Məlumat

Western blot görüntü analizində ümumi protein normallaşması ilə bağlı sual

Western blot görüntü analizində ümumi protein normallaşması ilə bağlı sual


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mən western blot məlumatlarını təhlil edirəm və Ponceau S istifadə edərək ümumi zülalın normallaşdırılmasından istifadə edirəm. Rəhbərim və mən qərb ləkələrim üçün Beta-aktin və GAPDH kimi təmizlik zülallarından istifadə etmək əvəzinə ümumi protein normallaşdırılmasından istifadə etməyə razılaşdıq. Tədqiqatlar göstərdi ki, təsərrüfat zülallarının səviyyəsi eksperimental qruplar arasında və müxtəlif inkişaf mərhələlərində fərqlənir. Mən həmçinin ədəbiyyatı oxudum ki, burada tək zülal yükləmə nəzarəti ümumi zülal ləkələri ilə müqayisə edildi və ümumi zülal ləkələrinin daha çox təkrarlana bilən və dəqiq kəmiyyət müəyyənləşdirilməsinə səbəb olduğu aşkar edildi.

Ponceau S boyanmasının miqdarını təyin edərkən, mən bir çox məqalədə gördüm ki, onlar bütün zolağı təsvir edir və onun inteqrasiya olunmuş sıxlığını ölçürlər. Bununla belə, mənim iki qərb ləkəm var, buna görə də iki Ponso ilə ləkələnmiş membran şəklini təhlil edirəm. Ponso ilə ləkələnmiş membranımın bir görüntüsündə bəzi zolaqların yuxarı və yan hissələrini gizlədən qabarcıqlar var. Buna görə də kəmiyyət hesablama apararkən bütün zolağı təsvir edə bilmirəm. Rəhbərim mənə tövsiyə etdi ki, əvəzində maraq dairəmdəki zülalın olduğu yerə uyğun bir zolaq çəkməliyəm və onu normallaşdırmaq üçün istifadə edim. Mən bir kağızda bütün zolağın əvəzinə ümumi zülalın normallaşdırılması zamanı zolağın kiçik bir düzbucaqlı hissəsini təsvir etdiklərini də görmüşəm.

Bununla belə, mən başa düşmürəm ki, hər bir nümunədəki ümumi zülalın yalnız zolağın bir hissəsi göstərildiyi təqdirdə necə ölçülə bilər. Zolaqda yalnız düzbucaqlı bir zolaq təsvir edirsinizsə, nümunədəki ümumi proteinin yalnız bir hissəsini ölçürsünüz. Nəticədə, nümunədəki ümumi proteinə qarşı normallaşmırsınız. Maraqlandım, hər kəs ümumi protein ləkələri ilə normallaşdırma apararkən zolağın bir hissəsini qeyd etməyin əsas səbəbinin nə olduğunu bilirmi?


Fəsil 4: Məlumatların Təhlili

Yeni cib bələdçimiz eksperimental dizaynınızda sizə kömək edəcək bir sıra addımlardan ibarətdir.

E-poçtlarımızda qeydiyyatdan keçin

Laboratoriyada daha çox nailiyyət əldə etməyinizə kömək etmək üçün yeni məhsul və resursları istifadəyə verəcəyimizi ilk bilən siz olun.


Kəmiyyət Western Blot Məlumatlarında Yeni Normalın Müəyyənləşdirilməsi

JBC kimi jurnalların normallaşma üçün ev zülallarının istifadəsinə qarşı ciddi xəbərdarlıq etdiyini bilirsinizmi? İndi əksər jurnallar western blotting məlumatlarının təqdimatı üçün ciddi standartlar tələb edir. Ev zülalları (HKP) ənənəvi olaraq onilliklər ərzində istifadə olunsa da, onların istifadəsi ilə bağlı problemlər yalnız son vaxtlar gündəmə gəlib. HKP istifadə edərək məlumatların təqdim edilməsi üçün daha çox doğrulama tələb olunur. Nümunədə mövcud olan ümumi zülallardan istifadə edərək normallaşdırma əhəmiyyətli çəkiyə sahib oldu və western ləkələrinin normallaşdırılması üçün etibarlı bir üsul olduğunu sübut etdi. Burada ümumi zülalın normallaşdırılması (TPN) metodunun niyə üstün olduğunu və western blotting üçün getməyin yolunu göstəririk.

Multipleks Sitokin İmmunoanalizləri - Səylərin minimuma endirilməsi, Nəticələrin Maksimallaşdırılması

Təmizləmə problemləriniz var?

Əlaqədar Məzmun

2017-ci ilin Ən Yaxşı On Videosu
Bio-Rad-ın Xüsusi Rekombinant Antikorlarının arxasındakı Texnologiyanı kəşf edin
Yosun muncuqlarına, fotosintezə və hüceyrə tənəffüsünə giriş

Əlaqədar Məqalələr

Axın Sitometrləri üçün Təhlükəsiz Maliyyələşdirmə üçün 6 Məsləhət
Miyelodisplastik Sindrom üçün irəliləyən molekulyar diaqnostika
Qabaqcıl Xərçəng Terapevtikləri: Effektivliyin və Spesifikliyin Artırılması və Toksikliyin Azaldılması
Western Blot Universiteti

Daxili bioradiasiyalar

Faydalı Linklər

Bizi izlə

Məxfiliyə Baxış

Bu vebsayt vebsaytda gəzərkən təcrübənizi yaxşılaşdırmaq üçün kukilərdən istifadə edir. Bu kukilərdən zəruri olaraq təsnif edilən kukilər vebsaytın əsas funksiyalarının işləməsi üçün vacib olduğundan brauzerinizdə saxlanılır. Biz həmçinin bu veb-saytdan necə istifadə etdiyinizi təhlil etməyə və anlamağa kömək edən üçüncü tərəf kukilərindən istifadə edirik. Bu kukilər yalnız sizin razılığınızla brauzerinizdə saxlanılacaq. Bu kukilərə qoşulmaq seçiminiz də var. Lakin bu kukilərdən bəzilərini seçməməyiniz baxış təcrübənizə təsir edə bilər.

Kukilərdən necə istifadə etdiyimiz haqqında ətraflı öyrənmək üçün Kuki Siyasətimizi nəzərdən keçirin.

Bütün kukiləri qəbul etməklə və ya aşağıdakı kuki seçimlərinizdən imtina edərək və idarə etməklə təsdiq etdiyiniz üçün təşəkkür edirik.

Veb saytın düzgün işləməsi üçün zəruri kukilər tamamilə vacibdir. Bu kateqoriyaya yalnız vebsaytın əsas funksiyalarını və təhlükəsizlik xüsusiyyətlərini təmin edən kukilər daxildir. Bu kukilər heç bir şəxsi məlumat saxlamır.

Veb saytın işləməsi üçün xüsusilə zəruri olmayan və analitika, reklamlar və digər daxil edilmiş məzmunlar vasitəsilə istifadəçinin şəxsi məlumatlarını toplamaq üçün xüsusi olaraq istifadə edilən hər hansı kukilər lazımsız kukilər adlanır. Bu kukiləri veb saytınızda işə salmazdan əvvəl istifadəçi razılığını almaq məcburidir.

Analitik kukilər ziyarətçilərin veb saytla necə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu anlamaq üçün istifadə olunur. Bu kukilər ziyarətçilərin sayı, sıçrayış dərəcəsi, trafik mənbəyi və s. göstəricilər haqqında məlumat verməyə kömək edir.

Performans kukiləri ziyarətçilər üçün daha yaxşı istifadəçi təcrübəsi təqdim etməyə kömək edən veb saytın əsas performans indekslərini anlamaq və təhlil etmək üçün istifadə olunur.

Reklam kukiləri ziyarətçiləri müvafiq reklamlar və marketinq kampaniyaları ilə təmin etmək üçün istifadə olunur. Bu kukilər vebsaytlar üzrə ziyarətçiləri izləyir və fərdiləşdirilmiş reklamlar təqdim etmək üçün məlumat toplayır.


Ümumi Protein Normallaşması

Ümumi zülalın normallaşdırılması (TPN) ev təsərrüfatı genlərinə etibar etmədən maraq doğuran zülalın bolluğunu ölçmək üçün istifadə edilə bilən bir texnikadır. Ənənəvi olaraq, TPN, antikorlarla aşkarlanmadan əvvəl və ya sonra, membranı ümumi protein ləkəsi ilə inkubasiya etməklə həyata keçirilir. Maraqlanan zülalın bolluğu hər bir zolaqda zülalın ümumi miqdarına normallaşdırılır, bolluğu tək bir zülalla müqayisə etməklə bağlı variasiyaları aradan qaldırır. TPN daha az bolluq zülallarının aşkarlanması ilə də daha uyğundur.

Ümumi protein ləkələri ilə normallaşma mürəkkəb və vaxt aparan ola bilər. Bəzi ləkələr immunostimulyasiyadan əvvəl istifadə oluna bilsə də, digərləri aşağı axın antikor aşkarlanması ilə uyğun gəlmir. Bundan əlavə, bəzi ləkələr tez solur və nəticələrin sənədləşdirilməsini çətinləşdirir. Ləkəsiz yanaşma adlanan daha yeni texnika həssaslığı artırır və vaxta qənaət etməklə mürəkkəbliyi azaldır.

Ümumi protein ləkələri

Ümumi protein ləkələri Western blot membranındakı bütün zülallara bağlanır və köçürmədən sonra vizual görüntü təmin edir. Ləkənin növündən asılı olaraq, ümumi zülal ləkələri immunodeteksiyadan əvvəl və ya sonra istifadə edilə bilər. Daha çox yayılmış ləkələrdən bəziləri aşağıda təsvir edilmişdir.

Antikordan əvvəl ləkələr

Ponceau S kimi anion boyalar və Sypro Ruby, Deep Purple və AdvanStain Scarlet kimi flüoresan boyalar antikorların boyanmasından əvvəl istifadə edilən ümumi ləkələrdir.

Ponso S

Ponceau S sürətli və qənaətcildir. Proteinlər yalnız 5 dəqiqə inkubasiyadan sonra qırmızı rəngə boyanır. PBS və ya yuma tamponunda inkubasiya yolu ilə vizuallaşdırıldıqdan sonra boya asanlıqla çıxarılır. Ponceau S-nin aşağı axının immunodeteksiyasına heç bir təsiri olmasa da, zaman keçdikcə boyanmanın intensivliyi sürətlə azalır və şəkil çəkməyi çətinləşdirir. Qırmızı zolaqları çəkmək də çətin ola bilər.

Floresan ləkələri

Ponceau S-dən daha bahalı və vaxt aparan flüoresan ləkələr yüksək həssas, qalıcı, ümumi zülal ləkələridir və antikorların aşkarlanmasından əvvəl də istifadə edilə bilər. Bir neçə şirkət 1,0 ng-8,0 ng arasında dəyişən aşkarlama həddi olan flüoresan ləkələr satır. Ləkələr uzun müddət qalıcıdır və fotoşəkillərə davamlıdır, uzun müddət məruz qalma müddətini təmin edir. Əksər ləkələr UV və ya görünən işıqla həyəcanlana bilər və aşkarlanması üçün flüoresan görüntüleyici tələb olunur. Ləkə fotofilmdə və ya CCD kamera ilə sənədləşdirilə bilər. Ləkələmə proseduru ləkədən asılı olaraq 30 dəqiqə - 1 saat çəkə bilər.

Qeyd: Bəzi ləkələrin tərkibində ağır metallar var və bu, xüsusi utilizasiya prosedurlarını tələb edir.

Post-Antikor Ləkəsi

Amido qara

Amido qara tez-tez istifadə olunan qalıcı post-antikor anion ləkəsidir. Floresan ləkəsi qədər həssas olmasa da, Ponceau S-dən daha həssasdır və vizualizasiya üçün xüsusi avadanlıq tələb etmir. Həm də floresan ləkələrdən daha qənaətlidir. Parlaq qara zolaqları sənədləşdirmək asandır.

Kolloid qızıl

Kolloid qızıl hissəcikləri ümumi protein ləkəsi kimi istifadə edilə bilər. Bir membrana bağlanmış zülallarla inkubasiya edildikdə, qızıl elektrostatik qarşılıqlı təsirlər vasitəsilə zülallara adsorbsiya edilir və nəticədə keçici, qırmızı-çəhrayı rəng əldə edilir. Həssaslıq, sabit tünd qəhvəyi siqnal və 1 ng-ə qədər zülalın aşkarlanması ilə nəticələnən şeridin gücləndirilməsi vasitəsilə artırıla bilər. Kolloid qızıl boyama digər üsullarla müqayisədə daha bahalıdır və aşağı axın immunodeteksiyası ilə istifadə edilə bilməz.

Ləkəsiz

Ləkəsiz ümumi protein aşkarlanması sürətli və həssasdır. Texnologiya birbaşa gelə daxil olan trihalo birləşməsindən istifadə edir. UV şüalarına məruz qaldıqda, birləşmə zülallardakı triptofan qalıqlarını dəyişdirərək onların flüoresanlaşmasına səbəb olur. Floresan siqnalı CCD kamera ilə aşkar edilə bilər. Zülallar transferdən əvvəl və membrana köçürüldükdən sonra geldə görünə bilər. Ləkəsiz aşkarlama aşağı axın immunodeteksiyasına mane olmur. Əvvəlcədən tökmə jellər ləkəsiz gellər alına bilər və ya laboratoriyada trihalo birləşməsini akrilamidlə qarışdırmaqla ləkəsiz gellər hazırlana bilər. Ləkəsiz texnologiya tərkibində triptofan olmayan zülalları aşkar edə bilmir və asanlıqla aşkarlanmaq üçün zülalda ən azı 2 triptofan olması tövsiyə olunur.


Western blot analizində normallaşdırma vasitəsi kimi ləkəsiz texnologiya.

Qərb ləkələri kompleks bioloji nümunələrdə maraq doğuran zülalların nisbi miqdarını xüsusi olaraq ölçmək üçün istifadə olunur. Zülalın membrana qeyri-bərabər ötürülməsi kimi proses uyğunsuzluqları səbəbindən kəmiyyət ölçmələri səhvə məruz qala bilər. Nümunə ilə əlaqəli olmayan bu dəyişikliklər normallaşdırma kimi tanınan bir yanaşma ilə kompensasiya edilməlidir. Məlumatların normallaşdırılmasına iki yanaşma adətən istifadə olunur: ev zülalının (HKP) normallaşdırılması və ümumi zülalın normallaşdırılması (TPN). Bu işdə biz HKP normallaşdırma strategiyasının nümayəndəsi kimi qliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) ilə müqayisədə Qərb blotlama təcrübələri üçün yeni TPN aləti kimi Stain-Free texnologiyasının performansını qiymətləndirdik. Bu tədqiqat üçün istifadə edilən hədəf zülal (TP) əvvəllər şüalanmış limfoblastoid hüceyrə xətlərində (LCL) 20% aşağı tənzimləndiyi göstərilən DNT-ni lisenziyalaşdıran replikasiya faktoru olan MCM7 idi. Biz MCM7-nin flüoresan etiketli ikincili antikorlara əsaslanan multipleks Western blotting yanaşması ilə tənzimlənməsini öyrəndik və Ləkəsiz texnologiyanın GAPDH ilə HKP normallaşması ilə müqayisədə daha etibarlı, daha möhkəm və zülal tənzimlənməsinin kiçik təsirlərinə daha həssas olduğunu gördük. . Ləkəsiz texnologiya gelin ayrılması və zülal ötürülməsinin sürətli vizuallaşdırılmasına imkan verməklə, Qərb ləkələmə prosesi boyunca nəzarət nöqtələrinin təmin edilməsinin əlavə üstünlüklərini təklif edir.


MÜZAKİRƏ

Ümumiyyətlə, üç həftəlik laboratoriya modulları bir-birinə gözəl uyğunlaşır və tələbələrə elektroforez, Western blot, immunodeteksiya və toxuma çapı üsullarını öyrənməyə və başa düşməyə kömək edən məntiqi ardıcıllıq təşkil edirdi. Proses zamanı onlar həmçinin görüntü analizi və riyazi manipulyasiya vasitəsilə nəticələrdən keyfiyyət (yəni, Rubiskonun nisbi bolluğu və onun toxuma paylanması) və kəmiyyət (yəni, Rubisko böyük alt vahidinin molekulyar kütləsinin qiymətləndirilməsi) məlumatlarını necə çıxarmağı və əlaqələr qurmağı öyrəndilər. bu nəticələr və onların bitki toxumalarında təmsil etdikləri arasında. Laboratoriyadan sonrakı cavablar göstərdi ki, tələbələrin 80%-i laboratoriya texnikalarını yaxşı başa düşdüyünü bildirdi (Şəkil 4). Hər bir laboratoriya modulu bir texnikaya diqqət yetirdiyi üçün tələbələrin laboratoriya dövründə hər bir protokol dəsti ilə tanış olmaq üçün kifayət qədər vaxtı var idi. Hər laboratoriya seansı arasında bir həftəlik fasilə tələbələrdən əsas məlumatı və əvvəlki laboratoriyada əldə etməyə çalışdıqları məqsədləri xatırlamağı tələb edirdi ki, davamlılıq məntiqini görsünlər. Bu təkrar, onların hər bir addımda öyrəndikləri vacib anlayışların saxlanmasını gücləndirməyə kömək etdi, bunu laboratoriyadan əvvəlki tədqiqatlarla müqayisədə onların laboratoriyadan sonrakı performansının yaxşılaşması sübut etdi (Cədvəl 2).

Şagirdlər tez-tez Rubiskonun molekulyar kütləsinin hesablanmasında riyaziyyatda çətinlik çəkirdilər. Onlara molekulyar kütlə markerlərinin ölçülmüş miqrasiya məsafələrini və molekulyar kütlə qiymətlərini Excel cədvəlinə daxil etmək, marker zülallarının molekulyar kütləsinin loqarifminə qarşı məsafəni çəkmək, xətti formada trend xəttini tapmaq tapşırılıb. tənliyi [yəni, Y (miqrasiya məsafəsi) = k × log (molekulyar kütlə) + b], alın R 2 dəyərinə baxın və tənliyin log-xətti əlaqəni nə qədər yaxşı təsvir etdiyinə baxın. Daha sonra onlar Rubiskonun miqrasiya məsafəsini tənliyə daxil edərək və molekulyar kütləni həll etməklə müxtəlif bitki nümunələri üçün Rubiskonun böyük alt bölmələrinin molekulyar kütləsini hesabladılar. Mübarizə tez-tez log (molekulyar kütlə) = məlum dəyər tənliyindən molekulyar kütlə üçün həllin son mərhələsində baş verir, bunun cavabı eksponensial funksiyaya çevrilməklə əldə edilir (yəni, molekulyar kütlə = e gücünə yüksəldilir). məlum dəyər). Bundan əlavə, tələbələr Excel proqramında verilənlərin emalında müxtəlif bacarıqlar nümayiş etdirdilər. Bir çox tələbələr elektron cədvəldə təkrarlanan hesablamaların asanlığını və sürətini görənə və eksperimental məlumatları əyani şəkildə təqdim etmək üçün Excel-də riyazi funksiyalardan necə istifadə etməyi və diaqramlar yaratmağı öyrənənə qədər məlumatları emal etmək üçün əl kalkulyatorundan istifadə etməklə məşğul olurdular. Bu 3 həftəlik laboratoriya modulu tələbələrin Excel-dən istifadəni öyrənmək imkanı əldə etdikləri bir neçə digər laboratoriyalar arasında sonuncu modul idi. Tələbələrin 51 faizi elektron cədvəldən daha rahat istifadə etdiklərini, 26%-i neytral cavab verdiyini, 12%-i isə Excel-də çətinlik çəkdiyini bildirdi (Şəkil 4). İnanırıq ki, tələbələrə bioloji məlumatları təhlil etmək üçün riyaziyyatı tətbiq etməkdə və kalkulyatordan istifadə etməkdən daha təkmil məlumat emal edən proqrama keçiddə kömək etmək tələbələrin öyrənmə təcrübəsinə əlavə faydadır, Milli tərəfindən tövsiyə edilən bakalavr biologiya təhsilinin aspektidir. Tədqiqat Şurası (2003).

Toxuma çap modulu tələbələrin təxminən 60%-i üçün xoş laboratoriya təcrübəsi təqdim etdi və tələbələrin 52%-i bitkilərlə işləməkdən həzz aldı (Şəkil 4). Çap üçün istifadə olunan bitki materialı olan kərəviz asanlıqla əldə edilə bilər və idarə etmək çətindir. Qrupdakı hər bir tələbə çap etməyə təşviq edildi, nitroselüloz membranın hər bir parçasına çoxsaylı çaplar vuruldu, bu, uğurlu çap əldə etmək şansını artırdı. Doku izlərindən toxumalarda zülal paylanmasının fiziki xəritələşdirilməsi və vizuallaşdırılması bütün tələbələrin yarısı üçün maraqlı oldu.

Bu prosedurlarla bağlı potensial problemlərdən biri prosedurun daha uzun mərhələləri zamanı dayanma vaxtı idi. Bu inkubasiya vaxtlarından istifadə etmək üçün tətbiq etdiyimiz strategiya tələbələrin əvvəlki laboratoriya modulunda toplanmış məlumatlarını təhlil etmələri, şərh etmələri və müzakirə etmələri üçün idi. Tələbələr həmçinin kərəvizin qida dəyəri və dərman istifadəsi ilə bağlı ədəbiyyat axtarışları aparmağa həvəsləndirildi və kərəviz yarpaqlarının anatomiyasını disseksiya çərçivəsində müşahidə və qeyd etmələri tələb olundu. Təlimatçıların üç laboratoriya bölməsindən birində tələbələr Rubisco'nun toxuma yeri və gənc və yetkin petiolelərin Rubisko məzmununda fərqlənib-fərqlənməməsi ilə bağlı proqnozlarını müzakirə etdi və müzakirə etdi. Onlar ümumiyyətlə Rubiskonu yaşıl epidermal toxumada görəcəkləri ilə razılaşdılar, lakin onun daxili damar toxumasında da varlığını görəndə təəccübləndilər. Onlar gənc və yaşlı saplar arasında Rubisko məzmununda mümkün fərqlər barədə fikir ayrılığına düşərək, böyümə sürəti fərqini və gənc və yaşlı budaqların bir dəstə içərisində bir-birinə nisbətən yerləşməsini və işıq mənbəyinin töhfə verən amil ola biləcəyini əsas gətirərək fikir ayrılığına düşdülər. Onların yaratdığı toxuma çapları bu sualların hamısına eyni dərəcədə yaxşı cavab verməsə də, bu sorğuya əsaslanan yanaşmadan açıq şəkildə faydalandılar.

Tələbələrin mühazirə materialını öyrənməsi və onların laboratoriya texnikalarını başa düşməsi laboratoriyada praktiki fəaliyyətlərdən əhəmiyyətli dərəcədə faydalandı. Burada təqdim olunan üç laboratoriya modulu ilə bağlı suallar üzrə əhəmiyyətli dərəcədə təkmilləşdirilmiş laboratoriyadan sonrakı sorğu performansına əlavə olaraq (Cədvəl 2), tələbələr laboratoriya məşğələləri ilə də əlaqəli olan digər iki mühazirə mövzusunda yaxşı nəticə əldə etdilər. Bununla belə, onlar mühazirədə bəhs edilən və ya mətnin oxunması tapşırığına daxil edilmiş, lakin heç bir laboratoriya fəaliyyətinə həsr olunmayan başqa bir fotosintetik əhəmiyyətli ferment (yəni, fosfoenolpiruvat karboksilaza) haqqında biliklərdə təkmilləşmə göstərmədilər (Cədvəl 2, paralel mühazirə mövzuları). ).

Yaxşı qiymətləndirmə anketinin hazırlanması potensial problemlərin qarşısını almaq üçün çox diqqət və bacarıq tələb edir. Hazırladığımız sorğu sualları çoxseçimli formatda idi və ümumilikdə tələbə öyrənməsinin ümumən effektiv və etibarlı ölçülməsi hesab oluna bilər, lakin biz “yuxarıda göstərilənlərin hamısı” şəklində inklüziv düzgün cavabları istisna etməyi vacib hesab etdik. tələbənin düzgün cavabı təxmin etmə şansını artırdı və tələbə qiymətləndirməsində daha çox qərəzlilik riski ilə üzləşdi (Cədvəl 2, suallar 10 və 17). Bununla belə, tələbələrin cavablarına inamını yoxlayan növbəti sualı daxil etməklə, bu cür cavablarla suallara tələbə cavablarını daha dərindən təhlil etmək və anlamaq üçün çarə mümkündür.

Tələbələrin öyrəndikləri texnikaları tətbiq etmək bacarığını yoxlayarkən biz müəyyən etdik ki, tələbələrin bu texnikaların sinifdən kənarda necə tətbiq oluna biləcəyinə dair biliklərində təkmilləşmə olsa da, bu, texniki detalları və faktları anlamaqla müqayisədə nisbətən kiçik bir qazancdır. tədqiq olunan xüsusi molekul (Cədvəl 2, tətbiq və digər kateqoriyalar). Tələbələrimizin əksəriyyətinin biokimya, üzvi kimya və ya hər ikisi üzrə daha təkmil biliyə malik olmadıqlarını nəzərə alaraq, fiziki və kimyəvi elmlər üzrə daha çox bilik əldə etdikcə onların texniki yanaşmanı tətbiq etmək və ya köçürmək qabiliyyətinin dərhal təcrübədən kənara çıxacağına inanırıq. digər kurs işlərindən bioloji molekulların xassələri.

Xülasə, qiymətləndirmə sorğularının nəticələri göstərir ki, biz laboratoriya modullarının hər biri üzrə müəyyən edilmiş təlim məqsədlərinə nail olmuşuq və biz inanırıq ki, onlar mühüm hüceyrənin öyrənilməsində bakalavrlar üçün mümkün və faydalı giriş hüceyrə biologiyası laboratoriya işi kimi tətbiq edilə və ya dəyişdirilə bilər. biologiya üsulları və onların potensial tətbiqləri.


Kəmiyyət Qərb Blot Təcrübəsinin Dizaynı

Western blotting kompleks nümunədə zülal hədəfinin aşkarlanması vasitəsi kimi başlayan, otuz ildən artıqdır ki, praktikada mövcud olan bir texnikadır. Həssaslığı, aşkarlamanın dinamik diapazonunu və multipleksləşdirilmiş hədəf aşkarlamanın tətbiqini təkmilləşdirmək üçün həm görüntüləmə, həm də reagent texnologiyalarında əhəmiyyətli irəliləyişlərin olmasına baxmayaraq, əsas texnika mahiyyətcə dəyişməz qalmışdır. Keçmişdə western blotting sadəcə mürəkkəb qarışıqda xüsusi hədəf zülalını aşkar etmək üçün istifadə olunurdu, lakin indi jurnal redaktorları və rəyçiləri nümunələr arasında protein ifadəsində qat dəyişiklikləri baxımından western blot məlumatlarının kəmiyyət şərhini tələb edirlər. Hesablamalar ləkələrdən gələn əlaqəli kimilümininessent və/və ya flüoresan siqnalların diferensial densitometriyasına əsaslanır və bu, indi eksperimental metodologiyada, məlumatların əldə edilməsində və şərhində əsaslı dəyişiklik tələb edir. Biz bu yaxınlarda western blotlardan kəmiyyət densitometrik məlumat əldə etmək üçün yenilənmiş bir yanaşma dərc etdik (Taylor et al., 2013) və burada biz kəmiyyət western blot üçün nümunənin hazırlanması və məlumat təhlilinə diqqət yetirməklə tam western blot iş prosesini ümumiləşdiririk.

1. Giriş

İkiölçülü elektroforez və kütləvi spektrometriya kimi proteomik texnologiyalar molekulyar hadisələrin, siqnal yollarının və mexanizmlərinin daha yaxşı başa düşülməsinə imkan verən geniş ifadə nümunələrinin müəyyən edilməsi üçün yarı kəmiyyətli zülal profilləşdirmə tədqiqatlarında qiymətli alətlərdir [1]. Əldə edilən məlumatlar adətən western blotting kimi ikinci müstəqil üsulla təsdiqlənir. Western blotting Towbin et al tərəfindən təqdim edilmişdir. [2] 1979-cu ildə və o vaxtdan kompleks hüceyrə homogenatlarında spesifik zülalların immunodeteksiyası və kəmiyyətinin təyini üçün qlobal miqyasda tədqiqat laboratoriyalarında istifadə olunan ümumi bir texnikaya çevrilmişdir. Son üç onillikdə müvafiq göstərici sistemlərinin həssaslığı, möhkəmliyi və çevikliyi əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır [3, 4]. Bundan əlavə, aşkarlama mühitinin və reagentlərin davamlı inkişafı elmi ictimaiyyətə eyni ləkədən həm aşağı, həm də yüksək ifadəli zülallardan gələn siqnalların dəqiq və dəqiq ölçülməsinə imkan verən geniş dinamik aşkarlama diapazonu verən ultrahəssas görüntüləmə sistemləri ilə təmin etmişdir. Laboratoriyalar western blotting üçün ən son aşkarlama texnologiyalarını və reagentləri tez bir zamanda satın almasına baxmayaraq, densitometrik məlumatların istehsalı üçün istifadə olunan əlaqəli üsullar təkamül etməyib və şərh etmək və ya çoxaltmaq çətin və ya qeyri-mümkün olan nəşr edilmiş məlumatlara səbəb olub [5-7].

Vestern blotlardan kəmiyyət məlumatı əldə etmək üçün əvvəllər təsvir edildiyi kimi ciddi metodologiyadan istifadə edilməlidir [8]. Qısaca olaraq, antikorların (Ab) yoxlanılması həm Ab/antigen qarşılıqlı təsirinin spesifik və düzgün olmasını təmin etmək, həm də hər bir antikor üçün kəmiyyət xətti dinamik diapazonda zülal yüklənməsi üçün tələb olunan nümunələrin seyreltmə əmsalını müəyyən etmək üçün vacibdir. Bundan əlavə, normallaşdırma metodunun müvafiq seçimi (immunokimyəvi boyanmadan sonra təmizlik zülalları (HKPs) tərəfindən əldə edilən istinad siqnalları və ya ümumi zülal boyanmasından sonra ləkələnmə membranlarında ümumi protein (TP) intensivliyi əsasında) nəzərə alınmalıdır. hədəf zülal istinad siqnalının artefaktı deyil. Beləliklə, verilənlərin normallaşdırılması nümunələr arasında hədəf zülal ifadəsində daha kiçik fərqlərin ölçülməsi ilə istinad qeyri-sabitliyinin getdikcə daha çox əhəmiyyət kəsb etdiyi eksperimental səhvləri müəyyən etmək və düzəltmək üçün çox vacibdir [9]. Zəif normallaşmanın birbaşa təsiri nümunə 10-dan yuxarı yükləndikdə aydın olur μGAPDH, aktin və tubulin kimi ənənəvi yükləyici HKP-lər həddən artıq yükləndiyinə və buna görə də məlumatların normallaşdırılması məqsədinə xidmət etmədiyinə görə hər bir zolaqda g ümumi protein lizat tələb olunur [8, 9]. Həmçinin, bu HKP-lər sınaqdan keçirilmiş nümunələrin biologiyasını əks etdirməyən hədəf protein ifadəsi üçün əyri nəticələr verən təcrübənin müalicə şərtlərindən təsirlənə bilər [10-15]. Alternativ olaraq, ümumi, ləkə ilə ötürülən zülalla normallaşmanın tipik ümumi protein lizatları üçün əla məlumat verdiyi göstərilmişdir [16].

Burada eksperimentlər arasında təkrar istehsal qabiliyyətini artırmaq üçün minimal deqradasiya ilə yaxşı keyfiyyətli zülal nümunələri istehsal etmək üçün bəzi ümumi üsulları təsvir edirik. Həmçinin kəmiyyət western blotlamanın əsas addımları və çoxsaylı ləkələrdən əlaqəli densitometrik məlumatların hesablanmasına standartlaşdırılmış yanaşma ümumiləşdirilmişdir.

2. Diqqətli Eksperimental Dizayn Etibarlı və Təkrarlana bilən Məlumatlar İstehsal edir

Müxtəlif şəraitlərdə adətən sabit olan proqnozlaşdırıla bilən molekul tipini ölçən DNT əsaslı analizlərdən fərqli olaraq, zülallar müxtəlif tampon və eksperimental şəraitdə ifadə, sabitlik, konformasiya və aktivlik baxımından əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənə bilər. Bundan əlavə, homogenatda çirkləndirici zülalların olması hədəf zülalların bütövlüyünə və aktivliyinə böyük təsir göstərə bilər [17]. Buna görə də, hər hansı zülal əsaslı analizin dizaynında diqqətli olmaq lazımdır ki, iş və nəzarət nümunələri arasında görünən fərqlər eksperimental şəraitin və ya nümunənin işlənməsinin artefaktı olmasın. Proteoma böyük təsir göstərə bilən amillərə inkubasiya vaxtı və temperaturu, eləcə də nümunələrin emal parametrləri, məsələn, toxumaların toplanması və sonrakı dondurulması arasındakı vaxt və ya hətta toxuma və ya hüceyrə qranullarının əridilməsi şərtləri və vaxtı kimi parametrlər daxildir (Cədvəl). 1).

Təcrübə proseduruNəzarət qruplarıTəkrar edirTəcrübə şərtləriNümunə ilə işləmə
Xəstəlik və ya müalicə qruplarıVaxt kursu təhsili (yəni,

3. Nümunənin hazırlanması

Nümunə hazırlığı ilə bağlı bir sıra tələlər var ki, bunlar qərb ləkəsi üzərindəki zolaqların sıxlığına birbaşa təsir edə bilər: (1) nümunələr arasında zülalların dəyişkən deqradasiyası və/yaxud ifadəsi ilə nəticələnən toxuma və ya hüceyrə nümunələrinin düzgün işləməməsi, (2) qeyri-kafi yuyucu vasitələr. , duzlar və liziz tamponunda proteaz inhibitorları, (3) zəif homogenləşdirmə texnikası.

Zülal lizatları hüceyrə və ya toxuma zibilləri, yağlar, hidrofobik zülal aqreqatları, nuklein turşuları və proteazlar kimi çirkləndiricilərlə olduqca mürəkkəb olduğundan, qərb ləkələrinin nəticələrinə birbaşa və mənfi təsir göstərə bilər, hüceyrə lizis tamponlarından və homogenləşdirmə üsullarından istifadə etmək vacibdir. təsirlərini aradan qaldırır [17]. Ümumiyyətlə, NP-40 və Triton X-100 kimi qeyri-ion yuyucu vasitələrdən ibarət homojenləşdirmə tamponları SDS və natrium deoksixolat kimi ion yuyucu vasitələrdən daha az sərtdir. NaCl və ya KCl kimi duzlar zülalların yığılmasının qarşısını almaq üçün adətən 100-150 mM konsentrasiyaya əlavə edilir. RIPA tamponu (1% NP-40 və ya Triton X-100, 1% natrium deoksixolat, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM EDTA) və tam mini proteaz inhibitoru kokteylli tabletlər Elm) mexaniki və ya əl ilə homojenləşdirmə alətləri ilə birlikdə western blot analizləri üçün möhkəm məlumatlar verən homogenatların istehsalı üçün istifadə edilmişdir.

Toxumanın homogenləşdirilməsi texnikasının düzgün seçilməsi uğurlu western blot analizi üçün ilkin şərtdir və tətbiq edilən üsul tamamilə nümunə növündən asılıdır (yəni, örtülmüş və ya asılmış hüceyrələrdən fərqli olaraq beyin və əzələ və qaraciyər toxuması) [18, 19]. Toxuma lizis protokolunun yaxşı nümunəsi aşağıdakı kimidir: (1) Toxumanı maye azotda dondurun və sonra quru buz üzərində havan içində neştər ilə 1 mm-lik parçalara kəsin. Prosedur boyu kəsilmiş və ya üyüdülmüş toxumanı quru buzun temperaturuna yaxın saxlamaq üçün neştər və ya dəyirmanın quru buz üzərində də dondurulduğundan əmin olun. (2) Küp doğranmış/yer toxumasını buz kimi soyuq RIPA tamponuna əlavə edin. (3) Doku preparatını buz kimi soyuq Dounce toxuma homojenizatoruna (Wheaton) və Dounce 25x buz üzərində köçürün. (4) Sonicate (Tekmar Sonic Disrupter) üçün buz üzərində Dounce-homogenləşdirilmiş toxuma

saniyə 50% gücdə və ekstraktları 30 dəqiqə 4°C-də 34.000 × g-də sentrifuqa edərək təmizləyin. (5) Supernatantı yeni boruya köçürün və protein analizini aparın (aşağıya bax). (6) Supernatantları -80°C-də və ya uzunmüddətli saxlama üçün maye azotda saxlayın.

Hüceyrə lizisi üçün qranullaşmış hüceyrələri (hüceyrə suspenziyaları vəziyyətində) buz kimi soyuq RIPA tamponuna və ya üzlənmiş hüceyrələr üçün əlavə edin, hüceyrələri yuduqdan sonra buz kimi soyuq RIPA buferini birbaşa boşqaba əlavə edin və hüceyrələri kazıyın və pipetka ilə yuxarı çəkin. və aşağı. Yuxarıdakı addım (3) ilə davam edin.

Hüceyrə və ya toxuma lizatlarından olan homogenatın ümumi zülal konsentrasiyası Bio-Rad-dan RC DC protein analizi kimi yuyucu vasitələrə uyğun zülal analizindən istifadə etməklə ölçülməlidir. İdeal olaraq, homogenatlar ən azı 2 mq/mL konsentrasiyaya qədər seyreltilməlidir ki, bu da 10 arasında yüklənməyə imkan verəcəkdir. μg və 80 μ1 mm qalınlığında mini poliakrilamid SDS-gelin hər zolağına g.

4. Protein yüklənməsinin xətti dinamik diapazonunu təyin edin

Əksər laboratoriyalar adətən 10 arasında olan western blotting üçün gelin hər zolağına təsadüfi miqdarda protein yükləyir. μg və 100 μg ümumi lizatdır və adətən bu miqdarı seçmək üçün heç bir elmi əsas yoxdur. Bu, tez-tez yüksək ifadə edilmiş, hədəf zülalların və xüsusən də məlumatları normallaşdırmaq üçün istifadə edilən yükləmə nəzarətlərinin həddindən artıq yüklənməsi ilə nəticələnir. Bu, bir qayda olaraq, zülalların ardıcıl yüklənməsi ilə deyil, membranın hədəf zülalla həddən artıq yüklənməsi ilə əlaqədar olan ev zülalları üçün zolaqlar arasında vahid bant sıxlığı verir (Şəkil 1). Membran doymasının təsirini azaltmaq üçün hər bir hədəf protein üçün zülal yükünün bant sıxlığına qarşı standart əyrisi yaradılmalıdır. Bu, 100-dən başlayaraq tədqiqat qrupundakı bütün lizatlardan birləşdirilmiş nümunənin 1/2 seyreltmə seriyasını hazırlamaqla həyata keçirilə bilər. μTGX ləkəsiz SDS-geldə (Bio-Rad) ən azı 12 qatılmadan çox protein yükü. ChemiDoc MP (Bio-Rad) kamera sistemində ləkəsiz aşkarlama, homogenatın yüklənməsini, keyfiyyətini və ayrılmasını yoxlamaq üçün istifadə oluna bilər, ardınca Trans Blot Turbo (Bio-Rad) zülalından istifadə edərək aşağı flüoresan PVDF membranına köçürülə bilər. köçürmə sistemi [8].


Etibarlı western blot məlumatları yalnız lazımi miqdarda protein nümunəsi istifadə edildikdə yaradıla bilər. Həddindən artıq zülal yükləmək qərb ləkələrində siqnal doymasına gətirib çıxarır, lakin çox az zəif siqnallar yaradır. Təhlil üçün eksperimental quraşdırma və şərtlər müəyyən edildikdən sonra növbəti təcrübələrdə nümunə yükünü, ötürmə metodunu, ötürmə vaxtını, anticisim qatılaşdırılmasını, antikor inkubasiya vaxtını və ya temperaturu dəyişməyin, çünki bu amillər aşkarlama siqnallarını əhəmiyyətli dərəcədə dəyişə bilər.

Zülal nümunələri üçün müvafiq yüklənmənin müəyyən edilməsi üçün tipik metodologiya aşağıdakılardır: (1) Hər bir inkubasiya arasında ən azı dörd, 3 dəqiqəlik yuyulma addımı ilə hədəf zülal əsas antikorunu və hər bir ləkə ilə əlaqəli ikincili inkubasiya etməklə müvafiq olaraq köçürün və ləkələyin. (2) İmmunokimyəvi siqnalı inkişaf etdirmək və ChemiDoc MP (Bio-Rad) kimi CCD-kamera əsaslı görüntüləyicidən istifadə edərək siqnalı çəkmək üçün Clarity (Bio-Rad) kimi görüntüleyiciyə uyğun, kimilüminesans substratı əlavə edin. (3) Şəkil Laboratoriyası (Bio-Rad) kimi dəqiq, fondan çıxarılan densitometrik alətləri təmin edən proqram təminatından istifadə edərək ləkələri təsvir edin və hər bir əsas antikor üçün nisbi sıxlıq və qat seyreltmə sxemi yaradın. (4) Antikorların xətti dinamik diapazonunu (yəni, sıxlığın ardıcıl, 1/2 azalmasının əldə edildiyi diapazon) müəyyən etməklə onları təsdiq edin. (5) Xətti dinamik diapazonun ortasına uyğun gələn hər bir antikor üçün protein yükünü seçin.

Tədqiqat qrupundakı fərdi nümunələrin hər bir antikor üçün yığılmış nümunənin xətti dinamik diapazonunun orta nöqtəsinə qədər seyreltilməsi fərdi zülal nümunələrinin hər bir antikor üçün geniş şəkildə fərqli seyreltmələr tələb etməsi anlamına gələ bilər. Bu, tədqiqat dəstindəki nümunələr arasında həqiqi biologiyanı əks etdirən dəqiq və təkrarlana bilən nəticələr vermək üçün hər bir hədəf zülal üçün densitometrik məlumatların xətti dinamik (kəmiyyət) diapazonda olmasını təmin edəcək (Şəkil 2). Nümunələrin qeyri-adekvat yüklənməsi, sadəcə membranın həddən artıq yüklənməsi səbəbindən verilmiş hədəf üçün nümunələr arasında heç bir kəmiyyət fərqi ilə nəticələnə bilməz.


(Müəlliflərin və Bio-Radın icazəsi ilə [9]-dan.) Ləkəsiz ümumi zülalın ölçülməsi və 10-50-də üç ev zülalının immunodeteksiyasının xətti müqayisəsi. μg HeLa hüceyrə lizatı. Solda (a), ləkəsiz ləkə və (b) üçün kimyəvi ləkələrin təmsil şəkilləri var. β-aktin (c), β-tubulin və (d), GAPDH. Zolaq etiketləri ümumi protein yükünə uyğundur (μg). Aktin və tubulin siqnalları xətti görünsə də, densitometrik nisbət faktiki yüklənmənin proqnozlaşdırılan “kəmiyyət reaksiyasından” xeyli aşağı idi, ləkəsiz siqnal isə gözlənilən nəticəyə (e) uyğundur.

5. Məlumatların Normallaşdırılması üçün Uyğun İstinad Siqnalını Müəyyən edin

Yaxşı istinad siqnalı və ya “yükləmə nəzarəti” eyni nümunə daxilində hədəf zülal ilə birgə ifadə edilən və nümunələr arasında ardıcıl olaraq ifadə edilən siqnaldır. tubulin kimi HKP, β-aktin və GAPDH ənənəvi olaraq yükləmə nəzarəti kimi xidmət edirdilər, lakin bu cür nəzarətlərdən istifadənin üç potensial çatışmazlıqları var. (1) HKP-lər səhv nəticələr verəcək eksperimental şərtlər arasında vahid şəkildə ifadə edilə bilməz [10-15]. Eyni problem qPCR üçün istifadə edilən istinad genləri ilə də tapıldı, burada qeyri-sabit hədəflərin seçilməsi stabil hədəflərlə ziddiyyət təşkil etdikdə əks nəticələrə gətirib çıxardı [20, 21]. (2) HKP-lər lizatlarda olduqca boldur və adətən təxminən 4-dən çox yüklənmiş nümunələr üçün membranı doyurur. μhər zolağa g (əvvəlki bölməyə baxın) (Şəkil 2). Bu, bu zülallara yaxşı normallaşma nəzarətinin "görünüşünü" verəcəkdir, çünki əlaqəli zolaqların sıxlığı membranın doyma "artifaktı" kimi zolaqlar arasında oxşar olacaqdır. (3) HKP-lərlə verilənlərin normallaşdırılması yalnız bir məlumat nöqtəsinə əsaslanır və mümkün proses uyğunsuzluqlarının zəif əksini təmin edir.

HKP nəzarətləri ilə bağlı yaranan problemləri nəzərə alaraq, elmi ictimaiyyət tərəfindən normallaşdırma üçün alternativ üsullar axtarılıb və biz təklif edirik ki, əla yükləmə nəzarəti (LC) aşağıdakı meyarlara cavab verməlidir. (1) Ayrı-ayrı nümunələrin ümumi protein miqdarındakı dəyişikliklərə yaxşı cavab verir (1: 1). (2) O, müxtəlif fizioloji şərtlərin və müalicələrin təsirinə qarşı həssasdır və buna görə də transfer səmərəliliyinin təsirini nəzərə almaq üçün membranın özündən kəmiyyətcə ölçülməlidir [22, 23]. (3) LC-nin əldə edilməsi ideal olaraq western blot prosesinin bütün mərhələlərində mümkün olardı (yəni, zülalın transferdən əvvəl gel zolaqlarında, posttransfer blot və posttransfer gel zolaqlarında vizuallaşdırılması) beləliklə ardıcıl prosesə nəzarəti təmin edir. (4) LC-nin əldə edilməsi sürətli, asan və yüksək dərəcədə təkrarlanmalıdır. (5) LC-nin optimallaşdırılması və qurulması üçün heç bir uzun proses tələb olunmamalıdır. (6) LC aşkarlama üsulu immunokimyəvi boyanma ilə uyğun olmalıdır.

Bu problemləri həll etmək üçün elmi ictimaiyyət indi məlumatların normallaşdırılması vasitəsi kimi ləkə ilə ötürülən zülaldan ümumi zolaq sıxlığının istifadəsini qəbul edir [24-26]. Ponceau S, Coomassie R-350, Amido Black, MemCode və Dərin Bənövşəyi də daxil olmaqla, ləkədə köçürülmüş zülalın vizuallaşdırılması, təsviri və kəmiyyətini təyin etmək üçün istifadə edilə bilən bir sıra ləkələr var. Bununla belə, bu ləkələrin hər birinin gündəlik olaraq zəif təkrarlana bilməsi, məhdud dinamik diapazonu və ləkələnmə membranları və immunokimyəvi boyanma ilə məhdud uyğunluğu kimi fərdi problemlər var [25]. Bu yaxınlarda Ləkəsiz texnologiya (Bio-Rad) təqdim edilmişdir [24-26] və xətti dinamik diapazonu təxminən 10 ilə 80 arasında olan yaxşı LC üçün yuxarıda qeyd olunan altı meyarın hamısına cavab verir. μtipik bir hüceyrə və ya toxuma lizatından q ümumi protein yükü [8, 9]. Bu, əksər western blot tədqiqatları üçün zolaqlar arasında normallaşma üçün ləkəsiz ləkədən ümumi zolaq sıxlığından istifadə etməyə icazə verir.

Ləkəsiz analiz texnologiyasından istifadə edərək ümumi zolağın normallaşdırılması texnikası yaxşı təsvir edilmişdir, lakin qısaca belədir: (a) Elektroforetik ayırmanın keyfiyyəti bir neçə dəqiqə ərzində yoxlanıla bilər. UV-aktivləşdirildikdən sonra zülal zolaqları geldə görünür və kamera sistemi ilə qeyd oluna bilər. Yaradılan flüoresan siqnal bir neçə saat ərzində sabit qalır. (b) Hər bir zolaqdan zülalın ötürülməsini yoxlamaq üçün ləkə köçürüldükdən dərhal sonra təsvir edilir. (c) Hər zolaqda bütün ləkə ilə ötürülən zülal zolaqlarının ümumi sıxlığından olan şəkil məlumatları, sonra hər bir zolaqda bir zolaq seçərək və zolaq profilindəki bütün həcm zirvələrini əhatə etmək üçün bant genişliyini uzatmaqla Image Lab proqram təminatından istifadə etməklə qeydə alınır. . (d) Arxa fonda yuvarlanan disk, normallaşma üçün hər zolağa düşən bütün zolaqların cəmindən yalnız ümumi fon çıxarılan sıxlığın əldə edilməsini təmin etmək üçün bütün zolaqlar üçün aşağı qiymətə (1 və 5 arasında) uyğunlaşdırılır.

Bundan əlavə, Stain-Free texnologiyası həm nitroselüloz, həm də PVDF membranları ilə uyğun gəlir və SF blot şəkilləri ilə məlumatların normallaşdırılması HKP-lərdən üstün olan bir çox məlumat nöqtələrinə əsaslanır.

6. Məlumatların Təhlili: Fonda Çıxarma Problemi

Fonun çıxarılması western blotlardan dəyişən və ya yanlış məlumat əldə etmək üçün ümumi səbəbdir [27]. Qutulu zolaqlar və fondan həcm təhlili kimi ənənəvi densitometrik analiz üsullarından istifadə edərək, fondan çıxarılan məlumatlarda dəyişikliklər yarana bilər, çünki fon zolağın yerləşdiyi eyni qutudan çıxarılmır. Bundan əlavə, bandın seçildiyi qutuda həmişə həm zolaqdan, həm də aşağı sıxlıqlı zolaqlarla daha çox yayılan əlaqəli fondan sıxlıq var [8]. Bu amillərin birləşməsi yüksək fonlu qeyri-spesifik antikordan istifadə edərək diferensial şəkildə ifadə edilmiş hədəf zülalı ilə nümunələri sınaqdan keçirərkən yüksək dəyişkən məlumatlarla nəticələnə bilər. Qutulardan istifadə edərək həcm təhlilinə yaxşı alternativ, zolaq profili aləti ilə birləşdirilmiş yuvarlanan disk fonunun çıxarılması alqoritmidir (Şəkil 3). Image Lab proqramı hər bir zolaq üçün müvafiq zolaq genişliyi və zolaq fonunun seçilməsini təmin etmək üçün eyni vaxtda istifadə edilə bilən bu alətlərin hər ikisi ilə hazırlanmışdır (Şəkil 3).


(Müəlliflərin və Bio-Radın icazəsi ilə [8]-dən.) Şəkillərin alınması və densitometrik analiz. Image Lab proqram təminatının 5.0 versiyası (Bio-Rad) bu tədqiqatda gellərin, ləkələrin və filmin təsvirin əldə edilməsi və densitometrik analizi üçün istifadə edilmişdir. Proqram təminatı xam məlumatları üç ölçüdə "Zolaqlar və Qruplar" aləti ilə müəyyən edilmiş zolağın uzunluğu və eni ilə "Zolaq Profili" aləti ilə birlikdə şərh edir ki, ləkədən yayılan kimyalüminessent siqnal üçüncü ölçüdə qeydə alınsın. ləkə səthindən çıxan zirvə kimi. Verilmiş zolağın sıxlığı üçölçülü zirvənin altındakı ümumi həcm kimi ölçüldü, kölgəli zirvənin altındakı sahəni nəzərə almaq üçün zolağın dəqiq enini tənzimləmək üçün “Zolaq Profili” alətindən istifadə etməklə iki ölçüdə baxmaq mümkün idi. maraq doğurur. Arxa fonda çıxma "Zirkalar" alətində yuvarlanan disk parametrindən istifadə etməklə təyin edilmişdir. Yuvarlanan diskin dəyərləri elə qurulmuşdur ki, fon verilmiş ləkənin zolaqları arasında vahid şəkildə maraq dairəsinin (yəni, pik) altından çıxarılsın. Bu halda, təhlil edilən iki zolaq üçün yuvarlanan disk müvafiq olaraq 18 və 25-ə təyin edildi ki, maraq zirvələri "X" ilə göstərilən markerlər arasında ardıcıl səviyyədə kəsildi.

7. Densitometrik məlumatların hesablama analizi

Vestern blotlarından kəmiyyət məlumatı əldə etmək üçün çoxsaylı iş vərəqləri və faylları əhatə edən EXCEL cədvəllərində basdırılmış düsturlardan istifadə edərək densitometrik məlumatlardan çoxsaylı hesablamalar var. Hesablamaların əsasını izləmək çox vaxt çətindir və biz gördük ki, laboratoriya üzvləri western blotlardan əldə edilən xam məlumatları dərc edilə bilən nəticələrə qədər necə işlətmək barədə birbaşa sualla qarşılaşdıqda, tez-tez çaşqınlıq olur. western blot məlumatlarının təhlili aşağıdakı addımlarda təsvir olunduğu kimi nisbi, normallaşdırılmış protein ifadəsini hesablamaqla qPCR-ə çox oxşar metodologiyadan istifadə etməklə həyata keçirilə bilər (Cədvəl 2 və 3). (1) Hər bir ləkə üçün, hər bir zolaqda hədəf zülalın (TP) fondan çıxılan sıxlığını (Şəkil Laboratoriya proqramında həcmi) yükləmə nəzarətinin (LC) sıxlığının nisbətinə (istər ev zülalı, ya da ümumi zolaq sıxlığı) vurun. bütün tədqiqat ləkələrinin 1-ci zolağına yüklənmiş nəzarət nümunəsindən geldəki digər zolaqlara keçir. Bu, yükləmə nəzarətinə (NDL) normallaşdırılmış sıxlığı verəcəkdir (Cədvəl 2). Nəzarət nümunəsi, bir qayda olaraq, hər bir tədqiqat ləkəsinin 1-ci zolağına təzə nəzarət nümunəsinin yüklənməsinə icazə vermək üçün bir neçə boruya bölünmüş müəyyən tədqiqatdakı bütün nümunələrdən yığılmış homogenatdır. (2) Hər bir zolağın NDL-ni 1-ci zolağın nəzarət nümunəsindən NDL-ə bölmək yolu ilə hər bioloji/texniki təkrar üçün qat fərqini (FD) hesablayın (Cədvəl 2). (3) Orta FD və əlaqəli müəyyən edin

yuxarıda (2) addımdan FD-ni PRISM və ya Analiz İT kimi statistik analiz proqram paketinə idxal etməklə bioloji təkrarlar üçün dəyərlər (Cədvəl 3).


ZÜLLƏLƏRİN AÇIQLANMASI, KƏMİYYƏTİ VƏ ANALİZİ

One-Step Blue® və One-Step Lumitein™ Protein Gel Ləkələri

Bizim One-Step protein gel ləkələrimiz ucuz, sürətli və istifadəsi asandır. Sadəcə olaraq SDS-PAGE gelinizə fiksasiya etmədən və yuyulmadan ləkə əlavə edin və 5 ilə 60 dəqiqə ərzində ləkələyin. Bu ləkələr daha təhlükəsiz işləmə üçün toksik deyil və pH neytrallaşdırıldıqdan sonra drenajın atılması üçün CCR Title 22 ilə sertifikatlaşdırılıb. One-Step Blue® görünən boyanma və ya yaxın IR floresansı üçün Coomassie®-ni əvəz edir. One-Step™ Lumitein UV qutusu və ya gel skaneri üçün SYPRO® Ruby-ni, One-Step™ Lumitein UV UV transilluminatoru üçün Oriole™-ni əvəz edir.

Bir Addımlı Ləkə Xüsusiyyətləri

  • Tez, sadə boyama
  • Təmir, mikrodalğalı soba və ya yuyulma yoxdur
  • Drenaj üçün sulu əsaslı və toksik olmayan
One-Step Blue®, LI-COR® Odyssey® 800 kanalında (sağda) sürətli və asan görünən boyanma (solda) və ya yaxın infraqırmızı təsvir üçün vaxt aparan Coomassie® boyanmasına alternativdir. Qırmızı floresan One-Step Lumitein™ vaxt aparan və bahalı SYPRO® Ruby protein gel ləkəsinə alternativdir və onu UV qutusu və ya flüoresan gel skanerində təsvir etmək olar. Qırmızı floresan One-Step Lumitein™ UV Protein Gel Ləkəsi UV transilluminatordan istifadə edərək görüntüləmə üçün nəzərdə tutulmuşdur. Oriole™ Gel Ləkəsindən fərqli olaraq, tərkibində təhlükəli həlledicilər yoxdur və gel büzülməsinə səbəb olmur.

Məhsul haqqında məlumat

MəhsulÜçün əvəzKataloq nömrəsiVahid ölçüsüMəhsul protokoluTəhlükəsizlik hesabatı
One-Step Blue®
Coomassie ləkəsi21003-1L1LPI-21003
Bir Addımlı Gel Ləkələri Təhlükəsizliyi Hesabatı
One-Step Lumitein™SYPRO® Ruby Protein Gel Ləkəsi21004-1L1LPI-21004
21004-4L4L
One-Step Lumitein™ UVOriole™ və Flamingo™ Protein Gel Ləkələri21005-1L1LPI-21005
21005-4L4L

Lumitein və onunla əlaqəli texnologiyalar ABŞ və beynəlxalq patentlərlə əhatə olunur. SYPRO Molecular Probes, Inc şirkətinin qeydə alınmış ticarət nişanıdır. Oriole Bio-Rad Laboratories şirkətinin ticarət nişanıdır. Coomassie Imperial Chemical Industries şirkətinin qeydə alınmış ticarət nişanıdır.

VersaBlot™ Total Protein Normalizasiya Dəstləri

VersaBlot™ Total Protein Normalization Kits SDS-PAGE gellərində və western blot membranlarında sadə, həssas və yüksək xətti zülal kəmiyyətini təyin etməyə imkan verir. Dəstlər nümunələri SDS-PAGE-də işə salmazdan əvvəl təmizlənmiş zülalları və ya hüceyrə lizatlarını yaxın infraqırmızı CF® boyalarımızla etiketləməyə imkan verir. Daha sonra zülallar floresan gel skanerindən istifadə edərək gel və ya membranda vizuallaşdırıla bilər ki, bu da bant başına 1 ng qədər az protein aşkar etməyə imkan verir. Arzu edilərsə, skan edildikdən sonra ön ləkə dəyişdirilə bilər, bu da aşağı axının çox rəngli western blot analizini asanlaşdırır. Ləkə geniş dinamik diapazonda ümumi zülalın kəmiyyətinin təyini üçün əla xəttilik nümayiş etdirir və ev zülalının aşkarlanmasına əsaslanan ənənəvi western blot normallaşdırılmasından üstündür.

VersaBlot™ Total Protein Prestain Xüsusiyyətləri

  • Aşağı axın çoxrəngli vestern ləkə analizi üçün geri dönən boya
  • Ev təsərrüfatı zülalları ilə müqayisədə qərb normallaşması üçün üstün xəttilik
  • PAGE gellərində və ya qərb membranlarında yüksək həssas protein miqdarı
  • Zülalların və ya lizatların sürətli və sadə etiketlənməsi, təmizlənmə tələb olunmur
  • 1 ng protein və zülal məzmununda 10% fərq kimi az miqdarda aşkar edin
SDS-PAGE gelində VersaBlot™ ümumi zülal normallaşdırma dəsti ilə etiketlənmiş iribuynuzlu serum albuminin (BSA) jeldaxili flüoresan şəkli. Hər bir zolaq üçün protein tərkibi soldan sağa 10 ug ilə 1 ng arasında dəyişir. Əsas zolaqların üstündəki və altındakı zolaqlar BSA nümunəsindəki çirk zülallarındandır. Artıq boya jelin ən dibinə axır. Daxil: 10, 5 və 1 ng BSA ilə lentləri vizuallaşdırmaq üçün gücləndirilmiş parlaqlığa malik təsvirin bir hissəsi. Vestern blot normallaşdırılması üçün VersaBlot™ ümumi protein normallaşdırma dəstləri. Serial seyreltmədə HeLa hüceyrə lizatında (A) SDS-PAGE-dən əvvəl CF®770T ümumi zülal qoruyucu boyası və PVDF-yə ötürülməsi və ya (B) transferdən sonra siçan anti-tubulin əsas antikoru və CF®770T keçi anti-siçan ikincil antikoru ilə etiketlənmişdir. PVDF üçün. (C) CF®770T etiketli lizat (A-da göstərilmişdir), CF®680T etiketli lizat (membran göstərilmir) və tubulin WB (B-də göstərilmişdir) üçün zülal tərkibinə qarşı zolaq intensivliyi qrafikləri. VersaBlot™ ümumi protein normallaşdırma dəstləri ev zülalının aşkarlanması ilə müqayisədə daha yaxşı xəttilik nümayiş etdirir.

Məhsul haqqında məlumat

MəhsulKataloq nömrəsiÖlçüAbs/EmTəsvir Sistemləri / Aşkarlama kanalları
VersaBlot™ CF®680T Total Protein Normalization Kit
33025-T100 etiket681 / 698 nmAmersham Typhoon™ Trio Cy®5 kanalı
Amersham Typhoon™ 5 IR qısa kanalı
LI-COR® Odyssey® 700 kanalı
33025500 etiket
VersaBlot™ CF®770T Total Protein Normalization Kit33026-T100 etiket764 / 787 nmAmersham Typhoon™ 5 IR uzun kanal
LI-COR® Odyssey® 800 kanalı
33026500 etiket

Typhoon ticarət nişanıdır və Cy boyası GE Healthcare Odyssey şirkətinin qeydə alınmış ticarət nişanıdır və LI-COR Biosciences şirkətinin qeydə alınmış ticarət nişanıdır.

GloMelt™ Protein Termal Sabitlik Təhlili

Protein sabitliyi üçün termal sürüşmə analizi

Protein Thermal Shift™, diferensial skan edən flüorimetriya və ya Thermofluor analizi adlanan termal sürüşmə analizi zülal denatürasiyasının temperaturunu ölçmək üçün sadə bir texnikadır. O, mutasiyalar, liqand bağlaması və tampon formulaları kimi zülalın istilik sabitliyinə təsir edən şərtləri yoxlamaq üçün istifadə edilə bilər. Təhlil sürətlidir və kəmiyyət PCR sistemində aparılır. Termal sürüşmə yüksək məhsuldarlıq skrininqinə uyğundur və dairəvi dikroizm və diferensial skan kalorimetri kimi üsullardan daha az protein tələb edir.

Ekoloji cəhətdən həssas flüoresan boyalar zülalın temperaturdan asılı olaraq açılmasını izləmək üçün istifadə edilə bilər. Zülalın ərimə temperaturu (Tm) zülalın istilik sabitliyinin müxbiridir.

Protein termal sabitliyi üçün GloMelt™ Boya

GloMelt ™ boyası denatürləşdirilmiş zülalların hidrofobik bölgələrinə bağlandıqdan sonra flüoresan gücləndirilməsinə məruz qalır və termal sürüşmə analizində zülalın açılmasını aşkar etmək üçün istifadə edilə bilər. GloMelt™ boyası SYBR® Green kanalında aşkarlanma üçün optimallaşdırılmışdır, ona görə də ümumi qPCR flüoresan kanallarına uyğun olmayan spektrləri olan SYPRO® Orange və PROTEOSTAT® TS boyalarından daha güclü siqnal yaradır. GloMelt™ yaşıl flüoresansa malik olduğundan, o, təkrar təkrar tutarlılığını yaxşılaşdırmaq üçün ROX normallaşdırılması ilə də istifadə edilə bilər.

GloMelt™ geniş çeşiddə ümumi stabilizatorlara və stabilizatorlara dözür və SYPRO® Orange-dan fərqli olaraq, yuyucu vasitələrin mövcudluğunda yaxşı işləyir. SYPRO® Orange və PROTEOSTAT® TS boyaları yüksək hidrofobikdir, ona görə də tamponda seyreltildikdən sonra boyalar dərhal istifadə edilməlidir. Bunun əksinə olaraq, GloMelt™ əla suda həll olunma qabiliyyətinə malikdir, bu da daha rahatlıq və daha az boya sərfi üçün seyreltilmiş boya məhlullarının saxlanmasına imkan verir.

GloMelt™ Xüsusiyyətləri

  • qPCR alətləri və ROX normallaşdırılması üçün optimal yaşıl flüoresan
  • Yüksək yuyucu konsentrasiyalara uyğundur
  • Geniş pH diapazonu, azaldıcı maddələr və ümumi tamponlar/köməkçi maddələrlə uyğundur
  • Yüksək məhsuldarlıq analizləri, aşağı reaksiya həcmləri və aşağı protein konsentrasiyası üçün əladır
  • Sulu tamponlarda yüksək dərəcədə həll olunur və sabitdir
GloMelt™ SYPRO® Orange-dan daha yaxşı yuyucu tolerantlığa malikdir. Yuyucu vasitənin iştirakı ilə IgG ərimə əyrisi qrafikləri. QuantStudio™ 5 qPCR sistemindən istifadə edərək, 5X SYPRO® Orange və ya 1X GloMelt™ boyasının iştirakı ilə 20 ug IgG-də istilik dəyişmə analizi aparıldı. Yuyucu vasitənin olması SYPRO® Orange analizini maneə törətdi, lakin GloMelt™ əyrisinə az təsir etdi. GloMelt™ PROTEOSTAT® TS-dən fərqli olaraq azaldıcı maddələrə dözür. DTT varlığında IgG ərimə əyrisi qrafikləri. QuantStudio™ 5 qPCR sistemindən istifadə edərək, 1X PROTEOSTAT® TS boyası və ya 1X GloMelt™ boyasının iştirakı ilə 25 ug IgG-də istilik dəyişmə analizi aparılmışdır. DTT-nin mövcudluğu PROTEOSTAT® analizinin həssaslığını kəskin şəkildə azaltdı, lakin GloMelt™ boyasına az təsir etdi. Gözlənildiyi kimi, DTT IgG istilik sabitliyini azaldıb. GloMelt™ siqnalının ROX istinad boyasına normallaşdırılması təkrar ardıcıllığını artırmaqla nəticələri yaxşılaşdıra bilər. 1X GloMelt™ boyası və 50 nM ROX iştirakı ilə 20 ug IgG üzərində termal sürüşmə təhlili aparıldı. ROX normallaşdırıldıqdan sonra standart kənarlaşma 5 dəfədən çox azaldı.

Məhsul haqqında məlumat

MəhsulKit məzmunuKataloq nömrəsiÖlçü*
GloMelt™ Dəsti&bull GloMelt™ Boya
&Bull Keçi IgG Nəzarəti
33021-T200 reaksiya
33021-12000 reaksiya
ROX ilə GloMelt™ Kit&bull GloMelt™ Boya
&Bull Keçi IgG Nəzarəti
&bull ROX İstinad Boyası
33022-T200 reaksiya
33022-12000 reaksiya
* Ölçü 20 uL reaksiya həcminə əsaslanır

SYPRO is a registered trademark of Thermo Fisher Scientific Protein Thermal Shift and QuantStudio are trademarks of Thermo Fisher Scientific PROTEOSTAT is a registered trademark of Enzo Life Sciences.

AccuOrange™ Fluorescent Protein Quantitation Assay

AccuOrange™ Protein Quantitation Kit is a highly sensitive fluorescence-based assay for quantitating purified protein or antibody samples in 96-well format. The detection range of the assay is 0.1-15 ug/mL protein. AccuOrange™ is much more sensitive than traditional protein quantitation assays such as BCA, Bradford and Lowry, and is more linearity and reproducible compared to the NanoOrange® protein quantitation assay. The assay shows minimal variability between different proteins, and has stable fluorescence signal for up to 16 hours. The AccuOrange™ assay has low tolerance for detergents, and is not recommended for use with cell lysates.

The AccuOrange™ fluorescent protein quantitation assay is more linear and less variable than the NanoOrange® assay.

TəhlilDetection RangeŞərhlər
AccuOrange™0.1-15 ug/mLFluorescence-based (480/598 nm)
Highly linear
Signal stable for at least 16 hours
Compatible with reducing agents
Not compatible with detergents
NanoOrange®0.1-10 ug/mLFluorescence-based (470/570 nm)
Non-linear
Fluorescence stable for 6 hours
Compatible with reducing agents
Not compatible with detergents
Modified Lowry1-1500 ug/mLAbsorbance-based (750 nm)
Non-linear
Not compatible with reducing agents or detergents
BCA20-2000 ug/mLAbsorbance-based (562 nm)
Highly linear
Signal not stable over time
Not compatible with reducing agents
Compatible with detergents
Bradford (Coomassie®)50-500 ug/mLAbsorbance-based (595 nm)
Signal not stable over time
Non-linear
Compatible with reducing agents
Not compatible with detergents
Pierce® 660 nm50-2000 ug/mLAbsorbance-based (660 nm)
Non-linear
Compatible with reducing agents & detergents
A28050-2000 ug/mLAbsorbance-based (280 nm)
High protein-protein variability
Contaminants and detergents can affect results

Product Information

MəhsulCatalog numberÖlçüXüsusiyyətləri
AccuOrange™ Protein Quantitation Kit30071-T200 assays&bull Highly sensitive: detect 0.1-15 ug/mL protein
&bull Excellent linearity and low variability
&bull Stable fluorescence signal
&bull Compatible with reducing agents and other additivies
&bull For use with purified protein or antibody samples
300711000 assays

NanoOrange is a registered trademark and Pierce is a trademark of Thermo Fisher Scientific Coomassie is a registered trademark of Imperial Chemical Industries.

Conjugates and accessories for western blotting

Near-infrared (near-IR) western detection is highly sensitive, and offers advantages of wider linear range and multiplexing capability compared to chemiluminscence detection (see our webinar to learn more). Biotium’s near-IR CF® dyes are the brightest and most photostable available. Learn more about CF®680 and CF®770 dyes for near-IR western, In Cell Western®, and other applications.

We offer wide selection of primary and secondary antibodies conjugated to our exceptional near-IR CF® dyes for western blot, as well as HRP conjugates for chemiluminescence detection. Also see below for our selection of protein markers, buffers, blocking agents, and more for western blotting.

CF® dye conjugates are brighter than IRDye® conjugates for near-infrared western blotting. A dilution series of HeLa cell lysate (from 2 ug to 0.125 ug) was transferred to PVDF membranes. Mouse anti-tubulin and rabbit anti-COX IV antibodies were detected using CF®680 anti-mouse and CF®770 anti-rabbit, or the corresponding IRDye® conjugates, and scanned on LI-COR® Odyssey®. Band quantitation showed

50% brighter signal with CF® dyes. M: marker.

Peacock™ and Peacock™ Plus Prestained Protein Markers on 10% Bis-Tris MES gels, labeled with apparent molecular weights of the bands.

Prinsip

Western blotting (protein blotting or immunoblotting) is a rapid and sensitive assay for detection and characterization of proteins. It is based on the principle of immunochromatography where proteins are separated into polyacrylamide gel according to their molecular weight.

The protein thus separated are then transferred or electrotransferred onto nitrocellulose membrane and are detected using specific primary antibody and secondary enzyme labeled antibody and substrate.


İstinadlar

Alexander SPH, Roberts RE, Broughton BRS, Sobey CG, George CH, Stanford SC, et al. Goals and practicalities of immunoblotting and immunohistochemistry: a guide for submission to the British. Br J Pharmacol. 2018175:407–11.

Uhlen M, Bandrowski A, Carr S, Edwards A, Ellenberg J, Lundberg E, et al. A proposal for validation of antibodies. Nat Metodları. 201613:823–7.

Vigelso A, Dybboe R, Hansen CN, Dela F, Helge JW, Guadalupe Grau A. GAPDH and beta-actin protein decreases with aging, making stain-free technology a superior loading control in Western blotting of human skeletal muscle. J Appl Physiol. 2015118:386–94.

Greer S, Honeywell R, Geletu M, Arulanandam R, Raptis L. Housekeeping genes expression levels may change with density of cultured cells. J Immunol Methods. 2010355:76–9.

Thacker JS, Yeung DH, Staines WR, Mielke JG. Total protein or high-abundance protein: which offers the best loading control for Western blotting? Anal Biokimya. 2016496:76–8.

Luo S, Wehr NB, Levine RL. Quantitation of protein on gels and blots by infrared fluorescence of coomassie blue and fast green. Anal Biokimya. 2006350:233–8.

Liu X, Fagotto F. A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells. Sci Signal. 20114:pl2.


Təşəkkürlər

The authors thank Dr. Nicole Davis for implementing this laboratory exercise in her biochemistry laboratory course. The authors also thank the Armstrong State University College of Science and Technology for their support through Summer Research Session Grants. This work was further supported by the National Science Foundation's STEP Program under Award No. DUE-0856593. Bu materialda ifadə edilən hər hansı rəy, tapıntı və nəticə və ya tövsiyələr müəlliflərə aiddir və Milli Elm Fondunun fikirlərini əks etdirməməlidir.

Əlavə dəstəkləyici məlumatı bu məqalənin onlayn versiyasında tapa bilərsiniz.

Nəşriyyatçı müəlliflər tərəfindən verilən hər hansı dəstəkləyici məlumatın məzmununa və ya funksionallığına görə məsuliyyət daşımır. İstənilən sorğu (çatışmayan məzmundan başqa) məqalə üçün müvafiq müəllifə ünvanlanmalıdır.


Videoya baxın: Western blot in Arabic شرح بالعربي الويسترن بلوت للكشف عن البروتينات (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Nenos

    Bu mənim fikrimcə aydındır. Google.com saytını axtarmağı məsləhət görürəm

  2. Tojazragore

    xoşuma gəldi

  3. Kagazil

    Wise objects, says)

  4. Malak

    Will you be able to quickly find such a single sentence?

  5. Mabar

    Onunla sonda ona qayğı göstərirsən?

  6. Asante

    Bu - cəfəngiyatdır.



Mesaj yazmaq