Məlumat

Böyük bir peptid ardıcıllığı əlavə etmədən zülal konsentrasiyasını müəyyən etmək üçün floresan analizləri?

Böyük bir peptid ardıcıllığı əlavə etmədən zülal konsentrasiyasını müəyyən etmək üçün floresan analizləri?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Potensial təmizləmə addımları vasitəsilə zülal konsentrasiyasını izləmək və ən səmərəli bu cür addımları sınamaq üçün zülalın vizual olaraq ölçülə bilən bir şeylə etiketlənməsinin bir yolunu tapmağa çalışıram. Bununla belə, GFP və onun əmiuşağı çox böyük zülallardır ki, mənim təmizlənməni hədəflədiyim xassələri dəyişdirəcək və onları başlanğıc deyil.

Təmizləmə üçün zülalın kimyəvi/fiziki xassələrini minimal şəkildə dəyişdirərkən, bir zülalın konsentrasiyasını ölçmək üçün flüoresan, kolorimetriya və s. vasitəsilə istifadə edilə bilən bir etiket varmı?


Kitab rəfi

NCBI kitab rəfi. Milli Tibb Kitabxanasının, Milli Səhiyyə İnstitutunun xidməti.

Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Molekulyar Hüceyrə Biologiyası. 4-cü nəşr. Nyu York: W. H. Freeman, 2000.

  • Nəşriyyatçı ilə razılaşma əsasında bu kitaba axtarış funksiyası ilə daxil olmaq mümkündür, lakin onu nəzərdən keçirmək mümkün deyil.


GİRİŞ

AMP ilə aktivləşdirilmiş protein kinaz (AMPK) hüceyrə [ATP]:[AMP] nisbətini azaldan ətraf mühitin streslərinə cavab olaraq ATP istehlak edən prosesləri aşağı salaraq və katabolizmi tənzimləməklə metabolik fəaliyyətin tənzimlənməsində mərkəzi rol oynayır. Aktivləşdirildikdən sonra AMPK asetil KoA karboksilaza (ACC, yağ turşularının biosintezində iştirak edir), HMG-CoA reduktaza (xolesterol sintezinin əsas tənzimləyicisi və statinlər sinfinin dərman vasitələrinin hədəfi) [1], həmçinin qlikogen sintazasını fosforlaşdırır və təsirsizləşdirir. [2]. AMPK 'x003b1, 'x003b2 və 'x003b3 subunitlərindən [3, 4] ibarət olan heterotrimerik kompleksdir və birbaşa ən azı üç proseslə tənzimlənir: katalitik aktivləşdirmə dövrəsində Thr-172-nin fosforlaşması ilə aktivləşmə. LKB1 [5-9] və ya CaMKK α və ya β [10, 11] tərəfindən α alt bölməsi, deaktivasiya vasitəsilə Bu yerdə PP2 [12] ilə defosforilasiya və allosterik aktivasiya vasitəsilə AMP [13].

AMPK müxtəlif toxumalarda geniş şəkildə ifadə olunur, müxtəlif izoformlar müxtəlif toxumalarda dominant olaraq ifadə edilir. Trimerik kompleks α, β və γ alt bölmələrindən ibarətdir, α və β alt vahidlərinin hər biri üçün müəyyən edilmiş iki izoforma və γ alt vahidi üçün müəyyən edilmiş üç izoforma malikdir. AMPK-nın on iki izoformasının mümkünlüyü. Qaraciyərdə α1 və α2 alt vahidlər β ilə təxminən bərabər miqdarda mövcuddur1 və γ1 onların müvafiq alt vahidlərinin üstünlük təşkil edən formaları olmaqla [14]. Bunun əksinə olaraq, ürək və skelet əzələsində α2 forma α üzərində üstünlük təşkil edir1 2:1 nisbətindən daha çox formalaşır və β2 alt vahid β üzərində üstünlük təşkil edir1 bu toxumalarda da əmələ gəlir [15].

AMPK aktivləşdirilməsinin terapevtik hədəflənməsinin diabet modellərində müsbət nəticələr verdiyi göstərilmişdir. Kiçik molekullu metformin dərmanı təxminən 50 ildir ki, tip 2 diabetin müalicəsində istifadə olunur və dolayı yolla AMPK fosforlaşmasını və aktivləşdirilməsini təşviq edir [16]. Başqa bir kiçik molekul, AICAR (5-aminoimidazol-4-karbozamid ribozid), hüceyrə [ATP]: [AMP] nisbətini pozmadan AMPK-ni farmakoloji cəhətdən aktivləşdirmək üçün faydalı bir vasitə olduğunu sübut etdi. AICAR hüceyrələrə alınır vasitəsilə adenozin nəql sistemi və sonra fosforilləşərək AICAR monofosfat və ya ZMP [17] əmələ gətirir ki, bu da allosterik AMP bağlayıcı yerə bağlanaraq AMPK-nı aktivləşdirir. Bu yaxınlarda, 700.000-dən çox birləşmədən ibarət kitabxananın AMPK aktivatorları və ya inhibitorları [18] üçün yoxlanıldığı yüksək dərəcədə miniatürləşdirilmiş radiometrik analizin nəticələri bildirildi və hitlərin optimallaşdırılması tienopiridona əsaslanan kiçik molekula (A-769662) gətirib çıxardı. aktivləşdirilmiş siçovul-qaraciyər və ya rekombinant AMPK (α1β1γ1) AK ilə50 təxminən 800 nM və diabet müalicəsində müsbət təsir göstərmişdir ob/ob siçanlar [19]. Maraqlıdır ki, bu birləşmə AMPK aktivliyini artıra bildi in vitro AMP-nin doymuş miqdarda olması, AMPK-nı aktivləşdirən birləşmələri inkişaf etdirmək üçün istifadə edilə bilən çoxlu allosterik saytların mümkünlüyünü göstərir. Bundan əlavə, AMPK aktivasiyası ateroskleroz və xərçəng [20] üçün terapevtik hədəf kimi ortaya çıxdı.

AMPK aktivləşdirilməsinə terapevtik marağa əlavə olaraq, hipotalamusda AMPK aktivliyinin birbaşa inhibisyonu [21] və ya leptinin səbəb olduğu azalmanın [22, 23] qida qəbulunu və bədən çəkisini azalda biləcəyinə dair sübutlar var. Mürəkkəb C, pirazo[1,5-a]AMPK-nı inhibə edən pirimidin birləşməsi yüksək məhsuldarlıqlı ekranda aşkar edilmişdir [16] və sonradan siçanlarda qida qəbulunu azaltdığı göstərilmişdir [21]. Siçan hipotalamusunda AMPK-nın dominant mənfi formasının ifadəsi həm qida qəbulunu, həm də çəki artımını azaldır, AMPK-nın konstruktiv aktiv forması ifadə edildikdə isə əks nəticələr müşahidə edilmişdir [22].

AMPK-nın metabolik homeostazın saxlanmasında və müxtəlif toxumalarda mövcud olan izoformaların müxtəlifliyində oynadığı əsas rola görə, AMPK fəaliyyətinin kiçik molekullu modulyatorlarını müəyyən etmək və xarakterizə etmək üçün sadə, homogen, qeyri-radiometrik üsullara ehtiyac var. Bu ehtiyacı ödəmək üçün biz bir sıra analizlər hazırlamışıq (Şəkil 1). ​ 1 1 ) kəşf prosesinin müxtəlif mərhələləri üçün. Rəngli, flüoresan və ya çökdürülmüş birləşmələr kimi ümumi analiz müdaxilə formalarına xas müqavimətinə görə HTS tətbiqləri üçün yaxşı uyğun olan, zamanla həll edilmiş Förster rezonans enerji ötürülməsi (TR-FRET) analizi hazırlamışıq [24]. Bundan əlavə, biz əmələ gələn məhsulun miqdarına birbaşa mütənasib olan cavabı təmin edən və buna görə də AMPK fəaliyyətinin kiçik molekullu modulyatorlarının təfərrüatlı mexaniki tədqiqatlarına (və ya vurma-təsdiqinə) yaxşı uyğun gələn ikinci dərəcəli analizlər hazırlamışıq. Bu formatlardan birincisi FRET əsaslı formatdır ki, burada AMPK üçün peptid substratı onun ucunda kumarin/flüoresein FRET cütü ilə etiketlənir. Kinaz reaksiyasından sonra fosforlaşdırılmamış substratı üstünlüklə parçalayan sahəyə xüsusi proteaza əlavə edilir və bununla da parçalanmamış, fosforlanmış məhsulda toxunulmaz qalan FRET siqnalını azaldır [25]. Bu şəkildə, FRET-dəki dəyişikliklər substratın fosforlaşması ilə birbaşa əlaqələndirilə bilər. İkinci format, serin, treonin və ya tirozin qalığının fosforlaşmasının fosfat qrupu ilə qeyri-təbii, flüorogen amin turşusu arasında maqneziumun fosfatdan asılı şelasiyasına səbəb olduğu xelatla gücləndirilmiş flüoresans (CHEF) prinsipinə əsaslanır. Sox), peptid ardıcıllığına daxil edilmiş və bu şelasiya hadisəsi ilə flüoresan olur [26]. FRET-əsaslı analiz formatı avtomatlaşdırılmış birləşmə profilinin yaradılması üçün rahat üsul təqdim edir və CHEF-əsaslı analiz real vaxt rejimində təmizlənmiş AMPK fəaliyyətini birbaşa izləmək imkanı verir.

İnhibitorların AMPK aktivatorlarını xarakterizə etmək üçün istifadə olunan flüoresan analiz formatlarının sxemi. (A) TR-FRET formatı flüoresein etiketli, fosforlanmış peptid və terbium etiketli fosfospesifik antikor arasında əlaqəni aşkar edir. (B) FRET-əsaslı format son olaraq kumarin-flüoresein FRET cütü ilə etiketlənmiş peptid substratından istifadə edir və fosforlanmış peptidin proteolizə həssaslığının azalması səbəbindən fosforlanmış məhsulun miqdarını ölçür. (C) CHEF əsaslı format qeyri-təbii, flüorogenik Sox qalığını özündə birləşdirən peptid substratdan istifadə edir. Proksimal serin, treonin və ya tirozin qalığının fosforlaşmasından sonra Sox hissəsi Sox qalığı ilə fosfat qrupu arasında Mg 2+ vasitəçiliyi ilə körpü əmələ gətirir və flüoresan olur.


Kimyəvi zülalların dimerizasiyası bioloji dünyada bir çox əsas tənzimləmə yollarında iştirak edir. [ 1 ] Bir sıra təbii məhsullar təbii olaraq meydana gələn qarşılıqlı təsirlərin sabitləşməsi ilə aşağı axın təsirini göstərir. Bu, allosterik effekt vasitəsilə baş verə bilər ki, bunun nəticəsində dimerizator və hədəf zülal arasında ilkin qarşılıqlı təsir zülalda yeni bağlanma interfeysinin əmələ gəlməsi və ya açılması ilə nəticələnir, başqa cür müşahidə olunmayan zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsinə (PPI) imkan verir. Alternativ olaraq, dimerizer iki və ya daha çox hədəf zülalın birbaşa bağlanması ilə fəaliyyət göstərə bilər. Bu, ya ikinci zülal üçün yeni, yüksək yaxınlıqlı zülal-liqand bağlama səthi yaratmaq üçün üstünlük olaraq bir hədəf zülalın bağlanmasını əhatə edə bilər, ya da iki zülal arasında əvvəlcədən mövcud olan interfeysə bağlanma müəyyən bir PPI-nin ömrünü və ya yaxınlığını artıra bilər. . [2] Birincisi ən yaxşı şəkildə rapamisin-mTOR qarşılıqlı təsiri ilə xarakterizə olunur. [3] Sonuncu adətən böyük makrolid təbii məhsullar tərəfindən induksiya olunur, bunlara 14-3-3 adapter zülalları daxildir, bununla da bu şaperon zülallarının bir sıra hədəflərlə sabitləşməsi fusikoksin A və kotilenin A kimi təbii məhsullarla nümayiş etdirilir. 2, 4 ]

Rapamisinlə eyni ailə daxilində, digər diqqətəlayiq nümunələrə immunosupressantlar FK506 və siklosporin daxildir, onların hər ikisi indi terapevtik istifadə üçün lisenziyalıdır. [ 5-7 ] Rapamisin bu ailənin ən çox öyrənilən nümunələrindən biridir. FKBP12-də kiçik hidrofobik ciblə bağlanaraq, mTOR (0,2 nM Kd) üçün güclü yaxınlıq göstərən yeni FKBP12-rapamisin bağlama səthi yaradılır. [8] Sonradan mTOR-a bağlanma, geniş yayılan mTOR siqnal yollarının inhibəsi ilə nəticələnir, [9] bu, hüceyrə böyüməsi və metabolizmində kritik yolları, həmçinin çoxalma və sağ qalmağı tənzimləyir. [ 10 ]

PPI inhibitorlarının identifikasiyası üçün müxtəlif üsullar işlənib hazırlanmış və tətbiq edilmiş olsa da, [11] de novo iki zülalın birbaşa birləşməsini tənzimləyən birləşmələrin kəşfi. [12] Hüceyrədaxili zülalların məkan-zaman nəzarətini təmin edən hədəf zülalların sekvestri ilə kompleks siqnal şəbəkələrinin tədqiqi üçün getdikcə daha çox kimyəvi səbəbli zülal dimerizasiyası istifadə olunur. [13] Bu, adətən, maraq doğuran zülallarla əvvəllər xarakterizə olunan liqandlara malik olan zülal domenlərinin birləşməsini əhatə edir. [14-16] Terapevtik və ya tədqiqat məqsədləri üçün kimyəvi cəhətdən induksiya edilmiş zülal dimerizasiyasından istifadə etmək üçün əvvəlcə məlum təbii zülal bağlayıcı və ya dimerizator tələb olunur, lakin bütün arzu olunan protein hədəfləri müəyyən edilmiş təbii məhsul ligandına malik deyildir. bu tədqiqatlar. Mövcud qarşılıqlı təsirlərin sabitləşməsi və ya təbii olaraq əlaqəsi olmayan iki zülalın süni birləşməsi PPI sahəsində həm əhəmiyyətli tədqiqat, həm də terapevtik potensialı təmsil edir.

Əvvəllər biz PPI inhibitorlarının müəyyən edilməsi üçün bir platforma haqqında məlumat vermişdik ki, bu da bakterial tərs iki hibrid sistemini (RTHS), PPI-ləri araşdırmaq üçün yaxşı qurulmuş bir vasitə ilə [17-19] birləşir. in vivo peptidlərin və zülalların split-intein dairəvi bağlanması (SICLOPPS) adlanan kitabxana nəsil texnikası. Bu birləşmiş yanaşma, müəyyən bir PPI inhibitorları üçün yüz milyona qədər üzvdən ibarət olan siklik peptid kitabxanalarının hüceyrədaxili istehsalına və skrininqinə imkan verir. [ 20-24 ] Bu yanaşmanın sonrakı inkişafı iki istiqamətli flüoresan iki hibrid sisteminin (FTHS) qurulmasını əhatə edir. [ 25 ] Burada biz SICLOPPS kitabxanaları ilə birləşmə üçün həm həyat/ölüm seçimini, həm də flüoresan markerini özündə birləşdirən üç hibrid sistemin (3HS) qurulması və təsdiqlənməsi haqqında məlumat veririk ki, bu da iki hədəf zülalın dimerləşməsini tənzimləyir. Belə bir sistem kiçik molekullu stabilizatorlar və ya dimerləşmə induktorları üçün yeni başlanğıc nöqtələrinin müəyyən edilməsinə imkan verə bilər.


Zülalların təmizlənməsi üsulları: 4 üsul

Zülalların təmizlənməsində istifadə olunan üsulları təqribən analitik və preparativ üsullara bölmək olar.

Fərqlilik dəqiq deyil, lakin həlledici amil bu üsulla praktiki olaraq təmizlənə bilən zülalın miqdarıdır. Analitik üsullar qarışıqda bir zülalın aşkarlanması və müəyyən edilməsi məqsədi daşıyır, hazırlıq metodları isə struktur biologiya və ya sənaye istifadəsi kimi digər məqsədlər üçün böyük miqdarda protein istehsal etməyi hədəfləyir. Ümumiyyətlə, hazırlıq üsulları analitik tətbiqlərdə istifadə edilə bilər, lakin əksinə deyil.

Metod № 1. Çıxarma:

Mənbədən asılı olaraq, zülal onu ehtiva edən toxuma və ya hüceyrələri parçalayaraq məhlula gətirilməlidir. Buna nail olmaq üçün bir neçə üsul var. Seçim üsulu zülalın nə qədər kövrək olmasından və hüceyrələrin nə qədər möhkəm olmasından asılıdır.

Bu ekstraksiya prosesindən sonra həll olunan zülal həlledicidə olacaq və mərkəzdənqaçma yolu ilə hüceyrə membranlarından, DNT-dən və s. ayrıla bilər. Ekstraksiya prosesi həmçinin məhluldakı zülalları həzm etməyə başlayacaq proteazları çıxarır. Əgər zülal proteolizə həssasdırsa, adətən proteolizi yavaşlatmaq üçün tez davam etmək və ekstraktın soyudulması arzu edilir.

Metod № 2. Yağıntı və Diferensial Həllləşmə:

Kütləvi zülalların təmizlənməsində zülalları təcrid etmək üçün ümumi ilk addım ammonium sulfat (NH) ilə çöküntüdür.4)2BELƏ Kİ4. Bu, artan miqdarda ammonium sulfat əlavə etməklə və çöküntü zülalının müxtəlif fraksiyalarını toplamaqla həyata keçirilir. Bu metodun bir üstünlüyü ondan ibarətdir ki, çox böyük həcmdə ucuz şəkildə həyata keçirilə bilər.

Təmizlənəcək ilk zülallar suda həll olunan zülallardır. İnteqral membran zülallarının təmizlənməsi, eyni membran bölməsində olan hər hansı bir xüsusi proteini digərlərindən təcrid etmək üçün hüceyrə membranının pozulmasını tələb edir. Bəzən mitoxondrial membranda yerləşən bir zülalın təmizlənməsindən əvvəl hüceyrələrdən mitoxondriyanın təcrid edilməsi kimi ilk növbədə xüsusi membran dartma təcrid oluna bilər.

Natrium dodesil sulfat (SDS) kimi bir yuyucu vasitə hüceyrə membranlarını həll etmək və təmizlənmə zamanı membran zülallarını məhlulda saxlamaq üçün istifadə edilə bilər, lakin SDS denatürasiyaya səbəb olduğundan, zülalları saxlamaq üçün Triton X-100 və ya CHAPS kimi daha yumşaq yuyucu vasitələrdən istifadə edilə bilər. Təmizləmə zamanı 8217-nin yerli uyğunlaşması.

Metod №3. Ultrasentrifuqalama:

Mərkəzdənqaçma, mayedə asılı vəziyyətdə olan müxtəlif kütlələrə və ya sıxlıqlara malik hissəciklərin qarışıqlarını ayırmaq üçün mərkəzdənqaçma qüvvəsindən istifadə edən bir prosesdir. Tərkibində zülalların və ya digər hissəciklərin, məsələn, bakteriya hüceyrələrinin qarışığı olan gəmi (adətən boru və ya butulka) yüksək sürətlə fırlandıqda, bucaq momentumu hər hissəcik üçün kütləsinə mütənasib olan xarici qüvvə verir.

Müəyyən bir zərrəciyin bu qüvvəyə görə mayedə hərəkət etmə meyli mayenin hissəcikə göstərdiyi müqavimətlə əvəzlənir. Nümunənin sentrifuqada “spinning” xalis təsiri ondan ibarətdir ki, kütləvi, kiçik və sıx hissəciklər daha az kütləli hissəciklərdən və ya mayedə daha çox “drag” olan hissəciklərdən daha sürətli xaricə doğru hərəkət edirlər.

Hissəciklərin süspansiyonları bir sentrifuqada “əyirildikdə”, mayedə aşağı sürükləmə ilə ən kütləvi hissəciklər üçün zənginləşdirilmiş qabın dibində “pellet” əmələ gələ bilər. Qalan, hələ də əsasən mayedə qalan sıxılmamış hissəciklər “supernatant” adlanır və supernatantı qranuldan ayırmaq üçün qabdan çıxarıla bilər.

Mərkəzdənqaçma sürəti nümunəyə tətbiq edilən bucaq sürəti ilə müəyyən edilir, adətən g ilə müqayisədə ölçülür. Nümunələr kifayət qədər uzun müddət sentrifuqa edilərsə, qabdakı hissəciklər tarazlığa çatacaqlar ki, burada hissəciklər xüsusi olaraq gəminin üzmə sıxlığının mərkəzdənqaçma qüvvəsi ilə balanslaşdırıldığı bir nöqtədə toplanır. Belə bir “tarazlıq” sentrifuqalama verilmiş hissəciyi geniş şəkildə təmizləməyə imkan verə bilər.

Saxaroza gradient sentrifuqalanması:

Şəkərin xətti konsentrasiya qradiyenti (adətən saxaroza qliserin və ya Percoll) ən yüksək konsentrasiyanın altda və ən aşağı hissəsində olması üçün bir boruda yaradılır. Daha sonra zülal nümunəsi gradientin üstünə qatlanır və ultrasentrifuqada yüksək sürətlə fırlanır. Bu, ağır makromolekulların daha yüngül materialdan daha sürətli borunun dibinə doğru miqrasiyasına səbəb olur.

Saxaroza olmadıqda mərkəzdənqaçma zamanı hissəciklər fırlanma mərkəzindən getdikcə uzaqlaşdıqca, onlar getdikcə daha çox mərkəzdənqaçma qüvvəsi yaşayırlar (nə qədər irəliləyirlərsə, bir o qədər sürətlə hərəkət edirlər). Bununla bağlı problem, gəmi daxilində faydalı ayırma diapazonunun kiçik müşahidə olunan pəncərə ilə məhdudlaşdırılmasıdır.

Nümunəni iki dəfə daha uzun fırlatmaq, maraq hissəciyinin əslində iki dəfə uzağa getməsi demək deyil, əhəmiyyətli dərəcədə irəli gedəcəkdir. Lakin zülallar saxaroza qradiyenti ilə hərəkət etdikdə sıxlığı və özlülüyü artan maye ilə qarşılaşırlar.

Düzgün tərtib edilmiş saxaroza qradiyenti artan mərkəzdənqaçma qüvvəsinə qarşı çıxacaq, beləliklə hissəciklər mərkəzdənqaçma sahəsində olduqları vaxta yaxın nisbətdə hərəkət edirlər. Bu qradiyentlərlə ayrılan nümunələr “rate zonal” sentrifuqalar adlanır. Zülal/hissəciklər ayrıldıqdan sonra gradient fraksiyalaşdırılır və toplanır.

Metod № 4. Xromatoqrafik üsullar:

Adətən zülalların təmizlənməsi protokolu bir və ya daha çox xromatoqrafik addımdan ibarətdir. Xromatoqrafiyada əsas prosedur, tərkibində zülal olan məhlulun müxtəlif materiallarla dolu sütundan axmasıdır. Müxtəlif zülallar sütun materialı ilə fərqli şəkildə qarşılıqlı təsir göstərir və beləliklə, sütundan keçmək üçün tələb olunan vaxt və ya zülalın sütundan ayrılması üçün tələb olunan şərtlərlə ayrıla bilər. Adətən zülallar sütundan çıxarkən 280 nm-də udma qabiliyyəti ilə aşkar edilir.

Bir çox müxtəlif xromatoqrafik üsullar mövcuddur:

1. Ölçü İstisna Xromatoqrafiyası:

Xromatoqrafiya məsaməli gellərdən istifadə edərək məhlulda və ya denaturasiya şəraitində zülalları ayırmaq üçün istifadə edilə bilər. Bu texnika ölçüsü istisna xromatoqrafiyası kimi tanınır. Prinsip ondan ibarətdir ki, kiçik molekullar məsaməli bir matrisdə daha böyük həcmdən keçməlidir. Nəticə etibarilə, müəyyən diapazonda olan zülallar gel sütununun digər ucunda toplanmazdan əvvəl dəyişkən həcmdə eluant (həlledici) tələb edəcəklər.

Zülalın təmizlənməsi kontekstində eluant adətən müxtəlif sınaq borularında yığılır. Tərkibində zülalın ölçülə bilən izi olmayan bütün sınaq boruları atılır. Qalan məhlul təmizlənmək üçün zülaldan və hər hansı digər oxşar ölçülü zülallardan hazırlanır.

2. İon mübadiləsi xromatoqrafiyası:

İon mübadiləsi xromatoqrafiyası birləşmələri ion yükünün təbiətinə və dərəcəsinə görə ayırır. İstifadə olunacaq sütun növünə və yüklənmə gücünə görə seçilir. Anion mübadilə qatranları müsbət yükə malikdir və mənfi yüklü birləşmə funtlarını saxlamaq və ayırmaq üçün istifadə olunur, kation dəyişdirici qatranlar isə mənfi yükə malikdir və müsbət yüklü molekulları ayırmaq üçün istifadə olunur.

Ayrılma başlamazdan əvvəl əks yüklü ionları tarazlaşdırmaq üçün sütundan bir tampon vurulur. Nümunənin yeridilməsi zamanı məhlulun molekulları bufer ionları ilə mübadilə edəcəklər, çünki hər biri qatrandakı bağlama yerləri üçün rəqabət aparır. Hər bir həll olunan maddə üçün saxlama müddəti onun yükünün gücündən asılıdır.

Ən zəif yüklü birləşmələr əvvəlcə, daha sonra ardıcıl olaraq daha güclü yüklərə malik olanlar süzülür. Ayırma mexanizminin təbiətinə görə pH, tampon növü, bufer konsentrasiyası və temperaturun hamısı ayrılmağa nəzarətdə mühüm rol oynayır. İon mübadiləsi xromatoqrafiyası zülalların təmizlənməsində istifadə üçün çox güclü vasitədir və tez-tez həm analitik, həm də preparativ ayırmalarda istifadə olunur.

3. Yaxınlıq Xromatoqrafiyası:

Yaxınlıq Xromatoqrafiyası, tez-tez tətbiq üçün xüsusi qatranlardan istifadə edən molekulyar uyğunlaşmaya əsaslanan ayırma üsuludur. Bu qatranların səthlərinə ayrılan birləşmələr üçün xüsusi olan liqandlar var. Çox vaxt bu liqandlar antikor-antigen qarşılıqlı təsirinə bənzər şəkildə fəaliyyət göstərirlər. Bu “kilid və açar” liqand və onun hədəf birləşməsi arasında uyğunlaşır, onu yüksək dərəcədə spesifik edir, tez-tez tək pik yaradır, eyni zamanda nümunədə qalan hər şey saxlanılmır.

Bir çox membran zülalları qlikoproteinlərdir və lektin yaxınlıq xromatoqrafiyası ilə təmizlənə bilər. Yuyucu vasitə ilə həll olunan zülalların kovalent bağlanmış lektinə malik olmaq üçün dəyişdirilmiş xromatoqrafiya qatranına bağlanmasına icazə verilə bilər.

Lektinə bağlanmayan zülallar yuyulur və sonra xüsusi olaraq bağlanmış qlikoproteinlər, lektin bağlanma yerində bağlanmış qlikoproteinlərlə rəqabət aparan yüksək konsentrasiyalı şəkər əlavə edilərək süzülə bilər. Bəzi lektinlər şəkərlərlə rəqabət aparmaq çətin olan qlikoproteinlərin oliqosakkaridlərinə yüksək yaxınlığa malikdirlər və lektini denatürasiya etməklə bağlı qlikoproteinlər buraxılmalıdır.

4. Metal bağlama:

Ümumi bir texnika zülalın C-terminalına 6-8 histidin ardıcıllığının mühəndisləşdirilməsini əhatə edir. Polihistidin nikel və kobalt kimi ikivalentli metal ionlarına güclü şəkildə bağlanır. Zülal, polihistidin etiketini bağlayan immobilizasiya edilmiş nikel ionları olan bir sütundan keçirilə bilər. Bütün etiketlənməmiş zülallar sütundan keçir.

Zülal, sütuna bağlanmaq üçün polihistidin etiketi ilə rəqabət aparan imidazol ilə və ya etiketin qatran üçün yaxınlığını azaldan pH-ın azalması (adətən 4,5-ə qədər) ilə yuyula bilər. Bu prosedur, bir qayda olaraq, rekombinant zülalların dizayn edilmiş yaxınlıq etiketi ilə (məsələn, 6xHis-teq və ya Clontech'in HAT etiketi kimi) təmizlənməsi üçün istifadə olunsa da, o, iki valentli kationlara xas yaxınlığı olan təbii zülallar üçün də istifadə edilə bilər.

5. İmmunoaffinlik Xromatoqrafiyası:

İmmunoaffinit xromatoqrafiyası zülalın seçici şəkildə təmizlənməsi üçün hədəf zülala antikorun spesifik bağlanmasından istifadə edir. Prosedura bir antikorun sütun materialına immobilizasiyasını əhatə edir, sonra zülalı seçici şəkildə bağlayır, qalan hər şey axır. Zülal pH və ya şoranlığı dəyişdirərək Ix-dən ayrıla bilər. Bu üsul bir etiketdə mühəndisliyi nəzərdə tutmadığından, təbii mənbələrdən zülallar üçün istifadə edilə bilər.

6. HPLC:

Yüksək performanslı maye xromatoqrafiyası və ya yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyası məhlulları sütundan daha sürətli sürmək üçün yüksək təzyiq tətbiq edən xromatoqrafiya formasıdır. Bu o deməkdir ki, diffuziya məhduddur və ayırdetmə qabiliyyəti yaxşılaşır. Ən çox yayılmış forma “ters faza” HPLC-dir, burada sütun materialı hidrofobikdir.

Zülallar asetonitril kimi üzvi həlledicinin artan miqdarının gradienti ilə elüt edilir. Zülallar hidrofobikliyinə görə ayrılır. HPLC ilə təmizləndikdən sonra zülal yalnız uçucu birləşmələri ehtiva edən məhlulda olur və asanlıqla liyofilləşə bilər. HPLC-nin təmizlənməsi tez-tez təmizlənmiş zülalların denatürasiyası ilə nəticələnir və beləliklə, kortəbii şəkildə yenidən qatlanmayan zülallara tətbiq edilmir.


Müzakirə

İmmunopresipitasiya (İP) prosedurları zülalların təmizlənməsi, konsentrasiyası, birgə immunopresipitasiyası və xromatin immunopresipitasiyası [2-8] daxil olmaqla, çoxlu molekulyar biologiya analizlərinə tətbiq edilir. Klassik İP proseduru tez-tez immunoblotinq analizi ilə birləşdirilir, bu üsul yalnız bir neçə nümunənin aşağı ötürmə qabiliyyətinin təhlili üçün uyğundur [10, 20, 21]. Burada biz muncuqların səthində flüoresanla işarələnmiş hədəf zülalının birbaşa müşahidəsi və/və ya kəmiyyətinin müəyyən edilməsi ilə şərti IP-ni birləşdirən FLIP (Flüoresan IP) təsvir və xarakterizə edirik. Bu yanaşma IP-nin uğurunu ölçmək üçün IB-dən istifadə etməkdən daha sürətli və daha ucuzdur və buna görə də yüksək məhsuldarlıqlı ekranlara uyğundur. İP analizinin əsas məhdudiyyəti tez-tez hədəf zülalı effektiv şəkildə immunoprecipitasiya edə bilən antikorların mövcudluğudur [22]. Burada biz siçanların monoklonal anticisimlərinin skrininqinə FLIP tətbiq etdik ki, onların müvafiq hədəf zülalını immunepresipitasiya edə bilənləri tez bir zamanda skrininq etmək və müəyyən etmək.

Burada biz göstəririk ki, FLIP IP/IB analizinə oxşar həssaslığa malikdir və FLIP həm hüceyrə lizatının həcmini, həm də İP üçün istifadə olunan antikor miqdarını minimuma endirməklə məhsuldarlığı artırmaq üçün miniatürləşdirilə bilər. FLIP-in digər üstünlüyü, FLIP-dən keçən antikorlar üçün spesifiklik dərəcəsini təmin edən flüoresan etiketli hədəf zülalın istifadəsidir. Həqiqətən də, hədəf zülalın İP üçün istifadə edilən hüceyrə lizatında flüoresan işarələnmiş yeganə zülal olduğunu nəzərə alsaq, immunopresipitasiyadan sonra agaroza muncuqlarını flüoresan örtüyən olması sınaqdan keçirilmiş antikorun hədəf zülala seçici bağlanmasını göstərir. Digər tərəfdən, FLIP analizi sınaqdan keçirilmiş antikorun flüoresanla işarələnmiş hədəf zülaldan fərqli zülallara mümkün qeyri-spesifik bağlanmasına “kordur”. FLIP-in digər mümkün məhdudiyyəti odur ki, o, hazırda sınaqdan keçirilmiş antikorun hədəf zülalı denatürasiya edilmiş vəziyyətdə tanımaq qabiliyyəti haqqında heç bir məlumat vermir və buna görə də FLIP immunoblotinq analizlərində antikorların davranışını proqnozlaşdıra bilmir. Bu məqsədlə, FLIP nəzəri olaraq yüksək SDS konsentrasiyaları və/və ya azaldıcı maddələr kimi denatürasiya şərtləri ilə əvvəlcədən işlənmiş protein məhlulları/lizatlarından istifadə etməklə istifadə edilə bilər [5]. Bu yanaşma, qismən denaturasiyaya məruz qalan və hələ də floresan olaraq qalan denaturasiya şərtlərinə tab gətirə bilən GFP və GFP əldə edilmiş flüoroforların yüksək sabitliyinə görə mümkün və bir növ informativ ola bilər [23].

Həmçinin, FLIP endogen zülalların İP-də bir antikorun performansını qiymətləndirə bilməz, çünki o, hədəf zülalın həddindən artıq ifadəsinə əsaslanır. Buna baxmayaraq, biz burada göstəririk ki, FLIP klassik IP/IB prosedurlarına asanlıqla inteqrasiya oluna bilər, heç bir pozulma və sonuncunun həssaslığı azalmır. Bu, endogen zülalın zolaqlarının IB analizi üçün FLIP skrininqindən sonra antikorların əlavə xarakteristikasına imkan verir. Üstəlik, FLIP hədəf zülalın flüorofor etiketli birləşmə kimi həddindən artıq ifadəsinə əsaslanır və buna görə də maraq doğuran genin uyğun bir ifadə vektoruna klonlaşdırılmasını tələb edir. Bu məqsədlə biz HuEV-A adlı çevik məməli ifadə vektorunu işləyib hazırladıq ki, bu da Gateway klonlaşdırmasının sadəliyini 3xFLAG-V5-YFP teqimizin çevikliyi ilə birləşdirdi [18, 19, 24]. Zülalların HuEV-A kitabxanasını yaratmaq üçün Gateway klonlama (Gateway giriş klon formatı) ilə uyğun gələn Life Technologies Ultimate ORF kolleksiyasından istifadə etdik. Həmçinin, HuEV-A teqi sadə Cre rekombinasiyası ilə 3xFLAG-V5 teqinə qədər ölçüdə kəskin şəkildə kiçilə bilər və ya FLP rekombinasiyasından istifadə etməklə bütün teq aradan qaldırıla bilər.

FLIP analizi əsas konsepsiyada daha əvvəl təsvir edilmiş LUMIER (luminescence-based memeli interactome mapping) analizinə [12, 13] çox bənzəyir. 25-27], mayanın iki hibrid skrininq hitinin təsdiqi [28, 29] və xəstələrin qanında xüsusi antikorların müəyyən edilməsi (Lusiferaza İmmunoprecipitation Systems və ya LIP) [30]. LUMIER, Renilla lusiferaza ilə birləşmiş hədəf zülalın həddindən artıq ifadəsindən istifadə edir və immunopresipitasiyadan sonra lüminesans siqnalının kəmiyyət təyinindən istifadə edir. FLIP-ə gəldikdə, hədəf sintez zülalının immuno-çökməsinin müvəffəqiyyəti yüksək məhsuldarlıq ölçmələri ilə səmərəli və asanlıqla müəyyən edilə bilər: LUMIER və LIP vəziyyətində lusiferaza substratı ilə inkubasiyadan sonra lüminesansın ölçülməsi və lüminesans örtüyünün ölçülməsi. FLIP halda immunoprecipitated muncuq. LUMIER sisteminin böyük uğurlarına və çoxsaylı tətbiqlərinə baxmayaraq, indiyədək İP təhlili üçün yüksək məhsuldarlıq qabiliyyətinə malik heç bir alternativ analiz hazırlanmamışdır.

Bizim FLIP analizimiz IP/WB və FLIP analizinin özü ilə müqayisədə yəqin ki, daha həssas olan LUMIER analizini əvəz etmək üçün nəzərdə tutulmayıb. Bizim FLIP analizimiz lusiferaza reaksiyaları üçün çətin olan yüksək məhsuldarlıqlı prosedurlarda və ya mikroskopiya müşahidələrinin lusiferaza siqnalının kəmiyyətləşdirilməsindən daha əlverişli olduğu və ya flüorofor işarələnməsinin üstünlük verildiyi kontekstlərdə əvvəllər məlum olan texnikaları (IP/WB və LUMIER analizləri) tamamlamaq üçün nəzərdə tutulub. Renilla etiketləmə. FLIP analizi İP reaksiyalarının sürətli yoxlanılması üçün əlavə vasitədir. FLIP, həmçinin LUMIER sistemi üçün ortoqonal analiz kimi də nəzərdə tutula bilər, çünki FLAG ilə işarələnmiş “yırtıcılar” və seçilmiş flüorofor, lüminesans kəmiyyətləşdirmədən əvvəl IP-nin effektivliyini yoxlamaq və kəmiyyətini müəyyən etmək üçün Renilla ilə işarələnmiş “yemlər” (bax [12]) ilə istifadə edilə bilər. . Bu kontekstdə FLAG, V5 və YFP etiketini ehtiva edən HuEV-A ifadə vektorumuz optimal olardı.

IP-Western blotlama ilə müqayisədə, antikorun qeyri-hədəf zülallara qarşı qeyri-spesifik reaktivliyi və/yaxud hədəf zülalın spesifik izoformlarına və ya birləşmə variantlarına qarşı üstünlük reaktivliyi kimi bəzi məlumatlar itirilir. Buna baxmayaraq, biz İP analizlərində səmərəli fəaliyyət göstərən antikorların skrininqində FLIP-in son dərəcə faydalı tətbiqini proqnozlaşdırırıq. Məsələn, bir çox təmizlənməmiş antikorlar hibridoma supernatantlarından istifadə edərək birbaşa FLIP tərəfindən sınaqdan keçirilə bilər. FLIP-müsbət klonların seçilməsindən sonra antikorların azaldılmış sayının təmizlənməsi və daha sonra IP/IB və ya digər analizlərlə xarakterizə edilməsi lazımdır. Üstəlik, FLIP analizində istifadə olunan material minimal olduğundan, FLIP-müsbət anticisimlər üçün yeni İP-nin təkrar yerinə yetirilməsinə ehtiyac yoxdur, çünki FLIP analizindən qalan muncuqlar sonrakı xarakteristikalar üçün istifadə edilə bilər.

Burada FLIP-in adi IP/IB prosedurunu qismən əvəz edə və asanlıqla tamamlaya bilən sürətli və etibarlı bir üsul olduğunu göstəririk. Bu yeni texnika birbaşa IP dərəcəli antikorların identifikasiyası üçün yüksək məhsuldarlıqlı skrininq üçün tətbiq oluna bilər.


Hutti, J. E. və başqaları. Protein kinaz fosforlaşmanın spesifikliyini təyin etmək üçün sürətli bir üsul. Nat. Met. 1, 27–29 (2004).

Songyang, Z. et al. Protein kinazalarının optimal substratlarını təyin etmək üçün yönümlü peptid kitabxanasından istifadə. Curr. Biol. 4, 973–982 (1994).

Asensio, C. J. A. və Garcia, R. C. Peptid substratları, P81 fosfoselüloz kağız massivləri və fosfor görüntülərindən istifadə edərək çoxlu sayda kinaz fəaliyyətinin müəyyən edilməsi. Analiz. Biokimya. 319, 21–33 (2003).

Fujii, K. və başqaları. Kinaz peptid spesifikliyi: təkmilləşdirilmiş təyinetmə və protein fosforilasiyasına aidiyyəti. Proc. Natl. akad. Sci. ABŞ 101, 13744–13749 (2004).

Rodriguez, M., Li, S.S., Harper, J.W. & Songyang, Z. Zülal-zülal qarşılıqlı təsirini öyrənmək üçün yönümlü peptid massivi kitabxanası (OPAL) strategiyası. J. Biol. Kimya. 279, 8802–8807 (2004).

Rychlewski, L. et al. Peptid mikroarray məlumatlarından istifadə edərək Abl kinazın hədəf spesifikliyi təhlili. J. Mol. Biol. 336, 307–311 (2004).

Bantan-Polak, T. et al. Amin turşularının mikroplata əsasında aşkarlanması üçün flüoreskamin və naftalin-2,3-dikarboksaldehid flüorogen reagentlərin müqayisəsi. Analiz. Biokimya. 297, 128–136 (2001).


Nəticələr

Peptidaza Fəaliyyəti üçün Tam Hüceyrə Təhlilinin İnkişafı.

FACS-in kəmiyyət kitabxanasının skrininq aləti kimi faydasını nəzərə alaraq, biz peptidazın aktivliyini, peptidazın səthində reportyor substratlarını göstərməklə yoxlamağa çalışdıq. Esherichia coli (şək. 1A). Reporter substrates were designed consisting of a peptide ligand that binds the fluorescent probe streptavidin-conjugated phycoerythrin (SA-PE) and a peptide substrate oriented such that cleavage removes the SA-PE-binding ligand from the cell surface. In this way, protease activity toward a given substrate would be detectable by monitoring whole-cell fluorescence by using FACS. Reporter substrates were displayed on E. coli by using circularly permutated outer membrane protein X (CPX), which presents both N- and C termini on the cell surface, enabling presentation of passenger peptides as nonconstrained, terminal fusions (18). As a control, a substrate-reporter display vector was constructed incorporating a known enteropeptidase cleavage site (DDDDK) flanked by flexible peptide linker sequences, as “spacers,” allowing protease access to the substrate, and a SA-PE-binding peptide ligand. Cells displaying the substrate were fluorescently labeled with SA-PE, resulting in a >20-fold increase in mean fluorescence intensity over background autofluorescence, as measured by flow cytometry (Fig. 2). Incubation of this cell population with enteropeptidase before labeling with SA-PE resulted in a ≈20-fold decrease in mean fluorescence intensity (Fig. 2B), whereas a negative control cell population displaying the sequence GGQSGQ exhibited minimal change in fluorescence (Fig. 2A). These results demonstrated that enzymatic cleavage of reporter substrates could be detected as a decrease in fluorescence intensity of cells by using FACS and hydrolysis is not due to cleavage outside of the designated substrate region.

CLiPS. (A) Display of reporter substrates, consisting of a substrate peptide and fluorescent-probe peptide ligand, on the surface of E. coli as fusions to the N terminus of circularly permuted outer membrane protein OmpX (CPX). Substrate cleavage results in a reduction of cellular fluorescence as detected by flow cytometry. (B) Substrate libraries are screened by depleting the library pool of clones that do not display a peptide and then enriching clones with hydrolyzed substrates.

Measurement of substrate conversion by FACS. Flow cytometry analysis of bacterial cell populations displaying either linker (GGSGGS) (A) or canonical substrate (DDDDK) (B) before (gray line) and after (black line) treatment with enteropeptidase. During library screening for enteropeptidase substrates, cell populations collected from screen 1A (C) and screen 3B (D) were analyzed by flow cytometry before (gray line) and after (black line) enteropeptidase treatment. The loss of fluorescence due to treatment, shown by the shift in the black line, demonstrates enrichment of enteropeptidase substrates after screen 3B (D).

To extend this single-cell substrate cleavage assay to identify optimal substrates for a given protease, a substrate library was constructed in E. coli by combinatorial randomization of six sequential amino acid positions within the substrate region (Fig. 1A). This CLiPS had a theoretical diversity of 6.4 × 10 7 unique amino acid sequences. The constructed library contained 1.5 × 10 8 independent transformants. Thus, this library is expected to include all possible 5-mer and 4-mer substrate sequences with >95% and 99% confidence limits, respectively, assuming a random distribution (19). Using the whole-cell activity assay, a screening methodology was devised to isolate library members displaying substrates cleaved by a given protease and, thereby, identify optimal substrates.

Determination of Enteropeptidase and Caspase-3 Specificity by Using CLiPS.

To demonstrate the general utility of CLiPS, the 6-mer substrate library was screened to identify optimal substrates for two unrelated proteases: caspase-3 and enteropeptidase. These proteases recognize the canonical substrates DEVD↓ (20) and DDDDK↓ (4), respectively. Caspase-3 was chosen to validate CLiPS, because specificity has been investigated extensively by using both substrate phage and fluorogenic substrates (21, 22). In contrast, enteropeptidase specificity is less well characterized and has been investigated primarily by using individually synthesized, fluorogenic substrate variants (23). For each protease, optimal substrates were identified by performing a two-step screen for hydrolysis (Fig. 1B). First, library members that display the affinity epitope were purified by sorting (Fig. 1B), thereby removing library members that do not display substrates (i.e., members with stop codons and frameshift mutations). The resulting library population was amplified by growth, treated with protease, labeled with SA-PE, and cells with reduced fluorescence resulting from substrate hydrolysis were collected (Fig. 1B). After three cycles of screening for enteropeptidase substrates, >95% of the enriched library displayed reporter substrates and exhibited cleavage similar to the canonical substrate (Fig. 2 CD). Therefore, a final sort was performed to identify enteropeptidase substrates that hydrolyzed more rapidly than the canonical substrate.

In applications that involve complex protease-containing mixtures, such as cellular lysates or tissue extracts, we anticipated that specificity could be identified by removing substrates that are cleaved by an appropriate background mixture. For this reason, we investigated whether substrates of a target protease can be determined in the presence of cell lysates. Nonspecifically cleaved substrates were depleted from the library first by incubation with E. coli lysate protein that does not contain the target protease, caspase-3 (Fig. 1B). Subsequently, cells displaying specifically cleaved substrates were isolated after incubating the library with lysate from E. coli-expressing caspase-3 (Fig. 1B). This process ensured that cleavage during screening was due to caspase-3 activity and not endogenous E. coli proteolytic activity. Two cycles of screening resulted in the enrichment of library members exhibiting caspase-3 dependent cleavage. Incubation of the enriched library with caspase-3 containing lysates, but not caspase-3-free lysates, resulted in a reduction of the mean fluorescence intensity of the population, as measured by flow cytometry (data not shown). Single clones from the enriched library were isolated from the remaining population by plating. Thus, CLiPS was capable of identifying caspase-3-specific substrates in the presence of a complex mixture.

Characterization of Substrate Cleavage Kinetics.

The use of multicopy substrate display on whole cells enabled simple and direct quantitative characterization of cleavage kinetics. Consequently, flow cytometry was used to rank individual isolated clones on the basis of substrate conversion, and those clones exhibiting >50% conversion were identified by DNA sequencing (Tables 1 and 2). Substrates efficiently cleaved by caspase-3 revealed a strong substrate consensus of DxVDG (Table 1), in agreement with the known specificity of caspase-3. The substrates identified for enteropeptidase shared a consensus sequence of D /ERM, indicating a substrate preference at the P1′ position (Table 2). Interestingly, enteropeptidase substrates identified by CLiPS were cleaved more rapidly than the canonical sequence, DDDDK (Table 2). Four isolated clones with high conversion were investigated further to quantify cleavage kinetics. Clones exhibiting multiple arginine residues were excluded to avoid substrates that may have multiple cleavage sites. Individual substrate displaying clones (e.g., EP4.1 EP, enteropeptidase) exhibited uniform substrate turnover (Fig. 3A), as determined by flow cytometry. In this way, the extent of conversion for each clone could be determined at several different time points and fit to a Michaelis–Menton model (Fig. 3B). The observed second-order rate constant (kpişik/KM) for the most rapidly cleaved substrate (EP4.3 SGDRMW) was 13-fold greater than that for the canonical substrate DDDDK (Table 3).

Caspase-3 substrates identified by using CLiPS with a 6-mer library

Enteropeptidase substrates identified by using CLiPS with a 6-mer library

Enteropeptidase substrate cleavage kinetics. (A) Time-dependent substrate conversion for clone EP 4.1 (VDYRFL) measured by FACS. (B) Average conversion for cell surface displayed enteropeptidase substrates identified by using CLiPS: VDYRFL (○), SGDRMW (▵), and SGERMM (×) with canonical DDDDK (♢). Data were fit to Michaelis–Menton model, which is shown as a line for each substrate.

Comparison of kinetic constants determined by using CLiPS, fluorescent protein FRET substrates, or synthetic peptides

To determine how cleavage kinetics (kpişik/KM) measured by using surface displayed reporter substrates relate to those measured in solution, two independent approaches were applied to measure kpişik/KM for soluble substrates. Because enteropeptidase is often used to remove peptide affinity tags, substrates were assayed in the context of a fusion protein. Specifically, fluorogenic substrates were constructed by using fluorescent proteins that exhibit FRET (CyPet and YPet) (24) and were used to determine protease cleavage kinetics as described in ref. 25. CyPet-YPet substrates for enteropeptidase having recognition sequences of DDDDKG, GGSGGS, or four sequences identified by CLiPS (EP4.1, EP4.2, EP4.3, or EP4.6) were constructed, expressed in E. coli, and purified. Substrate conversion by enteropeptidase was measured in real-time by fluorimetry and fit to Michaelis–Menton kinetics (Table 3). In relative agreement with whole-cell assays, the CLiPS substrate, SGDRMW, cleaved at a rate 17-fold faster than DDDDK. Absolute values of kpişik/KM for cell-surface-tethered and soluble substrates differed systematically, but importantly, the relative ranking of the cleavage rates of individual substrates was identical in either context. To further confirm the improved hydrolysis rate for the SGDRMW substrate, relative to DDDDK, fluorogenic peptide substrates were synthesized and cleavage was measured by using fluorimetry (Table 3). The kpişik/KM of the CLiPS-identified substrate SGDRMW was >5-fold higher than that of DDDDK. Collectively, these results demonstrate that whole-cell fluorescence assays provide a reliable means to quantitatively measure and rank cleavage kinetics of individual substrate sequences and that CLiPS enables identification of substrates with improved cleavage kinetics.


MULTICOLOR IMAGING

For many experiments, the first consideration will be what color (spectral properties) of fluorescent tag to use. The spectral properties of a fluorophore are given by its excitation and emission spectra. The excitation spectrum describes the wavelengths of light that, when absorbed, will result in the fluorophore reemitting light the spectrum of that emitted light is the emission spectrum. These are often reduced to numbers describing the peak excitation and emission wavelengths, but the spectra are often broad, and this simplification can obscure important information. To image two fluorescent tags in different channels requires that the excitation and emission spectra of one tag be sufficiently separate from those of the other tag (typically 60–100 nm) so that filters can be chosen that selectively detect each protein.

In many cases, the choice of colors is dictated by the instrumentation to which one has access and the fluorescent proteins it is designed to detect. For example, nearly all of the microscopes in the imaging center I direct can image blue, green, red, and infrared fluorescent proteins, but only a few microscopes are equipped with filters for cyan and yellow fluorescent proteins (CFP and YFP, respectively). I advise users of our center to avoid CFP and YFP if possible to maximize their imaging options. This is particularly true for instruments using laser illumination such as confocal, total internal reflection fluorescence, and light-sheet microscopes and flow cytometers, for which changing excitation wavelengths is expensive and difficult.

In general, I recommend starting with green and red fluorescent proteins, as these tend to be the brightest and best studied and have been found to work well for many applications. Somewhat surprisingly, EGFP still performs well in many systems, although newer proteins such as mClover3 and mNeonGreen outperform it in mammalian cells (Shaner və b., 2013 Bajar və b., 2016b). For red fluorescent proteins, mCherry was for many years the protein of choice, but it is now being supplanted by brighter and more photostable proteins. It appears likely that mScarlet (Bindels və b., 2017) will be the new red fluorescent protein of choice, but other proteins, such as mRuby3, TagRFP-T, and mKate2, may be worth considering (Shaner və b., 2008 Shcherbo və b., 2009 Bajar və b., 2016b). If additional colors are needed, mTagBFP2 (Subach və b., 2011) can be used with these with minimal cross-talk, although it is less bright than EGFP and phototoxicity is a concern with the near-ultraviolet (UV) excitation required. For a fourth color, a near-infrared fluorescent protein can be used, although these require a ligand. tdsmURFP is the brightest near-infrared fluorescent protein, although it requires supplementation with a biliverdin methyl ester to achieve maximum brightness (Rodriguez və b., 2016b). The next brightest monomeric option is mIRFP670 (Shcherbakova və b., 2016). However, both of these proteins are very new and have not been studied extensively. An alternative option is to use a self-labeling tag like Halo tag and an infrared dye these dyes, such as Cy5 or Alexa 647, are substantially brighter than the infrared fluorescent proteins. Four-color imaging with this combination is relatively straightforward, as both the fluorescent proteins and relevant filter sets are readily available.

CFP, YFP, and a red fluorescent protein can be used for three-color imaging (Livet və b., 2007), and an alternate system for four-color imaging has recently been demonstrated with mTurquoise2, Clover, mKO2, and mMaroon1 (Bajar və b., 2016a). In principle, both of these combinations should be extensible with the incorporation of a blue and infrared fluorescent protein to five and six colors. However, these combinations are less well tested, and filter sets for them are not widely available.

Other possibilities for imaging more than four fluorescent proteins at once include the use of long–Stokes shift proteins, which have a large separation between their excitation and emission wavelengths, enabling multiplexing with short–Stokes shift proteins. For example, T-Sapphire is a UV-excited GFP variant that can be multiplexed with the mWasabi green fluorescent protein, which is not UV excited (Ai və b., 2008). This pair can be further combined with mTagBFP2, allowing three proteins to be imaged in the spectral space previously used for two. The near-infrared proteins iRFP670 and iRFP720 are sufficiently spectrally separate to allow two-color imaging (Shcherbakova and Verkhusha, 2013), suggesting that iRFP720 could be multiplexed with other near-infrared fluorescent proteins to access an additional channel. However, iRFP720 is dimeric, and filter sets for this protein are not common, complicating use of this option. Another option for multiplexing larger numbers of colors is to acquire fluorescence at many wavelengths and use computational tools to separate overlapping fluorophore spectra (Zimmermann, 2005 Cutrale və b., 2017), although this requires specialized hardware and software.


NƏTİCƏ

Imaging confluently stained DNA molecules is complicated by issues of photodamage and phototoxicity mediated by organic dyes. Although fluorescent proteins do not generally suffer such issues and are well-targeted by many fusion techniques to cellular and molecular structures, they do not offer the ubiquitous binding patterns inherent to simple dyes. As such, we combined the virtues of organic and protein fluors by creating fluorescent fusion proteins (FP-DBP) featuring tightly binding peptides that promiscuously cover DNA molecules and when expressed within E. coli cells enabled the localization of nucleoid structures. Controllable expression of FP-DBPs will likely foster other new routes to localization of nucleic acids within living cells and offers yet another important advantage over organic dyes. Aside from reversible staining vasitəsilə pH shifts, we have also demonstrated FP-DBP confluent staining of naked DNA molecules in ways comparable to organic dyes, but featuring minimal photodamage during irradiation, and minimal perturbation of the DNA polymer contour length.

We thank Prof. Jungho Kim and Prof. Kwanghwan Jung for providing the mCherry and eGFP genes.