Məlumat

Virusların lipid zərfini hədəf alan dərmanlar varmı?

Virusların lipid zərfini hədəf alan dərmanlar varmı?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bir çox dərman unikal viral fermentlərin ardınca gedir, lakin onların lipidlərini hədəf alan varmı? Viral membranlar əlbəttə ki, ana membrana bənzəyir, lakin fərqli tərkibə malik ola bilər və fərqli əyrilik və zülal tərkibinə malikdir. Hər kəs onları məhdudlaşdırmaq üçün virusların lipid zərfinə zərbə vurmağa çalışan tədqiqatlardan və ya mövcud dərmanlardan xəbərdardırmı?

Məsələn, lipid membranını hədəf alan inkişaf etmiş molekullar var. Bu məsamə əmələ gətirən toksinlərin bir alt qrupu xolesteroldan asılıdır, buna görə də xolesterolda yüksək olan bir membranı aşağı bir membrana hədəfləyə bilər. Mən burada viral lipid membranının xüsusiyyətlərindən oxşar şəkildə istifadə edilə biləcəyini düşünməyə çalışıram.


Viral zərfdəki lipidlər onun parçalarından gəlir ana hüceyrə membranı. Buna görə də, bu lipidləri hədəf alan bir şeyin virusa xas olması ehtimalı azdır və canlı heyvanda istifadə üçün uyğun deyil.

Virusun səthlərdə olduğu mühitdə və buna bənzər şəkildə, sabun/yuyucu vasitələrdən istifadə edərək lipid zərfini hədəfə almaq olar, lakin siz onları daxildən götürmək istəməzsiniz.


Əgər zərfdəki zülallardan danışırsınızsa, bəli: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6259279/

Ancaq faktiki lipidlərdən danışırsınızsa, bunun mümkün olduğunu düşünmürəm: Birincisi, dərman molekulu lipidləri bağlamalıdır, eyni zamanda sahibinin lipidlərini bağlamamalıdır (onların yaxşı müəyyən edilmiş cibləri olmadığı üçün çətin görünür) İkincisi , hətta bir lipid molekulunu güclü şəkildə bağlayan bir dərman molekulu tapa bilsəniz belə, zülal molekullarından daha çox lipid molekulu var, buna görə də adi haldan daha çox dərman molekuluna ehtiyacınız olacaq (zülal hədəfləyən dərmanlar)


Qısa cavab: in vivo dərmanlar yoxdur; dezinfeksiyaedicilər üçün bəli. Əksər yuyucu vasitələr və həlledicilər lipid membranını parçalamaq (emulsiyalaşdırmaq) yolu ilə (həmçinin zülalları denaturasiya etməklə) ən azı qismən virusu təsirsiz hala gətirir.

Membranın hədəflənməsi in vivo çətindir, çünki o, ana hüceyrələrdən gəlir; mümkün dərmanların əksəriyyəti (məsələn, ilan zəhəri fosfolipazları) hər ikisinə bərabər təsir göstərər. Bununla belə, ev sahibi hüceyrə membranı, onu saxlayan fermentlərin (flippases) təsiri ilə güclü assimetrik tərkibə malikdir ("vərəq asimmetriyası"), əks halda daxili və xarici lipidlər zamanla tarazlaşmağa meyllidirlər. Bu, tanınma siqnalı kimi istifadə olunur və bəzi təbii birləşmələr, məsələn, lisenin kimi daxili-xarici membranları tanıyır. Çox güman ki, viral membran tarazlaşdırılıb və buna görə də lisenin kimi birləşmələr tərəfindən hədəf alına bilər (baxmayaraq ki, mən bu xətlər üzrə heç bir təcrübə və ya dərc edilmiş nəticələr tapa bilməmişəm).

Virusun lipid membranı haqqında çox ətraflı məlumat tapa bilmədim, ona görə də sizin sualınızı tapmazdan əvvəl burada bir qədər əlaqəli sual verdim: SARS-CoV-2-nin lipid membranı nədən ibarətdir?


Viral zərf

A viral zərf bir çox virus növlərinin ən xarici təbəqəsidir. [1] Ev sahibi hüceyrələr arasında səyahət edərkən genetik materialı həyat dövründə qoruyur. Bütün virusların zərfləri yoxdur.

Zərflər adətən ev sahibi hüceyrə membranlarının hissələrindən (fosfolipidlər və zülallar) əldə edilir, lakin bəzi viral qlikoproteinləri ehtiva edir. Onlar virusların ev sahibi immun sistemindən qaçmasına kömək edə bilər. Zərfin səthindəki qlikoproteinlər ev sahibinin membranındakı reseptor sahələrini müəyyən etməyə və onlara bağlanmağa xidmət edir. Daha sonra viral zərf ev sahibinin membranı ilə birləşərək kapsid və viral genomun ev sahibinə daxil olmasına və yoluxmasına imkan verir. [ sitat lazımdır ]

Bütün zərflənmiş virusların zərflə genom arasında başqa bir zülal təbəqəsi olan kapsid də var. [1]

Virusun qönçələndiyi hüceyrə tez-tez ölür və ya zəifləyir və uzun müddət daha çox viral hissəciklər buraxır. Bu virusların lipid ikiqatlı zərfi qurumaya, istiliyə və sabun və yuyucu vasitələr kimi amfifillərə nisbətən həssasdır, buna görə də bu virusları zərfsiz viruslara nisbətən sterilizasiya etmək daha asandır, ev sahibi mühitdən kənarda məhdud sağ qalır və adətən birbaşa anadan ötürülməlidir. ev sahibliyi etmək. Qapalı viruslar böyük uyğunlaşma qabiliyyətinə malikdir və immunitet sistemindən yayınmaq üçün qısa müddətdə dəyişə bilir. Qapalı viruslar davamlı infeksiyalara səbəb ola bilər. [ sitat lazımdır ]


Mikroorqanizmlərin təbiəti və patogenliyi

Joshua Fierer,. Jean-Claude Pechère, Yoluxucu Xəstəliklərdə (Dördüncü Nəşr), 2017

Zərf

Qapalı viruslar ikosahedral (məsələn, herpesviruslar, toqaviruslar) və ya spiral simmetriyanın (məsələn, qrip) nukleokapsidlərini ehtiva edir. Xarici zərf həm viral qlikoproteinlərin, həm də bəzi ana zülalların yerləşdiyi ana hüceyrə membranından əldə edilən lipid ikiqatlıdır. Viral matriks zülalları (M zülalları) zərflə assosiasiya olunur, kapsidi lipid iki qatına daxil edilmiş viral qlikoprotein(lər)lə əlaqələndirir. Səth qlikoproteinləri transmembran zülallardır ki, onlar da yağ turşusu hissələrinə birləşdirilə bilər və virionların hüceyrəyə bağlanmasında və nüfuz etməsində əsas rol oynayırlar.

Bəzi qlikoproteinlər həmçinin qrip virusu neyraminidaza kimi fermentativ aktivliyə malikdirlər ki, bu da yeni əmələ gələn virus hissəciklərinin ev sahibi hüceyrə membranından sərbəst buraxılması üçün vacibdir. Zülal strukturlarının yetişməsi və transkripsiya mərhələləri ana hüceyrədən azad edildikdən sonra baş verə bilər. Məsələn, insan immunçatışmazlığı virusunun retrovirusunun tipik konusvari nüvəsi buraxıldıqdan sonra viral proteazın virion daxilində nukleokapsidi yetişdirməsi nəticəsində əmələ gəlir. 10


Ən yaxşı anti-viral dərman: AMPK

Virusların çoxalmasını dayandıran və sağlamlıq müddətinizi uzatmaq üçün yeganə yan təsirini bilən bir dərmanınız olsaydı nə olardı? İstifadə edərdiniz? Əlbəttə ki, edərdin. Belə bir dərman bədəninizdəki hər hüceyrənin içərisindədir və yalnız aktivləşməyi gözləyir.

Bu “dərman” AMPK, metabolizminizin genetik əsas keçididir. AMPK əhəmiyyətli pəhriz nəzarəti altındadır və xüsusilə, Pro-Resolution Nutrition sistemindən istifadə etməklə aktivləşdirilə bilər.

AMPK orqanizmin çoxsaylı anti-viral müdafiələrində işləyir (1). Virusun hədəf toxumaya çatmasının qarşısını almaq üçün fiziki maneələri qorumaq üçün vacibdir (2-4). Eyni şəkildə, antikor yaratmaq üçün viral antigenləri adaptiv immun sisteminə təqdim etmək vacibdir (5,6). Bununla belə, onun ən mühüm rolu odur ki, virusun özünün çoxalmasının qarşısını ala bilsin ki, o, digər hüceyrələrə yoluxmasın (7-10). AMPK antiviral dərman kimi necə işləyir, mürəkkəb, lakin zərifdir.

Əksər viruslar virusun genetik nüvəsini əhatə edən lipid zərfindən ibarətdir. Lipid zərfi olan viruslara QİÇS-ə səbəb olanlar kimi retroviruslar, çiçək, herpes və hepatitə səbəb olanlar kimi DNT virusları, Qərbi Nil qızdırması, Denge qızdırması, ensefalit, sarı qızdırma, Zika virusuna səbəb olanlar kimi RNT virusları, qrip və əlbəttə ki, Covid-19. Bunun mənası odur ki, zərflənmiş virus, yoluxmuş hüceyrədəki mexanizmləri ələ keçirərək, replikasiya zamanı özləri üçün yeni lipid zərfləri yarada bilməsə, yoluxmuş hüceyrənin içərisində çoxalda bilməz. Bu kritik nöqtə AMPK-nın aktivləşdirilməsinin daxil olduğu yerdir. AMPK aktivləşdirildikdən sonra virus replikasiyasında sonuncu zəruri addımın formalaşmasını kəskin şəkildə azaldır.

Daha əvvəl qeyd etdiyim kimi, AMPK sizin maddələr mübadiləsiniz və xüsusən də lipidlərin sintezi üçün əsas keçiddir. Artan lipid sintezi ACC kimi tanınan başqa bir ferment tərəfindən idarə olunur. Bununla belə, AMPK-nı aktivləşdirə bilsəniz, bu proses maneə törədilir (11,12). Vücudunuzdakı hər bir hüceyrə yalnız AMPK-nı aktivləşdirə bilsəniz, viral replikasiyanı dayandırmaq üçün molekulyar mexanizm daşıyır.

AMPK-nın pəhriz aktivləşdirilməsi

AMPK ciddi pəhriz nəzarəti altındadır. Zone pəhrizi kimi kalorili məhdudlaşdırılmış pəhrizlərlə aktivləşdirilir (13, 14). AMPK həmçinin omeqa-3 yağ turşularından əmələ gələn rezolvinlər kimi tanınan hormonlar tərəfindən aktivləşdirilir (15-17). Bununla belə, AMPK-nı aktivləşdirməyin ən yaxşı yolu aşağıda göstərildiyi kimi suda həll olunan polifenollar (18) vasitəsilə həyata keçirilir.

Təəccüblü deyil ki, AMPK-nı aktivləşdirən üç pəhriz komponenti Pro-Resolution Nutrition sisteminin qidalanma sütunlarıdır. Bununla belə, onların hamısı AMPK-nı aktivləşdirmək qabiliyyətlərində bərabər deyil, çünki suda həll olunan polifenollar üçünün ən əhəmiyyətli təsiri olacaqdır.

Polifenolların AMPK-nın aktivləşdirilməsində bu qədər faydalı olmasının səbəbi, onların LKB1-ni deasilasiya yolu ilə aktivləşdirən SIRT fermentini aktivləşdirən mürəkkəb bir yolla işləmələridir ki, bu da öz növbəsində AMPK-nın aktivləşməsini təmin edir (19). AMPK-nın aktivləşdirilməsinin unikal cəhətlərindən biri NAD+ əmələ gətirən fermentin (Nampt) aktivliyinin artmasıdır ki, bu da öz növbəsində aşağıda göstərildiyi kimi SIRT fermentini aktivləşdirir.

Beləliklə, sistemi davamlı olaraq doldurmaq üçün polifenolların ardıcıl qəbulunu davam etdirdiyiniz müddətcə dövr zəncirvari reaksiya ilə davam edir. Bu mürəkkəb biokimya mənim kitabımda daha ətraflı izah edilmişdir. Qətnamə zonası (14). Nəticə budur ki, suda həll olunan polifenollar yeni zərflənmiş virusların replikasiyasını dayandırmaq üçün möcüzə ola bilər.

Təəssüf ki, aradan qaldırılmalı olan bir neçə problem var. Birincisi, polifenolların çoxu suda çox həll olunmur, yəni ilkin olaraq SIRT fermentlərini aktivləşdirmək üçün hüceyrələrə daxil olmaq üçün kifayət qədər yüksək səviyyədə qana daxil olmayacaqlar. İkincisi, polifenollar SIRT fermentini bağlamaq üçün unikal bir quruluşa malik olmalıdırlar (20). 8000 məlum polifenoldan yalnız delfinidlər kimi tanınan antosiyaninlərin spesifik alt sinfi hər iki meyara cavab verir.

Yaxşı, delfinidini haradan tapırsınız, çünki sizə gündəlik 100-500 mq qəbul lazımdır? Qırmızı şərabda bəzi delphinidinlər var, lakin AMPK-nı aktivləşdirməyə başlamaq üçün kifayət qədər delfinidini əldə etmək üçün gündə təxminən 50 stəkan qırmızı şərab istehlak etməli olacaqsınız. Qaragilə daha zəngin bir mənbədir, lakin kifayət qədər delfinidlər əldə etmək üçün gündə təxminən iki funt yaban mersini istehlak etməlisiniz ki, bu da AMPK fəaliyyətini maneə törədən böyük miqdarda qlükoza təmin edir (21).

İnanıram ki, cavab delfinidlərlə zəngin və qlükozadan məhrum olan yüksək təmizlənmiş ekstraktları tapmaqdır. Bu cür məhsullar mövcuddur və onlar AMPK aktivatorundan gözlədiyiniz çoxsaylı klinik faydalar nümayiş etdiriblər (22-25). Pro-Resolution Nutrition sisteminin bir hissəsi kimi yüksək dərəcədə təmizlənmiş delphinidin ekstraktları istifadə edildikdə, siz bədəninizi lipid zərfinə malik olan hər hansı bir virusun və o cümlədən SARS-CoV-2 virusunun potensial zərərini azaltmağa hazırlamaq üçün əlinizdən gələni etmiş olursunuz. Covid-19-a səbəb olur.

1. Silwal P, Kim JK, Yuk JM, Jo EK. “AMP-Aktivləşdirilmiş Protein Kinazı və İnfeksiyaya Qarşı Host Müdafiəsi.” Int J Mol Sci 19: E3495 (2018)

2. Günəş X və, Zhu MJ. “AMP ​​ilə aktivləşdirilmiş protein kinaz: bağırsaq xəstəliklərində terapevtik hədəf.” Open Biol 7: 170104 (2017)

3. Rowart P, Wu J, Caplan MJ və Jouret F. “AMPK-nın Epitelial Sıx Qovşaqların Yaranmasında Təsirləri.” Int J Mol Sci 19: E2040 (2018)

4. Zhu MJ, Sun X və Du M. Bağırsaq epitelinin apikal birləşmələrinin və maneə funksiyasının tənzimlənməsində “AMPK.” Toxuma Baryerləri 6: 1-13 (2018)

5. Fullerton MD və Steinberg GR. “AMPK üçün adaptiv rolun təqdim edilməsi.” J Leukoc Biol 94:1099-1101 (2013)

6. Carroll KC, Viollet B və Suttles J. “AMPKα1 çatışmazlığı proinflamatuar miyeloid APC aktivliyini və CD40 siqnalını gücləndirir.” J Leukoc Biol 94: 1113-1121 (2013)

7. Moser TS, Schieffer D, Cherry S. AMP ilə aktivləşdirilmiş kinaz, yağ turşusu sintezini maneə törətməklə Rift Valley qızdırması virus infeksiyasını məhdudlaşdırır. PLoS Pathog 8: e1002661 (2012)

8. Jiménez de Oya N, Blázquez AB, Casas J, Saiz JC və Martin-Acebes MA. “Adenozin monofosfatla aktivləşdirilmiş protein kinazın (AMPK) PF-06409577 tərəfindən birbaşa aktivləşdirilməsi ana hüceyrənin lipid metabolizmasının modifikasiyası vasitəsilə flavivirus infeksiyasını maneə törədir.

9. Singh S, Singh PK, Suhail H, Arumugaswami V, Pellett PE, Giri S, and Kumar A. “AMP ​​ilə aktivləşdirilmiş protein kinaz, anadangəlmə anti-viral reaksiyaları gücləndirərək və qlikolizi inhibə edərək endotel hüceyrələrində Zika virusunun replikasiyasını məhdudlaşdırır.& #8221 J Immunol 204:1810-1824 (2020)

10. Martín-Acebes MA, Jiménez de Oya N, və Saiz JC. “Lipid metabolizmi Zika və digər flaviviruslara qarşı anti-viral kəşf üçün dərman vasitəsi kimi hədəflər mənbəyi kimi. Əczaçılıq 12: E97 (2019)

11. Saha AK, Ruderman NB. “Malonyl-CoA və AMP ilə aktivləşdirilmiş protein kinaz: genişlənən tərəfdaşlıq.” Mol Cell Biochem 253: 65-70 (2003)

12. Foretz M və Viollet B. “Kültürlənmiş hüceyrələrdə lipid sintezi axınının AMPK tərəfindən inhibə edilməsinin ölçülməsi. Metodlar Mol Biol 1732:363-371 (2018)

13. Sears B. Zona. Regan Kitablar. Nyu York, NY (1995)

14. Sears B. Qətnamə zonası. Zona Press. Palm City, FL (2019)

15. Jung TW, Ahn SH, Shin JW, Kim HC, Park ES, Abd El-Aty AM, Hacımüftüoğlu A, Song KH, Jeong JH. Protectin DX, fetuin-A və SeP ifadəsinin AMPK/SIRT1 vasitəçiliyi ilə modulyasiyası vasitəsilə palmitatın səbəb olduğu qaraciyər insulin müqavimətini yaxşılaşdırır. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2019 oktyabr 46(10):898-909.

16. Jung TW, Kyung EJ, Kim HC, Shin YK, Lee SH, Park ES, Hacımüftüoğlu A, Abd El-Aty AM, Jeong JH. Protectin DX AMPK-induksiya etdiyi ORP150 İfadəsi vasitəsilə Endoplazmik Retikulum Stressini Yatıraraq Qaraciyər Steatozunu Yaxşılaşdırır. J Pharmacol Exp Ther. 2018 İyun 365(3):485-493.

17. Piao S, Du W, Wei Y, Yang Y, Feng X, Bai L. Protectin DX xondrositlərdə AMPK/NF-κB yolu vasitəsilə IL-1β-induksiya etdiyi iltihabı zəiflədir və siçovul modelində osteoartritin inkişafını yaxşılaşdırır. Int immunopharmacol. 2019 dekabr 1178:106043.

18. Momtaz S, Salek-Maghsoudi A, Abdolghaffari AH, Jasemi E, Rezazadeh S, Hassani S, Ziaee M, Abdollahi M, Behzad S, and Nabavi SM. "AMP ilə aktivləşdirilmiş protein kinaz yolu ilə diabeti hədəf alan polifenollar dərman kəşfinə gələcək yanaşma." Crit Rev Clin Lab Sci 56: 472-492 (2019)

19. Ruderman NB, Xu XJ, Nelson L, Cacicedo JM, Saha AK, Lan F, and Ido Y. “AMPK və SIRT1: uzunmüddətli əməkdaşlıq?” Am J Physiol Endocrinol Metab 298: E751-60 ( 2010)

20. Rahnasto-Rilla M, Tyni J, Huovinen M, Jarho E, Kulikowicz T, Ravichandran S, A Bohr V, Ferrucci L, Lahtela-Kakkonen M və Moaddel R. “Sirtuin 6 modulatorları kimi təbii polifenollar.–. Sci Rep 8: 4163 (2018)

21. Viollet B, Horman S, Leclerc J, Lantier L, Foretz M, Billaud M, Giri S, and Andreelli F. “AMPK inhibe sağlamlıq və xəstəlik.” Crit Rev Biochem Mol Biol 45: 276-295 ( 2010)

22. Alvarado JL, Leschot A, Olivera-Nappa Á, Salgado AM, Rioseco H, Lyon C, Vigil P. “Delphinidinlə zəngin maqui giləmeyvə ekstraktı (Delphinol®) oral qlükoza zamanı prediyabetik şəxslərdə oruc və yeməkdən sonra qlikemiyanı və insulinemiyanı azaldır. testlər." Biomed Res Int. 2016: 9070537 (2016)

23. Alvarado J, Schoenlau F, Leschot A, Salgad AM, Vigil Portales P. "Delphinol® standartlaşdırılmış maqui giləmeyvə ekstraktı üç aylıq klinik sınaqda qan qlükozasını əhəmiyyətli dərəcədə azaldır və diabetdən əziyyət çəkən şəxslərdə qan lipid profilini yaxşılaşdırır." Panminerva Med 58(3 Əlavə 1):1-6 (2016)

24. Davinelli S, Bertoglio JC, Zarrelli A, Pina R və Scapagnini G. “Antosiyanin-maki giləmeyvə ekstraktının (Delphinol®) oksidləşdirici stress biomarkerlərində effektivliyini qiymətləndirən randomizə edilmiş klinik sınaq.” J Am Coll Nutr. 201534 Əlavə 1:28-33 (2015)

25. Hidalgo J, Flores C, Hidalgo MA, Perez M, Yañez A, Quiñones L, Caceres DD və Burgos RA. "Delphinol® standartlaşdırılmış maqui giləmeyvə ekstraktı natrium qlükoza kotransporter inhibesinin yeni mexanizmi ilə qlükoza tənzimlənməsi pozulmuş şəxslərdə yeməkdən sonra qan qlükoza artımını azaldır." Panminerva Med 56(2 Əlavə 3):1-7 (2014)


Viral Fusion Zülalları

Biosintetik və struktur xüsusiyyətlərinə əsasən, viral fuzogenlər üç kateqoriyaya bölünür (Cədvəl 16.1). I sinif füzyon qlikoproteinləri füzyon qabiliyyətli olmaq üçün proteolitik emal tələb edən qeyri-aktiv prekursorlar kimi sintez olunmaqla xarakterizə olunur. Onların hamısı homotrimerlərdir ki, onlar birləşdikdən sonra uzun mərkəzi qıvrımlı özək quruluşunu (bir-birinə bükülmüş spirallardan əmələ gəlir) ehtiva edən saç sancaqlarına çevrilirlər. II sinif füzyon qlikoproteinləri biosintez zamanı proteolitik şəkildə işlənən daha uzun poliprotein prekursorlarından əldə edilir. II sinif füzyon zülalları viral səthdə zülal dimerlərinin ikosahedral skafoldlarını əmələ gətirir. Birləşmə zamanı bu zülallar metastabil prefuziya dimerini β-vərəq strukturlarından ibarət sabit saç sancağı homotrimerinə çevirərək, oliqomerik yenidən qurulmaya məruz qalırlar. Nəhayət, III sinif qlikoproteinləri proteolitik şəkildə işlənmir. Onların birləşmədən sonrakı saç tıxac trimeri sinif I qlikoproteinlər kimi mərkəzi α-spiral qıvrımlı sarğı göstərir, lakin birləşmə sahəsi uzanmış β-vərəqinin ucunda yerləşən iki birləşmə döngəsini ifşa edir və siniflə heyrətamiz yaxınlaşmanı göstərir. II birləşmə zülalları.

Cədvəl 16.1

Viral birləşmə zülallarının təsnifatı

SinifVirus ailəsiNümayəndəsiViral fuzogenQoşmada iştirak edir
I OrtomyxoviridaeQrip virusuHemaqlutinin (HA)Bəli
Retroviridaeİnsan immunçatışmazlığı virusu (HİV)Zərf glikoprotein 41 alt bölməsiBəli
FiloviridaeEbola virusuGP qlikoproteiniBəli
KoronaviruslarAğır kəskin respirator sindrom (SARS) virusuS qlikoproteinBəli
ParamyxoviridaeSendai virusuF qlikoproteinYox
II AlfaviridaeSemliki Meşə VirusuE1 qlikoproteinYox
FlaviviridaeDenq virusuE glikoproteinBəli
III RhabdoviridaeVesikulyar stomatit virusuG qlikoproteinBəli
BaculoviridaeBaculovirusGp64 qlikoproteiniBəli
HerpesviridaeHerpes simplex virusugB qlikoproteinYox

I sinif Viral Fusion Zülalları

Hər hansı bir viral və ya hüceyrəli qlikoproteinin ilk atom quruluşu rentgen kristalloqrafiyası ilə müəyyən edilmiş və 1981-ci ildə Wiley və Skehel [21] laboratoriyaları tərəfindən bildirilmişdir. Bu, TM bölgəsi yaxınlığında HA polipeptidlərini parçalayan bromelain müalicəsi ilə virus hissəciklərindən ayrılan qrip hemaglutinin (HA) trimerik ektodomeninin (plazma membranından çıxan sahə) strukturu idi.

Qrip HA yoluxmuş hüceyrədə kovalent olaraq qalan HA1 (təxminən N-terminalın üçdə ikisi) və HA2 (C-terminal üçüncü) zəncirlərini yaratmaq üçün proteolitik olaraq parçalanan təxminən 550 amin turşusundan ibarət polipeptid prekursoru (HA0) kimi sintez olunur. disulfid bağı ilə bağlıdır. Yeni yaradılmış HA2 N-terminusunda birləşmə zamanı hədəf membrana daxil olan füzyon peptidi adlanan hidrofobik amin turşularının bir hissəsi var. Qrip HA-nın ümumi quruluşu membrandan çıxan uzunsov sünbüldür. Yalnız HA1 ardıcıllığı ilə əmələ gələn distal baş, xarici əmələ gətirən səthində açıq olan dayaz cibdən əmələ gələn reseptor (sialik turşu) bağlama yerini daşıyır. Əsasən HA2 amin turşuları tərəfindən hazırlanmış gövdə trimerik α-spiral qıvrımlı qıvrımdır. Membran birləşməsi zamanı qrip HA-nın struktur yenidən qurulması Şəkil   16.1b-də göstərilmişdir.

Qrip kimi, digər viruslar da həm reseptor, həm də membran birləşmə fəaliyyətinə malik olan I sinif füzyon qlikoproteinlərini ehtiva edir (Cədvəl 16.1). Məsələn, HİV-in zərf qlikoproteini də proteolitik şəkildə işlənir və hüceyrə səthində membran birləşməsindən əvvəl protein reseptorlarına (CD4) və kemokin koreseptorlarına bağlanır. Eynilə, filovirus və koronavirusun reseptor bağlayan zülalları əlavə olaraq viral hüceyrə membranının birləşməsinə vasitəçilik edir.

Bunun əksinə olaraq, birləşmə və birləşmə fəaliyyətləri paramiksovirusların iki fərqli səth qlikoproteinlərində yerləşir. Əlavə zülal (HN, H və ya G adlanır) virusun hüceyrə səthi ilə ilkin qarşılıqlı əlaqəsi üçün tələb olunur (virus reseptorlarının istifadəsi üçün 10.1007/978-94-007-6552-8_15-ə baxın). Virus hüceyrəyə bağlandıqdan sonra, viral və hüceyrə membranlarının birləşməsini təşviq etmək üçün digər əsas viral qlikoprotein (füzyon üçün F adlanır) işə salınır. Prototip paramiksovirus F zülallarının sintezdən əvvəlki metastabil konformasiyada [22] və qaynaşmadan sonrakı vəziyyətdə [23] strukturunun rentgen kristalloqrafiyası ilə müəyyən edilməsi, həmçinin füzyon aralıqlarının [24] identifikasiyası ən tam mənzərəni təmin etmişdir. Şəkil 16.2-də göstərildiyi kimi I sinif füzyon qlikoproteinləri tərəfindən idarə olunan membran birləşmə prosesi.

I sinif füzyon zülalının (Paramyxovirus) vasitəçiliyi ilə membran füzyonu. Paraqrip virusu tip 5 (PIV5) [22] pre-füzyon formasının atom strukturları (yuxarı sol) və Respirator Sinsitial Virusun (RSV) post-fusion forması [53] (aşağı sağ) F zülalları lent şəklində göstərilmişdir. Eyni protein bölgələri iki uyğunlaşmada eyni rənglərlə vurğulanır. (a𠄽) Füzyon prosesinin diaqramı: (a) aktivləşdirmədən əvvəl viral membrana daxil edilmiş pre-füzyon paramiksovirus F protein trimeri, (b) uzun mərkəzi HRA α-spiralların yenidən qatlanmasını ehtiva edən saç tıxacı quruluşunun formalaşması (mavi) füzyon peptidi ilə (qırmızı) hüceyrə membranına daxil edilir, (c) iki membrana yaxınlaşmaq üçün pre-hairpin çökməsi və (d) füzyon məsaməsinin formalaşması və F trimerinin birləşmədən sonrakı konformasiyada sabitləşməsi. Son iki addımda, birləşmə prosesini idarə etmək üçün lazım olan əməkdaşlığı göstərmək üçün iki F protein molekulu təmsil olunur.

Paramiksovirus F zülalı, digər sinif I qlikoproteinlər kimi, aktiv olmayan bir prekursor (F0) kimi sintez olunur və o, trimerə yığılaraq endoplazmatik retikulumun lümeninə birgə translokasiya olunur. Hər bir F zülal alt bölməsi hüceyrə səthinə daşınarkən proteolitik olaraq parçalanır və bir və ya daha çox disulfid bağı ilə bağlı qalan iki zəncir, F2-terminal və F1 C-terminal yaradır. F1 (qrip virusunun HA2 zəncirinə ekvivalentdir) N-terminusunda hidrofobik birləşmə peptidinə və ektodomenində iki heptad təkrar ardıcıllığına (HRA və HRB) malikdir. HRA füzyon peptidinə bitişikdir və HRB F1 C-terminusunun yaxınlığında yerləşdirilən transmembran (TM) bölgəsinə proksimaldır.

Paraqrip virusu tip 5 (PIV5) F zülalının füzyondan əvvəlki üçölçülü (3D) strukturu HRB bölgəsi [22] tərəfindən hazırlanmış qısa trimerik qıvrıla-qıvrıla birləşdirilən böyük qlobulyar başdan ibarətdir [22] (Şəkil 16.2). ). Digər paramiksoviruslardan (məsələn, respirator sinsitial virus (RSV (Şəkil 16.2)) və peptid inhibitorlarından [24] istifadə edilən funksional tədqiqatlar) F ektodomeninin birləşmədən sonrakı strukturu ilə müqayisə membran birləşməsinin aşağıdakı modelini təmin etdi: Virus üzərində qoşma zülalı vasitəsilə hüceyrələrə bağlanan F aktivləşir və HRB qıvrımlarının ayrılması və HRA ardıcıllığının yenidən qatlanması da daxil olmaqla bir sıra konformasiya dəyişikliklərinə başlayır. HRA-ların hədəf hüceyrə membranına daxil edilməsi, nəticədə saç tıxacından əvvəl ara məhsulun əmələ gəlməsi.Bu addımdan sonra molekulun C-terminal hissəsinin iki membranı və membranı bir araya gətirmək üçün qıvrılmış qıvrım nüvəsi boyunca sıxılması izlənilir. HA qripi üçün əvvəl təsvir edilmiş prosesə bənzətməklə, füzyon və TM domenləri.Lakin paramiksovirus F vəziyyətində HRB ardıcıllıqları HRA-nın ətrafına sarılaraq son dərəcə sabit bir bükülmə əmələ gətirir. altı spiral paketi (6HB) birləşmədən sonrakı saç sancağında. Bu 6HB-nin əmələ gəlməsi membran itələməsini aradan qaldırmaq üçün lazım olan enerjinin çoxunu təmin edir. 6HB strukturu HİV zərfinin qlikoproteininin gp41 zənciri kimi digər I sinif füzyon qlikoproteinləri tərəfindən paylaşılır.

Qrip HA-nın aktivləşməsi endosomal aşağı pH-a məruz qalmağı tələb etsə də (ehtimal ki, əsas amin turşusu qalıqlarının protonasiyası ilə), paramiksovirus F zülallarını tetikleyen hadisə hələ də düzgün müəyyən edilməmişdir. Paramiksovirus F-ni ifadə edən transfeksiya edilmiş hüceyrələrin hüceyrə-hüceyrə birləşməsi əksər hallarda homotipik əlavə zülalın birgə ifadəsini tələb edir ki, bu da membranın birləşməsi üçün iki zülalın qarşılıqlı təsirinin lazım olduğunu göstərir. Birləşmə üçün əlavə zülal tələbini izah etmək üçün iki alternativ model (𠇌lamp” və “provocateur”) təklif edilmişdir:

The sıxac model HN-nin (və ya virusdan asılı olaraq ekvivalent əlavə zülalın) virus hissəciyində F ilə kompleksləşdiyini və sonuncunu metastabil konfiqurasiyada saxladığını irəli sürür. Reseptorların bağlanması ilə HN-də konformasiya dəyişiklikləri membran birləşməsini başlatmaq üçün kompleksdən F-ni buraxır.

Alternativ olaraq, təxribatçı model HN və F-nin hüceyrə ilə əlaqə qurmazdan əvvəl virusda qarşılıqlı təsir göstərmədiyini iddia edir. Reseptorların bağlanması zamanı HN-də induksiya edilən struktur dəyişiklikləri ilə eyni vaxtda HN F-yə bağlanır və bu qarşılıqlı təsir F-ni qaynaşma üçün tetikler [25].

Maraqlıdır ki, viruslara aid olan F proteini Pneumovirinae paramiksovirusların alt ailəsi (məs., RSV və insan metapnevmovirusu, hMPV) hüceyrə-hüceyrə birləşməsi üçün əlavə zülalın (G) birgə ifadəsini tələb etmir [26]. Bundan əlavə, bütün G geninin məhv edildiyi silinmə mutant virusları əldə edilmişdir. Bu mutantlar hələ də hüceyrələri yoluxdurur in vitro, baxmayaraq ki, vəhşi tip virusdan daha az effektivdir və heyvan infeksiya modellərində zəiflədilir [27]. Bu silinən mutantların F zülalının aktivləşdirilməsi G zülalı ilə qarşılıqlı əlaqəyə etibar edə bilməz və buna görə də alternativ tənzimləyici mexanizmlər membranın birləşməsini idarə etməlidir. Qeyd edək ki, RSV F zülalının unikal xüsusiyyəti F0 zülalının prekursorunda iki proteolitik parçalanma yerinin (bütün digər paramiksoviruslarda olduğu kimi birinin əvəzinə) olmasıdır [26]. F-də ikiqat parçalanma sahəsinin mövcudluğu, hələ də yaxşı başa düşülməyən G-müstəqil mexanizm [28] ilə membranın birləşməsinin aktivləşdirilməsinə təsir göstərdiyi aşkar edilmişdir.

II sinif Viral Fusion Zülalları

I sinif füzyon zülallarından fərqli olaraq II sinif füzyon zülalları (Cədvəl 16.1) alfavirusların E1 zülalını yaratmaq üçün biosintez zamanı parçalanan bir poliprotein sələfindən əldə edilir (Cədvəl 16.1).məs., Semliki Forest virusu (SFV)) və ya flavivirusların E proteini (məs., dang virusu və gənə ensefalit virusu). Hər iki zülal alfaviruslar üçün p62 və flaviviruslar üçün prM adlandırılan bir yoldaş və ya tənzimləyici zülal ilə birgə tərcümədə qatlanır [9].

Alfavirusda p62-E1 kompleksi plazma membranına daşınır, burada onlar p62-E1 dimerləri kimi yeni qönçələnən ikosahedral virus hissəciklərinə daxil olurlar. p62 daha sonra proteolitik şəkildə işlənir (və sonra E2 adlandırılır), lakin E1 birləşmə zülalının və xüsusən də onun birləşmə dövrəsinin çoxunu əhatə etdiyi virusa bağlı qalır. E2 hüceyrə səthi reseptoruna bağlanmağa vasitəçilik edir.

Bunun əksinə olaraq, flavivirus hissəcikləri prM-E zülal komplekslərini ehtiva edən yetişməmiş virionlar kimi endoplazmatik retikuluma qönçələnir. Yetişməmiş viruslar daha sonra prM-nin işləndiyi və E-dən ayrıldığı ekzositik yol vasitəsilə xaricə daşınır [29]. Sonuncu zülal daha sonra ikosahedral simmetriya ilə virion səthində E-E homodimerlərində düzülür. Flavivirus füzyon E zülalı əlavə olaraq reseptorların bağlanmasına cavabdehdir.

Hər hansı bir sinif II qlikoproteinin rentgen kristalloqrafiyası ilə həll edilən ilk strukturu məhdud tripsin həzmi ilə virionlardan həll olunan gənə ensefaliti (TBE) flavivirus E protein ektodomeninin [30] quruluşudur. Oxşar strukturlar indi 2 və 3 tip dang virusunun E ektodomenində həll edilmişdir [9]. E zülalının polipeptid zənciri mürəkkəb bir yol izləyir və nəticədə üç qlobular sahə əmələ gəlir və bunlar mahiyyətcə β-vərəqlərdən ibarətdir (Şəkil 16.3). Birinci domen yuxarı-aşağı topologiyası olan β-bareldir (qırmızı). I domenində iki bitişik tel uzanaraq virus membranına paralel uzanan uzun barmaq kimi uzun bir quruluş olan II (sarı) domenini əmələ gətirir. II domeninin ucunda E-E dimerində bitişik monomerin III (mavi) sahəsi ilə qarşılıqlı əlaqədə hidrofilik mühitdən virionda basdırılmış vəziyyətdə qalan hidrofobik birləşmə halqası yerləşir. I domen həmçinin E ektodomenini zülalın TM bölgəsinə qədər uzanan kök bölgəsi ilə birləşdirən III domenlə də bağlıdır.

II sinif füzyon zülalının (Flavivirus) vasitəçiliyi ilə membran füzyonu. Denq virusu E zülal dimerinin atom strukturlarının pre-füzyon konformasiyasında lent təsviri [54] (yuxarı sol) və birləşmədən sonrakı konformasiyada E protein trimeri [55] (aşağı sağ). E qlikoproteinin I, II və III domenləri rənglidir qırmızı, sarımavi, müvafiq olaraq. (a𠄽) Füzyon prosesinin diaqramı: (a) aktivləşmədən əvvəl artıq endosomda olan flavivirus E qlikoprotein dimerinin quruluşu, (b) E zülal alt bölmələrinin dissosiasiyası, birləşmə sahəsinin yenidən qatlanması (sarı) və birləşmə döngəsinin daxil edilməsi (yaşıl) endosom membranına, (c) iki membrana yaxınlaşmaq üçün E protein trimerinin formalaşması və yenidən qatlanması və (d) birləşmə məsaməsinin formalaşması və birləşmədən sonrakı konformasiyada E trimerinin sabitləşməsi. Son iki addımda, birləşmə prosesini idarə etmək üçün lazım olan əməkdaşlığı göstərmək üçün iki E protein molekulu təmsil olunur.

Birinci sinif füzyon zülallarından fərqli olaraq, birləşmədən əvvəlki və sonrakı uyğunlaşmalarında trimerikdir, II sinif füzyon qlikoproteinləri birləşmə zamanı əsas oliqomer çevrilmələrə məruz qalırlar. Qrip virusunda olduğu kimi, flavivirus E zülalı əvvəlcə virionun endositozuna səbəb olan hüceyrə səthi reseptoruna bağlanır. Turşu endosoma daxil olduqdan sonra E-E homodimer dissosiasiya olunur, nəticədə ikozahedral iskele sökülür. Fərdi alt bölmələr I və II domenləri birləşdirən menteşə bölgəsi ilə xaricə yellənir və birləşmə döngələri hədəf membrana daxil olur. Monomerlər arasında yanal qarşılıqlı təsirlər trimerlərə təkrar birləşməni asanlaşdırır [31]. Bu yenidən təşkillər I sinif füzyon qlikoproteinlərinin pre-saç tıxacının analoqu olan, hər bir E polipeptidinin iki fərqli bölgəsinin birləşən iki membrana daxil edildiyi genişlənmiş trimerik strukturun formalaşmasına gətirib çıxarır. Genişləndirilmiş aralığın dağılması, III domeninin onu I domenlə əlaqələndirən seqment ətrafında hər bir alt bölmədə fırlanması və II qruplaşdırılmış domenlərlə yanaşı kökün sıxılması ilə davam edə bilər. Bu yenidən qatlama lipid sapının, hemifüzyon diafraqmasının və birləşmə məsaməsinin formalaşmasına başlamaq üçün iki membranı birləşdirir.

Alfavirusların birləşmə E1 qlikoproteininin (SFV) strukturu, aşkar edilə bilən ardıcıllığın qorunmasının olmamasına baxmayaraq, gözlənilmədən flavivirus E zülalının quruluşuna çox bənzəyir. E1 də flavivirus E-ninkinə bərabər üç nəzərə çarpan domenə malikdir. Yeganə əhəmiyyətli fərq virus hissəciyində E1-in E2 ilə assosiasiyasıdır. E2, SFV virionunun endositik daxililəşdirilməsinə başlamaq üçün hüceyrə səthi reseptoru ilə qarşılıqlı əlaqədə olur [32]. Turşu endosomunda E2 E1-dən ayrılır və ehtimal ki, parçalanır. Aşağı pH-a məruz qaldıqda, E1 flavivirus E zülalınınkinə oxşar konformasiya dəyişikliklərinə məruz qalır, bu da viral və endosomal membranların birləşməsinə səbəb olur. Elektron mikroskopiyası və rentgen kristalloqrafiyasının nəticələri, beş və ya altı trimerdən ibarət üzüklər yaratmaq üçün birləşmə halqaları hədəf membrana daxil edildikdə, bitişik E1 trimerləri arasında qarşılıqlı əlaqə üçün dəstək verir. It has been postulated that these fivefold interactions would act at the fusion site to induce the formation of a nipple-like curvature in the viral and target membranes, favoring membrane fusion [33]. Although there is no direct evidence, it is likely that the flavivirus E protein forms similar rings of trimers during fusion.

Class III Viral Fusion Proteins

The best characterized members of the so-called class III fusion viral glycoproteins are the rhabdovirus (məs., vesicular stomatitis virus, VSV) G glycoprotein, the herpesvirus gB glycoprotein and the baculovirus gp64 glycoprotein. The pre-fusion [34] and post-fusion [35] structures of the VSV_G glycoprotein ectodomain have been solved by X-ray crystallography while only the post-fusion conformations of gB [36] and gp64 [37] are known.

Class III fusion glycoproteins are expressed from individual mRNAs and do not require proteolytic processing of either a protein precursor (as in class I proteins) or an accompanying protein (as in class II proteins) for activity. Class III proteins are trimeric before and after fusion and share structural characteristics with both class I and class II fusion glycoproteins, as described below.

The rhabdovirus G protein possesses both receptor binding and fusion promoting activities. As in the case of influenza virus, binding of rhabdovirus G to a poorly characterized receptor at the cell surface induces endocytosis of the virus particle. Acidification of the endosome triggers G for membrane fusion. However, and in contrast with all other fusion proteins, the low pH inactivation of rhabdovirus G is reversible. Thus, virions inactivated by prolonged incubation at pH φ can be reactivated by raising the pH to neutral [38]. This reversibility may be required to allow G to be transported through the acidic Golgi apparatus and to recover its native fusion-competent state when incorporated to new virions [39]. Given this reversibility, it is believed that the energy released during the structural transition of a single trimer from the pre-fusion to the post-fusion conformation is probably small, compared with the energetic barrier of the fusion reaction. In agreement with this hypothesis, the estimated number of rhabdovirus spikes required for fusion is higher (at least 15 trimers) than for other enveloped viruses.

A soluble ectodomain of the VSV_G glycoprotein, released from purified virions treated with thermolysin, was used to solve the structures of the pre-fusion and post-fusion conformations, after exposure to high and low pH, respectively [34, 35]. Several domains could be observed in both structures that are rearranged in their relative orientations during transit from the pre- to the post-fusion structure (Fig.  16.4 ). In the pre-fusion conformation, the fusion domain contains two fusion loops reminiscent of class II proteins that are oriented downward towards the viral membrane. After low pH exposure, the fusion domain moves upward by flipping relative to the central core of the trimer. Thus, an intermediate equivalent to the pre-hairpin structure of class I proteins is formed. This is followed by the reversal of the molecule around a central rigid block formed by lengthening of the central helix and refolding of the three C-terminal segments into helices that position themselves in the grooves of the central core in an anti-parallel manner. This six-helix bundle has obvious resemblance with that of the class I proteins.

Membrane fusion mediated by a class III fusion protein (Vesicular Stomatitis Virus, VSV). Ribbon representations of the VSV glycoprotein (G), in the pre- (upper left) and post-fusion (lower right) conformations. Domains are colored similarly in all images. The fusion domain is colored in sarı and the fusion loops in yaşıl. (a𠄽) Diagram of the fusion process denoting: (a) the structure of the VSV G glycoprotein trimer already in the endosome before activation, (b) dissociation of the G protein subunits, refolding of the fusion domain (sarı) and insertion of the fusion loop (yaşıl) into the endosomal membrane, (c) formation and refolding of the G protein trimer to approach the two membranes, and (d) formation of the fusion pore and stabilization of the G primer in the post-fusion conformation. In the last two steps, two G protein molecules are represented to indicate the cooperation needed to drive the fusion process

It is likely that the transition of VSV_G from the pre-fusion to the post-fusion conformation involves disassembly of the trimer into monomers and reassembly into trimers upon interaction of the fusion loops with the target membrane [40]. It is also likely that cooperativity between G glycoproteins is needed to overcome the energy barrier, as mentioned above. As for class II glycoproteins, lattices of G proteins have been observed in virions, particularly in the planar base of the rhabdovirus bullet-shape particle, which may act to induce nipple-like deformations in the viral and target membranes.

Although it has not been reported, it is likely that low pH exposure also leads to reversible inactivation of the baculovirus gp64 glycoprotein. This protein, like VSV_G, is involved in both receptor binding and membrane fusion after endosome acidification, since baculoviruses also use an endocytic route of entry [41]. In contrast, membrane fusion mediated by herpesvirus gB can occur either at the plasma membrane or in endosomes, depending on the virus and the target cell type. In either case, attachment of herpesvirus to host cells follows a complex mechanism in which several viral glycoproteins interact with cell surface molecules. Some of these interactions trigger fusion, whereas others simply serve to tether the virus to the cell and are dispensable for fusion. In any case, the gB protein, shared by all viruses of the Herpesviridae family, is responsible for fusion [42].

Other Viral Fusion Proteins

Poxviruses (vaccinia virus is the best known member) represent an extreme case among enveloped viruses, regarding the number of viral glycoproteins required for entry. As for herpes virus, entry can occur by fusion at the plasma membrane or in a low pH-dependent manner from within an intracellular particle, depending on the virus strain and the cell type. Vaccinia virus internalization is believed to occur by macropinocytosis (a type of non-specific endocytosis). Four vaccinia virus proteins are involved in attachment to cell surface proteoglycans or laminin [43]. Eleven or 12 other relatively small glycoproteins, ranging in size between 35 and 377 amino acids, form the so-called entry fusion complex (EFC) that mediates membrane fusion [44]. These proteins have N- or C-terminal transmembrane domains but no sequence similarity with the fusion peptide of other viral fusion glycoproteins has been found in any of them. Therefore, the actual mechanism of vaccinia virus membrane fusion remains to be elucidated but it seems to be different from that of other enveloped viruses. By using conditional lethal mutants of each of the 11 proteins that make the EFC, it was found that eight of them were required to reach the hemifusion step and the other three were needed for completion of virus entry [44]. It is likely that hydrophobic regions of several proteins may assemble in the EFC to form a hydrophobic surface that could bind to the target membrane and drive membrane fusion by some novel mechanism.

Finally, the fusion-associated small transmembrane (FAST) proteins of reoviruses are brought here -despite not being involved in virus entry and reovirus being a non-enveloped virus- because they induce cell-cell fusion and therefore facilitates dissemination of virus to neighboring cells. The FAST proteins are small non structural proteins (98� amino acids, depending on the viral strain) that are expressed on the surfaces of virus-infected cells, where they induce cell-cell fusion and syncytia (multinucleate cells) formation. Purified FAST proteins, when reconstituted into liposome membranes, induce fusion indicating that they are vicdanlı fusogens [45]. The orientation of the FAST polypeptides in the cell membrane is also unique among viral fusogens, with a relatively short N-terminal ectodomain followed by a transmembrane region and a long C-terminal cytoplasmic tail. Although they lack a fusion peptide, a relatively hydrophobic region near the N-terminus which is additionally myristoylated seems to insert into the target membrane to drive membrane fusion, at least for certain FAST proteins [46] .


Lipid-modifying enzyme: New target for pan-viral therapeutics

Three different disease-causing viruses -- poliovirus, coxsackievirus, and hepatitis C -- rely on their unwilling host for the membrane platforms enriched in a specific lipid, phosphatidylinositol 4 phosphate (PI4P) on which they can replicate, Rutgers University researchers said on Dec. 7, at the American Society for Cell Biology annual meeting in Denver.

The viruses carry proteins that enable them to gain access to the P14P lipid for replication. The proteins snare one of the host's own lipid-modifying enzymes, a Type III PI4-kinase (PI4-kinase), reported Nihal Altan-Bonnet, Ph.D., of Rutgers University.

The PI4-kinase may prove to be an excellent target for panviral therapeutics, Altan-Bonnet said. When the Rutgers researchers blocked this PI4-kinase, the invading viruses all ceased replicating, and their host cells survived.

The Rutgers group has extended its investigations to identify other viruses that might be vulnerable to this countermeasure.

Blocking the PI4-kinase was effective, Altan-Bonnet explained, because invading viruses require this enzyme to manufacture the P14P lipid for the platforms that they must set up on the host's membrane-bound organelles, which include the Golgi apparatus and the mitochondria.

The viruses can replicate only on cell membrane platforms enriched with the P14P lipid. To gain access to the lipid, the viruses employ a protein that hijacks the cell's P14-kinase.

They then use it to generate the lipid that enriches the platform. Once established, the viruses rapidly make copies of themselves that go on to infect other cells in the organism.

In normal, uninfected cells, the level of PI4P lipid on organelle membranes is generally low and increases only when signaling and membrane-remodeling proteins are required by the cell, said Altan-Bonnet.

But in infected cells, levels of PI4P lipid dramatically increase, reflecting the viruses' need for more PI4P lipid-enriched membrane surface to anchor their replication machinery.

Altan-Bonnet's lab also found that these membrane surfaces are enriched with cholesterol as well as PI4P lipid. Normally, cholesterol regulates membrane fluidity and elasticity, generating domains to sequester proteins so they can interact effectively.

Altan-Bonnet said that the PI4P lipid and cholesterol together may generate "sticky" membrane domains that viruses exploit for replication. Since viral proteins are relatively few after they invade the host cell, a "sticky" rallying point could be critical to their survival.

The researchers also discovered that RNA polymerases, which are vital for synthesizing the nucleic acids of viruses, have specific binding sites that lock onto PI4P lipids.


Metadichol® a novel nano lipid formulation

Antibiotic resistance, and the emergence of novel viruses, such as COVID-19, both present major challenges to human health. Whilst there are ongoing investigations into vaccines and alternative approaches to antibiotics, a broad-spectrum agent, able to target both bacteria and viruses would be an additional tool to help manage infectious diseases.

What bacteria and viruses have in common is the structure of their cell membranes. The cell membranes of both bacteria and viruses are formed from a lipid bilayer. This lipid membrane is made up of two layers of lipid molecules (phospholipids, fat, waxes and sterols), facing in opposite directions. The membrane keeps molecules, such as proteins, within the organism and prevents them diffusing into regions of the cell where they are not required. However, molecules can still be moved from the inside of the cell to the outside, and vice versa, using pumps which transect the lipid bilayer. When the structure of the lipid bilayer is lost, for example in damaged or dying cells, immune cells recognise this and eliminate the cell.

Naumova Marina/Shutterstock.com

Dr P. R. Raghavan, CEO of Nanorx Inc, works in the field of nanomedicine and his company aims to provide a solution that can be applied to a wide variety of settings, moving away from a ‘one drug one target’ approach.

Metadichol® and vitamin D receptors
In 2008, Dr Raghavan developed a product named ‘Metadichol®’ (also known as ‘Nanosoma® Nanoojas®’) which has since obtained patents from the U.S., as well as worldwide. Metadichol® is made from an absorbable nano-emulsion of a type of lipid molecule called policosanol, normally found in foods such as peanuts, sugar cane, rice and wheat. Found in foods we eat every day, policosanols have been used as a dietary supplement for many years as they have been suggested to reduce cholesterol level in number of studies.

Metadichol® competes by binding to vitamin D receptors, displacing the bacteria or viruses and enabling normal functioning of the immune system.

Metadichol® has now been made into a nano-emulsion, a delivery system frequently used for drug delivery which involves a mixture of two liquids, such as water in oil or oil in water droplets. This allows controlled or sustained release of substances such as drugs, genetic material or other biologically active ingredients it also enhances the stability and bioavailability of substances. This nano formulation has unique effects on other various disease biomarkers not seen in non-nano formulations.

Metadichol® is thought to act on vitamin D receptors (VDRs) which can be found on many different tissues throughout the body, including immune cells. Dr Raghavan and his team have published work which shows that it acts as an inverse agonist on nuclear receptors, Thyroid A (THRA) and Thyroid B (ThRB), Aryl Hydrocarbon receptor (ARH), Nuclear receptor ROR Gamma (RORC), and Estrogen related receptor alpha (ESRRA). Through this action it can activate all the other 48 nuclear receptors.

The effect of Metadichol® on gene expression.

Bacteria and viruses often bind to VDRs, that are responsible for innate immunity to mount an effective response against invading pathogens. It is thought that Metadichol® competitively displaces the bacteria attached to the VDR and enables normal functioning of the innate immune response.

If this is the case, this would make Metadichol® the only known inverse agonist of the VDR, meaning that it binds to the same site as the natural ligand of Vitamin D receptor (1,25 dihydroxy Vitamin D3) but induces a response very different from the Vitamin D3 agonist. Dr Raghavan hypothesises that Metadichol® may be a protean agonist, acting as both a positive and a negative agonist on the same receptor.

Vitamin C and the immune system
In addition to vitamin D activation, vitamin C is also required to maintain a healthy and effective immune system. For example, vitamin C has been shown to reduce severity of symptoms and length of illness in the common cold. It also functions as a cofactor in bile acid synthesis, facilitates thyroid hormone production and aids iron absorption, amongst other roles. Whilst most people obtain sufficient vitamin C from their diet, some people may be deficient in the vitamin, increasing their risk of developing scurvy, as well as less severe issues such as lethargy, impaired wound healing and depression.

In a non-randomised study, Dr Raghavan supplemented 30 individuals with Metadichol® and showed improvements in vitamin C levels threefold higher than what is achieved even with grams of Vitamin C intake.

Metadichol® also increases expression of the Gulo gene four-fold (@ 100 picogram/ml) in mouse adipocytes. This is needed for the pathway in the conversion of glucose to Vitamin C and this gene is dormant in humans. Dr Raghavan suggests that Metadichol® recycles vitamin C by increasing Glut4 gene expression, which is a dehydroascorbic acid transporters, 10 fold (@100 picogram/ml) that is needed for entry of oxidised Vitamin C to enter cells where they are then recycled. This occurs through antioxidant pathways, as Metadichol® binding to VDRs increases glutathione levels. Glutathione is an antioxidant which is capable of recycling other antioxidants, including vitamin C and has been shown to be increased in rats supplemented with Metadichol®.

COVID-19
In a publication (awaiting peer review) Dr Raghavan has recently reported that Metadichol® may be a potential therapeutic against COVID-19, as he has successfully shown that under laboratory settings, the compound can prevent virus replication in a human cell line. Dr Raghavan proposes that Metadichol® can inhibit a protein TMPRSS2 used by the coronavirus to bind to its target cells, therefore blocking this route of infection effectively stops the cell entry mechanisms used by the virus.

A cell culture experiment also showed Metadichol® was able to inhibit virus replication and, as discussed above, may also impact the immune response via the vitamin D pathway. Furthermore, known co-morbidities for COVID-19 infection, such as hypertension and diabetes may also benefit from Metadichol®.

In 1903 Thomas Alva Edison said “The doctor of the future will give no medicine, but will interest his patient in the care of the human frame, in diet and in the cause and prevention of disease.” Metadichol® may fulfil his vision.

Further cell culture studies have been done, focusing on a range of other viruses, including influenza, Ebola, and yellow fever. However, these findings have not yet been translated into rodent or animal models. A number of case studies, each investigating various disease, have also shown benefits of the supplement in viral diseases and other diseases, such as type 2 diabetes skin diseases and hypertension.

Studies conducted in India, the U.S. and Switzerland have suggested that Metadichol® is effective against bacteria, TB and Malaria. Dr Raghavan reports promising results from research exploring the effects of the compound in the fight against tuberculosis. The studies found that it was possible to inhibit the growth of drug resistant MDR as well as XDR in vitro. Clinical studies are ongoing in TB patients to investigate its potential as an immune booster against tuberculosis.

A novel dietary supplement
Metadichol® is a non-toxic product made from renewable sources. It is available as a spray, an edible gel and in cream form. In using a topical cream or gel applied to the skin, Metadichol® can promote the therapeutic and immune effects of vitamin D, in addition to enhancing vitamin C utilisation and collagen formation.

Nano-emulsions are gaining attention due to their improved drug solubilisation capacity, long shelf life, ease of preparation and improved drug bioavailability. Metadichol® is water soluble, and able to penetrate cells and act on nuclear receptors, bind to DNA and regulate the expression of genes. Metadichol® is thought to increase telomerase activity in umbilical cord cells 16-fold at 1 picogram/ml, and in doing so, could optimise the number of immune cells in the body available to fight infections and also the potential to reverse ageing.

When this delivery method is combined with a compound with reported benefits for a number of human diseases, it is clear to see why Metadichol® has so much potential for human health.

Personal Response

As Metadichol® binds to vitamin D receptors and displaces bacteria what are the impacts on other pathways and functions that are normally facilitated by vitamin D?

We have carried out a study of Metadichol® with THP1 cells and seen that it expresses over 2300 genes. We have narrowed this to 754 genes, of which over 600 are regulatory genes, each of these genes control 10-100s of other genes. Over 200 major pathways are activated. The key pathways based on our unpublished work and ongoing work are metabolism, cholesterol biosynthesis, innate immune system, adaptive immune system, and steroid biosynthesis (p values of E (-20) or lower). Metadichol® works at fine-tuning the biological system through the regulation of metabolism and immunity that are key to mitigating most diseases at the macro level.


Thinking on the Envelope: Finding a Medical "Silver Bullet" to Disable Many of the World's Deadliest Viruses

A series of promising compounds can cripple all enveloped viruses' ability to invade cells as well as circumvent any resistance that hobbles traditional antiviral drugs. But will they work outside the lab?

Benhur Lee may have discovered a medical silver bullet that can disable pandemic HIV, exotic Ebola, the common flu and possibly every kind of enveloped virus on the planet. An added bonus is that those viruses likely are unable to develop resistance to the compound.

If this sounds too good to be true, you are not alone. Lee was skeptical himself, and that is why it took four years of detailed work by his lab at the University of California, Los Angeles, (U.C.L.A.), along with collaborators spread across the country before the first paper was published on the potentially revolutionary discovery, on February 16 in Milli Elmlər Akademiyasının Materialları.

Lee is an expert on the viral envelope, the dynamic outside surface of a virus that latches onto a cell, then changes its shape to let the virus enter and infect the cell. This work began as part of a biodefense grant from the National Institutes of Health, screening a library of 30,000 compounds for activity against the envelope of Nipah virus, an emerging infection first identified in 1999 in Malaysia.

Nipah is so deadly that work with the virus itself can only be done in biosafety level 4 (BSL-4) labs where researchers wear tightly sealed hazmat suits with internal oxygen supplies. The labs themselves are strongly secured. There are only four in the U.S.

Lee got around that by creating a hybrid virus. He striped off the envelope covering the relatively benign vesicular stomatitis virus (VSV) and added the Nipah envelope to that core. This allowed him to screen the compounds in his lab at the university using much lower BLS-2 safety standards, to see if they inhibited viral entry into the cell.

"One compound (LJ001) looked really good, it had an IC50 of one micromolar [meaning that it inhibited the pathogen at a low concentration], which for an initial read is okay. Most importantly, it wasn't toxic" to cell cultures, Lee explained.

Mike Wolf, a grad student in the lab, wanted to make sure the compound was specific to Nipah, so he screened it against VSV. When the inhibition curves came back identical, he originally was disappointed because the study's funding was based on exploring potential therapeutics for Nipah.

Lee, however, encouraged him to be more persistent, and curious. After a series of studies confirmed the activity and lack of toxicity, Lee sent double-blinded samples of the compound and control to a colleague at the BSL-4 lab at the University of Texas Medical Branch at Galveston who tested it against Nipah, Ebola and other viruses. They were shocked when LJ001 inhibited viral entry to all of them.

So Lee pitted it against HIV, a pathogen he had worked with extensively&mdashit worked there, too. "That didn't make any sense at all to a virologist, because retroviruses have nothing to do with these negative-strand RNA viruses" like Nipah and Ebola, he says.

"We started going through a list of 20-plus viruses," and it inhibited entry of all of them. "I had no idea of what was going on, I couldn&rsquot find anything common about them." Finally, when he ran the compound against adenovirus, it came back negative. Only then did he recognize the commonality: LJ001 worked against lipid envelope viruses only. It took a few years to rule out possibilities that the compound might be inhibiting the binding or fusion processes by which such viruses enter cells.

Lee demonstrated that the compound binds to lipids in the envelope of both the virus and the invaded cell. Eventually he came to realize that it causes damage to both organisms. The difference is that the larger cell is equipped to repair all sorts of regularly occurring insults. The more primitive virus, however, carries no repair mechanisms a new virion (complete virus) acquires lipids for its envelope by literally ripping them off of the cellular membrane as it buds off from the infected cell. Once the viral lipids were disabled by LJ001 they stayed that way.

Current antiviral drugs target encoded proteins essential to the viral life cycle, and which vary so much among virus types that a specifically tailored drug seldom is effective against more than one of them. Furthermore, active processes allow viruses to inevitably develop resistance to such compounds. To compensate for this shortcoming, combination therapy attempts to hit a virus at so many places simultaneously that it cannot develop resistance to them all.

But viruses do not have genetic control of their lipids like they do with proteins. So, Lee is optimistic about the potential for resistance to drugs like LJ001. He says, "I can't imagine how the virus can develop resistance to it."

When U.C.L.A. lawyers searched the patent database, they found that a company already had filed a patent on LJ001 claiming antiviral activity but describing little else. Lee is not concerned his colleague Michael Jung, a medicinal chemist at U.C.L.A., had tinkered with the original compound and found a series of variations that are 100-fold more potent. The university is filing claim to those.

Lee says it is important to demonstrate in vivo efficacy of these compounds. He is working to try to overcome a few barriers they have identified, and he readily concedes that it will take teams of experts with specialized knowledge to bring a product to market. His primary focus is on basic research, and he already is thinking about those next challenges.

Warner Greene, director of the Gladstone Institute of Virology and Immunology at the University of California, San Francisco, congratulated Lee and his collaborators on "a fascinating piece of work on an unexpected finding." But, he cautions, "from a therapeutic point of view it is a very, very early finding."

"The breadth of antiviral activity is fascinating but I fear that with the underlying mechanism of membrane disruption, there might be a lot more toxicity than is currently appreciated. Primary cells often are much more sensitive than laboratory-adapted cells," Greene says.

He adds: "With this type of drug you are always going to be operating in a window of whether or not the cell can catch up and keep the cell alive while the drug is still being effective against the virus. It will be a race." That is the same principle behind many current therapies for cancer.


Lipid Rafts

Lipid rafts are highly dynamic structures that can play a key role in pathogens�ll interactions, including coronaviruses–host cell (Carotenuto et al., 2020 Fecchi et al., 2020).

Lipid rafts are functional membrane microdomains that contain sphingolipids and cholesterol. These regions are characterized by a highly ordered and tightly packed lipid molecules compared to the surrounding bilayer (Simons and Ikonen, 1997 Wang and Silvius, 2001). It has been estimated that the size of lipid raft is around 10� nm (Pralle et al., 2000) in a dynamic conformation, since they can combine to form larger raft domains.

Domain properties such as composition, size, and lifetimes have been thoroughly investigated (Levental and Veatch, 2016 Sezgin et al., 2017 Levental et al., 2020). The distribution of lipid rafts in cell membranes can vary greatly, from small isolated domains to larger coalescing rafts, depending on a variety of factors, including cell type, specific condition, and type of membrane (e.g., plasma membrane or intracellular membrane). Thus, lipids rafts can be considered like nanodomains enriched in the plasma membrane that can coalesce, forming microdomains platforms for proper cell functioning.

The advancement of technology made it possible to exploit some crucial characteristics of lipid rafts. In fact, since lipid rafts are relatively resistant to non-ionic detergents, such as Triton X-100 (Brown and London, 1998, Raggi et al., 2019), and they are present in low-density fractions after density centrifugation, many authors refer to lipid rafts also as glycolipid enriched and insoluble or detergent-resistant membrane complexes (DRMs) (Simons and Ikonen, 1997).

These characteristics of lipid domains are mainly related to their cholesterol content. In fact, it has been shown that cholesterol sequestering agents selectively destroy rafts. Thus, the use of cholesterol sequestering molecules is a useful tool for identifying proteins as components of the lipid raft or simply copurified contaminants (Foster, 2009), as well as for determining the role of rafts in modulating cellular processes (Mattei et al., 2015 Martellucci et al., 2019).

Noteworthy, these lipid domains show a peculiar fluidity, which allow lateral assembly and rapid reorganization upon diverse biological stimuli. Some molecules associate/dissociate from rafts in a regulated manner depending on their state of activation. These clusters allow the formation of highly efficient lipid–protein molecular associations that operate in several important cellular processes, including membrane trafficking, cell signaling, cell migration, and axonal guidance (Lingwood and Simons, 2010 Sezgin et al., 2017). This structure can concentrate membrane-associated proteins as receptors and molecules involved in signaling pathways (Levental et al., 2010 Martellucci et al., 2018 Mattei et al., 2020 Riitano et al., 2020). Of interest, in polarized cells, lipid rafts show a characteristic sorting on apical surface able to segregate distinct functional proteins, whereas in non-polarized cells, they are distributed randomly on the cell surface.

Lipid rafts play important roles in innate and adaptive immunity in T lymphocytes, rafts are enriched in many receptors and signaling molecules and participate in T-cell receptor (TCR) triggering and T-cell activation (Varshney et al., 2016 Robinson et al., 2017 Nakayama et al., 2018).

Thus, lipid rafts are thought to function as platforms that recruit specific proteins or concentrate some specific components and exclude others (Wang and Silvius, 2001 Pizzo and Viola, 2004 Pizzo et al., 2004), thus initiating and controlling cell signaling (Simons and Ikonen, 1997 Barbat et al., 2007). Lipid rafts have been proposed to mediate multiple stages of apoptosis (Sorice et al., 2012), including the recruitment of the different key molecules involved in the process, including Fas and the tumor necrosis factor receptor (TNF-α-R) (Garcia-Ruiz et al., 2002 Legler et al., 2003), as well as protein recruitment of the Bcl-2 proapoptotic family, including truncated Bid, t-Bid, and Bax, following the trigger of Fas (Scheel-Toellner et al., 2002).

Lipid rafts are not merely confined to the plasma membrane. In fact, as reported by numerous studies, lipid microdomains are formed similarly in the subcellular organelles, such as Golgi, ER, or mitochondria, termed as raft-like microdomains (Garofalo et al., 2005). In particular, functional studies suggest that mitochondrial lipid microdomains participate in the mitochondrial network of fusion and fission during remodeling, as well as in the regulation of cell fate, i.e., survival or death through activation of intracellular signaling (Ciarlo et al., 2010, 2018 Matarrese et al., 2014 Garofalo et al., 2018). Interesting emerging data establish that the interaction of the ER with the mitochondria occurs through endoplasmic reticulum (ER)–mitochondria-associated membrane (MAM) subdomains, and this interaction allows the membrane scrambling, contributing to the multiple functions of ER (Raturi and Simmen, 2013). Since some components of lipid microdomains are present within MAM subdomains (Sano et al., 2009 Garofalo et al., 2016), several authors assume a key role of these subdomains in regulating and influencing a variety of cellular activities (Annunziata et al., 2018), including the early stages of autophagosome formation in mammalian cells (Hamasaki et al., 2013 Garofalo et al., 2016). They are also enriched in caveolin-1 (Sala-Vila et al., 2016), lipid synthesis enzymes (Vance, 1990 Vance et al., 1997), and cholesterol (Area-Gomez et al., 2012 Fujimoto et al., 2012). This particularity suggests that these areas act as non-vesicular lipid transfer sites between ER and mitochondria. In recent years, it has become evident that a complex network of lipid–lipid and lipid–protein interactions contributes to protein sorting and intracellular transport. The hypothesis that the Golgi system sorts the proteins and sends them to the plasma membrane through preferential membrane sites such as lipid rafts, dates back to 1988 (van Meer and Simons, 1988). Moreover, host lipid rafts have been reported to be critically involved in apical targeting, assembly, and virus budding. In this case, the subcellular distribution of lipid raft on internal membranes, including the Golgi apparatus or the ER, has a significant impact in the sorting of proteins and in the trafficking and overall exocytosis of viral proteins, which constitute fundamental steps to support viral infection (Takeda et al., 2003 Von Blume and Hausser, 2019 Stalder and Gershlick, 2020).

Furthermore, at the cellular level, rafts and related membrane microdomains, such as caveolae, characterized by a high expression of caveolin-1, have been proposed to play important roles in the sorting of membrane and non-membrane molecules (Browne and London, 2000 Parton and Richards, 2003). In fact, the study of caveolar platform has been proposed as a potential target to inhibit the entry of SARS-CoV-2 (Filippini and Dɺlessio, 2020).

Functionally, lipid rafts host exo-/endocytosis molecular apparatuses that form the functional communication platforms inside and outside the cell (Manes et al., 2003). Thermodynamically, it would be energetically challenging due to the stiff and efficiently packed nature of lipid rafts owing to the fact that fusion mechanism involves processes like membrane bending and non-bilayer lipid intermediates, requiring substantial flexibility of membrane structures (Dadhich and Kapoor, 2020). Thus, Yang et al. (2015) proposed the role of the edges of raft domains, rather than the bulk region, as the preferred sites for fusion. Later on, they verified the mechanisms of fusion to be driven by the effect of hydrophobic mismatch at the edges of raft and not raft (liquid ordered–liquid disordered) domains. Although we cannot refer to the lipid raft as an area dedicated to endocytosis, however, many endocytic (and exocytic) mechanisms involve the lipid rafts to some extent (Pelkmans and Helenius, 2002). Many viruses, including SARS-Cov-2, can enter into the host cells by receptor-dependent endocytosis. One of the best characterized pathways is the clathrin-dependent one, based on viral entry and translocation into endosomes where they are degraded or recycled (Wang et al., 2019). Alternatively, a caveolae-dependent pathway may be used. Caveolae are small invaginations of the plasma membrane that are composed of cholesterol, glycosphingolipids, and caveolin (Filippini and Dɺlessio, 2020). Caveolin is able to oligomerize, leading to the formation of caveolin-rich microdomains in the plasma membrane, and subsequently, the caveolar vesicles may fuse with the early endosomal compartment. For instance, coronavirus infection may employ distinct endocytic pathways in the upper and lower respiratory tract related to different signaling molecules. Indeed, a large GTPase, dynamin, which is required for endocytosis, is abundant in the nasal epithelium but undetectable in pneumocytes (Glebov, 2020).

Lipid rafts have been shown to be exploited by intracellular pathogens at different times of the infectious process, as a gateway to the cell. Indeed, many steps of pathogen interaction with host cells, and sometimes all steps within the entire lifecycle of various pathogens, rely on host lipid rafts (Bukrinsky et al., 2020). In addition, the activation of the innate and acquired immune responses by the hosts is regulated by the rafts in many crucial steps in this regard, some pathogens have the ability to shut down the immunological response by altering the cholesterol content of the lipid raft (immune evasion) (Mackenzie and Khromykh, 2007 and Sen et al., 2011). Possibly, a similar strategy could be shared by SARS-CoV2.


A membrane-bound vesicle that is formed by the invagination of the plasma membrane during endocytosis.

A clathrin structure that consists of three heavy chains and three light chains that weave together to form three 'legs' radiating from a central point. The heavy chains form the backbone whereas the light chains are involved in the formation of clathrin lattices.

A drug that is designed to release the active moiety only upon certain activating conditions.

Transition state inhibitor

Inhibitors that are designed to mimic the transition state of a substrate molecule in the enzyme–substrate catalytic reaction. Such inhibitors do not undergo catalysis and inhibit the enzyme at the substrate-binding site.

The extent to and rate at which the drug enters the systemic circulation.

(siRNA). Small stretches of RNA, usually 21–25 nucleotides long, that bind to mRNA and target it for degradation, thereby silencing gene expression.

A form of molecular oxygen that is a reactive oxygen species and less stable than the normal triplet oxygen.

A semi-permeable cellular structure consisting of endothelial cells that allows selective passage of some molecules but prevents the passage of others.



Şərhlər:

  1. Ordland

    Üzr istəyirəm, amma mənim fikrimcə, səhv edirsən. Mən əminəm. Müzakirə etməliyik. PM-də mənə yazın, danışın.

  2. Hrycg

    Bağışlayın, bu cümləni başqa yerə köçürdüm

  3. Negal

    Demək istəyirəm ki, səhvə icazə verirsiniz. Bunu müzakirə etməyi təklif edirəm.

  4. Jurrien

    Vacib cavab :)

  5. Cofahealh

    Dəqiq mesajlar

  6. Pranav

    me nra) yaxşı fikirdir.

  7. Benoni

    Agree, your idea is simply excellent



Mesaj yazmaq