Məlumat

C. elegans üçün ağar və ya maye kulturaya xolesterol əlavə etmək vacibdirmi?

C. elegans üçün ağar və ya maye kulturaya xolesterol əlavə etmək vacibdirmi?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

NGM ilə agar plitələrinin, həmçinin c elegans yetişdirilməsi üçün maye kulturaların hazırlanmasında xolesterin və ağır metalların əlavə edilməsi nə dərəcədə vacibdir? Hər ikisini hazırlamışam. Mən heç bir açıq fərq görmürəm və bütün bu əlavələri əlavə etməkdən nifrət edirəm.

Əsasın əsas komponentləri kimi maya ekstraktı və peptonu istifadə edirəm.

Bu, sadəcə olaraq onların ətrafında sürünməsi üçün nəmli yarı yumşaq substrat olmalı deyilmi, onların qidaları yedikləri bakteriyalardan gəlir.


C. elegans xolesterinə ehtiyacı var, amma bunu edə bilmir. Bakteriyalar da xolesterol yaratmadığı üçün qida bakteriyaları mənbə deyil. Əlaqədar məqalədə izah edildiyi kimi, xolesterolun olmaması normal inkişafa təsir göstərir.


Nematod tutma göbələklərinin laboratoriyada saxlanması və kulturasiyası Arthrobotrys oligospora

Nematod tutan göbələklər (NTF) və nematodlar təbiətdə ümumi və simpatikdir. Bu krallıqlararası yırtıcı və yırtıcı qarşılıqlı əlaqənin əsasını təşkil edən molekulyar əsas, əsasən, qeyri-səciyyəvi olaraq qalır. Həm NTF, həm də nematodlar torpaq nümunələrindən asanlıqla təcrid oluna bilər. NTF qida ilə zəngin mühitlərdə tələlər əmələ gətirmir, lakin tələlərin morfogenezi qida çatışmazlığı şəraitində və nematod siqnallarının eyni vaxtda aşkarlanması zamanı müşahidə edilə bilər. Burada NTF modelinin laboratoriyada saxlanması və kultivasiyası üçün protokolları təqdim edirik Arthrobotrys oligospora. © 2021 Wiley Periodicals MMC.

Əsas Protokol 1: Bərk mühitdə nematod tutan göbələklərin böyüməsi

Əsas Protokol 2: Maye mühitdə nematod tutan göbələklərin böyüməsi

Əsas Protokol 3: Bərk mühitdən konidiyaların toplanması

Dəstək Protokolu 1: Miracloth filter hunisinin hazırlanması

Əsas Protokol 4: Tələ morfogenezinin induksiyası

Alternativ Protokol: Tələ induksiyasının kəmiyyət ölçülməsi

Dəstək Protokolu 2: Sinxronizasiyanın hazırlanması C. elegans L4

Əsas Protokol 5: yaradılması C. elegans məruz qaldıqda sağ qalma dərəcəsi A. oliqospora

Əsas Protokol 6: Nematod tutan göbələk suşlarının saxlanması


GİRİŞ

Sterollər eukaryotik hüceyrənin plazma membranının mühüm tərkib hissəsidir. Əsasən heyvan hüceyrələrində olan xolesterin, lipid qatının keçiricilik maneə xüsusiyyətlərinə və axıcılığına təsir göstərir. Son illərdə toplanmış məlumatlar göstərir ki, xolesterin təkcə membranı daha az maye edən membranın struktur komponenti deyil, həm də hüceyrə siqnalının modulyasiyasında fəal iştirak edir. Bu modulyasiyanın plazma membranındakı xolesterol və qlikosfinqolipidlə zənginləşdirilmiş mikrodomenlər vasitəsilə baş verdiyi güman edilir ki, bu da tez-tez qlikolipidlə zənginləşdirilmiş membranlar (GEM) və ya “sallar” adlanır (Simons və Ikonen, 1997). Bu xüsusi sahələr xolesterolun təşkiledici rol oynadığı xüsusi lipidlərin və zülalların yanal birliyi kimi nəzərdə tutulur. Bununla belə, ixtisaslaşmış lipid domenləri haqqında məlumatların əksəriyyəti model membran sistemlərində (Brown və London, 2000) və toxuma mədəniyyəti hüceyrələrində (Mukherjee və Maxfield, 2000) tədqiqatlardan əldə edilir. Bu araşdırmada biz xolesterinin canlı orqanizmdə, nematodda oynadığı rolları araşdırdıq C. elegans. Genetikanın gücü və onun bütün genom ardıcıllığının mövcudluğu bu orqanizmi bir çox bioloji prosesləri öyrənmək üçün əla model edir. Sterol trafikini və onun bioloji rollarını anlamaq üçün ilk addım olaraq Caenorhabditis elegans, canlı qurdlarda sterolun paylanmasını və daşınmasını araşdırdıq.

İstifadəsinin əsas üstünlüklərindən biri C. elegans model sistem kimi, nematodların sterollar üçün auksotrofik olmasıdır, çünki onlar de novo sterol biosintezi üçün lazım olan fermentlərə malik deyillər (Hieb və Rothstein, 1968 Chitwood və Lusby, 1991). Torpaq qurdu üçün sterolların əsas mənbələri C. elegans heyvan nəcisi və ya maya/bitki qalıqlarıdır. C. elegans mütəmadi olaraq laboratoriyada xolesterin olan agar lövhələrində çoxaldılır. Beləliklə, canlı orqanizmdə sterolların paylanmasını və funksiyasını araşdırmaq üçün orqanizmin sterollarını flüoresan və ya fotokimyəvi reaktiv analoqlarla əvəz etmək olar.

İçindəki xolesterin C. elegans ehtimal ki, digər heyvan hüceyrələrinə bənzər plazma membranının struktur və funksional təşkilində iştirak edir. Xolesterolu tükənmiş lövhələrdə böyüyən qurdlar ərimə qüsurlarını göstərir (Yochem və b., 1999). Xolesterolu onun qeyri-funksional analoqu 25-azakoprostan ilə əvəz edərsə, heyvanların böyüməsi və çoxalması güclü şəkildə maneə törədir (Chitwood) və b., 1984 Bottjer və b., 1985). Son zamanlar funksiyasını araşdırarkən a C. elegans caveolinin homoloqu olaraq, cinsiyyət vəzilərindəki xolesterol səviyyəsinin siqnal ötürülməsinə təsir etdiyini gördük (Scheel və b., 1999). Xüsusilə, xolesterolun azalması pakiten həbsindən çıxış yolu ilə meiotik hüceyrə dövrünün irəliləməsinin sürətlənməsinə səbəb oldu. Bu prosesin Ras/MAP-kinaz yolu ilə tənzimləndiyi məlumdur (Kilsəvə b., 1995).

Sterolların qurd üçün həyati əhəmiyyətinə baxmayaraq, xolesterolun paylanması və onun daşınmasının molekulyar mexanizmləri zəif başa düşülür. Sterollərin qəbul edilib-edilmədiyi belə aydın deyilC. elegans həzm sistemi və ya cuticle vasitəsilə. Yetkin qurdların və ya embrionların müxtəlif orqanlarına xolesterolun daşınmasında iştirak edən molekullar haqqında çox az şey məlumdur. Xolesterolun udulması üçün əvvəllər müəyyən edilmiş namizədlərdən biri aşağı sıxlıqlı lipoprotein (LDL)-reseptor super ailəsinin (Yochem) üzvü olan gp330/meqalin homoloqudur. və b., 1999). Bununla belə, onun hipodermisin apikal səthində eksklüziv lokalizasiyası bu reseptorun bağırsaq tərəfindən xolesterolun qəbulunda iştirakını şübhə altına alır. Maraqlıdır ki, CHE-14, ektodermal hüceyrələrin (Michaux) apikal tərəfində lokallaşdırılmış, yaxınlarda təsvir edilmiş başqa bir potensial xolesterol bağlayıcı zülaldır. və b., 2000).

Xolesterolun paylanması və daşınması ilə bağlı məlumatların azlığının səbəblərindən biri xolesterolun görüntülənməsi və ya xolesterol bağlayan zülalların müəyyən edilməsi üçün metodların olmamasıdır. Son vaxtlara qədər yalnız dolayı üsullar mövcud idi (Liscum və Dahl, 1992 Liscum və Munn, 1999). Optik şəffaflıq C. elegans bütöv bir orqanizmdə flüoresan görüntüləmə və fotoaffinlik etiketləmə yanaşmalarını tətbiq etmək üçün unikal imkan verir. Bununla belə, canlı hüceyrələrdə bioloji sterolların təsviri xolesterolun biofiziki və bioloji xassələrini təqlid edən uyğun flüoresan zond olmadığından son vaxtlara qədər mümkün deyildi. Dehidroerqosterol (DHE, Şəkil 1A) xolesterolun təbii olaraq meydana gələn flüoresan analoqudur və onun bir çox xüsusiyyətlərini təqlid edir (Schroeder). və b., 1991, 1995), lakin o, ümumiyyətlə mikroskopik görüntüləmə üçün faydalı deyildi, çünki o, uzaq UV bölgəsində udulur və spektrin yaxın UV bölgəsində yayır. Yalnız bu yaxınlarda, ultrabənövşəyi diapazonda yüksək effektivliyə, eləcə də mikroskopun müxtəlif optik komponentlərinin yüksək UV keçiriciliyinə malik kameranın istifadəsi ilə DHE-ni təsvir etmək və beləliklə, canlı mədəni hüceyrələrdə sterolun paylanmasını aşkar etmək mümkün olmuşdur (Mukherjee). və b., 1999). Bunun əksinə olaraq, xolesterolun flüoresan törəməsi olan 25-NBD-xolesterol ilə hüceyrələrin etiketlənməsi DHE ilə etiketlənmədən, o cümlədən sterolun aşağı səviyyədə olduğu bilinən nüvə zərfi kimi orqanoidlərin etiketlənməsindən kəskin şəkildə fərqlənirdi. Floresan xolesterolu bağlayan polien antibiotik filipin, DHE (Mukherjee) ilə müqayisədə hüceyrələrin kəmiyyətcə fərqli etiketlənməsinə baxmayaraq oxşar verdi. və b., 1999). İlkin təcrübələrimizdə filipin dilinin yaşayış sahəsində tədqiqatlar üçün tətbiq edildiyini tapdıq C. elegans bu reagentin qurdun daxili orqanlarına nüfuz etmə qabiliyyətinin zəif olması səbəbindən mürəkkəbdir. Üstəlik, filipin emissiya spektri bölgəsində qurdun avtoflüoresansı çox yüksəkdir, bu da parçalanmış heyvanlarda aşkarlanmasını demək olar ki, qeyri-mümkün edir.

Şəkil 1. DHE və [3 H] fotoxolesterinin strukturları.

Xolesterol nəqlinin öyrənilməsində başqa bir irəliləyiş bioloji aktiv, fotoaktivləşə bilən xolesterin analoqu [3 H] fotoxolesterinin son sintezindən əldə edilmişdir (Şəkil 1A). Bu analoq in vivo olaraq xolesterolu bağlayan zülalları müəyyən etməyə imkan verdi (Thiele və b., 2000).

Bu işdə biz qurdda sterolun paylanmasını araşdırmaq və onun daşınmasında iştirak edən molekulları müəyyən etmək üçün DHE və [3 H] fotoxolesterindən istifadə etdik. Biz göstəririk ki, filipin və ya 25-NBD-xolesteroldan fərqli olaraq, DHE xüsusi olaraq qurdun müəyyən toxumalarında toplanır. İki əsas toplanma yeri oositlər və inkişaf edən spermadır. [3 H] fotoxolesterinin istifadəsi ilə biz vitellogeninləri xolesterinin qarşılıqlı təsir ortaqları kimi müəyyən etdik və aşkar etdik ki,rme-2 vitellogenin reseptoru olmayan qurdlar (Grant və Hirsh, 1999), oositlərdə və embrionlarda DHE toplaya bilmir. Çünki vitellogeninlər məməli apolipoprotein B-100 ilə homologiyaya malikdir (Baker, 1988 Spieth) və b., 1991) və vitellogenin reseptoru, RME-2, LDL reseptorları super ailəsinin üzvüdür (Grant və Hirsh, 1999), vitellogeninlər və onların reseptorları LDL-nin və onun reseptorunun daha yüksək orqanizmlərdə təkamül sələfləri kimi qəbul edilə bilər. Fotokross-bağlama yanaşması həmçinin hermafroditlərdə və kişilərdə xolesterini bağlayan 37 kDa zülalın müəyyən edilməsinə səbəb olmuşdur.


Alternativ Protokol 1

Mikroinyeksiya unc-42 rde-1 Heyvanlar Zigotik RNTi Fenotiplərini Tədqiq etmək üçün N2 Erkəklərə keçdilər

Mikroinyeksiya yolu ilə RNTİ (bax. Əsas Protokol 1) embrionun tutulması ilə nəticələnirsə, bu, hədəflənmiş gen üçün ana funksiyasını əks etdirə bilər. Hədəflənmiş genin zigotik fəaliyyəti dsRNT-nin RNT defisitinə yeridilməsi ilə yoxlanıla bilər (rde mutant) hermafrodit vəhşi tipli N2 erkəklə cütləşmişdir (şək. 26.3.4). Bu ssenaridə hədəf genin ana fəaliyyətinə təsir etməyəcək, çünki RNTİ funksional deyil. rde mutant hermafrodit. Bununla birlikdə, vəhşi tip kişilərlə müvəffəqiyyətlə cütləşir rde mutant hermafrodit çarpaz nəsildə RNT fəaliyyətini təmin edəcək və bununla da hədəflənmiş genin zigotik ifadəsini susduracaq. identifikasiyasını asanlaşdırmaq üçün rde/+ çarpaz nəsil, an rde resessiv görünən mutasiya ilə qeyd olunan mutant, məsələn, koordinasiya olunmamış (Unc) N2 erkəklərlə cütləşir, dsRNA yeridilir və qeyri-Unc çarpaz nəsil, hədəflənmiş zigotik aktivliyin itirilməsi nəticəsində fenotiplər üçün araşdırılır. gen.

Zigotik RNT prosedurunun sxemi.

Əlavə materiallar (həmçinin Əsas Protokol 1-ə baxın)

unc-42 rde-1 C. elegans (WM36 CGC)

Ötürülməsi və yayılması (bax. Dəstək Protokolu 1) və cütləşmə üçün əlavə reagentlər və avadanlıqlar C. elegans

Yoldaş vəhşi tip (N2) C. elegans ilə kişilər unc-42 rde-1 bir gecədə mutant gərginliyi (bax. Support Protocol 2 Hope, 1999).

Cütlənmiş Unc hermafroditlərinə dsRNA yeridin (bax. Əsas Protokol 1).

Hər bir enjekte edilmiş hermafroditi bərpa etmək (yəni, 20°C-də inkubasiya etmək) və cütləşməyə davam etmək üçün (bax. Dəstək Protokolu 1) erkəklərlə fərdi cütləşmə lövhələrinə köçürün (bax. Dəstək Protokolu 2).

Hermafroditi təkbaşına təzə NGM boşqabına köçürün və yuxarıda təsvir olunduğu kimi RNTİ fenotipləri üçün qeyri-Unc çarpaz nəsil hesab edin.


C. elegans-da becərmə-temperaturdan asılı soyuq alışqanlığın öyrənilməsi üçün soyuğa dözümlülük analizi

Temperatur orqanizmlərdəki biokimyəvi proseslərə birbaşa təsir edən kritik və davamlı ekoloji amildir. Heyvanlar bir sıra mexanizmlərdən istifadə edərək ətraf mühitin temperaturunun dəyişməsinə alışa bilərlər. Temperaturun alışması mexanizmlərini araşdırmaq üçün biz Caenorhabditis elegans nematodlarını 2°C temperatura məruz qoyduq ki, bu da onların normal böyümə temperaturundan (təxminən 10-28°C) xeyli soyuqdur və bu soyuq şokdan sağalma zamanı onların sağ qalma dərəcəsini qiymətləndirdik. Soyuq şokdan sonra sağ qalma nisbəti 15°C və 25°C-də böyüyən heyvanlar arasında fərqli idi və bu, C. elegans-ın temperatura alışma ilə əlaqəli soyuq dözümlülük nümayiş etdirdiyini göstərir. Burada iki protokolu ətraflı şəkildə göstəririk: sabit temperaturda becərildikdən sonra standart soyuğa dözümlülük testi və çox pilləli temperatur dəyişikliyi ilə soyuq tolerantlıq testi. (T.U. və A.O. bu işə bərabər töhfə verdilər.)

Giriş

Canlı orqanizmlərin məruz qaldığı ətraf mühit şəraiti daim dəyişə bilər. Buna görə də, heyvanlar fiziki və ya davranış fəaliyyətlərini bu cür dəyişikliklərə uyğunlaşdıran müxtəlif mexanizmlərə malikdirlər. Temperatur orqanizmlərdə birbaşa biokimyəvi dəyişikliklərə səbəb olur və onların yaşaması üçün kritik amildir. Caenorhabditis elegans nematodu temperatura cavab verən hadisələr nümayiş etdirir. Dauer sürfələrinin və termotaksisin induksiyası yüksək temperatur 1,2,3-ə məlum cavablardır, lakin C. elegans-ın soyuq temperatura necə alışması yaxşı başa düşülmür. C. elegans 10°C-dən aşağı temperaturda çoxalmaq iqtidarında deyil, lakin əvvəlki hesabatlarda bu növdə soyuq dözümlülüyün mövcudluğu təklif edilirdi. 2-4°C temperaturda bir neçə saat sağ qalmağa imkan verən soyuğa dözümlülük fosfolipidlərin doyması və yaşlanma yolu 4,5 ilə tənzimlənir. Xiao və digərləri mədəniyyət temperaturunun soyuğa həssas TRPA-1-nöqsanlı mutantların uzunömürlülüyünə təsir etdiyini bildirdilər 6. Bu yaxınlarda biz işıq və feromonu hiss edən ASJ neyronlarının temperaturu aşkar etdiyini və insulin siqnalı vasitəsilə soyuq tolerantlığı idarə etdiyini bildirdi 7. Bu o deməkdir ki, bir cüt sensor neyron digər toxumalarda soyuq temperatur müqavimətini artırır. Burada əvvəlki temperatur təcrübəsindən sonra soyuq dözümlülük üzrə analizimizi təqdim edirik.

Müəyyən edilmiş soyuq dözümlülük vəziyyəti yeni temperaturda üç və ya daha çox saat inkubasiya ərzində dəyişdirilə bilər ki, bu da becərmə temperaturunun haradasa saxlandığını və yeni təcrübədən sonra bir neçə saat ərzində dəyişdirilə biləcəyini göstərir 7. Burada biz həmçinin becərmə temperaturumuzu təsvir edirik. - dəyişdirilmiş soyuğa dözümlülük testi.

Materiallar

  1. E. coli (OP-50) ilə səpilmiş nematod inkişaf mühiti (NGM)
    • NGM-ni Brenner tərəfindən hazırlanmış orijinal protokola əsasən, aşağıdakı kimi bəzi dəyişikliklər 8, 9 ilə etdik.
    • 3 q NaCl, 20 q agar (İna, Yaponiya), 2,5 q Bacto Peptone (BD Falcon) və 975 ml H2O qarışdırıcı çubuğu olan Erlenmeyer kolbasında qarışdırın və 40 dəqiqə avtoklavda saxlayın. Avtoklavlanmış mühiti qarışdırmaqla 50°C-yə qədər soyudun, sonra 1 ml MgSO4 (1 M), 1 ml CaCl2 (1 M), 25 ml kalium fosfat (1 M, pH 6,0) və 1 ml xolesterin (5 mq) əlavə edin. /ml etanolda). Steril avtomatik dispenserlə 60 mm diametrli petri qablarını və ya 6 ml-dən 35 mm diametrə qədər petri qablarını 14 ml mühitdən paylayın. Sonra toxum maye ilə becərilmiş E. coli OP-50-ni yaxşı bərkimiş mühitə köçürün.
  2. qurdlar
    • Yetkin heyvanlar yaxşı qidalanan şəraitdə yetişdirilirdi.

Avadanlıq

  1. İnkubatorlar
    • 15-25°C temperaturda qurd yetişdirmək üçün CRB-14A (Hitachi, Yaponiya) və ya FMU-2041 (Fukushima Industries Corp., Yaponiya) inkubator modellərindən istifadə etdik və CRB-41A və ya CRB-14A (Hitachi, Yaponiya) modelindən istifadə etdik. 2°C-də soyuq şok inkubasiyası üçün soyuducu.

Prosedur

Temperatur təcrübəsindən qaynaqlanan soyuğa dözümlülüyün təhlili (Şəkil 1, 2).

Şəkil 1: Temperatur təcrübəsindən qaynaqlanan soyuğa dözümlülüyün təhlili. Yumurta qoyduqdan sonra P0 heyvanlarını sınaq lövhəsindən çıxarın. Yumurtalar yetkinlik mərhələsinə çatana qədər sabit temperaturda kultivasiya edin, boşqab 48 saat ərzində 2°C mühitə köçürün. Sonra sağ qalma nisbətini hesablayın və onu vəhşi növlə müqayisə edin.

Şəkil 2: Soyuq şokdan sonra analiz lövhələrindəki heyvanlar. Bu şəkillər əvvəllər yumurtadan 15°C (a) və ya 25°C (b) temperaturda yetişdirilmiş vəhşi N2 növü üçün soyuq şok dövrünün sonunda (48 saat ərzində 2°C) sınaq lövhələrində heyvanları göstərir. yetkin.

  1. C. elegans-ı yaxşı qidalanan şəraitdə yetkinlərə yetişdirin. Aşağıdakı prosedurda analiz lövhələri olan 60 mm diametrli lövhələrdə NGM-ə iki yetkin nematodu (P0) qoyun.
  2. P0 yetkinləri təxminən 100 yumurta qoyana qədər hər bir eksperimental temperaturda 8-12 saat ərzində analiz lövhələrini inkubasiya edin.
  3. Nematodların mərhələlərini sinxronlaşdırmaq üçün bütün P0 yetkinlərini çıxarın
  4. Nəsil öz temperaturlarında yetkinlik mərhələsinə çatana qədər analiz lövhələrini inkubasiya edin, məsələn:
    • 15°C, 144-150 saat kultivasiya edin
    • 20°C, 85-90 saat kultivasiya edin
    • 25°C, 60-65 saat kultivasiya edin
  5. Tamamilə yetişmiş, lakin köhnə olmayan yetkin heyvanları olan analiz lövhələrini birbaşa buzun üzərinə 20 dəqiqə qoyun. Nəzərə alın ki, analiz plitələri Parafilm tərəfindən agar diblərinin yalnız yarısı buzla təmasda olmaqla möhürlənməlidir.
  6. Təhlil lövhələrini qapaqlı plastik qaba qoyun və 2°C-də soyuducuya köçürün.
  7. Təhlil lövhələrini 2°C-də 48 saat inkubasiya edin.
  8. Test lövhələrini gecə boyu 15°C-də saxlayın.
  9. Ölü və diri yetkin heyvanların sayını hesablayın və sağ qalma nisbətini hesablayın.
    • Hər bir ştam üçün ən azı doqquz analiz (1-dən 9-a qədər) aparılır. Doqquzdan çox analiz plitələrindən alınan məlumatlar üçün orta sağ qalma nisbətlərini və ortalamanın standart xətasını (SEM) hesablayın.
    • Mutantların böyümə sürətləri vəhşi növlərdən daha yavaş və ya daha sürətli olarsa, vəhşi növlər və mutantların soyuq təsirlərinin başlanğıcını sinxronlaşdırmaq üçün yumurtlama gününü dəyişdirin (2-ci addım).
    • Əgər mutantlar konstitutiv dauer əmələ gətirən fenotipə (daf-c) malikdirlərsə, onları yumurtadan L4 sürfələrinə qədər 15°C temperaturda kultivasiya edin və sonra soyuq şokdan əvvəl onları müəyyən edilmiş temperaturda (20°C və ya 25°C) bir gecədə becərin.

Becərmə temperaturu dəyişmiş soyuğa dözümlülük testi

Bu analizdə heyvanlar bir temperaturda yumurtadan gənc yetkinlərə və ya L4 sürfələrinə qədər becərilir və sonra soyuq şokdan bir neçə saat əvvəl ikinci temperaturda becərilir.

  1. C. elegans-ı yaxşı qidalanan şəraitdə yetkinlərə yetişdirin. İki yetkin heyvanı (P0) NGM-ə 60 mm diametrli lövhələrdə yerləşdirin, bunlar aşağıdakı prosedurda analiz lövhələridir. Bir analiz üçün eyni ştamın üç analiz lövhəsi istifadə olunur.
  2. P0 yetkinləri təxminən 100 yumurta qoyana qədər analiz lövhələrini ilk temperaturda 8-12 saat inkubasiya edin.
  3. Nematodların mərhələlərini sinxronlaşdırmaq üçün bütün P0 böyükləri çıxarın.
  4. İlk temperaturda nəsil gənc yetkinlərə və ya yetkinlərə çevrilənə qədər analiz lövhələrini inkubasiya edin, məsələn:
    • 15°C, 132-150 saat kultivasiya edin
    • 20°C, 72-90 saat kultivasiya edin
    • 25°C, 52-65 saat kultivasiya edin
      • Əgər 5-ci addım 20°C-dən yuxarı 18 saat inkubasiyanı nəzərdə tutursa, heyvanlar L4 sürfələri olduqda bu mərhələyə keçmək yaxşıdır.
  5. Təhlil lövhələrini ikinci temperaturda saxlanılan başqa bir inkubatora köçürün və bir neçə saat inkubasiya edin (məsələn, 0, 3, 5, 8 və ya 18 saat).
  6. İkinci temperaturda inkubasiya edildikdən sonra analiz lövhələrini 20 dəqiqə buz üzərinə qoyun. Nəzərə alın ki, analiz lövhələri Parafilm tərəfindən ağar diblərinin yalnız yarısı buzla təmasda olmaqla bağlanmalıdır.
  7. Test lövhələrini qapaqlı plastik qaba qoyun və 2°C-də soyuducuya köçürün.
  8. Təhlil lövhələrini 2°C-də 48 saat inkubasiya edin.
  9. Test lövhələrini gecə boyu 15°C-də saxlayın.
  10. Ölü və diri yetkin heyvanların sayını hesablayın və sağ qalma nisbətini hesablayın.
    • Hər biri üç analiz lövhəsi ilə analizi üç dəfə təkrarlayın və doqquzdan çox analiz lövhəsindən alınan məlumatlar üçün orta sağ qalma dərəcələrini və ortalamanın standart xətasını (SEM) hesablayın.

Giderme

Soyuğa dözümlülük fenotipi rütubət və digər naməlum amillərdən ciddi şəkildə təsirlənir. Xüsusilə, bu təsirlər mövsüm dəyişikliyi zamanı müşahidə olunur. Yaponiyada bu fenotiplər yağışlı mövsümdə nəzərəçarpacaq dərəcədə dəyişir. Mutant ştammların soyuq dözümlülüyü dəyişdirilərsə, soyuq şokun temperaturu və ya soyuq şokun vaxtı dəyişdirilməlidir, məsələn, 2°C ilə 3.5°C və/və ya 24 saatdan 72 saata qədər.

35 mm diametrli NGM plitələrdən istifadə edilərsə, P0 yetkinləri tərəfindən qoyulan yumurtaların sayı 100-dən az və yumurta qoyma müddəti qısaldılmalı və ya hər bir analiz lövhəsi üçün P0 sayı azaldılmalıdır.

Temperatur sabitliyi inkubator və ya soyuducunun müxtəlif modelləri arasında əhəmiyyətli dərəcədə fərqlidir. Biz tez-tez HA-100K rəqəmsal termometrindən (Anritsum, Yaponiya) istifadə edərək inkubatorların və soyuducunun daxili temperaturuna nəzarət edirdik.

İstinadlar

  1. Golden, J. W. & amp Riddle, D. L. Caenorhabditis elegans dauer sürfələri: feromonun, qidanın və temperaturun inkişaf təsirləri. İnkişaf biologiyası 102, 368-378 (1984).
  2. Hedgecock, E. M. & Russell, R. L. Caenorhabditis elegans nematodunda normal və mutant termotaksis. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 4061-4065 (1975).
  3. Ohta, A. & amp Kuhara, A. Caenorhabditis elegansın temperatur cavab dövrəsində trimerik G zülalı ilə əlaqəli termosensasiya və sinaptik tənzimləmə üçün molekulyar mexanizm. Neyrologiya tədqiqatı 76, 119-124, doi:10.1016/j.neures.2013.03.008 (2013).
  4. Murray, P., Hayward, S. A., Govan, G. G., Gracey, A. Y. & Cossins, A. R. Caenorhabditis elegansda əldə edilmiş soyuq dözümlülüyün fosfolipid doyma hipotezinin açıq sınağı. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 5489-5494, doi:0609590104 [pii] 10.1073/pnas.0609590104 (2007).
  5. Savory, F. R., Sait, S. M. & Hope, I. A. DAF-16 və Delta9 desaturaz genləri uzunömürlü Caenorhabditis elegans 1 yaş mutantlarında soyuq dözümlülüyü təşviq edir. PLoS One 6, e24550, doi:10.1371/journal.pone.0024550 PONE-D-11-11397 pii.
  6. Xiao, R. et al. Genetik proqram termosensitiv TRP kanalı vasitəsilə soyuq temperaturda C. elegans uzunömürlülüyünü təşviq edir. Hüceyrə 152, 806-817, doi:10.1016/j.cell.2013.01.020 S0092-8674(13)00072-X pii.
  7. Ohta, A., Ujisawa, T., Sonoda, S. & Kuhara, A. İşıq və feromon hiss edən neyronlar Caenorhabditis elegans-da insulin siqnalı vasitəsilə soyuq alışqanlığı tənzimləyir. Təbiət rabitəsi 5, 4412, doi: 10.1038/ncomms5412 (2014). 8 Brenner, S. Caenorhabditis elegansın genetikası. Genetika 77, 71-94 (1974). 9 Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: C. elegans biologiyasının onlayn icmalı, 1-11, doi: 10.1895/wormbook.1.101.1 (2006).

Təşəkkürlər

Kuhara laboratoriyasının üzvlərinə eksperimentləri dəstəklədiklərinə və müzakirələri stimullaşdırdıqları üçün A.K. Narishige Zoologiya Elmi Mükafatı, Toray Elm Fondu, Sumitomo Fondu, Astellas Fondu, Senri Həyat Elmi Fondu, Shimadzu Fondu, Novartis Fondu, Mitsubishi Fondu, Naito Fondu, Casio Fondu, Araşdırma Opto-Elm və Texnologiya Fondu, Asahi Şüşə Fondu, Konan Universitetinin Hirao Taro Fondu, JSPS KAKENHI, Gənc Alimlər (A) üçün qrant yardımı və Çətin Kəşfiyyat Tədqiqatları üçün qrant və Qrant -Yaponiyanın Təhsil, Mədəniyyət, İdman, Elm və Texnologiya Nazirliyindən (MEXT) innovativ sahələr üzrə elmi tədqiqatlara yardım. A.O. Sasaqava Elm Fondu, Naito Fondu, Narishige Zoologiya Elmi Mükafatı və JSPS Təqaüdçüləri (KAKENHI), Yaponiya tərəfindən dəstəklənib.

Mənbə: Protokol mübadiləsi (2014). Əvvəlcə 8 sentyabr 2014-cü ildə onlayn yayımlandı


MÜZAKİRƏ

DHE və [3 H] Fotoxolesterin in vivo olaraq xolesterinin paylanmasını və daşınmasını öyrənmək üçün alət kimi

Canlı hüceyrələrdə və ya orqanizmlərdə xolesterinin qəbulu və paylanmasının tədqiqi böyük əhəmiyyət kəsb edir və C. eleganskimi tədqiqatlar üçün çox uyğundur. Kiçik və optik cəhətdən şəffafdır, bu da bütün orqanizmlərdə flüoresan görüntüləmə və ya fotoaffinlik etiketinin tətbiqini mümkün edir. Bundan əlavə, mutant suşları C. elegans sterol nəqlinin və tənzimlənməsinin molekulyar mexanizmlərini təsvir etmək üçün istifadə edilə bilər. Qeyri-invaziv təbiətinə görə DHE canlı orqanizmlərdə xolesterinin qəbulunu və paylanmasını izləmək qabiliyyətini təmin edir, halbuki [3H]fotoxolesterin xolesterol bağlayan zülalların müəyyən edilməsi üçün əla reagentdir. Hər ikisi məməli sistemlərində in vivo olaraq xolesterolu etibarlı şəkildə təqlid edir (Mukherjee və b., 1999 Thiele və b., 2000) və burada göstərildiyi kimi, onlar da böyüməsini və inkişafını dəstəkləyə bilər C. elegans digər sterol mənbələrinin olmaması.

Germ Line Hüceyrələrində Xolesterolun Zənginləşdirilməsi

Bizim in vivo DHE etiketləmə təcrübələrimiz göstərir ki, xolesterol yığılması ən çox farenks, sinir halqası, ifrazat vəzi hüceyrəsi, bağırsaq və mikrob xətti hüceyrələrində müşahidə olunur. Farenks və bağırsağın apikal səthinin DHE etiketlənməsi tamamilə DHE tərkibli qida ilə birbaşa əlaqə ilə izah edilə bilməz, çünki DHE ilə qidalanan analardan alınan L1 sürfələri, lakin DHE olmadıqda yumurtadan çıxaraq bağırsaqda güclü apikal DHE floresansı nümayiş etdirir. Əksinə, DHE nümunəsi bu membranlarda xolesterinin həqiqi zənginləşməsini göstərir. Farenksin və bağırsağın apikal səthində xolesterolun zənginləşdirilməsi onu sərt və ya lümendəki sərt ekoloji şəraitə davamlı etmək üçün lazım ola bilər. Bundan əlavə, məməli sistemlərində aparılan son tədqiqatlar epitel hüceyrələrinin mikrovillilərində xolesterinlə zəngin domenlərin əhəmiyyətini göstərir (Röper və b., 2000). Tamamilə aksonal proseslərdən ibarət olan sinir halqasında xolesterinin yığılmasının əhəmiyyəti məlum deyil, baxmayaraq ki, xolesterolla zəngin domenlərin digər sistemlərdə aksonal və dendritik zülalların çeşidlənməsi üçün vacib olduğu düşünülür (Ledesma). və b., 1998). Bu neyronların kemotaksis, termotaksis və ya dauer sürfələri yaratmaq qərarı da daxil olmaqla bir neçə duyğu prosesində iştirak etdiyi bilinir (Bargmann və Mori, 1988).

Yumurtanın xolesterol ilə zənginləşdirilməsi təəccüblü deyil, çünki bu hüceyrələr embrionun sürətli böyüməsini və inkişafını asanlaşdırmaq üçün yüksək səviyyədə membran komponentlərini saxlamalıdırlar. Yumurta qabığının əmələ gəlməsindən sonra ətraf mühitdən əlavə mənimsənilməsi mümkün deyil.

Bunun əksinə olaraq, spermatidlərdə və spermatozoidlərdə xolesterinin yüksək səviyyədə yığılmasının səbəbi o qədər də aydın deyil. Spermadakı xolesterinin miqdarı daha böyük oositlə müqayisədə cüzidir və bu, onun inkişaf etməkdə olan embrionun qidalanmasında mühüm rol oynaması ehtimalı azdır. Təcrübələrimiz və dərc edilmiş tədqiqatlar göstərir ki, spermadakı xolesterol yığılması mayalanma üçün lazım deyil. Məsələn, məlumdur ki, xolesterinsiz mühitdə böyümə və ya xolesterolun qeyri-funksional analoqu olan 25-azakoprostan üzərində böyümə ilə xolesterolun azalması müalicə olunan heyvanların birinci nəslinə görünən təsir göstərmir (Chitwood). və b., 1984 Bottjer və b., 1985 Yochem və b., 1999). Yalnız ikinci nəsil ərimə və böyümə qüsurlarını göstərir.

Bundan əlavə, cinsiyyət orqanlarında xolesterinin ümumi tükənməsi yumurta qoyma fəaliyyətinin artmasına, meyotik hüceyrə dövrünün sürətlənməsinə və pakiten həbsindən çıxmasına səbəb olur (Scheel). və b., 1999). Məməlilərdə yeni boşalmış sperma qeyri-aktivdir və bir neçə faktorun təsirinə məruz qalmalıdır (Chang, 1951 Austin, 1952). Məlumdur ki, xolesterol axını məməli spermasının (Langlais) tutumunda mühüm rol oynayır. və b., 1988). Bu axıntı bir neçə sperma zülalının fosforilləşməsini və Ca 2+ konsentrasiyasının (Visconti) yüksəlməsini ehtiva edən siqnal şəlaləsini tetikler. və b., 1999). Bu kapasitasiya prosesinin təkamül yolu ilə qorunduğunu və nematodların spermanı uyğun ana qədər qeyri-aktiv saxlamaq üçün oxşar mexanizmlərə sahib olduğunu düşünmək cazibədardır. Spermatozoadakı xolesterin mənfi tənzimləyici rolunu oynaya bilər, bu prosesə nəzarət edə bilər və uğurlu mayalanma üçün onun axması lazım ola bilər.

Sarısı Zülalları Xolesterolun Daşıyıcıları kimi

Hazırkı tədqiqatın əsas tapıntılarından biri odur ki, vitellogeninlər xolesterolu bağlayır və onun oositlərə daşınmasında birbaşa iştirak edir. Ardıcıllıq homologiyası C. eleganssarısı zülallarının apolipoproteinlərə çevrilməsi təxminən 10 il əvvəl bildirilmişdir (Baker, 1988 Spieth və b., 1991). Bu yaxınlarda RME-2-nin vitellogeninlər üçün reseptor kimi müəyyən edilməsi C. elegansLDL və yumurta sarısı zülallarının endositozu arasında görünən oxşarlığı gücləndirdi, çünki RME-2 LDL reseptor super ailəsinin yeni üzvüdür (Grant və Hirsh, 1999 Willnow və b., 1999). Həmçinin, digər orqanizmlərdə LDL reseptoru ilə yumurta sarısı zülal reseptorları arasında homologiya müşahidə edilmişdir (Bujo). və b., 1994 Schonbaumvə b., 1995). Bu əlamətlərə baxmayaraq, vitellogeninlər və xolesterol arasında birbaşa qarşılıqlı əlaqə haqqında heç bir məlumat təqdim edilməmişdir. Üstəlik, oositlərdən təcrid olunmuş vitellogenin komplekslərinin tərkibində az miqdarda xolesterin olduğu üçün (Şarrok) və b., 1990), vitellogeninlərin xolesterol daşınmasında iştirakı laqeyd qaldı. Burada təqdim olunan bir neçə növ məlumat vitellogeninlərin və onların reseptorlarının xolesterinin daşınmasında həlledici rolunu nümayiş etdirir. Inrme-2 vitellogenin reseptoru olmayan mutantlarda sterolun oositlərə qəbulu çox güclü şəkildə azalır. Bundan əlavə, bir rme-2 mutant göstərdi ki, oositlərə daşınmazdan əvvəl xolesterolun əsas hissəsi vitellogeninlərin 8S və 12S komplekslərində yerləşir. Maraqlıdır ki, 12S kompleksində daha çox [3 H] fotoxolesterin olsa da, 8S kompleksi meydana gətirən YP170B vitellogenin [3 H] fotoxolesterin ilə daha böyük ölçüdə çarpaz əlaqədə idi. Ya YP170B xolesterolu ən güclü şəkildə bağlayır, ya da [3 H] fotoxolesterin 12S kompleksinin YP170A ilə kovalent bağlanmasına sterik şəkildə mane olur.

Oositlərdə DHE və vitellogeninlərin kolokalizasiyasının az olduğunu gördük. Biz hesab edirik ki, oositlərin endosom sisteminə daxil olduqdan dərhal sonra xolesterin vitellogenin komplekslərindən ayrılır və sürətlə hüceyrə membranlarına yenidən paylanır. Bu, əvvəlki tədqiqatların niyə oositlərdən təcrid olunmuş vitellogeninlə kompleksləşmiş çox az xolesterin tapdığını izah edə bilər (Sharrock). və b., 1990).

Aydındır ki, vitellogeninlər xolesterolun yeganə daşıyıcısı ola bilməz C. elegans. Hermafrodit sürfələri tərəfindən xolesterolun qəbulu sarı zülalların ifadəsindən çox daha erkən başlayır. Bundan əlavə, kişilər vitellogeninləri ifadə etmirlər, lakin hələ də əhəmiyyətli miqdarda xolesterol yığırlar. Həyat dövrü boyunca kişilər və hermafroditlər üçün ümumi olan 37 kDa xolesterol bağlayan zülal müəyyən etdik. Bu zülal ümumi xolesterol daşıyıcısı olmağa namizəddir C. elegans və vitellogeninlərdən asılı olmayan xolesterol nəqlinin əksəriyyətini təşkil edə bilər.

Bu məqalədə təqdim olunan nəticələr göstərir ki, fotoreaktiv və ya təbii floresan olan xolesterolun kimyəvi analoqlarından istifadə canlı orqanizmdə xolesterinin daşınmasını və paylanmasını araşdırmaq üçün güclü alətlər dəsti təmin edir. Burada bildirilən bu yanaşmanın ilkin nəticələri, sterol daşınmasının iki aspektində diqqətəlayiq oxşarlıq nümayiş etdirir. C. elegans və məməlilər. Birincisi, mayalanma üçün lazım olmayan inkişaf edən spermada sterolun təəccüblü bir şəkildə yığılmasını müşahidə etdik. Bu, kapasitasiya prosesinin əsas hissəsi kimi azalan məməli spermadakı yüksək xolesterol səviyyəsini xatırladır. Nəhayət, biz tapdıq ki, vitellogenin:vitellogenin reseptor sistemi oositlər tərəfindən sterolların idxalı üçün istifadə olunur və bu, bunun LDL:LDL reseptor sisteminin təkamül əcdadı olduğunu göstərir. Bu məqalədə təsvir olunan üsullar sterol daşınması və tənzimlənməsinin bir çox digər aspektlərini öyrənmək üçün faydalı olmalıdır.


Hüceyrə Dövrünün Təhlili C. elegans Timidin Analoq EdU ilə Germline

S-fazasını müəyyən etmək və hüceyrə dövrü dinamikasını təhlil etmək üçün istifadə edilə bilən görüntüləmə əsaslı bir üsul təsvir edilmişdir. C. elegans timidin analoq EdU istifadə edərək hermafrodit germline. Bu üsul heç bir transgen tələb etmir və immunofluoresan boyama ilə uyğun gəlir.

Mücərrəd

Eukariotlarda hüceyrə dövrü təhlili tez-tez xromosom morfologiyasından, hüceyrə dövrünün müxtəlif mərhələləri üçün tələb olunan gen məhsullarının ifadəsindən və/və ya lokalizasiyasından və ya nukleozid analoqlarının daxil edilməsindən istifadə edir. S-fazası zamanı DNT polimerazları EU və ya BrdU kimi timidin analoqlarını xromosomal DNT-yə daxil edərək, analiz üçün hüceyrələri qeyd edir. üçün C. elegans, nukleosid analoq EdU müntəzəm mədəniyyət zamanı qurdlara qidalanır və immunofluoressensiya üsulları ilə uyğun gəlir. nin mikrob xətti C. elegans şəffaf, genetik cəhətdən asan və meyoz profilaktikası və hüceyrə diferensiasiyası/qametogenez xətti montaj kimi baş verdiyi üçün siqnal yollarının, kök hüceyrələrin, meiozun və hüceyrə dövrünün öyrənilməsi üçün güclü model sistemdir. Bu xüsusiyyətlər EdU-nu mitotik dövran edən hüceyrələrin və cücərmə xəttinin inkişafının dinamik aspektlərini öyrənmək üçün əla alət edir. Bu protokol EU bakteriyalarını uğurla hazırlamaq, onları vəhşi tipə qidalandırmaq yollarını təsvir edir C. elegans hermafroditlər, hermafrodit cinsiyyət orqanını parçalayın, EU-nun DNT-yə daxil olması üçün ləkələyin, müxtəlif hüceyrə dövranını və inkişaf markerlərini aşkar etmək üçün antikorlarla ləkələyin, cinsiyyət orqanının şəklini çəkin və nəticələri təhlil edin. Protokol S-faza indeksi, M-faza indeksi, G2 müddəti, hüceyrə dövrü müddəti, meiotik giriş sürəti və meiotik profaza irəliləmə sürətinin ölçülməsi üçün metod və təhlildəki dəyişiklikləri təsvir edir. Bu üsul digər toxumalarda, mərhələlərdə, genetik fonlarda və fizioloji şəraitdə hüceyrə dövrü və ya hüceyrə tarixini öyrənmək üçün uyğunlaşdırıla bilər.

Giriş

Heyvanların inkişafında yetkin orqanizmi meydana gətirmək üçün yüzlərlə, minlərlə, milyonlarla, milyardlarla, hətta trilyonlarla hüceyrə bölünməsi lazımdır. Hüceyrə dövrü, G1 (boşluq), S (sintez), G2 (boşluq) və M (mitoz) ibarət hüceyrə hadisələri toplusu, hər bir hüceyrə bölünməsində həyata keçirilən hadisələr silsiləsini müəyyənləşdirir. Hüceyrə dövrü dinamikdir və real vaxtda ən yaxşı şəkildə qiymətləndirilir, bu da texniki cəhətdən çətin ola bilər. Bu protokolda təqdim olunan üsullar hərəkətsiz şəkillərdən hüceyrə dövrünün fazalarını və vaxtını ölçməyə imkan verir.

5-etinil-2'-deoksiyuridin (EdU) və ya 5-bromo-2'-deoksiyuridin (BrdU) kimi nukleozid analoqları ilə etiketlənmə, hüceyrə dövrü dinamikasının tədqiqatlarında S-fazasını müəyyən etmək üçün qızıl standartdır. Caenorhabditis elegans (C. elegans) yetkin hermafrodit cücərmə xətti 1, 2, 3, 4, 5. Həm EdU, həm də BrdU demək olar ki, hər hansı bir genetik fonda istifadə edilə bilər, çünki onlar heç bir genetik quruluşa etibar etmirlər. BrdU-nun vizuallaşdırılması anti-BrdU antikorlarının rənglənməsi üçün antigeni ifşa etmək üçün sərt kimyəvi müalicə tələb edir ki, bu da çox vaxt əlavə antikorlarla birgə boyanma ilə vizuallaşdırılan digər hüceyrə markerlərinin qiymətləndirilməsi ilə bir araya sığmır. Bunun əksinə olaraq, EU-nun vizuallaşdırılması mülayim şəraitdə klik kimyası ilə baş verir və beləliklə, antikorların birgə boyanması ilə uyğun gəlir 6, 7.

Etiketin spesifikliyi aydındır, çünki nüvələr S-fazasında yalnız timidin (5-etinil-2'deoksiyuridin) analoqlarını DNT-yə daxil edir. Vizualizasiya sabit toxumada baş verir. Azid tərkibli boya və ya flüorofor, mis katalizli klik kimyası ilə EdU-da alkin ilə kovalent reaksiyaya girənə qədər EU etiketi öz-özünə görünməzdir 8 . EU etiketlənməsi qısa bir işarələmə impulsundan istifadə edərək, hansı nüvələrin S fazasında olduğu barədə dərhal məlumat verə bilər. EU həmçinin dinamik məlumat təmin edə bilər, nəbz təqibi və ya davamlı etiketləmə istifadə edərək, məsələn, nəbz təqibi təcrübəsində, etiket hər hüceyrə bölünməsində seyreltilir və ya bölünməyən hüceyrələr inkişaf yolu ilə irəlilədikcə yayılır.

The C. elegans hermafrodit cücərmə xətti siqnal yollarının, kök hüceyrələrin, mayozun və hüceyrə dövrünün öyrənilməsi üçün güclü model sistemdir. Yetkin cücərmə xətti distal ucunda olan kök hüceyrələri olan, daha proksimal olaraq gametogenez mərhələləri ilə koordinasiya edilmiş, meyotik profilaktika fazasına daxil olan və irəliləyən qütblü birləşmə xəttidir (Şəkil 1). Proksimal ucunda oositlər yetişir, ovulyasiya olunur və döllənir və uşaqlıq yolunda embriogenezə başlayır 9 , 10 , 11 . The

Distal uc hüceyrənin yaxınlığında 20 hüceyrə diametrli uzunluğunda olan və mitotik dövran edən cücərmə xəttinin kökünü, progenitor hüceyrələri və meyotik S-faza hüceyrələrini ehtiva edən, lakin meiotik profilaktika fazasındakı hüceyrələri deyil, progenitör zona 2, 4, 9, 12 adlanır. Hüceyrə membranları distal cücərmə xəttindəki nüvələr arasında natamam ayrılmanı təmin edir, lakin progenitor zonanın hüceyrələri əsasən müstəqil olaraq mitotik hüceyrə dövriyyəsindən keçir. Gənc yetkin hermafroditlərdə cücərmə xəttinin progenitor zonası hüceyrələrinin mitotik hüceyrə dövrünün orta müddəti

6,5 saat G1 fazası qısadır və ya yoxdur, sakitlik müşahidə edilmir 1 , 2 , 13 . Germline kök hüceyrə fərqləndirmə mahiyyətcə birbaşa differensiasiya ilə baş verir və beləliklə, tranzit gücləndirici bölmələri yoxdur 4 . Pakiten mərhələsində differensiasiya zamanı 5 nüvədən təxminən 4-ü oositlər əmələ gətirməyəcək, əksinə apoptoza məruz qalır, sitoplazmatik məzmununu inkişaf etməkdə olan oosit 12, 14, 15-ə bağışlayaraq tibb bacısı hüceyrələri kimi fəaliyyət göstərir.

S-fazasında hüceyrələrin nukleozid analoqları ilə etiketlənməsinə əlavə olaraq, antikorların boyanmasından istifadə edərək mitoz və meiozdakı hüceyrələri müəyyən etmək olar. Mitozdakı nüvələr anti-fosfo-histon H3 (Ser10) antikoruna (pH3 adlanır) immunoreaktivdir 7 , 16 . Meyozdakı nüvələr anti-HIM-3 antikoruna (meyotik xromosom oxu zülalı) immunoreaktivdir 17 . Progenitor zonada nüvələr HIM-3-ün olmaması, nukleoplazmatik REC-8 18 və ya WAPL-1 19-un olması ilə müəyyən edilə bilər. WAPL-1 intensivliyi somatik cinsiyyət orqanında ən yüksək, progenitor zonada yüksək və erkən meiotik profilaktika zamanı aşağıdır 19 . Protokolda bir neçə variasiya ilə bir neçə hüceyrə dövrünün ölçülməsi mümkündür: I) S-fazasında nüvələrin müəyyən edilməsi və S-faza indeksinin ölçülməsi II) M-fazasında nüvələrin müəyyən edilməsi və M-faza indeksinin III ölçülməsi) nüvələrin olub olmadığını müəyyən etmək mitotik və ya meyotik S-faza IV) G2-nin müddətini ölçün V) G2+M+G1 fazalarının müddətini ölçün VI) meiotik girişin sürətini ölçün VII) meyozun irəliləmə sürətini qiymətləndirin.

Yalnız bir neçə növ yaş laboratoriya təcrübəsindən çoxlu hüceyrə dövrü ölçmələri edə bilərsiniz. Aşağıdakı protokol qidalanma ilə 30 dəqiqəlik nəbz etiketini təsvir edir C. elegans anti-pH3 antikoru və anti-WAPL-1 antikoru ilə boyanaraq progenitor zona hüceyrələri ilə boyanma yolu ilə EdU etiketli bakteriya və birgə etiketli M-faza hüceyrələri ilə yetkin hermafroditlər. Əlavə ölçmələr üçün yalnız EU yeminin müddətində dəyişikliklər (Addım 2.5), istifadə edilən antikorların növü (Addım 5) və təhlillər (Addım 8.3) tələb olunur.

Abunəlik Tələb olunur. Zəhmət olmasa JoVE-ni kitabxanaçınıza tövsiyə edin.

Protokol

1. EdU etiketli Bakteriyaların hazırlanması

  1. MG1693 başlanğıc mədəniyyətini yetişdirin. Escherichia coli (E. coli) MG1693 thyA-da mutasiya daşıyır.
    1. Çıxmaq E. coli MG1693 dondurulmuş qliserol ehtiyatından 120 mm lizogen bulyonu (LB) agar Petri qabına. Gecədə 37 ºC-də mədəniyyət.
    2. İki fərddən aşılayın E. coli MG1693 koloniyaları iki dublikat 4 mL maye LB borularına. Mədəniyyət üçün 37 °C

    1. 500 ml-lik konusvari kolbanı avtoklavlayın.
    2. 5 mL 20% qlükoza, 50 μL 10 mq/mL tiamin, 120 μL 5 mM timidin, 100 μL 1 M MgSO əlavə etmək üçün steril texnikadan istifadə edin.4, 200 μL 10 mM EU, 100 mL M9 buferi və 4 mL təzə yetişdirilmiş bir gecədə MG1693 mədəniyyəti.
      QEYD: EDU-nun son konsentrasiyası bu mədəniyyətdə 20 μM-dir 1 , 7 . Bu konsentrasiya birbaşa mədəniyyət 20 məməli hüceyrələrinə tətbiq edildikdə DNT zədələnməsinə və hüceyrə dövrü həbsinə səbəb olur. Bununla belə, bu EDU-nun yalnız bir hissəsi proqrama daxil edilmişdir E. coli və buna görə də mövcuddur C. elegans. Gənc yetkin hermafroditlərin EU ilə müalicəsindən sonra hüceyrə dövrünün dayanmasına dair heç bir dəlil və progenitor zonanın ölçüsündə və ya M-faza indeksində dəyişiklik yoxdur.
    3. Gecədə kultura, lakin 200 rpm-də silkələnmə ilə 37 º176C-də 24 saatdan çox olmamalıdır.

    8 damcı yenidən dayandırılmış EU etiketli E. coli MG1693 mərkəzinə otaq temperaturu 60 mm M9 agar Petri qabları. Bir partiya məhsul verir

    2. EDU-nun qidalanması C. elegans

    1. Vaxtı təyin edilmiş yumurta qoyma, qələvi hipoxlorit müalicəsi, sonra xolesterol ilə S-mühitinə daxil olmaq və ya müvafiq mərhələni seçməklə populyasiyanı sinxronlaşdırın 21 . Heyvanları istədiyiniz mərhələyə (burada, L4-dən 24 saat sonra) toxumlanmış Nematod Growth Medium üzərində böyüdün. E. coli OP50 20 º176C-də.
      QEYD: Təcrübə başına 50� heyvan hazırlayın, çünki bəziləri yaxşı parçalanmaya bilər, digərləri isə yuyulma və köçürmə prosesində itəcək.
    2. EU qablarının 20 º176C-ə (və ya təcrübə üçün tələb olunan temperatura) qədər istiləşməsinə icazə verin.
    3. M9 və ya fosfat tamponlu şoran (PBS) istifadə edərək, NGM qablarından heyvanları 1,5 mL boruya yuyun. Heyvanların cazibə qüvvəsi və ya mikrosentrifuqada qısa fırlanma ilə qısa müddətə yerləşməsinə icazə verin.
    4. Supernatantı çıxarın və heyvanları 1𔃀 dəfə yuyun

    3. Disseksiya və Fiksasiya C. elegans Germline

    QEYD: Bu protokolun disseksiyası, fiksasiyası və antikorların rənglənməsi üçün C. elegans hermafrodit cücərmə xətti Gervaise və Arur (2016) 22 tərəfindən nəşr olunan ilə demək olar ki, eynidir, istisna olmaqla, 1 ml şüşə borular yuyulma mərhələlərini sürətləndirmək üçün sentrifuqa edilə bilər və 1 ml-dən mayeni çıxarmaq üçün çəkilmiş şüşə Pasteur pipeti istifadə edilə bilər. şüşə borular daha effektivdir.

      Yuyun və parçalayın C. elegans mikrob xətləri.
        Heyvanların disseksiya qabının dibinə yerləşməsinə icazə verin, heyvanları mərkəzdə toplamaq üçün fırlansın və PBS-ni çıxarmaq üçün uzun Pasteur pipetindən istifadə edin. ilə 1𔃀 dəfə yuyun

        Metanol sulandırmaq və cinsi vəziləri rehidrat etmək üçün şüşə sentrifuqa borusunu PBSTw ilə doldurun. Klinik sentrifuqada 870 x-də aşağı fırladın g üçün

      5 mL PBSTw, klinik sentrifuqada 870 x-də fırlanır g üçün

      5. Antikorları olan antigenləri aşkar edin

      1. PBS-də 30% serumda əsas antikorları seyreltin. Hazırkı nümunədə anti-WAPL-1 antikoru 1:2000 nisbətində və anti-pH3 antikoru 1:500 nisbətində seyreltilir. Təzə əridilmiş serumu 20.000 x-də mikrofugedə 10 dəqiqə sentrifuqa edin. g hissəcikləri çıxarmaq üçün 4 º176C-də. Bir neçə gün ərzində 4 ºC-də saxlanıla bilən supernatantdan istifadə edin. İkinci dərəcəli antikorların ev sahibi orqanizminə uyğun gəlmək üçün müvafiq serumdan istifadə edin (burada keçi zərdabından istifadə olunur). Birincil antikorların əlavə edilməsindən əvvəl isteğe bağlı bloklama addımı əlavə edilə bilər.
      2. Hər kiçik şüşə boruya 100 μL seyreltilmiş birincil antikor tətbiq edin. Otaq temperaturunda 4 saat inkubasiya edin.
        QEYD: İnkubasiya müddətləri antikorlara görə dəyişir. Bəzi antikorlar üçün otaq temperaturunda 2 saat kifayətdir. Daha uzun inkubasiyalar (məs., bir gecədə) mümkündür, lakin fon artıra bilər.
      3. Boruları yuxarıya PBSTw ilə doldurun və 870 x-də klinik sentrifuqada aşağı çevirin. g üçün

      1 mL PBSTw. üçün inkubasiya edin

      1 mL PBSTw. üçün inkubasiya edin

      6. EdU-nu aşkar etmək üçün EU Klik Reaksiyasını yerinə yetirin

      QEYD: İstifadə olunan antikorlardan asılı olaraq, antikorların rənglənməsi addımlarından əvvəl (5-ci addımdan əvvəl 6-cı addımı yerinə yetirin) EU klik reaksiyasının yerinə yetirilməsi mümkündür 7 . Bununla belə, klik reagentləri müəyyən antigenlərə müdaxilə edə bilər (məs., REC-8 antikoru fiksasiya və keçiriciliyə həssasdır). Burada təqdim olunan sifariş REC-8, WAPL-1, HIM-3, pH3, FLAG və CYE-1 antikorları ilə parlaq antikor boyama verir, digərləri arasında.

      1. Təmiz 1,5 mL boruya aşağıdakıları əlavə etməklə klik EdU kokteyli 8 təzə hazırlayın. Əlavələrin ardıcıllığı vacibdir. İşıqdan qoruyun və bütün reagentləri buzda saxlayın. Bu resept bir nümunə üçün kifayət qədər məhsul verir (100 μL) lazım olduqda resepti çoxaltın.
        1. Tampon qatqısına 2 mL ultra saf su əlavə edin. Bu, istifadədən dərhal əvvəl 1x-ə qədər seyreltilməli olan 10x tampon əlavə edir.
        2. 76,5 μ L ultra saf suya 8,5 μL 10x tampon əlavə edin. Yaxşı qarışdır.
        3. 4 μL 100 mM CuSO əlavə edin4 (komponent E kimi etiketlənə bilər). Yaxşı qarışdır.
        4. 488 nm boya Aziddən 0,25 μL əlavə edin. Otaq temperaturunda əridilməlidir, çünki onun həlledicisi dimetil sulfoksid 4 º176C-də bərkdir. Yaxşı qarışdırın və işıqdan qoruyun.
        5. Borunun qapağında 9 μ L ultra saf suyu 1 μ L bufer əlavəsi ilə qarışdırın. Qalan kokteylə əlavə etmək üçün qapaqdan pipet çəkin və yuxarı və aşağı pipetlə yaxşıca qarışdırın.

        1 mL PBSTw. üçün inkubasiya edin

        7. DNT-ni rəngləyin və Slaydları Hazırlayın

        8. Konfokal görüntüləmə və təhlil

        1. Distal cinsiyyət orqanını yüksək enerjili işıq mənbəyi, plan-apoxromatik məqsədlər və yüksək effektiv mikroskop kamerası ilə təchiz edilmiş fırlanan diskli konfokal flüoresan mikroskopla təsvir edin. 1 μm və ya z-stacks arasında daha sıx məsafə ilə şəkillər çəkin. Bütün kanallar üçün lazer gücünü, həssaslığı və məruz qalma vaxtını qeyd edin.
          1. Aşağıdakılardan istifadə edin: DAPI üçün 485 nm (W60) emissiya filtri ilə 405 nm lazer xətti həyəcanlandırması, EdU üçün 527 nm (W55) emissiya filtri ilə 488 nm lazer xətti həyəcanlandırması, 6175 nm ilə 561 nm lazer xətti həyəcanlandırması (6175 nm) WAPL-1 üçün emissiya filtri və pH3 üçün 705 nm (W90) emissiya filtri ilə 640 nm lazer xətti həyəcanlandırması.
            QEYD: Siqnal intensivliyi və fon intensivliyi fərqli olacaq. Eyni şəkildə, tələb olunan məruz qalma müddətləri, ola bilsin ki, 10 dəfəyə qədər dəyişə bilər.
          1. (Variasiya I) S-fazasında nüvələri müəyyən etmək üçün heyvanları 30 dəqiqə ərzində EU qidalandırın. EU etiketini göstərən hər hansı nüvələr S-faza nüvələridir. Hesablamaq üçün A və C nüvələrinin cəmini götürün, baxın Cədvəl 1Şəkil 2.
            QEYD: Vəhşi tipli yetkin hermafroditlərdə 30 dəqiqəlik EU nəbzində bütün EU etiketli nüvələr progenitor zona markerləri 1 ilə birgə etiketlənir.
          2. Progenitor zonanı ölçmək üçün REC-8 və ya WAPL-1 antikoru kimi progenitor zona markeri ilə ləkələyin. Progenitor zona burada bütün nukleoplazmatik REC-8 18 və ya WAPL-1 immunoreaktiv germline nüvələri kimi müəyyən edilir. Hesablamaq üçün bütün WAPL-1 immunoreaktiv nüvələri cəmləyin (A+B+C+D, bax. Cədvəl 1Şəkil 2).
            QEYD: WAPL-1 həmçinin DTC və hesablanmamalı olan somatik gonad nüvələrini etiketləyir. Somatik nüvələri son dərəcə intensiv WAPL-1 siqnalı, rüşeym xəttindən bir qədər kənarda yerləşməsi və nüvələrin 'qızardılmış yumurta' morfologiyası ilə asanlıqla müəyyən etmək olar.
          3. S-faza indeksini ölçmək üçün 30 dəqiqəlik EU təcrübəsini yerinə yetirin və REC-8 və ya WAPL-1 antikoru ilə birgə etiketləyin. S-faza indeksi, S-fazasında olan progenitor zonanın nisbəti kimi müəyyən edilir. Hesablamaq üçün bütün S-faza nüvələrini sayın və sonra progenitor zona nüvələrinin ümumi sayına bölün (A+C / A+B+C+D, bax. Cədvəl 1Şəkil 2).
          4. (Variasiya II) M-fazasında nüvələri müəyyən etmək üçün pH3 antikoru ilə ləkələyin. İstənilən pH3 immunoreaktiv nüvələr M-faza nüvələridir. Bu, EU lentinin müddətindən asılı olmayaraq işləyir. Hesablamaq üçün A və B nüvələrinin cəmini götürün, baxın Cədvəl 1Şəkil 2.
            QEYD: WAPL-1 həmçinin DTC və hesablanmamalı olan somatik gonad nüvələrini etiketləyir. Somatik nüvələri son dərəcə intensiv WAPL-1 siqnalı, rüşeym xəttindən bir qədər kənarda yerləşməsi və nüvələrin 'qızardılmış yumurta' morfologiyası ilə asanlıqla müəyyən etmək olar.
          5. M-faza indeksini ölçmək üçün pH3 və REC-8 və ya WAPL-1 antikorları ilə birgə etiketləyin. M-faza indeksi, M-fazasında olan progenitör zonanın nisbəti kimi müəyyən edilir. Hesablamaq üçün bütün M-faza nüvələrini sayın və sonra progenitor zona nüvələrinin ümumi sayına bölün (A+B / A+B+C+D, bax. Cədvəl 1Şəkil 2).
          6. (Variasiya III) Mitotik və meyotik S-fazadakı nüvələr hər iki EU ilə etiketlənir. İki populyasiyanı bir-birindən ayırmaq üçün S-fazasının mitoz və ya meioz tərəfindən izləndiyini müəyyənləşdirin. Nüvələrin mitotik və ya meyotik S fazasında olub-olmadığını müəyyən etmək üçün EU-nu 4 saat ərzində qidalandırın və antikorların rənglənməsi ilə pH3 (M-faza markeri) və HIM-3 (meyotik xromosom oxu zülalı) üçün birgə etiketləyin. Həm EU, həm də pH3 göstərən nüvələri qeyd edin (tip A, bax Cədvəl 1Şəkil 2) həm EU, həm də HIM-3 nümayiş etdirən nüvələr isə mitotik S-faza kimi (tip E, bax. Cədvəl 1Şəkil 2) meyotik S-fazası kimi.
          7. (Variasiya IV) G2 fazasının müddətini hesablayın.
            QEYD: G2-faza S-fazasını M-fazadan ayırır. Baxmayaraq ki, G2-də heç bir marker yoxdur C. elegans germline, M-faza (parçalanma zamanı) və S-fazasını (parçalanmadan bir neçə saat əvvəl başlayan) etiketləyən bir neçə təcrübədən əldə edilən məlumatları birləşdirərək G2 fazasının müddətini hesablamaq olar. Həm M-faza, həm də S-faza markerlərini göstərən xana eksperiment zamanı G2-fazasını tamamladı. S-faza markerini deyil, yalnız M-faza markerini göstərən xana təcrübə zamanı S-fazasında deyildi.
            1. G2-faza müddətini hesablamaq üçün 2 saat üçün EU qidalandırın və pH3 antikoru ilə birgə etiketləyin. Yalnız pH3 ilə etiketlənən nüvələri (bunlar parçalanma zamanı M-fazasındadır) EU varlığına görə yoxlayın (bunlar parçalanmadan əvvəl 2 saatlıq EU etiketi ərzində S-fazasında idi). G2 fazasını tamamlayan M faza nüvələrinin hissəsini hesablayın (A / A+B, bax. Cədvəl 1Şəkil 2).
            2. Bu təcrübəni 3 saat EU etiketi ilə və yenidən 4 saat EU etiketi (və istəyə görə 5 saat EU etiketi) ilə təkrarlayın. Şəkildə göstərildiyi kimi y oxunda müsbət EU olan pH3 müsbət nüvələrin faizini və x oxunda EU etiketinin müddətini qrafiki Şəkil 3A.
            3. Şəkildə göstərildiyi kimi, qrafikdəki nöqtələri birləşdirərək və xəttin 50%-i keçdiyi yeri təyin etməklə G2-fazasının median müddətini hesablayın. Şəkil 3A.
            4. Şəkildə göstərildiyi kimi, qrafikdəki nöqtələri birləşdirərək və xəttin 99%-i keçdiyi yeri təyin edərək G2-fazasının maksimum müddətini hesablayın. Şəkil 3A.
            1. G2+M+G1-in müddətini hesablamaq üçün EU-nu 2 saat qidalandırın və REC-8 və ya WAPL-1 antikoru ilə birgə etiketləyin. Bu müddət ərzində S-fazasından keçən progenitor zonanın hissəsini müəyyən edin (A+C / A+B+C+D, bax. Cədvəl 1Şəkil 2).
            2. Bu təcrübəni 3 saat EU etiketi ilə və yenidən 4 saat EU etiketi (və istəyə görə 5 saat EU etiketi) ilə təkrarlayın. Aşağıda göstərildiyi kimi, y oxunda müsbət EU olan REC-8 və ya WAPL-1 müsbət nüvələrinin faizini və x oxunda EU etiketinin müddətini qrafiki Şəkil 3B.
            3. Qrafikdəki nöqtələri birləşdirərək və xəttin 99%-i keçdiyi yeri tapmaqla G2+M+G1-in maksimum müddətini hesablayın. Şəkil 3B.
              QEYD: G2 və G2+M+G1-in müddətini müəyyən etmək üçün eksperimentləri 2, 3, 4 və 5 saatlıq EU təcrübələrindən ibarət tək dəst kimi hər iki dovşan-anti-WAPL-1 ilə birgə etiketləməklə həyata keçirmək mümkündür. və siçan-anti-pH3 antikorları.
            1. Heyvanlara EdU etiketli bakteriyaları 4 saat (&& #8220pulse& #8221) bəsləyin. Heyvanları 48 saat ərzində etiketlənməmiş OP50 bakteriyasına köçürün ("təqib"), sonra parçalayın və REC-8 və ya WAPL-1 (və ya HIM-3 kimi meiotik profilaktika markeri) kimi progenitor zona markeri ilə birlikdə etiketləyin ) istəsəniz.
            2. Təsvir edərkən, ən proksimal EdU ilə işarələnmiş nüvənin mövqeyini axtarın. Meyotik irəliləyişin sürəti 48 saatlıq təqib zamanı ən proksimal EU etiketli nüvənin qət etdiyi məsafədir (əcdad zonasının sonundan hüceyrə diametrlərində).

            Abunəlik Tələb olunur. Zəhmət olmasa JoVE-ni kitabxanaçınıza tövsiyə edin.

            Nümayəndə Nəticələri

            EdU-nu daxil etmək üçün DNT sintezi tələb olunduğundan belə bir nəticəyə gəlmək olar ki, EdU ilə işarələnmiş nüvələr EdU etiketləmə vaxtı pəncərəsində S-fazasından keçiblər. EU etiketli bakteriyalarla 30 dəqiqəlik qidalanma zamanı etiketlənən nüvələri parçalanma zamanı S fazasında nüvələr kimi şərh etmək olar. Daha uzun davamlı EU qidalanma təcrübəsində etiketlənən nüvələr vaxt pəncərəsinin əvvəlində və S fazasını tərk etdikdən sonra etiketlənmiş ola bilər və ya EU vaxt pəncərəsinin son hissəsində etiketlənmiş ola bilər. EU siqnalı DAPI siqnalı ilə birgə lokallaşdırılır. Bəzi nüvələrdə EU siqnalı bütün xromosomları əhatə edir, digər nüvələrdə isə EU siqnalı 1-82112 parlaq nöqtəyə lokallaşdırılır (Şəkil 4). Bu nöqtələr, ehtimal ki, S-faza 13-də gec təkrarlanan X-xromosomudur.

            Burada heyvanlar 30 dəqiqə davamlı olaraq EU ilə qidalandırıldı və yuxarıda və aşağıda göstərildiyi kimi parçalandı. Şəkil 5. Gənc yetkin bir heyvanda uğurlu EU boyanmasının bir nümunəsi və yaşlı yetkin heyvanda uğursuz EU boyanmasının bir nümunəsi (aşağıya bax) aşağıda göstərilmişdir. Şəkil 4. 30 dəqiqəlik etiketləmədən gələn EU siqnalı progenitor zonada nüvələrin təxminən yarısına lokallaşdırılır (WAPL-1 antikor etiketi ilə müəyyən edilir, lakin DAPI morfologiyası ilə təqribən 26, 27, 28). S-faza indeksi, EU müsbət olan progenitor zonanın nisbəti əvvəllər 57 º1775% və gənc yetkinlərdə 1 , 2 , 3 70 %-ə qədər yüksək olduğu bildirilmişdi. M-faza indeksi təxminən 2𔃁% 1 , 29 . 4 saat və ya daha uzun müddətə davamlı qidalanmada, progenitor zonada olan bütün nüvələr EdU ilə etiketlənir və əcdad zonasında işarələnmiş bəzi nüvələr o vaxtdan meiotik profilaktika 1-ə daxil olur.

            Texnika vəhşi tipli gənc yetkin heyvanlarda ardıcıl olaraq işləsə də, cütləşmiş 5 günlük hermafroditlərin əhəmiyyətli bir hissəsi (hətta sperma olanlar) 30 dəqiqəlik EU nəbzində etiketlənə bilmədi (Şəkil 4E). Bununla belə, 4 saatlıq EU qidalanması ilə demək olar ki, bütün bu heyvanlar etiketlənir. EdU qısa impulsları olan genetik dişi heyvanlarda etiketlənmənin sporadik uğursuzluğu da bildirilmişdir 30 . etiketlənməməsi ilə nəticələnən başqa vəziyyətlər də ola bilər.

            Hüceyrə dövrünün müddətini hər birində pH3 etiketləməsi ilə bir neçə EU etiketləmə eksperimenti həyata keçirməklə hesablamaq olar. G2-nin müddəti M-fazasında (pH3 immunoreaktiv) zaman ərzində EU müsbət olan nüvələrin faizini təhlil etməklə təxmin edilmişdir (Şəkil 6). Bu yanaşma G2-nin orta və maksimum müddətini verir (Şəkil 3A). Gənc yetkin hermafroditlərdə təxmini G2 müddətini 2,5 saat göstərən median vaxt interpolyasiya edilmişdir. G2+M+G1-in müddəti EU müsbət olan bütün progenitor zona nüvələrinin (WAPL-1 immunoreaktiv) faizindən hesablanıb.Şəkil 6). G2+M+G1 metodu birləşmiş fazalar üçün maksimum müddət ölçüsünü təmin edir (Şəkil 3B). 99-cu persentil vaxtı interpolyasiya edilmiş, gənc yetkin hermafroditlərdə təxmini G2+M+G1 müddətini 3,4 saat göstərmişdir. Eyni eksperimentlərdən əldə edilən məlumatlar meiotik giriş sürətini (hər saatda nüvələr) hesablamaq üçün istifadə edilmişdir. Dərəcə, meioza daxil olan nüvələrin sayının (EdU müsbət, WAPL-1 mənfi və ya HIM-3 müsbət) EU etiketinin müddəti ərzində xətti reqressiyasının meylidir (Şəkil 3C). Vəhşi tip 1 günlük yetkin hermafroditlər üçün dəyərlər göstərilir Cədvəl 2.


            Şəkil 1: Diaqram C. elegans germline və hüceyrə dövrü. (A) Gənc yetkin hermafrodit rüşeym xəttində germ hüceyrələrinin hüceyrə dövrü. Rəqəmlər hüceyrə dövrünün hər bir mərhələsində sərf olunan vaxtın təxmini faizini göstərir. (B) C. elegans hermafroditlərin iki U formalı cücərmə xətti (qırmızı və mavi) var. Spermatozoid sarı rəngdə, inkişaf etməkdə olan embrionları olan uşaqlıq isə tünd boz rəngdə göstərilir. Kəsik narıncı xətt, cücərmə xətlərini çıxarmaq üçün heyvanların harada parçalandığını göstərir. (C) Açılmış bir diaqram C. elegans mikrob xətti. DAPI (mavi) nüvə morfologiyasını vurğulayan DNT boyasıdır. Distal progenitor zona (WAPL-1 antikorunun boyanması əsasında qırmızı rənglə vurğulanır) mitotik dövran edən kök hüceyrələri, progenitor hüceyrələr və meiotik S fazasındakı hüceyrələrdən ibarətdir (WAPL-1 həmçinin somatik gonad nüvələrini qeyd edir). 30 dəqiqəlik EU nəbzi ilə mitotik və meiotik S-faza etiketində olan hüceyrələr yaşıl rənglə göstərilir. M-faza etiketində pH3 antikoru olan iki hüceyrə qara rəngdə göstərilmişdir. Distal uc hüceyrəsi (DTC) bu hüceyrələrin kök hüceyrə taleyini qorumaq üçün GLP-1/Notch liqandını təmin edir. Hüceyrələr DTC-dən uzaqlaşdıqca, onlar progenitor zonadan çıxır və meiotik profilaktikaya daxil olurlar.Sarı hüceyrələr spermadakı spermadır. Bu rəqəmin daha böyük versiyasına baxmaq üçün bura klikləyin.


            Şəkil 2: Nüvə siniflərinin Venn diaqramı. Nüvələr üç markerin olması və olmaması ilə qruplaşdırılır: WAPL-1 progenitor zona hüceyrələrini (qırmızı), EU S-faza hüceyrələrini (yaşıl) və pH3 M-faza hüceyrələrini (mavi) göstərir. Hüceyrə növləri kimi müəyyən edilir A-G. Qeyd edək ki, vəhşi tipli gənc yetkin hermafroditlərdə F tipli hüceyrələr tapılmır və hüceyrələr (WAPL-1 müsbət) progenitor zonadan kənarda EU və pH3 ilə birgə etiketlənmir. Aşağıdakı distal gonad diaqramı A-E və G nüvələrinin bir nümunəsini göstərir. Görmək Cədvəl 1 ətraflı məlumat üçün. Bu rəqəmin daha böyük versiyasına baxmaq üçün bura klikləyin.


            Şəkil 3: Hüceyrə dövrünün müddəti və meiotik giriş eksperimental məlumatlarının sürətinin qrafik təqdimatı. (A) G2 fazasının müddəti müxtəlif müddətli EU impulslarından sonra pH3 və EU birgə etiketindən interpolyasiya edilir Boz xətlər oxlarla göstərilən median və maksimum G2 müddətlərinin interpolyasiyası zamanı istifadə olunan 50 və 99-cu persentilləri göstərir. (B) G2, M və ya G1 fazasındakı hüceyrə EU-nu birləşdirmir. Beləliklə, G2+M+G1 fazasının maksimum müddəti, EU-mənfi hüceyrələri verən EU etiketinin maksimum müddətini ölçməklə təxmin edilə bilər. G2+M+G1 fazasının müddəti müxtəlif müddətli EU impulslarından sonra EU və REC-8 birgə etiketindən interpolyasiya olunur. Boz xətt ox ilə göstərilən maksimum G2+M+G1 müddətinin interpolyasiyası üçün istifadə edilən 99-cu faiz dilini göstərir. Median G2+M+G1 müddətini interpolyasiya etmək mümkün deyil. (C) Meiotik giriş sürəti (hər saatda nüvələrdə – bax Cədvəl 2) reqressiya xəttinin mailliyindən hesablanır. Nəzərə alın ki, y-kəsici kəsişmə sıfır olmadığına görə, meiotik giriş sürətinin (C) dəqiq hesablanması üçün reqressiya lazımdır. . Səhv çubuqları standart sapmanı göstərir. Rəqəmlər dəyişdirilmiş və Fox-un icazəsi ilə yenidən çap edilmişdir və b. 2011 1 . Bu rəqəmin daha böyük versiyasına baxmaq üçün bura klikləyin.


            Şəkil 4: Uğurlu və uğursuz 30 dəqiqəlik EU boyama nümunəsi. 1 günlük uşağın konfokal mikroskop şəkilləri (A-D) və 5 günlük (E-H) 30 dəqiqə EU etiketləmə təcrübəsindən sonra hermafrodit gonad (sperma tükənməmiş). Kəsik ağ xətt progenitor zonanın sonunu göstərir. Ulduz işarəsi distal ucun mövqeyini göstərir. Yaşıl işarələr EU boyanması klik kimyası ilə vizuallaşdırılır (A). Uğursuz EU etiketlənməsi aşağı səviyyəli fon rənglənməsi ilə nəticələnir, lakin parlaq EU+ nüvələri yoxdur (E). Qırmızı işarələr WAPL-1 immunofluoressensiya (B,F). Sarı üst-üstə düşdüyünü göstərir (C, G). DNT üçün DAPI boyanmasının mavi işarələri (D, H). Tək ox başlıqları xromatin boyu EU ilə boyanmış nüvəni göstərir. İkiqat ox başlıqları yalnız bir cüt xromosomda EdU nöqtəsi olan nüvəni göstərir. Şəkillər 63X obyektivlə əldə edilib. Ölçək çubuğu = 10 µm  (D, H). Bu rəqəmin daha böyük versiyasına baxmaq üçün bura klikləyin.


            Şəkil 5: Eksperimental iş axını. Böyümək üçün eksperimental protokolun xülasəsi (A), EDU etiketi (B), parçalamaq (C), antikor ləkəsi (D), boyanı EdU-ya əlavə etmək üçün klik reaksiyasını yerinə yetirin (E), ləkə DNT (F), şəkil mikrob xətləri (G) və EU etiketli və antikor ləkələnmiş nüvələrin miqdarını təyin edin (H). Bu rəqəmin daha böyük versiyasına baxmaq üçün bura klikləyin.


            Şəkil 6: Uğurlu 4 saat EU boyanmasının nümunəsi. 4 saatlıq EU etiketləmə təcrübəsindən sonra 1 günlük yetkin hermafrodit cinsiyyət heyvanının konfokal mikroskop şəkilləri. Kəsik ağ xətt progenitor zonanın sonunu göstərir. Ulduz işarəsi distal ucun mövqeyini göstərir. Magenta pH3 immunofluoressensiyasını qeyd edir (A, C). Yaşıl işarələr EU boyanması klik kimyası ilə vizuallaşdırılır (B,C). Qırmızı işarələr WAPL-1 immunofluoressensiya (D). Sarı EU və WAPL-1-in üst-üstə düşdüyünü göstərir (E). DNT üçün DAPI boyanmasının mavi işarələri (F). Tək ox başlıqları EU və pH3 ilə birgə etiketlənmiş nüvələri göstərir. Qoşa ox ucu pH3+ EU- nüvəsini işarələyir - 4 saatlıq EU etiketində nadir haldır. Oklar EU+ WAPL-1 - meioza daxil olmuş nüvələri qeyd edir. Şəkillər 63X obyektivlə əldə edilib. 10 µm miqyaslı çubuq göstərilir (F). Bu rəqəmin daha böyük versiyasına baxmaq üçün bura klikləyin.

            Marker: pH3 EDU* WAPL-1 və ya REC-8 HIM-3
            Təfsir: Mitoz S-fazası* Progenitor zonası Meioz
            Sinif: Qarışıq şərh:
            A M-fazada, progenitor zonada, EdU etiketi zamanı mitotik S-fazasında idi (tamamlanmış G2)
            B M-fazada, progenitor zonada, EdU etiketi zamanı S-fazasında deyildi
            C İnterfazada, progenitor zonada, EdU etiketi zamanı S-fazasında idi
            D İnterfazada, progenitor zonada, EdU etiketi zamanı S-fazasında deyildilər
            E meiozda, EdU etiketi (meiotik giriş nüvələri) zamanı meyotik S-fazasında idi.
            F mitoza (bəzi mutantlarda rast gəlinir) və ya meyoz bölünməyə (spermatogenezdə) qayıtmaq
            G meiozda, EdU etiketi zamanı S-fazasında deyildilər
            cəmi pH3 müsbət M-fazasında bütün hüceyrələri cəmi EU müsbət S-fazada bütün hüceyrələri cəmi cəmi WAPL-1 pozitiv   progenitor zonanın bütün hüceyrələri cəmi HIM-3 müsbət meyotik profilaktika bütün hüceyrələri

            Cədvəl 1: Nüvələrin sinifləri. *Qeyd edək ki, 30 dəqiqə və 4 saat EdU təcrübələri şərhdə fərqlənir. Daha uzun müddətli EU təcrübələrində hüceyrələr ehtimal ki, S fazasından kənara çıxmışdır. Bax Giriş və Addım 8 müvafiq təcrübə üçün EU etiketləmə müddəti üçün.

            Hüceyrə dövrü hissəsi Əməliyyat tərifi Hesablama* Dəyər**
            Progenitor Zona nüvələri bütün WAPL-1 (və ya REC-8) müsbət, HIM-3 mənfi nüvələr A+B+C+D 231 ± 23 nüvələr
            S-faza nüvələri nüvələr 30 dəqiqə EU etiketindən sonra müsbət EU və WAPL-1 müsbət A+C 133 ± 20 nüvələr
            M fazalı nüvələr pH3 və WAPL-1 ko-pozitiv nüvələri A+B 5.2 ± 2.3 nüvələr
            S-faza indeksi S-faza nüvələri / Progenitor Zona nüvələri A+C/ A+B+C+D Hüceyrə dövrünün 57%-i
            M-faza indeksi M-faza nüvələri / Progenitor Zona nüvələri A+B/ A+B+C+D Hüceyrə dövrünün 2%-i
            Meiotik giriş hüceyrələri Meyozda EU etiketli nüvələr E EU etiketinin müddətinə görə dəyişir
            Meiotik Giriş dərəcəsi EdU etiketinin hər saatında meiotik giriş nüvələri Şəkil 4C-dən yamac*** Saatda 20,3 nüvə
            G2 müddəti (median) 50% Şəkil 4A-dan kəsilir 2,5 saat
            G2 müddəti (maksimum) 99% Şəkil 4A-dan kəsilir 3,5 saat
            G2+M+G1 müddəti (maksimum) 99% Şəkil 4B-dən kəsilir 3,5 saat
            Hüceyrə dövrünün müddəti (median) median G2 müddəti / G2-index**** 6,5 saat
            Hüceyrə dövrünün müddəti (maksimum) maksimum G2 müddəti / G2-index**** 8.1 saat

            Cədvəl 2: Hüceyrə dövrü hesablamaları. *Hərflər müəyyən edilmiş nüvə siniflərini təmsil edir Cədvəl 1Şəkil 3. Hesablamalar Fox-dan dəyişdirilib və b. 2011 1 . **L4 mərhələsinin ortasından 24 saat sonra 20 ºC-də böyüdülmüş vəhşi tipli hermafroditlər üçün dəyərlər (± standart sapma). ***Qeyd edək ki, y-kəsici kəsişmə sıfır olmadığından, meiotik giriş sürətinin dəqiq hesablanması üçün reqressiya lazımdır. ****G2-indeksi, Fox və digərləri tərəfindən təsvir edildiyi kimi, S-faza indeksi, M-faza indeksi və təxmini G1-indeksini (2%) 100%-dən çıxmaqla müəyyən edilir. 2011 1 .

            Abunəlik Tələb olunur. Zəhmət olmasa JoVE-ni kitabxanaçınıza tövsiyə edin.

            Müzakirə

            EdU etiketli bakteriyaların hazırlanması (addım 1) bu protokol üçün vacibdir və problemlərin aradan qaldırılması üçün ilk nöqtədir. Vəhşi tipli gənc yetkin hermafroditlər 4 saatlıq EU impulsunda çox etibarlı şəkildə etiketlənir və bu, EdU etiketli bakteriyaların hər yeni partiyası üçün faydalı nəzarət edir. Bundan əlavə, bağırsağa daxil olan bütöv EdU etiketli bakteriyalar (yaşlı heyvanlarda və ya müəyyən farenks/öğütücü qüsurlu mutantlarda) klik kimyası ilə etiketlənəcək və bağırsaqda parlaq uzunsov punkta kimi görünəcək. Hermafroditlərin etiketlənməsi üçün alternativ üsul EU 3-ün yüksək konsentrasiyasında (1 mM) “islatmaq” istifadə edir. Bu texnika heyvanları etiketləmə müddətində ac saxlayır, lakin fiksasiya və klik kimyası ilə bağlı problemlərin həlli zamanı EdU etiketli bakteriyaların yaradılmasından yan keçmək üçün faydalı bir yol təqdim edir. EU “soak” təcrübəsi EU yemi olmadıqda uğurlu olarsa, yeni EU etiketli bakteriyalar hazırlayın. Yüksək EU tərkibinə nail olmaqla kifayət qədər bakterial sıxlığa çatmaq üçün EU və timidinin konsentrasiyalarını tənzimləmək lazım ola bilər.

            S-fazasının etiketlənməsi üçün bu texnikanın əsas məhdudiyyəti EU etiketli bakteriyaları heyvanlara qidalandırmaq ehtiyacıdır. Qidalana bilməyən heyvanlar (genotip və ya mərhələyə görə) bu texnika ilə etiketlənməyə bilər. Buna baxmayaraq, nukleozid analoqları hazırda S-faza nüvələrini müəyyən etmək üçün yeganə üsuldur C. elegans germline və onların istifadəsi heyvanlarda hər hansı transgenin olmasını tələb etmir. Bundan əlavə, birləşdikdən sonra EU nüvələrdə qalır, hətta onlar S-fazasından çıxdıqda, hüceyrə dövründə irəlilədikcə, bölündükdə və ya fərqləndikdə. Hər hüceyrə bölünməsi ilə siqnal yarıya qədər zəifləyir. Bu, EdU-nu hətta bir neçə hüceyrə bölməsi vasitəsilə hüceyrənin tarixini izləmək üçün mükəmməl edir.

            EdU-nun sabitliyi nəbz təqibi ilə bağlı təcrübələri sadə edir, sadəcə olaraq, istədiyiniz müddət nəbz bitdikdən sonra heyvanlardan artıq EU bakteriyasını yuyun və heyvanları etiketsiz bakteriyalara köçürün. EU DNT-də qalır və çoxlu hüceyrə bölünməsindən sonra da görünən qalır. Bununla belə, təcrübələr bir növ S-faza etiketi (Edu-nun tək nəbzi) ilə məhdudlaşır. EdU və BrdU ilə birgə etiketləmə məməli hüceyrələrində 31 mümkündür, lakin bu barədə məlumat verilməyib. C. elegans. IdU və CldU-nun birgə etiketlənməsi məməlilərdə istifadə olunur 32 lakin C. elegans.

            EU etiketləməsinin əsas üstünlükləri metodun heç bir transgen tələb etməməsidir, EU ilə qidalana bilər C. elegans müntəzəm mədəniyyət zamanı kimya immunofluoressensiya üsulları ilə uyğun gəlir və qidalanma dayandırıldıqdan sonra EU uzun müddət DNT-də qalır. Bu xüsusiyyətlər EDU-nu hüceyrə dövrünün və mikrob hüceyrəsi dinamikasının bir çox aspektlərini öyrənmək üçün əla alətə çevirir.

            EU ilə hüceyrə dövrü və germ hüceyrə dinamikası təhlili müxtəlif tədqiqat suallarına tətbiq oluna bilər. Bu metodun əlavə tətbiqlərinə dair bir neçə nümunə: Hüceyrə dövrü gen mutasiyaları olan heyvanlarda hüceyrə dövrünün dinamikası necə dəyişir? Fizioloji şərtlər kök hüceyrələrdə hüceyrə dövrünə, mikrob hüceyrələrinin meiotik profilaktika fazasına daxil olma sürətinə və meiotik profilaktika ilə mikrob hüceyrələrinin irəliləmə sürətinə necə təsir edir? Sürfələrin inkişafı zamanı hüceyrə dövrü necə dəyişir? Əsas siqnal yolunun pozulması hüceyrə taleyində dəyişikliklərə (məsələn, ektopik yayılma kimi) əlavə olaraq hüceyrə dövrünə necə təsir edir? Bu sistem hüceyrələrin bir çox fərqli şəraitdə nə etdiyini öyrənmək üçün dəyişdirilə bilər.

            Abunəlik Tələb olunur. Zəhmət olmasa JoVE-ni kitabxanaçınıza tövsiyə edin.

            Açıqlamalar

            Müəlliflərin açıqlaması üçün heç nə yoxdur.

            Təşəkkürlər

            -ya minnətdarıq E. coli MG1693 Wormbase üçün fond mərkəzi Caenorhabditis Təlim, məsləhət, dəstək və dəstək üçün Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar və John Brenner üçün reagentlər üçün statistik məsləhətlər üçün Zach Pincus ştammları üçün Milli Səhiyyə İnstitutunun Tədqiqat İnfrastruktur Proqramları Ofisi (P40OD010440) tərəfindən maliyyələşdirilən Genetika Mərkəzi faydalı müzakirə və bu əlyazma ilə bağlı rəy üçün Kornfeld və Schedl laboratoriyaları. Bu iş qismən Milli Sağlamlıq İnstitutları [R01 AG02656106A1-dən KK-ya, R01 GM100756-dan TS-ə] və Milli Elm Fondunun doktorluqdan əvvəl təqaüdü [DGE-1143954 və DGE-1745038-dən ZK] tərəfindən dəstəkləndi. Nə Milli Sağlamlıq İnstitutları, nə də Milli Elm Fondu məlumatların tədqiqi, toplanması, təhlili və şərhində, nə də əlyazmanın yazılmasında heç bir rol oynamayıb.


            Elektron əlavə materialı https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4369613 saytında onlayn əldə etmək olar.

            Məhdudiyyətsiz istifadəyə icazə verən Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ şərtlərinə əsasən Royal Society tərəfindən nəşr olunub, orijinal müəllif və mənbə qeyd olunmaqla.

            İstinadlar

            . 2015 "Mendel-Fişer mübahisəsindən" kənarda. Elm 350, 159-160. (doi:10.1126/science.aab3846) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Anava S, Posner R, Rechavi O

            . 2014 Transgenerational epigenetik miras: miflər və mexanizmlər. Hüceyrə 157, 95-109. (doi:10.1016/j.cell.2014.02.045) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2017 Transgenerativ kiçik RNT irsiyyətinin prinsipləri Caenorhabditis elegans . Curr. Biol. 27, R720-R730. (doi:10.1016/j.cub.2017.05.043) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Rechavi O, Mineviç G, Hobert O

            . 2011 Əldə edilmiş kiçik RNT əsaslı antiviral reaksiyanın transgenerasiya irsi C. elegans . Hüceyrə 147, 1248-1256. (doi:10.1016/j.cell.2011.10.042) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Gammon DB, Ishidate T, Li L, Gu W, Silverman N, Mello CC

            . 2017 Antiviral RNT müdaxilə cavabı ölümcül arbovirus infeksiyasına və şaquli ötürülməyə qarşı müqaviməti təmin edir. Caenorhabditis elegans . Curr. Biol. 27, 795-806. (doi:10.1016/j.cub.2017.02.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2012 Virusdan əldə edilən qısa müdaxilə edən RNT-lər tərəfindən idarə olunan host genlərinin susdurulması Caenorhabditis elegans . J.Virol. 86, 11 645-11 653. (doi:10.1128/JVI.01501-12) Crossref, ISI, Google Scholar

            Rechavi O, Houri-Ze'evi L, Anava S, Goh WSS, Kerk SY, Hannon GJ, Hobert O

            . 2014-cü ildə kiçik RNT-lərin aclıqdan qaynaqlanan transgenerasiya mirası C. elegans . Hüceyrə 158, 277-287. (doi:10.1016/j.cell.2014.06.020) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Jobson MA, Jordan JM, Sandrof MA, Hibshman JD, Ashley L, Baugh LR

            . 2015 Erkən həyat aclığının böyümə, çoxalma və stress müqavimətinə transgenerativ təsiri C. elegans . Genetika 201, 1-37. (doi:10.1534/genetics.115.178699) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2017 AMPK aclığa səbəb ola bilən transgenerasiya qüsurlarını bloklayır Caenorhabditis elegans . Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 114, E2689-E2698. (doi:10.1073/pnas.1616171114) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Webster AK, Jordan JM, Hibshman JD, Chitrakar R, Baugh LR

            . 2018 Uzadılmış Dauer diapazasının aclıqda sağ qalmasına və gen ifadəsi plastikliyinə transgenerativ təsirləri Caenorhabditis elegans . Genetika 210, 263-274. (doi:10.1534/genetics.118.301250) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Klosin A, Casas E, Hidalgo-Carcedo C, Vavouri T, Lehner B

            . 2017 Ətraf mühit məlumatlarının nəsil ötürülməsi C. elegans . Elm 356, 320-323. (doi:10.1126/science.aah6412) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Schott D, Yanai I, Hunter CP

            . 2014 Təbii RNT müdaxiləsi ətraf mühitə irsi reaksiyanı istiqamətləndirir. Sci. Rep. 4, 7387. (doi:10.1038/srep07387) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Ni JZ, Kalinava N, Chen E, Huang A, Trinh T, Gu SG

            . 2016-da istilik stressi ilə əlaqəli transkripsiya aktivləşməsini basdırmaqda rüşeym xətti nüvə RNT yolunun transgenerativ rolu C. elegans . Epigenet. Xromatin 9, 3. (doi:10.1186/s13072-016-0052-x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Kishimoto S, Uno M, Okabe E, Nono M, Nishida E

            . 2017 Ekoloji stresslər cücərmə xətti ilə soma əlaqəsi vasitəsilə nəsildən-nəslə irsi sağ qalma üstünlükləri yaradır. Caenorhabditis elegans . Nat. Kommun. 8, 14031. (doi:10.1038/ncomms14031) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Burton NO, Furuta T, Webster AK, Kaplan REW, Baugh LR, Arur S, Horvitz HR

            . 2017 Ananın cücərmə xəttinə insulin kimi siqnal ötürülməsi osmotik stresə nəslin reaksiyasına nəzarət edir. Nat. Hüceyrə Biol. 19, 252. (doi:10.1038/ncb3470) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Tauffenberger A, Parker JA

            . 2014 Stress müqavimətinin yüksək pəhriz qlükoza ilə irsi ötürülməsi Caenorhabditis elegans . PLoS Genet. 10, e1004346. (doi:10.1371/journal.pgen.1004346) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Szewczyk NJ, Kozak E, Conley CA

            . 2003 Kimyəvi olaraq müəyyən edilmiş mühit və Caenorhabditis elegans . BMC Biotechnol. 3, 19. (doi: 10.1186/1472-6750-3-19) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Laranjeiro R, Harinath G, Burke D, Braeckman BP, Driscoll M

            . 2017 Tək üzgüçülük seansları C. elegans məməlilərin məşqinin əsas xüsusiyyətlərinə səbəb olur. BMC Biol. 15, 30. (doi:10.1186/s12915-017-0368-4) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2000 Aksenik in vivo şəraitdə Heterorhabditis bacteriophora və Steinernema carpocapsae-nin patogenliyi, inkişafı və çoxalması. J. İnvertebr. Patol. 75, 55-58. (doi:10.1006/jipa.1999.4900) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Peters A, Han R, Yan X, Leite LG

            . 2017 Entomopatogen nematodların istehsalı. In Həşərat və gənə zərərvericilərinə qarşı mikroblarla mübarizə (red. L Leysi), səh. 157-170. London, Böyük Britaniya: Akademik Mətbuat. Crossref, Google Scholar

            . 1996 Pilot miqyaslı maye mədəniyyəti və entomopatogen nematodun yığılması, Heterorhabditis bakteriyofora . J. İnvertebr. Patol. 67, 92-99. (doi:10.1006/jipa.1996.0013) Crossref, ISI, Google Scholar

            Upadhyay D, Mandjiny S, Bullard-Dillard R, Storms M, Menefee M, Holmes LD

            . 2015 Laboratoriya miqyası in vitro entomopatogen nematodun kütləvi istehsalı Heterorhabditis bakteriyofora maye mədəniyyət fermentasiya texnologiyasından istifadə etməklə. am. J. Biosci. Bioeng. 3, 203. (doi:10.11648/j.bio.20150306.19) Google Scholar

            Werner MS, Sieriebriennikov B, Loschko T, Namdeo S, Lenuzzi M, Dardiry M, Renahan T, Sharma DR, Sommer RJ

            . 2017 Ətraf mühitin təsiri Pristionchus pacificus müxtəlif mədəniyyət üsulları ilə ağız forması. Sci. Rep. 7, 7207. (doi:10.1038/s41598-017-07455-7) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2006 Ekologiya Caenorhabditis növlər. WormBook , 6-7. (doi:10.1895/wormbook.1.37.1) Google Scholar

            . 2017 Təbii biotik mühit Caenorhabditis elegans . Genetika 206, 55-86. (doi:10.1534/genetics.116.195511) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            2016 Kodlanmayan DNT-nin zəngin bir sinfi stoxastik genlərin susdurulmasının qarşısını ala bilər. C. elegans germline. Hüceyrə 166, 343-357. (doi:10.1016/j.cell.2016.05.072) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Timmons L, Tabara H, Mello CC, Fire AZ

            . 2003 Induksiya olunan sistemli RNT susdurulması Caenorhabditis elegans . Mol. Biol. Hüceyrə 14, 2972-2983. (doi:10.1091/mbc.E03-01-0858) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Doh JH, Moore AB, Celen I, Moore MT, Sabanayagam CR

            . 2016 ChIP və çiplər: farmakologiya və genom miqyaslı analizlərdən istifadə edən korrelyativ tədqiqatlar üçün WormPharm-ın tətbiqi C. elegans . J. Biol. Metodlar 3, 44. (doi:10.14440/jbm.2016.109) Crossref, Google Scholar

            Çelen İ, Doh JH, Sabanayagam CR

            . 2018 Maye becərilməsinin gen ifadəsi və fenotipinə təsiri C. elegans . BMC Genomics 19, 562. (doi:10.1186/s12864-018-4948-7) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2011 Ascaroside ifadəsi Caenorhabditis elegans pəhriz və inkişaf mərhələsindən çox asılıdır. PLoS One 6, e17804. (doi:10.1371/journal.pone.0017804) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            von Reuss SH, Bose N, Srinivasan J, Yim JJ, Judkins JC, Sternberg PW, Schroeder FC

            . 2012 Müqayisəli metabolomika kiçik molekullu siqnalların modul kitabxanası olan askarozidlərin biogenezini aşkar edir. C. elegans . J. Am. Kimya. Soc. 134, 1817-1824. (doi:10.1021/ja210202y) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2017 Sürfələrin sıxlaşması sürətlənir C. elegans inkişaf etdirir və ömrünü azaldır. PLoS Genet. 13, e1006717. (doi:10.1371/journal.pgen.1006717) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2008 Kiçik molekulların qarışığı həm cütləşməni, həm də inkişafı tənzimləyir Caenorhabditis elegans . Təbiət 454, 1115-1118. (doi:10.1038/nature07168) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 1985 istehsalına təsir edən gen Caenorhabditis elegans dauer induksiya edən feromon. MGG Mol. General Genet. 198, 534-536. (doi:10.1097/01.EPX.0000417960.79703.06) Crossref, Google Scholar

            McGrath PT, Xu Y, Ailion M, Garrison JL, Butcher RA, Bargmann CI

            . 2011 Evləşdirilmişlərin paralel təkamülü Caenorhabditis növ feromon reseptor genlərini hədəf alır. Təbiət 477, 321-325. (doi:10.1038/nature10378) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 1977 Nematodun kimyosensor mutantlarında spesifik neyroanatomik dəyişikliklər Caenorhabditis elegans . J. Komp. Neyrol. 172, 489-510. (doi:10.1002/cne.901720306) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Perkins LA, Hedgecock EM, Thomson JN, Culotti JG

            . 1986 Nematodda mutant həssas kirpiklər Caenorhabditis elegans . Dev. Biol. 117, 456-487. (doi:10.1016/0012-1606(86)90314-3) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Bargmann CI, Hartwieg E, Horvitz HR

            . 1993 Odorant-selektiv genlər və neyronlar qoxuya vasitəçilik edir C. elegans . Hüceyrə 74, 515-527. (doi:10.1016/0092-8674(93)80053-H) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2013 İnsulin/insulinə bənzər böyümə faktoru siqnalı C. elegans . WormBook , 1-43. (doi:10.1895/wormbook.1.164.1) Crossref, PubMed, Google Scholar

            BA Buckley, Burkhart KB, Gu SG, Spracklin G, Kershner A, Fritz H, Kimble J, Fire A, Kennedy S

            . 2012 Nüvə Argonaute çox nəsil epigenetik miras və cücərmə xəttinin ölməzliyini təşviq edir. Təbiət 489, 447-451. (doi:10.1038/nature11352) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Guang S, Bochner AF, Pavelec DM, Burkhart KB, Harding S, Lachowiec J, Kennedy S

            . 2008 Argonaute siRNA-ları sitoplazmadan nüvəyə nəql edir. Elm 321, 537-541. (doi:10.1126/science.1157647) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Burton NO, Burkhart KB, Kennedy S

            . 2011 Nüvə RNTİ-də irsi gen susdurulmasını təmin edir Caenorhabditis elegans . Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 108, 19 683-19 688. (doi:10.1073/pnas.1113310108) Crossref, ISI, Google Scholar

            Sapetschnig A, Sarkies P, Lehrbach NJ, Miska EA

            . 2015 Üçüncü siRNA-lar paramutasiyaya vasitəçilik edir C. elegans . PLoS Genet. 11, e1005078. (doi:10.1371/journal.pgen.1005078) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Gu SG, Pak J, Guang S, Maniar JM, Kennedy S, Fire A

            . 2012 siRNA-nın gücləndirilməsi Caenorhabditis elegans transgenerativ ardıcıllıqla hədəflənmiş histon H3 lizin 9 metilasiya izi yaradır. Nat. Genet. 44, 157-164. (doi:10.1038/ng.1039) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Lev I, Gingold H, Rechavi O

            . Mətbuatda. H3K9me3 yeni təkamül etmiş genlərin unikal alt dəstini hədəf alan kiçik RNT-lərin transgenerativ irsiyyəti üçün tələb olunur. eLife. (doi: 10.1101/338582) Google Scholar

            Lev I, Seroussi U, Gingold H, Bril R, Anava S, Rechavi O

            . 2017 MET-2-dən asılı H3K9 metilasiyası transgenerasiyalı kiçik RNT mirasını boğur. Curr. Biol. 27, 1138-1147. (doi:10.1016/j.cub.2017.03.008) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2017 Heterokromatin faktorlarından ibarət bir qrup təkrarlanan elementlər və mikrob xətti stressi ilə mübarizə aparmaq üçün kiçik RNT yolları ilə əməkdaşlıq edir. eLife 6, e21666. (doi:10.7554/eLife.21666) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Towbin BDD, González-Aguilera C, Sack R, Gaidatzis D, Kalck V, Meister P, Askjaer P, Gasser SMM

            . 2012 Histon H3K9-un pilləli metilasiyası heterokromatini nüvə periferiyasında yerləşdirir. Hüceyrə 150, 934-947. (doi:10.1016/j.cell.2012.06.051) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Spracklin G, Fields B, Wan G, Vijayendran D, Wallig A, Shukla A, Kennedy S

            . 2017 İdentifikasiyası və xarakteristikası C. elegans RNAi miras maşınları. Genetika 206, 1-19. (doi:10.20944/preprints201702.0096.v1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Hodgkin J, Félix M-A, Clark LC, Stroud D, Gravato-Nobre MJ

            . 2013 iki Leykobakter suşlar tamamlayıcı virulentlik göstərir Caenorhabditis o cümlədən qurd-ulduz əmələ gəlməsi ilə ölüm. Curr. Biol. 23, 2157-2161. (doi:10.1016/j.cub.2013.08.060) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Ehlers R-U, Lunau S, Krasomil-Osterfeld K, Osterfeld KH

            . 1998 Entomopatogen nematod-bakteriya-kompleks Heterorhabditis megidis/Photorhabdus luminescens-in maye kulturası. BioControl 43, 77-86. (doi:10.1023/A:1009965922794) Crossref, ISI, Google Scholar

            . 1998 Qida siqnalının istehsalı Photorhabdus luminescens entomopatogen nematodların bərpasına təkan verir Heterorhabdit spp. maye mədəniyyətdə. Tətbiq. Mikrobiol. Biotexnol. 50, 369-374. (doi:10.1007/s002530051306) Crossref, ISI, Google Scholar

            . 2010 Mədəniyyətlərinizi yoxlayın! Çarpaz çirklənmiş və ya səhv müəyyən edilmiş hüceyrə xətlərinin siyahısı. Int. J. Xərçəng 127, 1-8. (doi:10.1002/ijc.25242) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2018 Genetik və transkripsiya təkamülü xərçəng hüceyrə xəttinin dərman reaksiyasını dəyişdirir. Təbiət 560, 325-330. (doi:10.1038/s41586-018-0409-3) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 1998 Hüceyrə sinxronizasiyası. Metodlar Cell Biol. 57, 229-249. (doi:10.1016/S0091-679X(08)61582-4) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Niida H, Matsumoto T, Satoh H, Shiwa M, Tokutake Y, Furuichi Y, Shinkai Y

            . 1998 Telomeraza RNT komponenti olmayan siçan hüceyrələrində ciddi böyümə qüsuru. Nat. Genet. 19, 203-206. (doi:10.1038/580) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Campos EI, Stafford JM, Reinberg D

            . 2014 Epigenetik miras: nəsillər arasında histon əlfəcinləri. Trends Cell Biol. 24, 664-674. (doi:10.1016/j.tcb.2014.08.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            . 2013 Düyü təmiz cinslərində, F1 hibridlərində və poliploidlərində toxuma mədəniyyəti ilə bağlı genetik və epigenetik dəyişikliklər. BMC Bitki Biol. 13, 77. (doi: 10.1186/1471-2229-13-77) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Gialitakis M, Arampatzi P, Makatounakis T, Papamatheakis J

            . 2010 Gamma interferondan asılı transkripsiya yaddaşı bir gen lokusunun PML nüvə cisimlərinə yenidən yerləşdirilməsi ilə. Mol. Hüceyrə. Biol. 30, 2046-2056. (doi:10.1128/MCB.00906-09) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

            Light WH, Freaney J, Sood V, Thompson A, D'Urso A, Horvath CM, Brickner JH


            MATERİALLAR VƏ METODLAR

            Becərilməsi C. elegans qurdlar

            Caenorhabditis elegans yabanı tipli ştam N2, qidalanma qüsurlu mutant DA531 yemək-1 (e2343), və kemotaksis mutantları CB1033 che-2 (e1033), FK100 vergi-2 (p671), CX2065 odr-1 (n1936) və CX2205 odr-3 (n2150) -dan əldə edilmişdir Caenorhabditis Genetika Mərkəzi, Minnesota Universiteti.

            Nematodlar əsasən Sulston və Hodgkin tərəfindən təsvir edildiyi kimi idarə olunurdu (Sulston və Hodgkin, 1988). Üç gənc yetkin qurd, platin məftil seçicidən istifadə edərək, nematodların böyüməsi mühitinin (NGM) agar boşqabına toxumlanmış 6 sm plastik Petri qabına yerləşdirildi. E. coli OP50 ştammı, 20°C-də 3-4 gün ərzində becərilir və bu becərmə dövrü ilə saxlanılır. OP50 37°C-də Luria-Bertani (LB) maye mühitində (1% polipepton, 0.5% Difco Maya Ekstraktı, 1% NaCl) kulturlandı.

            Mikrosferlərin yığılması üçün analiz

            Mikrosferlər olaraq biz əsasən Fluoresbrite® Polistirol Karboksilat Ölçü Aralığı I və II dəstlərindən istifadə etdik (sarı-yaşıl floresan Polysciences Inc., Warrington, PA, ABŞ Kit I: 0.116±0.005, 0.210±0.013, 0.5116±0.0.2 və 0.516±0.0.2 və 0.516±0.0.9 ±0,028 μm diametrlər Kit II: 1,67±0,032, 1,83±0,061, 2,89±0,15, 4,87±0,25 və 6,60±0,60 μm diametrlər). Bəzi təcrübələrdə Fluoresbrite® Carboxy BB mikrosferləri (mavi flüoresan, 0,483±0,010 μm Polysciences Inc.) mikrosferlərin, karboksilatın, amin və ya sulfatla modifikasiya olunmuş lateksin səthi kimyəvi təbiətinə əsaslanan ayrı-seçkiliyi araşdırmaq üçün də təcrübələrdə istifadə edilmişdir. ) muncuqlardan (sarı-yaşıl flüoresan, φ1.0 μm Sigma-Aldrich, St Louis, MO, ABŞ) istifadə edilmişdir. Orijinal ehtiyatlardan başqa, mikrosferlər soyuducuda 90% etanolda 1/10 seyreltilmiş ehtiyat və 9% etanolda 1/100 seyreltilmiş ehtiyat şəklində saxlanılmışdır.

            Mikrosferin toplanmasının təhlili üçün 100 μl asqı 1,0 × 10 9 ml -1 0,5 μm və ya 1,0 × 10 8 ml -1 1,0 μm mikrosfer 100 μl S-bazal tampon (Sulston və Hod1988) ilə qarışdırıldı. , və qarışıq 3 sm NGM agar boşqabına qoyuldu (Sulston və Hodgkin, 1988) və boşqab təmiz skamyada əyilməklə yayıldı. Plitə mayenin udulması üçün 30-60 dəqiqə buraxıldı və 20°C inkubatorda saxlanıldı. Qidanın mövcudluğunda qəbulu təhlili üçün, E. coli OP50 hüceyrələri bir NGM mədəniyyət lövhəsindən S-bazala çıxarıldı, sıxlıq tənzimləndi və hüceyrə süspansiyonu mikrosfer süspansiyonu ilə qarışdırıldı. Mikrosferlərin və ya hüceyrələrin sıxlığı bakteriya sayğacı və mikroskopla ölçüldü.

            Təhlil üçün, 4 gün ərzində becərilmiş qurdlar 1 ml S-bazalda 6 sm NGM boşqabından çıxarıldı və qurdlar çöküntüdən sonra, supernatantın çıxarılması, 1 əlavə edilməsi ilə yuyulma cəmi üç dəfə təkrarlandı. ml yeni S-bazal və öz-özünə çökmə. On beş mikrolitr yuyulmuş qurd süspansiyonu OP50 ilə toxumlanmış 6 sm-lik NGM boşqabına qoyuldu və qurdlar 2 saat 20°C-də becərildi. Sonra qurdlar əvvəlki kimi iki yuyulma ilə bərpa edildi və 5 μl qurd süspansiyonu yuxarıdakı kimi hazırlanmış mikrosferlərlə toxumlanmış 3 sm NGM boşqabına qoyuldu və boşqab mikrokürələrin udulması üçün inkubasiya edildi. İnkubasiyadan sonra boşqabın mərkəzindəki üç qurd 2 dəqiqə ərzində Parafilm üzərində 50 μl S-bazalda yuyularaq mikrosferlərdən ayrıldı. Daha sonra qurdlar 200 mmol l-1 Na ​​azid (NaN) olan agar yastığında (Sulston və Hodgkin, 1988) anesteziya edilmişdir.3) və sürüşmə şüşəyə qoyulur. Aqar yastığındakı qurdlar Nikon ECLIPSE 80i mikroskopu (Tokio, Yaponiya) altında araşdırıldı və mikrosferlərin ağ-qara floresan mikrofotoqrafları rəqəmsal kamera (Digital Sight DS-2MBWc-U2, Nikon) ilə çəkildi. neytral sıxlıq filtri 4 (həyəcan işığının intensivliyi maksimumun 25%-i) standart şərt kimi. Qurdda yığılmış mikrokürələrin flüoresanlığı WinROOF (Mitani Corp. Ltd, Tokio, Yaponiya) təsvir analizi proqramından istifadə etməklə qiymətləndirilmiş və anesteziya zamanı qurddan çıxarılan mikrosferlərin flüoresansını əlavə etməklə düzəldilmişdir. ± s.e.m. 10 qurdun flüoresansından əldə edilmişdir. Bu düzəliş olmadan bəzi təcrübələrdə qurdları qəbul etdikdən sonra anesteziya etmək üçün boşqaba 50 μl 50 mmol l -1 Na ​​azid əlavə edildi və sonra 15 yetkin qurd 200 μl 50 mmol l -1 Na ​​azid içərisinə yerləşdirildi. Səkkiz yüz mikrolitr S-bazal əlavə edildi, qarışıq 1700-də sentrifuqa edildi. g 1 dəqiqə ərzində və 15 μl çöküntü qurdları sürüşmə şüşəyə yapışdırılmış ikitərəfli yapışan lentdən kəsilmiş 1 sm 2 boşluğa yerləşdirildi. Floresans yuxarıda göstərildiyi kimi yoxlanıldı. Bir qurd tərəfindən yığılan mikrokürələrin sayı qurdun ümumi floresansını mikrosferin orta flüoresansına bölmək yolu ilə təxmin edilmişdir, bu, 0,5 mkm-ə qədər olan mikrosferlər üçün birbaşa ölçülən və 0,2 və 0,1 mkm mikrosferlər üçün flüoresans arasındakı xətti əlaqə ilə hesablanmışdır. və ölçüsü 0,5 - 2 μm olan kürələr üçün həcm.

            Birinci instar (L1) sürfələri tərəfindən yığılmanın təhlili üçün 4-5 gün ərzində becərilmiş qurdlar nematod yumurtalarını hazırlamaq üçün qələvi ağartıcı ilə müalicə edildi (Sulston və Hodgkin, 1988). Yumurtalar bakteriyasız 3 sm NGM boşqabında inkubasiya edildi və nəticədə L1 sürfələri bərpa edildi, yuyuldu və 20 ° C-də 30 dəqiqə ərzində qəbul edilmək üçün inkubasiya edildi.


            Lüğət

            Biotransformasiya

            Kimyəvi birləşmənin orqanizm tərəfindən kimyəvi dəyişməsi. Bunlara qida maddələri, toksinlər, ksenobiotiklər daxil ola bilər.

            Kommensalizm

            Orta əsr Latın dilindən com mensa və ya "eyni masanı paylaşmaq". İki növün fərdləri arasındakı əlaqə, bir növün digərinə zərər vermədən və ya fayda vermədən fayda əldə etməsi.

            Pəhriz məhdudiyyəti

            Bir çox heyvan növünün məhsuldarlığını azaldan və ömrünü artıran aclıq olmadan qida qəbulunun azaldılması. Kalori məhdudiyyəti kimi də tanınır.

            Disbakterioz

            Dishomeostazın yaranmasına səbəb olan bağırsaqda mikrob balansının pozulması vəziyyəti.

            Bağırsaq mikrobiotası

            Ev sahibi mədə-bağırsaq traktında yaşayan mikrobların kollektiv icması. Təbiətdəki qurdlardan fərqli olaraq, laboratoriyada nematodlar adətən tək bir bakteriya ştammının iştirakı ilə yetişdirilir.

            Holobiont

            Bir orqanizm və onunla əlaqəli simbiotik mikroblar. Bu hologenom nəzəriyyəsində seçim vahididir.

            Mikrobiom

            Bir insanın mikrobiotasının kollektiv genomik tərkibi.

            Mutualizm

            Fərqli növlərin fərdləri arasında hər iki növün qarşılıqlı təsirdən faydalandığı münasibət.

            Nekromeniya

            Ev sahibi orqanizmə bağlanan və öldükdən sonra onun çürüyən cəsədi ilə qidalanan orqanizmin davranışı.

            Patobiont

            Ev sahibi və/və ya mikrobiota dishomeostazı şəraitində patoloji yarada bilən mikrobiotanın üzv növləri. Patogendən fərqlidir.

            Probiotik

            Canlı orqanizmlər, udulduqda ya ev sahibi ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqə quraraq, ya da mikrobiotanın digər üzvlərinin modulyasiyası yolu ilə ev sahibinə sağlamlıq faydaları verir. Nəsildən olan bakteriya ştammları LactobacillusBifidobakteriya namizəd probiyotiklərdir.

            Simbiont

            Başqası ilə qarşılıqlı faydalı əlaqədə olan orqanizm.

            Simbioz

            İki növ arasında sıx və uzunmüddətli faydalı qarşılıqlı əlaqə.

            Tip-2 diabet

            Nisbi insulin çatışmazlığı və insulin müqaviməti kontekstində yüksək qan qlükoza ilə xarakterizə olunan pandemik xəstəlik. Dünya əhalisinin təxminən 6%-i bu metabolik pozğunluqdan əziyyət çəkir.

            Qurd-böcək

            Termin burada holobiont konsepsiyasının uzantısı kimi yaranmışdır. Canlılıq və təkamül baxımından bölünməz bir varlıq kimi nematod-mikrob cütlüyünə istinad edir.


            Videoya baxın: P. pacificus eats C. elegans! (Avqust 2022).