Məlumat

Kiçik plazmidlərdə replikasiyanın mənşəyinə nisbətən istiqamət vacibdirmi?

Kiçik plazmidlərdə replikasiyanın mənşəyinə nisbətən istiqamət vacibdirmi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

İrəli və tərs iplə bağlı son sual məni sintetik biologiyada istiqamətləndirmə konvensiyaları haqqında düşünməyə vadar etdi.

Bu sualın cavabında qeyd olunduğu kimi, yalnız DNT-ni təcrid olaraq nəzərdən keçirsək, zəncirlər simmetrikdir və birini digərindən üstün tutmağa heç bir səbəb yoxdur. Sintetik biologiyada çoxlu iş kiçik plazmidlər üzərində aparılır və bu sistemlər üçün mütləq bir istiqamətli kontekst var: replikasiyanın mənşəyi.

Replikasiyanın mənşəyi adətən dizayn vektorunda daxiletmə nöqtəsindən ayrılır, lakin replikasiya prosesi istiqamətlidir və bütün plazmid ətrafında gedir. Beləliklə, düşünürəm ki, əslində transkripsiya fəaliyyəti ilə replikasiya prosesinin qarşılıqlı təsirindən yaranan davranış fərqi ola bilər, xüsusən də replikasiyanın daha yüksək aktiv olduğu yüksək surətli plazmid üçün.

Bunun həqiqətən belə olub-olmadığını bilən varmı və nə dərəcədə narahat olmağa dəyər?


Bu sualı bəyənirəm və "İrəli və ya Ters Strand" yazısını oxuyanda belə bir fikir yarandı. O vaxtdan mən Mirkin və Mirkinin 2005-ci il nəşrini tapdım1, bir kontekstdə replikasiya çəngəlləri və transkripsiya maşınları arasında qarşılıqlı əlaqəni araşdırır. E. coli plazmid.

Abstraktdan bir parça:

oxuyur Escherichia coli replikasiya mənşəyinə nisbətən müxtəlif oriyentasiyalarda konstitutiv və ya induksiya olunan promotorlar daşıyan plazmidlər göstəririk ki, iki prosesin qarşılıqlı oriyentasiyası onların qarşılıqlı təsir rejimini müəyyən edir. Replikasiya uzadılması, koistiqamətli oriyentasiyada gedən transkripsiyadan təsirlənmir. Baş-üstə transkripsiya, əksinə, replikasiya çəngəlinin irəliləməsinin ciddi şəkildə inhibə edilməsinə gətirib çıxarır.

Bunu parçalamaq üçün təkrarlama E. coli transkripsiya sürətindən təxminən 20 dəfə sürətlə irəliləyir.2,3 Buradan iki növ toqquşma mümkündür: (1) müxtəlif istiqamətlərdə gedən replikasiya və transkripsiya komplekslərinin qovuşduğu "baş-üstə" toqquşma və ya (2) daha sürətli replikasiya kompleksinin yetişdiyi "birgə istiqamətli" toqquşma eyni istiqamətdə gedən daha yavaş transkripsiya kompleksinə. Mirkin və Mirkin müəyyən edir ki, müştərək istiqamətli toqquşmalar DNT polimeraza III holoenziminin prosesinə az təsir edir, halbuki baş-başa toqquşmalar replikasiyanın dayanmasına səbəb olur.

Bir aydın görmək olar ki, P7 promotorundan transkripsiya replikasiya ilə koordinatlı olduqda, replikasiya təsirlənmir (Şəkil 3A). Baş-üstə transkripsiya, əksinə, replikasiya çəngəlinin gedişatına ciddi məhdudiyyətlər qoydu (Şəkil 3B).

Ümumilikdə, bu, bir kağızın incisidir və mən onların təcrübələrinin məhdudiyyətlərini və nəticələri şərh edərkən xəbərdarlıqlarını yaxşı başa düşmək üçün tam müzakirəni oxumağı təklif edirəm. (məs. DNT Pol I və III-ün müxtəlif proses sürətləri və polimeraza keçid tezliyi.)


İstinadlar

  1. Mirkin EV, Mirkin SM. Bakteriyalarda transkripsiya-replikasiya toqquşma mexanizmləri. Mol Cell Biol. 2005 fevral;25(3):888-95.
  2. Gotta SL, Miller OL Jr, Fransız SL. rRNA transkripsiya dərəcəsi Escherichia coli. J Bakteriol. 1991 oktyabr;173(20):6647-9.
  3. Hirose S, Hiraga S, Okazaki T. Replikasiya mənşəyində deoksiribonukleotid polimerləşməsinin başlanğıc yeri Escherichia coli xromosom. Mol Gen Genet. 1983;189(3):422-31.

Plazmidlər 101: Plazmid nədir?

Molekulyar biologiya laboratoriyasına qoşulan hər bir yeni gələndən, şübhəsiz ki, plazmid dizaynı, dəyişdirilməsi və ya qurulması tələb olunacaq. Plazmid bakteriya hüceyrələrində tapılan kiçik dairəvi DNT parçasıdır və plazmidlərə yeni başlayan birinin plazmidi təşkil edən spesifik komponentləri və hər birinin nə üçün vacib olduğunu anlamaq üçün bəzi əlavə təlimatlara ehtiyacı ola bilər.

"Plazmidlər 101" seriyamız bütün səviyyələrdə alimləri və plazmid həvəskarlarını öyrətmək üçün nəzərdə tutulmuşdur - plazmidlərə giriş kimi xidmət edir. Plasmids 101 sizə ümumi molekulyar biologiya bilikləri və texnikaları haqqında ümumi məlumat verəcək və sizə əsasları möhkəm başa düşmək imkanı verəcək. Bizim missiyamız plazmidlər üçün birdəfəlik istinad bələdçisini hazırlamaqdır ki, siz əsasları tədqiq etməyə daha az vaxt sərf edə və sahənin inkişafı üçün zəruri olan ağılla hazırlanmış təcrübələr və innovativ həllərin hazırlanmasına daha çox vaxt sərf edəsiniz.


Mücərrəd

Plazmidlər, bakteriyalarda müəyyən edilmiş nüsxə nömrələrində mövcud olan DNT molekullarını avtonom şəkildə təkrarlayırlar. Bəzi plazmidlər üçün bu rəqəm çox aşağı ola bilər (orta hesabla hər hüceyrəyə 2-5). Stabil irsi olmaq üçün plazmidin təkrarlanması və bölünməsi ciddi şəkildə idarə edilməlidir. Plazmidlər hər iki proses üçün genetik məlumat daşıyır. Bu yazıda biz FII uyğunsuzluq qrupuna aid olan bir az nüsxəli plazmid R1-in təkrarlanmasına nəzarət sistemi haqqında məlum olanları ümumiləşdiririk. Biz bunu ona görə edirik ki, FII qrupu genetika, molekulyar biologiya və replikasiyaya nəzarət sisteminin fiziologiyası ilə bağlı ən yaxşı başa düşülən nümunələrdən biri kimi görünür. Məqalə klassik icmal deyil, çoxalma nəzarətinin vacib hesab etdiyimiz aspektlərini müzakirə etdiyimiz bir essedir.

Hazırkı ünvan: Mikrobiologiya Departamenti, Uppsala Universiteti, Biotibbi Mərkəz, Box 581, S-75123 Uppsala, İsveç.

Hazırkı ünvan: Tətbiqi Mikrob Genetikası, Kopenhagen Texniki Universiteti, Bina 221, DK-2800 Lyngby, Danimarka.

Hazırkı ünvan: P. A. Technology, Cambridge Laboratories, Melbourn, Royston, Herefordshire SG8 6DP, İngiltərə.


Mücərrəd

IncQ ailəsinin plazmidləri müxtəlif bakterial hostlarda fəaliyyət göstərə bilən unikal zəncirlə yerdəyişmə mexanizminə malik olması ilə fərqlənir. Bundan əlavə, bu plazmidlər yüksək mobilizasiyaya malikdirlər və buna görə də çox azğın olurlar. Replikonların ümumi xüsusiyyətləri DNT ardıcıllığı verilənlər bazalarında IncQ ailəsi plazmidlərini müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir və bu yolla bir neçə öyrənilməmiş plazmid daha yaxşı öyrənilmiş IncQ plazmidləri ilə müqayisə edilmişdir. Biz təklif edirik ki, IncQ plazmidləri bir sıra qarşılıqlı dəstəkləyici meyarlar əsasında dörd alt qrupa bölünə bilər. Bunlardan ən əhəmiyyətlisi, onların üç əsas replikasiya zülalının amin turşusu ardıcıllığı və hər bir alt qrupun replikonunun dörd müxtəlif mobilizasiya genləri ilə birləşməsinin müşahidəsidir. IncQ ailəsinin plazmid müxtəlifliyinə dair bu baxış bu plazmidlərin təkamülündə bir sıra hadisələri vurğulamış və gələcək tədqiqatlar üçün bir neçə sual doğurmuşdur.

Vurğulananlar

► IncQ ailəsi plazmidləri unikal zəncirlə yerdəyişmə replikasiya mexanizmini bölüşür. ► Bu replikasiya mexanizmi bütün ardıcıllaşdırılmış IncQ ailəsi plazmidlərini müəyyən etmək üçün istifadə edilmişdir. ► Belə müəyyən edilmiş IncQ ailəsi plazmidlərinin hamısı mobilizasiya oluna bilən idi. ► Müxtəlif mobilizasiya genlərinə malik dörd IncQ-plazmid alt qrupu müəyyən edilmişdir.


DNT-nin 4 Əsas Replikasiyası | Hüceyrə biologiyası

Nukleoid DNT-yə əlavə olaraq, bakteriya hüceyrəsinin sitoplazmasında nukleoid DNT-dən asılı olmayaraq çoxalda bilən plazmidlər kimi tanınan bir və ya daha çox əlavə xromosom mini-dairəvi DNT dupleksləri var.

Plazmid DNT unikal mənşəli, lakin bir istiqamətdə təkrarlanır. Bubble strukturları mənşə nöqtəsində formalaşır. Ən azı üç zülal mənşəyə yaxın birləşir və siklik molekulun super qıvrılmasına səbəb olur və bununla da RNT polimerazanın bağlandığı tək zəncirli mənşəyi ifşa edir.

RNT transkripti (RNT II) mənşə nöqtəsindən başlayır. Nəticədə DNT/RNT transkripti hibrid və tək zəncirli DNT ilə D-halqası əmələ gəlir (şək. 20.15).

Bu hibrid bir neçə primer istehsal edən transkript RNT-ni parçalayan RNAase H-ə həssasdır. İndi DNT polimeraza I RNT primerlərinin köməyi ilə DNT parçalarının sintezinə başlayır. Çəngəlin geridə qalan tərəfində n’ bağlanma yeri (rriA) var ki, burada geriləmə zəncirinin sintezi DNT polimeraza III və primo-bəzi tərəfindən başlanır.

Bununla belə, hibridləşməmiş RNT II-nin quyruğu qalsa və plazmid replikasiyası biristiqamətli qalsa, geridə qalan zəncir sintezi mənşə bölgəsindən keçə bilməz. Replikasiyadan sonra dupleks molekula çevrilmə n’ zülalının tanınma sahəsinə (rriB) bağlanması ilə başlanır.

Plazmid başqa hüceyrəyə köçürülmədikdə və ya bakteriya xromosomuna inteqrasiya edilmədikdə, plazmid replikasiyası yuxarıda təsvir edilən hüceyrə daxilində baş verir və heç bir nik əmələ gəlmir.

Lakin bəzi bakteriya hüceyrələrində cins və ya F faktoru adlanan plazmid növü var və bu, konjuqasiya zamanı alıcı bakteriya hüceyrəsinə ötürülür. F faktoruna (F+) malik olan bakteriya erkək, F faktoruna malik olan bir bakteriya isə dişi kimi fəaliyyət göstərir.

Konjugal köçürmə üçün F faktoru qismən donor hüceyrə daxilində və qismən də alıcı hüceyrə daxilində təkrarlanır. Konjugal köçürmədə bir zəncirdə, xüsusən də H zəncirində nick əmələ gəlir [plazmiddə bir H-tel (Ağır zəncir) və dupleks etmək üçün bir L tel (Yüngül zəncir) var] və endonükleaza 5′ ilə bağlı qalır. - nik tərəfi.

Yuvarlanan dairənin təkrarlanması daha sonra yeni dupleksin sintezinə gətirib çıxarır, .siklik molekul və valideyn H-tel tək zəncirli şəklində konyuqasiya borusu vasitəsilə başqa bir bakteriyaya keçə bilər. Tək zəncirli plazmid DNT-nin tamamlayıcı zənciri alıcı hüceyrədə sintez olunur və dairəvi dupleks molekul əmələ gəlir.

Replikasiya № 2. Mitoxondrial DNT:

Eukaryotik hüceyrə mitoxondriyası qapalı dairəvi dupleks DNT molekulunu ehtiva edir. Bu DNT unikal mənşədən bir istiqamətli şəkildə təkrarlanır. Bu mənşə bölgəsi həm də mitoxondrial DNT-nin həm ağır, həm də yüngül zəncirlərinin sintezi üçün başlanğıc yerini ehtiva edir. Bu fəaliyyət üçün mi&şitoxondrial DNT-yə mitoxondrial RNT polimeraza və mitoxondrial transkripsiya faktoru lazımdır.

RNT transkripti mitoxondrial genomun bütün ətrafında sintez olunur, lakin onu RNAase H-yə bənzər fəaliyyətlə emal etmək olar. Bu ferment nüvə kodlu RNT ehtiva edən ribonuklein zülaldır və transkript RNT-ni DNT sintezi və şitezi üçün bir sıra primerlərə parçalayır.

Primerlər mitoxondrial DNT polimeraza tərəfindən uzadılır y. Digər tərəfdən, kiçik bir RNT primeri mitoxondrial DNT primazı tərəfindən sintez edilir və L-zəncirinin sintezinin başlamasına səbəb olur. Hər iki zəncir sintez olunur və iki qızı molekul ayrılır.

Tetrahymena və Paramoeciumdakı mitoxondrial DNT siklik deyil, xətti dupleksdir. Tetrahymenada replikasiya molekulun mərkəzinə yaxın yerdə başlanır və göz formalı replikasiya aralıqları əmələ gəlir. Replikasiya iki istiqamətlidir. Paramoeciumda mitoxondrial DNT-nin replikasiyası çarpaz bağlı terminaldan bir istiqamətli olaraq davam edir.

Replikasiya № 3. Kinetoplast DNT:

Kinetoplastlarda ağır zəncir sintezinin birdən çox təkrarlanması mənşəli ola bilən mini-dairəvi DNT var. Geridə qalan tel sintezinin başlaması bir çox təsadüfi yerlərdə baş verir.

Replikasiya № 4. Xloroplast DNT:

Yüksək bitkilərin və xlamidomonasın xloroplast DNT-si də dairəvi DNT-ni ehtiva edir. Bu DNT D-loop quruluşu ilə çoxalır.


YƏTİN MÜDDƏTLERİ VƏ PERSPEKTİVLƏR

Bu araşdırmanın əsas vurğusu plazmidlərin genetik, biokimyəvi və molekulyar yanaşmaların birləşməsinin bir çox bioloji hadisələri aşkar etdiyi mühüm modellər olduğunu göstərməkdən ibarət olmuşdur. Plazmidləri öyrənən molekulyar bioloqlar üçün mühüm diqqət onların təkrarlanmasında iştirak edən mexanizmlərə və bu prosesin idarə olunmasına yönəlmişdir. Replikasiya tədqiqatları dairəvi və ya xətti plazmidləri təkrarlamaq üçün istifadə olunan müxtəlif mexanizmləri aşkar etmişdir. Plazmidlər xüsusi ardıcıllıq və funksiyalarla öz replikasiyasına töhfə verirlər, lakin ümumiyyətlə, ev sahibinin replikasiya mexanizmindən geniş istifadə edirlər. Buna görə də, bu genetik elementlərin təkrarlanması plazmid və host-spesifik replikasiya mexanizmləri arasında əlaqə haqqında məlumat əldə etmək üçün bir pəncərə təmin edir. Bu qarşılıqlı əlaqədə plazmidlərin mühüm ekoloji və biotexnoloji təsirləri olan müxtəlif sahibləri (yəni, onların ev sahibi diapazonunu) kolonizasiya etmək qabiliyyəti var.

Plazmid təşəbbüskarı zülallar böyük maraq doğurdu və bu aktivatorlar üzərində aparılan tədqiqatlar aktiv başlanğıc kompleksinin formalaşmasında iştirak edən spesifik zülal-zülal və zülal-DNT qarşılıqlı təsirlərinə yönəldilib. Genetik və biokimyəvi analizlər onların DNT ilə qarşılıqlı təsirinə məruz qalmış Rep variantlarının təcrid edilməsinə və xarakteristikasına imkan versə də, əksər hallarda DNT ilə əlaqədə iştirak edən müvafiq zülal sahələri aydın şəkildə məlum deyil. Zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsinə gəldikdə, mövcud məlumatlar göstərir ki, başlanğıc kompleksi yalnız mənşə bölgəsindəki DNT ilə deyil, həm də bir-biri ilə və ev sahibinin başlanğıc faktorları ilə qarşılıqlı əlaqədə olan təşəbbüskar zülalın çoxsaylı nüsxələrindən əmələ gəlir. DNT replikasiyasında membranlar. Plazmid pPS10-un Rep zülalının təhlili bu qarşılıqlı təsirlərdə iştirak edən zülal motivləri haqqında mühüm ipuçları verdi, baxmayaraq ki, şəkil tam deyil. Təşəbbüskarın strukturunun və bir çox zülal-DNT başlanğıc kompleksinin atom həlli bu qarşılıqlı təsirlərin və hədəf DNT-də baş verən dəyişikliklərin aydın şəkildə başa düşülməsi istiqamətində mühüm addım olacaqdır. Bu, təkcə zülal-DNT komplekslərinin kristal strukturlarının həlli yolu ilə deyil, həm də mövcud olan bir çox digər fiziki-kimyəvi yanaşmalardan (nüvə maqnit rezonansı, işıq və neytronların səpilməsi, dairəvi dikroizm və analitik ultrasentrikqasiya kimi) istifadə etməklə edilə bilər. az). Plazmid P1-in RepA zülalı üçün bu istiqamətlərdə bəzi addımlar atılmışdır (50).

Plazmid replikasiyasının idarə edilməsinə dair tədqiqatlar kiçik antisens RNT-lərin RNT-lərin emalında və ya transkripsiya və ya tərcümə səviyyəsində Rep-protein sintezinin xüsusi inhibəsində oynadığı rolu aşkar etmişdir. Bu mühüm kəşfin biotexnoloji və klinik əhəmiyyəti yaxşı məlumdur və əsas tədqiqatların mühüm praktik əhəmiyyətini bir daha ortaya qoyur. Antisens RNT-lərin replikasiyaya nəzarəti modullaşdırdığı müxtəlif üsullar yaxşı qurulmuşdur. Daha az tanınan mexanizm, iteronlar tərəfindən modulyasiya edilən replikasiyaya nəzarətdir və bu, aktiv tədqiqat sahəsidir.

Molekulyar bioloqlardan fərqli olaraq, mikrob ekoloqları diqqətlərini daha çox təbii mühitlərdə plazmidlərin yanal yayılmasına və davamlılığına yönəldirlər. Bununla belə, bu sahədə molekulyar biologiya üsullarının tətbiqi çatışmazlığı mövcuddur ki, bu da yeni mühitlərdən və ya həddindən artıq seçici təzyiqlərə məruz qalmamış mühitlərdən təcrid olunmuş plazmidlərin qərəzli identifikasiyası və səciyyələndirilməsi ilə nəticələnə bilər. Plazmid replikasiyasının molekulyar təhlili və təbii şəraitdə böyüyən bakteriya populyasiyalarında baş verən ona nəzarət nəzərə alınmalıdır. Eksponensial fazadan başqa inkişaf fazaları da nəzərdən keçirilməli və təhlil edilməli və qarışıq bakteriya populyasiyalarında və mikrofilmlərdə böyüyən bakteriyalarda plazmid replikasiyasını öyrənmək üçün yeni üsullar hazırlanmalıdır. Plazmidlərin saxladığı sirli funksiyaların təhlili yeni potensial maraq sahələrini aşkar edə bilər. Bioloji müxtəlifliyə töhfə verən mikroorqanizmlərin böyük əksəriyyəti olan mədəniyyətsiz bakteriyalarda plazmidlərin olması ilə bağlı araşdırma hələ də aparılmalıdır. Biotexnoloqların “qida dərəcəli” seçilə bilən markerləri olan plazmidlərə, sabit irsiyyət mexanizmlərinə və mikrobioloji cəhətdən yaxşılaşdırılmış məhsullara olan maraqları, patogenlərin kliniki epidemiyaları ilə daha çox maraqlanan xəstəxanalarda çalışan insanların maraqlarından çox fərqlidir. antibiotiklərə davamlı plazmidləri saxlayan suşlar və onların aradan qaldırılması mexanizmlərində. Plazmid daşıyan bakteriyalardan məməlilərin hüceyrələrinə gen transferi ilə bağlı son hesabat insan xəstəliklərinin məqsədyönlü gen terapiyası imkanlarını açır (55).

Nə olursa olsun, son illərdə plazmidlərin genetik və funksional təşkili haqqında çoxlu məlumat toplanmışdır ki, bu da plazmidlərin ətraf mühitdə davamlılığı və yayılması ilə əlaqəli mexanizmləri öyrənmək üçün istifadə edilə bilər. Plazmidlə kodlanmış ev sahibi öldürücü sistemlərin birləşdirilməsi ətraf mühitə buraxılacaq mikrobların dizaynında maraqlı bir xüsusiyyətdir. Plazmid replikasiyasına xüsusi mane ola biləcək mexanizmlər, həmçinin plazmid populyasiyasının kinetikasının əsasını təşkil edən hadisələr haqqında biliklər mikrob patoloqları üçün mühüm vasitədir. Ümumiyyətlə, belə nəticəyə gələ bilərik ki, böyük nailiyyətlər əldə olunsa da, plazmid biologiyasının tədqiqində yeni mərhələlər burada qeyd olunan tədqiqat sahələrinin birləşməsinə və nəhayət, onların təbii sahibləri daxilində plazmidlərin öyrənilməsinə əsaslanmalıdır. və daha təbii mühitlərdə.


Nəticələr

Geniş host diapazonlu plazmidlər taksonomik cəhətdən uzaq növlərdə daşıdıqları genləri təkrarlaya və sabit saxlaya bilir. Beləliklə, onlar rekombinant DNT texnologiyası üçün faydalı vektorları təmsil edirlər. Burada biz plazmidə geniş host diapazonunun təkrarlanması və texniki xidmət imkanları verə biləcək bir neçə xüsusiyyəti birləşdirdik. Bu, yeni plazmidlərə host diapazonunun xüsusiyyətlərini təyin etməkdə faydalı olacaq. Bununla belə, bəzi plazmidlər üçün səbəblər o qədər də aydın deyil ki, bu hallarda ev sahibi diapazonunu idarə edən bəzi naməlum mexanizmlər ola bilər. BHR plazmidlərinin məlumat bazası məhduddur və daha çox tədqiqat tələb olunur. Metagenomik tədqiqatlardan və ya ayrı-ayrı hüceyrələrdən əldə edilən yeni plazmidlər, ehtimal ki, qorunan xüsusiyyətlərə və host-plazmid qarşılıqlı əlaqəsi ilə bağlı fəaliyyət göstərən daha yeni mexanizmlərə işıq salacaq.


İçindəkilər

Termin plazmid 1952-ci ildə amerikalı molekulyar bioloq Coşua Lederberq tərəfindən "hər hansı ekstraxromosomal irsi determinant"a istinad etmək üçün təqdim edilmişdir. [4] Termin ilkin istifadəsi onun replikasiya dövrünün ən azı bir hissəsi üçün ekstraxromosomal olaraq mövcud olan hər hansı bakterial genetik materialı əhatə edirdi, lakin bu təsvir bakterial virusları ehtiva etdiyi üçün plazmid anlayışı zaman keçdikcə avtonom şəkildə çoxalmış genetik elementləri ehtiva etmək üçün dəqiqləşdirildi. [5] Daha sonra 1968-ci ildə plazmid termininin ekstraxromosomal genetik element termini kimi qəbul edilməsi qərara alındı ​​[6] və onu viruslardan ayırmaq üçün tərif yalnız və ya əsasən xromosomdan kənarda mövcud olan genetik elementlərə daraltıldı. xromosomdur və avtonom şəkildə təkrarlana bilir. [5]

Plazmidlərin hüceyrə daxilində müstəqil şəkildə çoxalması üçün onlar replikasiyanın mənşəyi kimi çıxış edə bilən bir DNT uzantısına malik olmalıdırlar. Özünü təkrarlayan vahid, bu halda plazmid replikon adlanır. Tipik bir bakteriya replikonu bir sıra elementlərdən ibarət ola bilər, məsələn, plazmid spesifik replikasiya başlanğıc zülalının geni (Rep), iteronlar adlanan təkrar vahidlər, DnaA qutuları və bitişik AT ilə zəngin bölgə. [5] Kiçik plazmidlər özlərinin surətlərini çıxarmaq üçün ev sahibi replikativ fermentlərdən istifadə edir, daha böyük plazmidlər isə bu plazmidlərin təkrarlanması üçün xüsusi genləri daşıya bilər. Bir neçə növ plazmidlər də ev sahibi xromosomuna daxil ola bilər və bu inteqrativ plazmidlər bəzən prokaryotlarda episomlar adlanır. [7]

Plazmidlər demək olar ki, həmişə ən azı bir gen daşıyır. Plazmidin daşıdığı genlərin çoxu ana hüceyrələr üçün faydalıdır, məsələn: ana hüceyrənin ölümcül və ya böyüməsini məhdudlaşdıran bir mühitdə sağ qalmasına imkan vermək. Bu genlərin bəziləri antibiotiklərə qarşı müqavimət və ya ağır metallara qarşı müqavimət xüsusiyyətlərini kodlayır, digərləri isə bakteriyaya ev sahibini koloniyalaşdırmağa və onun müdafiəsini aradan qaldırmağa imkan verən virulentlik faktorları yarada bilər və ya bakteriyaya müəyyən bir qida, o cümlədən bakteriyadan istifadə etməyə imkan verən xüsusi metabolik funksiyalara malikdir. inadkar və ya zəhərli üzvi birləşmələri parçalamaq qabiliyyəti. [5] Plazmidlər bakteriyaları azotu fiksasiya etmək qabiliyyətini də təmin edə bilər. Bəzi plazmidlərin isə ev sahibi hüceyrənin fenotipinə heç bir müşahidə oluna bilən təsiri yoxdur və ya onun ev sahibi hüceyrələrə faydası müəyyən edilə bilməz və bu plazmidlər sirli plazmidlər adlanır. [8]

Təbii olaraq əmələ gələn plazmidlər fiziki xassələrinə görə çox dəyişir. Onların ölçüsü 1 kilobaza cütlüyündən (Kbp) az olan çox kiçik mini-plazmidlərdən tutmuş, bir neçə meqabaza cütlüyünün (Mbp) çox böyük meqaplazmidlərinə qədər dəyişə bilər. Üst ucda meqaplazmid və minixromosom arasında çox az fərq var. Plazmidlər ümumiyyətlə dairəvi olur, lakin xətti plazmidlərin nümunələri də məlumdur. Bu xətti plazmidlər uclarını təkrarlamaq üçün xüsusi mexanizmlər tələb edir. [5]

Plazmidlər fərdi hüceyrədə birdən bir neçə yüzə qədər müxtəlif sayda ola bilər. Tək bir hüceyrədə tapıla bilən plazmid nüsxələrinin normal sayı plazmid nüsxə nömrəsi adlanır və replikasiya başlanğıcının necə tənzimləndiyi və molekulun ölçüsü ilə müəyyən edilir. Daha böyük plazmidlər daha az nüsxə nömrələrinə malikdirlər. [7] Hər bir bakteriyada yalnız bir və ya bir neçə nüsxə olaraq mövcud olan az nüsxə sayılı plazmidlər hüceyrə bölündükdən sonra ayrılan bakteriyalardan birində itmək təhlükəsi ilə üzləşirlər. Bu cür tək nüsxəli plazmidlər bir nüsxəni hər iki ana hüceyrəyə aktiv şəkildə yaymağa çalışan sistemlərə malikdir. ParaABS sistemi və parMRC sistemini əhatə edən bu sistemlərə çox vaxt plazmidin bölmə sistemi və ya bölmə funksiyası deyilir.

Plazmidləri bir neçə şəkildə təsnif etmək olar. Plazmidlər geniş şəkildə konyuqativ plazmidlərə və konyuqativ olmayan plazmidlərə bölünə bilər. Konyuqativ plazmidlər müxtəlif hüceyrələr arasında cinsi birləşməni təşviq edən bir sıra transfer genlərini ehtiva edir. [7] Mürəkkəb konyuqasiya prosesində plazmidlər bir bakteriyadan digərinə transfer genlərinin bəziləri tərəfindən kodlaşdırılmış cinsi pililər vasitəsilə köçürülə bilər (şəklə bax). [9] Qeyri-konyuqativ plazmidlər konyuqasiyanı başlatmaq iqtidarında deyillər, buna görə də onlar yalnız konyuqativ plazmidlərin köməyi ilə köçürülə bilər. Plazmidlərin ara sinfi mobilizasiya edilə biləndir və transfer üçün tələb olunan genlərin yalnız bir hissəsini daşıyır. Onlar konyuqativ plazmidi parazitləşdirə bilər, yalnız onun iştirakı ilə yüksək tezlikdə ötürülür.

Plazmidləri də uyğunsuzluq qruplarına bölmək olar. Mikrob müxtəlif növ plazmidləri saxlaya bilər, lakin fərqli plazmidlər uyğun olduqda yalnız bir bakteriya hüceyrəsində mövcud ola bilər. İki plazmid uyğun gəlmirsə, biri və ya digəri hüceyrədən sürətlə itəcək. Buna görə də müxtəlif plazmidlər birlikdə mövcud olub-olmamasından asılı olaraq müxtəlif uyğunsuzluq qruplarına təyin edilə bilər. Uyğun olmayan plazmidlər (eyni uyğunsuzluq qrupuna aiddir) normal olaraq eyni replikasiya və ya bölmə mexanizmlərini bölüşürlər və buna görə də bir hüceyrədə birlikdə saxlanıla bilməzlər. [10] [11]

Plazmidləri təsnif etməyin başqa bir yolu funksiyaya görədir. Beş əsas sinif var:

  • Tərkibində olan məhsuldarlıq F-plazmidləri tra genlər. Onlar birləşmə qabiliyyətinə malikdirlər və cinsi pili ifadəsi ilə nəticələnirlər.
  • Antibiotiklərə və ya zəhərlərə qarşı müqavimət göstərən genləri ehtiva edən Müqavimət (R) plazmidləri. Plazmidlərin təbiəti başa düşülməmişdən əvvəl tarixən R faktorları kimi tanınırdı.
  • Bakteriosinləri kodlayan genləri, digər bakteriyaları öldürə bilən zülalları ehtiva edən Col plazmidləri.
  • Qeyri-adi maddələrin həzmini təmin edən deqradativ plazmidlər, məs. toluol və salisilik turşu.
  • Bakteriyanı patogenə çevirən virulent plazmidlər. məs. Ti plazmiddə Agrobacterium tumefaciens

Plazmidlər bu funksional qruplardan birinə aid ola bilər.

Süni şəkildə qurulmuş plazmidlər gen mühəndisliyində vektor kimi istifadə edilə bilər. Bu plazmidlər genetika və biotexnologiya laboratoriyalarında vacib alətlər kimi xidmət edir, burada xüsusi genləri klonlaşdırmaq və gücləndirmək (çox nüsxəsini çıxarmaq) və ya ifadə etmək üçün istifadə olunur. [12] Bu cür istifadələr üçün geniş çeşiddə plazmidlər ticari olaraq mövcuddur. Replikasiya ediləcək gen adətən onların istifadəsi üçün bir sıra xüsusiyyətləri olan plazmidə daxil edilir. Bunlara müəyyən antibiotiklərə qarşı müqavimət göstərən gen (ampisilin ən çox bakteriya ştammları üçün istifadə olunur), bakterial hüceyrələrin plazmid DNT-ni təkrarlamasına imkan verən replikasiya mənşəyi və klonlama üçün uyğun sahə (çox klonlama yeri kimi istinad edilir) daxildir. ).

DNT strukturunun qeyri-sabitliyi genetik materialın gözlənilməz yenidən qurulması, itirilməsi və ya qazanılması ilə nəticələnən bir sıra kortəbii hadisələr kimi müəyyən edilə bilər. Bu cür hadisələr tez-tez mobil elementlərin köçürülməsi və ya qeyri-kanonik (qeyri-B) strukturlar kimi qeyri-sabit elementlərin mövcudluğu ilə baş verir. Bakterial onurğaya aid aksesuar bölgələr geniş struktur qeyri-sabitlik hadisələri ilə məşğul ola bilər. Genetik qeyri-sabitliyin tanınmış katalizatorlarına birbaşa, ters çevrilmiş və tandem təkrarları daxildir ki, bu da çoxlu sayda kommersiyada mövcud olan klonlama və ifadə vektorlarında nəzərə çarpır. [13] Daxiletmə ardıcıllığı həm də qonşu gen ifadəsinin silinməsinə və yenidən qurulmasına, aktivləşməsinə, aşağı tənzimlənməsinə və ya inaktivasiyasına gətirib çıxararaq plazmid funksiyasına və məhsuldarlığına ciddi təsir göstərə bilər. [14] Buna görə də, kənar kodlaşdırmayan magistral ardıcıllıqların azaldılması və ya tamamilə aradan qaldırılması bu cür hadisələrin baş verməsi meylini və nəticədə plazmidin ümumi rekombinogen potensialını əhəmiyyətli dərəcədə azaldar. [15] [16]

Klonlama Redaktəsi

Plazmidlər ən çox istifadə edilən bakterial klonlama vektorlarıdır. [17] Bu klonlama vektorlarında DNT fraqmentlərinin daxil edilməsinə imkan verən sayt var, məsələn, çoxlu klonlama yeri və ya DNT fraqmentlərinin bağlana biləcəyi bir neçə tez-tez istifadə edilən məhdudlaşdırıcı sahələrə malik polilinker. Maraqlanan gen daxil edildikdən sonra plazmidlər transformasiya deyilən bir proseslə bakteriyalara daxil edilir. Bu plazmidlər bakteriyaya xüsusi antibiotikləri ehtiva edən seçici böyümə mühitində yaşamaq və çoxalmaq qabiliyyəti verən seçilə bilən bir marker, adətən bir antibiotik müqavimət geni ehtiva edir. Transformasiyadan sonra hüceyrələr seçici mühitə məruz qalır və yalnız plazmidi olan hüceyrələr sağ qala bilər. Bu şəkildə, antibiotiklər yalnız plazmid DNT-ni ehtiva edən bakteriyaları seçmək üçün filtr rolunu oynayır. Klonlanmış əlavələrlə plazmidlərin seçilməsini asanlaşdırmaq üçün vektor digər marker genləri və ya reportyor genləri də ehtiva edə bilər. Tərkibində plazmid olan bakteriyalar daha sonra böyük miqdarda yetişdirilə bilər, yığıla bilər və maraq doğuran plazmid daha sonra plazmid hazırlamaq üçün müxtəlif üsullardan istifadə edərək təcrid oluna bilər.

Plazmid klonlama vektoru adətən 15 kbp-ə qədər olan DNT fraqmentlərini klonlaşdırmaq üçün istifadə olunur. [18] Daha uzun DNT uzunluqlarını klonlaşdırmaq üçün lizogen genləri silinmiş lambda faqından, kosmidlərdən, bakterial süni xromosomlardan və ya maya süni xromosomlarından istifadə edilir.

Protein istehsalı Redaktə edin

Plazmidlərin başqa bir əsas istifadəsi böyük miqdarda zülal hazırlamaqdır. Bu halda tədqiqatçılar maraq doğuran geni özündə saxlayan plazmid olan bakteriyaları yetişdirirlər. Bakteriya antibiotik müqavimətini təmin etmək üçün zülallar istehsal etdiyi kimi, daxil edilmiş gendən çoxlu miqdarda zülal istehsal etməyə də səbəb ola bilər. Bu, məsələn, insulin üçün gen kodlayan zülalın kütləvi istehsalının ucuz və asan yoludur.

Gen terapiyası Redaktə edin

Plazmidlər, hüceyrələrdə çatışmayan zülalı ifadə edə bilməsi üçün gen terapiyasında potensial müalicə kimi gen transferi üçün də istifadə edilə bilər. Gen terapiyasının bəzi formaları insan genomu daxilində əvvəlcədən seçilmiş xromosom hədəf sahələrində terapevtik genlərin daxil edilməsini tələb edir. Plazmid vektorları bu məqsəd üçün istifadə edilə bilən bir çox yanaşmalardan biridir. Sink barmaq nükleazları (ZFNs) DNT genomunda sahəyə xüsusi ikiqat zəncir qırılmasına səbəb olmaq və homoloji rekombinasiyaya səbəb olmaq üçün bir yol təklif edir. ZFN-ni kodlayan plazmidlər terapevtik genin müəyyən bir sahəyə çatdırılmasına kömək edə bilər ki, hüceyrə zədələnməsinin, xərçəngə səbəb olan mutasiyaların və ya immun reaksiyanın qarşısını alır. [19]

Xəstəlik modelləri Redaktə edin

Plazmidlər tarixən siçovulların genetik xəstəlik modellərini yaratmaq üçün siçovulların embrion kök hüceyrələrinin genetik mühəndisliyi üçün istifadə edilmişdir. Plazmid əsaslı üsulların məhdud effektivliyi onların daha dəqiq insan hüceyrə modellərinin yaradılmasında istifadəsini istisna edirdi. Bununla belə, adeno ilə əlaqəli virusların rekombinasiya üsulları və sink barmaq nüvələrindəki inkişaflar yeni nəsil izogen insan xəstəlik modellərinin yaradılmasına imkan verdi.

Termin epizom 1958-ci ildə Fransua Jacob və Élie Wollman tərəfindən avtonom şəkildə təkrarlana bilən və ya xromosoma inteqrasiya oluna bilən ekstraxromosomal genetik materiala istinad etmək üçün təqdim edilmişdir. [20] [21] Termin təqdim edildiyi gündən, lakin onun istifadəsi dəyişdi, məsələn plazmid avtonom şəkildə ekstraxromosomal DNT-nin təkrarlanması üçün üstünlük verilən terminə çevrilmişdir. 1968-ci ildə Londonda keçirilən simpoziumda bəzi iştirakçılar bu termini təklif etdilər epizom başqaları bu termini məna dəyişikliyi ilə istifadə etməyə davam etsə də, tərk edilməlidir. [22] [23]

Bu gün bəzi müəlliflər istifadə edirlər epizom prokaryotlar kontekstində xromosoma inteqrasiya edə bilən plazmidə istinad etmək. İnteqrativ plazmidlər bir neçə nəsil ərzində hüceyrədə təkrarlana və sabit saxlanıla bilər, lakin müəyyən mərhələdə müstəqil plazmid molekulu kimi mövcud olacaqlar. [24] Eukariotlar kontekstində termin epizom nüvədə təkrarlana bilən qeyri-inteqrasiya edilmiş xromosomal qapalı dairəvi DNT molekulunu ifadə etmək üçün istifadə olunur. [25] [26] Viruslar bunun ən çox yayılmış nümunələridir, məsələn, herpesviruslar, adenoviruslar və poliomaviruslar, lakin bəziləri plazmidlərdir. Digər misallara, genin süni gücləndirilməsi zamanı və ya patoloji proseslərdə (məsələn, xərçəng hüceyrələrinin transformasiyası) yarana bilən iki dəqiqəlik xromosomlar kimi aberrant xromosom fraqmentləri daxildir. Eukariotlardakı episomlar prokaryotlardakı plazmidlərə bənzəyir, çünki DNT sabit saxlanılır və ana hüceyrə ilə təkrarlanır. Sitoplazmik viral epizomalar (poxvirus infeksiyalarında olduğu kimi) də baş verə bilər. Bəzi epizomlar, məsələn, herpes virusları, bakterial faq viruslarına bənzər bir yuvarlanan dairə mexanizmində çoxalır. Digərləri iki istiqamətli replikasiya mexanizmi vasitəsilə təkrarlanır (Teta növü plazmidlər). Hər iki halda, episomlar ev sahibi hüceyrə xromosomlarından fiziki olaraq ayrı qalırlar. Epstein-Barr virusu və Kaposi sarkoması ilə əlaqəli herpes virusu da daxil olmaqla bir neçə xərçəng virusu, virusların xərçəng hüceyrələrinin yayılmasını təşviq edən onkogenləri ifadə etdiyi xərçəng hüceyrələrində gizli, xromosom baxımından fərqli epizomlar kimi saxlanılır. Xərçənglərdə bu episomlar hüceyrə bölündükdə host xromosomları ilə birlikdə passiv şəkildə təkrarlanır. Bu viral epizomlar çoxlu virus hissəcikləri yaratmaq üçün litik replikasiyaya başladıqda, ümumiyyətlə, ana hüceyrəni öldürən hüceyrənin anadangəlmə immunitet müdafiə mexanizmlərini aktivləşdirirlər.

Bəzi plazmidlər və ya mikrob sahiblərinə asılılıq sistemi və ya postseqreqasiyalı öldürmə sistemi (PSK), məsələn, R1 plazmidinin hok/sok (ev sahibinin öldürülməsi/öldürülməsinin qarşısını alan) sistemi daxildir. Escherichia coli. [27] Bu variant həm uzunömürlü zəhər, həm də qısamüddətli antidot yaradır. Bir neçə növ plazmid asılılığı sistemləri (toksin/antitoksin, metabolizmə əsaslanan, ORT sistemləri) ədəbiyyatda [28] təsvir edilmiş və biotexniki (fermentasiya) və ya biotibbi (vaksin terapiyası) tətbiqlərində istifadə edilmişdir. Daughter cells that retain a copy of the plasmid survive, while a daughter cell that fails to inherit the plasmid dies or suffers a reduced growth-rate because of the lingering poison from the parent cell. Finally, the overall productivity could be enhanced.

In contrast, plasmids used in biotechnology, such as pUC18, pBR322 and derived vectors, hardly ever contain toxin-antitoxin addiction systems, and therefore need to be kept under antibiotic pressure to avoid plasmid loss.

Yeasts naturally harbour various plasmids. Notable among them are 2 μm plasmids—small circular plasmids often used for genetic engineering of yeast—and linear pGKL plasmids from Kluyveromyces lactis, that are responsible for killer phenotypes. [29]

Other types of plasmids are often related to yeast cloning vectors that include:

  • Yeast integrative plasmid (YIp), yeast vectors that rely on integration into the host chromosome for survival and replication, and are usually used when studying the functionality of a solo gene or when the gene is toxic. Also connected with the gene URA3, that codes an enzyme related to the biosynthesis of pyrimidine nucleotides (T, C)
  • Yeast Replicative Plasmid (YRp), which transport a sequence of chromosomal DNA that includes an origin of replication. These plasmids are less stable, as they can be lost during budding.

Plasmids are often used to purify a specific sequence, since they can easily be purified away from the rest of the genome. For their use as vectors, and for molecular cloning, plasmids often need to be isolated.

There are several methods to isolate plasmid DNA from bacteria, ranging from the miniprep to the maxiprep or bulkprep. [12] The former can be used to quickly find out whether the plasmid is correct in any of several bacterial clones. The yield is a small amount of impure plasmid DNA, which is sufficient for analysis by restriction digest and for some cloning techniques.

In the latter, much larger volumes of bacterial suspension are grown from which a maxi-prep can be performed. In essence, this is a scaled-up miniprep followed by additional purification. This results in relatively large amounts (several hundred micrograms) of very pure plasmid DNA.

Many commercial kits have been created to perform plasmid extraction at various scales, purity, and levels of automation.

Plasmid DNA may appear in one of five conformations, which (for a given size) run at different speeds in a gel during electrophoresis. The conformations are listed below in order of electrophoretic mobility (speed for a given applied voltage) from slowest to fastest:

  • Nicked open-circular DNA has one strand cut.
  • Relaxed circular DNA is fully intact with both strands uncut but has been enzymatically relaxed (supercoils removed). This can be modeled by letting a twisted extension cord unwind and relax and then plugging it into itself.
  • Xətti DNA has free ends, either because both strands have been cut or because the DNA was linear in vivo. This can be modeled with an electrical extension cord that is not plugged into itself.
  • Supercoiled (və ya covalently closed-circular) DNA is fully intact with both strands uncut, and with an integral twist, resulting in a compact form. This can be modeled by twisting an extension cord and then plugging it into itself.
  • Supercoiled denatured DNA is like supercoiled DNA, but has unpaired regions that make it slightly less compact this can result from excessive alkalinity during plasmid preparation.

The rate of migration for small linear fragments is directly proportional to the voltage applied at low voltages. At higher voltages, larger fragments migrate at continuously increasing yet different rates. Thus, the resolution of a gel decreases with increased voltage.

At a specified, low voltage, the migration rate of small linear DNA fragments is a function of their length. Large linear fragments (over 20 kb or so) migrate at a certain fixed rate regardless of length. This is because the molecules 'resperate', with the bulk of the molecule following the leading end through the gel matrix. Restriction digests are frequently used to analyse purified plasmids. These enzymes specifically break the DNA at certain short sequences. The resulting linear fragments form 'bands' after gel electrophoresis. It is possible to purify certain fragments by cutting the bands out of the gel and dissolving the gel to release the DNA fragments.

Because of its tight conformation, supercoiled DNA migrates faster through a gel than linear or open-circular DNA.

The use of plasmids as a technique in molecular biology is supported by bioinformatics software. These programs record the DNA sequence of plasmid vectors, help to predict cut sites of restriction enzymes, and to plan manipulations. Examples of software packages that handle plasmid maps are ApE, Clone Manager, GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler, LabGenius, Lasergene, MacVector, pDraw32, Serial Cloner, VectorFriends, Vector NTI, and WebDSV. These pieces of software help conduct entire experiments in silico before doing wet experiments. [30]

Many plasmids have been created over the years and researchers have given out plasmids to plasmid databases such as the non-profit organisations Addgene and BCCM/LMBP. One can find and request plasmids from those databases for research. Researchers also often upload plasmid sequences to the NCBI database, from which sequences of specific plasmids can be retrieved.


Interesting thought! The most clear difference between a heuristic and a hyperparameter is that the heuristic is a function which is helpful in search problems, it is used to quickly weigh in different solutions, while a hyperparameter is essentially "hardcoded" in the model, thus does not help the search at all.

However, if you define a heuristic function that just returns the constant hyperparameter, then we can really say that this heuristic function is indeed the same as a hyperparameter. We usually don't view it this way though, since such a heuristic function (that always returns a constant) does not help the search of optimal parameters.


Cell Division and DNA Replication

David P. Clark,. Mişel R. McGhee, Molekulyar Biologiya (Üçüncü Nəşr), 2019

12.1 Eukaryotic Chromosomes Have Multiple Origins

Eukaryotic chromosomes are often very long and have numerous replication origins scattered along each chromosome. Replication is bi-directional as in bacteria. A pair of replication forks starts at each origin of replication , and the two forks then move in opposite directions ( Fig. 10.26 ). The bulges where the DNA is in the process of replication are often called replication bubbles .

Figure 10.26 . Eukaryotic Chromosome Replication Bubbles

Numerous openings in the DNA, or replication bubbles, occur at the sites of replication in eukaryotic chromosomes. The longer replication continues, the larger the bubbles. The bubbles eventually merge together, which separates the newly replicated DNA molecules (not shown).

A vast number of replication origins function simultaneously during eukaryotic DNA replication. For example, there are estimated to be between 10,000 and 100,000 replication origins in a dividing human somatic cell. This creates major problems in synchronization. Synthesis at each origin must be coordinated to make sure that each chromosome is completely replicated. Conversely, each origin must initiate once and once only during each replication cycle in order to avoid duplication of DNA segments that have already been replicated.

Eukaryotic chromosomes are much longer than bacterial ones and have multiple replication origins.

Just as in prokaryotes, several proteins load onto the origin of replication in a specific order to control replication initiation in eukaryotes. In eukaryotes the cell cycle consists of a “rest” period called interphase, alternating with mitosis, the process of cell division (see Fig. 10.29 for mitosis). In reality, interphase is not so restful since this is when the DNA is synthesized. Interphase it is subdivided into the G1 (gap 1), S (synthesis) and G2 (gap 2) phases.

The activity of proteins called siklinlər regulates DNA synthesis in eukaryotes at the level of the cell cycle. Cyclins act via cyclin-dependent kinases (CDKs) that phosphorylate other proteins, which in turn directly promote DNA synthesis and other cell cycle processes. In brief, G1-CDK is activated by cyclins and then, in turn, activates S-phase specific CDK (S-CDK). This triggers the assembly of proteins at the origins of replication.

This process begins when the origin recognition complex (ORC) binds to each replication origin and triggers a chain of protein interactions. First, ORC recruits Cdc6 and Cdt1 (also known as replication licensing factor). In turn, Cdc6 and Cdt1 recruit the minichromosome maintenance (MCM) complex to form the pre-replicative complex (pre-RC) , which only forms in the beginning of the G1 phase ( Fig. 10.27 ). This ensures that replication only occurs one time in each cell cycle. The MCM complex consists of 6 proteins (Mcm2 – Mcm7) that form a hexameric ring around the DNA. After activation (discussed later), MCM acts as a helicase to unwind the double helix and thus is equivalent to the bacterial helicase DnaB. Two MCM assemblies are loaded in the pre-RC. This step is also referred to as licensing the origin.

Figure 10.27 . Formation of the Pre-replicative Complex

The origin of replication successively binds the origin recognition complex (ORC) and the Cdc6 protein. Together with Cdt1, these then recruit two MCM helicase complexes. This forms the pre-replicative complex (pre-RC).

The origin recognition complex recognizes the origins of eukaryotic chromosomes. This is then joined by a series of other proteins, including MCM helicase, to form the pre-replicative complex.

Further activation of the origin is controlled by the CDK that is activated during the transition from G1 to S-phase. First, the MCM assemblies in the Pre-RC are phosphorylated by CDK. This promotes the binding of Cdc45 protein and the Sld proteins. CDK next activates Sld2 and Sld3 by adding phosphates. This enables the GINS complex to bind ( Fig. 10.28 ). (The GINS complex in named after its four proteins: Go, Ichi, Nii, and San.) The GINS complex is needed for the MCM helicase to operate but its precise function is still under investigation. Finally, protein Mcm10 binds and the assemblage separates into two replication complexes or replisomes that proceed in opposite directions from the origin. Each replisome contains one MCM helicase complex that moves along the helix in a 3′ to 5′ direction, unwinding the two strands of DNA. DNA polymerase also joins at this stage.

Figure 10.28 . Formation of Two Active Replication Complexes

The MCM helicase assemblies in the pre-replicative complex are activated by phosphorylation. This allows binding of Cdc45 and several Sld proteins. Sld2 and Sld3 are activated by phosphorylation, which enables binding of the GINS complex. (Binding of Mcm10 and recruitment of DNA polymerase then triggers separation of the assembly into two replisomes that move in opposite directions—not shown).


Materiallar və metodlar

Plasmids and strains

Dimers of miniP1 plasmid pSP102 (Pal et al., 1986) were obtained by linearizing the plasmid with HindIII, subsequent ligation and transformation of a recA host, DH5Δlak (Sozhamannan and Chattoraj, 1993). Except for pVM11, all other miniP1 plasmids used in this study are isogenic to pSP102 except for a single mutation in repA (Figure  3 ) or the additional par locus (pBEF120 Funnell, 1988 Figure  1 ). pVM11 (Figure  2 ) was derived from pSP102. The BamHI–PstI fragment carrying the pişik gene of pSP102 was replaced with the BamHI–PstI fragment carrying the spesifikasiya gene (Taylor and Cohen, 1979) of plasmid pSE418 (S.Elledge, unpublished data). From the resultant miniP1 plasmid, pDKC409, 𢏁 kb of DNA between PvuII sites was deleted that included the C-terminal half of the repA open reading frame (codons 63�) and sequences upstream of the spesifikasiya gen. pVM11 (𢏃 kb) is Spec R and replicates only in the presence of a trans source of RepA.

pSP102 dimers with one of the origins partially deleted (Figure  4 ) were made by partial digestion with HindIII and gel isolation of the full-length (8.5 kb) HindIII fragment. The fragment was partially digested with PvuI, and the 7.5 kb PvuI–HindIII fragment with one of the origins entirely deleted was gel purified. This fragment is ligated to two partially deleted origin fragments. The fragment deleted for the AT-rich half of the origin (called 㥊T) was obtained from pRJM358 (Sozhamannan and Chattoraj, 1993). First the ScaI–SspI region containing the bla-p1 promoter was deleted from pRJM358 to avoid any possible influence of the vector promoter on miniP1 copy number. The deleted DNA subsequently was digested with PvuMən və HindIII, and a 1 kb PvuI–HindIII fragment containing pBR322 sequences between PvuMən və EkoRI (without the ScaI–SspI region) and the five origin iterons (P1 coordinates 504�) was ligated to the 7.5 kb PvuI–HindIII fragment. The origin fragment without the iterons (called ΔincC) was obtained from pPP101. The plasmid was constructed by cloning the 216਋p RsaI–NruI fragment of the P1 origin (P1 coordinates 287�) into the HincII site of pUC19. The P1 origin region was removed from pPP101 by digestion with PvuMən və HindIII, and the 1 kb PvuI–HindIII fragment was ligated to the 7.5 kb fragment. To generate plasmid Δ(AT+incC), the ΔincC plasmid was digested with SphMən və XbaI that flanked the AT-rich half and the ends ligated after they were made blunt with T4 polymerase.

Plasmid stability and copy number

The dimers of both pSP102 and pBEF120 were slightly unstable compared with monomers without selection. After � generations of growth in the absence of selection at 37ଌ, plasmid-carrying cells were 100% for pSP102 monomer, 91 ±ਅ% for pSP102 dimer, 100% for pBEF120 monomer and 92 ±ਈ% for pBEF120 dimer. Therefore, copy numbers were measured under selection only (Sozhamannan and Chattoraj, 1993).

Characterization of replication intermediates

The procedure to isolate intracellular DNA and its analysis in two-dimensional gels have been described (Park and Chattoraj, 2001).

Determination of topoisomer distribution by two-dimensional gel electrophoresis

A drug-permeable host (AS19 Wu and Liu, 1992) was transformed separately with monomer and dimer size plasmid DNA, and the transformants, after one round of purification on plates, were used to innoculate cultures for plasmid isolation. In this way, the majority of the plasmid DNA could be obtained in its original size. Cultures of AS19 cells (20 ml) with the desired plasmid(s) were grown to an OD600 of 0.2. A fresh solution of novobiocin was added to a final concentration of 100 µg/ml and the culture was grown for another 30 min and chilled on ice. A total of four OD600 units of cells was used for DNA isolation using a QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen Inc.). DNA was recovered in 50 ml of TE. A 4 µl aliquot was used for gel electrophoresis. The gel was 20਌m ×ꀠ਌m ×਀.6਌m 1% agarose in 0.5 TPE buffer and was run for � V-h (typically at 40 V overnight). The gel was soaked in 0.5 TPE +ꀕ µM chloroquine (Sigma) for 2 h in the dark and run in the second dimension using a fresh solution of 0.5 TPE +ꀕ µM chloroquine for � V-h (typically at 70 V). The gel was dried under vacuum without heat for 30 min and for another 30 min at 60ଌ. The dried gel was placed between two sheets of plastic mesh (FM-100 FlowMesh, Diversified Biotech) for protection during subsequent handling (Lueders and Fewell, 1994). The gel was soaked in 0.25 M HCl for 20 min, rinsed in H2O, soaked in 0.5 M NaOH +਀.15 M NaCl for 20 min, and rinsed in H2O for 5 min (twice) and in 0.5 M Tris pH 8.0 +਀.15 M NaCl for 20 min. Hybridization with radiolabeled probes (pAO or pSP102) was in 6× SSPE, 0.5% SDS, 0.05% sodium pyrophosphate, for 18 h at 55ଌ (SSPE is 0.15 M NaCl, 10 mM NaH2PO4 pHਇ.7). No pre-hybridization was necessary. Washing was in 2× SSC +਀.1% SDS for 15 min at room temperature and in 0.1× SSC +਀.1% SDS for 30 min at 60ଌ and a further 60 min at room temperature with two changes. The gel was transferred from the plastic screens to a sheet of 3M paper, covered with Saran wrap and exposed to phosphoimaging plates (Fuji) for subsequent analysis in a Fujix BAS2000 image analyzer.



Şərhlər:

  1. Vikora

    İçində bir şey var. Bu sualda köməyə görə sizə minnətdarıq. Mən bunu bilmirdim.

  2. Ihsan

    Hesab edirəm ki, haqlı deyilsən. Əminəm. Bunu müzakirə etməyi təklif edirəm. PM-də mənə yaz.

  3. Galen

    Və məntiq harada?



Mesaj yazmaq