Məlumat

Bakteriyalara zərər vermədən hüceyrə qranulunu necə yenidən dayandıra bilərəm?

Bakteriyalara zərər vermədən hüceyrə qranulunu necə yenidən dayandıra bilərəm?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Zülal ifadəmdə Ampisillin ilə bir prekulturadan istifadə edərkən, əsas mədəniyyətdə ampisillini məhv edəcək həddən artıq çox beta-laktamazanı daşımamaq üçün əvvəlcədən yetişdirilən mühitdən qurtulmalıyam. Bunu etmək üçün hüceyrələri pellet edirəm və yenidən dayandırıram.

Daha sonra bakteriyaya canlı ehtiyacınız varsa, hansı resuspenziya üsulları daha uyğundur? Bakteriyalara zərər vermədən nə qədər güc tətbiq edə biləcəyimdən əmin deyiləm və çox yumşaq bir şəkildə yenidən dayandırmaq çox, çox uzun vaxt aparır.

Bakteriyaları canlı olaraq yenidən dayandırmaq üçün hansı üsullardan istifadə edilə bilər və hansılar ən sürətlidir?


Fərz edək ki, siz danışırsınız E. coli: Hüceyrələri uyğun bir mayedə yenidən dayandırdığınız müddətcə, məs. təzə mühit və ya tampon, onda mənim təcrübəmdən narahat olmaq üçün çox şey yoxdur - hüceyrələr çox möhkəmdir. Fərqli ştamların və böyümə şərtlərinin çox fərqli keyfiyyətlərə malik qranullar verdiyini gördüm - bəziləri burulğanla kifayət qədər yaxşı dayanacaqlar. Əgər qranul topaqlı görünürsə, onda triturasiya həmişə işlədiyim bir şeydir - qranul parçalanana qədər yuxarı və aşağı pipetlə.

Əgər siz yenidən dayandırılmış hüceyrələrlə bir növ fizioloji ölçmə aparacaqdınızsa, bu, bir az yoxlama tələb edə bilər, ancaq əgər siz yalnız yenidən böyümək və ifadəni stimullaşdırmaq niyyətindəsinizsə, deyərdim ki, hüceyrələrin yeni mühitdə bərpası üçün bir az vaxt verin (bunu yoxlayın). udma artır) ifadə etmədən əvvəl kifayət qədər olmalıdır.


Yuxarı və aşağı pipetləmə, nə qədər yavaş pipetləsəniz və uc nə qədər qalın olarsa, bir o qədər incə olar və ya YAVAŞ vortekslə, yüksək burulğan sürəti kiçik uclarla sürətli pipetləmə kimi divarda kəsmə gərginliyi ilə nəticələnir.

Bakteriyalar çox şey ala bilər, maya ilə daha çox diqqətli ola bilər və məməlilərin hüceyrələrinə daha çox diqqət yetirə bilər


Geniş miqyaslı plazmidlərin təmizlənməsi üçün kömək - (Oktyabr/05/2004)

bu gün mən 500ml mədəni mühitdən təmizlənmiş plazmid aldım, 10ml məhlul əlavə edirəm 1 və 20 ml məhlul 2 əlavə etməzdən əvvəl bərabər şəkildə qarışdırıram, lakin bu müddət ərzində mayeni şəffaflaşdıra bilmirəm və həmişə bir qrup e.coli var. DNT ilə paket olun. Həll yetərli deyil, yoxsa başqa səbəblər?

mən DNT peyvəndi üçün təmizlənmiş plazmid istəyirəm, 10-20mg plazmid almaq üçün mənə hər hansı bir protokol verə bilərsinizmi? çox sağ olun

Tək nüsxə olan BAC-ları təcrid etmək üçün Qiagen's Maxiprep-dən kifayət qədər uğurla istifadə etmişəm. Məndə 1,5 mq-a qədər DNT var. Mən yalnız 300 ml o/n kulturasından istifadə edirdim. Daha çox başlanğıc materialdan istifadə etdiyiniz üçün daha yaxşı məhsul əldə edə bilərsiniz, üstəlik, güman edirəm ki, sizin çox nüsxə plazmidinizdir. Siz dəstlə birlikdə gələn reagentlərdən istifadə edə bilərsiniz, lakin sütunlardan qaçın və nəticəni daha da yaxşılaşdırmaq üçün izopropopanoldan istifadə edərək DNT-ni ppt edin.

Miniprepslərdə olduğu kimi, maksipreps ilə məşğul olduğunuz zaman lizisdən sonra aydın bir həll görməyə bilərsiniz.

1. Həll I: 500 mL hüceyrə qranulunu lizozimsiz 10 mL I məhlulda yenidən dayandırın. Sonra yenidən dayandırılmış qranullara 8 mq/mL lizozim ilə 10 mL I məhlul və ya RNase ilə məhlul I əlavə edin. Qarışdırın və 15 dəqiqə buz üzərində inkubasiya edin. Seçim: lizozimsiz I məhlulu əlavə edin, qranulları yenidən suspenziya edin və -20°C-də 5 günə qədər saxlayın. Hüceyrə qranulunu tamamilə yenidən dayandırılana qədər burulğan edin və ya qarışdırmaq və yenidən dayandırmaq üçün plastik pipet ucundan istifadə edin. Pipetin ucu daha yumşaqdır və xromosom DNT-nin kəsilməsinin qarşısını ala bilər. E. coli-nin bəzi ştamları mukoiddir və burulğanla təkrar suspenziyaya davamlıdır. Hüceyrə qranulunun yuxarı hissəsinin qismən lizisi qranulun dibinin yenidən dayandırılmasının qarşısını ala bilər, buna görə də qarışdırma tələb olunur.

2. II Həll: buz kimi soyuq Həll II istifadə köpüklənmənin qarşısını alır. Qarışıq şəffaf olana qədər borunu yumşaq bir şəkildə çevirin, ümumiyyətlə 5-7 dəfə. Otaq temperaturunda 10 dəqiqə və ya məhlul şəffaf olana qədər inkubasiya edin. Yüksək hüceyrə konsentrasiyası və ya plazmid DNT sıxlığı bu addımı yavaşlatırsa, 1-ci addımda qranul hazırlamaq üçün istifadə olunan hüceyrələrin həcmini azaldın. Hüceyrə bulanıqlığının cüzi izi icazə verilir. Tərkibində II məhlul olan qarışıqları burulğanlamayın, çünki bu, xromosom DNT-ni kəsəcək və sonra plazmid hazırlayıcısını çirkləndirəcək. Bəzi müəlliflər otaq temperaturunda 30 dəqiqə inkubasiyaya icazə verirlər

3. III məhlul: III məhlul əlavə edildikdə kəsmikə bənzər çöküntü əmələ gələcək. Hüceyrə qranulları xüsusilə böyükdürsə, III məhlulun inkubasiya müddətini 10 dəqiqəyə qədər artırın. Ağ məlhəm ilk növbədə dodesil sulfatın kalium duzundan və xromosom DNT-dən və hüceyrə zibilindən ibarətdir. Plazmid ccc DNT şəffaf supernatantdadır. Lazım gələrsə, reaksiya buzda 60 dəqiqədən çox qala bilər.

Bilmirəm 2-ci məhlul əlavə etdikdən sonra mayeni niyə şəffaf etmək istərdiniz. Bu zaman bakteriya parçalanmalıdır və siz goo kimi görünən bir şey almalısınız. selikli və yapışqan.
İşlədiyim şey mədəniyyətinizi fırlatmaq və 100 ml məhlul əlavə etməkdir 1. Peleti tamamilə yenidən dayandırın və yenidən aşağı fırladın (4C-də 10 dəqiqə ərzində 4000 rpm). Məhlulu atın və istədiyiniz Həll 1 həcmini əlavə edin (mən 12 ml istifadə edirəm, lakin protokolu ehtiyaclarınıza uyğunlaşdırın). Qranulları TAM olaraq yenidən dayandırın. Sonra məhlul 2 əlavə edin (mən 16ml əlavə edirəm) və bir neçə dəqiqə öz skamyanızda oturmasına icazə verin. 3-cü məhlulu əlavə edin (mən 12 ml əlavə edirəm) və yavaş-yavaş qarışdırın və 10 dəqiqə buzda saxlayın.
4C-də 20 dəqiqə ərzində 12000 rpm-də fırlanmadan sonra bütün hüceyrə zibilləri qranullanacaq, lakin bir neçə "chunks" supernatantda üzəcək.
Bu anda şəffaf maye lazımdır. Supernatantı təzə boruya tökərkən onu steril cuna ilə süzün. Bu, ətrafda üzən inadkar "chunkların" çoxundan xilas olmağa kömək edəcək :)

Əsasən bu, məhlul 1 ilə əlavə yuyulmanın əlavə edilməsi ilə düz irəli qələvi lizisdir.


Kitlərdən istifadə etmədən bakterial mədəniyyətlərdən Plazmid DNT-nin bərpası

Tam plazmid DNT ardıcıllığı kimi bir çox molekulyar biologiya texnikası yüksək dərəcədə təmizlənmiş və konsentratlaşdırılmış plazmid DNT tələb edir və bakterial plazmidlər DNT rekombinasiyası üçün klonlama vektorları kimi geniş istifadə olunur. Yeni plazmid qurulduqdan sonra onun ölçüsü və məhdudlaşdırıcı endonükleaz spektri gel elektroforezi ilə müəyyən edilə bilər. Bu məqalə dəstlərdən istifadə etmədən plazmid çıxarılması üçün iki effektiv protokol təqdim edəcək.

  • Denaturasiya məhlulu
  • Renaturing həlli
  • 100% etanol və ya izopropanol
  • 70% etanol
  • TE tamponu və ya su

1. Gecədə bakteriya mədəniyyətini yetişdirin.

2. DNT hazırlamazdan əvvəl bakteriyaları çökdürmək üçün kulturanı sentrifuqa edin.

3. Supernatantı çıxarın və bakteriyaları tamponda yenidən suspenziya edin.

4. Bakteriyaların parçalanmasına səbəb olmaq və onların tərkibini buraxmaq üçün yenidən suspenziya edilmiş bakteriyalara denaturasiya edən məhlul əlavə edin.

5. Protein və genomik DNT-ni çökdürmək və plazmidləri məhlulda sərbəst buraxmaq üçün denaturasiya olunmuş bakteriyalara renaturasiya edən məhlul əlavə edin.

6. Zülal və genomik DNT-ni sentrifuqasiya yolu ilə çökdürün və plazmidləri olan supernatantı çıxarın.

7. Plazmid DNT-ni çökdürmək üçün etanol və ya izopropanol əlavə edin.

8. Sentrifuqadan istifadə edərək DNT-ni çökdürün və ya məhlulu DNT-yə bağlanacaq sütuna tətbiq edin.

9. Artıq duzu çıxarmaq üçün qranul və ya sütunu 70% etanol ilə yuyun.

10. DNT qranulunu yenidən dayandırın və ya su və ya TE kimi neytral tampondan istifadə edərək DNT-ni sütundan çıxarın.

Protokol B: qələvi çıxarma üsulu

  • Eppendorf tipli (1,5 ml) polipropilen borular
  • 8-10.000 xg yarada bilən dəzgah üstü sentrifuqa
  • Həll I: Lizozim məhlulu - 2 mq/ml lizozim, 50 mM qlükoza, 10 mM CDTA, 25 mM Tris-HC1 (pH 8.0)
  • Həll II: Qələvi SDS məhlulu - 0,2 N NaOH, 1% natrium dodesil sulfat (SDS)
  • Həll II: Yüksək duz məhlulu-3 M natrium asetat (pH 4.8)
  • 0,1 M natrium asetat/0,05 M Tris-HCl (pH 8)
  • Soyuq etanol

1. Gecədə bakteriya mədəniyyətini yetişdirin.

2. Plazmid çıxarılması üçün 0,5 ml kulturanı 1,5 ml Eppendorf borusuna köçürün.

3. DNT hazırlığına davam etməzdən əvvəl bakteriyaları qranullaşdırmaq üçün mədəniyyəti sentrifuqa edin.

4. Supernatantı çıxarın, 100 ul Məhlul I əlavə edin, hüceyrə qranulunu yenidən süspansiyon edin və 0 °C-də 30 dəqiqə inkubasiya edin.

5. 200 ul II məhlul əlavə edin və yumşaq fırladın. Süspansiyon demək olar ki, şəffaf və bir qədər viskoz olmalıdır. Borunu 5 dəqiqə 0 °C-də saxlayın.

6. 150 ul III məhlul əlavə edin və bir neçə saniyə ərzində inversiya ilə boruların içindəkiləri yumşaq bir şəkildə qarışdırın, bu müddət ərzində DNT laxtası əmələ gəldi. Boru 60 dəqiqə 0 ° C-də saxlanılır.

7. 10,000 xg-da 5 dəqiqə sentrifuqa edin.

8. Supernatantı çıxarın və ikinci sentrifuqa borusuna köçürün, 1 ml soyuq etanol əlavə edin və borunu -20°C-də 30 dəqiqə saxlayın.

9. Çöküntünü 2 dəqiqə sentrifuqa edərək toplayın.

10. Supernatantı çıxarın və qranulları 100 ul 0,1 M natrium asetat/0,05 M Tris-HCl (pH 8) içində həll edin və onu 2 həcm soyuq etanol ilə 10 dəqiqə -20°C temperaturda çökdürün.

11. 5 dəqiqə, 10.000 xg-da sentrifuqa edin və qranulları 40 μl suda həll edin.

CD Genomics-də biz plazmidlərin təkamülünü, onların modul quruluşunu və köməkçi genlərin daxil edilməsi üçün qaynar nöqtələrin mövcudluğunu araşdırmaqda sizə kömək etmək üçün tam plazmid DNT ardıcıllığını təmin edirik.

Əlavə Oxumalar

    1. Bimboim H C, Doly J. Rekombinant plazmid DNT-ni yoxlamaq üçün sürətli qələvi ekstraksiya proseduru. Nuklein turşularının tədqiqi, 1979, 7(6):1513-1523.

    Hər ay birbaşa gələnlər qutunuza göndərilən CD Genomics-dən qabaqcıl elmi məlumat əldə edin.


    Başlanğıc laboratoriya sualı - tez burulğan etmək / ərimək üçün nə yaxşıdır?

    Beləliklə, mən bir bakalavr laboratoriyasında işə başladım və hansı növ materialların burulğan edilməməsi ilə maraqlanırdım. Topladığım şeylərə görə, hüceyrə qranulları ilə məşğul olduğunuz zaman həmişə bir pipet ilə yumşaq bir şəkildə yenidən dayandırmalısınız. Burulğan cinindən uzaq tutmalı olduğum başqa şeylər varmı? Bundan əlavə, bilirəm ki, zülallar tez əridilən halda denatürasiyaya uğraya bilər, halbuki tez əriyən DNT yükləyici boya burulğan/əllər vasitəsilə reallaşır. Bunlardan bəziləri ilə bağlı məni maarifləndirə bilərsinizmi?

    Bakteriyaları (əridikdən sonra) burulğanla yenidən dayandıra bilərsiniz və onlar yaxşı olacaqlar.

    Transformasiya üçün uyğunlaşdırılmış E. coli-ni burulğan etməyin. Əgər siz bakteriya laboratoriyasında işləyirsinizsə, mentorunuzdan burulğanlara dözmədiklərini soruşun. Bəzi bakteriyalar pisdir.

    Genomik DNT və ya hər hansı uzun fraqmentlər burulğan edilməməlidir, əks halda onlar kəsiləcək. Mən də burulğan RNT-dən qaçardım.

    Mən həmişə dNTP's və NEB buferləri 37 su banyosunda əridirəm. dNTP's inanılmaz dərəcədə sabitdir və laboratoriyada son illərdir. Mən bir dəfə gecə 65-dən birini tərk etdim və hələ də işləyəcəklərini görmək üçün PCR etdim və onlar hələ də işlədilər. Onlara qəribə bir şey gəlsə deyə, mən hələ də sonra boru atdım.

    yuyucu vasitə ilə heç vaxt burulğan etməyin

    Fermentlər adətən burulğanlanmağı sevmirlər və dondurulmuş ərimələrdən keçməməlidirlər. Bununla belə, bəzi fermentlər digərlərindən daha möhkəmdirlər, lakin ümumiyyətlə onları burulğan etməməyə çalışırlar. Əgər onları qarışdırmaq lazımdırsa, pipetka ilə yumşaq bir şəkildə yuxarı və aşağı çəkin və ya borunun yan tərəfini sürüşdürün.

    Bakteriyalar çox möhkəmdir və çox zərər vermədən güclü burulğanlara dözə bilirlər. Bir istisna kimyəvi cəhətdən səlahiyyətli hüceyrələr və ya yaxınlarda ərimiş hüceyrələrdir. Onlarla yumşaq olun və səlahiyyətli hüceyrələri buzda əridin. İnsan toxuma mədəniyyəti hüceyrələri o qədər də möhkəm deyil, lakin yumşaq və qısa burulğanlara dözə bilirlər. Əgər siz LN2-dən toxuma mədəniyyəti hüceyrələrini çıxarırsınızsa, onları 37C su banyosunda sürətlə əridin və dərhal qaba qoyun.

    DNT əslində vortekslə zədələnə bilər. Böyük plazmalar və ya BAC-lar üçün burulğanı tövsiyə etmirəm, çünki bu, DNT-ni kəsə bilər. DNT-ni barmaqlarımın arasında yuvarlayaraq, onu sürətlə əridirəm. Eyni şey PCR tamponları, primerlər və dNTP-lərə aiddir. Ümumiyyətlə, bu bir tampondursa, bu, sadəcə bir duz qarışığıdır və güclü burulğan və sürətli ərimə yaxşıdır.

    Ümumi bir şey, istifadə etdiyiniz hər bir reagent üçün protokolu oxumaqdır. Əksər şirkətlər protokollarında nəyin burulğan edilə biləcəyini və edilə bilməyəcəyini açıq şəkildə ifadə edəcəklər.


    Bakteriyalara zərər vermədən hüceyrə qranulunu necə yenidən dayandıra bilərəm? - Biologiya

    Kiçik miqyaslı His-Tag füzyon zülalının təmizlənməsi altında
    denatürativ şərtlər

    Bakterial sistemdə rekombinant zülalların yüksək səviyyədə ifadəsi həll olunmayanların əmələ gəlməsinə səbəb ola bilər
    adətən daxiletmə orqanları (IB) kimi tanınan aqreqatlar. 6M Guanidin-HCl (GuHCl), 8M Karbamid və ya digər güclü
    denaturantlar tamamilə həll olunan İB üçün istifadə edilə bilər. Denatürasiya şərtləri altında Onun etiketi tamamilə olduğu üçün
    məruz qaldıqda, Ni sütunlarına bağlanmağı asanlaşdıracaq. Əksər biokimyəvi tədqiqatlar üçün zülal renaturasiya edilməlidir və
    yenidən qatlanır və bu, adətən elüsyondan sonra və ya bəzən elüsyondan əvvəl sütunun özündə edilə bilər.
    Biz burada iki protein təmizləmə prosedurunu təsvir edirik. Prosedur-I, burada zülal bakteriyadan çıxarılır
    denatürasiya edən maddələrin iştirakı ilə qranullar və Ni 2+ muncuqlar üzərində təmizlənir və ya zülalın olduğu Prosedur-II
    qismən təmiz və ya təmiz IB-dən həll olunur (bax: Solübilizasiyadan əvvəl daxiletmə orqanlarından çirkləndiricilərin çıxarılması)
    təmizlənmədən əvvəl
    Ni 2+ muncuq. İkinci prosedur daha zəhmətli olsa da, fonu azaltmağa kömək edə bilər
    son təmizlənmə mərhələsində protein çirkləndiricilərinin.

    İnduksiyadan sonra hüceyrə qranulunun hissəcikləri

    İdeya, induksiyadan sonra hüceyrələrin hissələrini ayırmaq və kiçik miqyaslı optimallaşdırma üçün kifayət qədər hüceyrə qranul nümunələrini -80ºC-də saxlamaqdır.
    təmizləmə proseduru və daha da genişləndirilməsi. Aşağı miqyasda ən yaxşı təmizləmə şərtlərini qurduqdan sonra edə bilərsiniz
    proseduru genişləndirin.

    Misal:
    1) 1 litr mədəniyyət yetişdirin
    2) İnduksiya (IPTG, duz induksiyası və s.)
    3) Hüceyrə kulturasını 10 dəqiqə 8000 rpm 4ºC fırladın, supernatantı boşaltın
    4) Hüceyrə peletini 4ºC-də 100 ml soyuq PBS tamponu ilə çox yumşaq bir şəkildə yenidən dayandırın. Alikot aşağıdakı kimi:
    a) 1 ml suspenziya ilə 10 boru (1,5 ml plastik borular) (hər boru üçün 10 ml orijinal kultura deməkdir)
    b) 10 ml suspenziya ilə 4 boru (15 ml plastik borular) (hər boru üçün 100 ml orijinal kultura deməkdir)
    c) 50ml suspenziya ilə 1 boru (50ml plastik boru) (bu, 500ml orijinal mədəniyyət deməkdir).
    5) 10 dəqiqə 8000 rpm 4ºC fırladın, supernatantı boşaltın
    6) Hüceyrə peletini -80ºC-də saxlayın

    Ni-NTA agarozunun balanslaşdırılması

    50ul muncuq (100ul suspenziya) Ni-NTA agaroz muncuqlarını 1,5ml plastik boruya yerləşdirin.

    2 x 1,5 ml H ilə yuyun2O və 2x 1,5 ml tarazlıq tamponu (yuyulma: qarışdırın, 3 dəqiqə 3500 rpm fırladın, supernatantı boşaltın).

    Lizis tamponu: 50 mM Na2HPO4 pH 8.0, 0.3M NaCl, 1mM PMSF (və ya Sigma-dan bakterial hüceyrələr üçün proteaz inhibitor kokteyli #P-8849)
    və güclü denaturant kimi 6M Guanidin-HCl (GuHCl) və ya 6-8M karbamid
    Lizis tamponuna isteğe bağlı əlavələr
    a) 1 mM PMSF və ya proteaz inhibitor kokteyli 1:200 (Sigma-dan bakterial hüceyrələr üçün kokteyl # P-8849)
    b) Dnase 100U/ml və ya 25-50ug/ml (SIGMA DN-25). 10 mMMgCl varlığında 10 dəqiqə 4°C inkubasiya edin2
    c) ßME 20mM-ə qədər
    kimi azaldıcı agent zülalda sisteinlər varsa.

    Tarazlıq tamponu: 6-8M karbamid, 50mM Na2HPO4 pH 8.0, 0.5M NaCl

    Yuma tamponu: 6-8M karbamid, 50mM Na2HPO4 pH 8.0, 0.5M NaCl

    Elüsyon tamponu: 6-8M karbamid, 20mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl və müvafiq imidazol konsentrasiyaları.

    Məhdudiyyətlər
    Ni matrislərini DTT və ya DTE (ßME-dən 20 mM-ə qədər istifadə edə bilərsiniz) kimi reduksiyaedici agentlərə EDTA və
    EGTA NH4 + tamponlar və Arg, Glu, Gly və ya His kimi amin turşuları.

    Prosedur I: Bakterial Qranuldan Güclü zülalın çıxarılması
    denaturant

    1 1 ml lizis tamponunda 10 ml bakterial mədəniyyətin (və ya çox aşağı ifadə səviyyəsi üçün 100 ml bakterial mədəniyyət) resuspend pelletini

    2 Karbamid 6-8M və ya Guanidin-HCl 6M olan lizis buferini hazırlayın (əvvəlcə 8M karbamid sınayın və zülal həll olunursa, titri aşağı salın.
    zülalın həll edilməsi üçün minimum karbamid konsentrasiyası tələb olunana qədər növbəti təcrübələr)

    3 Buz üzərində sonikasiya 3 x 20 saniyə (sonikatordan asılıdır)

    4 Fırlatma 15 dəqiqə maksimum sürət 4°C

    5 Supernatantı təmiz boruya köçürün: xam ekstrakt (PAGE-SDS üçün 40 mikrorol saxlayın)

    6 50&mikro Nil muncuqlarını tarazlıq tamponu ilə tarazlaşdırın (bax: Ni-NTA agarozunun tarazlaşdırılması)

    7 Muncuqlara xam ekstraktı əlavə edin və 4°C / 1 saat inkubasiya edin (fırlanma)

    8 Dönmə 3 dəqiqə 3500 rpm. Bağlanmayan materialın boşaldılması (PAGE-SDS üçün 40&mikrolu saxlayın)

    9 3x1ml uyğun karbamid konsentrasiyası olan yuma tamponu ilə yuyun. Yuma: qarışdırın, 3 dəqiqə 3500 rpm fırladın, supernatantı boşaltın
    (PAGE-SDS üçün 40&mikrolu saxlayın)

    10 Yuma tamponu + 10 mM imidazol ilə 2x1ml yuyun (PAGE-SDS üçün 40 mikrorol saxlayın)

    11 3x100&mikrol elüsyon buferi + 250mM imidazol (PAGE-SDS üçün 40&mikrol saxlamaq) ilə elüt edin (elüsyon: qarışdırın, 4°C temperaturda 3 dəqiqə saxlayın, 3 dəqiqə fırladın.
    3500 rpm, supernatant toplayın)

    12 PAGE-SDS gel 5&mikrolu xam ekstrakt və bağlanmamış material və 13&mikrolu yuma və elüsyon fraksiyaları üzərində işləyin.

    Prosedur II: Daxiletmə Orqanlarından (IB) zülalın çıxarılması
    güclü denaturantdır

    1 1 ml lizis tamponunda 10 ml bakterial kulturanın (və ya çox aşağı ifadə səviyyəsi üçün 100 ml bakteriya mədəniyyətinin) resuspend peletini olmadan
    karbamid və ya Guanidin-HCl kimi denaturantlar

    2 Buz üzərində sonikasiya 3 x 20 saniyə (sonikatordan asılı olaraq)

    4 Fırlatma 15 dəqiqə maksimum sürət 4°C. Solubilizasiyadan əvvəl supernatantı qranuldan (IB) ayırın (PAGE-SDS üçün 40&mikrolu saxlayın).

    5 Karbamid 6 ilə 8M və ya Guanidin-HCl 6M olan 0,5 ml lizis tamponunda IB resuspend (30°C temperaturda 30 dəqiqə saxlayın) və ya əvvəl IB yuyun
    ""Holullaşmadan əvvəl çirkləndiricilərin inklüziv orqanlardan təmizlənməsi""ndə təklif edildiyi kimi həll olunma (bu addım daha zəhmətli olsa da,
    son təmizlənmə mərhələsində zülal çirkləndiricilərinin fonunu azaltmağa kömək edə bilər). IB həll edildikdən sonra fırlanma 15 dəq maks
    sürət 4°C. Həll olunduqdan sonra supernatantı (PAGE-SDS üçün 40&mikrolu saxlayın) həll olunmamış qranuldan ayırın (qranulları 0,5 ml-də dayandırın)
    lizis buferi və PAGE-SDS üçün 40&mikrolu saxlayın). Supernatantı təmiz boruya köçürün

    6 50&mikro Nil muncuqlarını tarazlıq tamponu ilə tarazlaşdırın (bax: Ni-NTA agarozunun tarazlaşdırılması)

    7 Son supernatant ekstraktı muncuqlara əlavə edin və 4°C / 1 saat inkubasiya edin (fırlanma)

    8 Dönmə 3 dəqiqə 3500 rpm. Bağlanmayan materialın boşaldılması (PAGE-SDS üçün 40&mikrolu saxlayın)

    9 3x1ml uyğun karbamid konsentrasiyası olan yuma tamponu ilə yuyun. Yuma: qarışdırın, 3 dəqiqə 3500 rpm fırladın, supernatantı boşaltın
    (PAGE-SDS üçün 40&mikrolu saxlayın)

    10 Yuma tamponu + 10 mM imidazol ilə 2x1ml yuyun (PAGE-SDS üçün 40 & mikrorol saxlayın)

    11 3x100&mikrol elüsyon buferi + 250mM imidazol (PAGE-SDS üçün 40&mikrol saxlamaq) ilə elüt edin (elüsyon: qarışdırın, 4°C temperaturda 3 dəqiqə saxlayın, 3 dəqiqə fırladın.
    3500 rpm, supernatant toplayın)

    12 PAGE-SDS gel 5 və həll edilməzdən əvvəl və sonra supernatant ekstraktı, həll olunmamış qranul və bağlanmamış material üzərində işləyin və
    13&mikrolu yuma və elüsyon fraksiyaları.

    Burada təsvir edilən prosedurlar aşağı miqyaslı təmizləmə üçündür. Əgər daha çox miqdarda protein təmizlənəcəksə, istifadə etməyi məsləhət görürük
    açıq sütunların və ya yüksək təzyiqdə istifadə edilə bilən qatranlı FPLC avadanlığının: QIAGEN-dən Ni-NTA superflow qatranı və ya
    CLONTECH-dən BD Talon TM Metal Affinity və ya Chelating Sepharose Fast Flow və ya Ni Sepharose Yüksək Performans
    NOVAGEN-MERCK-dən AMERSHAM-BIOSCIENCES və ya Ni-NTA Hi-Bind və ya Metal Chelate qatranları.
    FPLC avadanlığının istifadəsi daha çox əməliyyat çevikliyinə və sadə optimallaşdırmaya imkan verəcək:
    1) gradient və ya pilləli qradiyent elüsyonları
    2) axın sürətinin optimallaşdırılması, sütun ölçüsü, yuyulma şəraiti və s.
    3) müxtəlif gücə malik digər metal ionları ilə yüklənmiş sütunların istifadəsi ilə zülalların təmizlənməsinin sürətli və rahat müqayisəsi
    bağlama, məs. Zn 2+ , Co 2+ , Fe 2+ və Cu 2+

    Əgər zülal Ni-NTA qatranına bağlanmırsa, anti-polihistidin anticisimlərindən istifadə edərək His etiketinin bütövlüyünü western blot ilə yoxlayın və ya
    N-terminal teqləri vəziyyətində N-terminal ardıcıllığını edin. Lizis zamanı proteaz inhibitorlarından istifadə edərək hər zaman 4°C-də işləməyə çalışın.

    Hədəf zülal zülal çirkləndiriciləri ilə yuyulursa, Prosedur-II-də göstərildiyi kimi həll olunan təmiz IB-ni yükləməyə çalışın. Və ya alternativi sınayın
    İmidazol konsentrasiyasının artması ilə protokol. Və ya Ni-NTA qatranının miqdarını azaldın. Və ya əlavələri sınayın ß ME, qliserin, yuyucu vasitələr və ya
    yuyulma/elüsyon tamponlarında daha çox NaCl.
    Geniş miqyaslı istehsal üçün müvafiq qatranlarla FPLC avadanlığının istifadəsi sadə optimallaşdırmaya və sürətli və rahatlığa imkan verəcəkdir.
    zülalların təmizlənməsi şərtlərinin müqayisəsi.

    Elüt edilmiş zülal parçalanmış kimi görünürsə, hər zaman 4°C-də işləməyə çalışın və liziz zamanı proteaz inhibitorlarından istifadə edin.

    Zülal sütundan ayrılmırsa (protein sütuna əlavə olunur) daha yüksək imidazol konsentrasiyalarından (1M-ə qədər) istifadə edin.

    Hədəf protein kifayət qədər təmiz deyilsə, alternativ protokol

    10, 20, 30, 40 və ya 50 mM imidazolun lizis, bağlama və yuyucu buferə daxil edildiyi paralel təmizləmə prosedurlarını həyata keçirin.

    3x100ul elüsyon tamponu + 250mM Imidazol ilə birbaşa elüt edin.

    PAGE-SDS-də təmizlənmiş zülalları yoxlayın. Imidazol konsentrasiyasını artırmaqla daha aşağı məhsuldarlıq, lakin daha yüksək təmizlənmə gözləyin


    Membran interfeysində enzimologiya: membrandaxili proteazlar

    B. Kordier, M.K. Lemberg, Enzimologiyada Metodlar, 2017

    2.2 Ekspressiya və membranın hazırlanması

    Daha sonra membran fraksiyasını hazırlamaq üçün ümumi bir üsul təsvir edilmişdir E. coli sonrakı həll və təmizlənmə üçün maraq romboid proteazları ifadə edən hüceyrələr (Şəkil 1). Əvvəlcə romboidi kodlayan gen bakterial ifadə vektoru pET-25b(+)-a klonlanır (şək. 1 A). PET sistemi rekombinant zülalların ifadəsi üçün geniş istifadə olunur E. coli, güclü T7 bakteriofaq promotorunun nəzarəti altındadır. T7 RNT polimerazanın xromosom nüsxəsini daşıyan BL21 (DE3)-pLysS ştamına (və ya törəmələrinə) çevrildikdə ekspressiya mədəniyyət mühitinə izopropil β-d-1-tioqalaktopiranosidin (IPTG) əlavə edilməsi ilə baş verir. pET-25b(+) plazmidi zülalın C-terminusuna birləşdirilən heksa-histidin etiketini (His6) kodlayır.

    Şəkil 1. Romboid ifadəsi və təmizlənməsi iş axını istifadə edərək E. coli hüceyrələr. (A) E. coli glpg və insan rhbdl2 genlər pET25b(+) ifadə vektoruna klonlanır. Kodlanmış zülallar C-terminusunda His6tag ilə birləşdirilir. (B) Bakterial transformasiyadan zülalın təmizlənməsinə qədər bütün prosedur ifadə müddətindən asılı olaraq 4 günlük müddəti əhatə edir. GlpG və RHBDL2-nin ifadəsi zülalın qatlanmasına kömək etmək və daxiletmə orqanlarının əmələ gəlməsini azaltmaq üçün 16°C-də 16 saat ərzində həyata keçirilir. Aralıq addımlar təsvir edilmir.

    Sonra, konstruksiyanı ifadə edir glpG -ə çevrilir E. coli BL21 (DE3)-pLysS gərginliyi. Plazmid kodlaşdırması rhbdl2 Rosetta™ 2 ştammına çevrilir. Bu ştam kodon meylini aradan qaldıran heteroloji zülalları ifadə etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur, çünki o, nadir hallarda istifadə edilən kodonları deşifrə edən tRNA genləri olan bir plazmid daşıyır. E. coli.

    Həddindən artıq ifadə edilmiş membran zülalının davranışını və onun hüceyrə üçün toksikliyini proqnozlaşdırmaq mümkün olmadığından, digər plazmid və bakteriya ştammları da nəzərdən keçirilə bilər. C41/C43 (DE3) və daha yaxınlarda "Walker" suşları kimi tanınan Lemo21 (DE3) kimi BL21 törəmə suşları membran zülallarının həddindən artıq ifadəsi üçün daha uyğundur (Miroux & Walker, 1996 Wagner et al., 2008). Bəzi həddindən artıq ifadə edilmiş zülallar yanlış qatlana və daxiletmə orqanlarında toplana bilər. Buna görə də, bir ifadə plazmid istifadə bir araBAD T7 promotorundan daha zəif olan promotor (arabinoza ilə induksiya olunur) tədqiqatda məhsuldar olmuşdur. Hemofil qripi romboid proteaz GlpG (Lemieux, Fischer, Cherney, Bateman, & amp James, 2007).

    2.2.1 Müddət

    Bakterial transformasiyadan tutmuş yaxınlığın təmizlənməsi mərhələsinə qədər bütün prosedur zülalın ifadə müddətindən asılı olaraq 4 və ya 5 gün davam edə bilər (şək. 1 B).

    2.2.2 Materiallar və Avadanlıqlar

    E. coli suşlar: Rosetta™ 2 (Novagen) və ya BL21 (DE3)-pLysS (Novagen) (xloramfenikol müqavimət markerini daşıyır)

    İfadə plazmidləri pET25b(+) (Novagen) (ampisilin müqavimət markerini daşıyır)

    LB agar lövhələri (uyğun antibiotiklərlə əlavə olunur)

    2 × Laemmli nümunə tamponu (5% β-merkaptoetanol ilə əlavə olunur) (2XSB + BME)

    Lizozim (ehtiyat məhlulu 20 mq/mL)

    Fenilmetilsulfonil flüorid (PMSF) (ehtiyat məhlulu 100 mM)

    n-Dodecyl-β- d -maltoside (DDM) (Anatrace, ABŞ)

    Triton X100 (T-X100) (Applichem, Almaniya)

    Nonidet P-40 (NP-40) (Applichem, Almaniya)

    Xolesteril hemisüksinat Tris duzu (CHS) (Anatrace, ABŞ)

    Protein konsentrasiyasının qiymətləndirilməsi: bicinchoninic acid (BCA) testi (ThermoFisher, USA) və ya Bradford protein testi (Applichem, Almaniya) dəstləri

    Coomassie mavi boyama məhlulu (Coomassie Brilliant Blue R-250)

    Penta-onun antikoru (QIAGEN, Almaniya)

    İnkubator çalkalayıcı (temperatur tənzimlənən, 16-37°C)

    Erlenmeyer hüceyrə kulturaları (5 L)

    Su vannası/Eppendorf ThermoMixer®

    Lizis üçün alət (yüksək təzyiqli homojenizator Emulsiflex/Fransız presi)

    SDS-PAGE miqrasiya sistemləri və blot sistemi

    Imager ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Birləşmiş Krallıq)

    2.2.3 Metodlar

    Yetkin BL21 (DE3)-pLysS və ya Rosetta™ 2-ni əridin E. coli buz üzərində hüceyrələr (səlahiyyətli hüceyrələr CaCl istifadə edərək əvvəlcədən hazırlana bilər2 metodu (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, 1989).

    50 μL səlahiyyətli əlavə edin E. coli hüceyrələri steril 1,5 ml mikrosentrifuqa borusuna daxil edin.

    Səlahiyyətli hüceyrələrə 1-2 μL ifadə plazmidi (50 ng/μL) əlavə edin və qarışdırın (ifadə plazmidi olmadan mənfi nəzarət paralel olaraq həyata keçirilə bilər).

    Borunu buz üzərində 30 dəqiqə inkubasiya edin.

    Borunu 42°C-də su banyosunda 1 dəqiqə inkubasiya edin.

    Borunu buz üzərində 2 dəqiqə inkubasiya edin.

    Borunu otaq temperaturunda 2 dəqiqə inkubasiya edin.

    450 μL LB mühiti əlavə edin və su hamamında və ya termomikserdə 37°C-də 1 saat inkubasiya edin.

    Tərkibində ampisilin (100 μL/mL—Amp100) və xloramfenikol (34 mkL/mL—Cm34) olan LB agar boşqablarına 150 mkL transformasiya edilmiş hüceyrələri yayın. Gecədə 37 ° C-də böyüyün.

    Prekulturalar: təzə çevrilmiş koloniyaları 100 mL LB Amp100 Cm34 (hər antibiotik üçün 1:1000 seyreltmə) olan 1 litrlik kolonaya əkmək.

    Mədəniyyətlər OD-yə çatana qədər orbital çalkalayıcıda 37°C-də inkubasiya edin600 təxminən 0,6 (3-4 saat artım).

    Tərkibində 1 L LB Amp100, Cm34 (hər biri) olan üç 5 litrlik kolba 30°C inkubatorda çalkalayıcı platformaya qoyun. İsti və havalandırmaq üçün silkələyin.

    Böyük miqyaslı mədəniyyətlər: OD-də mədəniyyətləri aşılayın600 0,02 (əvvəlcədən isidilmiş və havalandırılmış).

    30 ° C-dən OD-yə qədər böyüyün600 0.3/0.4.

    Kulturadan 1 ml nümunə çıxarın (maraqlanan zülalı ifadə etməyən hüceyrələr, “−IPTG”). Aşağı fırladın (11 krpm, 1 dəq), supernatantı çıxarın, 100 μL 2XSB + BME əlavə edin və Western blot təhlili üçün - 20°C-də saxlayın. OD qeyd edin600 induksiyadan əvvəl mədəniyyət.

    IPTG-ni 0,6 m-ə əlavə edinM son konsentrasiya (IPTG ehtiyat məhlulu 1 M) və mədəniyyətləri 16°C-də 16 saat yetişdirin. İnduksiya konsentrasiyası və induksiyanın müddəti geniş miqyaslı ifadədən əvvəl optimallaşdırıla bilən parametrlərdir.

    Kulturaları soyumaq üçün buza qoyun (təxminən 20 dəq).

    Soyuduqda 1 ml nümunəni mədəniyyətdən çıxarın (maraqlanan zülalı ifadə edən hüceyrələr, “+IPTG”). Aşağı fırladın (11 krpm, 1 dəq), supernatantı çıxarın, 100 μL 2XSB + BME əlavə edin və -20°C-də saxlayın. OD qeyd edin600 ifadə induksiyasından sonra mədəniyyətin.

    3 L mədəniyyəti 1 litrlik şüşələr üçün müvafiq rotorla əvvəlcədən soyudulmuş sentrifuqada fırladın (15 dəqiqə ərzində 3,5 krpm).

    Qranulları orijinal həcmin 1/50-də buz kimi soyuq lizis tamponu A (3-L mədəniyyət hüceyrəsi qranul 60 mL lizis bufer A-da yenidən dayandırılır) ilə yenidən suspenziyaya salın. Yenidən suspenziya həcmi bir gecədə böyümədən sonra hüceyrə mədəniyyətinin sıxlığına uyğun olaraq tənzimlənə bilər.

    Asılmış hüceyrələri yeni əvvəlcədən soyudulmuş 50 ml borulara köçürün.

    Yenidən dayandırılmış hüceyrələri maye azotda dondurun.

    -80°C temperaturda saxlayın. Hüceyrələr -80°C-də bir neçə həftə saxlanıla və ya dərhal əridilə bilər. Hüceyrə lizizini yaxşılaşdırmaq üçün flaş dondurma mərhələsi vacibdir.

    Hüceyrə qranullarını buzlu suda əridin.

    600 μL 10 mq/mL lizozim (100 μq/mL son konsentrasiya) əlavə edin.

    600 μL 100 m əlavə edinM PMSF (1 mM son konsentrasiya).

    Dövri vortekslə 30 dəqiqə buz üzərində inkubasiya edin.

    Seçilmiş metoddan istifadə edərək hüceyrələrin lizisi: yüksək təzyiqli homojenizator Emulsiflex və ya Fransız presi burada üstünlük verilən üsullardır (Emulsiflex kamerasını təmizləmək üçün əlavə lizis buferi hazırlayın). Çıxarış daha aydın olmalıdır.

    20 μL çıxarın və 20 μL 2XSB + BME (hüceyrə ekstraktı) ilə birləşdirin.

    Hüceyrə ekstraktını 50 ml-lik sentrifuqa borularına köçürün.

    Hüceyrə ekstraktını 50 ml-lik borular üçün müvafiq rotorla əvvəlcədən soyudulmuş sentrifuqada fırladın (15 dəqiqə ərzində 3,5 krpm).

    60 mL buz kimi soyuq lizis buferində pelleti yenidən dayandırın. 20 μL çıxarın və 20 μL 2XSB + BME (qırılmamış hüceyrələr və daxiletmə orqanları) ilə birləşdirin.

    Lizis tamponu A: 20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% qliserin, 1 mM PMSF.

    Supernatantı buz kimi soyuq ultrasentrifuqa borusuna köçürün.

    Süpernatantı 50.000 ×-də fırlatmaqla membranları yığın g 1 saat üçün.

    20 μL supernatantı çıxarın və 20 μL 2XSB + BME (həll olan zülallar) ilə birləşdirin.

    Süpernatantın qalan hissəsini ultrasentrifuqa borusundan ehtiyatla çıxarın. Bütün mayeni almağa və qranulları toxunulmaz buraxmağa çalışın.

    Qranullara 4,5 mL həlletmə tamponu B əlavə edin və homogenləşdirici pestle istifadə edərək paylayın.

    Solubilizasiya buferi B: 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 15% qliserin, 1 mM PMSF.

    Homojenləşdirici pestle istifadə edərək ayrılmış qranulları tamamilə homojenləşdirin.

    20 μL asılmış pelet çıxarın və 20 μL 2XSB + BME (membranlar) ilə birləşdirin.

    Flash membranları maye azotda dondurur. Membranlar − 80°C temperaturda saxlanıla bilər və ya dərhal dondurulmadan həll etmək üçün istifadə edilə bilər. Əgər uyğun həlletmə şərtləri artıq məlumdursa, deterjan skrininqini həyata keçirmək üçün bütün membran fraksiyasını həll etmək və ya hissəciklər hazırlamaq (200 μL) olar.

    Bütün toplanmış nümunələr membran fraksiyasında düzgün istehsal və mövcudluğu təmin etmək üçün SDS-PAGE, ardınca Coomassie mavi rəngləmə (zülal çox miqdarda olarsa) və ya Western blotting ilə təhlil edilə bilər (Şəkil 2 A).

    Şəkil 2. E. coli GlpG və insan RHBDL2 ifadəsi və həll olunma şərtləri ekranı. (A) GlpG-His6 və RHBDL2-His6 ifadəsi və membranın hazırlanması E. coli hüceyrələr. İfadə 0,6 m ilə induksiya edilirM Bakterial hüceyrə mədəniyyətində IPTG və hüceyrələr 16 ° C-də 16 saat yetişdirilir. Membran fraksiyasında füzyon zülallarının ifadəsi və mövcudluğu penta-his antikorundan (QIAGEN, son konsentrasiya 0,2 ng/μL) istifadə edərək Western blotlama ilə təsdiqlənir. Qara oxlar GlpG-His6 uyğun gəlir və açıq ox ucları RHBDL2-His6 uyğun gəlir. (B) GlpG və RHBDL2-ni həll etmək üçün yuyucu vasitənin vəziyyəti ekranı. Həll edilmiş zülal fraksiyası (S) həll olunmayan fraksiya (IS) ilə müqayisə edilir ki, CHS RHBDL2-nin həllini artırır.


    I hissə: Bakterial Hüceyrələrin Lizisi

    Əvvəllər bakteriyalar hüceyrələr induksiya edildikdə gfp-ni ifadə edə bilən rekombinant plazmidlə çevrilmişdir. Hüceyrələrin zülal istehsal etməsinə səbəb ola bilməsinin səbəbi odur ki, plazmidin daxilində, gfp üçün genin qarşısında, mühitə kimyəvi maddə yerləşdirildiyi təqdirdə cavab verəcək xüsusi bir DNT ardıcıllığı var. Bu kimyəvi maddə induktor (ind) adlanır və genin &ldquoteçilməsi&rdquo və messenger RNT-nin DNT təlimatlarından transkripsiya edilməsi və zülalın istehsal edilməsi barədə siqnallar verir. Plazmid, həmçinin mədəniyyətinizdə böyüyən hüceyrələrin plazmidinizi ehtiva edən hüceyrələr olmasını təmin etmək üçün seçilə bilən ampisilin (amp) müqavimət genini ehtiva edir.

    Bu laboratoriya dövründən əvvəl hüceyrələr log fazasının sonuna qədər ampisillinin iştirakı ilə böyüdülürdü. Mədəniyyətdəki hüceyrələr bölünür və hər hüceyrədə plazmidin çoxlu nüsxəsi olur. Gec log fazasında, aktivləşdirmək üçün mühitə kimyəvi induktor əlavə edildi gfp gen və hüceyrələrin böyüməyə və gfp istehsal etməyə davam etməsinə icazə verildi.

    Birincisi, hüceyrələrinizi toplayacaqsınız və onları açacaqsınız. Bu proses hüceyrə lizisi adlanır. Hüceyrələr parçalandıqdan sonra gfp-ni təmizləmək üçün sütun xromatoqrafiyasından istifadə edəcəksiniz.

    MATERİALLAR

    • Aşağıdakı borularla mikrofuge boru rəfi:
      • LB/amp/ind mədəniyyəti E. coli hüceyrələr (EC)
      • Elüsyon tamponu (EB)
      • Lizis buferi (LyB)

      Avadanlıq və Təchizat

      • P-200 mikropipet
      • Pipet ucu qutusu
      • Daimi marker
      • Mikrosentrifuqa (siniflə paylaşılır)
      • Vorteks qarışdırıcı (siniflə paylaşılır)
      • Uzun dalğalı UV işığı
      • Maye tullantı konteyneri
      • Kəskin konteyner
      • Təmasda olan materiallar üçün biotəhlükə çantası E. coli hüceyrələr (siniflə paylaşılır)

      Təhlükəsizlik Xatırlatmaları

      Müvafiq təhlükəsizlik tədbirləri hər zaman istifadə edilməlidir. Bunlar müəlliminiz tərəfindən nəzərdən keçiriləcək və bu prosedura başlamazdan əvvəl istinad etməli olduğunuz laboratoriya təlimatınızın əvvəlində tapıla bilər. Müalicə zamanı aseptik texnika tələb olunur E.coli və bakteriya mədəniyyəti ilə təmasda olan materiallar. Unutmayın ki, aseptik texnika mədəniyyətinizi və nümunələrinizi çirklənmədən qorumaq, həm də sizi qorumaq üçün istifadə olunan prosedurlardır.

      1. Təcrübəyə başlamazdan əvvəl iş yerinizi dezinfeksiya edin və əllərinizi yuyun.
      2. ilə təmasda olan heç bir şeyə toxunmayın E.coli. Buraya pipetlər, yayıcılar və boruların daxili hissəsi daxildir. Pipet ucları köçürüləcək materialdan başqa heç bir şeyə toxunmamalıdır. Yayıcılar və pipetlər yalnız bakteriyalara toxunmayan ucundan işlənməlidir.
      3. Petri qabları ilə işləyərkən, yalnız agar səthi ilə işləmək üçün qapağı açın və dərhal qapağı bağlayın. Bu, agar boşqabınıza havadan göbələk sporları kimi çirklənmənin qarşısını alacaq.
      4. Bir şey təsadüfən çirklənirsə, əvəzedicinin uyğun və mövcud olub olmadığını öyrənmək üçün təlimatçı ilə danışın.
      5. Döküntülərdən çəkinin. Əgər bu baş verərsə, onu düzgün təmizləmək üçün dərhal təlimatçıya məlumat verin.
      6. İşlənmiş mikrofuge boruları və hüceyrə yayıcılar kimi çirklənmiş tullantılar biotəhlükə torbasına yerləşdiriləcək. Pipet ucları iti bir qabda yerləşdiriləcək.
      7. Yalnız buna göstəriş verildikdə siz istifadə etdiyiniz petri qablarını biotəhlükəli tullantılara atacaqsınız.
      8. Laboratoriyadan çıxmazdan əvvəl iş yerinizi təmizləməyi və əllərinizi yumağınızdan əmin olun.

      Prosedurlar

      1. Uzun dalğalı UV işığı götürün və EC borusuna baxın, müşahidələrinizi qeyd edin.
      2. EC borusunu çəkin. Bənzər çəkisi +/- 0,1 q olan başqa bir boru axtarın və ya mikrosentrifuqa üçün balans borusu yaradın.
      3. EC borusunu mikrosentrifuqada 5 dəqiqə 13000 rpm (və ya mümkün qədər yüksək sürətlə) fırladın. Boruları düzgün balanslaşdırdığınızdan əmin olun.
      4. Çox diqqətlə EC borusunu mikrosentrifuqadan çıxarın. Borunun altındakı hüceyrə peletini narahat etməkdən çəkinin.
      5. P-200 mikropipetini götürün, onu 200.0 µL-ə qoyun və bir ipucu alın. Supernatant (maye təbəqə) içərisinə girməzdən əvvəl ilk dayanacağa qədər basın və köhnə maye böyümə mühitini yumşaq bir şəkildə çıxarın. Bunu edərkən hüceyrə peletini narahat etməyin.
      6. Mayeni maye tullantı konteynerinə, ucunu isə iti qaba atın.
      7. Borunuza 1 ml eyni kultura paylamaq üçün hüceyrə qranulunu (AK borusu) təlimatçıya gətirin.
      8. 2-6 addımları təkrarlayın, beləliklə, hüceyrələri yenidən 5 dəqiqə aşağı çevirin və supernatantı çıxarın. Bu addımda supernatantın və qranulun rəngini qeyd edin.
      9. P-200 mikropipetini və yeni ucunu götürün və diqqətlə hüceyrələri götürmədən bütün mayeni qranuldan tam çıxarmağa çalışın. Ucunu kəskin şəkildə atın.
      10. P-200-ü 150.0 µL-ə təyin edin və yeni ucluq əldə edin. EC borusuna 150 µL elüsyon tamponu (EB) əlavə edin. Ucunu atın.
      11. Möhkəm EC boru bağlayın və bir burulğan ilə mobil pellet resuspend. Əgər bunlardan biri mövcud deyilsə, borunu boş mikrofuge borusu rəfinə sürətlə sürün. Bu, hüceyrə qranulunun borunun dibindən çıxmasına səbəb olmalı və tampon bulanıqlaşmalıdır. Bütün pelet yox olana qədər bu hərəkəti təkrarlayın.
      12. P-200 götürün və yeni bir ipucu alın. EC borusuna 150 µL lizis tamponu (LyB) əlavə edin. Borunun içindəkiləri burulğanla və ya əvvəlki kimi mikrofuge boru çarxı üsulu ilə qarışdırın.
      13. EC borusu otaq temperaturunda gecə ərzində liziz tamponunda inkubasiya ediləcək. Borunuzu sinif müddəti və qrup nömrəsi ilə etiketləyin və bu addımı yerinə yetirmək üçün təlimatçıya verin.
      14. İş yerinizi təmizləyin və bütün çirklənmiş boruları və ucları müvafiq biotəhlükəli tullantılara atın.

      Western Blot of Bakteria - Bakteriyalardan Qərb Ləkəsini yerinə yetirmək üçün bəzi məsləhətlərə ehtiyacınız var (May/06/2008)

      Salam, mən burada yeniyəm və bakteriyalardan vestern ləkəsi tətbiq etməklə bağlı bir neçə sualım var:

      Mənim üçün antikorlar hazırlandıqdan sonra Legionella pneumophila üzərində Western blot tətbiq edəcəyəm. Əvvəllər həyatımda heç bir protein işi görməmişəm.

      Mən antikorların bir ay və ya daha çox müddətə gəlməsini gözlədiyim halda, bakteriyaları bulyonda orta-gec log fazasına qədər böyütməklə hazırlamaq istərdim (indiyə qədər düzgün səslənirmi?). Daha sonra hüceyrə mədəniyyətinin bir hissəsini (1-2 ml qəbul edirəm) qranullaşdırmaq və sonra lizis üçün dondurmaq istərdim. Hal-hazırda mənim sualım bakterial hüceyrə qranulunun hazırlanması və dondurulması ilə bağlıdır (-70C-də), əlbəttə ki, böyümə mühiti çıxarılır.Qranulları bir növ buferdə yenidən dayandırmalıyam? (Bəlkə 1x PBS) Yoxsa -70C-də yenidən dayandırmadan qranulları yalnız dondura bilərəmmi?

      Kiminsə hər hansı məqaləsi/protokolu varsa, bu mənə çox kömək edə bilər.

      Əməyi keçən hər kəsə vaxt ayırdığınız üçün təşəkkür edirik.

      Mən birbaşa laemmli buferində pelleti yenidən dayandırırdım. Bu, zülalların çoxunu həll etməyin ən yaxşı yoludur.
      Ancaq bu şərtlərdə siz protein titrasiyası edə bilməzsiniz.

      İkinci nəticədə sizin üçün bir cavab var. Düşünürəm ki, bu, bütün bakteriyalar üçün eyni olmalıdır, amma əmin deyiləm.

      Mən antikorların bir ay və ya daha çox müddətə gəlməsini gözlədiyim halda, bakteriyaları bulyonda orta-gec log fazasına qədər böyütməklə hazırlamaq istərdim (indiyə qədər düzgün səslənirmi?). Daha sonra hüceyrə mədəniyyətinin bir hissəsini (1-2 ml qəbul edirəm) qranullaşdırmaq və sonra lizis üçün dondurmaq istərdim. Hal-hazırda mənim sualım bakterial hüceyrə qranulunun hazırlanması və dondurulması ilə bağlıdır (-70C-də), əlbəttə ki, böyümə mühiti çıxarılır. Qranulları bir növ buferdə yenidən dayandırmalıyam? (Bəlkə 1x PBS) Yoxsa -70C-də yenidən dayandırmadan qranulları yalnız dondura bilərəmmi?

      Kiminsə məqaləsi/protokolu varsa, bu mənə çox kömək edə bilər.

      Əməyi keçən hər kəsə vaxt ayırdığınız üçün təşəkkür edirik.
      [/quote]

      Təcrübəmə görə, həll olunan fraksiyanı həll olunmayan hissədən ayırmaq məqsədi ilə hər bir qranul lizis tamponunda yenidən suspenziya etməzdən əvvəl bir ay saxlamaq istəyirsinizsə, 1 ml kolturadan qranulları -20°C və ya -70°C temperaturda saxlaya bilərsiniz. bir. Bu halda, siz Bradford və ya BCA protokolu ilə lizatdakı protein konsentrasiyasını yoxlaya bilərsiniz. Əgər həll olunan zülalları bütün lizatdan ayırmağa ehtiyac yoxdursa, OD kolturasına mütənasib olaraq nümunə tamponunda hər bir qranulun yenidən dayandırılmasına üstünlük verməlisiniz. Bu üsul daha sadə və sürətlidir, hüceyrəni sonikasiya və ya digər üsullarla pozmağa ehtiyac yoxdur, sadəcə olaraq sentrifuqa edin və nümunə tamponunda rəngi yenidən dayandırın, nümunələri qaynadın e western blot üçün SDS səhifəsinə yükləyin!


      Laboratoriyanızı daha davamlı etmək üçün praktiki məsləhətlər

      Son 10 ildə hüceyrə biologiyası laboratoriyasında tezgah işi görmüsünüzsə, plazmid DNT-ni bakterial mədəniyyətdən təmizləmək üçün demək olar ki, mini-prep dəsti adlanan məhsuldan istifadə etmisiniz. Nə qədər nümunəniz olduğundan asılı olaraq, bir müddət çəkə bilər və bir növ darıxdırıcıdır: pipet, spin, pipet, spin. Bəlkə də darıxdırıcı olduğuna görə, mini-hazırlıqlar edəndə fikrim ümumiyyətlə başıma gəlir. İllər keçdikcə standart protokolu daha çox oxumağa başladım:

      qranul bakteriyaları a plastik mikrosentrifuqa borusu. Bufer 1-də pelleti yenidən dayandırın plastik pipet ucu istifadə edərək. Bufer 2 əlavə edin plastik pipet ucu istifadə edərək. Qarışdırın. Gözləmək. Bufer 3 əlavə edin plastik pipet ucu istifadə edərək. Qarışdırın. Spin. Üzərinə supernatant əlavə edin plastik sütunda a plastik qab borusu. Spin. Atın plastik mikrosentrifuqa borusu. a istifadə edərək yuma tamponu əlavə edin plastik pipet ucu. Spin. Yuma tamponu əlavə edin plastik pipet ucu istifadə edərək. Spin. Atın plastik qab borusu. Sütunu yeniyə yerləşdirin plastik mikrosentrifuqa borusu. Elüsyon tamponu əlavə edin plastik pipet ucu istifadə edərək. Gözləmək. Spin.

      Son spindən sonra mən həmişə kiçik bir plastik boru və pipet ucları ilə qalıram. Bu müşahidə diqqətimi laboratoriyada hər gün istifadə etdiyimiz çoxlu miqdarda istehlak materialına, birdəfəlik istifadəyə yönəltdi.

      Neçə pipet ucundan keçirsiniz? Foto Retama

      Təbii ki, bu maddələr tədqiqat üçün vacibdir. Onlar dəqiq və yaxşı idarə olunan eksperimentlər üçün ciddilik və qayğı ilə işləməyə imkan verən şeylərin bir hissəsidir. Reagentlər və eksperimentlər təmiz, müəyyən edilmiş və çirklənməmiş olmalıdır və onları bu şəkildə saxlamaq bahalı, faydalı və enerjiyə qənaətlidir. Hətta bu biliklərə baxmayaraq, özümü hələ də tədqiqatımın ekoloji təsirinə görə günahkar hiss edirəm və görəsən, edə biləcəyim daha çox şey varmı?

      Təxminən bir ay əvvəl “Mənim Yaşıl Laboratoriyam” adlı qeyri-kommersiya təşkilatı tərəfindən Davamlılıq Sammitinin keçirilməsi haqqında tvit gördüm. Mən həyəcanlandım! Birincisi, bu təşəbbüsün mövcud olması artıq bildiklərimin sübutudur: elmi ictimaiyyətin bir çox üzvləri öz işlərinin (yalnız parlaq kəşflərinin deyil) dünyaya necə təsir etdiyini fəal şəkildə düşünürlər. İkincisi, mənim qrafikim aydın idi və tədbir yaxınlıqda idi.

      Tədbirin keçirildiyi gün özümü qaçıra bilmədim, amma görüş canlı yayımlandı və mən masamdan baxdım. Mənim Yaşıl Laboratoriyamın Proqram Meneceri Erika Daley ilk məruzə ilə çıxış etdi və o, problemlə bağlı bəzi faktları açıqladı: laboratoriya otaqları hər kvadrat fut üçün ofis sahəsi kimi təxminən 5 dəfə enerji istifadə edir, təxminən 12,1 milyard funt-sterlinq plastik istehsal edir. Bütün dünyada tullantılara qarşı, tək bir –80 (və ya ultra aşağı temperatur, ULT) dondurucu gündə bir ev qədər enerji istehlak edə bilər və buxar qapağı hər il 1,733 gallon benzin kimi ekvivalent enerjini yandırır.

      Bəli! İndiyə qədər işlədiyim hər laboratoriyada ən azı bir -80 və bir duman başlığı var idi. Düşünürəm ki, mən oturduğum binanın mərtəbəsində çılğın şəkildə rəqəmləri zehni hesablamağa başladım.

      Sonra o, laboratoriyanızı daha davamlı etmək üçün edə biləcəyiniz ən təsirli beş şey haqqında danışdı. Bəli! Düşündüm ki, düz nöqtəyə:

      1) Soyuq anbar. Ultra aşağı temperaturlu dondurucular çox enerji sərf etdiyi üçün burada diqqətli fəaliyyət böyük fərq yarada bilər. Əgər -80 temperaturu 10 dərəcə -70-ə qaldırıla bilərsə, enerji sərfiyyatını 30-40% azalda bilər. Yeni bir ULT dondurucu alarkən enerjiyə qənaət edən bir dondurucu aldığınızdan əmin olun və bütün laboratoriyalar axtarış edilə bilən elektron inventar (google sənədləri, kvars və s.) saxlamaqla ümumi dondurucu yerindən istifadəni maksimum dərəcədə artıra bilər.

      2) İstifadə olunmayan avadanlıqları söndürün. Olduqca sadə, lakin mənim təcrübəmdə mütləq ümumi bir təcrübə deyil.

      3) Yaşıl kimya. Bunu daha az başa düşdüm (Erikdən fərqli olaraq, mən təlimlə kimyaçı deyiləm), lakin ümumi fikir mümkün olan ən təhlükəsiz və davamlı təcrübələrdən istifadə etməklə kimyəvi tullantıları idarə etməkdir (daha çox burada və burada).

      4) Qapağın bağlanması İstifadə edilmədiyi zaman duman qapağının işləməsi fan sürətini və işlənmiş havanın həcmini azaltmaqla enerjiyə qənaət edir.

      5) Kranlarda ucuz aeratorların quraşdırılması su sərfiyyatını azaldır. Onların qiyməti 5 dollardan azdır və su istifadəsini 50-70% azalda bilər.

      Bu təcrübələrdən bəziləri, məsələn, enerjiyə qənaət edən dondurucu almaq və aeratorların quraşdırılması, əgər yeni laboratoriyalarda tətbiq olunarsa, heç vaxt fərq edilmədən və ya bir daha düşünmədən uzunmüddətli fərq yaradacaq. Digərləri, məsələn, duman qapağının bağlanması və az tullantılı kimyəvi gigiyena tətbiq edilməsi tədqiqatçının davranışında dəyişiklik tələb edir.

      Virciniya Texniki Universitetində Biologiya Elmləri Departamentinin aspirantı Ellen B. Qarsianın ikinci çıxışı burada başladı. Onun hekayəsi öz davranışını və tədqiqat qrupunun davranışını dəyişdirməklə başladı və sonra digərlərinə yayıldı. kampus boyunca laboratoriyalar. Davamlı əsas səylər və yaradıcı problemlərin həlli ilə o, Virginia Tech-də kampusdakı laboratoriyalarda təkrar emal, təkrar istifadə və aşağı enerji istifadəsi proqramlarının həyata keçirilməsinə səbəb olan yaşıl laboratoriya hərəkatı təşkil etdi. O, həmçinin bioloji təchizat şirkətlərinin nümayəndələri ilə söhbəti və onların məhsullarından bərk tullantıların təkrar istifadəsi və emalı üçün xüsusi məhsulların alınmasını təsvir etdi. Onun şəxsi vəkillik hekayəsi və təcəssüm etdirdiyi dəyişiklik tək, motivasiyalı bir insanın zahirən öhdəsindən gəlməyən problemə göstərə biləcəyi təsirin ruhlandırıcı bir xatırlatmasıdır.

      More Recycling-in Proqram Meneceri Tonya Randelldən öyrəndim ki, təkrar emal təsəvvür etdiyimdən daha mürəkkəbdir və laboratoriya elmində istifadə olunan əşyaların təkrar emalı ilə bağlı artan çətinliklər var. Təsəvvür etdiyiniz kimi, potensial zərərli maddələrlə istifadə edilmiş əşyalar, onlarla təmasda ola biləcək şəxslərə potensial zərər verə biləcək formada təkrar emal edilməməlidir. Laboratoriyada istifadə etdiyimiz bəzi plastiklər də təkrar emal problemi yaradır: onlar istiliyə və deqradasiyaya qarşı müqavimət göstərmək üçün struktur və kimyəvi cəhətdən dəyişdirilə bilər. Molekulyar biologiya üçün istifadə etdiyimiz bir çox element (məsələn, mənim mini-hazırlayıcı plastik dağımda olanlar) adi təkrar emal üçün çox kiçikdir, çünki prosesdə ilk addım təkrar emal ediləcək materialları nəhəng bir şəbəkə üzərindən keçir. Bu o deməkdir ki, pipet ucları kimi əşyalar tordan düşəcək və zibilxanaya düşəcək. Lakin laboratoriyalarımızdakı bir çox gündəlik əşyalar təkrar emal edilə bilər: məsələn, göndərmə qutuları, printer patronları və strafor qutuları və fıstıqlar.

      Nə edə biləcəyiniz və Yaşıl Laboratoriyamın səyləri haqqında daha çox öyrənmək istəyirsinizsə, onların veb saytı faydalı məlumatlarla doludur. Həmçinin, mənim institutumda əvvəllər eşitmədiyim bir sertifikat proqramı var idi, mövcud laboratoriya davamlılığı proqramı üçün universitetinizi yoxlayın. Laboratoriyanızda istifadə etdiyiniz təkrar istifadə, təkrar emal və ya davamlılıq təcrübələri ilə bağlı isti məsləhətiniz varsa, lütfən, aşağıdakı şərhlərdə paylaşın.

      Ətrafımızda dağılmış kimi görünən qlobal mühitlə özümüzü çarəsiz hiss etmək asandır. Bununla belə, bu həftə mənə xatırladıldı ki, elm adamları enerjiyə qənaət edən və israfı azaldan davranışların modelləşdirilməsində lider olmalıdırlar. Hüceyrə bioloqları olaraq, biz tək və yeganə yer kürəmizin təqdim etdiyi inanılmaz biologiyanın sirlərini açmaq üçün çalışırıq və eyni zamanda onu xilas etməyə çalışa biləcəyimizi xatırlamaq vacibdir.

      Açıqlamalar: Mənim Yaşıl Laboratoriyamla heç bir əlaqəm yoxdur. 15 oktyabr 2018-ci ildə baş tutan Davamlılıq Sammitində iştirak etmək üçün cibimdən təvazökar qeydiyyat haqqı (15 ABŞ dolları) ödədim.

      Bu bloqda ifadə olunan fikirlər və rəylər müəllif(lər)in fikirləridir və ASCB-nin rəsmi siyasətini və ya mövqeyini təmsil etmir.


      PROTOKOL:

      1. MEMBRANIN EKSTRAKSİYASI ÜÇÜN ÜMUMİ REAKTİVLƏR VƏ MEDİALARIN HAZIRLANMASI

      1.1 Bakterial inkişaf mühiti: 1 L bulyon mühitini hərtərəfli təmizlənmiş və avtoklavlanmış 2 L kolbada hazırlayın və sterilizasiya edin.

      1.2. Ümumi resuspenziya tamponu (1 M Tris Buffer pH 7.5 50 mL): 6,05 q Tris əsasını 30 mL H-də həll edin2O. 5 M HCl ilə pH-ı 7,5-ə tənzimləyin. Ultra saf H ilə son həcmi 50 ml-ə tənzimləyin2O.

      1.3. İkivalentli kation şelasiya məhlulunun əsas ehtiyatı (0,5 M EDTA pH 8 100 mL): 18,6 q disodium etilen tetraasetat୲H əlavə edin.2O - 80 ml H2O. Ciddi şəkildə qarışdırın və NaOH ilə pH-ı 8,0-ə tənzimləyin. Ultra saf H ilə son həcmi 100 ml-ə tənzimləyin2O.

      Qeyd: EDTA-nın dinatrium duzu məhlulun pH səviyyəsinə uyğunlaşdırılana qədər həll olunmayacaq

      NaOH əlavə etməklə 8.0.

      1.4. Osmotik tampon A (0,5 M saxaroza, 10 mM Tris pH 7,5 1 L): 171,15 q saxaroza çəkin və 1 L silindrə köçürün. 10 mL 1 M Tris pH 7.5 əlavə edin. Ultra saf H ilə 1 L son həcminə uyğunlaşdırın2O. 4 ଌ-də saxlayın.

      1.5. Lizozim (10 mq/mL 5 mL): 50 mq (toyuq yumurtası-ağı) lizozim çəkin və 5 ml ultra saf H-də həll edin.2O. 4 ଌ-də saxlayın.

      1.6. Seyreltilmiş ikivalentli kation şelasiya məhlulu (1,5 mM EDTA 500 mL): 1,5 mL 0,5 M EDTA (Addım 1,3) 497,5 mL ultra saf H əlavə edin.2O. 4 ଌ-də saxlayın.

      1.7. Osmotik tampon B (0,2 M saxaroza, 10 mM Tris pH 7,5 2 L): 136,8 q saxaroza çəkin və 2 L silindrə köçürün. 20 mL 1 M Tris pH 7.5 əlavə edin. Ultra saf H ilə son həcmi 2 L-ə tənzimləyin2O. 4 ଌ-də saxlayın.

      1.8. Nukleaz ko-faktoru (1 M MgCl2 10 ml): 2,03 q MgCl həll edin2୶H28 mL ultra saf H-də O2O. Həcmi 10 ml-ə tənzimləyin. Otaq temperaturunda saxlayın.

      1.9. Nukleaz məhlulu RNaz və DNaz fermentləri daxil olmaqla kokteyl (reagentlər cədvəlinə baxın). � ଌ-də saxlayın.

      adŞirkətKataloq nömrəsiŞərhlər
      1 L sentrifuqa şüşələri, PC/PPCO, super sürət, sızdırmaz qapaqlı, NalgeneVWR525�
      Yüksək temperatur qapağı ilə 1 L Pyrex Media saxlama şüşəsiVWR10416�
      2000 mL Erlenmeyer Flask, Dar AğızVWR10545�
      4�% mini PROTEAN Precast Protein Gel, 12 quyuBIORAD4561095
      4x Laemmli Nümunə Tamponu 10 mLBIORAD1610747
      50 ml steril polipropilen sentrifuqa borularıVWR89049�
      İki Şüşə Pestle ilə 7 mL Dounce Toxuma HomojenizatoruVWR71000�
      70 mL polikarbonat şüşə yığımıBeckman Coulter Həyat Elmləri355622
      Agar tozuVWRA10752
      PH zondu ilə B10P Tezgah üstü pH ÖlçerVWR89231�
      Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (dəzgah versiyası)ThermoFisher Scientific50136146
      Benzonaz-nükleazMilliporeSigma70746𠄳
      EDTA disodium duzu dehidrat 99,0�,0%, kristallar, ultra saf Bioreagent Molekulyar biologiya dərəcəsi, J.T. çörəkçiVWR4040�
      EmulsiFlex-C3Avestin, Inc.
      Fiberlite F13� × 50cy Sabit Bucaqlı RotorThermoFisher Scientific75006526
      Xlorid turşusu 6,0 NVWRBDH7204
      IBI Scientific Orbital Platform ShakerFischer Scientific15-453-211
      LB Broth MillerVWR214906
      Lizozim, Yumurta Ağı, Ultra SafVWRVWRV0063
      Maqnezium xlorid heksahidratSigma AldrichM2670
      NADHSigma Aldrich10107735001
      Optima XPN-80 - IVDBeckman Coulter Həyat Elmləri <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"A99839","term_id":"25392059","term_text":"pir||A99839">> A99839
      Pharmco Məhsulları PURE ALKOHOL 200 PROOF GL 4/CSFischer ScientificNC1624582
      Molekulyar biologiya üçün 10 mM Tris HCI, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent ilə tarazlaşdırılmış fenol məhluluSigma - MilliporeP4557
      Pirs Coomassie Plus (Bradford) Təhlil KitiTermofisher23238
      Pro-Q zümrüd 300 Lipopolisakkarid Gel Ləkə DəstiTermofisher <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"P20495","term_id":"138373","term_text":"P20495">> P20495
      Proteacease �, EDTA pulsuzG Biosciences786�
      Proteinaz K, Molekulyar Biologiya DərəcəsiNew England BiolabsP8107S
      Natrium hidroksid 㺙,99%VWRAA45780�
      Sorval RC 6 Plus sentrifuqaThermoFisher Scientific36-101-0816
      saxarozaMilliporeSigmaSX1075𠄳
      SW 41 Ti yelləncək çarxıBeckman Coulter Həyat Elmləri331362
      Tris(hidroksimetil)aminometan (TRIS, Trometamol) �,9% (qurudulmuş əsas), ultra saf Bioreagent Molekulyar biologiya dərəcəsi, J.T. çörəkçiVWRJT4109𠄶
      Tip 45 Ti Sabit Bucaqlı Titan RotorBeckman Coulter Həyat Elmləri339160
      Ultra şəffaf boru, 14 × 89mmBeckman Coulter Həyat Elmləri344059
      Vortex-Genie 2VWR102091�

      1.10. Proteaz inhibitoru kokteyl (reagentlər cədvəlinə baxın). 4 ºC-də saxlayın.

      1.11. Aşağı sıxlıqlı izopiknik saxaroza qradiyenti məhlulu (20% saxaroza, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Məhlul 100 mL): 20 q saxaroza çəkin və 200 ml-lik silindrə köçürün. 100 μL 1 M Tris Buffer pH 7,5 və 200 μL 0,5 M EDTA pH 8 əlavə edin. Son həcmi ultra saf H ilə 100 ml-ə tənzimləyin.2O. Otaq temperaturunda saxlayın.

      1.12. Orta sıxlıqlı izopiknik saxaroza qradiyenti məhlulu (53 % w/v saxaroza, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Məhlul 100 mL): 53 q saxaroza çəkin və 200 mL-lik dərəcə silindrinə köçürün. 100 μL 1 M Tris Buffer pH 7,5 və 200 μL 0,5 M EDTA pH 8 əlavə edin. Son həcmi ultra saf H ilə 100 ml-ə tənzimləyin.2O. Otaq temperaturunda saxlayın.

      QEYD: saxarozanın yüksək faizinə görə dəqiqliyi təmin etmək üçün bu məhlulun dərəcə silindrdə hazırlanması çox vacibdir. Maqnit qarışdırma çubuğu əlavə edin və saxaroza məhlulda tamamilə həll olunana qədər qarışdırın. Bu proses bir neçə saat çəkə bilər.

      1.13. Yüksək sıxlıqlı izopiknik saxaroza qradiyenti məhlulu (73 % w/v saxaroza, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5 Məhlul 100 mL): 73 q saxaroza çəkin və 200 mL-lik dərəcə silindrinə köçürün. 100 μL 1 M Tris Buffer pH 7,5 və 200 μL 0,5 M EDTA pH 8 əlavə edin. Son həcmi ultra saf H ilə 100 ml-ə tənzimləyin.2O. Otaq temperaturunda saxlayın.

      Qeyd: saxarozanın yüksək faizinə görə dəqiqliyi təmin etmək üçün bu məhlulun dərəcə silindrdə hazırlanması çox vacibdir. Maqnit qarışdırma çubuğu əlavə edin və saxaroza tamamilə həll olunana qədər qarışdırın. Bu proses bir neçə saat çəkə bilər.

      1.14. İzolyasiya edilmiş membran saxlama tamponu (10 mM Tris Bufer pH 7,5 1 L): 1 L kolbaya 1 mL 1 M Tris Buffer pH 7.5 əlavə edin və son həcmi ultra saf H ilə 1 L-ə tənzimləyin.2O.

      1.15 β-Nikotinamid adenin dinukleotid (NADH) (10 mq/ml məhlul). 10 mq resuspend NADH ultra təmiz H2O. Həftəlik təzə ehtiyatlar hazırlayın. � ଌ-də saxlayın.

      1.16 Fenol məhlulu. Molekulyar biologiya üçün 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA ilə balanslaşdırılmışdır (reagentlər cədvəlinə baxın). Məhlulu 4 ºC-də saxlayın.

      1.17 Pro-Q ™ Emerald 300 Lipopolisaxarid Gel Ləkə Dəsti (reagentlər cədvəlinə baxın).

      1.18. Bradford reagenti (reagentlər cədvəlinə baxın)

      Qeyd: Davamlı nəticələri təmin etmək üçün bütün məhlullar və media analizin həyata keçirildiyi həftə ərzində hazırlanmalıdır.

      2. MEMBRAN EKSTRAKSİYA ÜÇÜN BAKTERİYALARIN HAZIRLANMASI

      2.1. Dondurulmuş qliserol ehtiyatlarından bakteriyaları təzə agar plitələrinə çəkin. Koloniyalar yarandıqdan sonra plitələri 4 ºC-də saxlayın. Bulyon mühiti ilə doldurulmuş 5 mL-lik bir boruya tək bir koloniya aşılayın və bir gecədə istədiyiniz kimi bakteriyaları mədəniyyət edin.

      2.2. Gecədə bakteriya mədəniyyətini 1 L üstünlük verilən bulyon mühitinə geri sulandırın və istədiyiniz optik sıxlığa nail olunana qədər bakteriyaları yetişdirin.

      Qeyd: Tək bakteriya koloniyasının 1 L bulyon mühitinə aşılanması böyümə fenotiplərini boğmağa meylli mutant genotiplər üçün tövsiyə olunur, lakin bəzi qram-mənfi bakteriyalar sadəcə olaraq digərlərindən daha yavaş inkişaf edir. Tək koloniya peyvəndi ilə kifayət qədər mədəniyyət sıxlığına nail olmaq mümkün deyilsə, bir gecədə mədəniyyətin 1 L mediada seyreltilməsi böyüməni sinxronlaşdırmaq üçün bir strategiyadır. Bakterial-membran tərkibi mədəniyyətin böyümə fazasından asılı olaraq dəyişir (loqarifmik və stasionar faza) 13 . Bakteriya kulturları üçün optik sıxlığın dəyişməsini zamandan asılı olaraq ölçən böyümə əyriləri kultura sıxlığını böyümə fazası ilə əlaqələndirmək üçün bütün ştammlarla yerinə yetirilməlidir.

      2.3. Bulyon mədəniyyətləri olan kolbaları buz üzərinə qoyun. 600 nm-də optik sıxlığı oxuyun (OD600) və 6,0 ilə 8,0 arasında 11 bakterial koloniya əmələ gətirən vahidə (cfu) ekvivalent olan mədəniyyətin həcmini hesablayın. üçün S. Typhimurium, bu, OD-də 1 L mədəniyyətə uyğundur600 OD-dən bəri 0,6𠄰,8 arasında600 1,0 təxminən 1,0휐 9 cfu/ml-ə bərabərdir. Bu həcmi bir sentrifuqa borusuna əlavə edin və qalan mədəniyyətlərin istifadə olunana qədər buz üzərində qalmasını təmin edin.

      2.4. Bakteriyaları 10 dəqiqə sabit bucaqlı yüksək sürətli sentrifuqada 4 ºC-də 7 000 º201310 000 º q-da sentrifuqa edərək pellet edin.

      Qeyd: Sentrifuqaları əvvəlcədən soyudun və aşağı temperaturda saxlayın. Bütün prosedur zamanı nümunələri buz üzərində saxlayın.

      2.5 Supernatantı diqqətlə süzün və atın.

      Qeyd: Membran fraksiyaları dərhal çıxarılmayacaqsa, qranul dondurula və/və ya º221280 ºC-də saxlanıla bilər.Bununla belə, hüceyrələrin yığıldığı gün birbaşa plazmolizlə davam etmək tövsiyə olunur və xüsusilə enterobakter olmayan növlər üçün tövsiyə olunur.

      3. XARİCİ MEMBRANIN DISSOSİASYASI VƏ PLAZMOLİZ.

      3.1 Hüceyrə qranullarını əvvəllər º221280ºC-də saxlayıbsa, buz üzərində əridin və prosedurun qalan hissəsi üçün nümunələri buzda saxlayın. 12,5 mL bufer A-da sentrifuqa borusu daxilində hər bir hüceyrə qranulunu yenidən dayandırın. Hüceyrələrin dayandırılmasına maqnit qarışdırıcı çubuğu əlavə edin.

      3.2. Hər bir hüceyrə resuspenziyasına 180 ml 10 mq/ml lizozim əlavə edin (son konsentrasiya 144 ½ cq/mL). Nümunələri 2 dəqiqə qarışdıraraq buz üzərində saxlayın.

      3.3. Hər hüceyrə resuspenziyasına 12,5 mL 1,5 mM EDTA məhlulu əlavə edin və əlavə 7 dəqiqə ərzində buz üzərində qarışdırmağa davam edin.

      3.4. Süspansiyonu 50 ml-lik konusvari boruya tökün və 9000°C-də 4°C-də 10 dəqiqə sentrifuqa edin.

      3.5. Supernatantları biotəhlükəli tullantı konteynerinə atın və qranulları buzda saxlayın.

      3.6. Hüceyrə peletinə 25 mL bufer B əlavə edin

      3.7. 55 μl 1 M MgCl əlavə edin2, 1 μl RNase/DNase nuklease reagent (homogenləşmədən əvvəl plazmoliz keçirən bakteriyalarla bağlı özlülük problemlərindən qaçmaq üçün) və 1 μl proteaz inhibitor kokteyli hüceyrə qranulunun üstündə oturan B buferinin həcminə

      3.8. Bufer B qarışığında pelleti yenidən dayandırın. Homojen bir məhlul müşahidə olunana qədər güclü şəkildə pipetlə və burulğan edin.

      Qeyd: Bu protokolun 4-cü addımına keçməzdən əvvəl homojen bir həllin olması çox vacibdir. Yenidən dayandırılmış hüceyrələr görünüş və tutarlılığa bənzər bir yapışqan tort xəmirinə sahib olmalıdır.

      3.9. Hər nümunəni 15 saniyə burulğan edin. Qranulları buzda saxlayın və 4-cü addıma keçin.

      4. TƏZİQLİ HOMOGENİZASYON VƏ LİZİS

      Qeyd: Lizis üçün bir neçə üsuldan istifadə edilə bilər. İstilik əmələ gəlməsi səbəbindən sonikasiya ideal deyil. Osmotik lizis əldə edilə bilər, lakin çox vaxt səmərəsizdir. Buna görə də yüksək təzyiqli lizisi tövsiyə edirik. Yüksək təzyiqli lizis müxtəlif alətlərdən istifadə etməklə əldə edilə bilər. Biz homogenləşdirmə maşınlarını təklif edirik, məsələn, French Press və ya Emusliflex. Biz yüksək osmolyar saxaroza məhlullarına reaksiyası fərqli olan bir çox qram-mənfi bakteriyalarla işləyirik. Yüksək təzyiqli homogenləşdirmə addımı səmərəliliyi, təkrar istehsal qabiliyyətini və məhsuldarlığı artırır.

      4.1 French Press hücrəsini 4 ºC-də əvvəlcədən soyudun və ya Emulsiflex maşınındakı metal rulonu buz üzərinə daxil edin.

      4.2 Nümunəni Fransız təzyiq hüceyrəsinə və ya Emulsiflex nümunə silindrinə tökün və hüceyrəni istədiyiniz homogenləşdirmə təzyiqi altına gətirin (Fransız Pressdən istifadə edərkən 10,000 psi və ya Emulsiflex istifadə edərkən 20,000 psi adekvat olmalıdır).

      4.3 Fransız mətbuatından istifadə edərkən təzyiqi qoruyarkən çıxış axını sürətini saniyədə təxminən bir damlaya tənzimləyin.

      4.4 Nümunələri buz üzərində saxlayarkən hüceyrə lizatını 50 mL konusvari borularda toplayın.

      4.5 Tam lizisə nail olmaq üçün 4.2𠄴.4 addımlarını üç-beş dəfə təkrarlayın, adətən nümunənin şəffaflığının tədricən artması ilə göstərilir.

      Qeyd: Nümunə kamerası yuyulmalı və nümunələr arasında Bufer B ilə tarazlaşdırılmalıdır.

      4.6 Lizis hüceyrələrini buzda saxlayın.

      5. ÜMUMİ MEMBRANIN FRAKSİYASİ

      5.1. Lizis olunmuş bakteriya nümunələrini 6169 º7 q-da 10 dəqiqə 4ºC-də santrifüj edin ki, bütöv qalan hüceyrə materialını qranullaşdırın. (məsələn, parçalanmamış bakteriya hüceyrələri)

      5.2. Artıq homojenləşdirilmiş membranları ehtiva edən supernatantın qalan hissəsini ultrasentrifuqa üçün polikarbonat şüşəyə paylayın.

      DİQQƏT: Lazım gələrsə, hüceyrə nümunələri B buferi ilə seyreltilməklə balanslaşdırıla bilər.

      5.3. Hüceyrə lizatlarını 184,500 º7 q-da ən azı 1 saat, 4 ºC-də ultrasentrifuqa edin. Bu addım membranların keyfiyyətinə təsir etmədən bir gecədə həyata keçirilə bilər.

      5.4. Ultrasentrifuqa borusunda mövcud olan qalan supernatantı atın və membran qranullarını buzda saxlayın. (şək. 1)

      5.5 Membran qranullarını 1 mL aşağı sıxlıqlı izopiknik-saxaroza qradiyenti məhlulunda şüşə-dounce homojenizatordan istifadə edərək yenidən dayandırın. Nümunə homogenatı 1,5 mL mikrosentrifuqa borusuna köçürmək və buz üzərində saxlamaq üçün şüşə-Paster pipetindən istifadə edin.

      QEYD: Yalnız ümumi membran tərkibinin təhlili istənirsə, 1 mL təcrid olunmuş membran saxlama buferi üçün 1 mL aşağı sıxlıqlı izopiknik-saxaroza gradient məhlulu ilə əvəz edin. 5.5-ci addım yalnız ümumi bakterial membran nümunələri tələb olunarsa, izolyasiyanın son nöqtəsidir. Nümunələri daha aşağı axın təhlili tələb olunana qədər � ଌ-də saxlayın.

      6. İKİLİ MEMBRANLARI AYIRMAK ÜÇÜN SıXLIQ QRADIENT ULTRASENTRƏFQQASIYA

      6.1 Sallanan vedrə rotoru və ultrasentrifuqa üçün nəzərdə tutulmuş müvafiq sayda 13 ml polipropilen və ya ultra şəffaf üstü açıq boruları toplayın.

      6.2. Borunu bir az əyilmiş vəziyyətdə saxlayın və saxaroza məhlullarını daha yüksək sıxlıqdan aşağı sıxlığa yavaş-yavaş əlavə edərək saxaroza gradientini aşağıdakı ardıcıllıqla hazırlayın:

      - 2 ml 73% sukroz, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5

      - 4 mL 53% w/v saxaroza, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5

      - Sonra, 20% w/v saxaroza məhlulunda yenidən suspenziya edilmiş ümumi membran fraksiyasını (1 ml) əlavə edin (addım 5.5). Membran fraksiyasını onun altında olan saxaroza məhlulu ilə qarışdırmaqdan çəkinin. Bu təbəqələrin hər biri arasında bölmələr görünməlidir. Nəhayət, borunu aşağı sıxlıqlı izopiknik-saxaroza qradiyenti məhlulu (təxminən 6 ml) ilə doldurun. Polipropilen və ultra şəffaf üstü açıq borular boru dəstəyi üçün mümkün qədər dolu doldurulmalıdır (borunun yuxarı hissəsindən 2 və ya 3 mm).

      Üçün tənzimləmə Acinetobacter baumannii 17978

      Tənzimlənmiş saxaroza gradienti müxtəlif bakterial nümunələrlə istifadə üçün uyğunlaşdırıla bilər. üçün A. baumannii, aşağıdakı saxaroza gradient membranların daha tam ayrılmasını təmin etdi (Şəkil 2).

      - 2 mL 73% w/v saxaroza, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5

      - 4 ml 45% saxaroza, 1 mM EDTA, 1 mM Tris pH 7.5

      - Sonra, 20% w/v saxaroza məhlulunda yenidən suspenziya edilmiş ümumi membran fraksiyasını (1 ml) əlavə edin (addım 5.5). Membran fraksiyasını onun altında olan saxaroza məhlulu ilə qarışdırmaqdan çəkinin. Bu təbəqələrin hər biri arasında bölmələr görünməlidir. Nəhayət, borunu aşağı sıxlıqlı izopiknik-saxaroza gradient məhlulu (təxminən 6 ml) ilə doldurun. Polipropilen və ultra şəffaf üstü açıq borular boru dəstəyi üçün mümkün qədər dolu doldurulmalıdır (borunun yuxarı hissəsindən 2 və ya 3 mm).

      6.3. Bir gecədə 288.000 º7 q və 4 ºC-də yellənən vedrə rotorundan istifadə edərək nümunələri ultrasentrifuqa edin.

      Qeyd: Əvvəlki addımlarda istifadə olunan həcmlər üçün 16 saat sentrifuqasiya müddətini < 23 saat tövsiyə edirik.

      SAKROZANIN AYIRILMASI ÜÇÜN MEMBRANLARIN YIYILMASI VƏ YUYULMASI

      6.4. P1000 pipet ucunun ucunu nöqtədən təxminən 5 mm kəsin. Pipetdən istifadə edərək yuxarı-qəhvəyi IM qatını çıxarın. IM fraksiyasını ultrasentrifuqa üçün polikarbonat şüşəyə köçürün.

      6.5. Aşağı ağ OM-nin IM fraksiya ilə çirklənməməsini təmin etmək üçün təxminən 2 ml saxaroza məhlulunu 53% interfeysin üstündə saxlayın. OM fraksiya üçün 6.4-cü addımdan pipetləmə prosedurunu təkrarlayın (şək. 1).

      Qeyd: membranlar həmçinin iynədən istifadə edərək alt hissədəki sentrifuqa borularını deşməklə və membranları fraksiya şəklində toplamaqla da toplana bilər.

      6.6. Ultrasentrifuqa borusunun qalan boşluğunu təcrid olunmuş membranlı saxlama buferi ilə doldurun və inversiya və ya pipetləmə yolu ilə qarışdırın. Nümunələri buz üzərində saxlayın.

      6.7. İndi yuyulmuş və təcrid olunmuş membranları 184500 º7 q-da 1 saat və 4 ºC-də ultrasentrifuqa ilə toplayın.

      6.8. Supernatantı atın və membranları homogenləşdirmə yolu ilə yenidən dayandırın. 500 � μl yaddaş buferi əlavə edin. Nümunələri 2 ml mikrosentrifuqa borularında toplayın.

      6.9. Bakterial membran nümunələrini � ଌ-də saxlayın.

      7. İKİLİTƏLƏRİN AYRILMASINI TƏSDİQ ETMƏK

      Qeyd: İkiqatlıların natamam ayrılması texniki səhv və ya bəzi növlərin unikal hüceyrə zərfinin tərkibinə görə baş verə bilər. Ayrılmanı təsdiqləmək üçün iki qatlı təbəqələr arasında çarpaz çirklənmə dərəcəsini ölçmək üçün iki müstəqil analizdən istifadə etməyi məsləhət görürük. Birinci analiz yalnız İM-də mövcud olan NADH dehidrogenazanın enzimatik aktivliyini aşkar edir. İkinci analiz əsasən OM-də mövcud olan LOS və ya LPS-nin mövcudluğunu aşkar edir.

      OM-lərin IM-lərdən təcrid olunduğunu təsdiqləmək

      NADH oksidləşmə analizi

      7.1 Bradford protein analizindən istifadə edərək hər bir təcrid olunmuş membran fraksiyasında protein konsentrasiyasını ölçün.

      7.2. 50 və 500 mcg proteinə uyğun gələn nümunənin həcmini 2 ml boş mikrosentrifuqa borusuna əlavə edin. Konsentrasiya növdən asılı olaraq dəyişəcək, lakin Enterobacteriaceae üçün adətən 50 º003bcg kifayətdir. Ümumi həcmi 990 μl əldə etmək üçün müvafiq 10 mM Tris-bufer həcmini əlavə edin. Məzmunu spektrofotometriya üçün kyuvetə köçürün.

      7.3. Nümunəyə 10 mq/ml NADH məhlulundan 10 ºL əlavə edin və 340 nm-də ilkin udma qabiliyyətini ölçün.

      7.4. 5 dəqiqə ərzində hər 30 saniyədən bir absorbansın ölçülməsinə davam edin.

      7.5. Məlumatları tərtib edin və hər bir membran fraksiyasına görə Absorbsiya (y oxu) və Zaman dəyişikliyi (x oxu) dəyişikliyinin qrafikini çəkin (şək. 3).

      IM-lərin OM-lərdən təcrid olunduğunu təsdiqləmək

      LPS/LOS çıxarılması və geldə vizuallaşdırılması.

      7.5. Boş 2 ml mikrosentrifuqa borusuna 50 ilə 500 μg proteinə uyğun gələn nümunənin həcmini əlavə edin. Konsentrasiya bakterial növdən asılı olaraq dəyişəcək, lakin Enterobacteriaceae üçün adətən 50 º003bcg kifayətdir. Bundan sonra sulu faza adlandırılacaq fosfat tamponlu şoran məhlulu ilə 100 μL son həcmə qədər doldurun.

      7.7. Sulu fazaya 5 μL Proteinase K (ehtiyat 800 U/ml) əlavə edin və gecə ərzində 59°C-də inkubasiya edin.

      7.8. 10 ml trislə doymuş fenol alikotunu 68°C-də 10 dəqiqə qızdırın.

      7.9. Proteinaz K ilə emal edilmiş sulu faza nümunələrini aşağı çevirin və sulu faza ilə 1:1 nisbətində Tris ilə doymuş fenol əlavə edin, güclü burulğan edin və 68°C-də 10 dəqiqə inkubasiya edin.

      7.10. İndi südlü ağ nümunələri 68ºC-dən buzlu su banyosuna köçürün və 10 dəqiqə inkubasiya edin.

      7.11. Nümunələri 2100 º7 q temperaturda 10 dəqiqə 4ºC-də sentrifuqa edin.

      7.12. Üst sulu fazanı yeni bir boruya köçürün və nümunə dərhal istifadə olunmayacaqsa, borunu º221220ºC-də saxlayın.

      7.13. Nümunələri SDS yükləmə buferində seyreltin və 4% Tris-glisin qradiyenti gelinin quyularını yükləyin.

      7.14. Elektroforez 45 dəqiqə və ya boya qabığı gelin dibində olana qədər.

      7.15. İstehsalçının göstərişlərinə əsasən PRO-Q Emerald 300 LPS boyama dəstindən istifadə edərək geli rəngləyin.


      Bakteriyalara zərər vermədən hüceyrə qranulunu necə yenidən dayandıra bilərəm? - Biologiya

      Transformasiya etmək üçün iki üsul var E. coli plazmid DNT ilə hüceyrələr - kimyəvi çevrilmə və elektroporasiya. Kimyəvi transformasiya üçün hüceyrələr orta log fazasına qədər böyüdülür, yığılır və CaCl kimi iki valentli kationlarla müalicə olunur.2. Belə bir şəkildə müalicə edilən hüceyrələrin səlahiyyətli olduğu deyilir. Hüceyrələri kimyəvi olaraq dəyişdirmək üçün səlahiyyətli hüceyrələr buz üzərində DNT ilə qarışdırılır, sonra qısa bir istilik şoku verilir. Sonra hüceyrələr zəngin mühitlə inkubasiya edilir və örtükdən əvvəl 30-60 dəqiqə ərzində antibiotikə davamlı geni ifadə etməyə icazə verilir. Elektroporasiya üçün hüceyrələr də orta log fazasına qədər böyüdülür, lakin sonra bütün duzları aradan qaldırmaq üçün su ilə bolca yuyulur. Adətən, qliserin suya son konsentrasiyası 10% olana qədər əlavə edilir ki, hüceyrələr dondurulmuş halda saxlanılsın və gələcək təcrübələr üçün saxlanılsın. DNT-ni hüceyrələrə elektroporasiya etmək üçün yuyulur E. coli transformasiya ediləcək DNT ilə qarışdırılır və sonra elektrodları olan plastik küvetə pipetlənir. Hüceyrələrə təqribən 2400 volt/sm gücündə qısa bir elektrik impulsu tətbiq edilir və bu, membranda DNT-nin daxil olduğu kiçik deşiklərə səbəb olur. Hüceyrələr daha sonra örtükdən əvvəl yuxarıdakı kimi bulyon ilə inkubasiya edilir.

      Kimyəvi transformasiya üçün DNT-ni əvvəlcədən müalicə etməyə ehtiyac yoxdur. Elektroporasiya üçün DNT bütün duzlardan azad olmalıdır, ona görə də ligasiyalar istifadə edilməzdən əvvəl əvvəlcə spirtlə çökdürülür.

      Eksperimental Dizayn :

      Transformasiyanın effektivliyini müəyyən etmək üçün 1 ng kəsilməmiş plazmid DNT-dən istifadə etməklə müsbət nəzarət transformasiyası aparılmalıdır, məs. pUC19. Transformasiyanın effektivliyi daxil olan DNT-nin transformantların/&mug sayı kimi hesablanır. Əlavə DNT olmayan hüceyrələri ehtiva edən mənfi nəzarət də daxil edilməlidir.

      Yalnız hüceyrələrlə (əlavə DNT yoxdur) mənfi nəzarət də daxil edilməlidir.

      Əksər klonlama proqramları üçün biz DH5&alpha host hüceyrələrindən istifadə edirik. Bu hüceyrələr uyğun gəlir lacZ mavi/ağ seçim prosedurları, asanlıqla transformasiya olunur və yaxşı keyfiyyətli plazmid DNT transformantlardan bərpa edilə bilər. Diqqətəlayiq bir istisna, T7 polimerazının nəzarəti altında rekombinant genləri ehtiva edən plazmid konstruksiyaları ilə transformasiya zamanıdır. Bu konstruksiyalar adətən klonlaşdırma mərhələsi üçün DH5&alfa-ya çevrilir, lakin rekombinant zülalın ifadəsi üçün fərqli bakteriya ştamına, BL21(DE3) çevrilməlidir (BL21 suşları T7 polimerazının ifadəsi üçün geni daşıyır).

      Elektroporasiya E. coli:

      • Steril sentrifuqa şüşələri &ndash 250 ml GSA rotoru üçün
      • SOB orta
      • E. coli DH5&alpha kimi host ştammı
      • 4°C-yə qədər soyudulmuş DB (10% yenidən distillə edilmiş qliserin, 90% distillə edilmiş su, v/v) hər 250 ml kultura üçün 500 ml WB lazımdır.
      • tRNA (5-10 & mikroq/ml &ndash yağıntının səmərəliliyini artırmaq üçün kütlə daşıyıcısı kimi istifadə olunur)
      • 5 M ammonium asetat
      • 100% etanol
      • 70% etanol
      • 0,5X TE və ya EB (10 mM Tris, pH 8,3)
      • SOC mühiti
      • transformasiya lövhələri

      I. Hazırlanması E. coli elektroporasiya üçün hüceyrələr.

      1. 50 ml steril konusvari boruda 5 ml SOB (maqneziumsuz) mühitini aşılamaq üçün təzə DH5&alpha koloniyasından (və ya digər müvafiq host ştamından) istifadə edin. 37°C-də bir gecədə güclü aerasiya ilə hüceyrələri böyüdün.

      2. 2,5 ml hüceyrəni 1 litrlik kolbada 250 ml SOB-da (maqneziumsuz) seyreltin. Hüceyrələr OD səviyyəsinə çatana qədər 37°C-də güclü aerasiya ilə 2-3 saat böyüyün.550 = 0.8.

      3. Steril sentrifuqa şüşələrində 10 dəqiqə ərzində GSA rotorunda 5000 RPM-də sentrifuqasiya yolu ilə hüceyrələri toplayın. (Avtoklavlanmış şüşələrdən istifadə etdiyinizə əmin olun!).

      4. Hüceyrə qranulunu 250 ml buz kimi soyuq WB-də aşağıdakı kimi yuyun. Birincisi, hüceyrə qranul pipetinə yuxarı və aşağı az miqdarda WB əlavə edin və ya hüceyrələr yenidən dayandırılana qədər yumşaq bir şəkildə burulğan edin. Sonra sentrifuqa şüşəsini buz kimi soyuq WB ilə doldurun və yumşaq qarışdırın. QEYD - bu nöqtədə əlavə olunan DB-nin mütləq həcmi vacib deyil.

      5. Hüceyrə suspenziyasını 5000 rpm-də 15 dəqiqə sentrifuqa edin və rotor dayanan kimi supernatantı diqqətlə tökün. WB-də yuyulan hüceyrələr yaxşı qranullanmır. Supernatant bulanıq olarsa, sentrifuqalama vaxtını artırın.

      6. Yuxarıda təsvir edilən eyni texnikadan istifadə edərək 250 ml steril buz-soyuq WB-də yenidən suspenziya etməklə hüceyrə qranulunu ikinci dəfə yuyun. Hüceyrə süspansiyonunu 5000 RPM-də 15 dəqiqə sentrifuqa edin.

      7. Şüşənin dibində az miqdarda WB qalaraq supernatantı yumşaq bir şəkildə tökün. Hüceyrə pelletini DB-də yenidən dayandırın - əlavə WB əlavə etmək lazım deyil &ndash və son həcm təxminən 1 ml olmalıdır. Hüceyrələr dərhal istifadə edilə bilər və ya quru buz-etanol vannası istifadə edərək, dondurucu flakonlarda 0,2 ml alikotlarda dondurula bilər. Dondurulmuş hüceyrələri -70°C-də saxlayın.

      II. Elektroporasiya üçün DNT-nin hazırlanması

      Elektroporasiya üçün DNT çox aşağı ion gücünə və yüksək müqavimətə malik olmalıdır. DNT ya seyreltmə, çöküntü və ya dializ yolu ilə təmizlənə bilər.

      • Təmizlənmiş plazmid DNT-nin çevrilməsi üçün DNT-ni 10 mM Tris pH 8-8.3-də təxminən 1-50 ng/mikrola seyreltin (TE istifadə etməyin). Transformasiya üçün 1 &mikrodan istifadə edin.
      • Bağlama reaksiyaları üçün aşağıdakı prosedurdan istifadə edin.

      DNT-nin yağışla təmizlənməsi:

      1. 1,5 ml boruda 20 ml liqasiya reaksiyasına 5-10 mq tRNT əlavə edin. 22 ml 5M ammonium asetat əlavə edin (və ya tRNT əlavə edilmiş bərabər həcmdə ligasiya reaksiyası). Yaxşı qarışdır.

      2. 100 &mul mütləq etanol (və ya 2,5 həcmli bağlama reaksiyası, tRNT və duz) əlavə edin. Buz 15 dəq.

      3. 4°C temperaturda 15 dəqiqə >12,000 x g-də sentrifuqa edin. Supernatantı diqqətlə süzün.

      4. Peleti 1 ml 70% etanol ilə yuyun. Otaq temperaturunda 15 dəqiqə >12,000 x g-də sentrifuqa edin. Üst qatını çıxarın.

      5. Qranulları hava ilə qurutun (sürətli vakansiya yaxşıdır, lakin həddindən artıq qurutma).

      6. DNT-ni EB buferində (10 mM Tris-HCl, pH 8.3) və ya 0.5X TE buferində [5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA (pH 7.5)] 10 ng/ul DNT konsentrasiyasına qədər yenidən dayandırın. Bağlama reaksiyaları üçün 10 mikroroldə yenidən suspenziya etmək rahatdır. 20 ml hüceyrə suspenziyasının çevrilməsi üçün 1 ml istifadə edin.

      III. Elektroporasiya.

      1. Mikro sentrifuqa borularının lazımi sayını qeyd edin. Lazım olan sayda Mikro-elektroporasiya kameralarını buzun üzərinə qoyun. Kamera Seyfinin temperatur nəzarət bölməsini doldurun

      250 ml buzlu su məhlulu və Kamera Rafını Kamera Seyfinə qoyun.

      2. Bölmə I-də olduğu kimi hazırlanmış hüceyrələrin bir hissəsini əridin və 20 &mikro l hüceyrələrin alikotunu buz üzərində lazımi sayda mikrofuge borularına qədər əridin. Bölmə II-də olduğu kimi hazırlanmış 1 &mikro l DNT (və ya bağlama reaksiyası) əlavə edin.

      3. Mikro-elektroporasiya kamerasında mikro pipetdən istifadə edərək, hüceyrə-DNT qarışığının 20 &mikro l-ni patronlar arasında pipetka ilə çəkin. Hüceyrələrin damlacıqlarında hava qabarcığı buraxmayın, qabarcıq təzyiqi qövslərə və nümunənin itməsinə səbəb ola bilər. Kameranı kamera rafındakı yuvaya yerləşdirin və onun mövqeyini qeyd edin. Birdən çox nümunə impulslanacaqsa, prosesi təkrarlayın. Kamera Rafına eyni vaxtda 4-ə qədər nümunə yerləşdirilə bilər. Nümunənin təsadüfən patronlar arasından yerdəyişməsinin qarşısını almaq üçün kameraları yumşaq bir şəkildə idarə edin.

      4. Kameranın seyfinin qapağını bağlayın və onu çəkmə qapağı ilə bərkidin.

      5. Pulse kabelini Kamera seyfinin sağ tərəfinə qoşun.

      6. Elektrik impulsunu istədiyiniz Mikro-Elektroporasiya Kamerasına yönəltmək üçün Kamera Safesinin üstündəki kamera seçim düyməsini çevirin.

      7. Gərginlik Gücləndiricisindəki müqaviməti 4 k&Omega-a təyin edin, Nəbz İdarəetmə blokunu LOW və 330 & microF ikiqat yoxlama bağlantılarına təyin edin.

      8. Nəbz İdarəetmə qurğusunda CHARGE ARM açarını CHARGE (YÜKLƏMƏ) vəziyyətinə təyin edərək və sonra gərginlik oxunuşu istənilən boşalma gərginliyindən 5-10 volt yüksək olana qədər YUXARI gərginliyə nəzarət düyməsini basaraq Pulse İdarəetmə qurğusunu doldurun. üçün E. coli, standart şərtlər 2,4 kv, yəni Nəbz İdarəetmə qurğusunu 405 volta təyin etmək deməkdir (400 volt istənilən boşalma gərginliyi + 5). Gərginlik gücləndiricisi voltları gücləndirir

      6 qat, ümumi boşalma gərginliyi 2400 volt və ya 2,4 kv. Nümunəyə çatdırılan faktiki pik gərginlik Voltage Booster sayğacında göstəriləcək sonra nəbz verilir.

      9. CHARGE/ARM açarını ARM vəziyyətinə qoyun. Yaşıl işıq cihazın DC impulsunu verməyə hazır olduğunu göstərir. Nəbz boşalması TRIGGER düyməsini sıxın və 1 saniyə saxlayın.

      QEYD: Pulse Nəzarət bölməsindəki DC gərginlik göstəricisi impuls verildikdən sonra <10 volt oxumalıdır. Əgər belə deyilsə, AŞAĞI düyməsini istifadə edərək kondansatörü boşaldın.

      10.Əlavə nümunələr üçün kamera seçim düyməsini növbəti istədiyiniz mövqeyə çevirin və bütün nümunələr impulslanana qədər 8 və 9-cu addımları təkrarlayın.

      11. Ampisilin seçilməsi üçün nümunələri 2 ml SOC mühitinə əkmək və antibiotik geninin ifadəsini təmin etmək üçün 30 dəqiqə (amper üçün), 60 dəqiqə (Kan üçün) silkələyin. Müvafiq antibiotik və ya skrininq reagenti (məsələn, 100 & mikroq/ml ampisilin və/və ya 40 ml 20 mq/ml X-Gal, XP və 40 ml 100 mM IPTG) ilə LB mühitində boşqab hüceyrələri.

      Bu veb-səhifə Julie B. Wolf, UMBC tərəfindən idarə olunur
      Sonuncu dəfə 3/2/2010 tarixində yenilənib

      sənaye və biotibbi elmlərdə karyera ilə maraqlanan tələbələr üçün nəzərdə tutulmuşdur.


      Videoya baxın: Bakteriyalar (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Vik

    Düşünürəm ki, səhvlər edilir. Bunu sübut edə bilərəm. Mənə baş nazirlə yaz, müzakirə edin.

  2. Vudolar

    hey! Sape mübadiləsi ilə tanışsınız?

  3. Corley

    Bloq sadəcə superdir, onu tanıdığım hər kəsə tövsiyə edirəm!

  4. Norberto

    Nə sevimli bir ifadə

  5. Derrold

    İçində bir şey var. Bir izahat üçün təşəkkür edirəm, daha asan, daha yaxşıdır ...

  6. Ardaleah

    Təbrik edirəm, başqa ideyanı ziyarət etdiniz



Mesaj yazmaq