Məlumat

İnsan neyronlarında sentriollar həqiqətən yoxdurmu?

İnsan neyronlarında sentriollar həqiqətən yoxdurmu?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kitabçada (məktəbim tərəfindən buraxılmış) iddia edilir,

Əvvəllər neyronlarda olmadığına inanılan sentriollar neyronlarda təsvir edilmişdir və onlarda neyro(mikro) boruların istehsalı və saxlanması ilə əlaqəli ola bilər.

Mən yetkin insan neyronlarının tamamilə olduğu təəssüratında idim məhrum sentriollardan ibarətdir.

Məktəbdə yayılan bir şey olduğundan, sitatlar/istinadlar kimi incəliklərdən məhrumdur. Mən Googling ilə məşğul oldum, lakin bu, kitabçadakı iddianı təsdiqləyən heç nə vermədi.


Q- Son araşdırmalara/məlumata görə. (yetkin) insan neyronları həqiqətən sentriollara malikdirmi?


xahiş etdin "son tədqiqatlar/məlumat"... Maraqlıdır ki, sentriollu yetkin neyronlar 1911-ci ildə Cajal tərəfindən təsvir edilmişdir (girişə ehtiyac yoxdur).

Daha müasir bir mənbə istəyirsinizsə, Jacobson (1978) görə bilərsiniz:

Kirpiklər və sentriol ilə əlaqəli mikrotubullar bütün gənc neyronlarda və bir çoxlarında mövcuddur yetkin neyronlar və glia. Nauta üsulu ilə gümüşlə hopdurulmuş kəsiklərdə neyron kirpikləri və sentriolları işıq mikroskopiyası ilə çox asanlıqla görmək olar (H. A. Dahl, 1963). Sentriollar digər histoloji üsullarla boyanmış neyronlarda işıq mikroskopiyası ilə də göstərilə bilər. (mənimkini vurğulayır)


Mənbələr:

  • CAJAL, S. RAMON Y. (1911). Histologie du système nerveux de l'Homme et des Vertébrés (trans. L. Azoulay, 1952), cild. i. Madrid: Centificas Superior de Investigaciones.
  • Jacobson, M. (1978). İnkişaf neyrobiologiyası. Boston, MA: Springer ABŞ.

Centrioles iki kritik funksiyası olan orqanoidlərdir. Bölünən hüceyrələrdə mikrotubulları nüvələşdirən və hüceyrə bölünməsi zamanı mil qütblərini təşkil edən sentrosomlar adlanan daha böyük orqanoidlər yaratmaq üçün zülallar toplusunu (perisentriolyar material kimi tanınır) toplayırlar (Fu və digərləri, 2015 Şəkil 1A) Bölünməyən hüceyrələrdə sentriollar Hüceyrələrin hüceyrədənkənar mayenin siqnal verməsi, hiss edilməsi və hərəkət etdirilməsi üçün istifadə etdiyi kiçik tük kimi çıxıntılar olan kirpiklərin istehsalında iştirak edirlər (Drummond, 2012).

Sentriollar necə çoxalır C. elegans.

(A) Perisentriolyar materialı toplayıb çoxalda bilən yetkin ana sentriol və onun yetişməmiş qızı sentriolunu ehtiva edən metafaza sentrozomunun sxemi. Ana sentriol tərəfindən toplanan perisentriolyar material mikrotubulları nüvələşdirir və mitotik milin qütbünü təşkil edir. (B) Qız sentriolunun yığılması və yetkinləşməsi mərhələləri, hər bir addım üçün tələb olunan zülallarla birlikdə təsvir edilmişdir. Aşağıdakı sxemlər qızın kəsik görünüşünü göstərir. Montaj, ana sentriole düz bucaq altında bir araba çarxı (boz) meydana gəldikdə başlayır. İkinci mərhələdə, araba çarxının ətrafında doqquz simmetrik şəkildə düzülmüş mikroborucuqdan (boz) ibarət olan xarici divar meydana gəlir. Avar çarxının yığılması (hər bir mikrotubulun qırmızı uzunluğu boyunca uzanan çıxıntılar dəsti) və çoxalma qabiliyyətinin əldə edilməsi SAS-7 tələb edir. (C) Tərkibində vəhşi tipli sentriol cütü olan sperma hüceyrəsi vəhşi tipli yumurta hüceyrəsini (sol sütun), qız sentriolun əmələ gəlməsi üçün vacib komponenti olmayan yumurta hüceyrəsini (orta sütun) və ya bir yumurta hüceyrəsini döllədikdə müşahidə edilən fenotiplər. qız sentriollarının çoxalma qabiliyyəti əldə etməsi üçün tələb olunan komponent (sağ sütun).

Fərdi sentriol, doqquz qat simmetrik stabilləşdirilmiş mikroborucuqları ehtiva edən xarici divarla əhatə olunmuş araba çarxı adlanan mərkəzi mərkəzdən ibarətdir (Şəkil 1B Fu et al., 2015 Gönczy, 2012). Bir hüceyrə doğulduğunda, iki yetkin sentriol ehtiva edir. DNT replikasiyası ilə eyni vaxtda sentriollar da dublikasiyaya başlayır, hər bir sentriol anasının xarici divarına düz bucaq altında formalaşan yeni bir qızın yaranmasına səbəb olur (Şəkil 1B). Metafaza ilə yeni qız sentriolun çarxı və xarici divarı var. Bununla belə, anasına bağlı qalsa da, qız sentriol yetişməmişdir, çünki onun öz perisentriol materialını toplamaq və öz qızını doğurmaq qabiliyyəti yoxdur. Hüceyrə iki qız hüceyrəyə bölündükdə, yeni qız sentriol anasından ayrıldıqda bu qabiliyyətləri əldə edir (Şəkil 1B).

Onurğalılarda və həşəratlarda Cep295/Ana1 adlı xüsusi bir zülal tələb edən sentriol yetişməsi üçün bir yol müəyyən edilmişdir (Fu et al., 2016 Izquierdo et al., 2014 Tsuchiya et al., 2016). Bununla belə, nematodların Cep295/Ana1 homoloqu yoxdur və bu, sentriolların bu orqanizmlərdə necə yetkinləşdiyi sualını doğurur. İndi eLife-da Bruce Bowerman və həmkarları, o cümlədən Oreqon Universitetindən Kenji Sugioka və Ohayo Wesleyan Universitetindən Danielle Hamill birgə ilk müəlliflər kimi - model nematod üzərində təcrübələrin nəticələrini bildirirlər. C. elegans bu suala cavab verməyə başlayırlar (Sugioka et al., 2017). Xüsusilə, onlar müəyyən ediblər C. elegans sentriolların çoxalma qabiliyyəti əldə etməsi üçün tələb olunan SAS-7 adlı zülal.

Əsas sentriolun yığılma yolu kəşf edildi C. elegans çünki yumurta hüceyrələrindən sentriol yığılması üçün lazım olan zülalların tükənməsi xarakterik bir fenotipə gətirib çıxarır (Şəkil 1C). Döllənmə zamanı sperma hüceyrəsi sentriolları olmayan yumurta hüceyrəsinə bir cüt sentriol gətirir. Bu sperma sentriolları dublikat olur ki, mitotik milin hər qütbündəki sentrozomda ana-qız sentriol cütü olsun. Hüceyrə bölünməsinin birinci mərhələsindən sonra iki hüceyrəli embrionun hər bir hüceyrəsi birinci hüceyrə siklindən iki yetkin sentriol, bir ana və yeni yetkin bir qızı miras alır, onların hər ikisi çoxalmaq və sentrosomlar yaratmaq üçün perisentriolyar materialı cəlb etmək qabiliyyətinə malikdir (Şəkil 2). 1C, sol sütun). Bunun əksinə olaraq, yumurtada qız sentriolunun əmələ gəlməsi üçün lazım olan zülal olmadıqda, vəhşi tipli sperma hələ də bir cüt sentriol gətirir, lakin yeni qız sentriollar ilk hüceyrə sikli zamanı əmələ gəlmir, buna görə də iki hüceyrənin hər bir hüceyrəsi hüceyrə embrionu normal cüt sentrioldan daha çox tək yetkin sentriol miras alır. Nəticə etibarilə, hər iki hüceyrə normal iki yox, yalnız bir qütbü olan milləri yığır (Şəkil 1C, orta sütun).

Ekranlar daxil C. elegans ikihüceyrəli mərhələli embrionlarda inhibisyonu monopolyar millərə gətirib çıxaran dörd zülal müəyyən etdi ki, bu da onların qız sentriolların formalaşması üçün vacib olduğunu göstərir (Şəkil 1B): sentriol birləşməsini başlatan Plk4 və ya ZYG-1 adlı kinaz (O'Connell et al. ., 2001) araba çarxını yaratmaq üçün tələb olunan SAS-5 və SAS-6 (Dammermann et al., 2004 Delattre et al., 2004 Leidel et al., 2005) və struktur komponenti olan SAS-4 sentriolun xarici divarı (Kirkham et al., 2003 Leidel və Gönczy, 2003). Beşinci əsas komponent olan SPD-2 iki funksiyaya malikdir: sentriolların sentrosomlar yaratmaq üçün perisentriolyar materialı cəlb etməsi və həmçinin qız sentriolun formalaşması üçün tələb olunur (Kemp et al., 2004 Pelletier et al., 2004). SPD-2 montaj yolunda ən yuxarı axın komponentidir, çünki o, qız sentriol əmələ gəlməsinə başlamaq üçün Plk4 kinazını ana sentriolaya cəlb edir (Delattre et al., 2006 Pelletier et al., 2006). Bu zülalların hamısı onurğalılarda qorunub saxlanılır və onların sentriol birləşməsindəki rollarını başa düşmək üçün geniş şəkildə öyrənilir.

Sugioka və başqaları. sentriolları öyrənin C. elegans SAS-7-ni kodlayan gendə mutasiya olan embrionlar. Yumurta hüceyrələrində sentriol yığılması üçün vacib olan zülalların çıxarılması iki hüceyrəli embrionlarda monopolyar millərə səbəb olduğu halda, monopolyar millər dörd hüceyrəli mərhələyə qədər müşahidə edilməmişdir. sas-7 yabanı tipli sperma ilə mayalanmış mutant embrionlar. Bu yeni fenotip qız sentriolların ilk hüceyrə dövrü ərzində formalaşa bildiyi üçün yaranır. Birinci bölünmə tamamlandıqda yeni qız sentriolları analarından ayrılır və sentrosomlar yaratmaq üçün perisentriolyar material toplayır. Beləliklə, ikihüceyrəli embrionun hər iki hüceyrəsi normal bipolyar millərə malikdir. Lakin ilk hüceyrə dövrəsində əmələ gələn yeni sentriolların çoxalma qabiliyyəti yoxdur və qız övladları əmələ gətirə bilmir. Nəticə etibarilə, dördhüceyrəli embrionda sperma sentriollarını miras alan iki hüceyrə və onların qızları normal bipolyar millər yığırlar, halbuki embrionda ilk hüceyrə sikli zamanı yığılmış sentriolları miras alan iki hüceyrədə monopolyar millər var (Şəkil 1C, sağda). sütun). Digər zülalların inhibəsinin oxşar fenotipə səbəb olub-olmadığını qiymətləndirmək üçün daha çox araşdırmaya ehtiyac var (bu, onların çoxalma qabiliyyətini əldə edən qız sentriollarında rolu olduğunu göstərir), bu da qız sentriollarının çoxalma qabiliyyətini əldə etməsində rolu göstərir. , çünki sentriol birləşmə yolunun əksəriyyətini təyin edən genom geniş RNTi ekranı yalnız bir və iki hüceyrəli embrionları izləyirdi (Sönnichsen et al., 2005).

Sugioka və başqaları. vəhşi tipli və mutant embrionlardan sentriolları vizuallaşdırmaq üçün ötürücü elektron mikroskopundan da istifadə etmişdir. Onlar aşkar etmişlər ki, vəhşi tipli sentriollarda toplanmış sentriollarda olmayan “avarlı təkər” quruluşu var. sas-7 mutant (Şəkil 1B). Onların nəticələri göstərir ki, bu strukturun formalaşması üçün SAS-7 lazımdır.

Sugioka və başqaları. daha sonra SAS-7-nin sentriollara lokallaşdırıldığını və SPD-2-dən asılı olmayaraq onlara cəlb olunduğunu göstərir. SAS-7, mutant zülalda olmayan kiçik bir C-terminal bölgəsi vasitəsilə SPD-2 ilə qarşılıqlı əlaqə qurur və SPD-2-nin interfaza zamanı, qız sentriollar meydana gəldiyi zaman sentriollara cəlb edilməsi, ciddi şəkildə pozulur. sas-7 mutant. Maraqlıdır ki, SPD-2-ni də tələb edən mitozda perisentriolyar materialın yığılması nisbətən normaldır və bu, iki hüceyrədə normal millərin əmələ gəlməsini izah edir. sas-7 mutant embrionlar (Şəkil 1C).

Kollektiv olaraq, Sugioka et al. göstərir ki, qız sentriolların yetişməsi iki hadisəni əhatə edir: (1) avarçəkmə çarxının əldə edilməsi və interfaza zamanı SPD-2-ni cəlb etmək bacarığı, bu da sentriola çoxalma qabiliyyətini verir (2) SPD-2-ni işə götürmə qabiliyyətinin əldə edilməsi və mil qütbünü təşkil edə bilən sentrosom meydana gətirmək üçün mitoz zamanı perisentriolyar material toplayır. SAS-7 birinci hadisə üçün vacibdir, lakin ikinci deyil, buna görə də SAS-7 genindəki mutasiyalar mil dirəyinin meydana gəlməsinə mane olmadan sentriolların dublikasiya qabiliyyətinə təsir göstərir.

SAS-7 onurğalılarda Cep295-in funksional analoqu kimi görünür. SAS-7 kimi, Cep295 də SPD-2 homoloqu Cep192-ni C-terminalı ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqə yolu ilə yetkinləşmə zamanı qız sentriollara cəlb edir (Tsuchiya və digərləri, 2016). Baxmayaraq ki, Sugioka və b. Cep295 ilə heç bir ardıcıllıq homologiyası barədə məlumat vermirlər, onlar SAS-7 arasında məhdud homologiya haqqında məlumat verirlər. Drosophila Cibby adlı zülal və Cby2 adlı insan zülalı. Cibby və Cby2 (Cby1) paraloqu, kirpiklərin istehsalında mərkəzi rolu olan bir proses olan sentrioldan bazal bədənə çevrilmə prosesində iştirak edir (Enjolras et al., 2012 Lee et al., 2014). Bu oxşarlıq qız sentriolların yetkinləşməsi və sentriolların kirpiklərin əmələ gəlməsində iştirakının oxşar mexaniki əsaslara malik ola biləcəyi ehtimalını artırır.


Sentriollar nədir?

Hüceyrə çoxlu müxtəlif orqanoidlərdən ibarətdir. Bu anlayışları daha yaxşı başa düşmək üçün hüceyrəni insan bədəni, orqanoidləri isə orqanlar kimi nəzərdən keçirək. İçimizdəki hər bir orqan kimi, hüceyrələrdə olan orqanoidlərin də hər birinin özünəməxsus funksiyaları və xüsusiyyətləri vardır. Bu mikro bölmələr yüksək ixtisaslaşmışdır və onların strukturu bilavasitə onların yerinə yetirdiyi vəzifələrə uyğundur.

Centrioles (Foto Kredit: Aldona Griskeviciene/Shutterstock)

Sentriollar eukaryotik heyvan hüceyrəsində mövcud olan çoxlu orqanoidlərdən biridir. Onlar silindrik formadadırlar və bütün səthində silsilələr mövcuddur. Onlar əsasən tubulin adlı qlobulyar zülaldan ibarətdir və iki əsas komponentdən və mdash&alfa- və &beta-tubulinlərdən ibarətdir.

Bu iki növ zülal bir-birinin ətrafında yığılır və əmələ gəlmək üçün müəyyən bir şəkildə polimerləşir mikrotubullar, əsasən sentriolları təşkil edir. Mikrotubullar, adlarından da göründüyü kimi, birləşərək sentriollar əmələ gətirən kiçik borulardır. Hər sentriolda cəmi doqquz cüt mikrotubul var və hər bir hüceyrə orqanoidində olduğu kimi, sentriolların quruluşu da onun funksiyası ilə sıx bağlıdır. Qısa müddətdə bu barədə daha ətraflı danışacağıq.

Hər hüceyrənin bölünməsi başlamazdan əvvəl iki sentriol var. Bunlar həmişə bir-birinə düz bucaq altında yerləşdirilir. Hüceyrə bölündükdən sonra hər bir sentriol yeni hüceyrələrdən birinin içindəki boşluğu tutur və daha sonra yenidən bir cüt meydana gətirmək üçün bölünür.

Bu dövr orqanizmin bütün həyatı boyu davam edir. Centrioles sentrosomlar adlanan daha böyük bir orqanoidin bir hissəsi hesab olunur. Sentrosom əsas mikrotübül təşkil edən mərkəzdir və hüceyrə bölünməsi dövrünü tənzimləyir.


Giriş

Neyron polaritesi gələcək aksonun formalaşmasından başlayaraq bir sıra yüksək koordinasiyalı proseslərlə müəyyən edilir. Neyronun çoxsaylı qütbləşməmiş neyritlərindən biri olan akson formalaşmasının ilk pilləsi olan akson spesifikasiyası zamanı geniş artım nümayiş etdirilir. Aksonal artım kritik olaraq yerli sitoskeletin yenidən təşkili və böyümə konusunun dinamikasına əsaslanır (Dotti və başqaları, 1988 Witte və başqaları, 2008). Sonra, yeni inkişaf etdirilən akson yetkinləşdikcə əhəmiyyətli dərəcədə yenidən qurulur və bununla da funksiyası üçün tələb olunan aksona xas əlamətləri qəbul edir. Yetkin aksonların vacib komponenti akson başlanğıc seqmentidir (AIS), xüsusi zülalların (məsələn, AnkG skafoldları, mikrotubula təşkil edən Trim46 zülalı və gərginliyə bağlı natrium və kalium kanalları) toplaşdığı aksonun əsasında xüsusi bölmədir. yüksək mütəşəkkil şəkildə (Leterrier, 2018 Freal və başqaları, 2019). AIS neyron polaritesini qorumaq və fəaliyyət potensialını (AP) yaratmaq üçün çox vacibdir. AP-lərin xarakterik formalaşdırılması və sonrakı yayılması AIS-də (Kole) gərginliyə bağlı kanalların lokal qruplaşdırılması ilə asanlaşdırılır. və başqaları, 2008). Yetkin aksonların digər xüsusilə vacib cəhəti onların unikal mikrotubul quruluşudur. Böyüyən aksonlarda mikrotubul şəbəkəsi geniş şəkildə yenidən qurulur, çünki o, qarışıq mikrotubul polaritesindən vahid üstəgəl mikrotubul təşkilatına keçir (Yau). və başqaları, 2016). AIS-ə yönəlmiş Trim46 zülalları proksimal aksonlarda paralel mikrotubul dəstələri meydana gətirərək bu aksonal mikrotubulların yenidən qurulmasının tənzimləyicisi kimi çıxış edir (van Beuningen). və başqaları, 2015). Bunun əksinə olaraq, dendritlər qarışıq polaritelərin mikrotubul təşkilatını ehtiva edir və inkişaf zamanı əlavə mənfi uçlu mikrotubullar əldə edirlər. Aksonlar və dendritlər arasında mikrotubüllərin təşkilindəki bu görkəmli fərq neyronların inkişafı və funksiyası üçün vacibdir, çünki o, qütbləşmiş yük daşımalarına və xarakterik neyron morfologiyasına kömək edir (Baas). və başqaları, 1988 Yau və başqaları, 2016). Bununla belə, böyüyən aksonlarda mikrotubulun yenidən qurulması aksonun spesifikasiyası və inkişafı üçün vacib olsa da, bu mikrotubula sitoskeletal yenidən qurulmasını idarə edən mexanizmlər əsasən həll edilməmiş qalır.

Əksər heyvan hüceyrələrində əsas mikrotubula təşkil edən mərkəz (MTOC) olan sentrozomlar qütbləşməmiş neyronlarda mikrotubul şəbəkəsini təşkil etmək üçün vacibdir (Tsai & Gleeson, 2005 Stiess). və başqaları, 2010 Meka və başqaları, 2020). Bu kiçik, membransız və mərkəzi lokallaşdırılmış orqanellər perisentriolyar material (PCM) ilə əhatə olunmuş iki sentrioldan ibarətdir (Moritz). və başqaları, 2000). Mikrotubulların əksəriyyəti adətən PCM-ə (Moritz) daxil edilmiş γ-tubulin Halqa Komplekslərindən (γTuRCs) nüvələşir. və başqaları, 2000). Neyron inkişafı zamanı sentrosomlar tədricən MTOC funksiyasını itirir, qütbləşmiş hüceyrələrdə əsas siqnal mərkəzləri olan kirpiklər əmələ gəlir (Stiess). və başqaları, 2010 Ishikawa & Marshall, 2011). Dissosiasiya olunmuş gəmirici neyronlarda bu prosesin akson inkişafı zamanı baş verdiyi bildirilir, lakin akson spesifikasiyası ilə sentrozomların azalan MTOC funksiyası arasında dəqiq müvəqqəti əlaqə aydın deyil (Stiess). və başqaları, 2010). Erkən nörogelişimdə sentrozom funksiyasının əhəmiyyəti mikrosefaliya və digər neyroinkişaf pozğunluqlarına səbəb olan sentrosomal zülallarda müəyyən edilmiş mutasiyaların sayının artması ilə göstərilir (Nano & Basto, 2017). Bununla birlikdə, erkən akson inkişafının müxtəlif prosesləri üçün sentrosomların MTOC kimi dəqiq funksiyası hələ də müzakirə olunur.

Akson spesifikasiyası zamanı sentrosomların rolunu başa düşməkdə irəliləyiş bir sıra texniki problemlərə görə əngəllənmişdir. Xüsusilə, sentrosomların müxtəlif növlərdə neyroinkişafda fərqli funksiyalar nümayiş etdirdiyi və nəticədə ziddiyyətli tapıntılar olduğu aşkar edilmişdir. Bu, əsasən, sentrozom disfunksiyasının səbəb olduğu insan nöro-inkişaf pozğunluqlarının zəif rekapitulyasiyası ilə təsvir olunur. Drosophila və siçanlar, halbuki ferretlər bu xəstəlikləri möhkəm şəkildə modelləşdirir (Basto və başqaları, 2006 Castellanos və başqaları, 2008 Pulver və başqaları, 2010 Johnson və başqaları, 2018). Aksonun böyüməsi sentrosomlardan da fərqli şəkildə təsirlənə bilər, çünki bu proses siçanlarda və zebra balığının periferik aksonlarında sentrozom disfunksiyası ilə pozulur, lakin dissosiasiya olunmuş gəmirici neyronlarda və zebra balığının mərkəzi aksonlarında deyil (de Anda) və başqaları, 2010 Stiess və başqaları, 2010 Andersen & Halloran, 2012). Müşahidə olunan növlərə xas fərqlərin altında yatan molekulyar mexanizmlər böyük ölçüdə naməlum olaraq qalır. Digər texniki problem, qütbləşdikdən sonra repolarizasiyaya məruz qaldıqları üçün klassik olaraq akson inkişaf proseslərini öyrənmək üçün istifadə olunan mədəniyyətdə dissosiasiya edilmiş gəmirici neyronlar tərəfindən təqdim olunur. in vivo daha çox de novo polarizasiya (Barnes & Polleux, 2009). Birlikdə bu, sentrosomların rolunun öyrənilməsinin vacibliyini vurğulayır de novo insan neyronlarından istifadə edərək qütbləşmə. İnsan tərəfindən törədilən pluripotent kök hüceyrələrin (iPSCs) inkişafı indi qütbləşməmiş insan neyron kök hüceyrəsinin qütbləşmiş insan neyronuna (Lancaster) keçidini idarə edən molekulyar mexanizmləri öyrənməyə imkan verir. və başqaları, 2013). İnsan neyronlarının əlavə mühüm xüsusiyyəti onların əhəmiyyətli uzunmüddətli inkişafıdır ki, bu da neyron polaritesinin altında yatan müvəqqəti proseslərin daha ətraflı araşdırılmasına imkan verir (Otani). və başqaları, 2016 Linaro və başqaları, 2019). Bunu göstərmək üçün, neyrogenez sonra baş verir

Gəmiricilərdə 1 həftə, bu isə təxminən davam edir

İnsanlarda 3 ay, hər ikisi in vivoin vitro (Şi və başqaları, 2012 Espuny-Camacho və başqaları, 2013 Otani və başqaları, 2016 Sousa və başqaları, 2017). İnsan iPSC-dən qaynaqlanan neyronların bu dərin yavaş inkişafı, son vaxtlar insan neyronlarında (Espuny-Camacho) əlavə akson inkişaf mərhələsinin müəyyən edilməsinə səbəb olan aksonal prosesləri öyrənmək üçün müvəqqəti rezolyusiyanı artırır. və başqaları, 2013 Lindhout və başqaları, 2020 Otani və başqaları, 2016 Linaro, 2019 №9). Ümumilikdə, bu, model sistem kimi insan iPSC-dən əldə edilən neyronlarda akson inkişafı zamanı sentrozom funksiyalarının öyrənilməsinin aktuallığını vurğulayır.

Bu işdə, insan iPSC-dən əldə edilən neyron mədəniyyətlərini canlı hüceyrə təsviri, elektrofiziologiya və kütləvi spektrometriya analizi ilə birləşdirərək, erkən akson inkişafı zamanı sentrosomların rolunu araşdırmaq üçün multidisiplinar yanaşmadan istifadə etdik. Biz aşkar etdik ki, sentrosomlar akson spesifikasiyası zamanı qeyri-insan neyronlarına bənzər mikrotubula təşkil edən funksiyaları nümayiş etdirir və bu funksiya aksonun sonrakı inkişafı zamanı tədricən itirilir. Xüsusilə insan neyronlarında Trim46 lokalizasiyası neyron inkişafı zamanı perisentriolyar bölgədən AİS-ə keçir və sentrosomal mikrotübüllərin təşkili funksiyalarının inkişafının azalması ilə üst-üstə düşür. Centriole tükənmiş neyron kök hüceyrələrinin (NSC) differensasiyası insan neyronlarında müxtəlif aksonal inkişaf qüsurları ilə nəticələnir, o cümlədən yetişməmiş fəaliyyət potensialının işə salınması, Trim46 zülallarının yanlış lokalizasiyası, böyümə konusunun pozulması və pozulmuş aksonal mikrotübüllərin yenidən qurulması. Birlikdə, bu məlumatlar sentrozomların insan iPSC-dən əldə edilən neyronlarda akson spesifikasiyası zamanı mikrotubulun yenidən qurulmasına vasitəçilik etdiyini göstərir ki, bu da sonrakı inkişaf zamanı düzgün akson formalaşması üçün zəruridir.


Nəticələr

Sentrosomlar akson spesifikasiyası zamanı mikrotubula təşkil edən funksiyaları nümayiş etdirirlər

Sentrosom erkən neyroinkişaf zamanı mikrotubulun nüvələşməsi və lövbər salması üçün əsas yerdir və neyronlar yetkinləşdikcə bu funksiya tədricən azalır (Şəkil 1A) (Stiess) və başqaları, 2010). İnsan neyronlarında erkən akson inkişafı zamanı sentrosomların rolunu başa düşmək üçün insan iPSC-dən əldə edilən neyronlarda sentrosomların bu inkişaf prosesi zamanı mikrotubula təşkil edən funksiyaları göstərib-göstərmədiyini araşdırmaq üçün yola çıxdıq. Bunu həll etmək üçün müxtəlif inkişaf mərhələlərində əsas mikrotubul nüvəli zülal olan yerli γ-tubulinin endogen səviyyələrini ölçməklə inkişaf zamanı sentrosomların mikrotubul nüvələşmə qabiliyyətini sınaqdan keçirdik. Neyroinkişaf mərhələləri aşağıdakı kimi müəyyən edilmişdir: 1-ci mərhələ (0-cu gün) Ki67-müsbət NSC-lər kimi mərhələ 2 (7-ci gün) Trim46-mənfi prosesləri ilə differensasiya olunmuş qütbləşməmiş MAP2-müsbət neyronlar kimi mərhələ 3 (12-ci gün) diferensiallaşmış MAP2-müsbət neyronlar kimi Trim46-müsbət aksonla (Şəkil 1B). Centriole marker Centrin ilə sentrosomları müəyyən etdik və Centrin ilə birgə lokalizasiya edən γ-tubulinin intensivlik səviyyələrini ölçdük (Şəkil 1B). Sentrosomlarda γ-tubulin səviyyələri 1-ci və 2-ci mərhələ neyronlarında davamlı olaraq yüksək idi və nəzərəçarpacaq dərəcədə azaldı.

3-cü mərhələdə neyronlarda 50%, dissosiasiya olunmuş siçovul neyronlarında əvvəlki tapıntılara uyğun olaraq (Şəkil 1B və C) (Stiess) və başqaları, 2010). Bu nəticələri yoxlamaq üçün biz daha sonra sıx neyron mikrotubul şəbəkəsini həll etmək üçün yüksək ayırdetmə qabiliyyətinə malik 3D STED görüntüləmə apardıq və ilkin neyroinkişaf zamanı mikrotubul şəbəkəsinin radial təşkilatdan daha qeyri-radial təşkilata çevrildiyini müşahidə etdik (Şəkil 1D). Bu keçid sentrosomların mikrotubula təşkil edən funksiyalarının azalmasına işarə edir və akson inkişafının başlanğıcı ilə əlaqələndirilir. Birlikdə, bu nəticələr sentrosomların insan iPSC-dən əldə edilən neyronların, akson spesifikasiyası prosesini əhatə edən erkən inkişaf mərhələlərində mikrotubul təşkil edən funksiyaları nümayiş etdirdiyini göstərir, lakin sonrakı mərhələlərdə deyil.

Şəkil 1. Sentrosomlar akson spesifikasiyası zamanı MTOC funksiyasını və Trim46 görünüşünü göstərir

  • A. İnsan iPSC-dən əldə edilən NSC-lərdə/neyronlarda 1, 2 və 3-cü neyroinkişaf mərhələlərində sentrosomal MTOC funksiyasının sxematik təsviri.
  • B. Mərhələ 1 (gün 0), mərhələ 2 (gün 7) və mərhələ 3 (gün 12) γ-tubulin və Centrin üçün immuno-boyanmış insan iPSC-dən alınmış NSCs/neyronların tipik nümunələri, oxlarla işarələnmişdir. Hüceyrələrin neyron mərhələlərini müəyyən etmək üçün Ki67 və DAPI (0-cu gün) və ya Trim46 və MAP2 (7 və 12-ci gün) ilə birgə immunolənglənmişdir. Ox başları AIS-i qeyd edir. Ölçək çubuğu = ümumi baxışda 10 µm, böyütmədə 2 µm.
  • C. Mərhələ 1, 2 və 3-cü insan iPSC törəmə neyronlarında sentrozomlarda normallaşdırılmış γ-tubulin flüoresan intensivliklərinin kəmiyyət göstəriciləri. n İki müstəqil təcrübədə = 46-51 hüceyrə.
  • D. 1-ci mərhələdə (0-cu gün), 2-ci mərhələdə (7-ci gün) və mərhələ 3-də (13-cü gün) hiPSC-dən qaynaqlanan neyronlarda α-tubulinin 3D STED görüntüsü. Ölçək çubuğu = ümumi baxışda 5 µm, böyütmədə 1 µm.
  • E. Trim46, γ-tubulin və Centrin üçün immunolənglənmiş insan iPSC-dən alınan NSC-lər (gün 0). Böyütmə sentrozom quruluşunu təmsil edir. Ölçək çubuğu = ümumi baxışda 5 µm, böyütmədə 2 µm.
  • F. Trim46 və Centrin immun boyamasının STED görüntüləməsi və γ-tubulin immun boyamasının konfokal görüntüləməsi ilə insan iPSC-dən əldə edilən NSC-lərin sentrozomlarının tipik nümunələri (gün 0). Ölçək çubuğu = 1 µm.
  • G. Trim46 və MAP2 üçün immuno-lənglənmiş insan iPSC-dən alınmış neyronların 2-ci mərhələ və 3-cü mərhələnin tipik nümunələri. Əlavələr sentrosomları təmsil edir. Sağdakı böyütmələr müvafiq olaraq 2-ci və ya 3-cü mərhələ neyronlarında qütbləşməmiş neyrit və ya inkişaf etməkdə olan aksonu təmsil edir. Ölçək çubuğu = ümumi baxışda 20 µm, əlavədə 1 µm, böyütmədə 10 µm.

Məlumat məlumatı: Məlumatlar orta ± SEM-i təmsil edir. Birtərəfli ANOVA daxil olmaqla post hoc Bonferroni korreksiyası ilə analiz (C). ***P < 0,001, ns P ≥ 0.05.

Erkən mərhələdə insan neyronlarında AIS protein Trim46-nın sentrozomla əlaqəli lokalizasiyası

Akson inkişafının mühüm əlaməti, dissosiasiya olunmuş siçovulların hipokampal neyronlarında sentrosomların mikrotubul təşkil edən funksiyasının inkişafının azalmasından sonra baş verən proksimal aksonda AİS-in yığılmasıdır (Stiess). və başqaları, 2010). İnsan neyronlarında, Trim46-nın hiPSC-dən əldə edilən NSC-lərdə sentrozom markerləri Centrin və γ-tubulin ilə birgə lokalizasiyası ilə göstərildiyi kimi, AIS zülalı Trim46-nın erkən neyroinkişaf zamanı (mərhələ 1-2) sentrozomlarda lokallaşdırıldığını müşahidə etdik (Şəkil 1E). ). Eynilə, Trim46-nın sentrozomla əlaqəli lokalizasiyası insan HeLa hüceyrələrində müşahidə edildi, lakin dissosiasiya olunmuş siçovulların hipokampal neyronlarında və ya siçan IMCD3 hüceyrələrində müşahidə olunmadı (Şəkil EV1A). Trim46-nın sentrozomlarda insana xas zənginləşməsi, insan iPSC-dən əldə edilən neyronlarda sentrosomlarda Trim46 aşkar edən, lakin ilkin siçovul neyronlarında olmayan iki əlavə antikor tərəfindən təsdiqlənir (Şəkil EV1B). Əvvəlki tədqiqatlar Trim46-nın mikrotubula bağlayan bir zülal olduğunu göstərdi, lakin sentrosom zülalları və ya strukturları ilə mümkün əlaqə bildirilməyib (van Beuningen). və başqaları, 2015). Hansı sentrozom alt quruluşunun centrosomal Trim46 strukturları ilə üst-üstə düşdüyünü müəyyən etməyə çalışdıq. Konfokal mikroskopiya ilə aparılan lokalizasiya təcrübələri göstərdi ki, Trim46 oval quruluş kimi görünür və yalnız qismən müvafiq olaraq Centrin və γ-tubulin ilə işarələnmiş sentriolyar və perisentriolyar strukturlarla üst-üstə düşür (Şəkil 1E). Daha dərin struktur anlayışlar əldə etmək üçün biz STED mikroskopiyası ilə sentrosomal Trim46 strukturlarını həll etdik və Trim46-nın ətrafı əhatə edən, lakin γ-tubulin strukturları ilə üst-üstə düşməyən nöqtə buludları kimi göründüyünü müşahidə etdik (Şəkil 1F). Bütün hüceyrələrdə γ-tubulini əhatə edən Trim46 nöqtələrinin ardıcıl düzülməsini müşahidə etdik ki, bu da öz növbəsində sentriolyar nüvəni təmsil edən Centrin punctae ilə əhatə olunub. γ-tubulin strukturları perisentriolyar materialın xarici təbəqəsini, eləcə də mikrotubulların mənfi sonlu nüvələşmə yerlərini qeyd edir ki, bu da Trim46-nın sentrosomal mikrotubulların (Mennella) başlanğıc nöqtələrinin yaxınlığında yerləşdiyini göstərir. və başqaları, 2012). Birlikdə bu məlumatlar göstərir ki, xüsusilə insan hüceyrələrində Trim46 sentrozomla əlaqəli strukturlara lokallaşdırılır.

Şəkil EV1. Trim46 lokalizasiyası müvafiq olaraq insan neyronlarında və glia hüceyrələrində sentrozomlardan aksonal və periferik mikrotubullara keçir.

  • A. İnsan iPSC-dən əldə edilən NSC-lərin (0-cu gün), HeLa hüceyrələrinin, ilkin dissosiasiya olunmuş siçovul neyronlarının (0-cu gün) və Trim46 və Centrin üçün immunolənglənmiş siçan IMCD3 hüceyrələrinin səciyyəvi nümunələri və göstərildiyi təqdirdə nestin və ya α-tubulin ilə birgə immunolənglənmişdir. Əlavələr sentrosomları təmsil edir. Ölçək çubuğu = ümumi baxışda 10 µm, əlavələrdə 2 µm.
  • B. hiPSC törəmə neyronlarda (7-ci gün) və ilkin siçovul neyronlarında (7-ci gün) Trim46 antikorlarının SySy337003 (#03) və SySy337005 (#05) tipik nümunələri. Əlavələr sentrosomları təmsil edir. Ölçək çubuğu = ümumi baxışda 20 µm, əlavələrdə 1 µm.
  • C. Trim46, Centrin və α-tubulin üçün immunolənglənmiş insan iPSC-dən əldə edilən glia hüceyrələrinin (17-ci gün) müxtəlif yetişmə mərhələlərinin tipik nümunələri. Zoomlar sentrosomları təmsil edir. Ölçək çubuğu = ümumi baxışda 20 µm, böyütmələrdə 1 µm.

Trim46 lokalizasiyası inkişaf zamanı sentrozomlardan aksonal mikrotubullara keçir

İnsan neyronlarında zamanla Trim46-nın lokalizasiyasının öyrənilməsi, inkişaf zamanı aksonal Trim46 səviyyələrinin intensivliyi artarkən, perisentriolyar bölgədə Trim46 boyanmasının aydın şəkildə azaldığını aşkar etdi. Daha dəqiq desək, pericentriolar Trim46 səviyyələri 2-ci mərhələ neyronlarında yüksək olaraq qaldı və γ-tubulin ilə aşkar edilən eyni tendensiyanın ardınca 3-cü mərhələ neyronlarında nəzərəçarpacaq dərəcədə azaldı (Şəkil 1G). Ardıcıl olaraq, insan iPSC-dən əldə edilən neyron mədəniyyətlərində az miqdarda mövcud olan insan iPSC-dən əldə edilən glia hüceyrələrində yetkinləşmədə sentrozomlardan sıx periferik mikrotubul massivlərinə Trim46 boyanmasının oxşar yerdəyişməsini müşahidə etdik (Şəkil EV1C). Birlikdə, bu məlumatlar Trim46 lokalizasiyasının neyroinkişaf zamanı perisentriolyar bölgədən periferik aksonal mikrotubul massivlərinə keçdiyini göstərir.

Centrinone-B müalicəsi neyron kök hüceyrələrində sentriolları tükəndirir

Sentrosom disfunksiyasının akson spesifikasiyasına təsirini öyrənmək üçün daha sonra farmakoloji PLK4 inhibitoru Centrinone-B istifadə edərək insan iPSC-dən əldə edilən NSC-lərdə sentriolları çıxarmağı hədəflədik. Centrinone-B müalicəsi ilə səmərəli və möhkəm sentriol itkisi əvvəllər müxtəlif digər hüceyrə növlərində (Wong) təsdiq edilmişdir. və başqaları, 2015). PLK4-ü inhibə edərək, Centrinone-B proliferasiya edən hüceyrələrdə hüceyrə bölünməsi zamanı sentriol duplikasiyasını bloklayır və bununla da 0, 1 və ya 2 sentrioldan ibarət qarışıq hüceyrə populyasiyasını yaradır. Neyron induksiyasından əvvəl insan iPSC-dən alınmış NSC-ləri 0, 2 və ya 5 gün ərzində Centrinone-B ilə müalicə etdik və hüceyrə başına sentriolların sayını təyin etdik. Centrioles Pericentrin və Centrin (Şəkil 2A) üst-üstə düşən ləkə ilə puncta kimi müəyyən edilmişdir. Biz 1 və ya 2 sentriolun uğurla çıxarılmasını müşahidə etdik

2 günlük Centrinone-B müalicəsindən sonra NSC-lərin 50%-i (Şəkil 2B). Bu, uzun 5 günlük Centrinone-B müalicəsindən sonra əhəmiyyətli dərəcədə artırılmadı, çox güman ki, bu müddət ərzində hüceyrələr vaxtından əvvəl neyronal differensiasiyaya məruz qaldılar və beləliklə, terminal hüceyrə siklini tərk etdilər. Centrinone-B müalicəsi, hətta neyronların differensiasiyasını induksiya etməzdən əvvəl xarakterik neyron kimi morfologiyaya malik hüceyrələrin sayını artırdı. Bu vaxtından əvvəl neyronal differensiasiya fenotipi müxtəlif növlərdə sentrozom disfunksiyasının yaxşı təsvir edilmiş əlamətidir. in vivo və ya 3D in vitro mikrosefaliya və digər neyroinkişaf pozğunluqlarının əsasını təşkil edir (Lancaster və başqaları, 2013). Neyron fərqləndirmə markerləri MAP2 və ya β3-tubulin və ya proliferasiya markeri Ki67 üçün müsbət olan hüceyrələrin nisbi sayı kimi ölçülən Centrinone-B müalicəsinin 2 günündə əhəmiyyətli dərəcədə daha çox neyron tapdıq (Şəkil EV2A–E-EV2A–E). Birlikdə, bu məlumatlar göstərir ki, Centrinone-B müalicəsi insan iPSC-dən əldə edilən neyron hüceyrələrində sentriolların müvəffəqiyyətlə tükənməsi ilə nəticələnir və o, sentrozom qüsurları ilə geniş şəkildə əlaqəli olan neyronal inkişaf fenotiplərini təkrarlayır.

Şəkil 2. NSC-lərdə sentriol itkisi sonrakı aksonal Trim46 hədəflənməsini və fəaliyyət potensialının yetişməsini pozur

  • A. Pericentrin və Centrin üçün immunolənglənmiş Centrinone-B ilə müalicə olunan və ya nəzarət edilən insan iPSC-dən alınan NSC-lərin tipik nümunələri. Əlavələr sentriol(lar)ı təmsil edir. Ölçək çubuğu = ümumi baxışda 5 µm, əlavələrdə 2 µm.
  • B. 0 (nəzarət), 2 və ya 5 gün Centrinone-B müalicəsindən sonra və neyron induksiyasından əvvəl hüceyrədə 0, 1 və ya 2 sentriol olan hüceyrələrin faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n İki müstəqil təcrübədə = 48-51 hüceyrə.
  • C. AnkG, Trim46, MAP2 və Centrin üçün immunolənglənmiş Centrinone-B ilə müalicə olunan və ya nəzarət edilən insan iPSC-dən əldə edilən neyronların (12-15 gün) tipik nümunələri. Ox başları AIS strukturlarını, oxlar sentrosomları qeyd edir. Əlavələr sentrosomları, sağdakı zoomlar AIS strukturlarını təmsil edir. Ölçək çubuğu = ümumi baxışda 20 µm, əlavədə 2 µm, böyütmələrdə 10 µm.
  • D. Trim46-müsbət və ya Trim46-mənfi prosesi olan Centrinone-B ilə müalicə olunan insan iPSC-dən əldə edilən neyronların (12-15 gün) faizinin kəmiyyət göstəriciləri. Neyronlar 2 sentriol və ya 2 sentrioldan az olan populyasiyalara bölünür, Centrin immuno-boyanması əsasında. n Üç müstəqil təcrübədə = 31-53 hüceyrə.
  • E. AnkG-müsbət və ya AnkG-mənfi prosesi olan Centrinone-B ilə müalicə olunan insan iPSC-dən qaynaqlanan neyronların (12-15 gün) faizinin kəmiyyət göstəriciləri. Neyronlar 2 sentriol və ya 2 sentrioldan az olan populyasiyalara bölünür, Centrin immuno-boyanması əsasında. n İki müstəqil təcrübədə = 27-32 hüceyrə.
  • F. Trim46-müsbət və ya Trim46-mənfi olan AnkG-müsbət prosesləri ehtiva edən Centrinone-B ilə müalicə olunan insan iPSC-dən qaynaqlanan neyronların (12-15 gün) faizinin kəmiyyət göstəriciləri. Neyronlar 2 sentriol və ya 2 sentrioldan az olan populyasiyalara bölünür, Centrin immuno-boyanması əsasında. n İki müstəqil təcrübədə = 27 hüceyrə.
  • G. Yuxarı: Eksperimental elektrofiziologiya qurğusunun sxematik təsviri. Fəaliyyət potensialının (AP) tezliyini müəyyən etmək üçün -10 pA-dan 50 pA-a qədər (5 pA, 400 ms addımlar) somatik cərəyan enjeksiyonları tətbiq edilmişdir. Aşağı: Centrinone-B ilə müalicə olunan insan iPSC-dən əldə edilən neyronda evokasiya edilmiş AP atəşinin nümunəvi nümunəsi, 13-cü gündə qeydə alınan hiperpolyarizasiya və ilk iki depolarizasiya cərəyanına cavab.
  • H. Neyronların həyəcanlılığı 54/61 nəzarət hüceyrələrində və 53/54 Centrinone-B ilə müalicə olunan hüceyrələrdə qeydə alınıb. Nəzarətdə sıfır, bir və ya birdən çox AP-ni işə salan hüceyrələrin faizi (AP olmayan 4 müstəqil təcrübə: n = 2, tək AP: n = 32, çoxlu AP: n = 22) Centrinone-B ilə müalicə olunan mədəniyyətlərə qarşı (AP olmayan 3 müstəqil təcrübə: n = 9, tək AP: n = 34, çoxlu AP: n = 10).
  • I. 11-ci gündə qeydə alınmış Centrinone-B ilə müalicə olunan insan iPSC-dən əldə edilən neyronlarda evokasiya olunmuş AP atəşinin nümunəvi nümunələri. Göstərilən AP-ləri işə salmayan neyronun, tək AP-ni yandıran və neyronun tək depolarizasiya edən cari addımına cavabdır. çoxlu AP-ləri işə salan neyron. Ofset cərəyanı (Itutun) baza membran potensialını təxminən −60 mV-də saxlamaq üçün düzəliş edilmişdir (kesikli xətlər).
  • J. Centrinone-B ilə işlənmiş (10-11 gün): n Bir müstəqil təcrübədə = 14 hüceyrə, 13-14 gün: n = üç müstəqil təcrübədə 28 hüceyrə) və nəzarət (7 gün: n = 7 hüceyrə, 10-11 gün: n İki müstəqil təcrübədə = 15 hüceyrə, 13-14 gün: n = dörd müstəqil təcrübədə 36 hüceyrə) insan iPSC-dən əldə edilən neyronlar.
  • K. Centrinone-B və müvafiq olaraq 13 və 14 günlük nəzarət neyronu ilə müalicə olunan insan iPSC-dən alınmış neyronun nümayəndəsi AP-nin faza planları.
  • L. AP yarım eni Centrinone-B ilə işlənmiş (n = üç müstəqil təcrübədə 43 hüceyrə) və insan iPSC-dən əldə edilən neyronları idarə edir (n = dörd müstəqil təcrübədə 59 hüceyrə).
  • M. AP həddi, amplituda və hiperpolyarizasiyadan sonrakı Centrinone-B ilə müalicə edilmiş (n = üç müstəqil təcrübədə 43 hüceyrə) və insan iPSC-dən əldə edilən neyron mədəniyyətlərini idarə edir (n = dörd müstəqil təcrübədə 59 hüceyrə).
  • N. Sol üst: Maksimum natrium cərəyanı membran potensialını təyin etmək üçün istifadə edilən gərginlik eniş protokolunun sxematik təsviri 400 ms-də −100 mV-dən 200 mV-ə dəyişdirildi. Sol alt: 13-cü gündə nəzarət neyronunda qeydə alınan maksimum natrium pikinin nümunəvi nümunəsi. Sağda: Centrinone-B ilə müalicə olunanda maksimum natrium pik (n = üç müstəqil təcrübədə 52 hüceyrə) və insan iPSC-dən əldə edilən neyronları idarə edir (n Üç müstəqil təcrübədə = 48 hüceyrə).

Məlumat məlumatı: Məlumatlar orta ± SEM-i təmsil edir. Ki-kvadrat testi daxil olmaqla post hoc Bonferroni korreksiyası ilə analiz (B, D, E, F) Mann-Whitney testi (L, M: hiperpolarizasiyadan sonra, N), Tələbə t-test (M: eşik həddi, AP amplitudası). ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns P ≥ 0.05.

Şəkil EV2. Centriole itkisi aksonal Trim46 hədəflənməsini və fəaliyyət potensialının yetişməsini pozur

  • A. 0 (nəzarət) və ya 3 günlük Centrinone-B müalicəsi ilə və Ki67, β3-tubulin və MAP2 üçün immunolənglənmiş insan iPSC-dən əldə edilən NSCs/neyronların (3-cü gün) tipik nümunələri. Ümumi baxışda miqyas çubuğu = 15 µm.
  • B. 1, 3 və 5-ci gündə MAP2-müsbət/Ki67-müsbət Centrinone-B-müalicə olunan və ya insan iPSC-dən əldə edilən NSCs/neyronlara nəzarət nisbətinin kəmiyyət göstəriciləri. n İki müstəqil təcrübədə = 54-110 hüceyrə.
  • C. 1, 3 və 5-ci gündə β3-tubulin-müsbət/Ki67-müsbət Centrinone-B ilə müalicə olunan və ya insan iPSC-dən əldə edilən NSCs/neyronları idarə edən nisbətin kəmiyyət göstəriciləri. n İki müstəqil təcrübədə = 49-104 hüceyrə.
  • D. 1, 3 və 5-ci günlərdə MAP2-müsbət Centrinone-B ilə müalicə olunan və ya insan iPSC-dən qaynaqlanan neyronların nəzarəti faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n İki müstəqil təcrübədə = 121-165 hüceyrə.
  • E. 1, 3 və 5-ci günlərdə β3-tubulin-müsbət Centrinone-B ilə müalicə olunan və ya insan iPSC-dən qaynaqlanan neyronlara nəzarət edən faizin kəmiyyət göstəriciləri. n İki müstəqil təcrübədə = 121-165 hüceyrə.
  • F. 0, 1 və ya 2 sentriol(lar) ilə nəzarət və Centrinone-B ilə müalicə edilmiş insan iPSC törəmə neyronlarının (12-14 gün) və tərkibində Trim46-müsbət və ya Trim46 olan neyronların populyasiyalarına bölünmüş faiz nisbətinin kəmiyyət göstəriciləri - mənfi proses. n İki müstəqil təcrübədə = 30 hüceyrə.
  • G. CRISPR/Cas9 nəzarəti və ya SAS6 KO lentivirusu ilə transduksiya edilmiş və γ-tubulin və Centrin üçün immunolənglənmiş insan iPSC-dən əldə edilən NSC-lərin tipik nümunələri. Əlavələr sentriol(lar)ı təmsil edir. Ölçək çubuğu = ümumi baxışda 5 µm, əlavələrdə 2 µm.
  • H. 5-ci gündə və neyron induksiyasından əvvəl CRISPR/Cas9 nəzarəti və ya SAS6 KO lentivirusu ilə transduksiyadan sonra hüceyrədə 0, 1 və ya 2 sentriol olan hüceyrələrin faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n İki müstəqil təcrübədə = 65-147 hüceyrə.
  • I. CRISPR/Cas9 nəzarəti və ya SAS6 KO lentivirusu ilə transduksiya edilmiş və Trim46 üçün immunolənglənmiş insan iPSC-dən əldə edilən neyronların (15 gün, 5-ci gündə neyron induksiyası) tipik nümunələri. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • J.CRISPR/Cas9 nəzarəti və ya SAS6 KO lentivirusu ilə transduksiyadan sonra Trim46-müsbət və ya Trim46-mənfi prosesi ehtiva edən insan iPSC-dən alınmış neyronların (15-ci gün, 5-ci gündə neyron induksiyası) faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n İki müstəqil təcrübədə = 280-354 hüceyrə.
  • K. TRIM46 və Aktin üçün boyanmış insan iPSC-dən alınmış nəzarət neyronlarından və ya Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlardan hüceyrə lizatlarının Qərb ləkəsi.
  • L. Neyronal differensiasiyadan sonra Centrinone-B müalicəsi ilə və ya olmayan Trim46-müsbət və ya Trim46-mənfi prosesi olan insan iPSC-dən alınmış neyronların (11-ci gün) faizinin kəmiyyət göstəriciləri (5-ci gün). n İki müstəqil təcrübədə = 51 hüceyrə.
  • M. Trim46-müsbət və ya Trim46-mənfi olan AnkG-müsbət prosesləri ehtiva edən insan iPSC-dən alınmış neyronların (11-ci gün) faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n İki müstəqil təcrübədə = 51-53 hüceyrə.
  • N. AP amplitudası Centrinone-B ilə müalicə edilmiş və 10-11 günlük insan iPSC törəmə neyronlarına nəzarət (nəzarət: n İki müstəqil təcrübədə = 15 hüceyrə +Centrinone-B: n = bir müstəqil təcrübədə 14 hüceyrə) və 13-14 gün (nəzarət: n Dörd müstəqil təcrübədə = 36 hüceyrə, +Centrinone-B: n = üç müstəqil təcrübədə 27 hüceyrə).
  • O. AP yarım eni Centrinone-B ilə müalicə edilmiş və 10-11 günlük insan iPSC törəmə neyronlarına nəzarət (nəzarət: n İki müstəqil təcrübədə = 15 hüceyrə +Centrinone-B: n = bir müstəqil təcrübədə 14 hüceyrə) və 13-14 gün (nəzarət: n Dörd müstəqil təcrübədə = 36 hüceyrə, +Centrinone-B: n = üç müstəqil təcrübədə 27 hüceyrə).
  • P. Centrinone-B ilə müalicə olunanın istirahət membran potensialı (n = üç müstəqil təcrübədə 54 hüceyrə) və nəzarət (n = dörd müstəqil təcrübədə 64 hüceyrə) insan iPSC törəmə neyronları.
  • Q. Centrinone-B ilə işlənmiş girişə davamlı (n = üç müstəqil təcrübədə 54 hüceyrə) və nəzarət (n = dörd müstəqil təcrübədə 63 hüceyrə) insan iPSC-dən əldə edilən neyronlar.
  • R. Neyron differensiasiyasından sonra Centrinone-B müalicəsi olan və ya olmayan insan iPSC törəmə neyronlarında qeydə alınan AP amplitudası (nəzarət: n Üç müstəqil təcrübədə = 17 hüceyrə, +Centrinone post-diferensiasiya: n = üç müstəqil təcrübədə 16 hüceyrə).
  • S. Nöronal differensiasiyadan sonra Centrinone-B müalicəsi olan və ya olmayan insan iPSC törəmə neyronlarında qeydə alınmış yarım eni AP (nəzarət: n Üç müstəqil təcrübədə = 17 hüceyrə, +Centrinone post-diferensiasiya: n = üç müstəqil təcrübədə 16 hüceyrə).

Məlumat məlumatı: Məlumatlar orta ± SEM-i təmsil edir. Ki-kvadrat testi daxil olmaqla post hoc Bonferroni korreksiyası ilə təhlil (D, E, H, J, L, M) Student’s t-test (N: nəzarət Centrinone-B-yə qarşı, 10-11-ə qarşı 13-14 gün, S) Mann-Whitney testi (O: sentrinona qarşı nəzarət, 10-11-ə qarşı 13-14 gün, P, Q, R). ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns P ≥ 0.05.

Şəkil EV3. Sentriol itkisi ilə inkişaf edən proteom dinamikası

  • A. Proteom analizi üçün istifadə edilən nəzarət neyronlarının və ya Centrinone-B (Cent-B) ilə müalicə olunan neyronların bioloji təkrarlarının korrelyativ matrisi.
  • B. 7-ci gündən 3-cü günə və 1-ci günə nəzarət neyronlarında nisbi protein ifadəsinin korrelyativ təhlili. Xüsusi kök hüceyrə markerləri (mavi), neyron markerləri (sarı) və akson markerləri (qırmızı) vurğulanır.
  • C. Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlarda 7-ci gündən 3-cü günə və 1-ci günə nisbi protein ifadəsinin korrelyativ təhlili. Xüsusi kök hüceyrə markerləri (mavi), neyron markerləri (sarı) və akson markerləri (qırmızı) vurğulanır.
  • D. Kök hüceyrə zülalları, neyron zülalları və akson zülalları üçün 1, 3 və 7-ci gündə nisbi zülal ifadə nisbətləri və 1-ci günə kalibrlənmişdir.
  • E. 5-ci və 9-cu günlərdə fan kimi böyümə konusunda ümumi phalloidin intensivliyinin kəmiyyəti. n = İki müstəqil təcrübədə 71-80 böyümə konusları.

Məlumat məlumatı: Məlumatlar orta ± SEM-i təmsil edir.

Şəkil EV4. Centriole itkisi erkən akson inkişafı zamanı mikrotubulun yenidən qurulmasını məhdudlaşdırır

  • A. Müxtəlif vaxt nöqtələri (7-ci gün 13-cü gün) və şərtlər (nəzarət Centrinone-B) üçün proksimal aksonun time-lapse qeydlərinin kimoqrafları və sxematik təsvirləri. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • B. 7-ci gündə proksimal aksonda anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa oriyentasiyaları nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 13-14 hüceyrə.
  • C. 13-cü gündə proksimal aksonda anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa istiqamətləri nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 12-17 hüceyrə.
  • D. 7-ci və 13-cü gündə proksimal aksonda anterograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 12-17 hüceyrə.
  • E. 7-ci və 13-cü gündə proksimal aksonda retrograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 12-17 hüceyrə.
  • F. Müxtəlif vaxt nöqtələri (7-ci gün 13) və şərtlər (nəzarət Centrinone-B) üçün dendritin time-lapse qeydlərinin kimoqrafları və sxematik təsvirləri. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • G. 7-ci gündə dendritdə anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa oriyentasiyaları nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 12-13 hüceyrə.
  • H. 13-cü gündə dendritdə anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa istiqamətləri nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 13-16 hüceyrə.
  • I. 7-ci və 13-cü gündə dendritdə anterograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 12-16 hüceyrə.
  • J. 7-ci və 13-cü gündə dendritdə retrograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 12-16 hüceyrə.
  • K. Müxtəlif vaxt nöqtələri (7-ci gün 13) və şərtlər (nəzarət Centrinone-B) üçün LS-dən sonra proksimal aksonun time-lapse qeydlərinin Kymoqrafları və sxematik təsvirləri. Qırmızı xətt və qırmızı ox ucu LS-in yerini və vaxtını bildirir. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • L. 7-ci gündə LS-dən sonra proksimal aksonda anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa istiqamətləri nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 20-21 neyron.
  • M. 13-cü gündə LS-dən sonra proksimal aksonda anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa istiqamətləri nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 22-25 neyron.
  • N. 7-ci və 13-cü gündə LS-dən sonra proksimal aksonda anterograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 20-25 hüceyrə.
  • O. 7-ci və 13-cü gündə LS-dən sonra proksimal aksonda retrograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 20-25 hüceyrə.
  • P. Müxtəlif vaxt nöqtələri (7-ci gün 13) və şərtlər (nəzarət Centrinone-B) üçün LS-dən sonra dendritin vaxtaşırı qeydlərinin kimoqrafları və sxematik təsvirləri. Qırmızı xətt və qırmızı ox ucu LS-in yerini və vaxtını bildirir. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • S. 7-ci və 13-cü gündə LS-dən sonra dendritdə anterograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 20-26 hüceyrə.
  • R. 7-ci və 13-cü gündə LS-dən sonra dendritdə retrograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 20-26 hüceyrə.
  • S. Müxtəlif şərtlər üçün 13-cü gündə distal aksonda anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa oriyentasiyaları nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri (5-ci gündə nəzarət Centrinone-B əlavəsi post-diferensiasiya). n Üç müstəqil təcrübədə = 21-23 hüceyrə.
  • T. Müxtəlif şərtlər üçün 13-cü gündə distal aksonda anterograd istiqamətə işarə edən dəqiqədə kometlərin sayının kəmiyyət göstəriciləri (5-ci gündə Centrinone-B əlavə post-differensiasiyaya nəzarət). n İki müstəqil təcrübədə = 21-23 hüceyrə.
  • U. Müxtəlif şərtlər üçün 13-cü gündə distal aksonda retrograd istiqamətə işarə edən dəqiqədə kometlərin sayının kəmiyyət göstəriciləri (5-ci gündə Centrinone-B əlavəsi post-diferensiyasına nəzarət). n İki müstəqil təcrübədə = 21-23 hüceyrə.

Məlumat məlumatı: Məlumatlar orta ± SEM-i təmsil edir. Xi-kvadrat testi (B, C, G, H, L, M, S), cütləşməmiş t-test (D, E, I, J, N, O, Q, R, T, U) **P < 0,005, *P < 0,05, ns P ≥ 0.05.

Centriole itkisi Trim46-nın aksonal hədəflənməsini pozur

Daha sonra Centrinone-B müalicəsi zamanı sentrioldan məhrum olmuş və vaxtından əvvəl fərqlənmiş bu neyronların normal inkişaf vaxtına əməl edib-etmədiyini və funksional aksonların böyüməsini soruşduq. Akson spesifikasiyası zamanı sentrozomların rolunu araşdırmaq üçün biz erkən mərhələdəki aksonların inkişafına sentriol itkisindən təsir edib-etmədiyini qiymətləndirdik. Erkən mərhələdə akson inkişafının mühüm aspekti AIS protein Trim46 da daxil olmaqla aksonal zülalların spesifik çeşidlənməsidir. Beləliklə, Trim46-nın akson spesifik lokalizasiyasının Centrinone-B-induksiya etdiyi sentriolun çıxarılmasından təsirləndiyini yoxladıq. Neyronlar sentriol sayını və hər bir hüceyrə üçün aksonal Trim46-nın mövcudluğunu əlaqələndirmək üçün Centrin və Trim46 ilə immuno-boyandı (Şəkil 2C). Biz qeyd etdik

Centrinone-B müalicəsi zamanı hələ də 2 sentriol ehtiva edən hüceyrələrlə müqayisədə ≤ 1 sentriol(s) olan hüceyrələrin subpopulyasiyasında Trim46-müsbət prosesi olan hüceyrələrin 50% azalması (Şəkil 2D). Müvafiq olaraq, Trim46-mənfi proseslər Centrinone-B müalicəsi zamanı hələ də hər iki sentriol ehtiva edən neyronlarla müqayisədə sentriol tükənmiş neyronlarda daha çox müşahidə edildi, halbuki bu fərq nəzarətdə müşahidə edilmədi (Şəkil EV2F). Centrinone-B-nin mümkün hədəfdən kənar təsirlərinə nəzarət etmək üçün biz sentriolun təkrarlanmasının mühüm tənzimləyicisi və sentriol çarxının strukturunun bir komponenti olan SAS6-nın genetik manipulyasiyasına əsaslanan sentriol itkisini induksiya etmək üçün əlavə yanaşmadan istifadə etdik (Nakazawa). və başqaları, 2007). Beş gün ərzində CRISPR/Cas9 SAS6 gRNA nokaut lentivirusu (SAS6 KO) ilə insan iPSC-dən əldə edilən NSC-lərin ötürülməsi sentriolların sayının əhəmiyyətli dərəcədə azalması ilə nəticələndi (Şəkil EV2G və H). Trim46-nın aksonal görünüşü SAS6 KO lentivirusu ilə ötürülən neyronlarda əhəmiyyətli dərəcədə azaldı və bununla da əvvəlki tapıntımızı təsdiqlədik (Şəkil EV2I və J). Centriole tükənməsi neyronlarda ümumi Trim46 ifadə səviyyələrinə təsir göstərmədi, çünki Centrinone-B ilə Western blot analizi ilə müalicə zamanı heç bir aydın fərq tapılmadı (Şəkil EV2K). Aksonal çeşidlənməyə məruz qalan digər mühüm zülal əsas AIS iskelesi AnkG-dir. Trim46-dan fərqli olaraq, Centrionone-B-nin səbəb olduğu sentriol tükənməsi ilə AnkG-nin aksonal görünüşündə heç bir dəyişiklik müşahidə etmədik (Şəkil 2E). Ardıcıl olaraq, ≤ 1 sentriol (s) ehtiva edən hüceyrələr AnkG-müsbət aksonal strukturlarda azalmış Trim46 birgə lokalizasiyasını göstərdi (Şəkil 2F). Centriole sayı ilə əlaqəli olmayan PLK4 inhibisyonunun mümkün post-differensial təsirlərinə nəzarət etmək üçün neyronal diferensiallaşmadan sonra Centrinone-B müalicəsini tətbiq edərkən Trim46-nın aksonal hədəflənməsinə təsir edib-etmədiyini araşdırdıq. Neyronların induksiyasından üç gün sonra Centrinone-B ilə neyronların müalicəsi, əvvəllər əksər neyronların fərqləndiyi, lakin hələ qütbləşmədiyi bir vaxt nöqtəsi kimi bildirdiyimiz, sonrakı mərhələlərdə aksonlarda və ya AnkG-müsbət strukturlarda Trim46 görünüşünə təsir etməmişdir (Şəkil EV2L və M) (Lindhout və başqaları, 2020). Birlikdə, bu məlumatlar sentrosomların neyron inkişafının erkən mərhələlərində aksonlara AnkG deyil, Trim46-nın hədəflənməsi üçün vacib olduğunu göstərir.

Centriole itkisi yetişməmiş fəaliyyət potensialı atəşinə səbəb olur

Trim46 və AnkG-nin aksonal hədəflənməsi, yetkin və səmərəli AP atəşi üçün vacib olan yüksək ixtisaslaşmış struktur olan AIS-i yığmaq üçün tələb olunur. Beləliklə, sentriolun tükənməsi zamanı akson zülalının hədəflənməsinə müşahidə edilən diferensial təsirlərin AP xassələrindəki dəyişikliklərlə əlaqəli olub olmadığını qiymətləndirdik. Erkən akson inkişafı ilə üst-üstə düşən 7-14 gün ərzində nəzarət və ya Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronların tam hüceyrəli yamaq sıxacının qeydlərini etdik. Neyronların həyəcanlılığını ölçmək üçün artan somatik cərəyan inyeksiyası (5 pA 400 ms addımlar) ilə atəşə tutulan AP-lərin sayını təyin etdik (Şəkil 2G). Centrinone-B ilə müalicə olunan mədəniyyətlərdə,

Neyronların 17% -i AP-ləri atəşə tutmadı, halbuki bu yalnız idi

Nəzarət mədəniyyətlərində 3% (Şəkil 2H və I). Atəş neyronları arasında nəzarətlə müqayisədə çoxlu AP-ləri işə salan Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlar daha az idi. AP-ləri işə salmayan neyronlar, cari stimullaşdırma zamanı natrium kanallarının açılmasını göstərən kiçik zirvələr yaratdılar, lakin AP-lərə xas olan membran potensialını sürətlə artırmaq üçün müsbət rəy yaratmadılar. Bundan əlavə, Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlar, nəzarət neyronlarında müşahidə edildiyi kimi, 10-cu gündən 14-cü günə qədər AP xüsusiyyətlərinin mütərəqqi olgunlaşmasını göstərməmişdir (Şəkil 2J və EV2N və O). Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlar tərəfindən atəşə tutulan AP-lər daha yetişməmiş görünürdü, çünki onlar daha geniş, daha kiçik amplitüdlərə və daha kiçik hiperpolarizasiyaya malik idi (Şəkil 2K-M və EV2N və O). Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlarda giriş müqaviməti də daha yüksək idi, lakin membran potensialı nəzarətdən fərqlənmədi (Şəkil EV2O–Q-EV2O–Q). AP həddi Centrinone-B müalicəsindən təsirlənməsə də (Şəkil 2M), Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlarda maksimum natrium cərəyanları əhəmiyyətli dərəcədə kiçik idi (Şəkil 2N). PLK4 inhibisyonunun sentriol ilə əlaqəli olmayan təsirlərinə nəzarət etmək üçün biz Centrinone-B müalicəsinin diferensiallaşmadan sonra fəaliyyət potensialının işə salınmasına təsirini sınaqdan keçirdik. Centrinone-B post-diferensiasiyadan sonra əlavə edildikdə, 13-14 günlük neyronlarda AP amplitudasında və yarı genişliyində fərq müşahidə etmədik (Şəkil EV2R və S). Birlikdə, Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronların elektrofiziologiya qeydləri daha yetişməmiş AP atəşini və azaldılmış natrium cərəyanlarını göstərir, bununla da neyron inkişafının erkən mərhələlərində sentrozom vasitəçiliyi ilə idarə olunan mexanizmlərin funksional əhəmiyyətini vurğulayır.

Centriole tükənməsi böyümə konus zülallarının ifadəsinin azalması ilə nəticələnir

Müşahidələrimiz göstərdi ki, sentriol tükənmiş NSC-lər akson inkişafında struktur və funksional pozğunluqları olan neyronlara çevrilir. Sonra, qərəzsiz profilləşdirmə ilə akson spesifikasiyası zamanı sentriol tükənməsinin təsirlərini ölçməyi hədəflədik. Buna görə də, biz 1, 3 və 7-ci günlərdə kütləvi spektrometriyaya əsaslanan kəmiyyət proteomik analizini həyata keçirdik, bu, ümumiyyətlə, müvafiq olaraq 1-ci inkişaf mərhələsi, 2-ci mərhələnin başlanğıcı və 3-cü mərhələnin başlanğıcına uyğundur (Lindhout və başqaları, 2020). Centrinone-B ilə müalicə olunan və nəzarət neyronlarının replikalarının erkən neyroinkişafı zamanı proteom dinamikasını müqayisə etdik (Şəkil EV3A, DATASET EV1). Centrinone-B müalicəsi zamanla nisbi protein ifadəsini nəzərəçarpacaq dərəcədə dəyişmədi (Şəkil 3A). Nəzarət neyronlarının zülal ifadə profili 1-ci mərhələdən 2-ci mərhələyə və 2-ci mərhələdən 3-cü mərhələyə keçidlərə uyğun gələn inkişaf dəyişikliyini göstərdi (Şəkil EV3B). Centriole tükənmiş neyronların zülal ifadəsi əsasən eyni tendensiyanı izləyir (Şəkil EV3C). Hər iki populyasiyada NSC-lər üçün spesifik hesab edilən zülallar 3 və 7-ci günlərdə aşağı tənzimlənir (məsələn, Ki67, nestin, Otx, Notch1), neyron zülalları isə yuxarı tənzimlənir (məsələn, Stathmin1, Map2, doublecortin, Tubß3) (Şəkil EV3D). Mərhələ 3-ün başlanğıcı akson spesifikasiyasını qeyd edir və həqiqətən də, Centrinone-B müalicəsindən təsirlənməmiş 7-ci gündə Trim46 və Tau aksonal zülallarının güclü tənzimlənməsini müşahidə etdik (Şəkil 3B). Böyümə konus zülallarının Basp1, Gap43 və Marksın ifadəsi nəzarət qruplarında, eləcə də Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlarda 3-cü gündə artmışdır. Bu tənzimləmə nəzarət neyronlarında 7-ci gündə daha da güclü idi, lakin sentriol tükənmiş neyronlarda (Şəkil 3C və EV3D) nəzərəçarpacaq dərəcədə sıxışdırıldı. Birlikdə, kəmiyyət proteom analizi göstərir ki, Centrinone-B ilə müalicə neyroinkişafın erkən mərhələlərində zülal ifadə profilini kəskin şəkildə dəyişdirmir və Centrinone-B ilə müalicə olunan hüceyrələrin uğurlu qlobal keyfiyyətinə nəzarəti təmin edir. Bununla belə, bu nəticələr sentriolların tükənməsindən sonra böyümə konusunun zülallarına xüsusi təsir göstərir.

Şəkil 3. NSC-lərdə sentriol itkisi neyritin böyüməsi konusunun morfologiyasında dəyişikliklərlə müşayiət olunur.

  • A. Centrinone-B ilə müalicə olunan nəzarət neyronları və neyronlar arasında protein bolluğundakı dəyişikliklərin korrelyativ sxemi (7-ci gün/3-cü gün). Pearson korrelyasiyası R = 0.5716, P < 0,001. Xüsusi, əhəmiyyətli dərəcədə dəyişən böyümə konus zülalları qırmızı rənglə vurğulanır.
  • B. Centrinone-B (+C) ilə müalicə olunan nəzarət neyronları və neyronlarında aksonla əlaqəli zülallar Trim46 və Tau üçün zamanla zülal bolluğu profili.
  • C. Centrinone-B (+C) ilə müalicə olunan nəzarət neyronlarında və neyronlarda böyümə konusu ilə əlaqəli zülallar Basp1, Gap43 və Marks üçün zamanla zülal bolluğu profili.
  • D. Nəzarətin 5-ci günündə fan kimi böyümə konuslarının və Nokodazol müalicəsi ilə və ya olmayan Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronların nümayəndəsi şəkilləri. Böyümə konusları phalloidin üçün immun boyama ilə vizuallaşdırılır. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • E. Müxtəlif vaxt nöqtələrində Nokodazol müalicəsi ilə və ya olmayan, nəzarət və Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronların böyümə konuslarının orta sahəsinin (µm 2) kəmiyyət göstəriciləri. n = Üç müstəqil təcrübədə 25-83 böyümə konusları.
  • F. Müxtəlif böyümə konuslarının morfoloji kateqoriyalarının nümayəndəsi şəkilləri: fanat kimi, torpedaya bənzər və ampul kimi. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • G. Fərqli vaxt nöqtələrində Nokodazol ilə müalicə olunan və ya olmayan nəzarət və Centrinone-B ilə işlənmiş neyronların böyümə konuslarının müxtəlif alt tiplərinin (yelçəkən kimi, torpedayabənzər, lampayabənzər) nisbətlərinin kəmiyyət göstəriciləri.
  • H. Fərqli vaxt nöqtələrində Nokodazol ilə müalicə olunan və ya olmayan nəzarət və Centrinone-B ilə işlənmiş neyronların böyümə konuslarının müxtəlif yarımtiplərinin (yelçəkən kimi, torpedayabənzər, lampayabənzər) orta sahəsinin (µm 2) kəmiyyət göstəriciləri . n = Üç müstəqil təcrübədə 5-55 böyümə konusları.

Məlumat məlumatı: Məlumatlar orta ± SEM-i təmsil edir. Tukey də daxil olmaqla birtərəfli ANOVA post hoc analiz (E), Xi-kvadrat testi daxil olmaqla post hoc Bonferroni korreksiyası (G), Sidak da daxil olmaqla birtərəfli ANOVA ilə təhlil post hoc təhlili (H). ***P < 0,001, **P < 0,005, *P < 0,05, ns P ≥ 0.05.

Centriole tükənməsi neyrit artım konus morfologiyası təsir göstərir

Sonra, böyümə konusu zülalların azaldılmış ifadəsinin aksonal böyümə konusunun morfologiyasının qüsurları ilə nəticələndiyini araşdırdıq. Nəzarət neyronlarında böyümə konuslarının ölçüsünün inkişafın əvvəlində nisbətən böyük olduğunu və zamanla azaldığını aşkar etdik (Şəkil 3D və E).Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronların böyümə konusları 5-ci gündə daha kiçik qaldı və onların ölçüsü inkişafda daha da azaldı. Mikrotubullar böyümə konuslarını formalaşdırmaq üçün vacib komponentlər olduğundan, mikrotubul sitoskeletinin manipulyasiyasının Centrinone-B müalicəsi ilə sentriol tükənməsinin böyümə konusunun ölçüsünə təsirini təqlid edib-etmədiyini araşdırdıq (Dent). və başqaları, 2011). Həqiqətən də, mikrotubula stabilizatoru olan Nocodazole ilə müalicə artıq 5-ci gündə daha kiçik böyümə konusları ilə nəticələndi (Şəkil 3D və E). Maraqlıdır ki, Nocodazole müalicəsi sentriol tükənmiş neyronlarda böyümə konusunun ölçüsünə əlavə təsir göstərmədi, bu da oxşar əsas mexanizmləri təklif edir. Centriole tükənməsinin böyümə konuslarına təsirini daha dəqiq öyrənmək üçün biz üç alt növə təsnif etdik: fanat kimi, torpedayabənzər və lampayabənzər (Şəkil 3F) (van der Vaart) və başqaları, 2013). Biz 5-ci gündə ventilyatora bənzər böyümə konuslarının əksəriyyətini tapdıq, bu konuslar aksonlar yetişdikcə daha çox torpedayabənzər və soğana bənzər böyümə konuslarına keçdi (Şəkil 3G). Nə Centrinone-B, nə də Nocodazole müalicəsi bu növ böyümə konuslarının nisbi bolluğunu dəyişdirməmişdir. Bununla belə, Centrinone-B, eləcə də Nocodazole müalicəsi 5-ci gündə ventilyatora bənzər böyümə konuslarının əhəmiyyətli dərəcədə kiçik olması ilə nəticələndi ki, bu da nəzarət neyronları torpedo və ampul kimi böyümə konuslarından xeyli böyükdür (Şəkil 3H). Torpedayabənzər böyümə konusları üçün bu təsir fərqli idi, çünki torpedayabənzər və lampayabənzər böyümə konuslarının ölçüləri təsirlənməmişdir, bu, böyümə konusunun ölçüsünün müşahidə edilən azalmasının xüsusilə təsirlənmiş yelçəkən kimi böyümə konusları ilə əlaqədar olduğunu göstərir (Şəkil 3E). və H). Aktin sitoskeleti böyümə konuslarının başqa bir vacib sitoskeletal komponentidir və əvvəllər dissosiasiya olunmuş gəmirici neyronlarda sentrozom fəaliyyəti ilə yanaşı mikrotubullar tərəfindən idarə olunduğu aşkar edilmişdir (Zhao və başqaları, 2017 Meka və başqaları, 2019). Burada, böyümə konuslarında F-aktinin yerli səviyyələrində heç bir dəyişiklik müşahidə etmədik, bu, fan kimi böyümə konuslarının ölçüsünün azalmasının böyümə konuslarında F-aktin səviyyələrindəki dəyişikliklərdən qaynaqlanmadığını göstərir (Şəkil EV3E). Birlikdə, bu nəticələr göstərir ki, sentriol tükənməsi, ehtimal ki, mikrotubula vasitəçiliyi ilə, akson böyüməsi zamanı böyümə konusunun morfologiyası qüsurlarına səbəb olur.

Centriole tükənməsi inkişaf edən aksonlarda mikrotubulun yenidən təşkilini pozur

Artı uçlu mikrotubulların vahid təşkili ilə qeyd olunan aksonal mikrotubul sitoskeletonunun unikal təşkilində sentrosomların potensial rolu haqqında daha çox məlumat əldə etmək üçün inkişaf zamanı sentriol itkisinin mikrotubulun yenidən qurulması proseslərinə təsirini öyrəndik. Biz 7 və 13-cü gündə aksonlarda və dendritlərdə mikrotubulların əlavə dinamikasını və istiqamətlərini sistematik olaraq təhlil etdik, bu da müvafiq olaraq 3-cü mərhələnin başlanğıcı və 3-cü mərhələnin gec başlaması ilə üst-üstə düşür (Lindhout və başqaları, 2020). Aksonlarda analiz üçün biz həm proksimal, həm də distal bölgələri ölçdük, çünki əvvəllər bildirdiyimiz kimi, akson inkişafı insan iPSC-dən qaynaqlanan neyronlarda (Lindhout) bu zaman pəncərəsində distaldan proksimala doğru yenidən təşkili izləyir. və başqaları, 2020). Nəzarət neyronlarında və Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlarda neyrit morfologiyasını və mikrotubul üstəgəl son izləmə zülallarını (MT+TIPs) görüntüləmək üçün iki rəngli canlı hüceyrə təsvirindən istifadə etdik (Şəkil 4A, MOVIE EV1). MT+TIP-lərin hərəkət istiqaməti mikrotubul oriyentasiyaları üçün oxunuş kimi istifadə olunur, çünki MT+TIP-lərin anterograd və retrograd hərəkəti müvafiq olaraq artı-ucu və mənfi-ucu mikrotubulları işarələyir. 7-ci gündə, yetkin aksonların əlaməti olan vahid mikrotubul polaritesi olan Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronların faizi həm proksimal, həm də distal aksonlarda nəzarət neyronlarına bənzəyir (Şəkil 4B və C, və EV4A və B). Eynilə, anterograd və geriyə doğru böyüyən MT+TIP-lərin sayı Centrinone-B müalicəsi zamanı dəyişmir (Şəkil 4D və E, və EV4D və E). Bununla belə, 13-cü gündə distal aksonda vahid mikrotubullara malik neyronların nisbəti nəzarət neyronları ilə müqayisədə Centrinone-B müalicəsi ilə əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (Şəkil 4B və F). Mikrotubul polaritesi xüsusi olaraq ən yetkin aksonal mərhələni təmsil edən distal aksonda təsirlənmişdir, çünki nəzarət neyronlarının və Centrinone-B neyronlarının proksimal aksonlarında və dendritlərində heç bir fərq müşahidə edilməmişdir (Şəkil EV4, EV4, EV4, EV4, EV4, EV4, EV4, EV4A–C,F–H). Bu onu göstərir ki, sentriolun tükənməsi neyronların aksonal inkişaf zamanı xarakterik vahid üstəgəl mikrotubul təşkilatını saxlamasına mane olur. Bundan əlavə, Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlar, xüsusilə anterograd hərəkət edən MT+TIP-lər üçün daha çox MT+TIP hərəkəti göstərir ki, bu da mikrotubul dinamikasının qlobal artımını göstərir (Şəkil 4G və H). MT+TIP-lərin sayında artım 13-cü gündə proksimal aksonda da müşahidə edilir, lakin dendritlərdə müşahidə olunmur (Şəkil EV4D,E,I,J). Artan MT+TIP-lərin sürəti və işləmə uzunluğu nəzarət neyronları və dendritlərdə Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlar, eləcə də hər iki vaxt nöqtəsində proksimal və distal aksonlar arasında uyğun idi (DATASET EV2). MT+TIP-lərin təsviri yalnız mikrotubulların dinamik ucları haqqında məlumat verir, lakin stabilləşdirilmiş mikrotubulları nəzərə almır. Beləliklə, daha sonra həm sabit, həm də dinamik mikrotubullar daxil olmaqla ümumi aksonal mikrotubul şəbəkəsinin mikrotubul istiqamətlərini təhlil etməyi hədəflədik. Bu, yeni əmələ gələn MT+TIP-ləri işə salan qısa impulslu lazerlə mikrotubulları kəsərək yeni mikrotubul uclarını yaratmaq üçün lazerin kəsilməsi ilə yanaşmamızı birləşdirməklə həll olundu (Şəkil 4I və J, MOVIE EV2) (Yau) və başqaları, 2016). Əvvəlki tapıntılara uyğun olaraq, biz qeyd olunan müşahidə etdik

Mikrotubulların lazerlə kəsilməsindən sonra Centrinone-B müalicəsi ilə distal aksonlarda vahid üstəgəl mikrotubul təşkilatı olan neyronların 40% azalması, proksimal aksonlarda isə əhəmiyyətli dəyişiklik müşahidə olunmamışdır (Şəkil 4K,L,O və EV4K,L,M). ). Distal aksonlarda, Centrinone-B ilə müalicə zamanı retrograd kometlərin sayı əhəmiyyətli dərəcədə artdı, anterograd kometlər isə təsirlənmədi, bu da sentriol itkisinin inkişaf edən aksonlarda daha sabit mənfi uçlu mikrotubullarla müşayiət olunduğunu göstərir (Şəkil 4M,N,P,Q). ). Gözlənildiyi kimi, Centrinone-B müalicəsi ilə proksimal aksonlarda və dendritlərdə anterograd və retrograd kometlərin sayı dəyişdirilməyib (Şəkil EV4N, O, P, Q, R). Centriol sayı ilə əlaqəsi olmayan postmitotik neyronlarda PLK4 inhibə təsirlərinə nəzarət etmək üçün fərqləndirmədən sonra Centrinone-B ilə müalicə olunan neyronlarda 13-cü gündə distal aksonlarda mikrotubul təşkilatını təhlil etdik və nəzarətlə müqayisədə əhəmiyyətli fərqlər müşahidə etmədik (Şəkil EV4S, T, U) . Birlikdə, bu məlumatlar sentrosomların vahid və sonlu mikrotubullara doğru unikal akson spesifik yenidən təşkili üçün vacib olduğunu göstərir (Şəkil 4R).

Şəkil 4. Centriole itkisi erkən akson inkişafı zamanı mikrotubula yenidən qurulmasını məhdudlaşdırır

  • A. mRFP və GFP-MT+TIP ilə transfeksiya olunmuş neyritin fırlanan diskin vaxtaşırı qeydindən nümunə kadrları. Üst panel mRFP-də neyritin morfologiyasını göstərən bir neyritdir. Digər panellərdə hərəkət edən GFP-MT+TIP kometləri ya anterograd istiqamətə (yaşıl ox başlıqları) və ya retrograd istiqamətə (mavi ox başlıqları) işarə edir. P proksimal istiqaməti, D isə neyritin distal istiqamətini göstərir. Dəqiqələrlə vaxt möhürü: sağ altda verilmiş saniyələr. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • B. Fərqli vaxt nöqtələri (7-ci gün 13-cü gün) və şərtlər (nəzarət Centrinone-B) üçün (A) göstərildiyi kimi distal aksonun vaxt fasiləsi qeydlərinin kimoqrafları və sxematik təsvirləri. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • C. 7-ci gündə distal aksonda anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa oriyentasiyaları nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 15-17 hüceyrə.
  • D. 7-ci gündə distal aksonda anterograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 15-17 hüceyrə.
  • E. 7-ci gündə distal aksonda retrograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının miqdarı. n Dörd müstəqil təcrübədə = 15-17 hüceyrə.
  • F. 13-cü gündə distal aksonda anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa oriyentasiyaları nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 11-18 hüceyrə.
  • G. 13-cü gündə distal aksonda anterograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 11-18 hüceyrə.
  • H. 13-cü gündə distal aksonda retrograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Dörd müstəqil təcrübədə = 11-18 hüceyrə.
  • I. Mikrotubula lazerlə kəsmə (LS) təcrübələrinin sxematik təsviri.
  • J. mRFP və GFP-MT+TIP ilə transfeksiya edilmiş neyritin spinning-disk time-lapse qeydindən nümunə kadrları. Qırmızı xətt LS-nin yerini bildirir. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • K. Kymographs və distal aksonun time-lapse qeydlərinin sxematik təsvirləri (J) LS-dən sonra, müxtəlif vaxt nöqtələri (gün 7-ci gün 13) və şərtlər (nəzarət Centrinone-B) üçün. Qırmızı xətt və qırmızı ox ucu LS-in yerini və vaxtını bildirir. Ölçək çubuğu = 5 µm.
  • L. 7-ci gündə LS-dən sonra distal aksonda anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa istiqamətləri nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 20-22 neyron.
  • M. 7-ci gündə LS-dən sonra distal aksonda anterograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 20-22 hüceyrə.
  • N. 7-ci gündə LS-dən sonra distal aksonda retrograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 20-22 hüceyrə.
  • O. 13-cü gündə LS-dən sonra distal aksonda anterograd istiqamətdə vahid və ya qeyri-bərabər kometa istiqamətləri nümayiş etdirən neyronların faizinin kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 24-27 neyron.
  • P. 13-cü gündə LS-dən sonra distal aksonda anterograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 24-27 hüceyrə.
  • Q. 13-cü gündə LS-dən sonra distal aksonda retrograd istiqamətdə hərəkət edən kometlərin dəqiqədə sayının kəmiyyət göstəriciləri. n Üç müstəqil təcrübədə = 24-27 hüceyrə.
  • R. Nəzarət şəraitində distal aksonda mikrotubulların təklif olunan oriyentasiyasının sxematik təsviri və Centrinone-B müalicəsindən sonra.

Məlumat məlumatı: Məlumatlar orta ± SEM-i təmsil edir. Xi-kvadrat testi (C, F, L, O), cütləşməmiş t-test (D, E, G, H, M, N, P, Q) **P < 0,005, *P < 0,05, ns P ≥ 0.05.


Sentrosoma qulluq

Tarixən sentriollar son dərəcə sabit strukturlar kimi qəbul edilmişdir. Onlar dərman və soyuqla səbəb olan MT depolimerləşməsinə (Kochanski və Borisy, 1990), mitozda qüvvələrə və MT qeyri-sabitliyinə davamlıdırlar (Belmont et al., 1990). Bundan əlavə, bazal cismin α-tubulinin fotoağartmasından (FRAP) sonra flüoresan bərpası tetrahymena az dövriyyə göstərir (Pearson et al., 2009). In zərif eksperiment C. elegans sentriolyar divarları qeyd etmək üçün GFP-də SAS4 ilə etiketlənmiş, ata tərəfindən töhfə verən tək sentriol ehtiva edən sperma ilə mayalanma zamanı mayalanmadan sonra ~350 hüceyrə mərhələsinə qədər aşkar edilə biləcəyini nümayiş etdirdi (Balestra et al., 2015), sentriolların bir çox bölmələr vasitəsilə sabit miras qaldığını göstərir.

Bununla belə, sentrozomlar əksər metazoa növlərinin oositlərindən itirilir (Delattre və Gönczy, 2004 Manandhar et al., 2005) və neyronlar kimi differensiasiyaya məruz qalan bəzi hüceyrə növlərində təsirsizləşdikləri (yəni MTOC qabiliyyətinin itirilməsi) məlumdur. əzələ və epitel hüceyrələri (Sanchez və Feldman, 2017). Məməlilərdə neyronların diferensiasiyası zamanı və Drosophila, sentrozomlar PCM zülallarını və nəticədə onların MTOC qabiliyyətini itirirlər (Stiess et al., 2010 Nguyen et al., 2011). Akson uzadılması məməlilərdə aktiv sentrozomlar olmadıqda baş verə bilər Drosophila (Tassin et al., 1985 Stiess et al., 2010 Nguyen et al., 2011). Miyositlərin differensiasiyasında sentrosomlar PCM zülallarını itirir və əzələ liflərində yoxdur (Srsen et al., 2009 Przybylski, 1971). Eyni zamanda, PCM zülalları MT-lərin nüvələşdiyi nüvə periferiyasında toplanır (Srsen et al., 2009 Przybylski, 1971). Bir neçə epitelial hüceyrə növləri də MT nüvəsini təsirsiz hala gətirir və / və ya onların sentrozomlardan ankrajını ləğv edir və beləliklə apikal-bazal ox boyunca MT-lər yaradır (Sanchez və Feldman, 2017 Muroyama və Lechler, 2017). Bu dəlil xətləri sentrozomun tənzimlənə bilən homeostatik baxım proqramı altında olduğunu göstərir və bununla da müxtəlif MT massivlərinin yaranmasına səbəb olur.

Üstəlik, bir neçə sentriol komponenti dinamikdir, məsələn, sentriolun lümenindəki sentrin (Bəhmənyar və digərləri, 2010), çarxda mil yığılması anormal protein 6 (SAS6) (Keller və digərləri, 2014) və sentrosom zülalı 120 ( CEP120) centriolar divarda (Mahjoub et al., 2010). Buna görə də, sentrozomlar üçün ümumi bir homeostatik baxım proqramının (Qutu 1) mövcud olduğu bir mənzərə ortaya çıxır ki, bu da həm dövran edən hüceyrələrdəki sabitliklərinin (Izquierdo et al., 2014), həm də bəzi toxumalarda, məsələn, oositlərdə müəyyən dərəcədə qeyri-sabitliyinin əsasını təşkil edə bilər. , neyronlar və epitel hüceyrələri (Pimenta-Marques et al., 2016 Yonezawa et al., 2015 Muroyama et al., 2016).

Sentrosomların homeostatik baxım proqramı onun strukturunun PCM, sentriol divarları və sentriol çarxı kimi kritik aspektlərindən asılıdır və CDK və PLK kimi hüceyrə dövrü tənzimləyicilərinin nəzarəti altındadır (Yang və Feldman, 2015 Muroyama et al. ., 2016). Bu kinazların sentrozomun biogenezini, olgunlaşmasını və funksiyasını tənzimlədiyi məlumdur, onlar müvafiq olaraq mitozun sonunda siklosom (APC/C) kimi tanınan anafaza təşviq edən kompleks tərəfindən pozulur və ya təsirsiz hala gətirilir (Ferris et al., 1998 Glotzer) və başqaları, 1991 Lindon and Pines, 2004 Murray, 1989). Aktiv mitotik sentrozom üçün CDK və PLK-ların yüksək aktivliyi tələb olunur, halbuki bu kinazların aşağı aktivliyi çox vaxt interfazada olan və ya hüceyrə dövründən çıxmış hüceyrələrin sentrosomları ilə əlaqələndirilir. Nəhayət, sentrozom tam təsirsizləşdirildikdə bu kinazaların heç bir fəaliyyəti müşahidə edilmir, bu da tez-tez sentriol itkisi ilə əlaqələndirilir (Şəkil 2A).

Daha sonra sentrozoma baxım proqramının müxtəlif komponentlərini daha ətraflı müzakirə edəcəyik.

İnsan becərilmiş hüceyrələrində, CEP295-in çıxarılması ilə sentrozomlara yetişməsi maneə törədilmiş yeni əmələ gələn sentriollar, çarxın itməsi ilə dövrün sonunda sökülür (Izquierdo et al., 2014). PLK1-in inhibəsi araba çarxını saxladı (Wang və digərləri, 2011) və yetişməmiş sentriolların itkisini xilas etdi (Izquierdo et al., 2014). Yetişmiş sentriollar, normal olaraq hüceyrə dövrünün sonunda araba çarxını itirsələr də, PCM-yə malik olduqları üçün sökülmürlər. Bu, həm PCM, həm də araba çarxının sentriollara sabitlik vermək və sentrozom qorunmasında bir-birini kompensasiya etmək üçün lazımsız olduğunu göstərir. Belə bir artıqlıq bütün növlərdə və/və ya toxumalarda olmaya bilər. S mərhələsində həbs olundu Drosophila hüceyrələr, dörd əsas PCM zülalının (SPD-2, CNN, Asl və D-PLP) və ya Polo (PLK1-in ortoloqu) tükənməsi sentriol sayının azalmasına səbəb olmaq üçün kifayət idi və sentrosomların homeostatik olaraq qorunduğunu nümayiş etdirdi. onların komponentlərinin yenilənməsi (Pimenta-Marques et al., 2016).

Centriole divar komponentləri və onların post-translational modifikasiyaları da sentriol sabitliyi üçün vacibdir. Tubulin qlutamilasiyasına (α-GT335) qarşı bir antikorla enjeksiyon və ya elektroporasiya sentriolların və sentrozomların yox olması ilə nəticələndi (Bobinnec et al., 1998). Bu halda, sentriollar və diskret sentrosomlar nəticədə hüceyrə populyasiyasında yenidən meydana çıxdı, lakin bəzi sentriollar normal sentriollara xas olan MT üçlüyü (Bobinnec et al., 1998) itkisini nümayiş etdirdi (Şəkil 1A). Mümkündür ki, qlutamilasiya özü sentriolyar MT strukturunu sabitləşdirir və ya stabilizatorların bağlanmasını təşviq edir. Bu qeyddə göstərilmişdir ki, həm glutamilləşdirilmiş tubulin, həm də perisentrin ilə qarşılıqlı əlaqədə olan, bununla da sentriolun PCM ilə əlaqəsi olan ATF5-in aşağı tənzimlənməsi sentrosomda PCM-nin yığılmasını bloklayır və sentriolların parçalanmasına səbəb olur (Madarampalli et al., 2015). ). Centrobin, sentriolyar tubulinə bağlanan və normal olaraq qız sentriolları ilə əlaqəli olan başqa bir amil (Gudi və digərləri, 2011 Zou və digərləri, 2005), sentriolun uzanmasını təşviq edir və mədəniyyətli velosiped hüceyrələrində PCM cəlb edilməsinin qarşısını alır. Dominant-mənfi sentrobinin ifadəsi sentriolsuz hüceyrələrin sayının artmasına səbəb oldu (Gudi et al., 2011). Nəhayət, müəyyən növlərdə sentriollarda tapılan δ- və ε-tubulinlər üçlü MT-lərin əmələ gəlməsinə və/və ya sabitliyinə kömək edir (Winey və O'Toole, 2014-cü ildə nəzərdən keçirilmişdir). Hamısı birlikdə, bu tədqiqatlar təkər çarxı, sentriol divarları (tubulin və sentrobin funksiyasının translasiyadan sonrakı modifikasiyaları daxil olmaqla) və sentriol sabitliyini dəstəkləmək üçün PCM arasında qarşılıqlı əlaqənin olduğunu göstərir.

Son tədqiqatlar göstərir ki, PCM-nin inaktivasiyası planlaşdırılan sentrozom inaktivasiyasına (məsələn, neyronlarda, əzələ və epitel hüceyrələrində) və ya hətta onların tamamilə yox olmasına (məsələn, oositlərdə, Şəkil 2A) gətirib çıxarır. Əvvəlcə Huettner tərəfindən 1933-cü ildə müşahidə edilmiş, indi məlumdur ki, bir çox növlərin oositləri meioz zamanı sentrosomlarını itirirlər (Huettner və Rabinowitz, 1933 Manandhar et al., 2005), bu, müxtəlif orqanizmlərdə müxtəlif yollarla əldə edilir (bax. Haşiyə 2). In Drosophila, erkən oogenez zamanı bunlardan bir-birinə bağlı olan 16 hüceyrədən ibarət kista əmələ gəlir, biri oosit olur və hüceyrələrarası sentriol miqrasiyası ilə bütün sentriolları miras alır, nəticədə 64 sentrioldan ibarət böyük MTOC yaranır. Polo və SPD-2 kimi bəzi PCM komponentləri sentriollar yoxa çıxmazdan əvvəl transkripsiya ilə aşağı tənzimlənir (Jambor et al., 2015). Bu, oosit MTOC-dan Polo və PCM zülallarının itirilməsi ilə əlaqələndirilir, ardınca yumurta bölünməzdən əvvəl sentriol yox olur (Pimenta-Marques et al., 2016). Polonun oogenezdə sentriollara məcburi lokallaşdırılması PCM-nin saxlanması və nəticədə sentriolların davamlılığı ilə nəticələndi (Pimenta-Marques et al., 2016) (Şəkil 2A). Oositlərdəki bu tapıntılar yeni sintez edilmiş Polo və PCM komponentlərinin sentrozoma aktiv şəkildə cəlb edilməsinin vacibliyinə işarə edir ki, bu da söndürülə bilən tənzimlənən homeostatik baxım proqramının mövcudluğunu daha da dəstəkləyir.

Sentrosomlar metazoa növlərinin əksəriyyətinin oositlərindən xaric edilir (Manandhar et al., 2005), mayalanmadan sonra düzgün sayda sentrozom əldə etməyə imkan verir.Meyvə milçəklərində, qurdlarda və insanlarda sentriollar meiotik bölünmədən əvvəl məhv edilir, bu növlərdə bir neçə acentriolar bölmədən biridir (Delattre və Gönczy, 2004 Manandhar et al., 2005 Cunha-Ferreira et al., 2009 Mikeladze-Dvali et al. ., 2012). In Drosophila, oogenez zamanı söndürülən Polo və PCM-dən asılı olan sentrozom baxım proqramı aydınlaşdırıldı (Pimenta-Marques et al., 2016 müzakirə üçün əsas mətnə ​​baxın). Bəzi növlərdə sentriollar meyotik bölünmələr zamanı qütb cisimlərinin içərisində ekstruziya yolu ilə DNT ilə birlikdə xaric edilir, məsələn, yalnız bir cüt sentriol ehtiva edən salyangoz oositlərində (Krioutchkova et al., 1994). Maraqlıdır ki, echinodermlər (dəniz kirpisi, dəniz ulduzu və dəniz xiyar) sentriolları aradan qaldırmaq üçün hər iki strategiyadan istifadə edirlər: ekstruziya və aradan qaldırılması. Bu növlər meioza I milinin hər qütbündə bir olan iki cüt sentriolla daxil olurlar. Bir cüt qütb gövdəsi I (PBI) vasitəsilə ekstrüde edilir. Daha sonra, bunların meiosis II-nin mil qütblərində tək sentriollar mövcuddur, MT nüvə qabiliyyətinə malik olan ana, yetkin yumurtada tək sentriol buraxaraq PBII ilə ekstrüde edilir (Borrego-Pinto et al., 2016). və başqaları, 1990 Miyazaki və başqaları, 2005 Nakashima və Kato, 2001). Qalan sentriol sonda aradan qaldırılır, lakin bunun necə əldə edildiyi dəqiq bilinmir. Əgər sentriollar süni şəkildə saxlanılırsa, onlar təsirsiz hala salına bilməz, nəticədə çoxqütblü zigotik millər yaranır (Borrego-Pinto et al., 2016). Saxlanılan qız sentriol MT-ni nüvələşdirmir, ola bilsin ki, PCM-nin qeyri-kafi səviyyələri səbəbindən sentriolun stabilləşməsinə səbəb ola bilər. Bəlkə də ana və qız sentriolları müxtəlif yollarla aradan qaldırılmalıdır, çünki bu hüceyrələrin PCM-ni aktiv şəkildə çıxarmaq üçün heç bir mexanizmi yoxdur. Fərqli növlərin sentrozom baxım proqramlarını təsirsiz hala gətirmək və sentrozomun aradan qaldırılmasına nail olmaq üçün oxşar mexanizmlərdən istifadə edib-etmədiyini anlamaq üçün gələcək tədqiqatlara ehtiyac var.

İnsan bədənində sentrosomların ya qismən, ya da tamamilə təsirsiz olduğu bir neçə başqa hüceyrə nümunəsi var. Bu halların bəzilərində sentriollar davam edir, digərlərində isə qəti sübut yoxdur. Məsələn, skelet əzələsinin differensiasiyası zamanı sentriollar mioblastların birləşməsi nəticəsində inaktivləşərək sinsitial miyotublar əmələ gəlir. Burada γ-tubulin, perisentrin və ninein kimi zülallar nüvə zərfində nesprin tərəfindən tutulur, onlardan MT-lər nüvələşir və uzanır, nəticədə hüceyrənin uzun oxu boyunca uzununa MT dəstələri əmələ gəlir (Tassin et al., 1985 Espigat-Georger et al., 2016). Hipokampal neyronların fərqləndirilməsində sentrozomun inaktivasiyası sentrozomdan γ-tubulin, perisentrin və sentrin itkisi ilə əlaqələndirilir (Stiess et al., 2010). MT-lər mövcud MT-lərdən augmin- və γTuRC-dən asılı nüvələşmə ilə əmələ gəlir. Bu, aksonlarda vahid artı-sonlu MT polaritesini təmin edir (Sánchez-Huertas et al., 2016). Bununla belə, həm əzələlərdə, həm də neyronlarda sentriolların nəhayət yox olub-olmadığı və sentrozom aktivliyi qorunub saxlanılsa nə baş verəcəyi aydın deyil.

Epitelial differensiasiya zamanı sentrosomlar tez-tez acentrosomal MTOC-lar qurulduqda hüceyrədə əsas MTOC olmaqdan çıxır. CDK1 fəaliyyətinin itirilməsi bu dəyişiklik üçün əsas tetikleyici kimi görünür (Muroyama et al., 2016). Maraqlı bir nümunə burada məməlilərin epidermisinin proliferativ bazal hüceyrələridir, MT-lər diferensiasiya zamanı hüceyrə qabığına toplanır. Hüceyrə dövründən çıxdıqda CDK1 aktivliyinin itirilməsi sentrosomlarda və hüceyrədə bir sıra dəyişikliklərlə nəticələnir. MT-lər sentrozomda CDK5RAP2-γ-TuRC kompleksləri ilə nüvələnməyə davam edir, halbuki bu sistemdə MT-nin bərkidilməsi üçün tələb olunan Nedd1-γ-TuRC kompleksləri sentrosomlardan sürətlə delokalizasiya olunur və astral MT konfiqurasiyasının itirilməsinə səbəb olur (Şəkil 2). 2A) (Muroyama, et al., 2016). Bu tədqiqat göstərir ki, γ-TuRC-lərin müxtəlif populyasiyaları fərqli funksiyalara malikdir və fərqli şəkildə tənzimlənir. Bu hüceyrələrdə sentrosomal MTOC fəaliyyətinin itirilməsi sentrosomlardan perisentrin və γ-tubulinin itkisi ilə əlaqələndirilir, lakin sentriollar tamamilə aradan qaldırılmır (Şəkil 2A) (Muroyama et al., 2016). Eynilə, hüceyrə diferensiasiyası zamanı C. elegans embrion bağırsaq hüceyrələri, MTOC funksiyası CDK-1-in aşağı tənzimlənməsindən sonra apikal membrana yenidən təyin olunur. Maraqlıdır ki, bu halda hüceyrələr diferensiasiyadan sonra bölünə bilir. Centrosomal MTOC-un yenidən aktivləşdirilməsi konservləşdirilmiş sentrozom zülal mili qüsurlu zülal 2 (insanlarda SPD-2 CEP192) və mitotik CDK fəaliyyətindən (Yang və Feldman, 2015) asılıdır.

Birlikdə götürüldükdə, PLK1 və CDK1 kimi kinazların həm sentrozom fəaliyyətinin tənzimləyicisi, həm də saxlanması kimi fəaliyyət göstərməsi mümkündür ki, bu da bəzi hallarda hər iki proses arasında aydın sərhədlərin yaradılmasını çətinləşdirir (Muroyama et al., 2016). Mitozda PLK1 və CDK1-in yuxarı tənzimlənməsi sentrozomun yetişməsinə və MT nüvələrinin artmasına səbəb olur. Bununla belə, onların interfazada və bir çox fərqli hüceyrələrdə olması sentrozomun saxlanması və hətta nüvələşməsi üçün zəruridir, onların olmaması sentrozomun inaktivasiyasına və yox olmasına səbəb olur. Drosophila (Şəkil 2A). Gələcək iş, ümid edirəm ki, bu proqramın transkripsiya və transkripsiyadan sonrakı səviyyədə necə tənzimləndiyini və PCM və sentriol zülallarının əslində nə qədər dinamik olduğunu açıqlayacaq.


Kirpiklərə qulluq

Fərqli orqanizmlər və hüceyrə tipləri kirpiklərin struktur və funksional saxlanmasını fərqli şəkildə tənzimləyir. Müəyyən uzunömürlü diferensiallaşmış hüceyrələrdə fotoreseptorlar kimi sabit kirpiklər olsa da, kirpiklərin velosiped sürən hüceyrələrdə yığılıb sökülməsi məlumdur (Şəkil 2B). Fotoreseptorun xarici seqmenti (dəyişdirilmiş kirpik) bir neçə gün ərzində tamamilə dəyişdirilir və buna görə də davamlı baxım tələb olunur (Besharse və Hollyfield, 1979 Hsu et al., 2017). Siliumun həm struktur, həm də siqnal bölməsi kimi bütövlüyü onun funksiyası üçün vacibdir (Şəkil 2B). Çox güman ki, strukturu daha möhkəm edən modifikasiyalar, eləcə də siliyer komponentlərin sintezi və onların kirpiklərə daşınması onların saxlanması üçün vacib amillərdir (həmçinin Haşiyə 3-ə bax). Sentriollara gəldikdə, tubulinin translyasiyadan sonrakı modifikasiyaları kirpiklərdə aksonemal MT-lərin sabitləşməsində rol oynayır. Tubulin deqlutamilaza CCPP-1-də mutasiya C. elegans aksonemal MT-lərin mütərəqqi degenerasiya fenotipinə gətirib çıxarır (O'Hagan et al., 2011). Bu qurdlar erkən sürfə mərhələlərində normal kirpiklər əmələ gətirir, lakin zamanla kirpik qüsurları yaranır (O'Hagan et al., 2011). Siçanda retinanın inkişafı üçün tubulin qlisilasiyası tələb olunmur, lakin tubulin qlutamilasiyası və qlisilasiyası düzgün balanslaşdırılmadıqda fotoreseptorlar yaşla degenerasiyaya uğrayır (Bosch Grau et al., 2017) (Şəkil 2B). Müəlliflər bu fenotipin fotoreseptorun mexaniki yükə uyğun şəkildə uyğunlaşa bilməməsi ilə əlaqəli olduğunu təklif edirlər (Bosch Grau et al., 2017).

Homeostatik kirpiklərin saxlanmasına dair vacib məlumatlar iki flagelli yaşıl yosunlardan gəldi. Chlamydomonas reinhardtii. Xlamidomonas flagella (bundan sonra kirpiklər adlandırılacaq) biokimyəvi cəhətdən təcrid edilə bilər (Witman və digərləri, 1972) və 1970-ci illərin sonundan etibarən kirpikləri kəskin şəkildə sökməyə imkan verən temperatura həssas mutantlar kolleksiyası mövcuddur (Huang et al., 1977) . Bu alətlər siliyaların saxlanmasında iştirak edən genlərin və mexanizmlərin müəyyən edilməsinə səbəb oldu. Xüsusilə, əvvəllər təsvir edilmiş siliardaxili "hərəkətliliyin" (Kozminski və digərləri, 1993) kinesinlə idarə olunan motor hərəkətindən asılı olduğu göstərilmişdir (Kozminski və digərləri, 1995). Bu hərəkətlilik indi intraflagellar nəqliyyat (IFT) adlanır və 22 subunitdən ibarət zülal kompleksindən ibarət olduğu bilinir (Piperno et al., 1998 Taschner və Lorentzen, 2016 Vashishtha et al., 1996). İFT-nin kəskin şəkildə çıxarılması kirpiklərin rezorbsiyasına gətirib çıxarır ki, bu da bu kompleksin kirpiklərin saxlanması üçün vacib olduğunu nümayiş etdirir. Canlı görüntüləmə və modelləşdirmə, kirpiklərin uzunluğunun tubulin dövriyyəsi vasitəsilə dinamik şəkildə idarə olunduğunu ortaya qoydu (Marshall və Rosenbaum, 2001 Marshall et al., 2005). IFT-nin bloklanması ucunda yeni tubulinin əlavə edilməsinin qarşısını alır və kirpiklərin qısalmasına səbəb olur (Marshall və Rosenbaum, 2001). Lakin, cəmi 12 il sonra, tubulinin əslində bir neçə növdə vicdanlı IFT yükü olduğu nümayiş etdirildi (Bhogaraju et al., 2013). Əsas IFT komponentləri digər növlərdə qorunur və mutasiyaya uğradıqda insan patologiyalarında görünənlərə bənzər fenotiplərə səbəb ola bilər (Pazour və digərləri, 2000, 2002). Kirpiklərdə zülal tərkibinin saxlanması isə tubulin nəqlindən kənara çıxır: bütün aksonemal və membran zülallarının 20%-i 6 saat ərzində çevrilir. Xlamidomonas (Song və Dentler, 2001). Bunlardan ən azı bəziləri IFT yükləri ola bilər ki, bu da IFT-nin uzunluqdan başqa əlavə siliyer xüsusiyyətlərini saxladığını göstərir. Ancaq bu yaxınlarda nümayiş olundu ki, hamısı deyil Xlamidomonas zülallar siliyer lokalizasiyası üçün IFT-dən asılıdır (Harris et al., 2016). Bu, siliyer xassələrin həm IFT-dən asılı, həm də IFT-dən asılı olmayan mexanizmlər vasitəsilə saxlanılması imkanını açır.

Centrioles üçün olduğu kimi, kirpiklərin saxlanması da siliyer komponentlərin davamlı transkripsiyasını və tərcüməsini tələb edir. Bunun sübutu burada siçanlarda fotoreseptorların saxlanmasında miRNA-ların rolu ilə bağlı araşdırmadan gəlir, miRNA182 və miRNA183-ün silindiyi heyvanlar doğulduqdan sonra ilk həftələrdə tam funksional fotoreseptorlar əmələ gətirir, lakin onlar həmin hüceyrələrin saxlanmasında xüsusi qüsurlar nümayiş etdirirdilər ( Busskamp et al., 2014). Eyni tədqiqatda miRNA182 və miRNA183-ün bir sıra gen hədəfləri kirpiklər və/yaxud sentrozomlarla əlaqəli olaraq qeyd edilmişdir və beləliklə, fotoreseptorların və daha ümumi olaraq kirpiklərin saxlanması üçün müvafiq ola bilər (Şəkil 2B). Bundan əlavə, şiş bastırıcı gen VHL-nin nüvə fəaliyyəti böyrəklərdə kirpiklərin saxlanması ilə əlaqələndirilmişdir (Thoma et al., 2007). Burada VHL-nin itirilməsi və sonradan kirpiklərin reabsorbsiyası hüceyrələrin hüceyrə dövrünə yenidən daxil olmasına imkan verir və kist əmələ gəlməsinə səbəb olur (şəkil 2B). Bununla belə, VHL-nin hansı genlər vasitəsilə kirpiklərin saxlanmasına nəzarət etdiyi bəlli deyil.

Çox güman ki, IFT həm siliyer quruluşun, həm də siqnal bölməsi kimi siliumun bütövlüyünün saxlanmasında mühüm rola malikdir (Qutu 3). IFT, FRAP təcrübələri və digər canlı hüceyrə görüntüləmə üsulları ilə göstərildiyi kimi, hətta tam formalaşmış kirpiklərdə də daim baş verir (Hu və digərləri, 2010 Milenkovic və digərləri, 2015 Trivedi və digərləri, 2012 Ye və digərləri, 2013). Yaşıl yosunlarda IFT-nin inhibəsi əvvəlcə normal fəaliyyət göstərən kirpiklərin qısalmasına səbəb oldu (Marshall və Rosenbaum, 2001 Marshall et al., 2005). Bu, flagella uzunluğunu qorumaq üçün siliyer zülalların daim doldurulması lazım olduğu fikrini qaldırdı (Marshall et al., 2005). Həqiqətən, IFT-nin gen silinməsi ilə xüsusi olaraq yetkin siçanların retinasında çıxarılması fotoreseptor degenerasiyasına gətirib çıxarır (Jiang et al., 2015). IFT yükləri arasında siliyer aksonemin əsas komponenti olan tubulinin müxtəlif növlərdə IFT kompleks zülalları IFT81 və IFT74 (Bhogaraju et al., 2013) və birbaşa kinesin-2 tərəfindən daşındığı müəyyən edilmişdir. Drosophila, bu IFT alt bölmələrinə malik olmayan (Girotra et al., 2017 van Dam et al., 2013). Bununla belə, bütün sistemlər kirpiklərə qulluq üçün IFT-dən eyni dərəcədə asılı ola bilməz, çünki tam formalaşmış flagella Tripanosoma IFT vasitəçiliyi ilə hərəkətliliyi göstərir, lakin bu halda, IFT kompleksi onların struktur bütövlüyünü deyil, yalnız bayraq funksiyasını qorumaq üçün tələb olunur (Fort et al., 2016). Əlavə olaraq, Drosophila sperma nə biogenez, nə də baxım üçün İFT-yə ehtiyac duymur (Han et al., 2003 Sarpal et al., 2003) və IFT yetkin siçan spermasında yoxdur və buna görə də onun saxlanılması üçün tələb olunmur (San Agustin et al., 2015). ). IFT-nin baxım siliya funksiyasını necə tənzimlədiyinə dair əlavə məlumatı kirpi siqnalından əldə etmək olar. Bir çox digər siqnal yolları kimi, kirpi siqnalı da kirpikləri tələb edir (Bangs and Anderson, 2017). Hamarlanmış G-proteinlə birləşmiş reseptor, siliyer membrana yerləşdikdə kirpi siqnalını işə salır. Siçanlarda, IFT27-dən yumşaldılmış kirpikləri xaricə çıxararaq, sönük vəziyyətdə saxlamaq üçün tələb olunduğu göstərildi (Eguether et al., 2014), lakin IFT27 tez-tez kirpikli növlərin genomlarından itirilir (van Dam et al. , 2013). IFT27 kirpi funksiyası üçün tələb olunduğundan (Eguether et al., 2014), IFT-nin bu sistemlərdə kirpi siqnal qabiliyyətini saxlaması ehtimalı azdır. Əslində, in Drosophila, kirpi siqnalı əsasən kirpiklərdən müstəqildir (Han et al., 2003 Sarpal et al., 2003), qoxu almadakı rolu istisna olmaqla (Kuzhandaivel et al., 2014 Sanchez et al., 2016). Bu, IFT tərəfindən qorunan xassələrin növlərdən asılı olduğunu və bəlkə də bir orqanizmdə kirpiklər arasında dəyişdiyini göstərir.

Siliar baxımda İFT-nin rolu siliyer kökcük tərəfindən də tənzimlənə bilər. In C. elegans kökcüklər əmələ gətirməyən, lakin kirpiklər və IFT komplekslərini birləşdirən rootletin mutantları (Mohan et al., 2013), IFT hissəcikləri daha aşağı sürətlə hərəkət edir və kirpiklər nəticədə degenerasiyaya uğrayır. In Drosophila, rootletin mutantlarında heç bir struktur qüsur tapılmadı, lakin siliyer disfunksiya da müşahidə edildi (Chen et al., 2015). Bu tapıntılar göstərir ki, siliyer kökcük kirpiklərin funksiyasının homeostatik saxlanması üçün tələb olunur, lakin onun struktur bütövlüyü üçün deyil. Gələcəkdə hansı IFT yüklərinin onun siqnal imkanları ilə müqayisədə siliya strukturunu saxlamaq üçün vacib olduğunu, həmçinin daşınmanın köklər tərəfindən necə tənzimləndiyini anlamaq vacib olacaq.

Nəhayət, bu yaxınlarda kirpiklərin aktindən asılı şəkildə hüceyrədənkənar veziküllər (çox vaxt ekzosomlar adlanır) istehsal etdiyi göstərildi (Nager et al., 2017). Bu ekzosomlar bioloji aktivdir və yumurtadan çıxma üçün tələb olunur Xlamidomonas (Wood et al., 2013) və ya fərdlər arasında ünsiyyətdə istifadə olunur C. elegans (Wang et al., 2014). Ekzosomlar həmçinin aktivləşdirmədən sonra kirpikləri qeyri-aktiv vəziyyətə qaytara bilər (Nager et al., 2017) və digər siliyer xüsusiyyətlərin qorunmasında iştirak edə bilər.


Nek kinazların və sentriolların birgə təkamülü

Birhüceyrəli biflagellatın bir neçə deflagellation-qüsurlu mutant suşları Xlamidomonas mutasiyaları daşıyır FA2 ('bayraq autotomiyası' üçün), bir Nek kodlayan bir gen (Mahjoub et al., 2002). Deflagellation (həmçinin desiliasiya kimi tanınır) kirpiklərin öz bazasında kəsilərək ətraf mühitə töküldüyü kalsium vasitəçiliyi ilə yaranan stress reaksiyasıdır (Quarmby, 2004-cü ildə nəzərdən keçirmişdir). Hüceyrə dövrü funksiyaları ilə tanınan ailənin üzvü nə üçün mühüm siliyer yoldan məsuldur? The fa2-null mutasiya ölümcüllükdən daha çox G2-M-də (Mahjoub et al., 2002) hüceyrə dövrü gecikməsi yaradır ki, bu da ehtimal ki, Nek ailəsinin başqa bir üzvünü əhatə edən kompensasiya yolunun mövcud olduğunu göstərir. Həqiqətən, birhüceyrəli göbələklər də daxil olmaqla bir neçə mikrob eukariotunun ailənin yalnız bir və ya iki üzvü olduğu halda (O'Connell et al., 2003 tərəfindən nəzərdən keçirilmişdir), Xlamidomonas ekspres 10 Neks (Bradley et al., 2004) (B. Bradley və L.M.Q., nəşr olunmamış). Göbələklərin nə sentriolları, nə də kirpikləri olmadığından, Nek ailəsinin kirpikli orqanizmlərdə genişləndiyini və hüceyrə dövrü ilə kirpikləri koordinasiya etdiyini fərz etdik (Bradley və digərləri, 2004 Quarmby və Parker, 2005).

Bir neçə orqanizmin genomlarının tədqiqi konkret orqanizmdə Nekslərin sayı ilə onun kirpikli hüceyrələrin olub-olmaması arasında korrelyasiya olduğunu aşkar edir (şək. 2). DrosophilaCaenorhabditis elegans kirpikli hüceyrələrə malikdir və buna görə də təmsil olunan yüksək bitkilərdən daha çox Neks olması gözlənilə bilər Ərəbidopsis, kirpikli hüceyrələri olmayan. Ancaq biz bunu iddia edirik, çünki içindəki tək kirpikli hüceyrələr DrosophilaC. elegans terminal differensiasiya olunur, bu orqanizmlər kirpikləri və hüceyrə siklini əlaqələndirmək məcburiyyətində deyillər (yəni onların həm bazal cisimlər, həm də mikrotubulların təşkili mərkəzləri kimi xidmət edən sentriolları yoxdur). Həqiqətən, hüceyrə dövrünə yenidən daxil olan kirpikli hüceyrələrə malik olan orqanizmlərə `1' təyin edildiyi və daxil olmayan orqanizmlərə '0' təyin edildiyi binar yanaşmadan istifadə edərək, Continuous v1 təkamül proqramından istifadə edərək bu fərziyyəni sınaqdan keçirdik. .0d13 PPC (Pagel, 1994). Nek genlərinin sayının və kirpikli hüceyrələrin bölünmə qabiliyyətinin müstəqil şəkildə təkamül etdiyi bir modelin iki əlamətin əlaqəli şəkildə inkişaf etdiyi alternativ bir modellə müqayisəsinin nəticəsi hipotezimizi güclü şəkildə dəstəkləyir (P=0,01). Biz təklif edirik ki, ali zavodlarda çoxlu sayda Neks əhəmiyyətli sub- və neo-funksionalizasiyanı əhatə edən müstəqil genişlənmənin nəticəsidir. Başqa sözlə, ali bitkilərdə bu kinaz ailəsi ata-baba funksiyaları ilə əlaqəli olmayan hüceyrə fəaliyyətinin xidmətində birləşdirilib genişlənmiş ola bilər. Buna uyğun olaraq, daha yüksək bitki Nekslərin digər orqanizmlərin Nekslərindən fərqli bir təbəqəyə düşməsi tapılır (Şəkil 1C).


Müəllif məlumatı

Giulia Pollarolo və Joachim G Schulz: Bu müəlliflər bu işə bərabər töhfə verdilər.

Əlaqələr

Molekulyar və İnkişaf Genetikası Departamenti, Vlaams Instituut for Biotechnologie, Campus Gasthuisberg, Leuven, Belçika

Giulia Pollarolo, Joachim G Schulz, Sebastian Munck və Carlos G Dotti

Katholieke Universiteit Leuven İnsan Genetika Mərkəzi, Kampus Gasthuisberg, Leuven, Belçika

Giulia Pollarolo, Joachim G Schulz, Sebastian Munck və Carlos G Dotti

Centro de Biologìa Molecular Severo Ochoa, Universitad Autonoma de Madrid, Madrid, İspaniya

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Siz həmçinin bu müəllifi PubMed Google Scholar-da axtara bilərsiniz

Töhfələr

G.P.: eksperimental dizayn, məlumatların toplanması və yığılması, məlumatların şərhi, əlyazmaların yazılması. J.G.S.: eksperimental dizayn, məlumatların yığılması və şərhi, əlyazmaların yazılması. S.M.: texniki və görüntüləmə yardımı, məlumatların təhlili. C.G.D.: layihəyə rəhbərlik və koordinasiya, əlyazma yazmaq və redaktə etmək. J.G.S. və C.G.D.: layihəyə nəzarət.

Müvafiq müəlliflər


Materiallar və metodlar

Uçuş ehtiyatları, antikorlar və immunofluoressensiya

Bu tədqiqatda istifadə edilən milçək ehtiyatları daha əvvəl təsvir edilmişdir: vəhşi tip Oreqon R, GFP-Sas6 (Peel və digərləri, 2007), GFP-Ana2 (Stevens və digərləri, 2010a) və bld10c 04199 (Cep135Δ) (Mottier-Pavie və Megraw, 2009). Təhlil edilən bütün mutant toxumalar həm ana, həm də ziqotik olaraq mutant idi (yəni onlar homozigot mutant analardan əldə edilən homozigot mutantlardan götürülmüşdür), burada testislər homozigot və heterozigot dişilərin qarışığından əldə edilən milçəklərdən götürülən yetkin yetkin testislər istisna olmaqla.Burada yaradılan bütün transgen xətlər, bütün toxumalarda orta səviyyədə ifadəni idarə edən Ubiquitin promotorunun nəzarəti altında Cep135/Bld10-un GFP- və ya RFP-füzyonlarını ifadə etdi (Lee et al., 1988). İmmunofluoressensiya analizi üçün biz aşağıdakı anticisimlərdən istifadə etdik: Dovşan anti-Cep135 (bu tədqiqat 401-700 amin turşularına qarşı qaldırılmışdır. Drosophila Cep135/Bld10 kodlaşdırma ardıcıllığı) Qvineya-donuz anti-Asl (bu tədqiqat Astersiz kodlaşdırma ardıcıllığının 1-333 amin turşularına qarşı qaldırılmışdır) Dovşan anti-Cnn (Lucas və Raff, 2007). İstifadə olunan ikincil antikorlar Alexa 488 anti-Dovşan və Alexa 568 anti-Qvineya Donuzları idi. Yetkin milçəklərin testisləri daha əvvəl təsvir edildiyi kimi parçalandı və sabitləndi (Dix və Raff, 2007). Testislər 100×/1.40 Oil UPlanSApo obyektivi ilə Olympus Flouview FV1000-də təsvir edilmişdir. ImageJ istifadə edərək şəkillər emal edildi və sentriollar ölçüldü.

Nümunə hazırlamaq, elektron tomoqrafiya və immuno-elektron mikroskopiya

Testislər üçün nümunə hazırlığı daha əvvəl təsvir edilmişdir (Stevens et al., 2010b). 3-cü dövr sürfələrindən olan qanad diskləri PBS-də parçalanmış və testislərə bənzər şəkildə hazırlanmışdır. Embrionlar meyvə şirəsi boşqablarında 1 saat toplanmış və 1 saat yaşlanmışdır. Erkən sinsitial embrionlar əvvəllər təsvir edildiyi kimi işlənmişdir (Dzhindzhev et al., 2010). İmmunoqramma və elektron tomoqrafiya əvvəllər təsvir edildiyi kimi aparılmışdır (Stevens et al., 2010b). İmmunobelinq üçün əsas antikorlar Rabbit anti-Asterless (Stevens et al., 2009) və ya Rabbit anti-Cep135 (bu tədqiqat) idi. İstifadə olunan ikincil antikor 10 nm Qızıl Konjugasiya Keçi Anti-Dovşan (Invitrogen) idi. Tilt seriyaları SerialEM (Mastronarde, 2005) və IMOD paketindən istifadə edərək yenidən qurulan tomoqramlar (Kremer et al., 1996) istifadə edərək əldə edilmişdir.

3D-strukturlaşdırılmış işıqlandırma mikroskopiyası

3-cü dövr sürfələrinin xaya və qanad disklərinin nümunələri kiçik dəyişikliklərlə immunofluoressensiyaya hazırlıq kimi 3D-SIM üçün hazırlanmışdır. Testislər və qanad diskləri örtüklərə əzilmiş və sabitlənmişdir. İstifadə edilən antikorlar Dovşan anti-Asl (Stevens və digərləri, 2009), Rabbit anti-DSpd2 (Dix və Raff, 2007), Dovşan anti-PLP (Martinez-Campos et al., 2004) idi. İkinci dərəcəli antikorlar Alexa 590 anti-Rabbit (Invitrogen) və GFP-Booster (Chromotek) idi. Super rezolyusiyaya malik görüntüləmə üçün şəkil yığınları 100×, 1.4 NA neft obyektivi (Olympus) ilə OMX mikroskopunda (Tətbiqi Dəqiqlik) əldə edilib və SoftWorx proqram təminatından (Tətbiqi Precision) istifadə edilərək işlənib.

Məlumatların təhlili

GFP zülalının diametrləri profil intensivliyinə bir Guassian uyğunlaşdırmaq və Tam Genişlik Yarım Maksimum dəyərini çıxarmaqla ölçüldü. Astersiz borunun diametrləri ikiqat Qauss əyrisinin intensivlik profilinə uyğunlaşdırılması və hər iki zirvə arasındakı məsafənin ölçülməsi ilə ölçüldü. Quraşdırma Prism 5d proqram təminatından (GraphPad) istifadə etməklə həyata keçirilib. D'Agostino və Pearson omnibus testi ilə paylamalar Quassian paylamaları üçün sınaqdan keçirilmişdir. Dağıtımlar arasındakı əhəmiyyət cütləşməmiş tərəfindən sınaqdan keçirildi t Qauss paylanmaları üçün test və qeyri-Qauss paylanmaları üçün Mann-Whitney testi.