Məlumat

3.7: Zülal davranışının təhlili - Biologiya

3.7: Zülal davranışının təhlili - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Giriş

Bu gün siz vəhşi tipli və mutant zülallarınız üçün avtomatik flüoresan lövhə oxuyucusu istifadə edərək kalsiuma qarşı titrləmə əyriləri əldə edəcəksiniz. Çıxış A-G sətirləri və 1-12 sütunları üçün 96 flüoresan dəyərinə qədər olan şəbəkədir və Excel kimi bir proqramla təhlil edilə bilər.

Bu yüksək məhsuldarlıq test formatından daha çox faydalanmaq üçün siz təkrarlanan təcrübələr üçün rəqəmsal deyil, sırf mexaniki köməkçi olan çoxkanallı pipetlə dostluq edəcəksiniz. Bu alət yalnız bir vuruşla birdən çox eyni nümunənin (adətən 8-12 ədəd) ekvivalent həcmlərini udmağa və çıxarmağa imkan verir. Mikrotitr lövhəsinin hər sırasını bir növ protein nümunəsi və hər sütunu fərqli kalsium konsentrasiyası ilə doldurmaq üçün bu tip pipetdən istifadə edəcəksiniz. Çoxkanallı pipet tipik bir tədqiqat laboratoriyası üçün kifayət ola bilsə də, gündə minlərlə nümunəni təhlil edə bilən əczaçılıq şirkətlərində hələ də daha çox avtomatlaşdırma və miqyasını artırma addımları tələb olunur, məsələn, əl ilə pipetləmə ehtiyacını aradan qaldıran robotik pipet qolları. hamısı. Müəyyən bir laboratoriyada və ya korporasiyada kommersiya baxımından mövcud olan və ya “evdə” inkişaf etdirilən avtomatlaşdırma dərəcəsi qismən müəyyən analizin istifadə olunma tezliyindən asılıdır. Bir çox müxtəlif laboratoriyalar və şirkətlər tərəfindən istifadə edilən analizlər (məsələn, flüoresan və ya absorbans spektrofotometriyası) kommersiya baxımından yüksək məhsuldarlığa malik maşınları istehsal edə bilər.

Miqyas anlayışı praqmatik bir narahatlıq olsa da, bu gün bizi maraqlandıran bəlkə də daha əsaslı mövzu nəticələrimizə inamdır. Yəqin ki, yaxşı bildiyiniz kimi, laboratoriyada etdiyiniz hər manipulyasiya və ölçmədə onunla əlaqəli bir səhv var. Məsələn, hər yerdə mövcud olan P200 pipetmanını nəzərdən keçirək. Bir pipet istehsalçısına görə, onun dəqiqliyi 1% təşkil edir (ən aşağı həcmlərdə bir qədər pisdir). Beləliklə, 100 μL-ni pipetləmək cəhdi yalnız alətin səhvindən 99-101 μL-lik faktiki həcmlə nəticələnəcək ki, bu da yuxulu pipet operatoru tərəfindən daha da mürəkkəbləşdirilə bilər. Pipetin dəqiqliyi adətən onun dəqiqliyindən daha yaxşıdır, yuxarıda verilmiş nümunə üçün 0,25%. Dəqiqlik verilmiş ölçmənin mütləq dəqiqliyinə deyil, təkrar istehsalına aiddir. Bu sadə nümunə digər xəta növləri üçün tətbiq olunan ümumi prinsipləri nümayiş etdirir.

Zülal nümunələrinizi iki nüsxədə işlətməklə bugünkü təcrübənin ümumi səhvini anlamağa çalışacaqsınız. Yəni, hər bir protein-kalsium birləşməsi üçün iki müstəqil ölçmə aparacaqsınız. Bu ölçmələr daha sonra məlumatlarınızı hamarlaşdırmaq üçün orta hesabla götürülə bilər və ümid edirik ki, siqnalın səs-küyə nisbəti yaxşılaşacaq - burada siqnal müxtəlif miqdarda kalsium ilə qarışdırılmış nümunələr arasındakı həqiqi fərqlərə istinad edir və səs-küy səhv səbəbindən sistemə xas olan dalğalanmalar deməkdir. Bu təcrübədəki səs-küy nümunə tamponunun fon flüoresansına da aid ola bilər. Beləliklə, ağlabatan bir siqnal: səs-küy nisbətini qorumağın başqa bir yolu, zülalımızı kifayət qədər konsentrasiyada saxlamaqdır ki, əldə etdiyimiz mütləq flüoresan dəyərlər fonla müqayisədə yüksək olsun. Sağdakı rəqəm yuxarıdakı anlayışları nümayiş etdirir. Məlumatda səpilmə (dairələrin hamısı eyni hündürlükdə deyil) bir növ səs-küydür. Arxa fonun səviyyəsi başqa bir səs-küy növüdür: sol tərəfdəki məlumatlar nisbətən aşağı siqnal və beləliklə zəif siqnal: səs-küy nisbətinə malikdir, sağ tərəfdən isə nisbətən yüksək mütləq siqnal və təkmilləşdirilmiş siqnal: səs-küy nisbəti var.

Protokollar

Bu gün laboratoriyada eyni vaxtda yalnız 2-3 qrup işləyəcək. Sonuncu dəfə bir saatlıq blok üçün qeydiyyatdan keçməli idiniz.

1-ci hissə: Protein Gel Müşahidəsi

İstəyirsinizsə, Coomassie ilə ləkələnmiş gelinizə nəzər salın əvvəlki laboratoriya.

Uğur üçün məsləhətlər

Nümunələrinizdə qabarcıqların daxil olmasını məhdudlaşdırmaq üçün bu gün çox diqqətli olun. Maye xaric edərkən, pipet yavaş-yavaş pipetin ucuna quyunun dibinə və ya tərəfinə toxunarkən. Çoxkanallı pipetdən istifadə edərkən, həmişə bütün ipuçlarının doldurulduğuna əmin olun - bəzən bir ucluq bütün yolda olmaya bilər və digərlərinə nisbətən daha az səs çıxarır. Bu baş verərsə, mayeni buraxın, ucunu tənzimləyin və yenidən cəhd edin.

Protokol

  1. Qara 96 ​​quyu boşqab götürün və sağdakı sxemlə tanış olun: yuxarıdakı iki cərgə vəhşi tipli, sonrakı iki cərgə M124S mutantıdır və son iki cərgə sizin öz mutantınızdır.
    • Lövhənin qaranlıq tərəfləri bitişik quyulardakı nümunələr arasında "çarpaz söhbəti" (yəni işıq sızmasını) azaldır ki, bu da səhvə başqa bir potensial töhfədir.
  2. Yabanı tipli zülalın bir hissəsini plastik bir rezervuara köçürün. Plakanızın yuxarı iki sırasına 30 μL protein (hər quyuya) əlavə etmək üçün çoxkanallı pipetdən istifadə edin.
  3. Təzə bir rezervuar götürün və mutant zülallarınız üçün 2-ci addımı təkrarlayın, hər birini müvafiq olaraq etiketlənmiş sıralara əlavə edin.
  4. Nəhayət, ortaq ayrılmış rezervuardan istifadə edərək boşqabın yeddinci sırasına düz EB buferi (zülalsız) əlavə edin. (Sizcə niyə biz proteinsiz məhlullar sırasına daxil edirik?)
  5. Paylaşılan rezervuar 1-dən (ən aşağı kalsium konsentrasiyası) istifadə edərək, boşqabın birinci sütununda yuxarı yeddi sıraya 30 μL əlavə edin. Pipet uclarını atın.
  6. İndi 2-dən 12-ə qədər rezervuarlardan (ən yüksək kalsium konsentrasiyası) və boşqabınızdakı sol tərəfdən sağ sütunlara doğru hərəkət edin. Hər dəfə təzə pipet uclarından istifadə etdiyinizə əmin olun! Əgər məhlulu çirkləndirirsinizsə, müəllim heyətinə bildirin ki, onlar təzə məhlul çıxara bilsinlər.
  7. Nəhayət, lövhəni parafilmlə örtün və alüminium folqa ilə sarın.

Hissə 2: Flüoresan Təhlil

  1. BPEC (Bioloji Proses Mühəndisliyi Mərkəzi) bizə öz boşqab oxuyucularından istifadə etməyə icazə verdi. Müəllim heyətinin üzvü ilə BPEC alət otağına gedin.
  2. Zülalınızı təhlil etmək üçün boşqab oxuyucusunda həyəcan (485 nm) və emissiya (515 nm) dalğa uzunluğunu necə təyin edəcəyiniz göstəriləcək.
  3. Xam məlumatlarınız sizə göndəriləcək və ya e-poçtla göndəriləcək; alternativ olaraq, məlumatları dərhal bərpa etmək üçün öz flash sürücünüzü gətirə bilərsiniz.

Növbəti dəfə

  1. SDS-PAGE nəticələriniz üçün rəqəm və başlıq hazırlayın. IPC ardıcıllığı sənədindən və bunu onlayn istifadə edərək gözlənilən molekulyar çəkiyə baxın Protein Molekulyar Çəkisi alət (və ya oxşar) Veb saytı. pRSET-in N-terminusunun ölçüsü üçün ~ 3 KDa əlavə etməyinizə əmin olun (Onun etiketi və s.). Əgər siz iki güclü qrup görürsünüzsə, ikincisi nədir sizcə? Bu ev tapşırığı növbəti dəfə dərs zamanı qiymətləndiriləcək ki, siz istənilən şərhi yekun hesabatınıza daxil edə biləsiniz.

Həm anadangəlmə, həm də bioloji şəraitdə molekulları və birləşmələri çatdırmaq üçün müxtəlif mühəndislik proqramlarından istifadə edilmişdir. Bioloji tətbiqlər kontekstində molekulların vaxtında çatdırılması hüceyrə və orqan funksiyası üçün kritik ola bilər. Beləliklə, əvvəlki tədqiqatlar həll olunan zülalın ənənəvi çatdırılması ilə müqayisədə biomühəndislik iskelelərinə zülal bağlama yolu ilə uzunmüddətli protein çatdırılmasının üstünlüyünü nümayiş etdirdi. in vitroin vivo. Bu cür faydalara baxmayaraq, bu zülalların sabitliyi, sərbəst buraxılma kinetikası, uzunömürlülüyü, hüceyrədaxili yolun aktivləşməsi və zamanla funksionallığı ilə bağlı çox az məlumat mövcuddur. Nümunə olaraq, burada neyronların sağ qalmasına, differensasiyasına və neyrit morfogenezinə təsir etdiyi məlum olan zülalın, qlial mənşəli neyrotrofik amilin (GDNF) sabitliyini, deqradasiyasını və funksionallığını araşdırdıq. Fermentlə əlaqəli immunosorbent analizləri (ELISA) göstərdi ki, polikaprolakton (PCL) elektrospun nanolifli skafoldlara kovalent şəkildə bağlanmış GDNF zülalın yuyulması və ya deqradasiyasına dair heç bir dəlil olmadan 120 gün ərzində iskele səthində qaldı. Birləşdirilmiş GDNF zülalı funksional olaraq qaldı və sinir hüceyrə xəttində hüceyrədaxili Erk-i fosforlaşdırmaq qabiliyyəti ilə aşkar edildiyi kimi, aşağı axın siqnal kaskadlarını aktivləşdirməyə qadir idi. Bundan əlavə, GDNF zülalının immobilizasiyası, eyni mədəniyyət şəraitində həll olunan zülallar üçün müşahidə edilən dəqiqələrdən saatlara qədər müddət ərzində zülalın uzunmüddətli funksionallığını daha da təsdiqləyərək, kulturada hüceyrələrin sağ qalmasını və differensiasiyasını həm 3, həm də 7 gündə təşviq etdi. Bu tədqiqat bağlı molekulların sabitlik və funksionallıq kinetikasına dair mühüm sübutlar təqdim edir.

Bu tədqiqat Avstraliya Tədqiqat Şurası, Bethlehem Griffith Araşdırma Fondu və Avstraliya Milli Universitetinin Əsas Avadanlıq Komitəsi Fondu tərəfindən maliyyələşdirilib.

Hər iki müəllif bu işə bərabər töhfə verib.


Fon

Hərəkət qidanın və həyat yoldaşlarının lokallaşdırılması, yırtıcılardan qaçmaq, ərazinin müdafiəsi və stresə cavab vermək üçün tələb olunur və buna görə də əksər heyvan davranışlarının ayrılmaz tərkib hissəsidir. İnsanlarda Parkinson xəstəliyi, Huntington xəstəliyi, fəaliyyət pozğunluqları və depressiya hərəkət çatışmazlığı ilə əlaqələndirilir. Beləliklə, lokomotor davranışın genetik arxitekturasını başa düşmək təkamül biologiyasının və insan sağlamlığının ikili perspektivlərindən vacibdir.

Hərəkət, ifadəsi ətraf mühitə həssas olan fərdi kiçik təsirlərə malik çoxlu qarşılıqlı əlaqədə olan kəmiyyət əlamət lokuslarına (QTL) aid edilən təbiət dəyişikliyi ilə mürəkkəb bir davranışdır [1]. Mürəkkəb davranışın genetik arxitekturasının parçalanması model orqanizmlərdə çox asanlaşdırılır, məsələn Drosophila melanogaster, burada davranışın təzahürü üçün hansı genlərin tələb olunduğunu müəyyən etmək üçün mutasiyaların təsirlərini qiymətləndirmək və təbii olaraq baş verən dəyişkənliyə təsir edən QTL-nin yüksək dəqiqliklə xəritəsini çəkmək olar [2]. Mürəkkəb davranışların genetik arxitekturasının ümumi xüsusiyyətləri çox güman ki, müxtəlif taksonlar arasında təkrarlanacaq. Əsas bioloji proseslər, o cümlədən sinir sisteminin inkişafı milçəklər və məməlilər arasında təkamül yolu ilə qorunur [3]. Beləliklə, genlərin ortoloqları təsir edir Drosophila Hərəkət insanlar üçün uyğun ola bilər. Məsələn, Parkinson xəstəliyi nigrostriatal dopaminerjik neyronların mütərəqqi degenerasiyası ilə əlaqələndirilir [4, 5] və dopamin də siçanların hərəkətində iştirak etmişdir [6] və Drosophila [1, 7–12].

Bir sıra tədqiqatlar lokomotor davranışın əsas genetik mürəkkəbliyini ortaya qoyur Drosophila. Neyrotransmitterlər serotonin (5-hidroksitriptamin) [13], oktopamin (noradrenalinin onurğasız homoloqu) [14] və γ-aminobutirik turşusu [15] təsir göstərir. Drosophila göbələk cisimlərinin və mərkəzi kompleksin komponentlərinin, normal hərəkət üçün tələb olunan beyin bölgələrinin düzgün neyroanatomik inkişafı üçün tələb olunan genlər kimi lokomotivdir [16-21]. Bu yaxınlarda biz lokomotor davranışın "hərəkət reaktivliyi" komponentini (mexaniki pozğunluqdan dərhal sonra fəaliyyət səviyyəsi ilə ölçülür) kəmiyyətini müəyyən etmək üçün yüksək məhsuldarlıq analizi hazırladıq və bundan əhəmiyyətli dərəcədə fərqli səviyyələrə malik iki inbred xətt arasında QTL seqreqasiyasının xəritəsini tərtib etmək üçün istifadə etdik. lokomotor reaktivlik [1]. QTL-yə uyğun gələn 13 mövqeli namizəd genini müəyyən etdik. Bu genlərdən üçünün böyüklərin hərəkətinə təsir göstərdiyi bilinirdi, altısı hərəkətin tənzimlənməsində iştiraka uyğun mutant fenotiplərə malikdir, baxmayaraq ki, hərəkətin hərəkətinə təsirlər əvvəllər ölçülməmişdir və qalan dörd gen, bütün kodlayan RNT polimeraza II transkripsiya faktorları sinir sisteminin inkişafında iştirak edir, lokomotor davranışa təsir edən yeni namizəd genlər idi. Bu tədqiqat mürəkkəb davranışı öyrənmək üçün təbii allel variantlarından istifadənin gücünü vurğulayır [22], lakin təbii populyasiyada ayrılan allellərin məhdud bir nümunəsini təmsil edən istifadə edilən iki valideyn xəttində ayrılan genləri müəyyən etməklə məhdudlaşır.

Mürəkkəb davranışlara təsir edən genləri aşkar etmək üçün alternativ strategiya, divergent fenotiplər üçün süni seçimi bütün genom ifadə profili ilə birləşdirməkdir [23-28]. Bu yanaşmanın əsası ondan ibarətdir ki, seçimə korrelyasiyalı cavab kimi ifadədə ardıcıl dəyişikliklər göstərən genlər seçilmiş əlamətə təsir edən namizəd genlərdir. Bu strategiyanın ənənəvi QTL xəritəçəkmə paradiqmaları və davranış xüsusiyyətlərinə təsir edən mutasiyalar üçün qərəzsiz ekranlarla müqayisədə iki üstünlüyü var. Birincisi, bu yaxınlarda təbiətdən əldə edilmiş böyük bir baza populyasiyasından süni seçmənin başlanması, iki valideyn xəttindən istifadə edən QTL xəritələşdirmə tədqiqatlarına nisbətən davranışdakı seqreqasiya variasiyasına təsir edən allellərin daha böyük və daha reprezentativ nümunəsinin daxil edilməsini təmin edir. İkincisi, ekspressiyası genetik cəhətdən divergent xətlərdə birgə tənzimlənən namizəd genlərdə mutasiyaların davranış təsirlərinin qiymətləndirilməsi maraq xüsusiyyətinə təsir edən genləri müəyyən etmək üçün qərəzsiz mutasiya ekranlarından daha səmərəlidir [23, 26, 27]. Burada lokomotor reaktivliyin genetik arxitekturasını daha yaxşı başa düşmək üçün bu strategiyanı klassik kəmiyyət genetik analizi ilə birləşdirdik. Biz genetik olaraq heterojen fondan süni seçim xətləri yaratdıq və lokomotor reaktivliyin artan və azaldılmış səviyyələri ilə təkrarlanan xətləri, həmçinin seçilməmiş nəzarət xətlərini əldə etmək üçün 25 nəsil üçün seçdik. Eyni təbii populyasiyadan əldə edilən 340 inbred xəttin populyasiyasında lokomotor reaktivliyi də ölçdük. Daha sonra seçim xətləri arasında diferensial şəkildə ifadə olunan genlər dəstinin kəmiyyətini müəyyən etmək üçün bütün genom ifadə profilindən istifadə etdik. Diferensial şəkildə ifadə olunan on gendə mutasiyaların funksional testləri lokomotor davranışa təsir edən yeddi yeni namizəd gen müəyyən etdi.


Nəticələr

SERBP1 GBM-də yeni proqnostik markerdir

Biz SERBP1-nin glioma/GBM-də onkogen faktor kimi rolunu və onun xəstənin sağ qalmasına və terapiyaya cavab reaksiyasına potensial təsirini qiymətləndirdik. GTEx verilənlər bazası [21] ilə həyata keçirilən çox toxumalı transkriptomik analizdə beyin toxumaları azalmış SERBP1 mRNA ifadəsini, iki transformasiya olunmuş hüceyrə xətti (LCL və FIBRBLS) isə ən yüksək səviyyələri göstərmişdir (Şəkil 1a). Xüsusilə, SERBP1 normal beyin və LGG (aşağı dərəcəli glioma, II dərəcəli) ilə müqayisədə GBM-də (TCGA nümunələri) daha yüksək ifadə göstərir (Şəkil 1b, c, Əlavə Fayl 2: Cədvəl S1). Yüksək SERBP1 ifadəsi TCGA və CGGA kohortlarında glioma xəstələrində zəif sağ qalma ilə əlaqələndirildi (Şəkil S1A, Əlavə Fayl 3: Cədvəl S2). Bundan əlavə, biz müşahidə etdik ki, SERBP1 normal toxuma ilə müqayisədə 25 şiş növündə artan ifadə səviyyələrini göstərir (Əlavə Fayl 1: Şəkil S1B) və R2 verilənlər bazasındakı məlumatlar SERBP1-in yüksək ifadəsinin neyroblastoma hallarında pis proqnozla əlaqəli olduğunu göstərdi. , pankreas adenokarsinoması, sidik kisəsinin urotelial karsinoması, servikal skuamöz hüceyrəli karsinoma və sarkomalar (Əlavə Fayl 1: Şəkil S1C).

SERBP1 ifadəsi və glioma sağ qalma və müalicəyə təsiri. a GTex verilənlər bazası əsasında normal insan toxumasında SERBP1 mRNT ifadəsi. b TCGA konsorsiumundan normal beyin/korteks (GTEx) və glioma nümunələrində (II, III və IV dərəcə) SERBP1 mRNA ifadəsinin müqayisəli təhlili. c SERBP1 zülal ifadə səviyyələrini göstərən Şanxay Xəstəxanası kohortundan nümayəndəli qlioma nümunələrinin (II, III və IV dərəcələri) immuno-boyanması. d Kaplan-Meier əyriləri aşağı və yüksək SERBP1 səviyyələrini göstərən Şanxay Changzheng Xəstəxanası kohortundan 177 glioma xəstəsinin sağ qaldığını göstərir. eg Kaplan-Meier əyriləri aşağı və yüksək SERBP1 səviyyələrini göstərən Şanxay Changzheng Xəstəxanası kohortundan 118 GBM xəstəsinin sağ qalmasını göstərir: E (bütün xəstələr), F (TMZ alan 54 xəstə) və G (radiasiya qəbul edən 83 xəstə)

Bu nəticələri təsdiqləmək və genişləndirmək üçün Şanxay Changzheng Xəstəxanasından bir glioma kohortundan istifadə edərək bir araşdırma apardıq. Nümunələr immuno-boyanma yolu ilə təhlil edilib SERBP1 nümunələrin 21,5%-də aşkar olunmayıb, 18,1%-də yüngül müsbət, 37,3%-də orta müsbət, xəstələrin 23,2%-də güclü müsbət olub. SERBP1 ifadəsinin glioma dərəcələri ilə əlaqəli olub olmadığını daha da araşdırdıq. SERBP1 I dərəcəli qlioma olanların 28,6%-də, II dərəcəli qlioma olanların 55,6%-də, III dərəcəli qliomaların 83,3%-ində və IV dərəcəli qliomaların 89,0%-ində müsbət olmuşdur (P < 0,001). Bundan əlavə, IV dərəcəli (GBM) olan xəstələrin 71,2% -ində SERBP1 üçün yüksək müsbət boyanma olub, I dərəcəli (7,1%), II dərəcəli (40,7%) və III dərəcəli (61,1%) qlioma (P < 0,001) (Şəkil 1c, Əlavə Fayl 4: Cədvəl S3). SERBP1 ifadəsi ÜST qlioma dərəcəsi ilə sıx əlaqədə idi (aşağı dərəcəli və yüksək dərəcəli, ki-kvadrat testi, P = 0,002) (Əlavə Fayl 4: Cədvəl S3). Qliomalarda SERBP1-in dəyişkən ifadəsinə baxmayaraq, GBM nümunələri LGG nümunələri ilə müqayisədə SERBP1-in nəzərəçarpacaq dərəcədə yüksək ifadəsinə malik idi. SERBP1 ifadəsi yüksək olan xəstələr üçün orta sağ qalma 13,12 ± 1,12 ay (95% güvən intervalları [CI] 10,91-15,33), aşağı SERB1 ifadəsi olan xəstələr üçün isə 23,73 ± 1,76 (95% CI 20,23-27,23) ay idi.P < 0,0001) (Şəkil 1d). Aşağı SERBP1 ifadəsi olan GBM xəstələri yüksək SERBP1 ifadəsi (10,52 ± 0,97 ay, 95% CI 8,59-12,46) ilə müqayisədə (17,41 ± 1,93 ay, 95% CI 13,48-21,35) nəzərəçarpacaq dərəcədə uzun yaşamışdır.P = 0,0006) (şək. 1e).

Biz həmçinin sağ qalma müddətinə əməliyyatdan sonrakı köməkçi terapiyanın (radioterapiya və kemoterapiya) təsir edib-etmədiyini araşdırdıq. (Şəkil 1f)-də göstərildiyi kimi, kemoterapi (temozolomid) alan GBM xəstələri arasında aşağı SERBP1 səviyyələri olanlar yüksək SERBP1 səviyyələrinə (11,11 ±) malik olanlara nisbətən əhəmiyyətli dərəcədə daha uzun yaşamışdır (20,91 ± 2,52 ay, 95% CI 15,67-26,15) 1,22 ay, 95% CI 8,68–13,55) (P = 0,0002). Eynilə, aşağı SERBP1 səviyyələri olan xəstələr, yüksək SERBP1 səviyyələri (9,24 ± 1,15 ay, 95% CI 6,570) olan xəstələrlə müqayisədə sağ qalma baxımından (18,81 ± 2,69 ay, 95% CI 13,09-24,54) radioterapiyadan daha çox fayda əldə etmişlər.P < 0,0001) (Şəkil 1g). Bütün xəstə məlumatları (Əlavə Fayl 5: Cədvəl S4) siyahısında verilmişdir.

SERBP1 xərçənglə əlaqəli fenotiplərə təsir göstərir

Xərçənglə əlaqəli fenotipləri qorumaq üçün SERBP1-in yüksək ifadəsinin tələb olunduğunu müəyyən etmək üçün bir neçə analiz apardıq. CRISPR-Cas9 yanaşmasından istifadə edərək SERBP1 nokaut xətlərini istehsal etmək cəhdləri uğurlu olmadığı üçün bütün eksperimentlər siRNA-nın yıxılması ilə aparıldı, bu, ən azı sınaqdan keçirdiyimiz GBM xətlərinin SERBP1 funksiyası olmadan yaşaya bilməyəcəyini göstərir.

SERBP1-in yıxılması MTS analizi vasitəsilə aşkar edilən U251 və U343 hüceyrələrinin canlılığına dramatik təsir göstərdi (Şəkil 2a, Əlavə Fayl 1: Şəkil S2A, S3A) Biz həmçinin hüceyrə koloniyasının formalaşması analizini apardıq və hər iki sətirdə SERBP1-də azalma müşahidə etdik. ifadə dramatik şəkildə koloniyalar yaratmaq üçün GBM hüceyrə qabiliyyətini azaldır (Şəkil 2b, Əlavə Fayl 1: Şəkil S3B). Eynilə, Boyden kamera analizindən istifadə edərək, SERBP1 susdurulduğu zaman hüceyrə işğalının pozulduğunu müəyyən etdik (Şəkil 2c, Əlavə Fayl 1: Şəkil S3C). Sonra, SERBP1-in yıxılmasının apoptoza təsir edib-etmədiyini araşdırdıq. Biz hər iki ssenaridə axın sitometriyasından istifadə etməklə PARP1 parçalanmasını, eləcə də anneksin-V boyanmasını araşdırdıq, nəzarət siRNA ilə müqayisədə siSERBP1 ilə transfeksiya edilmiş hüceyrələrdə məhsulun artımını müşahidə etdik (Şəkil 2d, e). Eynilə, SERBP1-in apoptozdakı rolunu təsdiqləyən nəzarətlə müqayisədə SERBP1 yıxılan hüceyrələrdə daha yüksək kaspaz 3/7 aktivliyini müşahidə etdik (Şəkil 2f). Nəhayət, biz SERBP1-in glioma kök hüceyrəsinin (GSC) sağ qalması və yayılmasına təsirini qiymətləndirdik. Geltrex, GSC mədəniyyətlərinin monolayer kimi böyüməsinə icazə vermək üçün istifadə edilmişdir. Sağ qalma MTS analizi ilə qiymətləndirildi, hüceyrə proliferasiyası isə Incucyte sistemindən istifadə edərək zamanla izləndi. SERBP1 yıxılması sağ qalmağı və həm proneural, həm də mezenximal GSC-lərin yayılmasını azaldır (Şəkil 2g, h Əlavə Fayl 1: Şəkil S2B).

SERBP1 xərçənglə əlaqəli fenotiplərə və şiş böyüməsinə təsir göstərir. a U251 hüceyrələrində SERBP1-in yıxılması canlılığı azaldır (MTS analizi). b SERBP1-in susdurulması koloniya əmələgəlmə analizləri ilə ölçülən klonogen potensialı azaldır. c Boyden kamera analizi SERBP1-in kristal bənövşəyi absorbsiyasının invaziya dəyərlərinə təsirini qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir ki, SERBP1-in yıxılması işğal potensialını azaldır. df SERBP1 susdurulması PARP1 parçalanması ilə göstərildiyi kimi apoptozu artırdı (d), anneksinlə boyanma (e) və kaspaz (f). g Zamanla GSC yayılması Incucyte avtomatlaşdırılmış sistemi ilə izlənildi. SERBP1 səviyyələrinin azalması hüceyrə proliferasiyasını pozdu. i GSC xətlərində SERBP1-in yıxılması həyat qabiliyyətini azaldır (MTS analizləri). Məlumatlar Tələbə ilə təhlil edildi t test edilir və orta ± standart kənarlaşma kimi təqdim olunur. Çoxsaylı müqayisələr üçün Bonferroni korreksiyasından istifadə edilmişdir. *səh ≤ 0.05 **səh ≤ 0.01 ***səh ≤ 0.001 ****səh ≤ 0.0001. i shSERBP1 3565 GSC hüceyrə xətti (qrup başına 10 siçan) istifadə edərək kəllədaxili ksenoqraftlar quruldu. Eksperimental qrup shSERBP1 ifadəsini stimullaşdırmaq üçün Dox aldı. Kaplan-Meier əyriləri SERBP1-in yıxılmasının şiş böyüməsini azaltdığını və sağ qalma müddətini artırdığını göstərir. j Hər qrup üçün şiş sərhədindən nümayəndə Ki67 boyanması. Ölçək çubuğu = 100 μm

Sonra, SERBP1-in intrakranial ksenoqraftlardan istifadə edərək şiş böyüməsinə təsirini qiymətləndirdik. Biz yüksək aqressiv GSC xətti 3565 [22] seçdik və lentiviral infeksiya vasitəsilə tet-induksiya olunan SERBP1 shRNA-dan ibarət stabil xətt hazırladıq. Bu xəttin in vitro qiymətləndirilməsi göstərdi ki, doksisiklinlə müalicə zamanı 80% yıxılma əldə edilə bilər. Doksisiklinlə müalicə zamanı neyrosferin formalaşmasında və sağ qalmada azalma müşahidə edildi və nəticələr istifadə olunan dərman miqdarı ilə əlaqələndirildi (Əlavə Fayl 1: Şəkil S2C-F). Həm nəzarət qrupu, həm də eksperimental qruplar (5 kişi və 5 qadın/qrup) 3565 SERBP1 shRNA-tet hüceyrələri ilə implantasiya edilib. Eksperimental qrupda hüceyrələr implantasiyadan əvvəl doksisiklinlə müalicə olundu və siçanlara ad libitum doksisiklin ehtiva edən su içməyə icazə verildi. Eksperimental qrupda SERBP1 ifadəsini azaltmaqla biz nəzarət qrupuna nisbətən orta sağ qalma müddətini 11 gün uzatdıq (P = 0,0026) (Şəkil 2i). Şişlər də çox fərqli morfologiya göstərdi. Anti-Ki67 ilə immunostaining ilə əks olunduğu kimi, yüksək proliferasiya edən hüceyrələrin sayında nəzərəçarpacaq fərq var (Şəkil 2j). SERBP1 ifadə profili, onun GBM xəstəsinin sağ qalmasına təsiri, terapiyaya cavab, xərçəng fenotipləri və şiş böyüməsi SERBP1-i GBM-də yeni onkogen RBP kimi qurur.

SERBP1 bağlayan motivin xarakteristikası və tənzimləyici təsir

SERBP1 RNT bağlayıcı üstünlüklərini müəyyən etmək üçün biz RNAcompete [23] istifadə etdik. Tam uzunluqlu rekombinant SERBP1 zülalı bir hovuzla inkubasiya edilmişdir

240.000 dizayn edilmiş (təsadüfi olmayan) RNT oliqosu. SERBP1 tərəfindən seçilmiş RNT-lər mikroarray hibridizasiyası vasitəsilə müəyyən edildi və sonrakı hesablama analizi SERBP1 üçün GC ilə zəngin RNT-məcburi motivi müəyyən etdi (Şəkil 3a). Biz həmçinin SERBP1-i N-terminus His kimi ifadə etdik və təmizlədik6 birləşmə zülalı və RNAcompete tərəfindən müəyyən edilmiş RNT 7-mer (5′- GCGCGGG - 3′) ilə bağlanma yaxınlığını kəmiyyətcə ölçmək üçün flüoresan qütbləşmədən (FP) istifadə etdi. Ölçülmüş tarazlıq dissosiasiya sabiti (KD) SERBP1-RNT qarşılıqlı əlaqəsi (KD

47 nM) RNT Compete tərəfindən müəyyən edilmiş ardıcıllığa güclü yaxınlığını təsdiqləyir (Şəkil 3b). SERBP1-in hüceyrələrdə bu motivə bağlanıb-bağlanmadığını müəyyən etmək üçün biz RIP-Seq təcrübəsi keçirdik. Bunu müşahidə etdik

SERBP1 ilə bağlı olduğu müəyyən edilən mRNA növlərinin 40%-i müəyyən edilmiş GC ilə zəngin motivi 3′ UTR-də göstərir ki, bu da təsadüfən gözləniləndən xeyli yüksəkdir (Şəkil 3c). RIP-Seq analizinin tam nəticələri (Əlavə Fayl 6: Cədvəl S5) göstərilmişdir. Nəhayət, lusiferaza analizlərini yerinə yetirmək üçün SERBP1-in yıxılmasından (aşağıda RNT-Seq analizinə baxın) təsirlənmiş 3′ UTR-də çoxlu “SERBP1 bağlayan motivləri” olan genləri seçdik. Bu genlərin 3′ UTR-ni ehtiva edən Luc-müxbirləri SERBP1 ifadə vektoru və ya nəzarəti ilə birgə transfeksiya edilmişdir. Bütün hallarda, SERBP1 transgenik ifadəsi lusiferaza müxbirinin ifadəsini artırdı (Şəkil 3d), bu transkriptlərin mRNA sabitliyini və / və ya tərcüməsini təşviq etdiyini göstərir.

SERBP1 bağlama motivi. a RNACompete ilə əldə edilən SERBP1 RNT bağlama motivi. b Floresan qütbləşmə analizi SERBP1-in yüksək yaxınlığını göstərir (KD

47 nM) 7-mer RNT oliqonukleotidinə (5′- GCGCGGG - 3′). c

RIP-Seq vasitəsilə müəyyən edilən transkriptlərin 40%-i SERBP1 ilə üstünlük təşkil edir, müəyyən edilmiş GC ilə zəngin motivi 3′ UTR-də göstərir ki, bu da təsadüfən gözləniləndən xeyli yüksəkdir. d SERBP1 ifadə vektorunun birgə transfeksiyasının ehtimal olunan SERBP1 bağlama motivlərini göstərən genlərin 3′ UTR-ni ehtiva edən reportyor konstruksiyalarının ifadəsini artırdığını göstərən lusiferaza analizinin nəticələri. GAPDH mənfi nəzarət kimi istifadə edilmişdir

SERBP1 "xərçəng metabolizminin" tənzimləyicisidir

SERBP1-in xərçənglə əlaqəli fenotiplərə necə töhfə verdiyini anlamaq üçün biz SERBP1-in U251 hüceyrələrinə qarşı nəzarətdə RNT-Seq analizi apardıq. SERBP1-in yıxılması maddələr mübadiləsi və maddələr mübadiləsinin tənzimlənməsi ilə əlaqəli genlərin böyük dəstinin ifadəsini azaldıb, üst zənginləşdirilmiş Gen Ontologiyası terminləri ilə göstərildiyi kimi (Şəkil 4a, Əlavə Fayl 7: Cədvəl S6). Şəbəkə təhlili göstərdi ki, maddələr mübadiləsi ilə əlaqəli genlərin bu dəsti yüksək dərəcədə bir-birinə bağlıdır (Şəkil 4b). Eynilə, RIP-Seq analizi SERBP1 ilə əlaqəli çoxsaylı transkriptlərin (genlərin) maddələr mübadiləsində iştirak etdiyini müəyyən etdi (Əlavə Fayl 7: Cədvəl S6). Xüsusilə, bir-biri ilə əlaqəli iki metabolik marşrut, serin biosintezi və bir karbon (1C) dövrü, SERBP1-in yıxılmasından yüksək dərəcədə təsirlənir (Şəkil 4c). Bu yollarla əlaqəli genlərin dəyişdirilmiş ifadəsi qRT-PCR və Western blot tərəfindən təsdiq edilmişdir (Şəkil 4d, e). Ksenoqraftların immuno-boyanması da göstərdi ki, SERBP1-in yıxılması da şişlərdə PHGDH ifadəsində kəskin azalma əmələ gətirir (Şəkil 4f).

SERBP1 maddələr mübadiləsini tənzimləyir. a U251 hüceyrələrində SERBP1 ilə aşağı tənzimlənən genlərlə bağlı zənginləşdirilmiş Gen Ontologiyası (GO) terminləri. Gen dəsti Panther [24] istifadə edərək təhlil edildi və GO şərtləri Revigo [25] istifadə edərək tərtib edildi, maddələr mübadiləsi ilə əlaqəli ən çox təmsil olunan terminlər sadalandı. b SERBP1-in yıxılmasından təsirlənən maddələr mübadiləsində iştirak edən genlərin şəbəkə təhlili. Şəbəkə String [26] istifadə edərək qarşılıqlı əlaqə (eksperimental sübut), mətnin öyrənilməsi və birgə baş vermə nəzərə alınmaqla qurulmuşdur. Qrupları göstərmək üçün müxtəlif rənglərdən istifadə edilmişdir. c SERBP1-in yıxılmasından təsirlənən genləri göstərən bir karbon dövrünün sxematik təsviri. d, e U251 və U343 hüceyrələrində qRT-PCR və Western blot analizi SERBP1-in maddələr mübadiləsində iştirak edən kritik genlərin ifadəsinə təsirini təsdiqlədi. f Hər qrup üçün ksenoqraft tədqiqatından olan şişlərin nümayəndəsi PHGDH immuno-boyanması. Ölçək çubuğu = 60 μm

Bir karbon (1C) metabolizmi, de novo purin və timidilat sintezi, bir neçə amin turşusunun qarşılıqlı çevrilməsi, universal metil donorlarının istehsalı və redoks kofaktorlarının bərpası üçün istifadə olunan 1C vahidlərini istehsal edən universal folatdan asılı bir yoldur, bunların hamısı xərçəngə fayda verir. sağ qalma [27]. Bəzi 1C fermentlərinin hədəflənməsi artıq terapevtik strategiya kimi tədqiq edilmişdir [27,28,29]. Müvafiq 1C genlərinə PHGDH (3-fosfo-qliserat dehidrogenaz), SHMT2 (serin hidroksilmetil-transferaza 2), MTHFD2 (metilen tetrahidrofolat dehidrogenaz 2) və PSAT1 (fosfoserin aminotransferaza 1) daxildir (Şəkil 44b). Xərçəng hüceyrələrində 3-fosfogliserat serin və glisini sintez etmək və NADPH yaratmaq üçün böyüməyi təşviq edən mexanizmin bir hissəsi kimi istifadə olunur. Qlükozadan alınan karbonun yarısı serin biosintezində istifadə olunur və PHGDH bu prosesdə məhdudlaşdırıcı ferment kimi fəaliyyət göstərir [30]. PHGDH gliomada həddindən artıq ifadə edilir və invazyon və angiogenezə təsir göstərir [31]. SHMT2 1C siklində kritik bir fermentdir [32] və xərçəng metabolizmində kritik bir nöqtəyə - serin/glisin çevrilmə istiqamətinə nəzarət edir. Serinin tükənməsi xərçəng hüceyrələrinin yayılmasını maneə törədir və purin səviyyəsini azaldır, oxşar təsir SHMT2 yıxıldıqdan sonra müşahidə olunur [27]. MTHFD2 mitoxondrial 1C folat metabolizmasında iştirak edən dehidrogenaz və siklohidrolaza aktivliyi ilə NAD+-dan asılı fermentdir və şişlərdə həddindən artıq ifadə olunan ən tez-tez metabolik fermentlərdən biridir [33]. PSAT1, 3-fosfo-D-gliseratdan L-serini sintez edən alt yolda kritik bir fermentdir. Yüksək PSAT1 ifadəsi döş xərçəngi, kolorektal, nazofarenks və özofagus karsinomaları da daxil olmaqla bir çox şişlərdə pis proqnozla əlaqələndirilir və dərman müqaviməti ilə əlaqələndirilir [34,35,36,37].

RNT-Seq analizimizin nəticələrini təsdiqləmək üçün metabolik bir araşdırma apardıq. SERBP1 siRNA-nın yıxılması canlılığa və apoptoza nəzərəçarpacaq dərəcədə təsir göstərdiyi üçün biz tet-induksiya olunan shRNA ilə U251 stabil xəttindən istifadə etməyə üstünlük verdik. Metabolomika məlumatlarında həyata keçirilən əsas komponent təhlili (PCA) nəzarət və SERBP1 yıxılan qruplar arasında fərqli bir fərqi göstərir (Əlavə Fayl 1: Şəkil S4A-B). Vulkan süjeti məlumatları metil dövrü aralıq məhsullarının (S-adenosilhomosistein və metionin) əhəmiyyətli dərəcədə tükənməsini və 5-metiltioadenozin (MTA) dövrünün aralıq məhsullarının (putresin və N-asetilputresin) yığılmasını göstərir (Əlavə Fayl 1: Şəkil S4C). Metabolik analizlər SERPB1-nin serin metabolizmini modulyasiya etdiyini və bir karbon vahidinin (C1) folat dövründən metil dövrünə köçürülməsinə mane olduğunu təsdiqlədi. Bu dəyişiklik DNT/histon metilasiyasını, redoks kofaktorlarının regenerasiyasını və nukleotidlərin biosintezini dəyişə bilər [27, 38, 39]. Təsiri 1C dövrü aralıq metil-tetrahidrofolatdan (metil-THF) bir metil qrupunun töhfəsi ilə metionini təkrar emal edən metilləşmənin əlavə məhsulu olan metionin və S-adenosilhomosisteinin (SAH) əhəmiyyətli dərəcədə tükənməsindən görünür (Şəkil 5a, c). və Əlavə Fayl 1: Şəkil S4). Hüceyrədə yüksək səviyyədə metionin, eləcə də metioninlə zəngin pəhrizlər şişin inkişafı ilə əlaqələndirilmişdir [40, 41]. Digər tərəfdən, poliamin prekursorlarının, putressinin və N-asetil putressinin əhəmiyyətli dərəcədə tənzimlənməsi metioninin və onun metaboliti S-adenosilmetionin (SAM) SAM-ın mövcud olmadığını göstərir. 42]. Bundan əlavə, sisteinin tükənməsi aralıq məhsullar kimi homosistein və sistationinə malik olan SAH-dan sisteinin biosintezini kataliz edən sistationin-β-sintazanın (CBS) aşağı tənzimlənməsi ilə əlaqələndirilir [38].

SERBP1-in bir karbon və metil dövrlərinə təsiri və potensial aşağı axın təsirləri. a Metabolik təhlil göstərir ki, SERBP1 susdurulması bir karbon, metil və MTA dövrləri ilə əlaqəli metabolitlərin istehsalına təsir göstərir. b SERBP1 susdurulduqdan sonra hüceyrədaxili glutatyon səviyyələri. c SERBP1-in metabolizma və funksional aşağı axın təsirlərinə təsiri modeli

Glutatyonun ümumi səviyyələrində azalma luminescent əsaslı analizlə müəyyən edilmişdir (Şəkil 5b). Sistein redoks-tənzimləyici metabolit olan glutatyonun (GSH) xəbərçisi olduğundan, onun tükənməsi SERPB1 yıxılan hüceyrələrdə redoks balansına təsir göstərə bilər (Şəkil 5c). Eynilə, Q koenziminin əhəmiyyətli dərəcədə tükənməsi10 (CoQ10H2) və ya yüksək CoQ10/CoQ10H2 yıxılan qrupdakı nisbət, mitoxondrial tənəffüs zəncirinin (mETC) tənzimlənməsinin pozulmasını, oksidləşdirici fosforlaşmanın inhibəsini və nəticədə apoptozu tetikləyən reaktiv oksigen növlərinin (ROS) əmələ gəlməsini təklif edir [43]. CoQ10 is a lipophilic redox cofactor that functions as an electron carrier in the mETC and generates the proton gradient that drives ATP synthesis through oxidative phosphorylation [44] (Fig. 5a, c). In summary, the results of the metabolic analysis support the changes observed in the genomic study, establishing SERBP1 as a novel regulator of metabolic pathways. Full results of the metabolic analysis are shown in (Additional File 8: Table S7).

SERBP1 impact on neuronal differentiation, “stemness,” and epigenetic regulation

Genes upregulated after SERBP1 knockdown are preferentially associated with nervous system development, neurogenesis, and synaptogenesis according to GO analysis (Fig. 6a, b Additional File 1: Fig. S5, Additional File 7: Table S6). This data suggests that SERBP1 could function as a “repressor” of neuronal differentiation. In fact, according to our previous analysis [46], most of these genes show an increase in expression during neurogenesis (Fig. 6c). SERBP1 shows the opposite pattern NSCs and GSCs display high levels of SERBP1 while decreased expression occurs when cells are induced to differentiate (Fig. 6d, Additional File 1: Fig. S6A-B). Next, we performed gene expression correlation analyses with R2 using TCGA GBM and brain samples. Genes showing strong negative correlation with SERBP1 are found in many GO-enriched categories previously identified in analyses of genes upregulated upon SERBP1 knockdown (e.g., synapse organization, nervous system development, and neurogenesis) (Additional File 9: Table S8, Additional File 10: Table S9). Overall, these results suggest that SERBP1 represses neuronal differentiation. We then evaluated whether increased SERBP1 expression can disrupt neuronal differentiation using the neuroblastoma BE-(2)-C cell line. Cells were infected with either SERBP1 expressing or control lentivirus and treated with or without retinoic acid (RA) to induce differentiation. After 4 days, we used an Incucyte system to measure neurite outgrowth as an indicator of differentiation. RA treatment effectively induced neurite formation but SERBP1 overexpression diminished the effect (Additional File 1: Fig. S6C-E).

SERBP1 knockdown increased expression of genes linked to neurogenesis and nervous system development. a Enriched Gene Ontology terms related to genes upregulated upon SERBP1 knockdown in U251 cells. Gene set was analyzed using Panther [24] and GO terms were compiled using [25]. Most representative terms associated with nervous system development and function are listed. b Network analysis of genes implicated in neuronal differentiation affected by SERBP1 knockdown. The network was built using String [26] considering interaction (experimental evidence), text mining, and co-occurrence. Different colors were used to indicate clusters. c Heatmap shows that genes upregulated upon SERBP1 knockdown cells display increased expression during murine neurogenesis—0 day/stem vs. 4 days/differentiated cells. d qRT-PCR shows SERBP1 and β-III Tubulin expression in neuronal stem cells (NSCs) and differentiated cells. e Genes upregulated upon SERBP1 knockdown showing decreased expression in GBM in reference to LGG are labeled in blue, genes that show reduced expression in GBM in reference to normal brain (cortex) are labeled in green and genes that are methylated (H3K27me3) in GBM cells [45] are labeled in orange. f Western blot showing that SERBP1 knockdown leads to a decrease in H3K27me3 in GBM cells

The effect of SERBP1 on methionine production could ultimately influence histone and/or DNA methylation. Therefore, SERBP1 could function as an epigenetic modulator, indirectly repressing the expression of genes implicated in neuronal differentiation. Gene set enrichment analysis (GSEA) identified strong similarities between the list of upregulated genes in SERBP1 knockdown cells and binding profiles of H3K27me3 and EZH2 and SUZ12, two members of PRC2 which trimethylate histone H3 on lysine 27 (Additional File 11: Table S10). Analysis of H3K27me3 profiles in GBM cells [45] confirmed that several genes “repressed” by SERBP1 show H3K27me3 sites (Fig. 6e, Additional File 12: Table S11). Consistent with these results, levels of expression for most of these genes are decreased in GBM samples in comparison to brain (cortex) and LGG (Fig. 6e, Additional File 13: Table S12. Corroborating the association between SERBP1 and H3K27me3, we determined by Western analysis that SERBP1 knockdown in GBM cells reduced H3K27me3 levels (Fig. 6f).

We then tested if a reduction in SERBP1 levels could increase GBM cell sensitivity to PRC2 inhibition. EED226 is a potent and selective PRC2 inhibitor that directly binds to the H3K27me3 binding pocket of EED. Control and SERBP1 knockdown cells were treated with 20 or 40 μM of EED226 and cell proliferation was followed over time with an Incucyte. Since the impact of SERBP1 on cell proliferation is very strong, we decided to use a partial SERBP1 knockdown (40–50% reduction in proliferation) to appreciate the effect of combined treatment. While control cells showed almost no response to EED226 treatment, SERBP1 knockdown cells showed decreased proliferation in response to treatment (Additional File 1: Fig. S7A,S7C). To better illustrate the differences between siRNA control and SERBP1 knockdown cells, we show proliferation at the terminal time point, comparing EED226-treated cells to its respective untreated control (Additional File 1: Fig. S7B, S7D).

In line with these findings, we observed that SERBP1 knockdown decreased expression of several genes associated with PI3K/AKT signaling (Additional File 1: Fig. S8A, Additional File 7: Table S6) which has been shown to modulate the cancer epigenome through methylation [47]. Corroborating the connection between SERBP1 and the PI3K/AKT pathway, knockdown of SERBP1 reduced levels of AKT and p-AKT in U251 and U343 cells as observed by Western blot (Additional File 1: Fig. S8B). Finally, using the glioma cohort from the Shanghai Changzheng, we determined that AKT1 and SERBP1 display good expression correlation based on immunostaining (Additional File 1: Fig. S8C).

Finally, we examined whether increased expression of SERBP1 could contribute to stem cell features. We generated, via lentiviral infection, a U343 line that overexpresses SERBP1 (SERBP1 OE) (Additional File 1: Fig. S2G-H). Control (empty vector) and SERBP1 OE cells were grown as neuro-spheroids in stem cell media. SERBP1 OE cells were more efficient in forming spheres than controls and the difference increased in higher passages (Additional File 1: Fig. S9A-B). SERBP1 OE cells also showed increased expression of stem cell markers by qRT-PCR (Additional File 1: Fig. S9C). Increased metabolism and radio-resistance are characteristics of “cancer stem cells” [48]. We observed that SERBP1 OE cells also had increased mitochondrial respiration and ATP production compared to controls (Additional File 1: Fig. S9D-E). Consistent with the finding that that high SERBP1 expression influences response to radiation in GBM patients (Fig. 1G), SERBP1 OE cells were more resistant to radiation than controls as shown in a colony formation assay (Additional File 1: Fig. S9F).

Overall, our results indicate that SERBP1 contributes to GBM poorly differentiated state and glioma stem cell phenotypes by repressing genes implicated in neuronal differentiation and neuronal function. SERBP1 could influence epigenetic regulation by controlling methionine production via the one-carbon and methyl cycles and the AKT pathway.


Mücərrəd

Fatty acid, polyketide, and nonribosomal peptide biosynthetic enzymes perform structural modifications upon small molecules that remain tethered to a carrier protein. This manuscript details the design and analysis of cross-linking substrates that are selective for acyl carrier proteins and their cognate condensing enzymes. These inactivators are engineered through a covalent linkage to fatty acid acyl carrier protein vasitəsilə post-translational modification to contain a reactive probe that traps the active site cysteine residue of ketosynthase domains. These proteomic tools are applied to Escherichia coli fatty acid synthase enzymes, where KASI and KASII selectively cross-link ACP-bound epoxide and chloroacrylate moieties. These mechanism-based, protein–protein fusion reagents also demonstrated cross-linking of KASI to type II polyketide ACPs, while nonribosomal peptide carrier proteins showed no reactivity. Similar investigations into protein–protein interactions, proximity effects, and substrate specificities will be required to complete the mechanistic understanding of these pathways.


Müzakirə

IL-1β is a pro-inflammatory cytokine involved in various liver diseases [6]. In this study we report that pre-treatment of hepatocytes with IL-1β enhances FasL-induced caspase-3/-7 activity, but astonishingly diminishes FasL-induced apoptosis. In the literature, contrary effects of IL-1β on cell viability are described. An in vivo study demonstrated that a pre-treatment of mice with IL-1β protected the animals from subsequent liver injury by Fas-dependent apoptosis. These mice showed decreased liver enzyme serum concentrations, reduced caspase-3/-7 activity levels and prolonged survival [3]. On the other hand, in pancreatic MIA PaCa-2 cells IL-1β mediated cell death by triggering the phosphorylation of JNK due to ER stress [30].

Our results demonstrate that treatment of hepatocytes with IL-1β alone resulted in a time-dependent phosphorylation of JNK1/2, which was previously described in mouse embryonic fibroblasts and in the rabbit liver [31], [32]. This JNK1/2 activation was essential for the crosstalk of IL-1β in the presence of FasL as its inhibition, but not that of p38 MAPK, abolished the increase in caspase-3/-7 activity that was mediated by IL-1β pre-treatment. JNK is known to be crucial for modulating the activity of pro-apoptotic BH3-only proteins. In vitroin vivo (thymus) studies showed that Bim and Bmf were phosphorylated by JNK in response to UV or during thymic selection [23]. Similarly, we recently reported that gliotoxin, a fungal toxin of Aspergillus fumigatus, induced apoptosis via JNK1/2-mediated phosphorylation of Bim at three sites (S100, T112 and S114) [24]. Bim phosphorylation by JNK1/2 was shown to increase its binding affinity to Bcl-2-like survival factors which translated into a better activation of Bax/Bak with subsequent cytochrome c release and caspase-3/-7 activation [23], [24]. In agreement with this, we could observe increased caspase-3/-7 levels after stimulation with IL-1β + FasL, and this response was abrogated in Bim -/- hepatocytes as well as in wt hepatocytes treated with the JNK inhibitor SP600125. In addition to Bim, we showed that Bid was crucial for the increased caspase-3/-7 activity. Bid -/- hepatocytes were unable to increase caspase-3/-7 activity upon IL1β + FasL treatment, thus preserving cell viability.

Our experimental observations are supported by a mathematical model, which was established to confirm that our network structure covers the observed effects in all scenarios and explains the underlying mechanism. The model indicates that the sensitizing is due to a depletion of free anti-apoptotic Bcl-2 proteins after tBid and Bim were formed and/or activated in response to IL-1β and FasL treatment. FasL contributes to apoptosis by cleaving full-length Bid into the pro-apoptotic tBid form, whereas IL-1β enhances the pro-apoptotic activity of Bim by JNK1/2-mediated phosphorylation (pBim). tBid and pBim bind to anti-apoptotic Bcl-2 proteins with high affinities. Hence, when cells are treated with FasL or IL-1β alone, either one of the BH3-only proteins is fully sequestered by Bcl-2 proteins. However, if both stimuli are present, the Bcl-2 protein buffer is insufficient to block tBid and pBim simultaneously leading to free amounts of the BH3-only proteins which can then directly activate Bax/Bak and trigger MOMP, cytochrome c release and increased caspase-3 activation. Thus, IL-1β sensitizes hepatocytes to FasL-induced caspase-3/-7 activation by shifting the balance from anti- to pro-apoptotic Bcl-2 proteins. The crucial role of Bid, Bim and JNK1/2 was further emphasized by simulating the knockout and inhibition scenarios. MOMP was ablated in both Bid -/- and Bim -/- knockout cells as well as in wt hepatocytes treated with the JNK inhibitor SP600125. While in Bid -/- cells, blockage of MOMP was because FasL could not trigger tBid formation, in Bim -/- cells and wt hepatocytes treated with SP600125 IL-1β was unable to favour MOMP via Bim phosphorylation. However, the question remained how IL-1β could increase FasL-induced caspase-3/-7 activation but at the same time attenuate FasL-induced cell death.

The threshold for MOMP-activation may significantly vary in individual cells within a population [33]–[35]. The intracellular ratio of pro- and anti-apoptotic Bcl-2 proteins determines the susceptibility of individual cells to apoptotic stimuli [36], [37]. Furthermore, Kallenberger et al. described heterogeneous caspase-8 activation in individual cells following FasL stimulation that critically depended on the quantity of FasL - Fas interaction and DISC formation [29]. We observed that only a fraction of hepatocytes died after 3 h of FasL treatment, whereas others appeared resistant to the stimulus. Our mathematical simulations showed that this heterogeneity may be explained by the dependence of caspase-3 activation and thus cell fate on different initial protein levels of Fas and Bcl-2. Accordingly, IL-1β pre-treatment favors MOMP-mediated apoptosis by influencing the Bcl-2 balance and thus promotes increased caspase-3 activity, but only in those cells which are susceptible to FasL-induced cell death anyway. Thereby, IL-1β pre-incubation leads to higher average caspase-3 levels but not to increased cell death. Our model predicts that pre-incubation with IL-1β changes the ratio of survivors, type I cells and type II cells. This could be verified by monitoring single cell responses to FasL and IL-1β + FasL stimulation distinguishing between type I and type II cells. So far the missing increase of PARP cleavage, the downstream event of caspase-3/-7 activation, supports our hypothesis.

We observed an enhancement of NF-㮫 DNA binding activity and induction of the NF-㮫 target gene A20 after treatment with IL-1β + FasL, whereas NF-㮫 DNA binding activity and A20 mRNA induction was reduced when IL-1β was substituted by TNFα ( Figs. 8 and ​ and9A). 9A ). Enhanced expression of A20 could be confirmed on the protein level ( Fig. 9 B-D ). This might explain increased cell viability of IL-1β + FasL treated hepatocytes. A20 is an inhibitor of caspase-8 activation and thereby can mediate a protective effect on FasL-induced apoptosis [28]. In our mathematical model, expression of the protective protein X that could be A20 can explain decreased caspase-3 activity in Bid -/- hepatocytes treated with IL-1β + FasL as well as increased cell viability in wt cells after treatment with IL-1β and FasL ( Fig. 13B ).

In addition to NF-㮫 activation and increased expression of A20 other survival signaling such as the PI3K/Akt pathway might be crucial for IL-1β-mediated protection. For example, active caspase-3 may trigger Akt activation and protection from apoptosis by proteolytic cleavage of RasGAP to a N-terminal fragment [38]. Furthermore, proteins that directly associate with active caspases and block their proteolytic activity such as the HGF-receptor domain, survivin or XIAP may suppress cell death induced by FasL [12], [39], [40]. Our results with XIAP - / - hepatocytes did not reveal any implication of XIAP in the IL-1β–mediated survival response. Whether Akt or other cellular caspase inhibitors are involved in the protective effect remains to be elucidated.

Altogether, we characterized the IL-1β-mediated sensitizing effect on FasL-induced caspase-3/-7 activation via comprehensive studies. Based on our experiments and according to our mathematical model it can be assumed that IL-1β exerts two distinct effects on FasL-induced apoptosis. On one hand it shifts the balance of Bcl-2 proteins to favoring MOMP and increasing the average caspase-3/-7 activity. On the other hand this pro-apoptotic effect is minimized by elevating A20 levels, which may reduce caspase-8 activation and further caspase-3 activation. Therefore, cells that show only a weak response to FasL stimulation and low caspase-8 levels could be rescued by a pre-incubation with IL-1β resulting in elevated cell viability. Moreover, we hypothesize that the seemingly contradictory results of increased caspase-3/-7 activity but decreased cell death do not represent the situation in a single cell but the average of a cell population.


THE EFFECTS OF PROTEIN BINDING ON THE PHYSICOCHEMICAL PROPERTIES OF THE MEMBRANES

Proteins have a limited number of interaction partners and often display their functions through bimolecular interactions. However, biological membranes display physical properties that cannot be explained at the single-molecule level. For example, membranes display trans-bilayer coupling, phase behavior, and elasticity. The chemical composition of the bilayer affects its mechanical properties and, conversely, membranes adapt their compositions such that the physical properties are maintained when external conditions change (Janmey and Kinnunen, 2006). Peripheral membrane proteins can cause changes in the physicochemical properties of the membranes, such as alterations in membrane fluidity and phase behavior, and can induce formation of lipid microdomains.

Protein-induced lipid clustering can be studied by fluorescence spectroscopy using an acyl chain–labeled lipid molecule such as BODIPY-PI(4,5)P2 (Gambhir və b., 2004). This fluorescent probe has highly superimposable absorption and emission spectra and exhibits self-quenching properties when two or more molecules are brought into proximity. If protein binding induces the formation of PI(4,5)P2 microdomains, BODIPY-PI(4,5)P2 molecules are clustered together, resulting in intramolecular self-quenching (Figure 4). In addition to BODIPY-labeled lipids, pyrene-labeled phospholipids can be applied to study lipid microdomain formation upon protein binding (Pap və b., 1995 Kinnunen and Holopainen, 2000). It is important to note that fluorometric lipid-clustering assays are very sensitive to small environmental changes for example, divalent cations induce phosphoinositide clustering in model membranes (Wang və b., 2012). Thus such assays should always be carried out with proper controls and special attention should be paid to ensure no changes in the buffer conditions occur during the assay.

FIGURE 4: Detection of PI(4,5)P2 microdomain formation by a fluorometric assay using BODIPY-PI(4,5)P2.Interaction of a protein in a multivalent manner with specific lipids (e.g., PI(4,5)P2) may induce lipid clustering. Furthermore, oligomerization of membrane-binding proteins may induce clustering of specific lipid molecules. The BODIPY fluorescent probe has highly superimposable absorption and emission spectra and exhibits self-quenching properties when two or more molecules are brought into proximity. Upon lipid clustering, BODIPY-labeled lipids (e.g., PI(4,5)P2) form excimers, which results in intramolecular self-quenching of the BODIPY fluorescence. This change in BODIPY fluorescence can be applied for studying the effects of a protein on clustering of specific BODIPY-conjugated lipid species.

Other lipid probes, such as laurdan, prodan, and pyrene, are extensively used in studies concerning structural and dynamical properties of membranes (e.g., phase behavior, lipid order, membrane fusion). These probes can be incorporated into the lipid bilayer either alone or covalently linked to fatty acids. They locate at different depths in the bilayer and display distinct photophysical properties. Pyrene-labeled phospholipids are commonly used for studying lateral diffusion and segregation of lipids, as well as for membrane fusion assays (Kinnunen and Holopainen, 2000). Laurdan and prodan probes are sensitive to the physical state of the surrounding lipids, and are thus applied to study changes in lipid order and membrane-phase behavior (Parasassi və b., 1998 Krasnowska və b., 1998 Kaiser və b., 2009).


Metodlar

Sequence alignment and family tree construction

Amino acid sequence alignments and family tree construction were performed by Genstruct, Inc. (Cambridge, MA, USA). Amino acid sequences were obtained from annotated protein sequence files obtained from the NCBI reference proteins database, RefSeq (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/) or from Swiss-Prot (http://www.expasy.ch/sprot/) ( 14 ). Rigorous identification of family member sequences was accomplished using position-specific iterated basic local alignment search tool ( psi-blast ) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Multiple sequence alignments for each family group were generated using the clustalw 2 software (http://www.clustal.org). Visualization and manual editing of alignments were performed using GeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/). Interfamily sequence alignment was accomplished using a ‘sparse alignment’ approach [S. Smith (2009), personal communication] that aligns representative members of each family using clustalw 2 to define appropriate anchor points for the interfamily alignments. The final alignments were generated by manually adding additional proteins to the alignment, ensuring alignment of key anchor points identified in the sparse alignments. The final multiple sequence alignments used for the phylogenetic analysis are illustrated in the supplemental materials as Figures S1 and S2 for the PKMTs and the PRMTs (plus DOT1L), respectively.

The phylogenetic analysis of the aligned sequences was accomplished using the phylip package developed at the University of Washington (http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html). To facilitate bootstrap analysis of the data, the seqboot program was used to create 250 randomized data representations of the input alignment for analysis. The protdist program was used to calculate pairwise distance measures between the sequences within the alignments using the blosum 45 matrix, and the program neighbor was used to construct phylogenetic trees from the distance data using the neighbor joining method. Consensus trees were built using the consense utility and uprooted trees were drawn using the drawtree program.

Determination of PMT enzymatic activity

Recombinant protein production and activity assays were performed for the 11 PMTs as described elsewhere ( 15 S. R. Daigle, E. J. Olhava, C. A. Therkelsen, C. R. Majer, C. J. Sneeringer, J. Song, D. Johnston, M. Porter Scott, J. J. Smith, Y. Xiao, L. Jin, K. W. Kuntz, R. Chesworth, M. P. Moyer, K. M. Bernt, S. A. Armstrong, R. A. Copeland, V. M. Richon, R. M. Pollock, unpublished data).

Determination of inhibitor IC50 dəyərlər

IC50 values for enzymes in the protein methyltransferase panel were determined under balanced assay conditions with both SAM and protein/peptide substrate present at concentrations equal to their respective KM dəyərlər. Where a peptide was used as methyl-accepting substrate, the peptide is referred to here by the histone and amino acid residue numbers that it represents. For example, peptide H3:16–30 refers to a peptide representing histone H3 amino acid residues 16 through 30. Flag and his-tagged CARM1 (2–585) purified from 293 cells was assayed at a final concentration of 0.25 n m against a biotinylated peptide corresponding to histone H3:16–30 (R26-Me1). E. coli-expressed EHMT2 (913–1193) was assayed at a final concentration of 0.1 n m against a biotinylated peptide corresponding to H3:1–15. Full-length EZH1 and EZH2 were expressed as four-component complexes in insect cells and purified as described elsewhere ( 15 ). EZH1 (4 n m ) and EZH2 (4 n m ) four-component complexes were assayed against a biotinylated peptide corresponding to histone H3:21–44. Insect expressed full-length PRMT1 was assayed at a final concentration of 0.75 n m against biotinylated peptide corresponding to H4:36–50. Flag-tagged full-length PRMT5 purified from 293 cells was assayed at a final concentration of 1.5 n m against a biotinylated peptide corresponding to H4:1–15. E. coli-expressed full-length PRMT8 was assayed at a final concentration of 1.5 n m against a biotinylated peptide corresponding to H4:31–45. Full-length SETD7 purified from E. coli was assayed at a final concentration of 1 n m against a biotinylated peptide corresponding to H3:1–15. Flag and his-tagged full-length WHSC1 was purified from 293 hüceyrələr and assayed at a final concentration of 2.5 n m against avian oligonucleosomes.

Determination of METTL11A enzymatic activity

Histone H3 and Histone H4 (NEB, Ipswich, MA, USA) were diluted separately in assay buffer (20 m m Tris, pH 8.0, 0.002% Tween20, 0.005% bovine skin gelatin, and 0.5 m m DTT) to a final concentration of 200 n m in a 96-well plate (25 μL each well). To monitor the reaction, 300 n m S-[methyl- 3 H]-adenosyl- l -methionine (80 Ci/mmol, from ARC) together with 200 n m cold SAM (total SAM concentration = 500 n m ) was used in each reaction. For initial determination of activity, METTL11A (Sino Biologics, Beijing, China) was added to initiate the reaction (25 μL each well for final concentration of 50 n m ). The reaction was incubated at room temperature and quenched with 10 μL per well of 300 μ m unlabeled S-adenosyl- l -methionine (Sigma, St. Louis, MO, USA) at various time-points. For detection, 50 μL of reaction was transferred to a filter plate [Millipore (Billerica, MA, USA) Multiscreen HTS FB 1.0/0.65 μm], washed three times with 10% trichloroacetic acid, washed once with 95% ethanol, and read on the Top Count (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) after the addition of 30 μL scintillant. Having established histone H4 as the preferred substrate, the enzyme concentration was titrated from 5 to 40 n m , and the reaction progress over time was determined at each enzyme concentration as described previously.

Structure determination of DOT1L with SAH or SAM bound

DOT1L-1-416 was produced in E. coli as either a GST or hexa-histidine N-terminal fusion protein. The GST-DOT1L-1-416 was cloned into the pGEX-KG vector and expressed in BL21 (DE3) cells (Novagen, Madison, WI, USA) with coexpression of chaperone plasmid pGTf2 (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) with 0.2 m m isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG), at 18 °C for 16 h. Cell pellets were suspended in buffer containing 50 m m Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7.5, 200 m m NaCl, 5% glycerol, and 5 m m β-mercaptoethanol. Cells were lysed by sonication. The supernatant was loaded onto a column of glutathione-sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare, Pittsburg, PA, USA). Protein was eluted with buffer containing 10 m m reduced glutathione. The GST-tag was cleaved from DOT1L-1-416 by thrombin and removed by a second run on a glutathione-sepharose column. The tag-free protein was purified further by SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) chromatography and eluted with 25 m m Tris–HCl, pH 8.0, 675 m m NaCl, 5% glycerol, and 5 m m β-mercaptoethanol. The protein was further purified by Superdex75 (GE Healthcare) chromatography in buffer containing 20 m m Tris–HCl, pH 8.0, 200 m m NaCl, 1 m m EDTA, and 1 m m dithiothreitol. Fractions of pure protein were pooled and concentrated to 40 mg/mL for crystallization work. The His-DOT1L-1-416 was cloned into pET30a vector with N-terminal His tag and expressed in BL21-Gold (DE3) (Stratagene, Cedar Creek, TX, USA). The culture was incubated at 37 °C until OD600 reached 0.3 and continued at 25 °C until OD600 reached 0.7. Expression was induced by adding 0.2 m m IPTG, and cells were harvested after 4 h. Cell pellet was suspended in buffer A (20 m m Tris–HCl, 500 m m NaCl, 10 m m imidazole, 10% glycerol, 5 m m β-mercaptoethanol, pH 7.8) with 1 mg/mL lysozyme and incubated on ice for 30 min. The cells were sonicated and centrifuged. The supernatant was loaded onto Ni-NTA column (Qiagen, Valencia, CA, USA) that preequilibrated with buffer A and washed with the same buffer. Protein was eluted with 200 m m imidazole in the buffer A and then dialyzed against 20 m m HEPES, 50 m m NaCl, 1 m m EDTA, 1 m m DTT, pH 7.5. The sample was loaded on a SP Sepharose Fast Flow column (GE Healthcare) and eluted with a linear gradient of 0–1 m NaCl. The target protein was concentrated and further purified by Superdex200 column (GE Healthcare) with 20 m m HEPES, 200 m m NaCl, 1 m m EDTA, 1 m m DTT, pH 7.8. Fractions of pure protein were pooled.

SAH or SAM (Sigma-Aldrich) was dissolved in the final DOT1L protein buffer to 100 m m . The DOT1L–SAH or DOT1L–SAM binary complex was prepared at a final concentration of DOT1L of 20 mg/mL (0.4 m m ) and SAH or SAM of 2 m m . Crystals were obtained in 1.94 m ammonium sulfate, 0.1 m sodium acetate, pH 5.3, and 2 m m TCEP by the hanging-drop method at 18 °C. The crystals were cryoprotected in 30% glucose and flash-frozen in liquid nitrogen. The diffraction data set for DOT1L–SAH was collected at beamline 17 U at Shanghai Synchrotron Radiation Facility and the data set for DOT1L–SAM was collected at beamline 21-ID-F at Advanced Photon Source in Argonne National Laboratory. All data were processed by HKL2000 ( 16 ). The SAH-bound crystal diffracted to 2.3 Å and the SAM-bound crystal diffracted to 2.1 Å, in the space group of P65 with one protein molecule in the asymmetric unit. The structures were solved by molecular replacement (Molrep) ( 17 ) using the published DOT1L–SAM structure (PDB ID: 1NW3) as a search model ( 18 ). Refinement was carried out by Refmac5 ( 19 ), and the model building was carried out by COOT ( 20 ). Detailed information on the diffraction data, refinement, and structure statistics is provided in Table S1.

The enzyme thus purified was tested for enzymatic activity in a radiometric assay of 3 H-CH3 transfer from labeled SAM (Perkin-Elmer) to purified nucleosomes from chicken erythrocytes according to the method of Fang və b. ( 21 ). The DOT1L used for crystallographic studies was found to have reproducible activity as a histone methyltransferase and displayed the following steady state kinetic parameters: kpişik = 0.3 per minute, = 0.67 μ m , = 8.6 n m , = 0.26 μ m . A more complete description of the enzymatic mechanism of DOT1L will be reported separately (A. Basavapathruni, C. R. Majer, R. A. Copeland and M. Porter Scott, manuscript in preparation).


Parallel single-cell analysis of active caspase-3/7 in apoptotic and non-apoptotic cells

Analysing the chemical content of individual cells has already been proven to reveal unique information on various biological processes. Single-cell analysis provides more accurate and reliable results for biology and medicine than analyses of extracts from cell populations, where a natural heterogeneity is averaged. To meet the requirements in the research of important biologically active molecules, such as caspases, we have developed a miniaturized device for simultaneous analyses of individual cells. A stainless steel body with a carousel holder enables high-sensitivity parallel detections in eight microvials. The holder is mounted in front of a photomultiplier tube with cooled photocathode working in photon counting mode. The detection of active caspase-3/7, central effector caspases in apoptosis, in single cells is based on the bioluminescence chemistry commercially available as Caspase-Glo ® 3/7 reagent developed by Promega. Individual cells were captured from a culture medium under microscope and transferred by micromanipulator into detection microvial filled with the reagent. As a result of testing, the limits of detection and quantification were determined to be 0.27/0.86 of active caspase-3/7 content in an average apoptotic cell and 0.46/2.92 for non-apoptotic cells. Application potential of this technology in laboratory diagnostics and related medical research is discussed.

Miniaturized device for simultaneous analyses of individual cells

Bu, abunə məzmununun, qurumunuz vasitəsilə girişin önizləməsidir.


Neurotransmitter Function Presynaptic Neurotransmission: Alterations in Exocytotic/Secretory Machinery and Glutamate Signaling in Kindling☆

Asymmetric Accumulation of SNARE Complexes (7SC)

We have examined the state of the SNARE proteins and several of the SNARE regulators in hippocampi from kindled animals. Initial studies showed an asymmetric accumulation of 7SCs in ipsilateral hippocampal synaptosomes prepared from animals kindled by entorhinal stimulation ( Matveeva et al., 2003 ). Control experiments suggest that this ispsilateral buildup of 7SCs is a marker of some basic biochemical change occurring during kindling and is indicative of epileptogenesis. Asymmetric accumulation cannot be induced by electroconvulsive shock nor is it seen in synaptosomes prepared from tissues outside of the limbic system, eg, cerebellum or occipital cortex. It can be induced by stimulating at several different sites including entorhinal cortex, septal region and amygdala it develops in the ipsilateral hippocampus regardless of whether the right or left hemisphere is stimulated ( Matveeva et al., 2007 ). As with kindling, asymmetric 7SC accumulation is not simply a shock burst response, but requires time to evolve and stimulation within a frequency range that promotes kindling. The accumulation occurs gradually during kindling, mirroring the progression of Racine behavioral stages ( Fig. 1 A), but it is persistent and can still be detected up to 1 year after attaining a minimally kindled state defined as two successive Stage 5 seizures ( Matveeva et al., 2008 ). It appears that a certain minimal level of kindling induction is necessary to induce permanence of the 7SCs asymmetry. In animals advancing up to but not beyond Stage 3, the asymmetry begins to develop. If they receive no further stimuli, by 1 month after the last stimulation hippocampal 7SCs symmetry is regained ( Fig. 1 B). Further, we have shown that kindling and 7SC asymmetric accumulation is associated with an increase in the amplitude of spontaneous glutamate release in the ipsilateral DG, a decrease in amplitude in the ipsilateral CA3, and no changes in signaling in the ipsilateral CA1 of the rat hippocampus ( Matveeva et al., 2012a ). Interestingly, the frequency of glutamate release in the ipsilateral DG is smaller than that seen in the ipsilateral CA1. Thus, kindling seems to alter glutamatergic signaling in multiple areas of the hippocampus and which change occurs is location specific (ie, an increase in release quanta versus an increase in the frequency of release events).

Şəkil 1. Asymmetric SNARE Complex (7SC) Accumulation Correlates with Kindling Stage. A) Animals were electrically kindled by amygdalar (open squares) or entorhinal cortical (closed squares) stimulation until they exhibited behavior consistent with the indicated Racine Stages. The next day, hippocampi were harvested from each animal and the ipsilateral/contralateral ratios of 7SCs were measured. One set of animals was fully kindled and hippocampi were harvest after 1 month (30 days). (B) Four cohorts of animals were held as naïve (no stimulation), kindled to Stage 2 by amygdalar (open bars), or kindled to Stage 4 by either amygdalar (hatched bars) or entorhinal cortical (solid bars) stimulation. Hippocampi were harvested from the animals either 1 day post stimulation or 1 month post stimulation and the ipsilateral/contralateral ratios of 7SCs were measured.

Once attained, the asymmetric accumulation of 7SCs is the most stable biochemical marker of kindling-induced epileptogenesis that we have been able to find in the literature ( Matveeva et al., 2008 ) It is not clear whether trans- və ya cis-7SCs accumulate. Əgər onlar trans-7SCs, it represents an increase in engagement of the membrane fusion machinery and our observations might be consistent with a focal enhancement of NT release. Əgər cis-7SCs accumulate, it might signal defective recycling machinery, although this would not be entirely consistent with the observed increases in NT release, particularly glutamate, measured in hippocampi from patients undergoing epilepsy surgery, in several reported seizure models, and the studies reported here.

At this stage of our investigations it is unclear whether the accumulation of 7SCs is merely an association or is part of a cause-effect relationship, either a driver of the kindled state or a sequela of the process. The control experiments described above demonstrate the tight correlation between kindling and asymmetric complex accumulation, but as discussed below, at least one anti-epilpetic drug can separate accumulation from kindling behavior. Further analysis with transgenic mice expressing reduced SNARE levels or defective SNARE regulation may prove to be a useful strategy to lower the availability of SNAREs and thus decrease the formation of 7SCs. Determining whether these conditions affect kindling progression might at least address whether complex accumulation is causative, responsive, or simply correlative. Either of the first two situations would indicate a locus for modification with agents useful to arrest epileptogenesis or quell epilepsy.


Videoya baxın: Zülal sintezi prosesi (BiləR 2022).