsi dinamikasının tədqiqatları üçün irəliyə doğru sıçrayışdır. Həqiqətən də, müəlliflərin yanaşması artıq digər tədqiqatçılar tərəfindən də tətbiq edilmişdir 6 . Yaxın gələcəkdə RNT sürətinin asanlıqla tək hüceyrəli analitiklər üçün vacib alətə çevriləcəyini proqnozlaşdıra bilərəm.


Nəticələr

Vurğulamaq istərdik ki, yüksək ölçülü rəqəmsal məlumatlarda müxtəlif meyllər mövcuddur və müxtəlif məsafə ölçüləri bu tendensiyaların bəzilərini fərqli şəkildə vurğulayır. İndiki halda, üç növ məsafə, gen ifadə profillərinin növlər arasında homolog olmayan toxumalara nisbətən, növlər arasında homolog toxumalar üçün daha oxşar olması xüsusiyyətini nisbətən yaxşı vurğuladı. Bunun əksinə olaraq, ortoloji genlər arasında divergensiya ilə bağlı sualı cavablandırarkən, üç məsafədən biri (Evklid) ifadə fonuna yaxın bütün toxumalarda vahid şəkildə ifadə olunan genləri seçdi, korrelyasiyaya əsaslanan məsafələr və GA məsafəsi isə homoloji toxumalar arasında uyğun dəyişiklikləri olan genləri seçdi. Beləliklə, müxtəlif növlərdə ifadə fərqliliyini öyrənmək üçün məsafə ölçüsünün seçimində müəyyən etmək istədiyiniz ifadə nümunələrinin növü rəhbər tutulmalıdır.


Gen ifadəsində dəyişkənliyin gen tənzimlənməsini öyrənmək üçün bir vasitə kimi istifadə edilməsi

Maraqların toqquşması: AR məqalədə təsvir olunan RNT FISH metodları ilə bağlı patentlərdən, həmçinin məsləhət gəlirlərindən qonorar alır.

Mücərrəd

Tək hüceyrələrdə gen ifadəsini ölçmək üçün kəmiyyət vasitələrinin meydana çıxması ilə tədqiqatçılar kəşf etdilər ki, bir çox kontekstlərdə messenger RNT və zülal səviyyələri, çox vaxt gen ifadəsi ilə əlaqəli təbii stoxastik hadisələr səbəbindən hüceyrədən hüceyrəyə geniş şəkildə dəyişə bilər. Bu hüceyrə fərdiliyinin tədqiqi texnoloji inkişafın, nəzəri təhlilin və son zamanlar bioloji hadisələrə tətbiqlərin qarışığı ilə xarakterizə olunan özlüyündə bir tədqiqat sahəsinə çevrildi. Bu araşdırmada biz gen tənzimləməsini başa düşmək üçün bir vasitə kimi gen ifadəsinə xas olan dəyişkənliyin istifadəsinə diqqət yetiririk. Dəyişkənliyin təbii sistem səviyyəli pozğunluğu kimi istifadəsini, transkripsiyanın əsasını təşkil edən bioloji proseslərin kəmiyyətcə xarakterizə edilməsində istifadəsini və yeni gen tənzimləyici qarşılıqlı təsirlərin kəşfinə tətbiqini müzakirə edirik. İnanırıq ki, dəyişkənliyin istifadəsi transkripsiya nəzarətinin müxtəlif aspektlərinə dair yeni bioloji anlayışlar təmin edə bilər və mövcud texnikalara güclü tamamlayıcı yanaşma təmin edə bilər. WIREs Syst Biol Med 2013, 5:751–759. doi: 10.1002/wsbm.1243


Mücərrəd

Bioloji proseslər tez-tez dinamik olur, buna görə də tədqiqatçılar bir neçə vaxtda onların fəaliyyətinə nəzarət etməlidirlər. Bu cür dinamik fəaliyyətlə bağlı ən zəngin məlumat mənbəyi zaman seriyası gen ifadəsi məlumatlarıdır. Bu məlumatlar bioloji prosesdə aktivləşdirilmiş genlərin tam dəstini müəyyən etmək, onların dəyişmə sürətlərini, nizamlarını və səbəb-nəticə təsirlərini müəyyən etmək və hüceyrədəki dinamik sistemləri modelləşdirmək üçün istifadə olunur. Bu icmalda biz zaman seriyası təcrübələrində müşahidə edilmiş əsas nümunələri, bu nümunələrin ifadə proqramlarını yaratmaq üçün necə birləşdirildiyini və dinamik bioloji sistemlərin modellərini çıxarmaq üçün bu məlumatların hesablama analizi, vizuallaşdırılması və inteqrasiyasını müzakirə edirik.


Nəticələr

İnsan ASC-lərinin yayılması və adipogen differensasiyası

İnsan ASC-lərinin çoxalması və fərqləndirilməsinin kəmiyyət RT-PCR əsaslı gen ifadəsi tədqiqatları üçün namizəd istinad genlərini qiymətləndirdik. Birincisi, qarın boşluğunda abdominal plastik cərrahiyyə əməliyyatı keçirən dörd qadın donordan kəsiklə əldə edilmiş təzə qarın sWAT nümunələrindən ASC-ləri təcrid etdik (Əlavə fayl 1: Cədvəl S1). Hüceyrələr maye azotda saxlanıldı. ASC populyasiyasının saflığını müəyyən etmək üçün hüceyrələr əridildi və keçid 3-ə qədər böyüdüldü. Sonra hüceyrələr keçiriciləşdirildi və müəyyən edilmiş ASC marker zülallarına qarşı antikorlardan istifadə etməklə çox parametrli aşkarlama FACS analizinə məruz qaldı [6, 25]. Hüceyrələrin böyük əksəriyyəti xarakterik ASC immunofenotipini göstərdi, DLK1 + /CD34 + /CD90 + /CD105 + /CD45 - /CD31 - (Şəkil 1a), keçirici keçid 3 ASC üçün gözlənilir [6, 25].

ASC-lərin xarakteristikası, yayılması və differensasiyası. a – FACS analizi ilə ASC-lərin xarakteristikası. 100.000 hüceyrə sabitlənmiş, keçiriciləşdirilmiş və marker zülallarının CD45, CD31, CD90, CD105, CD34 və DLK1 ifadələri üçün təhlil edilmişdir. 3 ASC keçidinin histoqramları göstərilir. Qara histoqramlar: Ləkəsiz nəzarət. Qırmızı histoqramlar: Xüsusi antikor boyaması olan hüceyrələr. Histoqramlar müxtəlif donorlardan ASC-lərdən istifadə edərək 3 müstəqil axın sitometriya analizini təmsil edir. bc - Mikrofotoşəkillər (b) və böyümə əyriləri (c) tərkibində 2,5% FCS və ya 10% FCS olan PM4 mühitində becərilmiş çoxalan ASC-lərin. Hər bir məlumat nöqtəsi 3 müxtəlif quyunun orta hüceyrə sayını əks etdirir. Dəyərlər +/− SEM vasitələri kimi təqdim olunur. **səh < 0,01. d – ASC-lərin adipogen differensasiyası. Adipogenez 0 (d 0) gündə induksiya edildi və göstərilən günlərdə parlaq sahə mikroskopiyası ilə hüceyrələrin morfologiyası sənədləşdirildi. e – Adipogenezin induksiyasından sonrakı 9 və 14-cü günlərdə Yağ-Qırmızı-O boyama üsulu ilə lipid damcılarının əmələ gəlməsinə nəzarət edilmişdir. f – Perilipinin zülal səviyyəsi fərqlənməmiş (d 0) və differensiallaşdırılmış (d 9) ASC-lərdə western blot analizi ilə izlənildi. Üç müxtəlif donordan əldə edilən ASC-lərdə həyata keçirilən üç müstəqil təcrübənin nümayəndəsi nəticələri göstərilir

Sonra ASC-lər aşağı mitogen mühitdə (2,5% FCS olan PM4 mühiti) və yüksək mitogen mühitdə (10% FCS ehtiva edən PM4 mühitində) becərildi. Yayılma göstərilən günlərdə ASC nömrələrini hesablamaqla izlənildi (Şəkil 1b və c). Gözlənildiyi kimi, yüksək mitogen mühitdə yetişdirilən ASC-lər aşağı mitogen mühitdə yetişdirilən hüceyrələrlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yüksək proliferasiya dərəcəsi göstərmişdir.

Adipogen differensiasiya üçün ASC-lər sıxlıq dərəcəsinə qədər böyüdüldü və zərdabsız mühitdə ac qaldı. Hormon kokteyli ilə adipogenezin induksiyası, induksiyadan sonra ilk 72 saat ərzində ASC-lərin fibroblasta bənzər morfologiyadan yuvarlaq hüceyrələrə xarakterik morfoloji çevrilməsinə səbəb oldu (Şəkil 1d). Bu, adipogenezin əlamətidir [26]. Fərqlilik hüceyrədaxili yağ damcılarının (Şəkil 1e) və adipositlərə xas protein perilipinin (Şəkil 1f) aşkarlanması ilə təsdiq edilmişdir. Tam western blot təhlili Əlavə fayl 2-də göstərilmişdir: Şəkil S1.

Referans genlərin seçilməsi və ifadə səviyyələri

Kəmiyyət RT-PZR analizi üçün ümumi RNT proliferasiya edən ASC-lərdən (3 donor) və adipogenezin induksiyasından 0, 1, 2, 3, 6 və 10 gün sonra ASC-lərdən (4 donor) təcrid edilmişdir. Orta təmizlik nisbəti (A260/A280) 2.0 olmaqla məhsuldarlıq 2 ilə 10 μg arasında dəyişdi.

Proliferasiya edən və diferensiasiya edən ASC-lərdə RNT ifadə analizi üçün ən etibarlı olanları tapmaq üçün bir neçə namizəd istinad genini seçdik (Əlavə fayl 1: Cədvəl S2). İstinad genləri üçün standart əyrilər proliferasiya edən ASC-lər əsasında işlənmişdir, halbuki adipogen marker genləri üçün standartlar adipogenezin induksiyasından üç gün sonra ASC-lərdə yerinə yetirilmişdir (Əlavə fayl 3: Şəkil S2 və Əlavə fayl 4: Şəkil S3).

Standartlar üçün kəmiyyət RT-PCR klassik 10 qat seriyalı seyreltmə metodundan istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. İstinad və hədəf gen primer dəstlərinin effektivliyi (E) müvafiq olaraq 101.9 +/− 2.81% və 103.9 +/− 3.80% orta dəyərlərə malikdir (Əlavə fayl 4: Cədvəl S3). Xüsusi bir PCR gücləndirilməsini təsdiqləmək üçün gel elektroforezi aparıldı. O, proqnozlaşdırılan ölçüdə yalnız bir PCR məhsulunu göstərdi (Şəkil 2a). Əlavə olaraq, ərimə əyri analizi hər bir primer cütü üçün bir aydın zirvə nümayiş etdirdi (məlumatlar göstərilmir).

Primer spesifikliyi və orta xam dövr hədləri. a – Bütün namizəd istinad gen primer dəstlərinin gücləndirmə spesifikliyi. cDNA differensiallaşdırılmamış insan ASC-lərindən təcrid edilmişdir. 1-10 zolaqları: GAPDH, TBP, EF1A, LMNA, RPS18, PSMD5, MRPL19, TCRF, CCNA2 və GUSB. B və C - xam kəmiyyət PCR CT proliferasiya zamanı namizəd istinad genləri üçün dəyərlər (b) və adipogenez (c). Hər bir gen dublikatlarda 15 (çoxalma) və ya 24 (adipogenez) müxtəlif bioloji nümunələrdə gücləndirildi. Dəyərlər +/− SEM vasitələri kimi təqdim olunur

Test edilmiş istinad genləri müxtəlif ifadə səviyyələrini göstərdi (Şəkil 2b və c). Bu dörd qrup daxilində artan SD-lərin əhəmiyyətli kənar göstəricilərə aid olub-olmadığını qiymətləndirmək üçün müəyyən bir məlumat dəstində kənar göstəriciləri aşkar edən və onların əhəmiyyətini təyin edən Grubbs testini etdik. eşik həddi ilə əhəmiyyətli kənar göstərici aşkar edilmədi səh ≤ 0,05. Buna görə də, bütün nümunələr əlavə təhlil üçün daxil edilmişdir.

ASC proliferasiyası və differensasiyası üçün müvafiq istinad genlərinin qiymətləndirilməsi

Bu işdə seçilmiş namizəd istinad genləri müxtəlif funksional siniflərdə zülalları kodlayır, beləliklə, genlərin birgə tənzimlənmə şansı aşağıdır [18]. ASC proliferasiyası və differensasiyası üçün optimal istinad genlərini seçmək üçün üç müxtəlif riyazi yanaşma (GeNorm, NormFinder və BestKeeper) istifadə edilmişdir:

GeNorm təhlili namizəd istinad genlərini 0,5 həddi qədər ən aşağı ifadə sabitlik dəyərinə (M-dəyəri) malik olaraq sıralayır. Dəyəri 0,5-dən çox olan genlər qeyri-sabit sayılır [27], baxmayaraq ki, heterojen hüceyrə populyasiyalarında M-dəyəri 1,0 də qəbul edilə bilər [27]. Fərqlənmə prosesindən keçən ASC-lər velosiped sürən ASC-lərlə müqayisədə homojen hüceyrə populyasiyası kimi qəbul edilə bilməz. Buna görə də, həddi çoxalmış hüceyrələr üçün 0,5, hüceyrələri fərqləndirmək üçün isə 1,0 olaraq təyin edilmişdir. GeNorm proqram təminatı ilə yaradılan M-dəyərləri Şəkil 3a və b-də təqdim olunur.

Proliferasiya və adipogenezdə ən sabit istinad genlərini müəyyən etmək üçün namizəd gen ifadəsinin təhlili və sıralanması. ab – Proliferasiyada namizəd istinad genlərinin M sabitlik dəyərini göstərən GeNorm analizi (a) və fərqləndirmə (b) ASC-lər. Aşağı dəyərlər daha sabit genləri, yüksək dəyərlər daha az sabit genləri göstərir. cd – Proliferasiyada ən sabit istinad genlərini göstərən NormFinder analizi (c) və fərqləndirmə (d) ASC-lər. Aşağı dəyərlər daha sabit genləri, yüksək dəyərlər daha az stabil genləri göstərir. ef – Proliferasiya üçün ən stabil istinad genlərini (onların Pearson korrelyasiya əmsalı əsasında) göstərən BestKeeper analizi (e) və fərqləndirmə (f). Daha yüksək dəyərlər daha sabit genləri, aşağı dəyərlər daha az sabit genləri göstərir. səh < 0,001 (istisnalar: yayılma: RPS18 səh = 0,002 adipogenez: GUSB səh = 0,03, MRPL19 səh = 0.003). g – Adipogenez zamanı uyğun (yaşıl) və uyğun olmayan (qırmızı) istinad genlərinin adipogen marker genlərinin nisbi ifadələrinə təsiri göstərilir.

NormFinder alqoritmi hər bir genin sabitlik dəyərini hesablayır. Bu təhlilə əsasən, ən aşağı stabilliyə malik iki namizəd genin istifadəsi tövsiyə olunur (həddi 0,15) [18]. Şəkil 3c-də göstərildiyi kimi, namizəd genlər (MRPL19, TBP, EF1A, PMSD5GAPDH) çoxalmaqda olan ASC-lər üçün normallaşdırma əmsalı kəsilmə dəyəri 0,15 ilə müəyyən edilmiş meyarlara cavab verir. NormFinder analizi ortaya çıxdı MRPL19TBP proliferasiya edən ASC-lər üçün istinad genlərinin ən yaxşı birləşməsidir (sabitlik dəyəri 0,075). Bununla belə, fərqləndirici ASC-lərdə sınaqdan keçirilmiş namizəd genlərinin sabitlik dəyərləri 0.15 həddinin altında qala bilmədi (Şəkil 3d). Yuxarıda qeyd edildiyi kimi, bu yüksək dəyərlər fərqli hüceyrələrin heterojenliyinə görə ola bilər. Bununla birlikdə, birləşməsi PSMD5TBP sabitlik dəyərini məqbul sayı 0,122-yə dəyişdi.

BestKeeper analizi, uyğun olmayan namizəd istinad genlərini mərhələli şəkildə istisna edir. Hər bir istinad geni üçün təsviri statistik təhlildən sonra standart sapması 1.0-dan yuxarı olan namizədlər dərhal xaric edilir. Sonradan hər bir istinad geni üçün Pearson korrelyasiya əmsalı R hesablamaq üçün cüt-müdrik korrelyasiya təhlili aparılır. Yüksək R dəyərləri sabit gen ifadə modelini göstərir [24]. C-nin təhliliT proliferasiya edən ASC-lərdə bütün namizəd genlərin dəyərləri 1.0-dan aşağı SD (standart sapma) aşkar etdi (məlumatlar göstərilmir). CCNA2 yüksək SD (0,89) olduğu üçün əlavə hesablamalardan çıxarılmışdır. Əlavə təhlil bütün namizəd genlər üçün güclü korrelyasiya göstərdi (0,977 < R < 0,741 Şəkil 3e). BestKeeper analizini ən uyğun üç genlə təkrarladığımızda, MRPL19, GUSBEF1A, korrelyasiya hətta artdı (0,985 < R < 0,987, Əlavə fayl 1: Cədvəl S4). İstisna etdikdən sonra CCNA2 (SD = 1,5), adipogenik ASC-lərdə namizəd istinad genləri kifayət qədər zəif korrelyasiya göstərdi (0,920 < R < 0,437, Şəkil 3f). Bununla belə, üç ən yaxşı namizədin yoxlanılması (PSMD5, EF1ATFRC) bu genlər arasında güclü korrelyasiya aşkar etdi (0,969 < R < 0,935, Əlavə fayl 1: Cədvəl S4).

Fərqli istinad genlərinin maraq genlərinin (GOIs) ifadələrinə təsiri ASC-ləri fərqləndirərkən qiymətləndirildi. Kombinasiyalardan istifadə edərək təmsilçi vaxt kursu təcrübələri EF1A + PSMD5, CCNA2 + LMNA və yalnız CCNA2 as the reference gene(s) are shown in Fig. 3g. It is clear that the selection of the reference gene(s) has considerable influence on the measurement of GOI expression.


Müzakirə

Using a repeated sampling study design, we investigated PBMC transcript expression in patients undergoing stent implantation, using a novel time-course analysis method. We identified a set of 42 genes with differential temporal expression among patients with and without ISR at one year follow-up in a discovery analysis of the CardioGene Study. Independent replication testing in an Icelandic sample confirmed differential expression of 36 probesets mapped to 32 genes. The gene expression patterns over time may be of interest as well, with consistently expressed genes representing gene expression data that may be able to predict ISR and differentially expressed genes over the time course representing genes with possible direct functional roles in the development of ISR, both of which require further investigation to explore more fully.

Gene expression profiling with DNA microarray technology is a popular tool to monitor the expression level of thousands of genes simultaneously and has been applied in cardiovascular research, to detect patterns of gene expression indicative of underlying disease states[16–21]. Since the data generated represent the temporal abundance of mRNA levels in the sample, measurements of the change of this abundance over the course of disease progression (or any biological process) is therefore both possible and of great scientific interest using this technology. In fact, Yuan and Kendziorski[22] reported that more than one-third of the experiments catalogued in the Gene Expression Omnibus (National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) are from experiments that measure gene expression over time. Early time-course RNA expression studies have focused on identifying clusters of genes with a similar pattern over time[14, 23, 24]. More recently, detecting a differential gene expression pattern over time between several biological groups has become an interesting goal of time-course gene expression data.

To detect differential gene expression pattern over time, we used a time-varying intercept model which can account for differences in sample intervals between patients. The term "differential gene expression pattern over time" can be interpreted in several ways to form suitable questions and, thus, the hypotheses are dependent on the particular experiment under consideration. We considered two related questions where each can roughly correspond to the main effect of the group, and the interaction between group and time points. Consider, for example, a gene with exactly the same expression pattern over time in both groups, but the first group has a higher expression than the second group, consistently over all time points. This is a gene that shows the main effect of the group. On the other hand, consider another gene with similar expression level at two time points, 1 and 2, but this gene's expression increases from time 1 to 2 in one group but decreases in another group. This group-by-time interaction cannot be examined by methods that only test the main effect of the group. The time-varying intercept model we used can detect both the main effect and group-by-time interaction. This method, however, requires a large number of bootstrap resampling to evaluate the significance level of the difference between groups, which can be computationally challenging especially when a large number of genes are tested.

Of the genes we identified, the most extensive prior literature in vascular disease was found for the NAB2 gene, which is also known as EGR1 binding protein 2. Early growth response (EGR) genes, which are transcription factors that are implicated in a wide variety of proliferative and differentiative processes[15]. Nab proteins are necessary for Schwann cells to exit the cell cycle and generate a myelin-specific gene profile and are key regulators of the myelination process of peripheral nerves[25]. NAB2 is expressed in vascular smooth muscle cells in response to injury[3–12, 26] and EGR1 has been identified in a microarray study of in vitro smooth muscle cell proliferation[27]. The LAMP2 gene product protects the lysosomal membrane from proteolytic enzymes within lysosomes and also functions as a receptor for proteins to be imported into lysosomes[28]. İçindəki mutasiyalar LAMP2 gene have been identified in patients with hypertrophic cardiomyopathy[29], and the gene product mediates adherence of PBMCs to the vascular endothelium[13]. Cellular adhesion to the vascular endothelium has been well-described in animal models and post-mortem human examinations, in atherogenesis and acute vascular injury[30, 31]. In the latter, the extent of leukocyte adhesion is predictive of the degree of subsequent neointimal hyperplasia, which is the key lesion of ISR.

Some genes identified have no apparent role in vascular biology, such as VPS26, VPS41, SRP54, və RAD23B, and comparison to previously published reports in the literature do not show differential gene expression in other studies of restenosis, although these investigations were conducted primarily on vascular tissues or culture vascular smooth muscle cells rather than peripheral blood[17, 18, 27, 32]. The VPS26 and VPS4 genes belongs to a group of vacuolar protein sorting genes and may have a role in lysosome maintenance[33], and SRP54 is a protein in the signal recognition particle, which directs secretory proteins to membranes as they emerge from the ribosome [34]. Specific vascular or inflammatory cell function has not been described, but derangement of these basic cellular processes may impact vascular and other physiologic functions adversely. RAD23B has a role in DNA (nucleotide excision) repair, and genetic variants in RAD23B have been associated with several solid tumors[35–38]. The association with cancer would suggest a possible link to excess proliferative mechanisms in vascular wound repair, as has been described for many other cell cycle regulatory genes[39]. Genetic variants in other genes we identified are also associated with human diseases. Several genetic variants in ACADM have been associated with medium-chain acyl-CoA dehydrogenase activity, but there is no known vascular implication of this disorder[40]. Variants in PCMT1FOLR2 have been associated with neural tube defects[41–43], with no known vascular phenotype in these cases. Overall the findings of this study are hypothesis-generating and can be used to support the rational for investigating the function of specific genes and pathways in adverse vascular remodeling, which is relevant to both ISR and more general CAD phenotypes.

We compared the results of our study to previously published reports of transcriptome analysis in ISR. Our results were negative for replication of these studies which focused primarily on vascular tissue samples, in relatively small sample sets. In one study, peripheral blood total leukocyte gene expression was studied in 10 patients with ISR and atherectomy specimens [23]. While a high degree of correlation between peripheral blood leukocyte and arterial neointima tissue gene expression was identified in a subset of genes, these findings were based upon single measurements in a small sample size and were not replicated in the original report. These prior reports highlight the major difficulty of studying vascular tissues, since access to these tissues in adequately large sample sizes is limited.

Vascular biopsy and atherectomy are performed infrequently as part of routine clinical care and would not support well-powered studies of vascular tissues. Tissue sampling over a time course is not clinically indicated or possible. Additionally, a large degree of intra-individual variability in gene expression was noted in these prior studies of vascular tissues, making replication testing critical, yet this cannot be done without access to additional tissues samples. In our study, we analyzed peripheral blood leukocytes, specifically focusing on the mononuclear fraction which contains primarily B and T lymphocytes and monocytes. Although the analysis of peripheral blood cells would ideally be complemented by similar studies in vascular tissues, studying gene expression profiles in blood leukocytes is biologically relevant due to well-defined interactions with the arterial wall, particularly in the setting of vascular injury and repair as in the setting of ISR[17]. The overlap between vascular and blood gene expression in one prior transcriptome analysis of ISR was supportive of our rationale to study PBMCs. For these reasons, and with the additional prior knowledge that inflammation plays a significant role in the development of ISR, we undertook a study of PBMCs in several hundred patients, with adequately powered replication testing for our top discovery findings. Additionally, we use a time course analysis method that improved our ability to detect gene expression signals between the two comparison groups, overcoming some of the difficulty of substantial variability in single point microarray gene expression data.

To address the possibility of false positives identified with our statistical methods, we conducted replication analyses in the independent sample of deCODE samples and we conducted bootstrap resampling to assess significance of the findings. Through this sensitivity analysis, we demonstrated that the validation of 36 probe sets is not likely to be due to chance. Additional potential limitations of this study of ISR are the use of a clinical restenosis outcome, rather than an angiographic outcome, in which clinically silent ISR may have been missed, and the choice of tissue analyzed, as discussed. The CardioGene and deCODE cohorts differ in the incidence of ISR (16.7% in the CardioGene Study and 28.8% in deCODE) with the patients in the deCODE sample showing overall lower residual percent stenosis in the treated lesion after stent implantation. Also, the proportions with hyperlipidemia and diabetes differ. However, despite the differences in the cohorts, we find replication of a substantial proportion of the discovery findings.


Buna istinad edin

  • APA
  • Müəllif
  • BIBTEX
  • Harvard
  • Standart
  • RIS
  • Vankuver

Vertebrate Embryogenesis. red. / Francisco J. Pelegri. New York, NY : Humana Press, 2019. p. 183-218 (Methods in Molecular Biology Vol. 1920).

Tədqiqatın nəticəsi: Kitab/Hesabat/Konfransda fəsil › Fəsil (Kitab) › Digər › ekspert rəyi

T1 - Detection of gene and protein expression in mouse embryos and tissue sections

N2 - Analysis of gene (mRNA and protein) expression patterns is central to the study of embryonic development. This chapter details methods for detecting mRNA and protein expression in whole-mouse embryos and in tissue sections, including mRNA in situ hybridization, immunohistochemistry, and detection of enzymatic and fluorescent protein reporters. We focus on histological methods molecular methods of measuring gene expression (for example, RNAseq, PCR) are not included here.

AB - Analysis of gene (mRNA and protein) expression patterns is central to the study of embryonic development. This chapter details methods for detecting mRNA and protein expression in whole-mouse embryos and in tissue sections, including mRNA in situ hybridization, immunohistochemistry, and detection of enzymatic and fluorescent protein reporters. We focus on histological methods molecular methods of measuring gene expression (for example, RNAseq, PCR) are not included here.


Videoya baxın: 7-ci sinif. Quşlar sinfi (Iyun 2022).