Məlumat

Plazmid spesifik DNT deqradasiyası

Plazmid spesifik DNT deqradasiyası


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mənə maraqlıdır ki, metodun xromosom DNT-yə heç bir zərər verməməsi üçün xüsusi olaraq E.Coli hüceyrəsindəki plazmid DNT-ni deqradasiya etməyin bir yolu varmı? Əvvəlcə məhdudlaşdırıcı endonükleazlar haqqında düşünürdüm, amma qorxuram ki;

  • kifayət qədər spesifik deyil və hüceyrəni öldürür
  • ya da heç nə etmir, çünki E.Coli plazmid DNT-ni də metilləşdirir

İkinci fikrim CRISPR/Cas9 sistemi idi, lakin bu, problemin həddindən artıq mürəkkəbliyi kimi səslənir. Daha sadə fikirlər varmı? (Məs. xüsusi fermentlər üçün)

EDIT: əsas ideya yönləndirilmiş təkamüllə daha bacarıqlı E.Coli hüceyrələri yaratmaqdır. Hal-hazırda bu, sadəcə bir düşüncə təcrübəsidir, ona görə də xüsusi plazmid ardıcıllığı yoxdur. Təfərrüatlarda; Mən plazmidi hüceyrələrə çevirərdim, sonra antibiotiklə seçim hissəsini edərdim və onların böyüməsinə icazə verərdim, sonra hüceyrələri antibiotik olmayan bir mühitə köçürür və plazmid-DNT-hidrolaz fermentini induksiya etmək üçün IPTG əlavə edərdim. digər seçim hissəsi hələ də plazmidi olan hüceyrələri çıxarmaq üçün yerinə yetirilə bilər (məsələn, plazmiddə bir GFP geni varsa, FACS ilə), sonra hüceyrələri yenidən CaCl2 ilə səlahiyyətli hala gətirin və bütün bu prosesi təkrar-təkrar edin.


E. Coli-dən plazmidi çıxarmaq üçün ənənəvi üsul hüceyrələrin Etidium bromidi ilə böyüməsidir.

http://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=186&sim=1097&cnt=1


Hüceyrədənkənar genomik, plazmid DNT və xüsusi antibiotik müqavimət genlərinin xlorlama yolu ilə deqradasiyası

Müvafiq içməli su, tullantı suları və təkrar istifadə üsullarını inkişaf etdirmək üçün xlor dezinfeksiyasının antibiotik müqavimət genlərinə (ARGs) təsirinin başa düşülməsinə ehtiyac var. Bununla belə, az sayda tədqiqat DNT-yə fiziki təsirləri açıq şəkildə qiymətləndirmişdir. Burada sərbəst xlorun (1-20 mq Cl.) təsirini araşdırdıq2/L) hüceyrədənkənar genomik, plazmid DNT və seçilmiş ARG-lərdə. Xlorlamanın qeyri-xlor nəzarəti ilə müqayisədə hüceyrədənkənar genomik və plazmid DNT-nin flüorometrik siqnalını (0,005-0,05 μg/mL arasında) 70% azaltdığı aşkar edilmişdir. Nəticədə alınan DNT daha sonra Bioanalizatordan istifadə edərək fraqment analizinə məruz qaldı ki, bu da xlorlamanın parçalanma ilə nəticələndiyini göstərir. Bundan əlavə, xlor həm xromosom, həm də plazmid daşıyan ARG-ləri effektiv şəkildə təsirsiz hala gətirir, mecA və tetmüvafiq olaraq A. Konsentrasiyalar üçün >2 mg Cl2//L × 30 dəq, ARG-lərin ilkin konsentrasiyası 10 5 nüsxə/μL və ya daha az olduqda xlor qPCR siqnalını səmərəli şəkildə azaldıb. Xüsusilə, genomik DNT və mecGen siqnalları xlorla plazmid daşıyıcılarından daha asan azaldıldı tetBir gen (tərəfindən

2 qat). QPCR nəticələrinə əsasən qısa (

200 bps) və uzun amplikonlar (

1200 bps), xlorlama ARG-lərin bütövlüyünü poza bilər ki, bu da təbii çevrilmə ehtimalını azaldır. Ümumilikdə, tapıntılarımız xlorlamanın hüceyrədənkənar xromosom və plazmid daşıyan DNT və ARG-ləri təsirsiz hala gətirmək üçün təsirli bir üsul ola biləcəyini güclü şəkildə göstərir.


Plazmid vektorlarının əsas xüsusiyyətləri

Tetrasiklin ribosomun translokasiyasının qarşısını almaq üçün ribosomun 30S alt bölməsinə bağlanır
tet müqaviməti tetrasiklinin hüceyrəyə daxil olmasına mane olan bir protein istehsal edir.

Xloramfenikol protein sintezinin qarşısını almaq üçün ribosomun 50S alt bölməsinə bağlanır
cat (xloramfenikol müqaviməti) xloramfenikolu ribosomu bağlaya bilməyən bir formaya çevirən bir ferment sistemi komponenti istehsal edir.

Kanamisin (və yaxından əlaqəli neomisin) ribosomun alt komponentlərini bağlayan və zülal sintezinin qarşısını alan aminoqlikozidlərdir.
kan (və neo) müqaviməti onların hüceyrəyə daşınmasını maneə törədən periplazmik boşluqda yerləşən aminoqlikozid fosfotransferazanın sintezindən asılıdır.


Xenopus laevis oositlərində zəncirli spesifik ekzonükleaz aktivliyi ilə xətti DNT-nin deqradasiyası.

Xenopus laevis oosit nüvələrinə yeridilmiş xətti DNT, üst-üstə düşən molekulyar uclarda homoloji ardıcıllıqlar varsa, yüksək effektivliklə rekombinasiya olunur. İnyeksiya edilmiş xətti DNT-nin 3'-quyruqlu molekulların heterojen populyasiyasını tərk etmək üçün oosit nüvəsində inkubasiya zamanı 5'----3' zəncirinə xas ekzonükleaz aktivliyi ilə parçalandığını aşkar etdik. Enjekte edilmiş DNT konsentrasiyasının azalması heterojenliyi və orta tənəzzül sürətini artırdı. Yaradılan 3' quyruğu, bir gecədə inkubasiyadan sonra davam edən molekullar arasında nisbətən sabit idi, bir çoxunun 3' quyruğu orijinal ucların 10 əsasına qədər toxunulmaz idi. Oositlərdə homoloji rekombinasiya üçün səmərəli substratlar olan DNT molekulları da qismən parçalanmış və 3' quyruq buraxmışdır. Digər güclü nüvə fəaliyyətləri üçün heç bir dəlil tapmadıq. Əgər 3'-OH ucları girintili molekullar yeridilsəydi, endogen polimeraza 5' quyruğunun deqradasiyası baş verməzdən əvvəl tamamlayıcı telləri effektiv şəkildə yenidən sintez etdi. 3'-quyruqlu molekullar Xenopus oosit nüvələrində homoloji rekombinasiya hadisələrinin başlanmasında ağlabatan ara məhsullardır.


Materiallar və metodlar

Plazmid DNT-nin hazırlanması

Plazmid molekulları pGEM-5S, pGEM-9Z-f(−)-in 3126 bp superdolaqlı qapalı dairəvi ikiqat zəncirli plazmid altklonudur. Xenopus borealis ( 18 ), aşağı kütləvi DNT, ribonuklein turşusu və duzlarla çirklənməni aradan qaldırmaq üçün hazırlanmış və təmizlənmişdir. Plazmid əsas ardıcıllıqla hesablanmış sərbəst turşu üçün 1 945 664 Da proqnozlaşdırılan MW-a malik idi (18). Plazmid transformasiya edilmiş formada becərildi Escherichia coli JM109 və qələvi lizisdən sonra super qıvrılmış DNT CsCl sıxlığı qradiyenti sentrifuqasiyası ilə ayrıldı. Ammonium asetat məhlulundan ardıcıl 100% etanol çöküntüsü Centricon-100 (Amicon, Danvers, MA) ilə ultrasüzgəcdən keçirildi. Hazırlıqlar əsasən nicked dairəvi və linearized plazmid tərəfindən kiçik töhfələri ilə supercoiled növ ibarət idi.

Elektrospreylənmiş plazmid DNT-nin elektroforezi

Elektrosprey ionlaşması zamanı plazmidin taleyi keçirici səthlərdə nümunələrin toplanması və sonra agaroz gel elektroforezinin təhlili ilə tədqiq edilmişdir (5). Hədəflər kimyəvi cəhətdən təmiz paslanmayan polad folqa və ya sulu 9 mM Tris, 9 mM bor turşusu və 1% agaroza gel ilə stabilləşdirilmiş 0,2 mM EDTA (TBE) tamponlu damcıdan (50 µl) ibarət idi. Plazmid (deionlaşdırılmış suda 10 µg/µl) 0,2-0,5 µl/dəq sürətlə ion mənbəyinə çatdırıldı və hədəflər atmosfer təzyiqində ESI-MS interfeysinin giriş lövhəsində (aşağıya bax) başqa cür eyni şərtlər altında yerləşdirildi. sonra təsvir edilən ESI-MS təcrübələri (yəni, qabıq qazı və əks axın qazı, həmçinin plitə arxasında diferensial nasos olduqda). Hədəf qurudulduqdan sonra plazmid 50µl TBE tamponuna ekstraksiya edilmişdir. Alınmış plazmid nümunələrinin elektroforetik analizi etidium bromid (0,5 µg/ml) ilə vizuallaşdırma ilə TBE-də tamponlanmış 1% agaroz gellərində olmuşdur.

Kütləvi spektrometriya

İlkin ESI-MS təcrübələri həlletmə gücü (m/Δm) ~800 və kütlə diapazonu 1400 () olan Sciex (Thornhill, ON, Kanada) TAGA 6000E üçlü dördqütblü kütlə spektrometrindən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. m/z ). Bu alət burun-skimmer interfeysinə malik prototip ESI mənbəyi ilə təchiz edilmişdir (19). Plazmid nümunələrinin toplanması və plazmid DNT kütlə spektrlərinin əldə edilməsi üçün aşağıdakı parametrlərdən istifadə edilmişdir: 0,2 µl/dəq püskürtmə gərginliyi, −60 V skimmer gərginliyi −150 −2,5 kV başlıq gərginliyi, 0,2µl/dəq deionlaşdırılmış su nümunəsində 10µM DNT nümunələri V Koaksial axınlar SF 6 və əks cərəyan N 2 DNT nümunələrinin ESI üçün istifadə edilmişdir.

FTICR təcrübələri Oxford 7-Tesla superkeçirici maqnit ilə dəyişdirilmiş IonSpec (Irvine, CA) FTICR istifadə edilməklə və dəyişdirilmiş Analytica (Branford, CT) ESI mənbəyi (7) ilə həyata keçirilmişdir. Zaman domeni siqnalının əldə edilməsi Omega məlumat sistemindən (versiya 3.0) və ayrıca, evdə qurulmuş, uzadılmış vaxt domen məlumatlarının əldə edilməsi sistemindən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir (8, 15). Plazmid DNT nümunəsi deionlaşdırılmış suda 0,2 mq/ml (0,1 µM) yekun konsentrasiyası ilə yuxarıda göstərildiyi kimi hazırlanmışdır. Nümunə yuxarıdakı kimi elektrosprey idi və ionlar FTICR hüceyrəsində 1 saniyə ərzində ~10 -4 Torr (azot) ilə toplandı, 15 saniyə ərzində toqquşma şəraitində soyudulmuş və cingilti həyəcanı (süpürmə sürəti 35 Hz/µs) və genişzolaqlı məlumatların əldə edilməsi ilə aşkar edilmişdir. (200 kHz seçmə sürətindən istifadə etməklə) 40 s ( 7 ). Kütlənin və yükün təyini üçün, yük vəziyyətinin dəyişməsinə səbəb olmaq üçün fərdi DNT ionlarının sirkə turşusu ilə qaz fazası reaksiyasından istifadə edilmişdir. Kütləvi spektrlər sistemə sirkə turşusunun impulslu əlavə edilməsindən bir neçə dəqiqə sonra əldə edildi (bu, sistem təzyiqini bir neçə saniyə ərzində 10 −9-dan 10 −7 Torr-a qaldırdı) ( 15 ) ki, bu da yük ötürülməsi reaksiyalarını istənilən səviyyədə asanlaşdırdı. dərəcəsi.


DNT-nin ultrasəs deqradasiyası

Sulu məhluldakı DNT və bioloji toxumadakı DNT ultrasəsə məruz qaldıqda fərqli nəticələr əldə edilir. Klinik olaraq tətbiq olunanlarla müqayisə edilə bilən ultrasəs intensivliyində ultrasəsləşdirmə sulu məhlulda təmizlənmiş DNT-ni parçalaya bilir və ultrasəsləmə DNT fraqmentlərinin hazırlanması üçün faydalı bir vasitə halına gətirir. in vitro. Məhlulda DNT-nin ultrasəs deqradasiyası hidrogen bağlarının qırılması və DNT sarmalının tək və iki zəncirli qırılması ilə baş verir. Əsasən iki mexanizm məsuliyyət daşıyır: kavitasiya və istilik və ya mexaniki təsir. Ultrasəsin aşağı intensivliyində sabit kavitasiya müşahidə olunur. Ultrasəsin intensivliyinin 2 Vt/sm 2-dən yuxarı artması keçici kavitasiya ilə sərbəst radikalların yaranması səbəbindən tək zəncirli qırılmaların artması ilə müşayiət olunur. Sonikasiyadan sonra yaranan DNT fraqmentlərinin paylanması 100-500 bp aşağı ölçü həddinə yaxınlaşır. DNT sarmalında qırılmalar əsasən oksigen və karbon atomları arasında baş verir, nəticədə fosforlanmış 5′ ucu və 3′ ucunda sərbəst spirt olan DNT fraqmentləri əmələ gəlir. DNT spiralının deqradasiyasında spesifikliyin nisbi olmaması ultrasəsləşdirməni məhdudlaşdırıcı endonükleazlar tərəfindən əldə edilən yüksək spesifik parçalanmaya tamamlayıcı alternativ edir.


Plazmid spesifik DNT deqradasiyası - Biologiya

MDPI tərəfindən nəşr olunan bütün məqalələr açıq giriş lisenziyası altında dərhal bütün dünyada mövcuddur. MDPI tərəfindən dərc edilmiş məqalənin, o cümlədən rəqəmlər və cədvəllər də daxil olmaqla, hamısının və ya bir hissəsinin təkrar istifadəsi üçün xüsusi icazə tələb olunmur. Açıq giriş Creative Common CC BY lisenziyası altında dərc olunan məqalələr üçün məqalənin hər hansı bir hissəsi orijinal məqaləyə aydın şəkildə istinad etmək şərti ilə icazəsiz təkrar istifadə edilə bilər.

Feature Papers sahədə yüksək təsir üçün əhəmiyyətli potensiala malik ən qabaqcıl tədqiqatları təmsil edir. Bədii məqalələr elmi redaktorlar tərəfindən fərdi dəvət və ya tövsiyə əsasında təqdim olunur və dərc edilməzdən əvvəl ekspert rəyindən keçir.

Bədii məqalə ya orijinal tədqiqat məqaləsi, tez-tez bir neçə texnika və ya yanaşmanı özündə cəmləşdirən əsaslı yeni tədqiqat işi, ya da elmi sahədə ən maraqlı nailiyyətləri sistematik şəkildə nəzərdən keçirən sahədəki ən son irəliləyişlərə dair qısa və dəqiq yenilikləri olan hərtərəfli icmal sənədi ola bilər. ədəbiyyat. Bu tip kağız tədqiqatın gələcək istiqamətləri və ya mümkün tətbiqlər haqqında dünyagörüşünü təqdim edir.

Redaktorun Seçimi məqalələri dünyanın hər yerindən MDPI jurnallarının elmi redaktorlarının tövsiyələrinə əsaslanır. Redaktorlar jurnalda bu yaxınlarda dərc edilmiş az sayda məqaləni seçirlər ki, onlar müəlliflər üçün xüsusilə maraqlı və ya bu sahədə vacib olacaq. Məqsəd jurnalın müxtəlif tədqiqat sahələrində dərc edilmiş ən maraqlı işlərdən bəzilərinin şəklini təqdim etməkdir.


Plazmid spesifik DNT deqradasiyası - Biologiya

Şablon təmizlik və konsentrasiya avtomatlaşdırılmış flüoresan kapilyar ardıcıllıqla optimal nəticələr əldə etmək üçün ən vacib iki amildir. Aşağı keyfiyyətli şablon DNT və ya qeyri-optimal miqdarda şablon DNT ardıcıllıq reaksiyasının müvəffəqiyyətinə əhəmiyyətli təsir göstərəcək.

Əgər siz Sanger DNT Sequencing üçün DNT şablonlarını (plazmid DNT, PCR amplikonları) hazırlayırsınızsa, lütfən, tövsiyələrimizə və təlimatlarımıza əməl etməklə mövzu üzrə təcrübəmizdən yararlanın. Biz istərdik ki, Sanger DNT Sequencing nümunələri ilk dəfə işləsin və yüksək keyfiyyətli məlumatla nəticələnsin - təkrar etməyə və ya problemlərin aradan qaldırılmasına ehtiyac olmadan!

Kapilyar ardıcıllıq üçün Plazmid DNT Şablonunun hazırlanması:

Bu gün əla keyfiyyətli şablon DNT əldə edən çoxsaylı üsullar və plazmid hazırlama dəstləri mövcuddur. Bu seçimlərin hamısı olmasa da, əksəriyyəti dəyişdirilmiş qələvi lizis prosedurundan istifadə edir. Tez-tez bəzi ümumi səhvlər və ya xüsusi protokol addımlarının buraxılmaması nəticəsində yaranan müxtəlif amillər keyfiyyət plazmid DNT şablonunun.

  • - Duzlar, üzvi kimyəvi maddələr (fenol, xloroform və ya etanol) və qalıq yuyucu vasitələr kimi çirkləndiricilər
  • - RNT, zülallar, polisaxaridlər və ya xromosom DNT kimi hüceyrə komponentlərinin olması
  • - Silisium xırdalarının daşınması - Saxlama zamanı deqradasiya
  • - Plazmid DNT molekullarının heterojen populyasiyası (başqa plazmidlə çirklənmə)

Aşağı keyfiyyətli şablon DNT səs-küylü məlumatlar (yəni oxunan ardıcıllıqda əsas zirvələrin altındakı kiçik ikinci dərəcəli zirvələr), yararsız ardıcıllıq məlumatları (yəni ardıcıllıq datası əsasən N-ləri ehtiva edir) və ya zəif siqnal ilə nəticələnə bilər. Bundan əlavə, keyfiyyətsiz şablon DNT kapilyar sıranın ömrünü azalda bilər.

Kommersiya baxımından mövcud olan hər hansı məhsulu təsdiqləməsək də, plazmid hazırlama protokollarına diqqətlə və aşağıdakıları nəzərə alaraq riayət etməyi təklif edirik. tövsiyələr:

  • İzopropanol ilə çökdürülmüş Plazmid DNT artıq duzu çıxarmaq üçün 70% etanol ilə yuyulmalıdır (ən azı bir dəfə göstərişə uyğun olaraq). Son şablon hazırlığında qalıq duz Taq polimerazanın fəaliyyətinə mənfi təsir göstərəcək.
  • Şablon DNT nükleazsız suda, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 (EB Bufer) və ya Aşağı TE Tamponunda (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.5-) son resuspensiyadan əvvəl tamamilə qurudulmalıdır. 8.0). Qalıq etanol Taq dövrünün ardıcıllığına zərərlidir. Plazmid DNT-nin təmizlənməsi üsulu spin kolonunun istifadəsini nəzərdə tutursa, sonuncu yuyulma addımından sonra (sütundan plazmid DNT-ni çıxarmazdan əvvəl) sütunda tutula bilən etanolun çıxarılmasına diqqət yetirilməlidir. Əvvəlcə sütunu (qab borusunun üzərində oturaraq) 180 dərəcə fırlamağı və ikinci (“quru”) sentrifuqa addımı ilə davam etməyi tövsiyə edirik.
  • Hər hansı qalıq sütun qatranını çıxarmaq üçün fırlanma sütununun elüsyonundan sonra əlavə sentrifuqasiya addımını tövsiyə edirik ki, bu da ardıcıllığın zəif nəticələri ilə nəticələnəcək. Elüt edilmiş plazmid DNT-nin maksimum sürətlə 5 dəqiqə sentrifuqalanmasından sonra nümunənin ən yuxarı hissəsi təzə boruya köçürülməlidir.
  • Sütunların həddən artıq yüklənməsinin qarşısını almaq üçün hüceyrə böyüməsi üçün metoda xas istiqamətlərə əməl edilməlidir ki, bu da aşağı DNT məhsuldarlığı və arzuolunmaz çirkləndiricilərin daşınması ilə nəticələnəcək.
    Plazmidin yayılması üçün istifadə edilən E. coli host ştammı təmizlənmiş DNT-nin keyfiyyətinə əhəmiyyətli təsir göstərə bilər. DH1, DH5&alpha və XL1-Blue kimi ən çox istifadə edilən suşlar ardıcıl olaraq yüksək keyfiyyətli plazmid DNT istehsal edir. HB101 və onun törəmələri (TG1 və JM100 seriyası kimi) kimi ana suşların şablon keyfiyyətinə görə dəyişkənlik mənbəyi olduğu bilinir.
  • Yaxşı mikrobioloji təcrübələrə riayət etməyin vacibliyini vurğulamaq istərdik:
    • Nümunənizdə unikal DNT məhsulu olmalıdır: Böyümə mühitinin inokulyasiyasından əvvəl (transformasiya plitələrindən koloniyaları zolaqlamaqla) təmiz "tək" bakterial klonlar əldə edilməlidir.
    • Plazmid daşıyan klonun yayılması həmişə müvafiq antibiotikin iştirakı ilə aparılmalıdır.

    DNT Kəmiyyəti

    DNT keyfiyyətində olduğu kimi, şablon DNT-nin kəmiyyəti də ardıcıllıq reaksiyasının uğuru üçün eyni dərəcədə vacib müəyyənedicidir - yəni bu, yüksək dəqiqlik və etibarlı DNT ardıcıllığı məlumatlarının əldə edilməsi üçün ilkin şərtdir. Çox az şablon, az və ya heç bir siqnal və zəif və ya heç bir əsas çağırış olmayan reaksiyalara səbəb olur. Həddindən artıq DNT ardıcıllıq reaksiyasının vaxtından əvvəl dayandırılmasına səbəb olur, tez-tez 250 əsasdan az etibarlı ardıcıllıq məlumatı verir. Buna görə də yüksək keyfiyyətli şablon DNT-nin dəqiq kəmiyyəti ümumi ardıcıllıq prosesində mühüm addımdır.

    Tövsiyələrimizi nəzərdən keçirmək üçün bir az vaxt ayırın DNT konsentrasiyasını təyin etmək üçün:

    • DNT konsentrasiyası mümkün olduqda spektrofotometriya ilə müəyyən edilməlidir.
    • Nəzərə alın ki, əksər spektrofotometrlər 0,05-dən aşağı OD (Optik Sıxlıq) dəyərlərində heç də dəqiq deyil. Təkrarlana bilən və etibarlı nəticələr vermək üçün OD260 dəyərləri 0,05 ilə 0,8 aralığında olmalıdır. Qeyd: Bir çox spektrofotometrlər 0,05-də oxuya bilər, lakin yalnız istinadla (boş) çox diqqətlə kalibrləndikdə. Plazmid DNT mini-hazırlanması (və ya PCR aşağıya bax) adətən əksər laboratoriyalarda tapılan tipik spektrofotometrlərdə dəqiq kəmiyyət müəyyən etmək üçün kifayət qədər DNT vermir. Nəticələrinizlə çox diqqətli olmalısınız - əgər siz 10 ul (və ya nümunənizin xüsusiyyətlərindən asılı olaraq, bəlkə də 100 ul kimi yüksək) kyuvet həcmi ilə OD ölçməsini həyata keçirə bilmədiyiniz halda.
    • Əgər NanoDrop UV spektrofotometrindən istifadə edirsinizsə, postamenti tez-tez təmizlədiyinizə və cihazı vaxtaşırı kalibrlədiyinizə əmin olun. Plazmid DNT mini-preparatının konsentrasiyasını ölçərkən qeyri-adi yüksək OD müşahidə etsəniz, nümunənizdə RNT və ya xromosom DNT ola bilər. Bu, plazmid DNT mini-prepsləri ilə uğursuz ardıcıllığın bir nömrəli səbəbidir.
    • Nümunənizin 260/280 nisbəti ideal olaraq 1,8 ilə 2,0 arasında olmalıdır. 1,6-dan aşağı və 2,0-dan yuxarı dəyərlər nümunədəki çirkləndiriciləri göstərir. Bunlar konsentrasiyanın təyin edilməsinə mane ola bilər və ardıcıllıq reaksiyasını maneə törədə bilər.
    • Mümkünsə, OD-ləri 230 nm və 320 nm-də ölçməyi tövsiyə edirik. Hər iki dəyər ideal olaraq 0,0, 230/260 nisbəti isə 0,6-dan aşağı olmalıdır. OD320-də yüksək dəyər çirkləndirici olduğunu göstərir.
    • Spektrofotometr və ya mikro-spektrofotometrə (NanoDrop) girişiniz yoxdursa, biz sizə ən azı iki müxtəlif miqdarda şablon DNT-ni analitik Agaroza gelində, seyreltmə seriyasına (50-500 ng) bitişik olaraq işləməyi tövsiyə edirik. nümunənizin konsentrasiyasını qiymətləndirmək üçün oxşar ölçüdə və məlum konsentrasiyada istinad DNT fraqmenti.

    DNT Seyreltmə

    Konsentrasiyanı təyin etdikdən sonra şablonu steril nukleazsız su və ya 10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0 istifadə edərək düzgün yekun konsentrasiyaya qədər seyreltin (buraya baxın). Zəhmət olmasa tərkibində Na olan buferlərdən istifadə etməyin2EDTA və ya iki valentli kationlar (Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+ ).

    Ardıcıllıq üçün kifayət qədər miqdarda şablon DNT təqdim etdiyinizə əmin olmaq üçün Sanger Nümunəsinin Təqdimatı səhifəmizi nəzərdən keçirin.

    Kapilyar ardıcıllıq üçün PCR məhsullarının hazırlanması:

    Plazmid DNT şablonlarında olduğu kimi, PCR məhsulları uğurlu ardıcıllığı təmin etmək üçün kifayət qədər keyfiyyətli olmalıdır. PCR reaksiyasından sonra məhlulda qala biləcək potensial müdaxilə edən maddələrin çıxarılması vacibdir. Potensial çirkləndiricilərə artıq PCR primerləri, nukleotidlər, ferment və PCR reaksiyasının tampon komponentləri, eləcə də qeyri-spesifik gücləndirmə məhsulları daxildir. Bu çirkləndiricilər bəzən dövrənin ardıcıllığı reaksiyasında iştirak edə və beləliklə müdaxilə edə bilər və keyfiyyətsiz məlumatlara və ya ümumiyyətlə məlumatın olmamasına səbəb ola bilər.

    Zəhmət olmasa aşağıdakıları nəzərə alın tövsiyələr PCR reaksiyanızı (reaksiyalarınızı) təqdim etmək üçün hazırlayarkən:

    • Ardıcıllıqdan əvvəl bütün PCR primerləri çıxarılmalıdır. Sıralama yalnız bir primerdən istifadə edir - PCR reaksiyasında istifadə etdiyiniz ikisinin əvəzinə. Əgər həm irəli, həm də tərs PCR primerləri PCR məhlulunda qalsa, onlar hər ikisi ardıcıllaşdırıcı primer rolunu oynayacaq və müxtəlif nukleotid tərkibinə malik tamamlayıcı zəncirlərə bağlanacaq və beləliklə, oxuna bilməyən ("qarışıq ardıcıllıq") bir-birinin üzərinə qoyulmuş iki ardıcıllıqla nəticələnəcək. ).
    • Həddindən artıq dNTP-lər də ardıcıllıqdan əvvəl çıxarılmalıdır, çünki onlar dövrənin ardıcıllığı reaksiyasında optimal uzadılması və dayandırılması üçün tələb olunan dNTP/ddNTP-lərin xüsusi nisbətlərini pozacaqlar. Nəzərə alın: Bir çox kommersiya PCR təmizləmə dəsti olsa da, biz xüsusi məhsulları tövsiyə etməməyi üstün tuturuq.

    DİQQƏT:
    Bizim DNT Sequencing qrupumuz 100bp-dən çox bir məhsuldan ibarət olan PCR reaksiyaları üçün tam avtomatlaşdırılmış (96 quyu formatlı) təmizləmə xidməti təklif edir. Xidmət təfərrüatları üçün buraya baxın.


    Plazmid DNT-nin keyfiyyəti

    Plazmid DNT-nin saflığı və keyfiyyəti uğurlu transfeksiya üçün vacibdir. Ən yaxşı nəticələr fenol, natrium xlorid və endotoksinlərdən azad olan ən yüksək saflığa malik plazmid DNT ilə əldə edilir. Çirkləndiricilər hüceyrələri öldürəcək və duz lipidlərin kompleksləşməsinə mane olacaq, transfeksiya səmərəliliyini azaldır. Lipopolisaxaridlər kimi tanınan endotoksinlər plazmid preparatlarının lizis mərhələsi zamanı buraxılır və çox vaxt plazmid DNT ilə birgə təmizlənir. Onların mövcudluğu ilkin və digər həssas hüceyrələrdə transfeksiyanın effektivliyini kəskin şəkildə azaldır. Transfeksiyalar üçün ən yüksək keyfiyyətli DNT təmin edən PureLink HiPure Plazmid Kitlərindən (Mini, Midi, Maxi, Mega və Giga) istifadə edərək plazmid DNT-ni təcrid etməyi tövsiyə edirik.

    Sezium xlorid bantlanması həm də yüksək dərəcədə təmizlənmiş DNT versə də, bu, çox əmək tələb edən və vaxt aparan bir prosesdir. DNT-lipid komplekslərinin və ya DNT məhlullarının həddindən artıq burulğanı, xüsusən daha böyük molekullarla bəzi kəsiklərə səbəb ola bilər və bununla da transfeksiyanın effektivliyini azalda bilər. Seyreltilmiş DNT-də EDTA-nın konsentrasiyası 0,3 mM-dən çox olmamalıdır.


    Plazmid pAMI2 Paracoccus aminophilus JCM 7686 Daşıyır N,N- İfadəsi LuxR Ailə Tənzimləyicisi tərəfindən aktivləşdirilən Dimetilformamid Deqradasiyası ilə əlaqəli genlər

    ŞEK. 1 . Deqradasiyası üçün sxematik yol N,N-dimetilformamid, pAMI2 ilə kodlanmış ilk addımı göstərir N,N-dimetilformamidaza. ŞEK. 2 . DMF-nin deqradasiyası və üç artım sürəti P. aminophilus suşlar. A. HPLC ilə müəyyən edildiyi kimi, kultura supernatantlarında DMF konsentrasiyaları. B. Canlı hüceyrə sayları (CFU) ilə müəyyən edilən bakterial kulturaların böyümə sürətləri. Ştammlar yeganə karbon və enerji mənbəyi kimi DMF əlavə edilmiş (1500 mq/litr) maye mineral mühitdə (50 ml) yetişdirilmiş və nümunələr 96 saat ərzində hər 24 saatdan bir götürülmüşdür. Göstərilən dəyərlər standart kənarlaşmaları göstərən xəta çubuqları ilə üç təkrarın vasitəsidir. ŞEK. 3 . pAMI2 plazmidinin genetik təşkili. Süjet pAMI2 ardıcıllığının G+C məzmununu göstərir, orta dəyər (~62 mol%) kəsik xətt ilə qeyd olunur. Proqnozlaşdırılan plazmid modulları kölgəli qutularla göstərilir. Oklar proqnozlaşdırılan kodlaşdırma bölgələrini və onların transkripsiya istiqamətini göstərir. Replikasiyanın ehtimal olunan mənşəyinin yeri (oriV), konjugal köçürmənin mənşəyi (oriT) və bölmə saytı (parS) göstərilir. ŞEK. 4 . RT-PCR analizi dmfR-dmfA1-dmfA2 gen klasteri. A. DMFase modulunun genetik təşkili. RT-PCR analizləri üçün istifadə olunan primerlərin mövqeləri göstərilmişdir. P-ni ehtiva edən DNT bölgələridmfR, PdmfA1, və PdmfA2 promotorlar (promotor zond vektorunda pCM132-də klonlanmış) boz qutularla göstərilir. Nükleotidlərin ardıcıllığı dmfR promotor bölgə diaqramın altında göstərilmişdir. Təxmin edilən −10 və −35 heksamerlər və proqnozlaşdırılan DmfR bağlanma ardıcıllığı qutuya salınıb və ribosomun bağlanma yeri (rbs) və başlanğıc kodonu göstərilib. Mutasiya analizi üçün istifadə edilən məhdudiyyət yerləri göstərilir. B. RT-PCR məhsullarının agaroz gel elektroforezi. Təhlil təcrid olunmuş ümumi RNT istifadə edərək aparılmışdır P. aminophilus JCM 7686R karbon və enerjinin yeganə mənbəyi kimi arabinoza (sol panel) və ya DMF (sağ panel) ilə mineral mühitdə yetişdirilir. Gücləndirilmiş fraqmentlərin ölçüləri sağdakı marker zolağı ilə müqayisə edilərək təsdiq edilmişdir. Nəzarət reaksiyaları DNase ilə işlənmiş RNT və pAMI2 DNT şablonları (müvafiq olaraq mənfi və müsbət nəzarət) ilə həyata keçirilmişdir. ŞEK. 5 . DmfR zülalının daxilində müəyyən edilmiş promotorların fəaliyyətinə təsiri dmfR-dmfA1-dmfA2 gen klasteri. Promotor prob vektoru pCM132 (nəzarət -) və daşıyan törəmələr tərəfindən istehsal olunan β-qalaktosidaza fəaliyyətləri lacZ P ilə transkripsiya birləşmələridmfR, PdmfA1, və PdmfA2 promotorların iştirakı ilə trans plazmid pBBR-dmfR (DmfR zülalının W mənbəyi) və ya pBBR-ΔdmfR (M mutasiya edilmiş dmfR gen) göstərilir. Enzimatik fəaliyyətlər müəyyən edilmişdir P. aminovorans JCM 7685R, karbon və enerjinin yeganə mənbəyi kimi arabinoza (sol panel) və ya DMF (sağ panel) ilə minimal mühitdə yetişdirilir.



Şərhlər:

  1. Pickworth

    I think this has already been discussed, use the search on the forum.

  2. Felan

    I think it's a good idea.

  3. Vujinn

    Sən düzgün deyilsən. Müzakirə edəcəyik. PM-də mənə yazın, biz onu idarə edəcəyik.



Mesaj yazmaq