Məlumat

MS2 RNT bağlayıcı zülalın hər hansı tərcümə repressiya təsiri varmı?

MS2 RNT bağlayıcı zülalın hər hansı tərcümə repressiya təsiri varmı?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Quora-dan təkrar yayımlandı: http://www.quora.com/Does-the-MS2-RNA-binding-protein-have-any-translational-repression-effects

Mən MS2 zülalının RNT saç sancağı hədəfinə bağlanmasını düşünürəm. MS2 zülalının ORF-nin yuxarı hissəsində yerləşdirilən saç sancağı ilə qarşılıqlı təsiri hər hansı tərcümə repressiyasına səbəb ola bilərmi?


Güman edirəm ki, siz mRNA-lar üçün mTAG vizuallaşdırma texnikasından danışırsınız (1). Yəqin ki, siz onunla tanışsınız, lakin maraq doğuran OFR onun aşağı axınında və 3'UTR-dən yuxarıda MS2L ardıcıllığı ilə işarələnir. Həm maraqlandıran mRNT-ni, həm də tərcümə olunan zülalları görüntüləyə biləcəyiniz dəyişdirilmiş bir versiya da var, aşağıdakı şəkilə baxın (2). Haim və həmkarları aşkar etdilər ki, mCherry və MS2L ilə işarələnmiş ATP2 ifadə edən maya, ATP2-nin səmərəli tərcüməsini tələb edən qliserol tərkibli mühitlərdə böyüyür.

Beləliklə, ORF-nin aşağı axınında mRNA-nı işarələsəniz, heç bir tərcümə repressiyasının olmadığını güman edərdim. Maraqlanan ORF-ni başlanğıc kodonunun yuxarı hissəsindəki MS2 ilə işarələmək üçün çox yaxşı səbəbiniz olmasa, mən bunu etməzdim, çünki bu kök döngə strukturları çox güman ki, tərcüməni dayandıracaq, çünki mRNA ikincili strukturu tərcümənin başlanmasında iştirak etmişdir. səmərəlilik.


PUF zülal ailəsinin iskelesindən istifadə edərək hədəflənmiş tərcümə tənzimlənməsi

mRNT-lərdə əmələ gələn tənzimləyici komplekslər tərcüməni, sabitliyi və lokalizasiyanı idarə edir. Bu komplekslər iki fəaliyyətə malikdir: biri RNT-ni bağlayan, digəri isə bioloji funksiyanı yerinə yetirən effektor. RNT bağlayıcı zülalların Pumilio və FBF (PUF) zülal ailəsi yeni spesifikliklərə malik zülalların layihələndirilməsi və seçilməsi üçün çox yönlü bir baza təmin edir. Burada, PUF iskele xüsusi mRNA-ların translyasiya aktivləşdirilməsini və repressiyasını hədəfləmək və spesifik poli(A) əlavə və çıxarılmasını induksiya etmək üçün istifadə olunur. Bunu etmək üçün PUF iskele zülallarını tərcümə aktivatoru, GLD2 və ya tərcümə repressoru, CAF1 ilə əlaqələndirdik. Kimerik zülallar hədəflənmiş mRNA-ları aktivləşdirir və ya repressiya edir Ksenop oositlər və poli(A) əlavə və ya xaric edilməsinə səbəb olur. Tərcümə nəzarətinin böyüklüyü birbaşa RNT-protein kompleksinin 100 qat diapazonunda yaxınlığına aiddir. Kd. Kimerik zülallar həm məruzəçi, həm də endogen mRNT-lərdə fəaliyyət göstərir: oositlərin yetişməsi zamanı normal olaraq ölü olan mRNT, əvəzinə müvafiq ximeranın iştirakı ilə poli(A) alır. PUF-effektor strategiyası in vivo olaraq spesifik mRNA-ların tərcüməsinə və sabitliyinə təsir edən zülalların dizaynına imkan verir.

Messenger RNT nəzarəti geniş yayılmışdır. Tərcüməni, sabitliyi və lokalizasiyanı idarə edən tənzimləyici komplekslər hədəf mRNT-lərin 3′UTR-sindəki elementlərdə əmələ gəlir (1 –8). Bu tənzimləyici komplekslər iki fəaliyyətə malikdir: biri RNT spesifikliyini təmin edir, digəri isə nəticəni təyin edən effektor. Bu fəaliyyətlər kompleksdə eyni və ya fərqli molekullarda ola bilər.

Effektor domenləri zülalı reportyor mRNT-nin 3′UTR-yə bağlamaq yolu ilə təhlil edilə bilər. Bəzən “birləşdirilmiş funksiya” təhlili adlandırılan bu ümumi yanaşma məlum tənzimləyicilərin fəaliyyətini müəyyən etmək, onları daha kiçik tənzimləyici bölgələrə bölmək və onların fəaliyyət mexanizmlərini təhlil etmək üçün istifadə edilmişdir (9-11). Bu yanaşmanın bir üstünlüyü RNT-nin bağlanması və effektor fəaliyyətinin ayrılmasıdır. Tipik olaraq, təhlil ediləcək zülalın toplanması, MS2 örtük zülalı və ya λ N-zülalının bağlanma yeri kimi yaxşı xarakterizə edilmiş, yüksək yaxınlıqlı RNT-zülal qarşılıqlı təsirindən istifadə etməklə həyata keçirilir. Bir çox təcrübələr üçün 3′UTR bağlayıcı yerləri daxil etmək üçün ideal yerdir: onların plastikliyi xarici ardıcıllığın daxil edilməsinə dözür və çoxlu təbii tənzimləyici zülalları cəlb edir.

Bu yazıda biz Pumilio və FBF (PUF) zülalının canlı hüceyrələrdə translyasiya effektor sahələrini bağlamaq üçün bir cihaz kimi istifadəsini araşdırırıq. PUF zülalları spesifik, qısa RNT ardıcıllığını bağlayır (7). Bir neçə PUF zülalının RNT ardıcıllığının spesifikliyi, bir neçə PUF-RNT kompleksinin quruluşu kimi eksperimental olaraq müəyyən edilmişdir. Bu günə qədər tədqiq edilmiş bütün PUF zülalları üç α-spiraldan ibarət rampalı üçbucağın səkkiz dəfə təkrarlandığı oxşar skafolddan ibarətdir (Şəkil 1) (12-14). Bu təkrarlar birlikdə uzadılmış qövs əmələ gətirir. Qövsün bir üzündə RNT-ni bağlayan səkkiz α-sarmal var, bunlara RNT-nin tanınması sarmalları deyilir.

PUF-RNT komplekslərinin arxitekturası. Səkkiz RNT-nin tanınması üçün spiral (struktur və diaqramda qırmızı) amin turşularının RNT bazası ilə təmasda olmasına kömək edir (struktur və diaqramda mavi). FBF-2 strukturunda yaşıl əsaslar çevrilmiş əsaslara uyğundur. Düz xətlər RNT ilə göstərilən sarmal arasında bir və ya bir neçə kontaktı göstərir. (A) İnsan Pumilio1-RNT kompleksi (12). (B) C. elegans FBF-2-RNT kompleksi (24)

PUF iskele RNT ardıcıllığının tanınması üçün çox yönlü rejimi təmin edir. Ən sadə vəziyyətdə, insan Pumilio nümunəsi, səkkiz təkrar səkkiz nukleotidi tanıyır: hər bir RNT tanınması α-heliks bir baza bağlayır (Şəkil 1).A) (12). Bağlayıcı qarşılıqlı təsirlər hər təkrarda üç qorunmuş amin turşusu qalıqlarını əhatə edir: ikisi əsaslarla, digəri isə əsaslar arasında sıx əlaqə qurur. Təbii olaraq meydana gələn PUF zülalları PUF domeninin pozulmaları vasitəsilə fərqli spesifikliklərini əldə edirlər. Bəzi hallarda, PUF strukturunun pozulması, ehtimal ki, əyrilikdə dəyişikliklər də daxil olmaqla, əlavə əsaslar tələb edir ki, bunlar misal olaraq zülaldan “ayrıla” bilər. Caenorhabditis elegans FBF-2 (Şəkil 1B) (15-19). Digər PUF zülallarında zülalın bir ucunda əlavə α-spirallar əlavə əsaslar üçün ciblər əmələ gətirir və yerin uzunluğunu uzadır (20).

PUF arxitekturası yeni RNT spesifikliyi ilə zülallar yaratmaq üçün çox yönlü bir iskele təmin edir. Mutasiyalar təbii PUF-RNT komplekslərinin məlum strukturlarına (12, 16, 18, 21, 22, 23-24) əsaslanaraq, RNT spesifikliyini dəyişdirmək üçün rasional şəkildə tərtib edilə bilər. Yeni spesifikliklər bir seqmentin bir zülaldan digərinə köçürülməsi, hədəflənmiş mutagenez və ya protein kitabxanalarından genetik seçimlər yolu ilə əldə edilə bilər (18, 23). Beləliklə, PUF iskele müxtəlif məqsədlər üçün yeni spesifikliklərə malik zülalların dizaynı üçün uyğun alət təmin edə bilər.

Effektiv zülallar, GLD2 və CAF1, tərcümə və poli(A) quyruq uzunluğuna nəzarət edir. GLD2 sitoplazmik poli(A) polimerazdır. Erkən inkişaf zamanı və sinir sistemində xüsusi mRNA-ların tərcüməsini aktivləşdirir (25-30). CAF1 dedenilazadır və poli(A) quyruqlarını qısaldır (31, 32). Bundan əlavə, CAF1, hətta deadenylase aktivliyi olmadıqda belə davam edən daxili tərcümə repressiya fəaliyyətinə malikdir (33). Həm GLD2, həm də CAF1 RNT-ni birləşdirən digər zülalların təsiri ilə xüsusi mRNT-lərə cəlb olunur, çünki onlar RNT-ni tək başına yüksək yaxınlıqda bağlamırlar.

Xenopus laevis oositlər PUF iskelesinin bağlama qurğusu kimi faydalılığını yoxlamaq üçün əla sistem təmin edir. Endogen tərcümə mexanizmi mikroinyeksiya edilmiş RNT-ləri tərcümə edir və zülal istehsalı asanlıqla izlənilə bilər (34, 35). Enjekte edilmiş RNT-lər, tərcümə fəaliyyətinin təhlilini asanlaşdıran poli(A) olmasa belə, adətən sabitdir. Oositlərdə müxtəlif aktivləşdirmə və repressiya sahələri müəyyən edilmişdir (9, 10, 26, 28, 33, 36, 37) və sitoplazmik poli(A) əlavə və çıxarılması hadisələri yaxşı sənədləşdirilmişdir (30, 38, 39, 40, 41, 42, 43–44).

Burada, PUF iskelesinin in vivo olaraq xüsusi mRNA-lara effektor domenlərini hədəfləmək üçün istifadə oluna biləcəyini yoxlayırıq. Translyasiya effektor sahələrini həm reportyor, həm də endogen mRNA-lara bağlamaq üçün təbii və mutant PUF zülallarından istifadə edirik. Nəticələrimiz göstərir ki, tərcümə fəaliyyəti dizaynla artırıla və ya azalda bilər. Sitoplazmada mRNT fəaliyyətinin məqsədyönlü modulyasiyası üçün bu yanaşmanı müzakirə edirik.


Mücərrəd

Trans-fəaliyyət göstərən RNT-ni bağlayan zülallar (RBP) 5′ və 3′ tərcümə olunmamış bölgələrdə ardıcıl elementlərlə qarşılıqlı əlaqədə olmaqla mRNT tərcüməsini tənzimləyir. Bu RBP-lər mRNA-ların ribosoma cəlb edilməsinə nəzarət edə və zülal sintezinin sürətini tənzimləyə və ya alternativ olaraq mRNT-nin qeyri-sabitliyini/deqradasiyasını tənzimləməklə mRNT tərcüməsini sıxışdıra bilər.


Nəticələr

PfAlba1 vacibdir, lakin C-terminal Ty1 etiketi olan epizomdan həddindən artıq ifadə edilə bilər. P. falciparum qan mərhələləri

Çoxsaylı cəhdlər ya döymək ALBA1 (PF3D7_0803200) PfAlba1 üçün induksiya olunan protein yıxılan parazitlərin lokalizasiyası və ya yaradılması uğursuz oldu (Əlavə fayl 1-də Şəkil S1). İki fərqli plazmid konstruksiya ilə üç müstəqil transfeksiyadan sonra (Əlavə fayl 1-də Şəkil S1a), biz gen nokaut parazitləri əldə etmədik ki, bu da ALBA1 yer üçün zərərli idi P. falciparum eritrositdaxili artım. Bundan sonra, biz şərti zülal yıxma yanaşmasını qəbul etdik, burada biz dəyişdirdik ALBA1 ilə işarələnmiş PfAlba1 ifadə etmək yeri Escherichia coli Kiçik molekul trimetroprin (TMP) [22] tərəfindən stabilləşdirilən DHFR stabilizasiya sahəsi (eDHFR) (Əlavə fayl 1-də Şəkil S1b). ALBA1-eDHFR-HA transgen parazitləri TMP olmadan yetişdirildikdə, hətta 10 gündən sonra da PfAlba1-eDHFR-HA səviyyələrində əhəmiyyətli azalma müşahidə etmədik (Əlavə fayl 1, gün 7 və 10-da Şəkil S1c) panellər), işarələnmiş zülalın stabilləşdirici dərmana odadavamlı olduğunu göstərir. Nəhayət, biz hipermorf parazitlər yaratdıq ALBA1, 3D7-ni heteroloji kalmodulin promotorundan PfAlba1, PfAlba1-Ty1-in C-terminal etiketli versiyasını kodlayan plazmid ilə transfeksiya etməklə (P cam) (Şəkil 1a). western blotting istifadə edərək, biz anti-Ty1 və anti-PfAlba1 antikorları ilə PfAlba1-Ty1 aşkar etdik (Şəkil 1b) və immunofluoressensiya analizlərindən istifadə edərək etiketlənmiş zülalın trofozoit və şizont mərhələlərində lokalizasiyasını təhlil edərkən, PfAlba1-Ty1-in üstünlük təşkil etdiyini aşkar etdik. sitoplazmik (Şəkil 1c) yerli PfAlba1 [20] üçün təsvir edildiyi kimi.

C-terminal etiketli PfAlba1-Ty1 epizomdan uğurla ifadə edildi P. falciparum aseksual qan mərhələləri. a pPfAlba1-Ty1C plazmidinin transfeksiyası və saxlanması genomik DNT-nin PCR ilə təsdiq edilmişdir. Primer cütləri endogen hədəflənir ALBA1 (p1+p2 Primer ardıcıllığı üçün Əlavə fayl 11-ə baxın), the ALBA1-TY1 epizomda yer (p3+p4p5+p6) və əlaqəli olmayanlar ALBA4 genomik yer (A4F+R), ya transfeksiya edilməmiş 3D7 parazitlərində, ya da boş vektoru və ya pPfAlba1-Ty1C-ni saxlayan parazitlərdə. sxem (üst panel) miqyasda çəkilmir UTR = tərcümə olunmamış bölgə. Ən sol zolaq (alt panel) ölçü markerini, GeneRuler 1 kb Plus DNT Ladder (Fermentas, Life Technologies) təmsil edir. b PfAlba1-Ty1 boş vektordan və ya PfAlba1-Ty1 parazitlərindən hazırlanmış zülal lizatlarında gel elektroforezini denatürasiya etməklə və siçan anti-Ty1 anticisimləri və ya anti-PfAlba1 anticisimləri ilə vestern blotlama yolu ilə aşkar edilmişdir. PfAldolase yükləmə nəzarəti kimi xidmət edirdi. c Trofozoitdə PfAlba1-Ty1-in lokalizasiyasını müəyyən etmək üçün immunofluoressensiya analizlərindən istifadə edilmişdir (T) və şizont (S) PfAlba1-Ty1 parazitlərinin mərhələləri. Boş vektor transfektantları mənfi nəzarət rolunu oynadı. İstifadə olunan antikorlar arasında siçan anti-Ty1 (yaşıl) və ya anti-PfAlba1 (qırmızı). Nüvələr DAPI ilə etiketlənmişdir (mavi). Ölçək çubuğu 1 μM-i təmsil edir

Həddindən artıq PfAlba1 səviyyələri eritrositdaxili böyüməni maneə törədir P. falciparum

PfAlba1-Ty1-i funksional olaraq xarakterizə etməzdən əvvəl, etiketlənmiş zülalın ifadə səviyyələrini modulyasiya edə biləcəyimizi araşdırdıq. P. falciparum IDC və əgər belədirsə, parazitin PfAlba1-Ty1 səviyyələri üçün tolerantlıq həddi olub-olmaması. İlkin olaraq böyümə mühitində 2,5 μg/ml blastisidin-S (BS) ilə böyüyən 3D7+PfAlba1-Ty1 parazitlərini iki gün ərzində artan miqdarda BS ilə müalicə etdikdə, PfAlba1-Ty1 protein səviyyələri tədricən artdı (Şəkil 2a), 2,5 μg/ml BS-ə nisbətən 20 μg/ml BS-də maksimum beşqat yuxarı tənzimləməyə çatır (Şəkil 2b). Biz həmçinin endogen PfAlba1 səviyyələrinin BS dozadan asılı şəkildə artdığını müşahidə etdik (Əlavə fayl 1-də Şəkil 2a Şəkil S2a), lakin ikinci Alba ailəsi zülalı PfAlba4 (Şəkil 2a) və digər iki ortoloq, PfAlba2 və PfAlba3 (məlumatlar göstərilmir), bu, PfAlba1-Ty1-in həddindən artıq ifadəsinin birbaşa endogen PfAlba1 səviyyələrinə təsir etdiyini göstərir. Qeyd edək ki, hətta 2,5 μg/ml BS-də PfAlba1-Ty1 transfektantları boş vektor nəzarəti ilə müqayisədə ümumi PfAlba1-in daha yüksək səviyyələrini ifadə edir (Şəkil 1b və 2a).

PfAlba1 həddindən artıq ekspressiyası eritrositdaxili artımı azaldır P. falciparum. a Boş vektordan və ya artan blastisidin-S konsentrasiyasının mövcudluğunda yetişdirilmiş PfAlba1-Ty1 transfektantlarından hazırlanmış protein lizatları (BS 2.5-20 μg/ml) denaturasiya edən gel elektroforezi ilə ayrıldı və siçan anti-Ty1 anticisimləri, anti-PfAlba1 antikorları və ya anti-PfAlba4 antikorları ilə western blotting ilə təhlil edildi. PfAldolase yükləmə nəzarəti kimi xidmət edirdi. b Anti-Ty1 antikorları tərəfindən aşkar edilən PfAlba1-Ty1 səviyyələri (a), densitometriya ilə ölçüldü. Hər bir BS konsentrasiyası üçün PfAlba1-Ty1 siqnalını PfAldolase siqnalına normallaşdırdıqdan sonra məlumatlar 2,5 μg/ml nümunəyə normallaşdırıldı. Məlumatlar minimum üç müstəqil eksperimentin vasitələrini təmsil edir ± standart xəta (S.E. səhv çubuqları). c Boş vektorun böyüməsi (sol panel) və ya PfAlba1-Ty1 (sağ panel) parazitlər BS-nin göstərilən konsentrasiyalarının (μg/ml ilə) iştirakı ilə 5 gün ərzində axın sitometriyası ilə ölçüldü. The y oxu hər bir zaman nöqtəsində parazitemiya faizini bildirir. Məlumatlar minimum üç müstəqil eksperimentin vasitələrini təmsil edir ± S.E. (səhv çubuqları). d The

Boş vektorun və ya PfAlba1-Ty1 transfektantlarının 48 saat IDC-si axın sitometriyası ilə monitorinq edildi. The y oxu hər zaman nöqtəsində halqa mərhələlərinin faizini bildirir. The şaquli kəsik xətt bir təkrarlama dövrünü təmsil edir. Məlumatlar üç müstəqil eksperimentin vasitələrini təmsil edir ± S.E. (səhv çubuqları)

Daha sonra biz axın sitometriyasından istifadə edərək müxtəlif konsentrasiyalarda BS ilə müalicə olunan sinxronlaşdırılmış 3D7+PfAlba1-Ty1 halqa mərhələsi parazitlərinin böyüməsini izlədik və aşkar etdik ki, iki replikasiya dövründən sonra 3D7+PfAlba1-Ty10 parazitlərinin parazitemiyasında nəzərəçarpacaq dərəcədə azalma olub. , 15 və 20 μg/ml BS 3D7+boş vektor ilə müqayisədə (Şəkil 2c Şəkil S2b Əlavə fayl 1). Hətta 5 μg/ml BS-də PfAlba1-Ty1 transfektantları boş vektor transfektantları ilə müqayisədə bir qədər aşağı çoxalma sürəti göstərdi (Şəkil 2c), bu, PfAlba1-Ty1 səviyyələrində təvazökar 1,5 dəfə artımın parazit artımını gecikdirmək üçün kifayət olduğunu göstərir. Biz bu BS konsentrasiyasını əlavə analiz üçün istifadə etdik və axın sitometriyası ilə 3D7+PfAlba1-Ty1 parazitlərinin hüceyrə dövrü vaxtını ölçdük. Bununla belə, biz 3D7+boş vektor və 3D7+PfAlba1-Ty1 parazitləri arasında halqanın gec mərhələlərə keçməsində əhəmiyyətli fərq müşahidə etmədik (Şəkil 2d), bu, PfAlba1-Ty1 transfektantlarının böyüməsinin azalmasının dəyişmə ilə bağlı olmadığını nəzərdə tuturdu. hüceyrə dövrü vaxtı. Ümumilikdə, nəticələrimiz göstərir ki, PfAlba1-in artıq miqdarı azalır P. falciparum dozadan asılı şəkildə intraeritrositar artım, lakin DNT replikasiyasının və şizoqoniyanın başlanğıcını dəyişdirməklə deyil.

İmmunopresipitasiya analizi trofozoit mərhələlərində PfAlba1-Ty1 kompleksləri ilə əlaqəli olan 1665 transkripti müəyyən edir.

Transkripsiyadan sonrakı tənzimləmədə PfAlba1-in rolunu təsvir etməyə başlamaq üçün əvvəlcə onun in vivo İmmunopresipitasiya və dərin ardıcıllıq analizi ilə RNT interaktomu. Anti-PfAlba1 anticisimləri ilə endogen PfAlba1-ni immunoprecipitasiya etmək (IP) cəhdləri uğurlu olmadığı üçün (məlumatlar göstərilmir), biz diqqəti PfAlba1-Ty1-ə yönəltdik. Bənzər bir yanaşma bu yaxınlarda siçan malyariya parazitinin gametositlərində istifadə edilmişdir Plasmodium berghei DOZI-CITH translyasiya repressor kompleksinin əsas RNT bağlayıcı komponentləri olan yaşıl flüoresan zülal etiketli DOZI və ya CITH-nin RNT hədəflərini müəyyən etmək üçün [23]. Müvafiq olaraq, biz 5 μg/ml BS-də böyüyən trofozoit mərhələsi 3D7+PfAlba1-Ty1 parazitlərindən - PfAlba1 və PfAlba-Ty1 əsasən sitoplazmatik olduqda (Şəkil 1c) - hüceyrə lizatlarını denaturasiya etməyən şəraitdə hazırladıq və etiketlənmiş zülaldan istifadə edərək IPeddik. -Ty1 antikorları (Şəkil 3a). Şəkil 3b-də göstərildiyi kimi, biz maksimum təcrid edə bildik

Ümumi PfAlba1-Ty1-in 20%-i 3D7+PfAlba1-Ty1-də ifadə edildi və təəccübümüzə görə, IPed kompleksində endogen PfAlba1 də aşkarlandı (kontrastlı şəkilə baxın). Alba zülallarının arxeylərdə homo- və hetero-dimerlər əmələ gətirdiyi bildirildiyini nəzərə alsaq [24, 25], bu müşahidənin bir izahı PfAlba1-Ty1-in PfAlba1 ilə birbaşa qarşılıqlı təsiri ola bilər.

Trofozoit mərhələlərində PfAlba1-Ty1 ribonukleoprotein kompleksi 1665 transkriptlə qarşılıqlı əlaqədə olur. a RNT immunoprecipitation protokolunun sxematik təsviri. PfAlba1-Ty1 parazitlərindən hazırlanmış yerli lizatlar, PfAlba1-Ty1 tərkibli ribonukleoprotein kompleksini immunoprecipitate (İP) etmək üçün proteaz və RNTaz inhibitorlarının iştirakı ilə dovşan anti-Ty1 anticisimləri ilə inkubasiya edilmişdir. IPed RNT molekulları strand-spesifik RNT-seq ilə müəyyən edilmişdir. Boş vektor parazitlərindən alınmış RNT arxa fon bağlayıcı rolunu oynayır. b Boş vektordan və ya PfAlba1-Ty1 transfektantlarından anti-Ty1 antikorları ilə İP-li lizatlar (immunoprecipitasiya üçün istifadə edilən girişin 10%-i) və ya zülallar denaturasiya gel elektroforezi ilə ayrılmış və siçan anti-Ty1 antikorları və ya anti-PfAlba1 antikorları ilə qərb blotlama üsulu ilə təhlil edilmişdir. PfAldolase yükləmə nəzarəti kimi xidmət edirdi. Təzadlı təsvir PfAlba1-in anti-PfAlba1-Ty1 birgə IPed kompleksində olduğunu aydın şəkildə göstərir. c PfAlba1-Ty1 kompleksi ilə birləşən 1665 transkriptin mRNT bolluğuna görə genlərin paylanmasının Qauss sıxlığı nüvəsinin təxminləri. The y oxu nisbi sıxlığı və x oxu gen ifadə dərəcələrini təmsil edir, 0 ən az ifadə edilir. d 1665 co-IPed transkriptinin normallaşdırılmış RNT-seq məlumatlarının Furye faza paylanması. Üst panel: P. falciparum IDC transkriptomik məlumatları Bozdechdən əldə edilmişdir və s al. [6], burada müəlliflər infeksiyadan sonrakı saatları müəyyən etmək üçün əlverişli bir metrik, Furye mərhələsini təqdim edirlər (HPI) hər bir genin ən çox transkripsiya edildiyi. Alt panel: Bozdechdən nümunə götürülmüş PfAlba1-Ty1 ilə birlikdə işləyən 1665 transkriptin Furye faza dəyərlərinin paylanmasının Qauss sıxlığı nüvəsi təxmini və s al. [6]

Bundan sonra, biz RNT-nin (RNT-seq) dərin ardıcıllığını həyata keçirdik, zəncirlərə xas şəkildə ardıcıllığı oxuduq. P. falciparum genomu öyrənir və analiz boru kəmərimizdən istifadə edərək əhəmiyyətli bağlanma fəaliyyəti zirvələri üçün skan edilir ("Materiallar və üsullar" bölməsində ətraflı təsvir edilmişdir). Boş vektor immunoçökmələri ilə müqayisədə PfAlba1-Ty1 immunoçökmələrində iki dəfə və ya daha çox zənginləşdirilmiş zirvələrin PfAlba1-Ty1-ə spesifik bağlanma hadisələrini təmsil etdiyi hesab edilmişdir. Trofozoit mərhələlərində 1665 transkriptin PfAlba1-Ty1 kompleksi ilə birləşdiyini aşkar etdik (Əlavə fayl 2-də Cədvəl S1a). Birgə IP-li RNT-lər 5672-güclü parazit transkriptomunun (5365 kodlaşdırma transkriptinin) 29%-ni təşkil edir və 1643 zülal kodlaşdırma transkriptini ehtiva edir. Mümkün yanlış pozitivləri və/və ya yalan neqativləri aradan qaldırmaq üçün təhlilimizə əlavə nəzarətlər daxil etdik: biz boş vektordan və ya PfAlba1-Ty1 lizatlarından zülal komplekslərini qeyri-spesifik dovşan IgG antikorları ilə yoxladıq, hər hansı əlaqəli RNT-ləri təmizlədik və onları zəncirlə təhlil etdik. -spesifik RNT-seq. Analiz boru kəmərimizdən istifadə edərək PfAlba1-Ty1 lizatlarından olan anti-Ty1 İP-lərini müvafiq IgG İP-ləri ilə müqayisə etdikdə, 791 transkriptin anti-Ty1 IP-lərdə zənginləşdirildiyini aşkar etdik (Əlavə fayl 2-də Cədvəl S1b), bunlardan 612-si (Cədvəl) Əlavə fayl 2-də S1c) yuxarıda müəyyən edilmiş 1665 transkript siyahısında da var idi. Bu onu göstərirdi ki, iki müxtəlif nəzarətin istifadəsi bir sıra mümkün PfAlba1 hədəflərinin müəyyən edilməsi ilə nəticələnir: 612 yüksək etibarlı hədəflə 1665 icazə verilən siyahı və 791 mühafizəkar siyahı. Əlavə təhlil üçün icazə verilən siyahıdan istifadə etmək qərarına gəldik.

Daha sonra Bozdech və həmkarları [6] tərəfindən təsvir edilən 28-30 saatlıq 3D7 transkriptomuna korrelyasiya təhlili apararaq, 1665 bağlanmış transkriptin IDC-nin bu mərhələsində ən yüksək transkripsiyaya məruz qalanlar arasında olub-olmadığını soruşduq və onların ifadə dərəcələrinin aşağıdan aşağı dəyişdiyini aşkar etdik. yüksək (Şəkil 3c). Bundan əlavə, birgə IP-li transkriptlərin Furye fazasının paylanmasının təhlili göstərdi ki, transkriptlərin pik ifadəsinin vaxtı infeksiyadan sonra hər hansı bir saat ərzində aşkar qərəz olmadan IDC spektri üzrə bərabər paylanır və təsvir edilən əsas paylanmaya yaxından bənzəyir. Bozdech tərəfindən və s al. [6] (Şəkil 3d). Birlikdə, bu məlumatlar anti-Ty1 immunopresipitasiyasının ən yüksək transkripsiya edilmiş trofozoit transkriptləri üçün seçici olmadığını və spesifik PfAlba1-Ty1-mRNA komplekslərini aşkar etdiyini dəstəkləyir. in vivo. İntronlar olan genlər üçün, transkript üçün xəritələnmiş ardıcıllıq oxunuşlarında intronların ayrıldığını müşahidə etdik ki, bu da PfAlba1-Ty1 kompleksinin pre-mRNT-yə bağlanmadığını göstərir.

Nəhayət, Gen Ontologiyası (GO) təhlili (Əlavə fayl 1 Əlavə fayl 3-də Şəkil S3a) və birgə İP-li transkript siyahısının dərin qiymətləndirilməsi (Əlavə fayl 2) göstərdi ki, ribosom və spliceosom kimi ev təsərrüfatı maşınları həmçinin qlikoliz, RNT transkripsiyası, DNT replikasiyası və zülalın tərcüməsi kimi vacib hüceyrə prosesləri mRNA səviyyəsində PfAlba1-Ty1 kompleksi tərəfindən xüsusi olaraq hədəflənir. Bu, bizim bu geni/proteini genetik cəhətdən nokaut və ya sıradan çıxara bilməməyimiz üçün bir izahat verir. Görkəmli GO siniflərindən olan bəzi namizədlər üçün normallaşdırılmış ardıcıllıq əhatə dairələri Əlavə fayl 1-də Şəkil S3b-də təsvir edilmişdir.

Rekombinant PfAlba1 birbaşa PfAlba1-Ty1 kompleksləri ilə birgə İP olan transkriptlərin əksəriyyətinə bağlanır.

PfAlba1 ilə birbaşa bağlı olan transkriptləri ayırd etmək üçün biz daha sonra uyğunlaşdırdıq in vitro 3D7 trofozoit və şizont mədəniyyətindən hazırlanmış rekombinant glutatyon-S-transferaza (GST)-PfAlba1 zülalı və ümumi RNT ilə zülallarla (SNAAP) [26] əlaqəli spesifik nuklein turşuları adlanan RNT aşağı açılan analiz (Şəkil 4a). Şəkil 4b-də göstərildiyi kimi, GST-PfAlba1 pull-downs-dan olan eluat mənfi nəzarətlə müqayisədə RNT üçün yüksək zənginləşdirilmişdir. GST-PfAlba1 ilə əlaqəli RNT-lərin şəxsiyyətini müəyyən etmək üçün biz daha sonra zəncirlə bağlı spesifik RNT-seq həyata keçirdik, ardıcıllıq oxunuşlarını P. falciparum genomu və analiz boru xəttimizi istifadə edərək, 1927 RNT-nin GST nəzarəti ilə müqayisədə GST-PfAlba1 açılmalarında ikiqat və ya daha çox zənginləşdiyini aşkar etdi (Əlavə fayl 4). Bu, parazit transkriptomunun 34%-ni təşkil edir və 1919 protein kodlayan transkript daxildir. Bunlardan 592 və 465 transkript müvafiq olaraq trofozoit (24-38 saat) və şizont (38-48 saat) mərhələlərində transkripsiya zirvələrinə çatır. Üstəlik, 1927-ci il bağlanmış transkriptlər yalnız bu mərhələlərin hər ikisində (Şəkil 4c) ən yüksək transkripsiya edilmişlər arasında deyil və onların Furye faza paylanmasının təhlili ilə müəyyən edilən IDC transkripsiya zirvələrinin geniş paylanmasını göstərir (Şəkil 4d). Birlikdə bu, PfAlba1-GST-nin 1927-ci il transkriptlərinə bağlanmasının onların nisbi sabit vəziyyət bolluğundan asılı olmadığını və çox güman ki, spesifik olduğunu göstərir. Maraqlıdır ki, arasında üst-üstə düşür in vivoin vitro bağlı transkriptlər müştərək İP-li transkriptlərin 1193-ü və ya 71%-ni təşkil edir (Şəkil 4e, bu da ko-IP-li transkriptlərin böyük bir hissəsinin birbaşa PfAlba1-Ty1 tərəfindən tanındığını göstərir. Bununla birlikdə, 472 ko-IPed transkript bağlanmır in vitro PfAlba1-in digər zülallar və ya zülal kompleksləri vasitəsilə bir neçə RNT ilə əlaqələndirilməsi ehtimalını artırır.

PfAlba1 kompleksi ilə birgə İP olan transkriptlərin 71%-dən çoxu birbaşa rekombinant PfAlba1-ə bağlanır. in vitro. a The in vitro RNT aşağı açılan protokol. GST və ya GST-PfAlba1 glutatyon-agaroz maqnit muncuqlarında immobilizasiya edildi və ümumi inkubasiya edildi. P. falciparum Proteaz və RNTaz inhibitorlarının iştirakı ilə 3D7-nin qarışıq trofozoit və şizont mədəniyyətindən hazırlanmış RNT. Bağlanmış RNT-lər, GST mənfi nəzarət rolunu oynayan zəncirli RNT-seq ilə aşkar edilmişdir. b Ümumi RNT və ya GST və ya GST-PfAlba1-ə bağlı RNT-lər poliakrilamid gel elektroforezini denaturasiya etməklə həll edildi və Sybr Gold boyanması ilə vizuallaşdırıldı. Ölçü markeri = 0,1–2 kb RNT Nərdivanı (Invitrogen, Life Technologies nt = nukleotidlər). c GST-PfAlba1-ə bağlanan 1993 transkriptlərinin mRNT bolluğuna görə genlərin paylanmasının Qauss sıxlığı nüvəsinin təxminləri. Təfərrüatlar üçün Şəkil 3c əfsanəsinə baxın. d 1993-cü il GST-PfAlba1 ilə əlaqəli transkriptlərin normallaşdırılmış RNT-seq məlumatlarının Furye faza paylanması. Təfərrüatlar üçün Şəkil 3d əfsanəsinə baxın. e Co-IPed-də müəyyən edilmiş transkriptlərin üst-üstə düşməsini təmsil etmək üçün Venn diaqramlarından istifadə edilmişdir (co-IP Əlavə fayl 2) və in vitro- bağlı (In vitro Əlavə fayl 4) verilənlər dəstləri

Daha sonra hüceyrə komponentlərini, molekulyar funksiyaları və zənginləşdirilmiş bioloji prosesləri müəyyən etmək üçün GO analizini həyata keçirdik. in vitro-bound transkript verilənlər bazası (Əlavə fayl 5). Biz aşkar etdik ki, birgə IPed verilənlər bazasında tapılan siniflərə əlavə olaraq, GST-PfAlba1 qida vakuolunun komponentlərini kodlayan transkriptlərə, ubiquitindən asılı proteazomal katabolik prosesə, ana hüceyrəyə daxil olmağa və karbohidrat biosintetik prosesinə birbaşa bağlıdır. bir neçə (ətraflı məlumat üçün Əlavə fayl 1-də Şəkil S4a-a baxın). Həm PfAlba1-Ty1 kompleksi ilə birləşən, həm də əlaqəli seçilmiş transkriptlərin normallaşdırılmış ardıcıllıq əhatə dairəsi in vitro GST-PfAlba1-ə olan nisbətlər Əlavə fayl 1-də Şəkil S4b-də göstərilmişdir. Ümumilikdə belə nəticəyə gəlirik ki, trofozoit mərhələlərində PfAlba1 birbaşa tərcümə, transkripsiya və DNT replikasiyasında iştirak edən 1193 mRNT-ni kodlayan komponentlərə bağlanır və onları post-transkripsiya üçün hədəfləyə bilər. tənzimləmə. Qeyd edək ki, tərcümə və DNT replikasiyası trofozoit mərhələsində sürətlənən və hemoglobinin deqradasiyası ilə birlikdə ciddi şəkildə tənzimlənməli olan əsas metabolik proseslərdir [6, 27].

Həddindən artıq PfAlba1 trofozoit mərhələsində 926 transkriptin səhv tənzimlənməsi və şizonta bənzər transkriptomik profilin erkən başlaması ilə nəticələnir.

Yaxşı müəyyən edilmişdir ki, RBP-nin ifadə səviyyələrində əhəmiyyətli dəyişikliklər RBP-RNT komplekslərinin stoxiometriyasına təsir göstərə bilər, nəticədə RBP tərəfindən idarə olunan post-transkripsiya tənzimləyici şəbəkələrdə geniş miqyaslı dəyişikliklər baş verir [28]. Buna görə də, PfAlba1 həddindən artıq ifadə edən parazitlərin sabit dövlət transkriptomunun ölçülməsi PfAlba1 tərəfindən hədəflənən RNT hovuzunu birləşdirməyə və PfAlba1-RNT qarşılıqlı təsirinin bəzi nəticələrini proqnozlaşdırmağa imkan verəcəkdir. Bu məqsədlə biz IDC parazitinin iki mərhələsindən ümumi RNT yığdıq: PfAlba1 nüvə lokalizasiyasına malik olduqda [20] 8-10 saatlıq halqalar və PfAlba1 əsasən sitoplazmatik olduqda 28-30 saat trofozoitlər (Şəkil 1c) [ 20], və poli (A) ilə zənginləşdirilmiş RNT-nin zəncirli spesifik RNT-seqini yerinə yetirdi (Şəkil 5a). Biz aşkar etdik ki, 3D7 və 3D7+boş vektor parazitləri ilə müqayisədə, PfAlba1-Ty1 transfektantlarının halqa mərhələsi transkriptomunun kiçik bir hissəsi ikiqat və ya daha çox diferensial şəkildə tənzimlənir (117 transkript = transkriptomun 2,1%-i 52 yuxarı tənzimlənir və 65 aşağı requlyasiya edilir) kimi multigen virulent gen ailələrinə aid olan bu transkriptlərdən (62%) var, rifin, və stevor (Əlavə fayl 6-da Cədvəl S5a). Bunun əksinə olaraq, 3D7+PfAlba1-Ty1 trofozoitlərində 926 transkript ikiqat və ya daha çox diferensial şəkildə tənzimlənmişdir (635 yuxarı və 291 aşağı tənzimlənmiş) (Əlavə fayl 6-da Cədvəl S5b), bunlar ümumi parazit transkriptomunun 16%-ni təşkil edir. Transkripsiya dəyişikliklərini təsdiqləmək üçün biz 14 genin təsadüfi seçimi üzərində kəmiyyət tərs transkriptaza-PCR (qRT-PCR) həyata keçirdik (Əlavə fayl 5 genlər mavi rənglə vurğulanır) və Şəkil 5b-də göstərildiyi kimi, RNT- ilə müəyyən edilmiş dəyişiklikləri təsdiqlədik. seq. Ümumiyyətlə, bu nəticələr PfAlba1-in trofozoit mərhələlərinin mRNT homeostazının saxlanmasında iştirak etdiyini göstərir.

PfAlba1 həddindən artıq ekspressiyası trofozoit mərhələsinin transkriptomunu pozur, nəticədə şizontabənzər transkripsiya profilinin erkən başlaması ilə nəticələnir. a Transkriptomik profilləşdirmə təcrübəsinin sxematik təsviri. 3D7, 3D7+boş vektor və ya 3D7+PfAlba1-Ty1 parazitləri ağ qan hüceyrəsində yetişdirilmişdir (WBC)-zəngə qədər sərbəst qan (infeksiyadan 8-10 saat sonra (h p.i.)) və ya trofozoit (28-30 saat p.i.) mərhələləri və yığılmış RNT və mRNT zənginləşdirilmiş və zəncirli RNT-seq ilə təhlil edilmişdir. 3D7 və boş vektor transfektantlarına nisbətən 3D7+PfAlba1-Ty1-də diferensial ifadə edgeR [71] ilə ölçüldü. b Göstərilən genlərin qRT-PCR analizi boş vektordan və ya PfAlba1-Ty1 transfektantlarından təcrid olunmuş ümumi RNT-dən istifadə etməklə həyata keçirilib. The sol, ortasağ panellər RNT-seq-ə uyğun olaraq yuxarı tənzimlənmiş, dəyişməmiş və ya aşağı tənzimlənmiş genlər daxildir. The y oxu -ΔΔC ifadə edirt, “Materiallar və üsullar” bölməsindəki kimi hesablanır. Məlumatlar minimum üç müstəqil eksperimentin vasitələrini təmsil edir ± standart xəta (səhv çubuqları). c İnfeksiyadan bir neçə saat sonra (HPI) transkriptomik məlumatlar üçün təxminlər, normallaşdırılmış RNT-seq məlumatlarını Lemieux tərəfindən hazırlanmış maksimum ehtimal alqoritmi vasitəsilə ötürməklə əldə edilmişdir. və s al. [29]. The sol panel HPI təxminlərini 95% etibar intervalları daxilində göstərir, halbuki sağ panel 48 saat IDC ərzində hər bir nümunə üçün müəyyən edilmiş faktiki ehtimalları göstərir. d Giemsa ilə ləkələnmiş qan filmlərində üzük (R), trofozoit (T) və ya şizont (S) boş vektor və ya PfAlba1-Ty1 transfektantlarının mərhələləri. İçəridə göstərilən yoluxmuş qırmızı qan hüceyrələrinin böyüdülmüş görünüşləri göstərilir

Daha sonra PfAlba1-Ty1 transkriptomik məlumat dəstlərimizin inkişaf yaşını qiymətləndirmək üçün maksimum ehtimala əsaslanan statistik analiz metodundan [29] istifadə etdik. Gen ifadəsinin dövriliyini nəzərə alaraq P. falciparum [6, 16], belə bir analiz həqiqi diferensial ifadəni hüceyrə dövründən asılı, ifadə nümunələrindəki müvəqqəti dəyişikliklərdən ayırır və texniki və bioloji dəyişkənlik üçün RNT-seq təkrarlarımızın keyfiyyətinin vacib bir ölçüsüdür [29]. Qeyd etmək lazımdır ki, 3D7+PfAlba1-Ty1 trofozoit transkriptomu parazitin həyat dövrünün sonrakı vaxt nöqtəsinə - iki replikat üçün 38-40 saat və ya 44-46 saata uyğunlaşdırıldı, halqa transkriptomunun vaxtı isə 8-10 saat idi. vəhşi tipli və boş vektor tərkibli parazitlərlə demək olar ki, eynidir (Şəkil 5c). Çoxölçülü miqyaslı süjet də 3D7+PfAlba1-Ty1 trofozoit məlumat dəstlərinin inkişaf yaşının dəyişməsini dəstəklədi (Əlavə fayl 1-də Şəkil S5a). Birlikdə götürüldükdə, bu müşahidələr göstərir ki, PfAlba1 həddindən artıq ifadəsi mRNT homeostazının pozulması səbəbindən şizontabənzər transkriptomik profilin erkən başlanğıcı ilə nəticələnir və 3D7+PfAlba1-Ty1 artımının azalması üçün bir izahat verir. Bununla belə, bu, müvafiq olaraq, müvafiq mərhələlərin axını sitometriyası (Şəkil 2d) və Giemsa boyanması (Şəkil 5d) ilə qiymətləndirilən parazit DNT replikasiyasında və morfologiyasında dəyişiklik kimi özünü göstərmir.

Nəhayət, biz diferensial şəkildə tənzimlənən verilənlər bazasında zənginləşdirilmiş GO terminlərini müəyyən etdik və onlar aşağıdakı qruplara uyğunlaşdırıldı (Əlavə fayl 1 Əlavə fayl 7-də Şəkil S5b): ana hüceyrə plazma membranı, ana hüceyrə sitoplazma hissəsi, mikronem, rhoptri boyun, daxili membran kompleksi, heparinin bağlanması, ev sahibi hüceyrə səthinin bağlanması, aktin bağlanması, tək orqanizm hüceyrəsi-hüceyrəsinin yapışması, antigenik variasiya və ana hüceyrəyə daxil olması. Daha yaxından təhlil bu terminləri iki əsas kateqoriyaya qruplaşdırdı: sitoadherensliyə nail olmaq üçün ev sahibi ilə qarşılıqlı əlaqə üçün tələb olunan komponentlər və eritrositlərin işğalı üçün vacib olan komponentlər. Maraqlıdır ki, yalnız bir əhəmiyyətli GO termini birgə IPed və/və ya ilə üst-üstə düşür in vitro-bağlı RNT verilənlər bazası: ana hüceyrəyə giriş. Əslində, daxili membran kompleksi, mikronem və rhoptry zülalları daxil olmaqla, eritrositlərin işğalı komponentlərini kodlayan transkriptlərin hamısının 3D7+PfAlba1-Ty1 trofozoitlərində yuxarı tənzimləndiyini aşkar etdik. Məsələn, 20-dən

Bu mərhələdə 25 rhoptry komponenti üç dəfədən çox yuxarı tənzimlənmişdir (Əlavə faylda Cədvəl S5b 6 gen adı qırmızı hərflərlə verilmişdir). Bu transkriptlər transkripsiya zirvələrinə yalnız 38-42 saatda çatdığından (Əlavə fayl 1-də Şəkil S6), biz hesab edirik ki, şizontabənzər transkriptomik yerdəyişmə qismən PfAlba1-Ty1 trofozoitlərində bu cür transkriptlərin vaxtından əvvəl tənzimlənməsi ilə bağlıdır, yəni.

Vəhşi tipli hüceyrələrə nisbətən 8-14 saat əvvəl.

PfAlba1 həddindən artıq ifadə edildikdə, 13 eritrosit invaziya komponenti daxil olmaqla, 105 PfAlba1 ilə əlaqəli transkript diferensial şəkildə tənzimlənir.

PfAlba1-i müəyyən etdikdən sonra in vivoin vitro Parazitlər artıq PfAlba1 istehsal etdikdə differensial şəkildə tənzimlənən RNT interaktomu və RNT-lər, biz bu məlumat dəstlərinin hamısında aşkar edilən RNT-lərin, çox güman ki, transkripsiyadan sonrakı tənzimləmə üçün PfAlba1 tərəfindən hədəflənən ilk transkript dəsti olacağını düşündük. Müvafiq olaraq, biz Venn diaqramından istifadə edərək onların kəsişməsini təsvir etdik və müəyyən etdik ki, 1193 transkriptdən kiçik bir hissə, 8,8% (n = 105) birləşdirilir. in vivoin vitro ikiqat və ya daha çox diferensial şəkildə tənzimlənirdi: 97 yuxarı və 8 aşağı tənzimlənir (Şəkil 6a). 105 transkriptin funksional qrup təhlili göstərdi ki, 43%-i naməlum funksiyaya malik konservləşdirilmiş zülalları, qalanları isə PfCDPK1, PfEBA175, PfRhopH2, PfRhopH3, PfRON2, PfRONR2 və PfRON2a və PfRON2a, 14 kinaza və əlaqəli siqnal molekulları, üç aktin və miyozinlə əlaqəli zülallar və üç ApiAP2 zülalları, bir neçəsini adlandırmaq olar (Şəkil 6b Əlavə fayl 8). Bundan əlavə, diferensial şəkildə tənzimlənən transkriptomda yalnız bağlanan 38 transkript var idi. in vivo və yalnız bağlanan 119 transkript in vitro (Şəkil 6a Əlavə fayl 8), IDC zamanı tənzimləmə üçün PfAlba1 kompleksləri tərəfindən hədəflənmiş mRNA-ların ilkin siyahısını 262-ə qədər genişləndirir. Şəkil 6a-nın Venn kəsişmələrində qeyd edilmiş genlərin hüceyrə və funksional paylanmasını vizuallaşdırmaq üçün biz sxematik dizayn tərtib etdik. a P. falciparum aseksual qan mərhələsi hüceyrəsi və hər bir geni və onun kəsişmə kateqoriyasını MapMan [30] istifadə edərək sxematik xəritəyə çəkdi (Əlavə fayl 1-də Şəkil S7). Məlum oldu ki, apikal orqanoidlərin komponentləri və aktin və miyozinlə əlaqəli motor zülalları daxil olmaqla, eritrositlərin işğalına kömək edən zülalları kodlayan mRNA-lar PfAlba1 hədəflərinin əhəmiyyətli bir hissəsini təşkil edir.

PfAlba1-Ty1 trofozoitlərində tənzimlənməmiş transkriptlərin 11 faizi birbaşa PfAlba1-ə bağlanır və bu, eritrositlərin invaziya mexanizminin seçilmiş komponentlərinin translyasiya repressiyası ilə nəticələnir. a Co-IPed-də müəyyən edilmiş transkriptlərin üst-üstə düşməsini təmsil etmək üçün Venn diaqramlarından istifadə edilmişdir (co-IP Əlavə fayl 2), in vitro- bağlı (In Vitro Əlavə fayl 4) və diferensial şəkildə tənzimlənir (Exp. Əlavə fayl 6) verilənlər dəstləri. b 105 PfAlba1 ilə əlaqəli və tənzimlənməmiş transkriptlərdə funksional olaraq həddindən artıq təmsil olunan kateqoriyaları göstərən pasta diaqramı. c PfAlba1-Ty1 trofozoitlərində yuxarı tənzimlənən 14 transkripti onların bağlanmasına əsaslanaraq bölmək üçün Bootstrap iyerarxik klasterindən istifadə edilmişdir (log2(qat dəyişikliyi) mavi kölgə) PfAlba1-Ty1 (co-IP) və GST-PfAlba1 (In Vitro). Qutulardakı nömrələr açılış ballarıdır. Nəticədə yaranan klasterlər PfAlba1 ilə bağlıdır (yuxarı klaster) və PfAlba1-bağlı olmayan (aşağı çoxluq). d Üst panel: Göstərilən genlərin qRT-PCR analizi boş vektordan və ya PfAlba1-Ty1 trofozoitlərindən təcrid olunmuş mRNT-dən istifadə etməklə həyata keçirilib. The y oxu “Materiallar və üsullar” bölməsindəki kimi hesablanmış -ΔΔCt deməkdir. Məlumatlar minimum üç müstəqil eksperimentin vasitələrini təmsil edir ± standart xəta (səhv çubuqları). Alt panel: boş vektordan və ya PfAlba1-Ty1 trofozoitlərindən hazırlanmış protein lizatları denaturasiya gel elektroforezi ilə ayrıldı və göstərilən antikorlarla western blotlama üsulu ilə təhlil edildi. 3D7 halqalarından hazırlanmış lizatlar (R ctrl) və ya şizonlar (S ctrl) PfFIKK7.1 istisna olmaqla, zülal aşkarlanması üçün nəzarət kimi xidmət etmişdir. ** = PfAlba1-RNT bağlanması və translyasiya repressiyası arasında müşahidə edilən korrelyasiya üçün istisnalar

PfAlba1 RNT interactome transkriptləri ehtiva edir ki, onların transkriptləri tərcümə nəzarəti altındadır

PfAlba1-ə post-transkripsiya funksiyasını təyin etmək üçün biz daha sonra PfAlba1 RNT interaktomunu aseksual qan mərhələlərinin əvvəlki tədqiqatlarında müəyyən edilmiş post-transkripsiya ilə tənzimlənən gen dəstləri ilə müqayisə etdik [16, 19].Qiymətləndirdiyimiz ilk məlumat dəsti Bozdech və həmkarları [16] tərəfindən korrelyativ transkriptomik və proteomik analizdən istifadə edərək yaradılıb və tərcümə tənzimlənməsinə tabe olan 127 aseksual mərhələ mRNA-dan ibarətdir (Əlavə fayl 9-da Cədvəl S8a). 127 mRNT-dən 104-nün (və ya 82%) PfAlba1 ilə bağlandığını aşkar etdik. in vivo və/və ya in vitro (Əlavə fayl 9-da Cədvəl S8a), PfAlba1-in aseksual inkişaf zamanı mRNT tərcüməsini modullaşdıra biləcəyini göstərir. Bu bağlı RNT-lərdən 13-ü PfAlba1-Ty1 trofozoitlərində səhv tənzimlənir və Rap1, Rap3, RhopH2, RhopH3 və RON4 kimi invazyon transkriptlərini ehtiva edir. Təhlil etdiyimiz ikinci məlumat dəsti DeRisi və həmkarları [19] tərəfindən ribosomal profilləşdirmə yolu ilə yaradılıb və tərcümə effektivliyi səviyyəsində tənzimlənən 297 aseksual mərhələ mRNA-dan ibarətdir (Əlavə fayl 9-da Cədvəl S8b). Bunlardan 187-si (və ya 63%) PfAlba1 ilə bağlıdır in vivo və/və ya in vitro (Əlavə fayl 9-da Cədvəl S8b), yenidən mRNA tərcüməsinin tənzimlənməsində PfAlba1-in rolunu göstərir. Bağlanmış transkriptlərdən 48-i PfAlba1-Ty1 trofozoitlərində sabit vəziyyət səviyyələrini dəyişmiş və 20 eritrosit işğalı və Rap1, Rap3, RhopH2, RhopH3, Clag9, RON2-5, EBA3, MSP16, MSP16 və MSP kimi erkən halqa mərhələsinin transkriptlərini ehtiva edir. (Əlavə fayl 9-da Cədvəl S8b). Birlikdə götürüldükdə, bu analiz aseksual qan mərhələlərində translyasiya tənzimlənməsində PfAlba1-in rolunu proqnozlaşdırdı.

PfAlba1 bağlanması seçilmiş eritrosit invaziya komponentlərinin tərcümə repressiyası ilə əlaqələndirilir.

Daha sonra, IDC zamanı PfAlba1-in tərcümə tənzimləmə funksiyasını müəyyən etmək üçün biz PfAlba1-Ty1 trofozoitlərində yuxarı tənzimlənən və ko-immunopresipitasiyada və diferensial PfAlba1 bağlanmasını göstərən rhoptry və invaziya mexanizmlərinin seçilmiş komponentlərinə diqqət yetirdik. in vitro aşağı açılan təcrübələr. Məhz, biz PfAlba1 ilə əlaqəli RhopH3, CDPK1, Rap1 və Clag9-a diqqət yetirdik. in vivo və/və ya in vitro, və hər iki vəziyyətdə bağlanmayan Rap2, AMA1 və TRAMP (Şəkil 6c). Qeyd edək ki, bu mRNA-lar 3D7 parazitlərində 38-42 saatda [6, 16] transkripsiya zirvələrinə çatır (Əlavə fayl 1-də əlavə fayl 8 Şəkil S6) və zülal ifadəsi zirvələrinə 38-48 saatda çatır [16, 17]. Təhlil etdiyimiz və 3D7 + PfAlba1-Ty1 parazitlərində transkripsiya ilə tənzimlənən əlavə qeyri-invaziv namizədlərə serin/treonin FIKK kinaz ailəsinin üzvləri, FIKK7.1 və FIKK9.6 daxildir: mRNA-lar PfAlba1-ə bağlanmadı (Şəkil 6c). ) və müvafiq olaraq orta halqa və gec şizont mərhələlərində maksimum sintez olunur (Əlavə fayl 1-də Şəkil S6).

28-30 saat trofozoit mərhələsi 3D7 + boş vektor və ya 3D7 + PfAlba1-Ty1 parazitlərini yığdıq və seçilmiş genlərin mRNT və zülal səviyyələrini təhlil etdik. qRT-PCR analizindən (Şəkil 6d, yuxarı panel) istifadə edərək, boş vektor transfektantları ilə müqayisədə PfAlba1-Ty1 trofozoitlərində bütün doqquz mRNA-nın səviyyəsinin yüksəldiyini aşkar etdik. Bununla belə, western blotting istifadə edərək, PfAlba1-ə bağlanan mRNA-ların olduğunu müşahidə etdik in vivo və/və ya in vitro, yəni., RhopH3, CDPK1 və Rap1 bu mərhələdə tərcümə edilmədi, mRNA-ları PfAlba1 ilə bağlı olmayan PfRap2 və PfTRRAMP isə tərcümə edildi (Şəkil 6d, aşağı panel). İstisnalar əks tendensiya göstərən Clag9 və AMA1 idi (şəkil 6d, ikiqat ulduzlarla işarələnmiş) — Clag9 mRNA PfAlba1-ə bağlandı, lakin zülal trofozoitlərə çevrildi, AMA1 mRNA isə PfAlba1-ə bağlanmadı, lakin tərcümə ilə repressiya edildi. . Nəhayət, transkriptləri PfAlba1-ə bağlanmayan FIKK zülalları həm PfAlba1-Ty1, həm də boş vektor trofozoitlərində tərcümə edilmişdir (Şəkil 6d, aşağı panel). Ümumilikdə, nəticələrimiz PfAlba1 assosiasiyası ilə trofozoit mərhələlərində tərcümə repressiyası arasında güclü korrelyasiya olduğunu göstərir.

İnkişaf mərhələləri arasında tərcümə repressiyasının sərbəst buraxılması PfAlba1 kompleksindən mRNT dissosiasiyasını müşayiət edir.

Nəhayət, eritrosit işğalı transkriptlərinin tərcüməsinin dəqiq tənzimlənməsinin molekulyar əsaslarını araşdırmaq üçün tipik protein ifadəsi zamanı RhopH3, CDPK1, Clag9, Rap1, Rap2, AMA1 və TRAMP mRNA-larının PfAlba1-Ty1 ilə əlaqəsini qiymətləndirdik. yəni., şizont mərhələsi (42-45 saat) və aşkar edilə bilən protein ifadəsindən təxminən 14-17 saat əvvəl, yəni., trofozoitlər (28-30 saat) (Şəkil 7a). Trofozoitlərdə PfAlba1-ə bağlanan və transkripsiyaya məruz qalan işğal transkriptlərinin tərcüməyə imkan vermək üçün şizontlarda PfAlba1-dən azad ediləcəyini fərz etdik. Biz əvvəlcə PfAlba1-Ty1-i anti-Ty1 antikorları ilə qeyri-denaturasiya şəraitində (Şəkil 7b) IPed etdik və seçilmiş işğal transkriptlərinə xas olan primerlərlə qRT-PCR analizini həyata keçirdik. Biz FIKK7.1 və FIKK9.6-nı yuxarı tənzimlənmiş, lakin əlaqəsiz, nəzarət edən və immunopresipitasiya üçün nəzarət kimi üç dəyişməmiş və bağlanmamış mRNA-nı daxil etdik: aldolaz, aktin I və seril tRNA sintetaza. Hər bir gen üçün, həmçinin aktin I mRNA-ya nisbətən trofozoitdən şizont mərhələlərinə transkript səviyyələrində qat dəyişikliyini təyin etdik (Əlavə fayl 1-də Şəkil S8) və bu dəyərdən trofozoitlərdən şizontlara birləşmədəki qat dəyişikliyini hesablamaq üçün istifadə etdik.

Tərcümə ilə sıxışdırılmış transkriptlər trofozoitlərdə PfAlba1 kompleksi ilə əlaqələndirilir və sonradan səmərəli tərcümə üçün şizontlarda buraxılır. a Eksperimental qurğunun sxematik təsviri. Trofozoit (28-32 saat) və ya şizont (42-45 saat) mərhələsində PfAlba1-Ty1 parazitlərindən hazırlanmış yerli lizatlar, IP a PfAlba1-Ty1 ehtiva edən proteaz və RNAse inhibitorlarının iştirakı ilə dovşan anti-Ty1 antikorları ilə inkubasiya edilmişdir. ribonukleoprotein kompleksi. IPed RNT-lər çıxarıldı və qRT-PCR ilə təhlil edildi. Nəhayət, RNT assosiasiyası bütün hüceyrə lizatlarında müvafiq zülalın olması ilə müqayisə edildi. goi = maraq gen. b Lizatlar (immunopresipitasiya üçün istifadə olunan girişin 20%-i) və ya PfAlba1-Ty1 trofozoitindən anti-Ty1 antikorları olan zülallar (T) və ya şizont (S) mərhələləri denaturasiya gel elektroforezi ilə ayrılmış və siçan anti-Ty1 anticisimləri və ya anti-PfAlba1 antikorları ilə western blotlama ilə təhlil edilmişdir. PfAldolase nəzarət rolunu oynadı. c Sol panel: PfAlba1-Ty1 trofozoitindən və ya şizont lizatlarından IPedilmiş RNT, göstərilən genlərə xas olan primerlərlə qRT-PCR ilə təhlil edilmişdir. The y oxu ştrix qrafiki “Materiallar və üsullar” bölməsindəki kimi hesablanmış faiz zənginləşdirməni göstərir. Məlumatlar minimum üç müstəqil eksperimentin vasitələrini təmsil edir ± standart xəta (səhv çubuqları). ** = AMA1 transkripti trofozoit mərhələlərində PfAlba1-ə bağlanır. PfAlba1 assosiasiyasının trofozoitlərdən şizontlara çevrilməsi, yəni., T/S, “Materiallar və üsullar” bölməsindəki kimi hesablanmışdır. * = PfAlba1 və Clag9 mRNT-nin assosiasiyası trofozoitlərdən şizontlara qədər azalmır. Sağ panel: boş vektordan və ya PfAlba1-Ty1 trofozoitlərindən hazırlanmış protein lizatları (T) və şizonlar (S) denaturasiya gel elektroforezi ilə ayrılmış və göstərilən antikorlarla qərb blotlama üsulu ilə təhlil edilmişdir.

Şəkil 7c-də (sol panel) göstərildiyi kimi, RhopH3, CDPK1 və Rap1-in mRNA-ları trofozoit mərhələlərində PfAlba1-Ty1 ilə əhəmiyyətli dərəcədə əlaqələndirilir, assosiasiya isə şizont mərhələlərində itirilir. Nəticə etibarilə, biz onların zülal məhsullarını, PfRhopH3, PfCDPK1 və PfRap1-i təkcə şizont mərhələsində aşkar etdik (Şəkil 7c, sağ panel). Birgə IPedimizdə aşkarlanmayan AMA1/in vitro - RhopH3, CDPK1 və Rap1-dən daha aşağı dərəcədə olsa da, yalnız trofozoit mərhələlərində PfAlba1 kompleksi ilə əhəmiyyətli dərəcədə əlaqəli olan bağlanmış transkript verilənlər bazası (Əlavə fayllar 2 və 4) (Şəkil 7c, ikiqat ulduzlarla işarələnmişdir) və tərcümə ilə repressiya edilmişdir . Bunun əksinə olaraq, Rap2 və TRAMP-ın mRNA-ları nə trofozoitlərdə, nə də şizontlarda PfAlba1-Ty1 ilə bağlanmadı (Şəkil 7c, sol panel) və müvafiq zülal hər iki mərhələdə aşkar edildi (Şəkil 7c, sağ panel). İstisna Clag9 idi: trofozoitlərdən şizontlara qədər PfAlba1-Ty1-in Clag9 mRNA ilə əlaqəsinin aşkar azalmasına baxmayaraq (Şəkil 7c, sol panel), birləşmənin qat dəyişməsi <1 idi (Şəkil 7c, ulduzla işarələnmiş) və PfClag9 hər iki mərhələdə tərcümə edilmişdir (Şəkil 7c, sağ panel). Güman edirik ki, PfAlba1 bağlanması Clag9 mRNA-nın sabitliyi və/və ya lokalizasiyası kimi digər xüsusiyyətlərə təsir edə bilər. Bütün nəzarət mRNA-ları IDC-nin hər iki mərhələsində PfAlba1-Ty1 ilə əhəmiyyətli dərəcədə əlaqələndirilməmişdir və PfFIKK7.1 və PfFIKK9.6 zülalları yalnız həm PfAlba1-Ty1, həm də boş vektor transfektantlarının trofozoitlərində aşkar edilmişdir. Birlikdə götürdükdə, biz PfAlba1 ribonukleoprotein (RNP) kompleksinə bağlanmanın və ondan azad edilməsinin vaxtında tərcümə ilə əlaqəli olan bir sıra eritrosit işğalı mRNT-lərini göstəririk. Bu, IDC-nin son saatlarında apikal ifrazat orqanellələrinin və eritrositlərin invaziya komplekslərinin yığılması kimi yüksək dəqiqliklə proqramlaşdırılmalı olan hadisələr üçün xüsusilə vacib ola bilər. Həqiqətən, PfAlba1-Ty1 trofozoitlərində müşahidə olunan Rap1, RhopH3, AMA1 və CDPK1 transkriptlərinin erkən yüksəldilməsi PfAlba1-in bu mRNA-lara bağlanması və PfRhopapapp1-in funksionallığı PfRhopap13-un gec şizont mərhələsinə qədər onların tərcüməsinin qarşısının alınması ilə xilas edildiyini düşünürük. , PfAMA1 və PfCDPK1 çox vacibdir.


Nəticələr

Makrofag vasitəçiliyi ilə iltihablı reaksiya zamanı qlobal tərcümə profili

Biz siçanların əsas BMDM-lərinin LPS-ə reaksiyasını iltihabda tərcümə tənzimləmələrini öyrənmək üçün bir model kimi istifadə etdik, çünki bu, ən yaxşı xarakterizə edilən iltihab reaksiyalarından biridir (Medzhitov və Janeway, 2000-ci ildə nəzərdən keçirilmişdir). Xüsusilə, siçan əsas BMDM-ləri 100 ng / ml LPS ilə müalicə edildi və LPS stimullaşdırılmasından sonra 0, 1, 2, 4 və 6 saatda toplandı. Hər bir zaman nöqtəsində yığılmış hüceyrələr RNT seq və ya ribosom profilinə (Ribo-seq) məruz qalan iki fraksiyaya bölündü (Şəkil 1A). RNT-seq, ribosomal-RNT tükənmiş ümumi RNT-lər təsadüfi olaraq parçalandı, ardınca ardıcıllıq üçün istiqamətli klonlama aparıldı. Ribo-seqdə ribosomla qorunan mRNT fraqmentləri (RPF) saxaroza sıxlığı qradiyenti ilə təcrid olundu və sonra istiqamətli klonlaşdırma və ardıcıllığa məruz qaldı. Nəticə oxunuşlar daha sonra yaxşı şərh edilmiş siçan transkriptomuna uyğunlaşdırıldı və ümumilikdə 300 milyondan çox oxunma xəritələndi. Beləliklə, BMDM vasitəçiliyi ilə baş verən iltihablı reaksiya zamanı paralel olaraq mRNT ifadəsini və ribosom-mRNA birləşməsini profilləşdirdik.

Siçan əsas BMDM vasitəçiliyi ilə iltihab reaksiyasının qlobal tərcümə profili.

(A) BMDM vasitəçiliyi ilə iltihab reaksiyası zamanı paralel ribosom və RNT profilinin iş axını. (B) Metagen qrafikləri müvafiq olaraq qeyd edilmiş CDS-nin başlanğıc və dayanma nöqtələrinin yaxınlığında 28 nt ribosom izlərinin (RFP) sıxlığının (milyon unikal xəritələnmiş oxunuşda oxunuş, RPM) yüksəlişini və azalmasını göstərir. Başlanğıc və dayanma nöqtələrindən 12-nt və 15-nt ofsetləri (qırmızı oxlarla göstərilir) tərcümənin başlanğıcında və sonlanmasında müvafiq olaraq RFP 5' terminindən ribosom P- və A-sayt kodonlarına qədər olan məsafələri əks etdirir. (C) Ribosom izlərinin subkodon həlli. Qeyd edək ki, məlum CDS-lərə nisbətən 3-nt kodon dövriliyi 28-nt RFP-lər üçün görünür, lakin RNT-seq oxunuşlarında deyil. (D) Ribosom izləri kodlaşdırma bölgələri üçün olduqca spesifikdir. Qutular əlaqəli CDS-lərə nisbətən 5'UTR, 3'UTR və intronlarda Ribo-seq və RNT-seq oxumalarının sıxlığını göstərir. (E) İltihab reaksiyasında diferensial şəkildə tərcümə edilmiş 724 genin tərcümə effektivliyinin (TE) klaster analizi (empirik p<0.05). İstilik xəritəsi LPS müalicəsindən 0, 1, 2, 4, 6 saat sonra orta sıra mərkəzli log2 TE dəyərlərini göstərir. (F) 724 translyasiya ilə tənzimlənən genin 3'UTR-ləri daxilində zənginləşdirilmiş RNT bağlayan protein motivləri. Makrofaqlarla ifadə olunan RBP-lərin 10 ən zənginləşdirilmiş motivi zənginləşdirmə statistikası ilə birlikdə göstərilir.

BMDM-lərin iki bioloji replika dəstinin nəticələrini müqayisə etməklə göstərildiyi kimi Ribo-seq məlumat dəstlərimiz yüksək dərəcədə təkrarlana bilirdi (Şəkil 1-şəkil əlavəsi 1A). Üstəlik, tərcümənin aşağıdakı əsas xüsusiyyətləri bu məlumatlardan tək nukleotid ayırma zamanı əldə edilə bilər. Birincisi, RPF-lər RFP 5'-terminalından P- və A-ya qədər məlum məsafələri əks etdirən tərcümə başlanğıc kodonlarının və sonlanma kodonlarının yuxarı axınında 12-nt və 15-nt ofsetləri ilə məlum kodlaşdırma ardıcıllıqlarını (CDSs) və onların eksonlarını dəqiq təsvir edir. - müvafiq olaraq sayt kodonları (Şəkil 1B). İkincisi, RPF-lər ribosomların köçürülməsinin əsas xüsusiyyəti olan 3-nt kodon dövriliyinə malikdir, lakin RNT-seq oxunuşları yoxdur (Şəkil 1C). Üçüncüsü, RPF-lər RNT seq oxunuşları ilə müqayisədə CDS bölgələri üçün yüksək dərəcədə spesifikdir (Şəkil 1D). Kollektiv olaraq, bu müşahidələr iltihab reaksiyasında tərcümə tənzimlənməsinin qlobal təhlili üçün yaxşı məlumat keyfiyyətini göstərir.

İltihab reaksiyasında diferensial şəkildə tərcümə edilmiş mRNA-ları müəyyən etmək üçün hər bir zaman nöqtəsində bir hədddən (FPKM ≥10) yuxarıda ifadə edilən hər mRNT üçün aydın tərcümə effektivliyini (TE) hesabladıq. Burada biz aydın TE-ni CDS bölgələrində RNT seq oxunuşları üzərində RPF-lərin zənginləşdirilməsi kimi təyin etdik. LPS müalicəsi zamanı beş vaxt nöqtəsində əhəmiyyətli (empirik p<0.05) TE dəyişiklikləri olan 724 mRNA tapdıq (Şəkil 1E) (Əlavə fayl 1). Gen ontologiyasının təhlili bu mRNA-ların müxtəlif yollarda iştirak etdiyini aşkar etdi (Şəkil 1-şəkil 1B), o cümlədən iltihablı reaksiyalarda kritik olan TNF və NF-kB siqnal yolları. Həqiqətən, TNF Əsas iltihablı sitokin TNF-ni kodlayan mRNT translyasiya ilə tənzimlənir. Bu mRNT LPS stimullaşdırılması zamanı 0-dan 1 saata qədər transkripsiyaya səbəb olur və sonra 1-dən 2 saata qədər azalır və mRNT səviyyəsi stimullaşdırıldıqdan 6 saat sonra nisbətən sabit qalır. RPF-ləri TNF mRNT isə 1 saatdan 6 saata qədər əhəmiyyətli dərəcədə azalır, azdır TNF 6 saatda RPF-lər (Şəkil 1-şəkil əlavəsi 2), bu göstərir TNF mRNT iltihabın gec mərhələlərində translyasiya ilə repressiyaya məruz qalır. Həqiqətən, görünən TE TNF BMDM-lərdə mRNT LPS stimullaşdırılmasından sonra 1 saatdan 6 saata qədər əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (Şəkil 1 - şəkil əlavəsi 3A). Bu nəticəni daha da təsdiqləmək üçün biz paylanmanı izləmək üçün polisom analizini və ardınca qRT-PCR apardıq TNF saxaroza qradiyenti boyunca mRNT (Şəkil 1-şəkil 3B əlavəsi). ilə müqayisədə TNF mRNT 1 saat vaxt nöqtəsində, the TNF mRNT LPS müalicəsindən 6 saat sonra saxaroza qradiyenti üzrə poliribosom bölgəsindən mRNP bölgəsinə əhəmiyyətli bir sürüşmə keçirdi (Şəkil 1—şəkil 3B və C əlavəsi), bu transkript transkriptinin tərcümə ilə repressiya edildiyini göstərir. Əsas odur ki, nəzarət mRNT-nin paylanması, Gapdh mRNT, 1 saat və 6 saat vaxt nöqtələri arasında dəyişmədi (Şəkil 1 - şəkil əlavəsi 3C), bu da translyasiya repressiyasının spesifikliyini göstərir. TNF mRNT. Kollektiv olaraq, bu müşahidələr iltihab reaksiyası zamanı çoxlu sayda mRNA-nın tərcümə səviyyəsində tənzimləndiyini göstərdi.

Aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə potensial tərcümə tənzimləyicilərinin müəyyən edilməsi

mRNT-nin tərcüməsi UTR-lərdə cis-elementlər və RBP və mikroRNT kimi trans-fəaliyyət göstərən amillərlə modullaşdırıla bilər. İltihab reaksiyasında potensial tərcümə tənzimləyicilərini müəyyən etmək üçün biz aşağıdakı hesablama təhlilini apardıq. Əvvəlcə 724 differensial şəkildə tərcümə edilmiş mRNA-nın 3'UTR-lərində məlum bağlanma yerləri ilə uyğun gələn əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmiş motivlər (düzəliş edilmiş p<10-100, Fişerin dəqiq testi) üçün axtarış etdik.

Bu mRNA-ları bağlaya bilən RBP-lərin siyahısını yaradan in vitro bağlama tədqiqatları (Ray et al., 2013) vasitəsilə müəyyən edilmiş 200 RBP. Sonra, bu RBP siyahısından BMDM-lərdə ifadə olunanları (FPKM ≥10) seçdik, bu da iltihab reaksiyasında potensial tərcümə tənzimləyiciləri ola biləcək bir qrup RBP (Şəkil 1F) ilə nəticələndi. Bu RBP-lər arasında bu yanaşmanın etibarlılığını dəstəkləyən Pcbp1, Pcbp2 və Cpeb4 (Hu et al., 2014 Makeyev və Liebhaber, 2002) kimi bir neçə tanınmış tərcümə tənzimləyiciləri var.

Burada bir neçə səbəbə görə ARE (AU ilə zəngin element) bağlayıcı zülal olan Zfp36 (TTP) üzərində dayandıq. Birincisi, siçanlarda aparılan genetik tədqiqatlar Zfp36-nın iltihabı aradan qaldırmaq üçün lazım olduğunu göstərdi (Taylor et al., 1996). İkincisi, Zfp36 aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə (FPKM & gt200) bol şəkildə ifadə edilir. Üçüncüsü, Zfp36 hədəf mRNT deqradasiyasını təşviq etmək üçün xarakterizə edilsə də (Brooks və Blackshear, 2013-də nəzərdən keçirilmişdir), onun mRNA translyasiya nəzarətindəki rolu ilkin BMDM-lərdə yaxşı başa düşülmür.

Zfp36-nın mRNT tərcüməsini tənzimləyə biləcəyini yoxlamaq üçün, substrat mRNA-larını bilmədən hədəf RBP-nin funksiyasını təyin etməyə imkan verən bağlama təcrübələrini həyata keçirdik (Coller və Wickens, 2007). Xüsusilə, bakteriofaq λN polipeptidi və BoxB RNT motivi arasındakı möhkəm və spesifik qarşılıqlı əlaqədən istifadə edərək, biz λN-Zfp36 füzyon zülalını atəşböcəyi lusiferazası (FLuc) mRNA-nın 3'UTR-yə bağladıq (Şəkil 1 - şəkil əlavəsi 4). Luciferase fəaliyyəti və FLuc mRNT səviyyəsi daha sonra 293 T hüceyrəsində yoxlanıldı. Zfp36-nın bağlanması həm lusiferaza aktivliyini, həm də aktivliyini azaldıb Fluc mRNT səviyyəsi (Şəkil 1—şəkil əlavəsi 4). Əsas odur ki, tərcümə oluna bilən Fluc mRNA, lusiferaza aktivliyi olaraq təyin olunana qədər normallaşdırılır Fluc mRNA səviyyəsi, Zfp36-dan asılı şəkildə əhəmiyyətli dərəcədə azaldı (Şəkil 1-şəkil əlavəsi 4), Zfp36-nın mRNA tərcüməsini sıxışdıra biləcəyini göstərdi. Bu nəticə Zfp36 nokautlu BMDM-lərdə əvvəlki müşahidələrə uyğundur TNF Zfp36 hədəfi olan mRNA artır

vəhşi tipli BMDM-lərlə müqayisədə iki dəfə, lakin TNF proteini artmışdır

beş qat (Taylor et al.

Sonra, Zpf36-nın ilkin BMDM-lərdə mRNA tərcüməsini necə basdırdığını və endogen Zfp36-nın mRNA hədəflərini müəyyən etməyi hədəflədik.

Endojen Zfp36-nın öyrənilməsi üçün V5-epitop etiketli siçan

Həddindən artıq ifadə edilmiş Zfp36 və ya maya iki-hibrid sisteminin immunoprecipitation (IP) istifadə edərək əvvəlki tədqiqatlar Zpf36-nın qarşılıqlı əlaqədə ola biləcəyi bir çox zülalları müəyyən etmişdir (Brooks və Blackshear, 2013-də nəzərdən keçirilmişdir). Faydalı mexaniki anlayışlar əldə olunsa da, bu əvvəlki nəticələri şərh edərkən üç xəbərdarlıq var: (1) hüceyrə xətləri müvafiq ilkin hüceyrələri təmsil edə bilməz (2) həddindən artıq ifadə edilmiş Zfp36 ilə əlaqə quran zülallar endogen Zfp36 və (3) ilə qarşılıqlı əlaqədə olmaya bilər. bir çox müəyyən edilmiş qarşılıqlı təsirlər üçün onların gen ifadəsinə təsiri hələ də məlum deyil.Oxşar məhdudiyyətlər Zpf36-aşırı ifadə edən makrofaqabənzər və qeyri-makrofaq hüceyrə xəttlərində müəyyən edilmiş mRNA hədəflərinə də aiddir (Mukherjee və digərləri, 2014 Tiedje et al., 2016). Bununla belə, endogen Zpf36-nın öyrənilməsinin əhəmiyyətli texniki problemlərindən biri spesifik və effektiv Zfp36 izolyasiyası üçün IP dərəcəli antikorların olmamasıdır.

Bioloji cəhətdən uyğun bir şəraitdə gen ifadəsinin endogen Zfp36 vasitəçiliyi ilə tənzimlənməsini xarakterizə etmək və texniki maneələri aradan qaldırmaq üçün CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə genom redaktəsindən istifadə edərək V5-epiptop etiketini vuran siçan yaratdıq (Şəkil 2A). Xüsusilə, Zfp36 lokusunun stop-kodon bölgəsinə yaxın genomik sahəni hədəf alan sgRNA Cas9 fermenti və 51-nt V5-epitotpe etiketi olan oliqonukleotidlə siçan ziqotlarına koinyeksiya edilmişdir.

V5 ardıcıllığının hər tərəfində 60 nt homoloji qol. Cas9 tərəfindən yaradılan ikiqat zəncirli DNT qırılması homoloji rekombinasiya vasitəsilə V5-epitop etiketinin çərçivəyə daxil olmasını asanlaşdırdı. Genetik cəhətdən dəyişdirilmiş ziqotlar qoruyucu siçan analarına köçürüldü və nəticədə siçanlarda Zfp36-V5 knock-in alleli PCR ilə izləndi (Şəkil 2B). Biz bu Zfp36-V5 knock-in allelini backcrosses vasitəsilə genetik olaraq təmizlədik. Homoziqot Zfp36-V5 siçanları heterozigot cütləşmələrdən proqnozlaşdırılan Mendel nisbətində doğulmuşdur (Şəkil 2—şəkil 1A). Üstəlik, Zfp36 çatışmazlığı olan BMDM-lərdən fərqli olaraq (Taylor və digərləri, 1996), Zfp36-V5 siçanlarının BMDM-ləri iltihablı sitokin induksiyası və Zfp36 ifadəsi baxımından vəhşi tipli siçanlarla eyni reaksiyaya malikdir (Şəkil 2-şəkil). əlavə 1B), bu, döyülən siçanlarda Zfp36-V5-in Zfp36-nın vəhşi tip siçanlarda olduğu kimi eyni endogen səviyyədə ifadə edildiyini göstərir. Bundan əlavə, Zfp36-V5 siçanları fenotipik olaraq vəhşi tipli siçanlardan fərqlənmir. Bu müşahidələr 51-nt V5-teq vurma ardıcıllığının nə Zfp36 promotorunu, nə də 3'UTR-də tənzimləyici elementləri dəyişdirdiyi anlayışına uyğundur.

Endogen Zfp36 üzərində mexaniki tədqiqatlar üçün Zfp36 V5-epitop teq vurma siçanının yaradılması.

(A) CRISPR/Cas9 vasitəçiliyi ilə genomun redaktəsi vasitəsilə Zfp36-V5 knock-in siçanın yaradılması üçün iş axını. (B) Zfp36-V5 knock-in siçanlarının genotiplənməsi (-də göstərilən iki primerdən istifadə etməklə)A). (C) Zfp36-V5 siçanlarından BMDM-lərdə V5-epitopdan istifadə edərək Zfp36-nın spesifik və birmənalı aşkarlanması. Vəhşi tipli və Zfp36-V5 siçanlarından olan BMDM-lər 4 saat ərzində 100 ng/ml LPS ilə müalicə olundu, ardınca anti-V5 antikoru istifadə edərək Western blot tətbiq olundu. Zfp36-nın dublet lentləri onun post-tərcümə modifikasiyaları ilə bağlıdır. (D) Zfp36-V5 siçanlarından BMDM-lərdə V5-epitopdan istifadə edərək endogen Zfp36-nın səmərəli izolyasiyası. Zfp36-V5 siçanlarından olan BMDM-lər 4 saat ərzində 100 ng/ml LPS ilə stimullaşdırılıb, ardınca UV254 çarpaz bağlandı. Hüceyrə lizatlarından endogen Zfp36-nı İP etmək üçün müvafiq olaraq bir anti-V5 antikoru və iki fərqli IgG istifadə edilmişdir. Giriş, IP nümunələri və supernatantlar anti-V5 antikorundan istifadə edərək SDS-PAGE və Western blot analizinə məruz qaldı. Şəkil 2 üçün aşağıdakı şəkil əlavəsi mövcuddur.

V5 etiketi endogen Zfp36-nın dəqiq aşkarlanmasına və səmərəli izolyasiyasına imkan verir. Bir V5 antikorundan istifadə edərək, Zfp36-V5 siçanlarından BMDM-lərdə endogen Zfp36-nı birmənalı şəkildə aşkar edə bildik (Şəkil 2C, Şəkil 2 - şəkil əlavəsi 1C). Əhəmiyyətli odur ki, Zfp36 antikorundan fərqli olaraq, V5 antikoru qeyri-spesifik zolaqlarla nəticələnmir (Şəkil 2—şəkil əlavəsi 1C), bu Zfp36 aşkarlanmasının yüksək spesifikliyini göstərir. Bundan əlavə, V5 antikorundan istifadə edərək, Zfp36-nın giriş, IP və supernatant nümunələrində paylanması ilə göstərildiyi kimi, endogen Zfp36-nı UV-çapraz bağlı (aşağıya bax) LPS ilə müalicə olunan BMDM-lərdən səmərəli şəkildə təcrid edə bilərik (Şəkil 2D). Nəhayət, Zfp36-V5 siçanları demək olar ki, qeyri-məhdud əsas hüceyrələrin (yəni BMDM) mənbəyini təmin edir. Kollektiv olaraq, bu üstünlüklər Zfp36-V5 siçanını bioloji cəhətdən uyğun şəraitdə endogen Zfp36-nın mexaniki xarakteristikası üçün dəyərli alətə çevirir.

Zfp36 aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə sitoplazmik poli(A) bağlayıcı zülal ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqədə olur.

Zfp36-nın ilkin BMDM-lərdə gen ifadəsini necə tənzimlədiyini müəyyən etmək üçün əvvəlcə endogen Zfp36-nın IP-dən istifadə edərək, sonra kəmiyyət proteomikası ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğu zülalları müəyyən etdik. Xüsusilə, Zfp36-V5 siçanlarından BMDM-lər 4 saatlıq LPS stimullaşdırılmasından sonra, Zfp36-V5 bol şəkildə ifadə edildikdə yığılmışdır (Şəkil 2 - şəkil əlavəsi 1C). Zfp36 və onunla əlaqəli zülallar nəzarət kimi V5 antikoru və ya IgG istifadə edilərək İP-dən alınıb. Zfp36-nın RNT-ni bağlama qabiliyyətinə görə, IP RNT-vasitəçili qarşılıqlı əlaqəni pozan RNaseA ilə həyata keçirilmişdir ki, yalnız zülal-zülal qarşılıqlı təsirləri təcrid oluna bilər. IPed zülalları xüsusi olaraq Zfp36 ilə əlaqəli zülalları müəyyən etmək üçün tandem kütlə etiketinə (TMT) əsaslanan kəmiyyət proteomik analizinə (Tompson və digərləri, 2003) məruz qalmışdır (Şəkil 3A). Bu üsulda V5 antikoru və ya IgG ilə təcrid olunmuş zülallar tripsin tərəfindən həzm olunurdu. Hər bir nümunədən əldə edilən peptidlər fərqli izobarik kütlə etiketi ilə etiketləndi, ardınca kütlə spektrometriyası (nisbi və mütləq kəmiyyət üçün izobarik etiketlər, iTRAQ) identifikasiyası və kəmiyyəti üçün birləşdi. Hər bir nümunənin unikal kütlə etiketi V5 IP-də müəyyən edilmiş zülalların bolluğunu IgG nəzarət nümunələri ilə müqayisə etməyə imkan verir. Bu yanaşmadan istifadə edərək, V5 IP nümunələrində əhəmiyyətli dərəcədə zənginləşdirilmiş (hər üç bioloji replikada >2 qat) bir neçə zülal müəyyən etdik (Əlavə fayl 2). Müsbət nəzarət kimi Zfp36-nın özü 20 qatdan çox zənginləşdirməyə malik idi ki, bu da bu metodun etibarlılığını göstərir. Növbəti ən zənginləşdirilmiş (>4 qat) və bol aşkar edilmiş zülal Pabpc1, ardınca isə 14-3-3θ (Şəkil 3B) olmuşdur. Bundan sonra, mRNA tərcüməsini və sabitliyini idarə etməkdəki rollarına görə, sitoplazmik poli(A) bağlayıcı zülal 1 olan Pabpc1-ə diqqət yetirdik (Mangus et al., 2003).

Endogen Zfp36, LPS ilə stimullaşdırılmış BMDM-də Pabpc1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olur.

(A) LPS ilə stimullaşdırılmış BMDM-lərdə endogen Zfp36 ilə əlaqəli zülalları müəyyən etmək üçün tandem kütlə etiketi (TMT) kəmiyyət proteomikası üçün iş axını. (B) TMT kəmiyyət proteomikası ilə müəyyən edilmiş Zfp36 ilə əlaqəli zülallar. (C) Zfp36 LPS ilə stimullaşdırılmış BMDM-lərdə endogen Pabpc1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olur. Zfp36-V5 siçanlarından və ya vəhşi tipli (WT) siçanlardan olan BMDM-lər 4 saat ərzində 100 ng/ml LPS ilə müalicə olundu, ardınca (+) və ya (-) RNaseA (200 ng/ml) ilə IP ilə bir anti-ant V5 antikoru. Giriş (5%) və IP məhsulları göstərilən antikorlardan istifadə edərək SDS-PAGE və Western blot analizinə məruz qaldı. (D) Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsi RNT-dən müstəqildir. FLAG işarəli vəhşi tipli Zfp36 və ya mutant Zfp36(F118N) ifadə edən plazmid müvafiq olaraq 293 T hüceyrəsinə HA işarəli Pabpc1 ifadə edən plazmidlə birgə transfeksiya edilib. İP (+) və ya (-) RNaseA (200 ng/ul) ilə ya anti-FLAG antikoru, ya da IgG ilə aparılmışdır. Giriş və IP nümunələrində göstərilən zülalları təhlil etmək üçün SDS-PAGE və Western blot istifadə edilmişdir. (E) Pabpc1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olan regionun xəritələşdirilməsi üçün Zfp36 kəsilmələrinin sxematik təqdimatı. (F) Pabpc1-i bağlayan Zfp36-da bölgənin identifikasiyası. FLAG etiketli Zfp36 kəsilmələrini ifadə edən plazmidlər (E) müvafiq olaraq 293 T hüceyrələrinə HA işarəli Pabpc1 ifadə edən plazmid ilə birgə transfeksiya edilmişdir. IP RNaseA (200 ng/ml) ilə anti-FLAG antikoru və ya IgG istifadə edərək həyata keçirilib. Giriş və IP nümunələrində göstərilən zülalları təhlil etmək üçün SDS-PAGE və Western blot istifadə edilmişdir. Şəkil 3 üçün aşağıdakı şəkil əlavəsi mövcuddur.

Zfp36 və Pabpc1 arasında RNT-dən asılı olmayan qarşılıqlı əlaqəni yoxlamaq üçün iki əlavə təcrübə apardıq. Əvvəlcə Zfp36-V5 siçanlarından və V5 antikorundan istifadə edərək RNaseA olan və ya olmayan vəhşi tipli siçanlardan stimullaşdırılmış BMDM-lərdə IP-ləri yerinə yetirdik. Endogen Pabpc1, Zfp36-V5 BMDM-lərinin İP nümunələrində RNaseA-ya həssas olmayan şəkildə Western blot tərəfindən aşkar edilmişdir, lakin vəhşi tipli BMDM-lərdən deyil (Şəkil 3C). Əhəmiyyətli odur ki, İP nümunələrində bol sitoplazmik zülal olan Gapdh aşkar edilməmişdir ki, bu da IP-lərin spesifikliyini göstərir (Şəkil 3C). Bu nəticə göstərdi ki, endogen Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsi RNT ilə vasitəçilik etmir. Bu iki RBP arasındakı qarşılıqlı əlaqənin RNT-dən asılı olmadığını daha da təsdiqləmək və bu qarşılıqlı əlaqənin V5 etiketi ilə vasitəçilik etməsi ehtimalını istisna etmək üçün biz HA-etiketli Pabpc1-i ifadə edən 293 T hüceyrəsində ya FLAG etiketli Zfp36 ilə IP-ləri yerinə yetirdik. və ya FLAG etiketli RNT-bağlama çatışmazlığı olan Zfp36 mutantı (Zfp36[F118N]) (Lai et al., 2002). HA işarəli Pabpc1-in RNaseA-nın mövcudluğunda həm vəhşi tip, həm də mutant Zfp36 ilə xüsusi olaraq birləşdiyini aşkar etdik (Şəkil 3D). Zfp36-Pacbpc1 qarşılıqlı əlaqəsinin RNaseA-nın parçalaya bilmədiyi poli(A) ardıcıllığı ilə vasitəçilik etməsi ehtimalını daha da istisna etmək üçün biz RNT-ni qeyri-ardıcıllığa xas olmayan şəkildə deqradasiya edən RNAse1 ilə IP təcrübəsini həyata keçirdik. Zfp36-nın hələ də bu şərt altında Pabpc1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu aşkar etdik (Şəkil 3 - şəkil əlavəsi 1). Kollektiv olaraq, bu təcrübələr Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsinin həqiqətən RNT-dən asılı olmadığını ortaya qoydu. Pabp1c kəmiyyət proteomikası ilə müəyyən edilmiş ən bol Zfp36 ilə əlaqəli zülal olduğundan, endogen Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı təsirinin aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə birbaşa qarşılıqlı əlaqə olduğunu müdafiə edir.

Zfp36-da Pabpc1 ilə xüsusi olaraq qarşılıqlı əlaqədə ola bilən minimal bölgəni müəyyən etmək üçün struktur-funksiya xəritələrini yerinə yetirdik. Ətraflı olaraq, bir sıra FLAG etiketli Zfp36 kəsilmələri (Şəkil 3E) 293 T hüceyrəsində müvafiq olaraq co-IP üçün HA işarəli Pabpc1 ilə birlikdə ifadə edildi. Müəyyən edilmiş qarşılıqlı əlaqənin RNT-dən müstəqil olmasını təmin etmək üçün iki addım atdıq. Birincisi, bütün Zfp36 kəsilmələrində RNT bağlama qabiliyyətini ləğv edən F118N mutasiyası (Zfp36-m) var idi (Lai et al., 2002). İkincisi, IP-lər RNaseA ilə həyata keçirilmişdir. Bu təhlil Zfp36-da (Zfp36-mF) 39-dan 196-a qədər olan amin turşularından minimal bir bölgə ilə nəticələndi ki, bu da sabit şəkildə ifadə oluna bilər və xüsusi olaraq Pabpc1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olur (Şəkil 3F).

Zfp36 vasitəçiliyi ilə translyasiya repressiyası Pabpc1-dən asılıdır

Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsinin Zfp36-vasitəçili translyasiya repressiyası üçün tələb olunub-olunmadığını yoxlamaq üçün iki təcrübə apardıq. Əvvəlcə λN polipeptidindən və BoxB RNT motivi bağlama sistemindən istifadə edərək, Pabpc1 ilə qarşılıqlı əlaqədə ola bilməyən Zfp36 və 2 Zfp36 kəsiklərini (Şəkil 4-şəkil 1) ayrı-ayrılıqda 3'UTR-ə bağladıq. FLuc mRNA, sonra lusiferaza aktivliyi ölçüldü Fluc mRNT səviyyəsi və tərcümə qabiliyyəti (Şəkil 4A). Biz gördük ki, Zfp36-dan fərqli olaraq, iki kəsilmə xüsusi olaraq tərcüməni sıxışdırmır. Fluc mRNT (Şəkil 4B). Bu nəticə Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsinin funksional olması anlayışına uyğundur.

Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsi Zfp36 vasitəçiliyi ilə tərcümə repressiyası üçün tələb olunur.

(A) Luciferase reportyorları və Zfp36 və onun kəsikləri bağlama təcrübəsində istifadə olunur. Mavi qutu λN polipeptidini təmsil edir. (B) Lusiferaza aktivliyi, FLuc mRNA və translatabilite tethering təcrübəsində müəyyən edilmişdir. FLuc-5BoxB reportyor plazmidi və ya nəzarət plazmidi ya λN-GFP plazmidi, ya da λN-Zfp36 ifadə edən plazmidlər və onun kəsilmələri ilə birgə transfeksiya edilmişdir (A) müvafiq olaraq 293 T hüceyrəsinə. Lusiferaza analizi və mRNT ölçülməsi transfeksiyadan 24-30 saat sonra aparılmışdır. Tərcümə qabiliyyəti FLuc mRNA səviyyəsi ilə normallaşdırılmış lusiferaza aktivliyi kimi hesablanmışdır. Lusiferaza aktivliyi, FLuc mRNA və λN-GFP ifadə edən hüceyrələrdən tərcümə qabiliyyəti nisbi kəmiyyət üçün müvafiq olaraq 1 olaraq təyin edilmişdir. (C) FLuc-5BoxB-MALAT1 reportyoru mRNT poli(A)- transkriptdir. FLuc-5BoxB-MALAT1 reportyor plazmidi ilə transfeksiya edilmiş 293 T hüceyrəsindən cəmi RNT oliqod(T) ilə fraksiyalaşdırıldı.25 maqnit boncukları. RNT-lər poli(A)+ və poli(A) fraksiyalarında qRT-PCR ilə ölçüldü. Poli(A)- fraksiyasında RNT səviyyəsi nisbi RNT səviyyəsinin hesablanması üçün 1 olaraq təyin edilmişdir. (D) 293 T hüceyrəsində HA-Pabpc1-in İP. HA-Pabpc1 ifadə edən plazmid ya FLuc-5BoxB-SV40pA reportyoru, ya da FLuc-5BoxB-MALAT1 müxbiri ilə 293 T hüceyrəsinə birgə transfeksiya edilib. IP bir anti-HA antikoru istifadə edərək həyata keçirildi və giriş və İP nümunələrində göstərilən zülalları yoxlamaq üçün Western blot istifadə edildi. (E) Pabpc1 FLuc-5BoxB-MALAT1 reportyor mRNT-ni bağlamır. qRT-PCR, giriş və İP nümunələrindən təcrid olunmuş ümumi RNT-dən göstərilən mRNA-lar üzərində aparılmışdır.D). (F) Zfp36 FLuc-5BoxB-MALAT1 mRNA-nın tərcüməsini sıxışdıra bilməz. FLuc-5BoxB-MALAT1 mRNA-nın lusiferaza, mRNT səviyyəsi və tərcümə qabiliyyəti () -də təsvir olunduğu kimi bağlama təcrübəsində müəyyən edilmişdir.B). Bütün nəticələr üç müstəqil eksperimentin vasitələrini (± SD) əks etdirir. *p<0.05, n.s. Tələbənin t-testi ilə əhəmiyyətli deyil (p>0.05). Şəkil 4 üçün aşağıdakı şəkil əlavəsi mövcuddur.

Sonra, biz fərz etdik ki, Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsi vacibdirsə, Zpf36, poli(A) quyruğu olmayan mRNA kimi Pabpc1-dən məhrum olan transkriptlərin tərcüməsini sıxışdıra bilməz. Bu fərziyyəni yoxlamaq üçün biz FLuc reportyorunda (FLuc-5BoxB-SV40pA) SV40 poliadenilasiya siqnalını MALAT1-in 3' ucundakı ardıcıllıqla əvəz edərək poli(A) mənfi (poli(A)-) mRNT yaratdıq. poli(A) quyruğu olmayan sitoplazmik transkriptlərlə nəticələnə bilər (Şəkil 4C) (Wilusz et al., 2012). Həqiqətən, nəticədə FLuc-5Box-MALAT1 mRNT oliqod(T) maqnit muncuqları ilə fraksiyalaşdırıldı, əksəriyyəti (>95%) poli(A)- fraksiyada qaldı, bu da poli(A)- transkriptlərə bənzəyir, məsələn histon mRNT (H2ab) və 18S rRNA-dan fərqlidir Gapdh transkript, poli(A)+ mRNT (Şəkil 4C). Əlavə olaraq müəyyən etmək üçün poli(A)- FLuc-5Box-MALAT1 mRNT Pabpc1 ilə əlaqəli deyil, biz HA-Pabpc1-i ifadə edən 293 T hüceyrəsində RNT IP-ləri yerinə yetirdik. FLuc-5BoxB-SV40pA mRNT və ya FLuc-5BoxB-MALAT1 mRNT. HA-Pabpc1-in əhəmiyyətli miqdarda poli(A)+ transkriptlərini aşağı çəkə biləcəyini gördük, məsələn FLuc-5BoxB-SV40pA mRNT və Gapdh mRNT, lakin poli(A)- transkriptləri deyil, məsələn FLuc-5BoxB-MALAT1 mRNT və histon mRNT (H2ab) (Şəkil 4D və E). Bu nəticələr göstərdi ki, Pabpc1 poli(A)-nı bağlamır. FLuc-5BoxB-MALAT1 mRNT. Zfp36 şəbəkəyə bağlandıqda FLuc-5BoxB-MALAT1 mRNA, biz lusiferaza aktivliyində heç bir dəyişiklik olmadığını gördük, FLuc mRNA səviyyəsi və ya nəzarət zülalının (GFP) bağlanması ilə müqayisədə tərcümə qabiliyyəti (Şəkil 4F), bu da Zfp36-nın Pabpc1 ilə əlaqəli olmayan poli(A)-mRNA-nın tərcüməsini sıxışdıra bilməyəcəyini göstərir. Birlikdə, bu nəticələr Zfp36-vasitəçili tərcümə repressiyasında Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsinin funksional əhəmiyyətini mübahisə edir.

CLIP-seq ilə aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə Zfp36 qlobal mRNA hədəflərinin müəyyən edilməsi

Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsinin Zfp36 hədəf mRNA-larının ifadəsi ilə bağlı funksional uyğunluğunu müəyyən etmək üçün əvvəlcə aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə endogen Zfp36 bağlayan mRNA-ları müəyyən etdik. Xüsusilə, Zfp36-V5 BMDM-lərdə CLIP-seq (Darnell, 2010) yerinə yetirdik. Bu üsulda aktivləşdirilmiş BMDM-lər əvvəlcə UV (254 nm) ilə çarpaz bağlandı, bu, yalnız RNT və bir-biri ilə birbaşa təmasda olan zülallar arasında kovalent bağlar təqdim edir (Darnell, 2010). RNT-lərin zülalsız bölgələri hüceyrə lizatında RNase1 tərəfindən həzm olundu. Daha sonra Zfp36 və onunla əlaqəli RNT fraqmentləri V5 antikoru tərəfindən IPedildi. Zfp36 və onunla əlaqəli RNT fraqmentləri arasındakı kovalent əlaqə IP addımı zamanı sərt yuyulmağa imkan verir ki, bu da qeyri-spesifik qarşılıqlı təsirləri əhəmiyyətli dərəcədə azaldır. Daha sonra RNT fraqmentləri təcrid olundu və yüksək məhsuldarlıq ardıcıllığı üçün klonlaşdırıldı. Cəmi

İki müstəqil CLIP-seq təcrübəsindən (Şəkil 5A) 5 milyon unikal xəritələnmiş oxu əldə edilmişdir. Əhəmiyyətli olan odur ki, bu iki bioloji replikadan əldə edilən CLIP nəticələri bir-birinə bənzəyirdi, lakin ümumi RNT-də RNT-seq-dən fərqli idi ki, bu da məlumatların yüksək reproduktivliyini göstərir (Şəkil 5B).

CLIP-seq istifadə edərək, Zfp36 hədəf mRNA-larının transkriptom geniş identifikasiyası.

(A) CLIP-seq dublikatları və RNT-seq üçün siçan genomuna bənzərsiz şəkildə təyin edilmiş oxunmaların sayını ümumiləşdirən Cədvəl. (B) CLIP-seq dublikatlarından və mRNA-seq-dən gen başına unikal xəritələşdirilmiş oxunmaların sayının log qrafikləri. Hər bir nöqtə bir geni təmsil edir. Pearson korrelyasiya əmsalları (Cor) göstərilir. (C) CLIP-seq protein kodlayan genlər daxilində paylanmanı oxuyur. CLIP-seq oxunuşları üçün mRNA-lara unikal şəkildə uyğunlaşdırılmışdır, onların 3'UTR, 5'UTR, CDS və intron bölgələrindəki faizləri göstərilir. (D) CLIP-seq tərəfindən müəyyən edilmiş çox təmsil olunan Zfp36 bağlayıcı motivlər. Motiv mRNA-lardakı Zfp36 bağlayıcı klasterlərdə MEME analizi ilə müəyyən edilmişdir. E-dəyər 1.6e-22-dir. (E) Aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə Zfp36 hədəf mRNA-larının gen ontologiyası təhlili.

İki müstəqil CLIP-seq eksperimentinin hər ikisində mövcud olan aydın Zfp36 bağlayıcı zirvələri olan 280 mRNA müəyyən etdik (Əlavə fayl 3). Bu mRNA-lara yaxşı xarakterizə olunan Zfp36 hədəfləri daxildir, məsələn TNF, İL-6, və Zfp36 özü. Bağlayıcı zirvələrin əksəriyyəti hədəf mRNA-ların 3'UTR-lərində yerləşir (Şəkil 5C). Tənqidi olaraq, motiv təhlili Zfp36 bağlayan zirvələr daxilində ən əhəmiyyətli şəkildə zənginləşdirilmiş ardıcıl motivin UAUUUAUU olduğunu ortaya qoydu (Şəkil 5D). Baxmayaraq ki, UV-C (məsələn, UV254nm) ilə induksiya olunan çarpaz bağlanma daha çox uridinlərdə baş verir (Sugimoto et al., 2012), müəyyən etdiyimiz U ilə zəngin motiv (Şəkil 5D) in vitro RNT bağlanmasından müəyyən edilmiş Zfp36 bağlayıcı motivlərlə uyğun gəlir. Zfp36 üzrə tədqiqatlar (Brooks və Blackshear, 2013-cü ildə nəzərdən keçirilib), UAUUUAUU ardıcıllığının həm də aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə Zfp36-nın in vivo bağlama motivi olduğunu qəti şəkildə müdafiə edir. Gen ontologiyası təhlili Zfp36 hədəf mRNA-larının sitokin və kemokin siqnal yolları kimi iltihab reaksiyalarında bir neçə mühüm yolda iştirak etdiyini ortaya qoydu (Şəkil 5E). Kollektiv olaraq, bu nəticələr CLIP-seq məlumatlarının etibarlılığını göstərdi və aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə endogen Zfp36 bağlayan mRNT hədəflərini müəyyən etdi.

Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsi aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə Zfp36 vasitəçiliyi ilə tərcümə repressiyası üçün tələb olunur.

Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsinin aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə Zfp36 hədəf mRNA ifadəsinə nəzarət etmək üçün funksional olaraq uyğun olub olmadığını müəyyən etmək üçün əvvəlcə bu endogen qarşılıqlı əlaqəni zəiflətdik. Xüsusilə, biz retrovirus vektorundan istifadə edərək Zfp36-V5 BMDM-lərdə Pabpc1 (Şəkil 3E, F) ilə qarşılıqlı əlaqədə ola bilən minimal Zfp36 bölgəsini (Zfp36-mF) ifadə etdik (Şəkil 6A). Əhəmiyyətli olan odur ki, Zfp36-mF, Zfp36 hədəf mRNA-ları üçün rəqabətli bağlanmanın fəsadlarını aradan qaldıran RNT bağlama fəaliyyətini (Lai və digərləri, 2002) ləğv edən bir nöqtə mutasiyası (F118N) ehtiva edir. RNaseA ilə IP, endogen Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı təsirinin Zfp36-mF-ifadə edən BMDM-lərdə nəzarət BMDM-ləri ilə müqayisədə yarıya qədər azaldığını göstərdi (Şəkil 6B, C).

Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsi LPS-stimullaşdırılmış BMDM-də Zfp36-vasitəçili translyasiya repressiyası üçün vacibdir.

(A) LPS ilə stimullaşdırılmış BMDM-lərdə Zfp36-mF fraqmentinin ifadəsi. Zfp36-V5 siçanlarından BMDM-lər ya boş retrovirus vektoru, ya da Zfp36-mF fraqmentini ifadə edən retrovirus vektoru ilə transduksiya edilmişdir (Şəkil 3E). Transduksiya edilmiş BMDM-lər 4 saat ərzində LPS ilə müalicə olundu və Zfp36-mF-nin ifadə səviyyəsi göstərilən antikorlardan istifadə edərək Western blot tərəfindən nəzarət edildi. (B) Zfp36-mF aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə endogen Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı təsirini zəiflədir. Zfp36, LPS ilə stimullaşdırılmış transduksiya edilmiş BMDM-lərin hüceyrə lizatlarından RNaseA (200 ng/ml) ilə IPedildi (A) anti-V5 antikorundan istifadə etməklə. Giriş və IP nümunələrində göstərilən zülalları təhlil etmək üçün SDS-PAGE və Western blot istifadə edilmişdir. (C) Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı təsirinin kəmiyyəti. IPed endogen Pabpc1 ImageJ tərəfindən ölçüldü və boş vektoru ifadə edən BMDM-lərdən Pabpc1 intensivliyi nisbi kəmiyyət üçün 1 olaraq təyin edildi. (D) Birincil BMDM-ləri ifadə edən Zfp36-mF-nin polisom analizi. (E) Zfp36 hədəf mRNA-ları BMDM-ləri ifadə edən Zfp36-mF-də translyasiya olaraq yuxarı tənzimlənir. mRNP, 80S və poliribosom fraksiyalarında mRNT paylanması (D-də göstərilmişdir) müvafiq olaraq Zfp36-mF (+) və ya boş retrovirus vektorunu (-) ifadə edən aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə qRT-PCR ilə ölçüldü. (F) Zfp36 hədəf mRNA səviyyələri BMDM-ləri ifadə edən Zfp36-mF-də kəskin şəkildə dəyişməyib. TNF və IL-6 mRNA-ları müvafiq olaraq Zfp36-mF və ya boş vektoru ifadə edən aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə qRT-PCR ilə ölçüldü. Normallaşma üçün 18S rRNT istifadə edilmişdir. (G) Zfp36 hədəf mRNA-larından olan zülallar Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı təsirini zəiflətdikdə artır. TNF və IL-6 zülalları müvafiq olaraq BMDM-ləri və nəzarət BMDM-lərini ifadə edən Zfp36-mF-nin hüceyrə lizatında və supernatantında ELISA ilə ölçüldü. Nəticələr üç müstəqil eksperimentin vasitələrini (± SD) təmsil edir. *p<0.05 və n.s. Tələbənin t-testi ilə əhəmiyyətli deyil.

Sonra, Zfp36 hədəf mRNA-larının ribosom birləşməsini saxaroza-sıxlıq-qradient vasitəçiliyi ilə polisom profili ilə izlədik. Zfp36-mF fraqmentinin ifadəsi aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə qlobal polisom profilini dəyişmədi (Şəkil 6D), bu fraqmentin RNT-ni bağlamadığı anlayışına uyğundur. Sonra yeddi Zfp36 hədəf mRNA-nın gradient üzrə paylanmasını araşdırdıq. Bu mRNA-lar bol şəkildə ifadə edilir və 3'UTR-ləri daxilində güclü Zfp36 bağlayıcı zirvələrə malikdir. Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı təsirini zəiflətdikdən sonra Zfp36 hədəf mRNA-larının hamısında ribosomun köçürülməsindən məhrum olan mRNP bölgəsindən saxaroza qradiyenti üzrə aktiv tərcümənin baş verdiyi poliribosom bölgəsinə əhəmiyyətli yerdəyişmələr oldu (Şəkil 6E). Tənqidi olaraq, paylanması Gapdh Zfp36 hədəfi olmayan mRNT Zfp36-mF ifadəsi ilə dəyişməyib (Şəkil 6E). Bu müşahidələr göstərdi ki, Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı təsirinin zəifləməsi Zpf36 hədəf mRNA-larında ribosom birləşməsinin xüsusi artması ilə nəticələndi.

Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsinin funksional əhəmiyyətini daha da yoxlamaq üçün iki Zfp36 hədəfinin mRNT və protein səviyyələrini ölçdük: TNFİL-6. Bu iki sitokin iltihab reaksiyasında kritik oyunçulardır. Kəmiyyət RT-PCR bunu üzə çıxarıb İL-6 mRNT əhəmiyyətli dərəcədə dəyişməyib və TNF mRNT bir qədər azaldı (

70% nəzarət) Zfp36-mF ifadə edildikdə (Şəkil 6F). Maraqlıdır ki, protein səviyyəsində həm TNF, həm də IL-6 BMDM-ləri ifadə edən Zfp36-mF-dən hüceyrə lizatlarında əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (Şəkil 6G). Zfp36-mF-ifadə edən hüceyrələrdən (Şəkil 6G) supernatantda oxşar artımlar müşahidə edildi, baxmayaraq ki, IL-6-da artım statistik cəhətdən əhəmiyyətli deyildi. Beləliklə, mRNA səviyyəsindən və zülal səviyyəsindən birləşdirilmiş nəticələr endogen Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsi zəiflədikdə bu iki Zfp36 hədəf mRNA-nın tərcümə səmərəliliyinin artdığını göstərdi.

Kollektiv olaraq, bu nəticələr Zfp36-Pabpc1 qarşılıqlı əlaqəsinin aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə Zfp36 hədəf mRNA-larının tərcümə repressiyası üçün tələb olunduğunu ortaya qoydu.

Zfp36, Pabpc1 tərcüməni tənzimlədiyi kimi oxşar addımlarla tərcüməni sıxışdırır

Zfp36 tərcüməsinin hansı addım(lar)ının müdaxilə etdiyini müəyyən etmək üçün biz IRES (daxili ribosom giriş yeri) elementlərini ehtiva edən bicistronic reportyorlardan istifadə etdik. IRES elementləri eukaryotik tərcümənin başlanğıcını yerləşdirə və aktivləşdirə bilən bir çox virusda mövcud olan strukturlaşdırılmış RNT-lərdir (Fraser və Doudna, 2007). Əsas odur ki, kanonik tərcümə ilə müqayisədə, müxtəlif virus IRES elementləri tərcümənin başlanğıc faktorlarının müxtəlif alt dəstlərini tələb edir. Beləliklə, müxtəlif IRES vasitəçiliyi ilə edilən tərcümələrin Zfp36-ya həssaslığını araşdıraraq, Zfp36 tərəfindən tərcümənin hansı addım(lar)ının sıxışdırıldığını tədqiq etməyi məqsəd qoyduq. Burada iki IRES elementindən istifadə etdik: tərcümənin başlanması üçün eIF4G və eIF4E istisna olmaqla, bütün başlanğıc faktorlarını tələb edən hepatit C virusu (HCV) IRES və tərcümə üçün yalnız 40S ribosom alt bölməsinə ehtiyacı olan kriket iflic virusu (CrPV) IRES başlanğıc. Bu iki IRES elementi müvafiq olaraq bicistronic reportyorda FLuc CDS və renilla luciferase (RLuc) CDS arasına daxil edilmişdir (Şəkil 7A). Beləliklə, FLuc tərcüməsi kanonik başlıqdan asılı tərcümə ilə idarə olunur, RLuc isə IRES vasitəçiliyi ilə tərcümə olunur. Bundan əlavə, reportyorun 3'UTR-də BoxB RNT motivləri λN polipeptidindən istifadə edərək bicistronic reportyor mRNA-larında ya Zfp36, ya da nəzarət zülalının (GFP) spesifik bağlanmasına imkan verir. Zfp36 bağlandıqda reportyor mRNA səviyyələri GFP tethering ilə müqayisədə dəyişməyib (Şəkil 7B). Maraqlıdır ki, həm HCV-IRES müxbirində, həm də CrPV-IRES müxbirində həm FLuc, həm də RLuc lusiferaza fəaliyyəti əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır (Şəkil 7C). 40S ribosom alt bölməsi CrPV IRES elementi tərəfindən tərcüməyə başlamaq üçün lazım olan yeganə amil olduğundan (Fraser və Doudna, 2007), bu nəticələr Zfp36-nın ya tərcümənin başlanması zamanı 40S ribosom subunitinin işə salınmasına mane olduğunu və ya ribosomun başlanması zamanı və ya sonrasında baş verən hadisələri inhibə etdiyini qəti şəkildə iddia edir. mRNA tərcüməsi zamanı 60S alt vahidinin birləşmə mərhələsi. Maraqlıdır ki, Pabpc1 də mRNA tərcüməsini asanlaşdırmaq üçün bu addımları tənzimləyir (Mangus və digərləri, 2003). Beləliklə, bu müşahidələr göstərir ki, Zfp36, Pabpc1 tərcüməni tənzimlədiyi kimi oxşar addım(lar)da tərcüməni sıxışdırır.

Zfp36, Pabpc1 tərcüməni tənzimlədiyi kimi oxşar addımlarla tərcüməni sıxışdırır.

(A) Zfp36-nın tərcüməni necə basdırdığını öyrənmək üçün bisistronik lusiferaza məruzəçi sisteminin sxematik təqdimatı. (B) Zfp36-nın bağlanması bicistronic reportyorların mRNA səviyyələrini dəyişmir. Bicistronic reportyor plazmidi (ya HCV müxbiri, ya da CrPV reportyoru) λN-GFP plazmidi və ya λN-Zfp36 plazmidi ilə müvafiq olaraq 293 T hüceyrəsinə birgə transfeksiya edilmişdir. Transfeksiya edilmiş 293 T hüceyrəsindən reportyor mRNT səviyyələri qRT-PCR ilə ölçüldü və normallaşma üçün 18S rRNT istifadə edildi. (C) Zfp36 həm kanonik tərcüməni, həm də IRES vasitəsi ilə tərcüməni maneə törədir. Bicistronic reportyor plazmidi ya λN-GFP plazmidi, ya da λN-Zfp36 plazmidi ilə müvafiq olaraq 293 T hüceyrəsinə transfeksiya edilmişdir. Atəşböcəyi (FLuc) və renilla (RLuc) lusiferaza fəaliyyəti transfeksiyadan 24-30 saat sonra ölçüldü. Tərcümə qabiliyyəti reportyor mRNT səviyyəsi ilə normallaşdırılan lusiferaza aktivliyi kimi hesablanır. (D) Aktivləşdirilmiş BMDM-lərdə gen ifadəsinin Zfp36 vasitəçiliyi ilə tənzimlənməsi üçün bir model. Bütün kəmiyyət nəticələri üç müstəqil təcrübənin vasitələrini (± SD) təmsil edir. *p<0.05 və n.s. Tələbənin t-testi ilə əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənmir.


MÜZAKİRƏ

Yuxarıdakı bir sıra müşahidələr KH-domen zülalının, GLD-1-in birbaşa repressor kimi fəaliyyət göstərdiyini göstərir. glp-1 tərcümə. Birincisi, endogen GLD-1 xüsusi olaraq əlaqələndirilə bilər glp-1 GRE repressiya elementini ehtiva edən RNT. İkincisi, rekombinant GLD-1 spesifik olaraq və birbaşa 34 nukleotid fraqmentinə bağlanır. glp-1 SCR in vitro. Üçüncüsü, GLD-1-in bağlanması glp-1 RNT xüsusi olaraq GRE-dəki mutasiyalar tərəfindən pozulur, bu da meiotik mikrob hüceyrələrində və erkən embrionlarda tərcümənin repressiyasını pozur. Nəhayət, endogen GLD-1-in tükənməsi endogen GLP-1-in oxşar vaxtlarda və inkişaf yerlərində uyğunsuz ifadə edilməsinə səbəb olur. glp-1 GRE funksiyaları. Bu nəticələr GLD-1-in repressor olduğunu güclü şəkildə göstərir glp-1 iki inkişaf mərhələsində tərcümə, mikrob hüceyrəsi meiozunun erkən profilaktikası və embriogenezin erkən mərhələsində.

GLD-1 müxtəlif siqnal ötürülməsi və inkişaf hadisələri ilə əlaqəli olan STAR/Quaking/GSG zülal ailəsinin qorunmuş üzvüdür. In C. elegans, GLD-1-in bir neçə rüşeym xətti mRNA-nın tənzimlənməsi ilə cücərmə xəttində cinsiyyət təyini və oogenezi idarə etdiyi göstərilmişdir (Francis və digərləri, 1995a Jan və digərləri, 1999 Lee və Schedl, 2001 Xu et al., 2001). Tədqiqatlarımız erkən embrion asimmetriyasına nəzarətdə GLD-1 üçün yeni bir funksiya təklif edir. Bu funksiya bir Notch reseptorunun embrionun ön hüceyrələrinə lokalizasiyasına kömək edir. Digər orqanizmlərdə STAR ailəsinin üzvləri müxtəlif protein kinaz siqnal kaskadlarına qoşulmuşdur (Vernet və Artzt, 1997). In C. elegans, GLD-1 tərcüməsini tənzimləyir tra-2cinsi təyin etmək üçün əsas membran reseptorunu kodlayan (Jan et al., 1999 Kuwabara et al., 1992). GLD-1 həmçinin rüşeym xəttində bir Raf protein kinazını kodlayan mRNT ilə əlaqələndirilir (Lee və Schedl, 2001). Nəticələrimiz GLD-1 funksiyasını başqa bir siqnal sisteminin, Notch yolunun idarə edilməsi ilə əlaqələndirir. Buna görə də, RNT bağlayıcı zülalların bu ailəsi metazoanlarda mühüm inkişaf qərarlarını idarə edən müxtəlif siqnal hadisələrinin tənzimlənməsi üçün ümumiyyətlə vacib ola bilər.

Bu nəticələr göstərir ki, GLD-1 həm embrionda, həm də cücərmə xəttində Notch siqnalının məkan təşkilinə kömək edir. Embrionda GLP-1/Notch liqandlarının və reseptorun lokalizasiyası, ehtimal ki, ön hüceyrə taleyinin məkan nümunəsi üçün vacibdir (Mello et al., 1994 Priess və Thomson, 1987). Biz təklif edirik ki, GLD-1 repressiya yolu ilə bu prosesdə iştirak etsin glp-1 embrionun arxa hüceyrələrində tərcümə. Germline, GLD-1 repressiya glp-1 Notch siqnalının və mikrob hüceyrələrinin inkişafının məkan təşkilinə nəzarət edən RNT tənzimlənməsinin mənfi rəy sisteminin bir hissəsi ola bilər. GLP-1, mitotik kök hüceyrə populyasiyasını qoruduğu distal ucun mitotik mikrob hüceyrələrində ifadə edilir (Austin və Kimble, 1987 Crittenden et al., 1994). Maraqlıdır ki, GLD-1 ifadəsi mitotik distal uc bölgəsində RNα-bağlayıcı zülallar FBF-1 və FBF-2-dən asılı olan bir proseslə inhibə edilir və bu, birbaşa bağlana bilir. gld-1 3′ UTR (Crittenden və digərləri, 2002 Jones və digərləri, 1996). Bu, bu hüceyrələrdə GLP-1 reseptorunun tam ifadəsini təmin etmək üçün vacib ola bilər. Mikrob hüceyrələri distal ucundan və GLP-1 siqnalı üçün liqand mənbəyindən uzaqlaşdıqca, onlar meioza daxil olurlar və GLD-1 və ehtimal ki, digər amilləri (aşağıya bax) ifadə etməyə başlayırlar, bu da sonra onların tərcüməsini sıxışdırır. glp-1 mRNT. GLD-1 mitoz və qadın gametlərinin diferensiasiyasından çıxışı təşviq etmək üçün vacibdir (Francis et al., 1995a Francis et al., 1995b). Bununla belə, genetik tədqiqatlar göstərir ki, GLD-1 tərəfindən GLP-1 aşağı tənzimlənməsi yalnız germ hüceyrə mitozunun inhibe edilməsinə zəif kömək edir (Francis et al., 1995b). Bu GLD-1 repressiyası ola bilər glp-1 mRNT və digər mRNA-lar, GLP-1/Notch liqandının somatik distal uc hüceyrəsinə lokalizasiyası ilə birlikdə (Henderson və digərləri, 1994), GLP-1 siqnalını məkan olaraq məhdudlaşdırmaq və germline kök hüceyrələrinin mitotik proliferasiyasını təşkil etmək üçün lazımsız sistemlər təmin edir. gonad.

Araşdırmalarımız və əvvəlki müşahidələrimiz dəqiq lokalizasiyanın olduğunu göstərir glp-1 embrionda tərcümə GLD-1-in digər amillərlə tənzimlənməsini tələb edir. Erkən embrionda lokallaşdırılmış tərcümə yalnız GRE deyil, həm də tərcüməni təşviq edən GDE tələb edir. GDE yalnız GRE-ni tənzimləmək üçün lazım olduğundan, biz onun GLD-1-in GRE-yə və ya onun fəaliyyətinə bağlanmasını maneə törədən derepressiya faktoru üçün bağlama yeri kimi fəaliyyət göstərməsini təklif edirik (Şəkil 6). Tərcümənin lokalizasiyasına ən sadə şəkildə derepressorun anterior hüceyrələrə lokalizasiyası ilə nail olmaq olar. Bununla belə, GLD-1 posterior hüceyrələrdə çox zəngindir (Jones et al., 1996). Anterior hüceyrələrdə davam edən aşağı qalıq GLD-1 səviyyələrini maneə törətmək üçün bir derepressor lazım ola bilər. Ola bilsin ki, həm GLD-1, həm də derepressor amillərin lokalizasiyası GLP-1 və digər hüceyrə taleyi tənzimləyicilərinin sıx lokalizasiyasını təmin edir. Alternativ olaraq, başqa bir qeyri-lokal repressor da kömək edə bilər glp-1 GRE vasitəsilə mRNA repressiyası.


Nəticələr

PAB Xenopus oositlərində tərcüməni stimullaşdıra bilər

PAB-nin tərcüməni stimullaşdıra biləcəyini müəyyən etmək Xenopus laevis oositlər, biz əvvəllər mayada mRNT sabitliyini öyrənmək üçün istifadə edilən "bağlanmış funksiya" analizini uyğunlaşdırmaqla PAB-nı reportyor mRNT-nin 3′-UTR-yə bağladıq ( Coller və b., 1998 Şəkil 1A). Bu yanaşma PAB-nın tərcümədə rolu ilə bağlı araşdırmaları onun digər funksiyalarından azad edir və PAB-nın tükənməsinin fəsadları olmadan müəyyən mRNT-də PAB-nın mövcudluğunu modulyasiya etməyə imkan verir. in vivo. In vitro PAB ilə birləşdirilən MS2 və ya MS2-ni kodlayan transkripsiya edilmiş mRNA-lar (MS2-PAB Şəkil 1A) VI mərhələyə yeridildi. Ksenop oositlər. Protein istehsalını təmin etmək üçün oositlər 6 saat inkubasiya edildi. Daha sonra məruzəçi mRNA-lar enjekte edildi və oositlər yığımdan əvvəl bir gecədə inkubasiya edildi. İki mRNA istifadə edildi və qarışıq olaraq vuruldu (Şəkil 1B). Luc-MS2 mRNA lusiferazanı kodlayır və əksinə MS2-məcburi yerləri ehtiva edir, nəzarət β-Gal mRNA β-qalaktosidazanı kodlayır, lakin MS2 sahələrini ehtiva etmir (Şəkil 1B). Bütün bu iş ərzində translyasiya aktivliyi ölçüldü, belə ki, β-qalaktosidaza aktivliyinə normallaşdırılan lusiferaza aktivliyi β-qalaktosidaza səviyyələrindəki variasiyalar adətən <10% təşkil edirdi, bu da nəzarət mRNT-nin birləşmə zülallarının mövcudluğuna cavab vermədiyini göstərir (Şəkil 3 əfsanəsinə baxın).

MS2-PAB ifadəsi tək MS2 zülalı ilə müqayisədə Luc-MS2 mRNA-dan lusiferaza fəaliyyətini stimullaşdırdı (Şəkil 1C). Müşahidə olunan orta stimullaşdırma 7 dəfə nadir hallarda <4,5 və ya >10 dəfə olmuşdur. Məruzəçi mRNA-nın miqdarının böyüklük sırası ilə azaldılması bağlı PAB tərəfindən stimullaşdırmanı artırmadı, standart şəraitdə reportyor mRNT-nin PAB zülalına nisbətinin optimal olduğunu göstərir (məlumatlar göstərilmir). 32 P etiketli Luc-MS2 mRNA eksperimentin gedişində MS2 və ya MS2-PAB ifadə edən oositlərdə eyni dərəcədə sabit idi (Şəkil 1D). Bu, lusiferaza aktivliyinin artmasının müxbir mRNT sabitliyindən deyil, tərcümədəki fərqlərdən qaynaqlandığını göstərir.

MS2-PAB tərəfindən stimullaşdırmanın yalnız baş verib-vermədiyini müəyyən etmək üçün cis-də, biz MS2–PAB-nin Luc-ΔMS2 mRNA-ya təsirini təhlil etdik. Bu mRNT Luc-MS2 mRNA-dan yalnız onunla fərqlənir ki, onda MS2-ni birləşdirən yerlər yoxdur (Şəkil 1B). Luc-ΔMS2-nin tərcüməsi MS2–PAB tərəfindən stimullaşdırılmadı (Şəkil 2A, 1 və 2-ci çubuqları 3 və 4 ilə müqayisə edin). Gel hərəkətliliyinin dəyişməsi analizləri göstərdi ki, MS2-PAB yalnız Luc-MS2 mRNA ilə qarşılıqlı təsir göstərir: etiketlənməmiş Luc-MS2 mRNA, Luc-ΔMS2 mRNA deyil, MS2-PAB-nin MS2 sahələrini daşıyan qısa radioetiketli RNT-yə bağlanması üçün rəqabət aparır (Şəkil 2B). The cis bağlı PAB stimullaşdırılmasından asılılıq MS2-PAB-nin nəzarətə, β-qalaktosidaza mRNA-ya təsirinin olmaması ilə təsdiq edilmişdir (məlumatlar göstərilmir).

Stimullaşdırmanın füzyon zülalının PAB hissəsini tələb edib etmədiyini müəyyən etmək üçün digər iki polipeptid MS2 örtük zülalına birləşdirildi (Şəkil 2C). MS2–CAT bakterial xloramfenikol asetiltransferaza (CAT), RNT metabolizmində məlum funksiyası olmayan bir zülal ilə MS2 birləşməsidir. MS2–U1A MS2-nin RNT-nin tanınması motivi (RRM) ailəsinin spliceosomal RNT bağlayan zülalı olan U1A ilə birləşməsidir ( Jovine və b., 1996 və oradakı istinadlar). Luc-MS2 mRNA-nın bu birləşmə zülallarını ifadə edən oositlərə yeridilməsi yalnız MS2-PAB-nin lusiferaza tərcüməsini stimullaşdırdığını aşkar etdi (Şəkil 2C). Bütün füzyon zülalları oositlərdə ifadə edildi (Şəkil 2D). [MS2 zülalı bu kiçik zülaldakı metioninlərin sayının az olması səbəbindən asanlıqla vizuallaşdırıla bilmədi (məlumatlar göstərilmir). Bu, bağlanmış PAB-nın digər sintez zülalları, o cümlədən digər RRM-lər tərəfindən əldə olunmayan spesifik tərzdə tərcüməni stimullaşdırdığını göstərir. zülalları ehtiva edir. Buna görə də belə nəticəyə gəlirik ki, PAB xüsusi bir dildə tərcüməni stimullaşdırır, cis-də asılı şəkildə Ksenop oositlər.

PAB-ın çoxsaylı domenləri tərcüməni stimullaşdıra bilər

PAB RRM ailəsinin dörd qeyri-ekvivalent RNT bağlayıcı motivindən və C-terminal domenindən (Sachs) ibarətdir. və b., 1986 Burd və b., 1991 Şəkil 3A). RRM 2 PAB-nın poli(A)-nı bağlamaq qabiliyyətinin çoxunu təmin edir, RRM 4 isə “qeyri-spesifik” RNT-ni bağlamaq fəaliyyətinin çoxunu təmin edir (Nietfeld). və b., 1990 Burd və b., 1991 Kühn və Pieler, 1996 Deardorff and Sachs, 1997). PAB-nin C-terminusu ən az qorunur və RNT-ni bağlamır (Kühn və Pieler, 1996): o, PAB molekulları arasında molekullararası qarşılıqlı əlaqəni təşviq edə bilər (Kühn və Pieler, 1996) və mayada mRNT sabitləşməsinə kömək edə bilər (Kühn və Pieler, 1996). Coller və b., 1998 ).

Ayrı-ayrı PAB domenlərinin tərcüməyə töhfələrini araşdırmaq in vivo, biz PAB bölgələrini bağladıq və tərcüməni təhlil etdik (Şəkil 3A).Nümunəvi eksperiment Şəkil 3B-də, bir neçə təcrübənin orta göstəricisi isə Şəkil 3C-də göstərilmişdir. Tərkibində RRM 1-4 (MS2 1-4) olan füzyon zülalının tam stimullaşdırıcı fəaliyyət göstərməsi, C-terminusunun tələb olunmadığını göstərir. RRM 1-4 ilə stimullaşdırmanın dimerləşmə yolu ilə endogen tam uzunluqlu PAB-nin cəlb edilməsi ilə vasitəçilik etmək ehtimalı azdır (məlumatlar Kühn və Pieler, 1996-da göstərilmir). RRM 1 və 2 (MS2 1-2) tərcüməni stimullaşdırmaq üçün kifayət idi və tam uzunluqlu PAB-dan daha aktiv görünürdü, bu təkrarlana bilən fərqin əhəmiyyəti aydın deyil. Təəccüblüdür ki, yalnız RRM 3 və 4 (MS2 3-4) ehtiva edən füzyon proteini də tam uzunluqlu MS2-PAB-ə bənzər dərəcədə Luc-MS2 tərcüməsini stimullaşdırdı. PAB-ın yalnız C-terminal hissəsini (MS2-Ct) ehtiva edən birləşmə daha kiçik, lakin təkrarlana bilən və tərcüməni stimullaşdırmaq üçün xüsusi qabiliyyət göstərdi (Şəkil 3B və C). Hər hansı qeyri-spesifik stimullaşdırıcı fəaliyyət üçün əlavə nəzarət kimi daxil edilən MS2-U1A tərcüməni əhəmiyyətli dərəcədə stimullaşdırmadı. Bütün birləşmə zülalları oositlərdə ifadə edildi (Şəkil 3D) və ifadə səviyyələrindəki fərqlər onların fəaliyyətindəki fərqləri izah etmir. Eynilə, 10 qat daha az reportyor mRNA yeritməklə zülalın mRNT nisbətinin artırılması stimullaşdırmanın miqyasına heç bir təsir göstərməmişdir (məlumatlar göstərilmir), bu, maksimal stimullaşdırma üçün kifayət qədər füzyon zülallarının mövcud olduğunu göstərir.

Biz belə nəticəyə gəlirik ki, PAB-nin çoxsaylı bölgələri (RRMs 1-2 və RRMs 3-4) tərcüməni səmərəli şəkildə stimullaşdırır. Maraqlıdır ki, RRM 1 və 2 və RRM 3 və 4-ün fəaliyyətləri lazımsız görünür: 1-4 RRM-lərin fəaliyyəti 1 və 2 və ya 3 və 4-cü RRM-lərin aktivliyindən çox deyil. C-terminalı daha aşağı, lakin əhəmiyyətli, stimullaşdırıcı fəaliyyət.

Xenopus PAB ilə qarşılıqlı təsir göstərən amillər

digər növlərdə (Saccharomyces cerevisiae, insan və buğda), PAB qarşılıqlı təsir göstərir in vitro eIF-4E ilə qapaq bağlayan kompleksin bir hissəsini təşkil edən eIF-4G ilə (Tarun və Sachs, 1996 Le və b., 1997 Imataka və b., 1998). İnsanlarda eIF-4G ilə əhəmiyyətli homologiyaya malik olan Paip-1, PAB ilə də qarşılıqlı əlaqədə olur (Craig və b., 1998). Daha necə başa düşmək üçün Ksenop PAB oositlərdə translyasiyanı stimullaşdırır, bölgələrin olub olmadığını təyin edirik Ksenop Tərcümə aktivləşdirməsini yaradan PAB eIF-4G və ya Paip-1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olur. istifadə edərək iki hibrid testlər etdik Ksenop PAB törəmələri və insanlardan alınan eIF-4G (eIF-4GNt) və ya tam uzunluqlu Paip-1 N-terminalı Ksenop zülallar hələ klonlaşdırılmayıb. PAB hissələri LexA füzyonları, eIF-4G və Paip-1 kimi təqdim edildi. GAL4 aktivləşdirmə domeninin birləşmələri. PAB 1-2 (tərkibində RRM 1 və 2) həm eIF-4G, həm də Paip-1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olub, lakin başqa bir RNT bağlayıcı zülal ilə deyil (IRP1 Şəkil 4A). PAB-nin Paip-1 ilə qarşılıqlı əlaqəsi eIF-4G ilə müqayisədə daha güclü idi, bu, Paip-1-in yüksək səviyyələri ilə bağlı deyil (məlumatlar göstərilmir). Bağlanmış funksiya analizində tərcüməni zəif stimullaşdıran PAB-ın C-terminusu (PAB-Ct), yalnız Paip-1 ilə qarşılıqlı əlaqədə idi (Şəkil 4A). Tərcüməni effektiv şəkildə stimullaşdıran PAB 3-4 heç bir faktorla qarşılıqlı əlaqədə olmadı (Şəkil 4A).

Bütün LexA füzyon zülalları, anti-LexA monoklonal antikordan istifadə edərək western blotlama ilə müəyyən edildiyi kimi mayada oxşar səviyyələrdə ifadə edilmişdir (Şəkil 4B). Beləliklə, spesifik amillər arasında qarşılıqlı əlaqənin olmaması mayada zülalların olmaması ilə əlaqədar deyil. Üstəlik, PAB 3-4 iki hibrid sistemdəki digər zülallarla qarşılıqlı əlaqə qura bilir və onun nüvə və aktiv olduğunu göstərir (məlumatlar göstərilmir). Biz belə nəticəyə gəlirik ki, eIF-4G, Paip-1 və digər hələ naməlum amilləri əhatə edən çoxsaylı qarşılıqlı təsirlər translyasiya stimullaşdırılmasına vasitəçilik edə bilər. Ksenop PAB.

Paip-1 ilə deyil, eIF-4G ilə qarşılıqlı əlaqə in vivo translyasiya stimullaşdırılması ilə əlaqələndirilir

PAB-nin 1 və 2 RRM-ləri oositlərdə tərcüməni stimullaşdırır və həm eIF-4G, həm də Paip-1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olur. Hər iki amil oositlərdə mövcuddur: eIF-4G əvvəllər aşkar edilmişdir (Keyper və Rhoads, 1999) və anti-Paip-1 antikoru oosit ekstraktlarında proqnozlaşdırılan molekulyar çəkidə bir zülal aşkarlayır (Şəkil 5A). Beləliklə, eIF-4G və ya Paip-1 ilə qarşılıqlı əlaqə oositlərdə RRM 1 və 2-nin stimullaşdırıcı təsirinin əsasını təşkil edə bilər.

Hansı qarşılıqlı əlaqənin vacib olduğunu ayırd etmək in vivo, biz zülallardan yalnız biri ilə qarşılıqlı təsir göstərən mutant PAB formasını müəyyən etməyə çalışdıq. RRM 1 və 2-nin C-terminal delesiyasını qurduq, burada RRM2-nin son 38 amin turşusu çıxarıldı (PAB 1-2Nt) maya PAB-nın bu bölgəsi eIF-4G-yə bağlanmaq üçün tələb olunur (Otero). və b., 1999). PAB 1-2Nt ilə iki hibrid analizi onun eIF-4G-yə deyil, Paip-1-ə bağlandığını aşkar etdi (Şəkil 5B). Bütünlükdə RRM 1 və 2-dən ibarət variant gözlənildiyi kimi eIF-4G ilə qarşılıqlı əlaqədə oldu (Şəkil 5B).

Silinmiş PAB formasının tərcüməni stimullaşdırdığını müəyyən etmək üçün bu bölgəni ehtiva edən MS2 birləşməsi (MS2 1-2Nt Şəkil 5C) oositlərdə ifadə edildi. MS2 1-2Nt Luc-MS2 tərcüməsini stimullaşdırmadı (Şəkil 5D), baxmayaraq ki, protein səmərəli şəkildə ifadə edildi (Şəkil 5E). Beləliklə, eIF-4G-yə bağlanmaq üçün tələb olunan RRM 1 və 2 bölgəsinin silinməsi translyasiya stimullaşdırılmasını ləğv edir. Bu məlumatlar tərcümə stimullaşdırılması üçün eIF-4G ilə qarşılıqlı əlaqənin tələb olunduğunu və Paip-1 ilə qarşılıqlı əlaqənin qeyri-kafi olduğunu sübut edir.

Tərcümə aktivləşdirilməsi nə poli(A), nə də tam RNT-məcburi aktivliyi tələb etmir

Maya hüceyrəsiz sistemlərdə PAB-poli(A) quyruq kompleksinin PAB-nin eIF-4G ilə qarşılıqlı əlaqədə olmaq və tərcüməni stimullaşdırmaq qabiliyyəti üçün vacib olduğu təklif edilmişdir (Tarun və Sachs, 1996 Tarun və b., 1997). Əldə etdiyimiz məlumatlar göstərir ki, burada belə deyil Ksenop oositlər: Şəkil 1, 2, 3, 4, 5-dəki reportyor mRNA-larda poli(A) yoxdur, lakin bağlı PAB tərəfindən stimullaşdırılıb. Eynilə, poly(A)-nı bağlamaq qabiliyyətinin əhəmiyyətli dərəcədə azalmasına baxmayaraq, tərcümə RRM 3 və 4 (Şəkil 3) tərəfindən səmərəli şəkildə stimullaşdırıldı (Burd). və b., 1991 Kühn və Pieler, 1996 Deardorff və Sachs, 1997) və RRM 1 və 2 tərəfindən, baxmayaraq ki, Ksenop RRM4 və C-terminusu olmayan PAB oositlərdəki poli(A) ilə stabil qarşılıqlı təsir göstərmir (Vorminqton). və b., 1996 ).

Bağlanmış PAB ilə stimullaşdırmanın poli(A) bağlanmasını tələb edib-etmədiyini daha qəti şəkildə yoxlamaq üçün biz əvvəllər poli(A) bağlanmasını 100 dəfə azaltmaq üçün göstərilən MS2 1-2-də (Şəkil 6A) PAB-nın RNP1 ardıcıllığına nöqtə mutasiyalarını təqdim etdik. in vitro (Deardorff və Sachs, 1997 və oradakı istinadlar). PAB-nin bu mutant forması (MS2-Rd) ilə stimullaşdırma, MS2 1-2 ilə müqayisədə bir qədər azalsa da, tam uzunluqlu MS2-PAB ilə müqayisə edilə bilər (Şəkil 6B və C). Bu nəticə iddia edir ki, bağlı PAB poly(A) ilə əlaqə saxlamır. trans məruzəçidən başqa mRNA-larda və poli(A) bağlanması stimullaşdırma üçün lazımsızdır.

İki hibrid təhlili RRM 1 və 2-nin RNT bağlayıcı qüsurlu formasının bir qədər azaldılmış yaxınlıq ilə olsa da, hələ də həm eIF-4G, həm də Paip-1 ilə qarşılıqlı əlaqədə olduğunu ortaya qoydu (Şəkil 6D). Bu nəticə iki hibrid sistemdə PAB ilə bu amillərin qarşılıqlı təsirinin RNT körpüsü ilə deyil, zülal-zülal qarşılıqlı əlaqəsi vasitəsilə olduğunu iddia edir. Birlikdə götürdükdə, məlumatlarımız tərcümə stimullaşdırılmasının daxili xüsusiyyət olduğunu güclü şəkildə göstərir Ksenop PAB zülalı və oositlərdə PAB-vasitəçili stimullaşdırmada poli(A)-nın rolunun sadəcə olaraq PAB-ı cəlb etmək olduğunu.

Oositlərdə maya PAB tərəfindən tərcümə stimullaşdırılması

Tərcümə stimullaşdırılması ildən Ksenop Oositlərdəki PAB poli(A) üçün maya PAB ilə eyni tələbi nümayiş etdirmədi in vitro, biz birbaşa bağlı maya və təsirlərini müqayisə etdik Ksenop Poli(A) olmayan müxbir mRNT-dən istifadə edərək oositlərdə PAB. Təəccüblüdür ki, bağlanmış maya PAB (MS2-yPAB) adenilləşməmiş mRNT-nin tərcüməsini bağlanmış mayadan daha səmərəli şəkildə stimullaşdırmışdır. Ksenop PAB (Şəkil 7). Bu, maya ilə arasındakı fərqləri göstərir Ksenop PAB özbaşına arasında poli(A) asılılığında olan fərqləri nəzərə almayın Ksenop oositlər və maya in vitro çıxarışlar. Maya zülalının daha yüksək aktivliyi tənzimləməni əks etdirə bilər Ksenop Oositlərdə PAB-nın fəaliyyəti (Müzakirəyə baxın).

Mayada PAB tərəfindən tərcümə stimullaşdırılması

Mayada PAB-nın rolunu araşdırmaq üçün bütöv maya hüceyrələrində PAB-nın fəaliyyətini ölçmək üçün fenotipik analiz hazırlanmışdır. Dövriyyə ilə bağlı fəsadları aradan qaldırmaq üçün nisbətən stabil adenilləşdirilmiş reportyor mRNT-dən istifadə etdik ( Coller və b., 1998). MS2 saytları maya mis metallotionein zülalını kodlayan müxbirin 3′-UTR-ə daxil edildi (1 kubok) açıq oxu çərçivəsi (Şəkil 8A). Mayanın misin varlığında yaşamaq qabiliyyəti Cup1p protein səviyyələri ilə mütənasibdir (Stutz və Rosbash, 1994). The CUP1/MS2 MS2 yerlərini daşıyan gen funksional idi, çünki o, xromosomun pozulmasını tamamlayırdı. 1 kubok gen (məlumatlar göstərilmir).

MS2–yPAB ifadəsi yüksək mis səviyyələrində sağ qalma müddətini əhəmiyyətli dərəcədə artırdı, 2,4 mM-ə qədər konsentrasiyalarda böyüməyə imkan verdi (Şəkil 8B, yuxarı panel). Bu təsirlər spesifik idi, çünki nə tək MS2, nə tək yPAB, nə də MS2-Cinsi öldürücü (MS2-Sxl) birləşmə (Crowder) və b., 1999) yüksək mis konsentrasiyalarında hüceyrə artımını artırdı (Şəkil 8B, yuxarı panel). Sabit vəziyyətdə olan mRNT səviyyəsi CUP1/MS2 reportyor heç bir qaynaşma zülalından əhəmiyyətli dərəcədə təsirlənmədi (Şəkil 8B, aşağı panel), bu, MS2-yPAB tərəfindən misə qarşı artan müqavimətin mRNA səviyyələrinin dəyişməsi ilə deyil, tərcümə ilə əlaqəli olduğunu göstərir. mRNT nəqlinə təsirlər rəsmi olaraq aradan qaldırıla bilməz, lakin poliadenilləşdirilmiş reportyor mRNA-lar nüvə saxlanmasının qarşısını almaq üçün istifadə edilmişdir.

MS2–yPAB-in tərcümə effektlərini ölçmək üçün əvəz etdik 1 kubok ilə LacZ (Şəkil 8A). β-qalaktosidaza aktivliyi tək MS2-ni ifadə edən hüceyrələrə nisbətən MS2-yPAB tərəfindən 2,7 dəfə yüksəldi (Şəkil 8C). Stimullaşdırmanın miqyası mis müqavimətinin cüzi artım səviyyəsinə uyğundur (Stutz və Rosbash, 1994), lakin oositlərdə MS2-yPAB ilə müşahidə ediləndən xeyli azdır (Şəkil 7). Bu, maya hüceyrələrində reportyor mRNA-larda poli(A)-nın olması ilə əlaqədar ola bilər ki, quyruqlar endogen PAB-nı bağlaya və MS2-yPAB-nin təsirlərini minimuma endirə bilər. Bu fikri dəstəkləmək üçün, oositlərdə poliadenilləşdirilmiş reportyor mRNA-lar MS2-yPAB tərəfindən yalnız 2,4 dəfə stimullaşdırıldı (məlumatlar göstərilmir).

Mayada poli(A) bağlanmasının rolunu araşdırmaq üçün biz MS2-yPAB (MS2-yRd) mutant formasını qurduq ki, bu da hər bir RRM-də poli(A) bağlanmasını 300 dəfə azaldan nöqtə mutasiyalarını ehtiva edir (Deardorff). və Sachs, 1997). Əsas odur ki, MS2-yRd stimullaşdırıldı CUP1/MS2 ifadəsi, eləcə də MS2–yPAB (Şəkil 8D, yuxarı panel), sabit vəziyyətli mRNA səviyyələrinə təsir göstərmədən (Şəkil 8D, aşağı panel).

Mayada translyasiya stimullaşdırılması üçün tələb olunan MS2-yPAB spesifik bölgələrini müəyyən etmək üçün biz MS2 örtük zülalına birləşdirilən bir sıra PAB silmələrini təhlil etdik (Şəkil 9A). Maya PAB-nin (MS2 y1–4CΔ90) son 90 amin turşusunun çıxarılması PAB-nın başqa cür qeyri-sabit reportyor mRNA-ları (məlumatlar göstərilmir) sabitləşdirmək qabiliyyətinə mane oldu, lakin onun tərcüməni təşviq etmə qabiliyyətinə mane oldu (Şəkil 9B). Daha böyük silmə aşkar etdi ki, RRM 1-3 yüksək mis konsentrasiyalarında artımı dəstəkləmək üçün kifayətdir (MS2 y1-3 Şəkil 9B). Maraqlıdır ki, əksinə Ksenop PAB, RRM 3 və 4 və maya PAB-nin C-terminusu tərcüməni təşviq etmir (Şəkil 9B). Bu birləşmə zülalı aktivdir, çünki mRNA-ları sabitləşdirə bilər ( Coller və b., 1998). Bu nəticələr göstərir ki, 1-3 RRM-lər mayada translyasiya stimullaşdırılması üçün kifayətdir və RRM2-nin maya üçün kritik olduğu müşahidəsinə uyğundur. in vitro Pab1p-nin eIF-4G ilə əlaqəsi (Kessler və Sachs, 1998).


İstinadlar

Nilsen TW, Graveley BR: Alternativ birləşmə ilə eukaryotik proteomun genişlənməsi. Təbiət. 2010, 463 (7280): 457-463. 10.1038/nature08909

Barbosa-Morais NL, Irimia M, Pan Q, Xiong HY, Gueroussov S, Lee LJ, Slobodeniuc V, Kutter C, Watt S, Colak R: Onurğalı növlərdə alternativ birləşmənin təkamül mənzərəsi. Elm. 2012, 338 (6114): 1587-1593. 10.1126/elm.1230612

Merkin J, Russell C, Chen P, Burge CB: Məməli toxumalarında gen və izoform tənzimlənməsinin təkamül dinamikası. Elm. 2012, 338 (6114): 1593-1599. 10.1126/elm.1228186

Witten JT, Ule J: RNT splicing xəritələri vasitəsilə splicing tənzimlənməsini anlamaq. Trendlər Genet. 2011, 27 (3): 89-97. 10.1016/j.tig.2010.12.001

Miller JW, Urbinati CR, Teng-Umnuay P, Stenberg MG, Byrne BJ, Thornton CA, Swanson MS: İnsan əzələ kor zülallarının miotonik distrofiya ilə əlaqəli (CUG) (n) genişlənməsinə cəlb edilməsi. EMBO J. 2000, 19 (17): 4439-4448. 10.1093/emboj/19.17.4439

Kalsotra A, Xiao XS, Ward AJ, Castle JC, Johnson JM, Burge CB, Cooper TA: CELF və MBNL zülallarının postnatal keçidi inkişaf etməkdə olan ürəkdə alternativ birləşməni yenidən proqramlaşdırır. Amerika Birləşmiş Ştatları Milli Elmlər Akademiyasının Materialları. 2008, 105 (51): 20333-20338. 10.1073/pnas.0809045105

Terenzi F, Ladd AN: Əzələ kor kimi (MBNL) transkriptlərinin qorunmuş inkişaf alternativ birləşməsi MBNL lokalizasiyasını və fəaliyyətini tənzimləyir. RNT Biol. 2009, 7 (1): 43-55.

Botta A, Caldarola S, Vallo L, Bonifazi E, Fruci D, Gullotta F, Massa R, Novelli G, Loreni F: [CCTG]n təkrar genişlənməsinin II tip miyotonik distrofiyada (DM2) ZNF9 ifadəsinə təsiri. Biochim Biophys Acta. 2006, 1762 (3): 329-334. 10.1016/j.bbadis.2005.11.004

Osborne RJ, Lin X, Welle S, Sobczak K, O'Rourke JR, Swanson MS, Thornton CA: Miotonik distrofiyada zəhərli RNT-nin transkripsiya və post-transkripsiya təsiri. İnsan molekulyar genetikası. 2009, 18 (8): 1471-1481. 10.1093/hmg/ddp058

Du H, Cline MS, Osborne RJ, Tuttle DL, Clark TA, Donohue JP, Hall MP, Shiue L, Swanson MS, Thornton CA: Miyotonik distrofiyanın siçan modellərində anormal alternativ birləşdirmə və hüceyrədənkənar matris gen ifadəsi. Nat Struct Mol Biol. 2010, 17 (2): 187-193. 10.1038/nsmb.1720

Kino Y, Washizu C, Oma Y, Onishi H, Nezu Y, Sasagawa N, Nukina N, Ishiura S: MBNL və CELF zülalları skelet əzələsi xlorid kanalı CLCN1-in alternativ birləşməsini tənzimləyir. Nuklein turşuları Res. 2009, 37 (19): 6477-6490. 10.1093/nar/gkp681

He F, Dang W, Abe C, Tsuda K, Inoue M, Watanabe S, Kobayashi N, Kigawa T, Matsuda T, Yabuki T: İnsan əzələ kor kimi zülalda RNT bağlama domeninin həll strukturu 2. Protein Sci. 2009, 18 (1): 80-91.

Teplova M, Patel DJ: Alternativ birləşdirmə tənzimləyicisi əzələ kor kimi MBNL1 tərəfindən RNT tanınmasına dair struktur anlayışlar. Nat Struct Mol Biol. 2008, 15 (12): 1343-1351. 10.1038/nsmb.1519

Goers ES, Purcell J, Voelker RB, Gates DP, Berglund JA: MBNL1 alternativ birləşməni tənzimləmək üçün pirimidinlərə daxil edilmiş GC motivlərini birləşdirir. Nuklein turşuları Res. 2010, 38 (7): 2467-2484. 10.1093/nar/gkp1209

Cass D, Hotchko R, Barber P, Jones K, Gates DP, Berglund JA: MBNL1-in dörd Zn barmağı onun RNT bağlayıcı elementlərinin tanınması üçün çevik platforma təmin edir. BMC Mol Biol. 2011, 12: 20- 10.1186/1471-2199-12-20

Tran H, Gourrier N, Lemercier-Neuillet C, Dhaenens CM, Vautrin A, Fernandez-Gomez FJ, Arandel L, Carpentier C, Obriot H, Eddarkaoui S: Nüvə lokalizasiyası, splicing fəaliyyəti və əzələlərin dimerizasiyasında iştirak edən ekzonik bölgələrin təhlili -kimi-1 İzoformalar. Bioloji Kimya Jurnalı. 2011, 286 (18): 16435-16446. 10.1074/jbc.M110.194928

Grammatikakis I, Goo YH, Echeverria GV, Cooper TA: Splicing aktivasiyası və repressiya üçün tələb olunan MBNL1 və MBNL3 domenlərinin identifikasiyası. Nuklein turşuları Res. 2011, 39 (7): 2769-2780. 10.1093/nar/gkq1155

Purcell J, Oddo JC, Wang ET, Berglund JA: MBNL1 Sink Barmaqlarının Kombinatorial Mutagenezi, Splicing Tənzimləyici Hadisələrin Fərqli Siniflərini Aydınlaşdırır. Mol Cell Biol. 2012, 32 (20): 4155-4167. 10.1128/MCB.00274-12

Graveley BR, Maniatis T: SR zülallarının arginin/serinlə zəngin domenləri mRNT-dən əvvəl birləşmənin aktivatoru kimi fəaliyyət göstərə bilər. Mol hüceyrəsi. 1998, 1 (5): 765-771. 10.1016/S1097-2765(00)80076-3

Del Gatto-Konczak F, Olive M, Gesnel MC, Breathnach R: in vivo bir ekzona cəlb edilən hnRNP A1, ekson əlavə edən səsboğucu kimi fəaliyyət göstərə bilər. Mol Cell Biol. 1999, 19 (1): 251-260.

Robinson F, Smith CW: Polipirimidin traktını bağlayan zülalda birləşmə repressor sahəsi. J Biol Chem. 2006, 281 (2): 800-806.

Gooding C, Edge C, Lorenz M, Coelho MB, Winters M, Kaminski CF, Cherny D, Eperon IC, Smith CW: MBNL1 və PTB Tpm1 ekson 3-ün birləşməsini sıxışdırmaq üçün əməkdaşlıq edirlər. Nuklein turşuları Res. 2013, 41 (9): 4765-4782. 10.1093/nar/gkt168

Sun S, Zhang Z, Fregoso O, Krainer AR: Alternativ birləşmə faktorları ilə aktivləşdirmə və repressiya mexanizmləri RBFOX1/2. Rna. 2011, 18 (2): 274-283.

Shankarling G, Lynch KW: hnRNP L və hnRNP LL paraloqlarının minimal funksional sahələri eksonik birləşmə repressiyasında mexaniki fərqlər nümayiş etdirir. Biochem J. 2013, 453 (2): 271-279. 10.1042/BJ20130432

Hudson BP, Martinez-Yamout MA, Dyson HJ, Wright PE: TIS11d sink barmaq sahəsi ilə mRNA AU ilə zəngin elementin tanınması. Nat Struct Mol Biol. 2004, 11 (3): 257-264. 10.1038/nsmb738

Fu Y, Ramisetty SR, Hussain N, Baranger AM: MBNL1-RNT tanınması: MBNL1 ardıcıllığının və RNT uyğunlaşmasının töhfələri. Kimbiokimya. 2012, 13 (1): 112-119. 10.1002/cbic.201100487

Gooding C, Clark F, Wollerton MC, Grellscheid SN, Groom H, Smith CW: AG dinukleotid istisna zonalarının təhlili ilə aşkar edilmiş proqnozlaşdırılan uzaq filial nöqtələri olan insan eksonları sinfi. Genom Biol. 2006, 7 (1): R1- 10.1186/gb-2006-7-1-r1

Yuan Y, Compton SA, Sobczak K, Stenberg MG, Thornton CA, Griffith JD, Swanson MS: Muscleblind 1, splicing hədəfində və patogen RNT-lərdə RNT hairpins ilə qarşılıqlı əlaqədə olur. Nuklein turşuları Res. 2007, 35 (16): 5474-5486. 10.1093/nar/gkm601

Wollerton MC, Gooding C, Robinson F, Brown EC, Jackson RJ, Smith CW: Polipirimidin traktının bağlayıcı zülalının (PTB) izoformlarının diferensial alternativ əlavə aktivliyi. Rna. 2001, 7 (6): 819-832. 10.1017/S1355838201010214

Joshi A, Coelho MB, Kotik-Kogan O, Simpson PJ, Matthews SJ, Smith CW, Curry S: Alternativ birləşmənin tənzimlənməsində iştirak edən polipirimidin traktını bağlayan protein-Raver1 qarşılıqlı təsirlərinin kristalloqrafik təhlili. Struktur. 2011, 19 (12): 1816-1825. 10.1016/j.str.2011.09.020

Gromak N, Smith CW: Hamar əzələlərin spesifik alternativ birləşməsini tənzimləyən splays səsboğucu bir çox hüceyrə tipində aktivdir. Nuklein turşuları Res. 2002, 30 (16): 3548-3557. 10.1093/nar/gkf480

Sharma S, Maris C, Allain FH, Black DL: U1 snRNA splicing repressiyası zamanı polipirimidin traktını bağlayan zülal ilə birbaşa qarşılıqlı əlaqədə olur. Mol hüceyrəsi. 2011, 41 (5): 579-588. 10.1016/j.molcel.2011.02.012

Wang ET, Cody NA, Jog S, Biancolella M, Wang TT, Treacy DJ, Luo S, Schroth GP, Housman DE, Reddy S: Transkriptome miqyasında mRNA-nın birləşməsi və əzələ kor zülallar tərəfindən mRNA lokalizasiyasının tənzimlənməsi. Hüceyrə. 2012, 150 (4): 710-724. 10.1016/j.cell.2012.06.041

Charizanis K, Lee KY, Batra R, Goodwin M, Zhang C, Yuan Y, Shiue L, Cline M, Scotti MM, Xia G: İnkişaf etməkdə olan beyində əzələ koruna bənzər 2 vasitəli alternativ birləşmə və miyotonik distrofiyada nizamsızlıq. Neyron. 2012, 75 (3): 437-450. 10.1016/j.neuron.2012.05.029

Warf MB, Berglund JA: MBNL miotonik distrofiyanın və onun pre-mRNA substratı ürək troponin T. Rna-nın CUG təkrarlarında oxşar RNT strukturlarını bağlayır. 2007, 13 (12): 2238-2251. 10.1261/rna.610607

Warf MB, Diegel JV, von Hippel PH, Berglund JA: Protein faktorları MBNL1 və U2AF65, splicingi tənzimləmək üçün alternativ RNT strukturlarını bağlayır. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009, 106 (23): 9203-9208. 10.1073/pnas.0900342106

Nasim FU, Hutchison S, Cordeau M, Chabot B: Yüksək yaxınlıqlı hnRNP A1 bağlama yerləri və dupleks əmələ gətirən ters çevrilmiş təkrarlar, ümumi dönmə və repressiya mexanizmini dəstəkləmək üçün 5' birləşmə yeri seçiminə oxşar təsir göstərir. Rna. 2002, 8 (8): 1078-1089. 10.1017/S1355838202024056

Fisette JF, Toutant J, Dugre-Brisson S, Desgroseillers L, Chabot B: hnRNP A1 və hnRNP H 5' əlavə yeri seçimini modulyasiya etmək üçün əməkdaşlıq edə bilər. Rna. 2010, 16 (1): 228-238. 10.1261/rna.1890310

Cherny D, Gooding C, Eperon GE, Coelho MB, Bagshaw CR, Smith CW, Eperon IC: Tək molekullu analizlərlə aşkar edilmiş tənzimləyici birləşmə kompleksinin stoixiometriyası. EMBO J. 2010, 29 (13): 2161-2172. 10.1038/emboj.2010.103

Llorian M, Schwartz S, Clark TA, Hollander D, Tan LY, Spellman R, Gordon A, Schweitzer AC, de la Grange P, Ast G: PTB tərəfindən tənzimlənən alternativ birləşdirmə hadisələrinin qlobal profilləşdirilməsi ilə aşkar edilən mövqedən asılı alternativ birləşdirmə fəaliyyəti. Nat Struct Mol Biol. 2010, 17 (9): 1114-1123.

Gromak N, Rideau A, Southby J, Scadden AD, Gooding C, Huttelmaier S, Singer RH, Smith CW: PTB qarşılıqlı zülal raver1 alfa-tropomiyozin alternativ birləşməsini tənzimləyir. EMBO J. 2003, 22 (23): 6356-6364. 10.1093/emboj/cdg609

Ho TH, Charlet BN, Poulos MG, Singh G, Swanson MS, Cooper TA: Muscleblind proteinlər alternativ birləşməni tənzimləyir. EMBO J. 2004, 23 (15): 3103-3112. 10.1038/sj.emboj.7600300


Əlavə material

AGO, arqonaut zülalı ALP, lizosomal otofagiya yolu ALS, amiotrofik lateral skleroz AMPK, AMP ilə aktivləşdirilmiş protein kinaz ARE-RBP, AU ilə zəngin elementləri tanıyan RNT bağlayan zülallar ARE, AU ilə zəngin element ATM, ataksiya-telangiektaziya, mutasiyaya uğramış CARM1 -əlaqəli arginin metiltransferaza 1 CBP, cAMP-cavab elementi bağlayan zülal (CREB) bağlayan zülal CD62E, E-selektin Chk2, nəzarət nöqtəsi kinaz 2 Clk1, Cdc kimi kinaz 1 COX-2, siklooksigenaza 2 CSE, cysta-x3B3 CTSS, katepsin S CUREs, CU ilə zəngin elementlər DDR, DNT zədələnmə reaksiyası DGCR8, DiGeorge sindromu kritik bölgəsi 8 DICE, diferensiasiya nəzarət elementi ECRG2, özofagus xərçəngi ilə əlaqəli gen 2 eNOS, endotelial azot oksidi sintaza ERK, hüceyrədənkənar siqnal-regulse enterovirus 71 FASTK, Fas ilə aktivləşdirilmiş serin/treonin kinaz FBXW2, F-box/WD təkrar tərkibli protein 2 FTLD, fronto-temporal lobar degenerasiya FUS, sarkoma ilə birləşmiş FXR2P, kövrək X ilə əlaqəli protein 2 GM-CSF, qranulosit yaş koloniyasını stimullaşdıran amil GSK3 β, glikogen sintaza kinaz 3 β G3BP1, Ras-GAP SH3 domenini bağlayan zülal 1 HDM2/MDM2, insan/siçan ikiqat dəqiqə 2 hnRNP A1/A2/K, heterojen A1/A2/K nüvəsi və K HNS, HuR nukleositoplazmik şatllama ardıcıllığı Hsp27, istilik şoku zülalı 27 HuR, insan antigeni R IDR, mahiyyətcə pozulmuş bölgə IKK α, I κ B kinaz α IRES, daxili ribosom giriş yeri JAK3, K3 kina , K homologiyası KI, K interaktiv bölgəsi KLF2, Krüppel kimi faktor 2 KNS, K nüvə keçid domeni KSRP, KH tipli birləşən tənzimləyici protein LCR, aşağı mürəkkəblik bölgəsi LLPS, mayenin maye fazasının ayrılması MAPK, mitogenlə aktivləşdirilmiş zülal kinaz MAPKAPK-2/3, MAPK ilə aktivləşdirilmiş zülal kinaz 2 və 3 mFas, membrana bağlı Fas miRISC, miRNA ilə induksiya edilən susdurucu kompleks miRNA, mikro-RNT MK2/3, MAPK ilə aktivləşdirilmiş protein kinaz 2 və 3 MLO, membransız orqanoid MMP2/7, matris metalloproteinaz 2 və 7 mRNP, messenger ribonukleoprotein par Ticle NCL, nukleolin NEDD8, inkişaf baxımından aşağı tənzimlənmiş 8 NLS, nüvə lokalizasiya siqnalı ifadə edilən sinir prekursoru O-GlcNAc, O-qlikozil-N-asetilasiya PABP, poli(A)-bağlayıcı zülal PAD4, peptidil arginin deiminaz 4 PAR, poli(ADP-riboza) PARP-1, PAR polimeraza 1 Pc2, polikomb 2 protein Pin1, NIMA ilə qarşılıqlı əlaqədə olan zülal (heç vaxt A mitozunda)- 1 PKA, protein kinaz A PKC α/δ/ζ, protein kinaz C α δ və ζ PLD, priona bənzər domen pre-miRNA, prekursor miRNA pri-miRNA, ilkin miRNA PRMT1, zülal arginin N-metiltransferaza 1 PTH, paratiroid hormonu PTM, translasiyadan sonrakı modifikasiya r15-LOX, eritroid-15-lipoksigenaza RBD, RNT bağlayan domen RBP, RNT bağlayan protein RGG/RG, arginin/glisinlə zəngin RRM RNT tanınma motivi sFas, həll olunan Fas SGs, stress qranulları SIRT1, Sirtuin 1 SMN, motor neyronunun sağ qalması snRNP U1, kiçik nüvə ribonukleoprotein hissəcik U1 SR, serin/argininlə zəngin SRPK1/2, SR1 zülalı və SRP1 kinase2 SR birləşdirmə faktoru 1 və 3 StUbL, SUMO- hədəflənmiş ubiquitin ligase SUMO, kiçik ubiquitinə bənzər modifikator TDP-43, 43 kDa TIA-1 TAR DNT-ni bağlayan protein, T-hüceyrə daxili hüceyrə antigeni 1 TIAR, TIA-1 ilə əlaqəli TIAR, TIA-1 ilə əlaqəli protein TRAF6, TNF reseptoru ilə əlaqəli faktor 6 TRN, transportin TTP, tristetraprolin Ub, ubiquitin UBXD8, ubiquitin tənzimləyici X domenini ehtiva edən protein 8 UCP2, uncoup protein 2 UPS, ubiquitin-proteasome sistemi UTR, tərcümə edilməmiş bölgə XIAP, apoptoz zülalının X xromosomu ilə əlaqəli inhibitoru β-TrCP 1, β-transducin təkrar tərkibli protein 1.


† Hazırkı ünvan: Rijk Zwaan, De Lier 2678 ZG, Hollandiya.

Elektron əlavə materialı https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5113668 saytında onlayn əldə etmək olar.

Kral Cəmiyyəti tərəfindən nəşr edilmişdir. Bütün hüquqlar qorunur.

İstinadlar

Glisovic T, Bachorik JL, Yong J, Dreyfuss G

. 2008 RNT bağlayan zülallar və transkripsiyadan sonrakı gen tənzimlənməsi. FEBS Lett. 582, 1977-1986. (doi:10.1016/j.febslet.2008.03.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2011 Plastid genlərinin ifadəsi: prokaryotik iskeledə orqanellə xüsusi işlənmələr. Bitki fiziol. 155, 1520-1532. (doi:10.1104/pp.110.171231) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Hammani K, Bonnard G, Bouchoucha A, Gobert A, Pinker F, Salinas T, Giegé P

. 2014 Spiral təkrar modul zülallar orqanoid gen ifadəsi üçün əsas oyunçulardır. Biokimya 100, 141-150. (doi:10.1016/j.biochi.2013.08.031) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 Mayadan insana RNT bağlayan proteomlar qorunan sirr RBP-ləri saxlayır. Nat. Kommun. 6, 10127. (doi:10.1038/ncomms10127) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2012 Məməli mRNT-ni bağlayan zülalların atlasından RNT biologiyasına dair anlayışlar. Hüceyrə 149, 1393-1406. (doi:10.1016/j.cell.2012.04.031) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Marondedze C, Thomas L, Serrano NL, Lilley KS, Gehring C

. 2016 RNT bağlayıcı zülal repertuarı Arabidopsis thaliana . Sci. Rep. 6, 29766. (doi:10.1038/srep29766) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Bach-Pages M, Homma F, Kourelis J, Kaschani F, Mohammed S, Kaiser M, Van Der Hoorn RAL, Castello A, Preston GM

. 2020 Təkmilləşdirilmiş RNT interaktom tutma üsulu ilə bitki yarpaqlarının RNT bağlayan proteomunun kəşfi. Biomolekullar 10, 661. (doi:10.3390/biom10040661) Crossref, ISI, Google Scholar

Marondedze C, Thomas L, Gehring C, Lilley KS

. 2019 Dəyişikliklər Ərəbidopsis RNT bağlayan proteom yeni stress reaksiya mexanizmlərini ortaya qoyur. BMC Bitki Biol. 19, 139. (doi:10.1186/s12870-019-1750-x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2016 Plantada mRNT bağlayan proteomun təyini Ərəbidopsis etiollaşdırılmış şitillər. Bitki hüceyrəsi. 28, 2435-2452. (doi:10.1105/tpc.16.00562) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Zhang Z, Boonen K, Ferrari P, Schoofs L et al.

. 2016 yarpaq mezofil protoplastlarından tutulan UV çarpaz bağlı mRNA-bağlayıcı zülallar. Bitki üsulları 12, 42. (doi:10.1186/s13007-016-0142-6) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2019 Çiçəkli bitkilərdə ətraf mühitin temperaturunun Brachypodium distachyon inkişafına və mRNT bağlayan zülallara təsiri . Leuven, Belçika: KU Leuven. Google Alim

Marondedze C, Thomas L, Gehring C, Lilley KS

. 2020 Quraqlıq stressi spliceosom və stress qranul komponentlərində xüsusi dəyişikliklərə səbəb olur. Ön. Mol. Biosci. 6, 163. (doi:10.3389/fmolb.2019.00163) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2014 RNT bağlayıcı zülalın bitki toxunulmazlığına salisilik turşudan asılı və müstəqil təsiri. Bitki Hüceyrə Ətrafı. 37, 696-706. (doi:10.1111/pce.12188) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Heintzen C, Nater M, Apel K, Staiger D

. 1997 AtGRP7, nüvə RNT-ni bağlayan zülal, sirkadianla tənzimlənən mənfi rəy dövrəsinin tərkib hissəsi kimi Arabidopsis thaliana . Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 94, 8515-8520. (doi:10.1073/pnas.94.16.8515) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2009 Soyuq şok domen proteini 3 donma tolerantlığını tənzimləyir Arabidopsis thaliana . J. Biol. Kimya. 284, 23 454-23 460. (doi:10.1074/jbc.M109.025791) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2004 Yeni Arabidopsis geni, FLK, K homologiya motivləri ilə RNT bağlayıcı zülal kodlayır və FLOWERING LOCUS C vasitəsilə çiçəkləmə vaxtını tənzimləyir. Bitki hüceyrəsi. 16, 731-740. (doi:10.1105/tpc.019331) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2002 Genom analizi: çiçəkli bitkidən RNT tanıma motivi (RRM) və K homologiyası (KH) domeni RNT bağlayıcı zülallar Arabidopsis thaliana . Nuklein turşuları Res. 30, 623-635. (doi:10.1093/nar/30.3.623) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Schmal C, Reimann P, Staiger D

. 2013 Sirkadian saatla tənzimlənən keçid açarı AtGRP7 və AtGRP8 salınımlarını izah edir Arabidopsis thaliana . PLoS Comput. Biol. 9, e1002986. (doi:10.1371/journal.pcbi.1002986) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Cruz TM, Carvalho RF, Richardson DN, Duque P

. 2014 Abscisic turşusu (ABA) tənzimlənməsi Ərəbidopsis SR protein geninin ifadəsi. Int. J. Mol. Sci. 15, 17 541-17 564. (doi:10.3390/ijms151017541) Crossref, ISI, Google Scholar

Thatcher LF, Kamphuis LG, Hane JK, Onate-Sanchez L, Singh KB

. 2015 The Ərəbidopsis KH-domen RNT-ni bağlayan protein ESR1 jasmonat siqnalının komponentlərində fəaliyyət göstərir, böyümə məhdudiyyətini və stresə qarşı müqaviməti aradan qaldırır. PLoS BİR 10, e0126978. (doi:10.1371/journal.pone.0126978) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2013 RNT bağlayıcı zülal FPA flg22 ilə tetiklenen müdafiə reaksiyalarını və alternativ poliadenilasiya ilə transkripsiya faktorunun fəaliyyətini tənzimləyir. Sci. Rep. 3, 2866. (doi:10.1038/srep02866) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2010-cu ildə ehtimal edilən RNT-ni bağlayan zülal salisilik turşunun vasitəçiliyi ilə toxunulmazlığı müsbət tənzimləyir. Ərəbidopsis . Mol. Bitki Mikrobunun qarşılıqlı əlaqəsi. 23, 1573-1583. (doi:10.1094/MPMI-05-10-0106) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Daszkowska-Golec A, Wojnar W, Rosikiewicz M, Szarejko I, Maluszynski M, Szweykowska-Kulinska Z, Jarmolowski A

. 2013 Ərəbidopsis abh1-in supressor mutantı artıq məlum olan oyunçuların yeni üzünü göstərir: ABH1 (CBP80) və ABI4 - toxumların cücərməsi zamanı ABA və abiotik stresslərə cavab olaraq. Bitki Mol. Biol. 81, 189-209. (doi:10.1007/s11103-012-9991-1) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2014 APUM5, bir Pumilio RNT bağlayıcı zülalını kodlayır, abiotik stressə cavab verən gen ifadəsini mənfi tənzimləyir. BMC Bitki Biol. 14, 75. (doi: 10.1186/1471-2229-14-75) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kim JS, Jung HJ, Lee HJ, Kim KA, Goh C-H, Woo Y, Oh SH, Han YS, Kang H

. 2008 Glisinlə zəngin RNT bağlayıcı zülal 7 stomatanın açılması və bağlanmasını tənzimləyərək abiotik stress reaksiyalarına təsir göstərir. Arabidopsis thaliana . Bitki J. 55, 455-466. (doi:10.1111/j.1365-313X.2008.03518.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Park HY, Kang IS, Han JS, Lee CH, An G, Moon Y-H

. 2009 OsDEG10 kiçik RNT bağlayıcı zülalı kodlayan abiotik stress siqnalında iştirak edir. Biokimya. Biofizika. Res. Kommun. 380, 597-602. (doi:10.1016/j.bbrc.2009.01.131) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Park SJ, Kwak KJ, Oh TR, Kim YO, Kang H

. 2009 Soyuq şok domen zülalları toxumların cücərməsinə və böyüməsinə təsir göstərir Arabidopsis thaliana abiotik stress şəraitində. Bitki Hüceyrə Fiziol. 50, 869-878. (doi:10.1093/pcp/pcp037) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Schomburg FM, Patton DA, Meinke DW, Amasino RM

. 2001 FPA, çiçək induksiyasında iştirak edən bir gen Ərəbidopsis, tərkibində RNT-nin tanınması motivləri olan zülalı kodlayır. Bitki hüceyrəsi. 13, 1427-1436. (doi:10.1105/tpc.13.6.1427) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2001-ci ildə RNT bağlayan zülallar və sirkadiyalı ritmlər Arabidopsis thaliana . Fil. Trans. R. Soc. London. B 356, 1755-1759. (doi:10.1098/rstb.2001.0964) Link, ISI, Google Scholar

Riehs-Kearnan N, Gloggnitzer J, Dekrout B, Jonak C, Riha K

. 2012 Anormal böyümə və ölümcüllük Ərəbidopsis cəfəngiyat vasitəçiliyi ilə RNT-nin çürüməsi faktorlarının çatışmazlığı otoimmün kimi reaksiyadan qaynaqlanır. Nuklein turşuları Res. 40, 5615-5624. (doi:10.1093/nar/gks195) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Schmidt F, Marnef A, Cheung MK, Wilson I, Hancock J, Staiger D, Ladomery M

. 2010 Oliqo (dT) ilə əlaqəli mRNP-nin oksidləşdirici stress səbəb olduğu proteomik təhlili Arabidopsis thaliana RNT bağlayıcı zülallar ATGRP7 və ATGRP8. Mol. Biol. Rep. 37, 839-845. (doi:10.1007/s11033-009-9636-x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2015 RNT-zülal qarşılıqlı təsirinin və RNT-nin ikincil struktur mənzərələrinin qlobal təhlili Ərəbidopsis nüvə. Mol. Hüceyrə. 57, 376-388. (doi:10.1016/j.molcel.2014.12.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Krauss P, Markstadter C, Riederer M

. 1997 Odunlu növlərdən olan bitki kütikülləri tərəfindən UV radiasiyasının zəifləməsi. Bitki Hüceyrə Ətrafı. 20, 1079-1085. (doi:10.1111/j.1365-3040.1997.tb00684.x) Crossref, ISI, Google Scholar

Silverman IM, Li F, Gregory BD

. 2013 RNT-nin ikincil strukturunun və RNT-ni bağlayan zülalların genomik dövrü təhlilləri onların bitkilərdə transkripsiyadan sonrakı tənzimləmə üçün əhəmiyyətini ortaya qoyur. Bitki Elmi . 205–206, 55-62. (doi:10.1016/j.plantsci.2013.01.009) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2012 Mitoxondrial poli(A) polimeraza və poliadenilləşmə. Biokim. Biofizika. Akta 1819, 992-997. (doi:10.1016/j.bbagrm.2011.10.012) Crossref, PubMed, Google Scholar

Köster T, Marondedze C, Meyer K, Staiger D

. 2017 RNT bağlayan zülallara yenidən baxıldı: ortaya çıxan Ərəbidopsis mRNT interaktomu. Trends Plant Sci. 22, 512-526. (doi:10.1016/j.tplants.2017.03.009) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kedersha N, Stoecklin G, Ayodele M, Yacono P et al.

. 2005 Stress qranulları və emal orqanları mRNP-nin yenidən qurulmasının dinamik şəkildə əlaqəli saytlarıdır. J. Cell Biol. 169, 871-884. (doi:10.1083/jcb.200502088) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2006 RNT qranulları. J. Cell Biol. 172, 803-808. (doi:10.1083/jcb.200512082) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2006 Stress qranulları: Stress altında əmələ gələn RNP tərkibli sitoplazmik cisimlər. Təşkilat strukturu və mexanizmi. Mol Biol. 40, 937-944. (doi:10.1134/s0026893306060021) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2008 Bitki stress qranulları və mRNT emal orqanları istilik stresi qranullarından fərqlidir. Bitki J. Cell Mol. Biol. 56, 517-530. (doi:10.1111/j.1365-313X.2008.03623.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Téllez SR, Kanhonou R, Alepuz P, Ros R

. 2020 RNT bağlayıcı zülallar məhsullarda duz stresinə dözümlülüyünü yaxşılaşdırmaq üçün hədəf kimi. Aqronomluq 10, 250. (doi:10.3390/agronomy10020250) Crossref, Google Scholar

Sanchez de Groot N, Armaos A, Grana-Montes R, Alriquet M, Calloni G, Vabulas RM, Tartaglia GG

. 2019 RNT strukturu zülallarla qarşılıqlı əlaqə yaradır. Nat. Kommun. 10, 3246. (doi:10.1038/s41467-019-10923-5) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2009 Ribosomal zülalların ekstraribosomal funksiyaları nə dərəcədə ümumidir? Mol. Hüceyrə. 34, 3-11. (doi:10.1016/j.molcel.2009.03.006) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2008 Bitkilərin sink barmaq şəbəkəsi. Hüceyrə. Mol. Həyat Elmi. 65, 1150-1160. (doi:10.1007/s00018-007-7473-4) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Nguyen CD, Mansfield RE, Leung W, Vaz PM, Loughlin FE, Grant RP, Mackay JP

. 2011 Tək zəncirli RNT-ni tanıya bilən RanBP2 tipli sink barmaqları ailəsinin xarakteristikası. J. Mol. Biol. 407, 273-283. (doi:10.1016/j.jmb.2010.12.041) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Frei dit Frey N, Muller P, Jammes F, Kizis D, Leung J, Perrot-Rechenmann C, Bianchi MW

. 2010 RNT bağlayıcı zülal Tudor-SN stresə dözümlülük üçün vacibdir və ifraz olunan zülalları kodlayan stressə cavab verən mRNA səviyyələrini sabitləşdirir. Ərəbidopsis . Bitki hüceyrəsi. 22, 1575-1591.(doi:10.1105/tpc.109.070680) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2005 Transgeniklərin xarakteristikası Ərəbidopsis yüksək duzluluq, susuzlaşdırma və ya soyuq stres altında GR-RBP4-ü həddindən artıq ifadə edən bitkilər. J. Exp. Bot. 56, 3007-3016. (doi:10.1093/jxb/eri298) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Maurel C, Boursiac Y, Luu DT, Santoni V, Shahzad Z, Verdoucq L

. 2015 Bitkilərdə aquaporinlər. Fiziol. Rev. 95, 1321-1358. (doi:10.1152/physrev.00008.2015) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Pena EJ, Ferriol I, Sambade A, Buschmann H, Niehl A, Elena SF, Rubio L, Heinlein M

. 2014 Eksperimental virus təkamülü RNT alverində bitki mikrotubula dinamikası və TORTIFOLIA1/SPIRAL2 rolunu ortaya qoyur. PLoS BİR 9, e105364. (doi:10.1371/journal.pone.0105364) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1998 Bitki toxumalarında dehidroaskorbat və dehidroaskorbat reduktazın olması. FEBS Lett. 425, 528-529. (doi:10.1016/s0014-5793(98)00281-6) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1979 H2O2-nin xloroplastlardan askorbatdan asılı sistemlər tərəfindən məhv edilməsi. Biokim. Biofizika. Akta 546, 426-435. (doi:10.1016/0005-2728(79)90078-1) Crossref, PubMed, Google Scholar

Hakimi H, Suqanuma K, Usui M, Masuda-Suqanuma H, Angeles JMM, Asada M, Kawai S, Inoue N, Kawazu S

. 2014 Plazmodium bilikləri tioredoksin peroksidaza 1 nuklein turşularına bağlanır və RNT şaperon aktivliyinə malikdir. Parazit. Res. 113, 3957-3962. (doi:10.1007/s00436-014-4060-0) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Carmona P, Rodriguez-Casado A, Molina M

. 1999 Raman və CD spektroskopiyası ilə tədqiq edilən qliseraldehid-3-fosfat dehidrogenazanın tRNT-yə konformasiya quruluşu və bağlanma rejimi. Biokim. Biofizika. Akta 1432, 222-233. (doi:10.1016/s0167-4838(99)00113-2) Crossref, PubMed, Google Scholar

. 2019 Ortoqonal üzvi faza ayrılmasından (OOPS) istifadə edərək hər hansı bir orqanizmdə RNT-zülal qarşılıqlı təsirlərinin hərtərəfli müəyyən edilməsi. Nat. Biotexnol. 37, 169-178. (doi:10.1038/s41587-018-0001-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1993 Transfer RNT-nin qliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz tərəfindən ardıcıllıqla spesifik bağlanması. Elm 259, 365-368. (doi:10.1126/science.8420004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2019 GAPDH qeyri-kanonik AU ilə zəngin RNT bağlayıcı zülal kimi. Semin. Cell Dev. Biol. 86, 162-173. (doi:10.1016/j.semcdb.2018.03.013) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2016 RNT tənzimlənməsinin şirin tərəfi: qliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz qeyri-kanonik RNT-ni bağlayan zülal kimi. Wiley Discip. Rev. RNT. 7, 53-70. (doi:10.1002/wrna.1315) Crossref, PubMed, Google Scholar

Michaud M, Ubrig E, Filleur S, Erhardt M, Ephritikhine G, Marechal-Drouard L, Duchene A-M

. 2014 VDAC3 mRNA izoformlarının diferensial hədəflənməsi mitoxondriya morfologiyasına təsir edir. Proc. Natl akad. Sci. ABŞ 111, 8991-8996. (doi:10.1073/pnas.1402588111) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Saint-Georges Y, Garcia M, Delaveau T, Jourdren L, Le Crom S, Lemoine S, Tanty V, Devaux F, Jacq C

. 2008 Maya mitokondrial biogenezi: mRNA lokalizasiyasında PUF RNT-ni bağlayan Puf3p proteininin rolu. PLoS BİR 3, e2293. (doi:10.1371/journal.pone.0002293) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2017 Bitki mitoxondrilərini hədəf alan mRNA-ların genom miqyaslı təhlili: 5' tərcümə olunmamış bölgələrdə yuxarı axın AUG-ləri mitoxondrial assosiasiyanı azaldır. Bitki J. Cell Mol. Biol. 92, 1132-1142. (doi:10.1111/tpj.13749) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Waltz F, Corre N, Hashem Y, Giege P

. 2020 Bitki mitoxondrial tərcümə aparatının xüsusiyyətləri. Mitoxondri 53, 30-37. (doi:10.1016/j.mito.2020.04.008) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2007 mRNA spesifik hüceyrəaltı lokalizasiyası məməli hüceyrələrində gen ifadəsinin dəqiq tənzimlənməsi üçün mühüm addımdır. Biokim. Biofizika. Akta 1773, 473-475. (doi:10.1016/j.bbamcr.2006.06.008) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Corral-Debrinski M, Blugeon C, Jacq C

. 2000 Mayada mRNT-nin mitoxondrilərin yaxınlığında lokalizasiyası üçün 3′ tərcümə olunmamış bölgə və ya ATM1-in ardıcıllığı tələb olunur. Mol. Hüceyrə. Biol. 20, 7881-7892. (doi:10.1128/mcb.20.21.7881-7892.2000) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Marc P, Margeot A, Devaux F, Blugeon C, Jacq C

. 2002 Maya mitoxondriyalarına yönəlmiş mRNA-ların genom miqyasında təhlili. EMBO Rep. 3, 159-164. (doi:10.1093/embo-reports/kvf025) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Michaud M, Marechal-Drouard L, Duchen AM

. 2010 Bitki hüceyrələrində RNT ticarəti: sitozolik mRNA-ların mitoxondrial səthə yönəldilməsi. Bitki Mol. Biol. 73, 697-704. (doi:10.1007/s11103-010-9650-3) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Lesnik C, Golani-Armon A, Arava Y

. 2015 Mitoxondrial xarici membranın yaxınlığında lokallaşdırılmış tərcümə: yeniləmə. RNT Biol. 12, 801-809. (doi:10.1080/15476286.2015.1058686) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Tian L, Chou HL, Fukuda M, Kumamaru T, Okita TW

. Bitki hüceyrələrində 2020 mRNT lokalizasiyası. Bitki fiziol. 182, 97-109. (doi:10.1104/pp.19.00972) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2011 DREME: transkripsiya faktoru ChIP-seq məlumatlarında motiv kəşfi. Bioinformatika 27, 1653-1659. (doi:10.1093/bioinformatics/btr261) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Zarrinpar A, Bhattacharyya RP, Lim WA

. 2003 Prolin tanınma sahələrinin strukturu və funksiyası. Sci. STKE. 2003, RE8. (doi:10.1126/stke.2003.179.re8) PubMed, Google Scholar

. 2015 RNT bağlayan zülallarda nizamsız ardıcıllığın ortaya çıxan rolları. Trendlər Biochem. Sci. 40, 662-672. (doi:10.1016/j.tibs.2015.08.012) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2012 RNT qranullarının hüceyrəsiz formalaşması: bağlı RNT-lər hüceyrə birləşmələrinin xüsusiyyətlərini və komponentlərini müəyyən edir. Hüceyrə 149, 768-779. (doi:10.1016/j.cell.2012.04.016) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2016 İnsan hüceyrələrində RNT bağlayan domenlərin hərtərəfli identifikasiyası. Mol. Hüceyrə. 63, 696-710. (doi:10.1016/j.molcel.2016.06.029) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2020 Parçalanma mayası poli(A)(+) RNT interaktomunun sistem miqyaslı təhlilləri RNT-zülal komplekslərinin təşkili və funksiyası haqqında anlayışları ortaya qoyur. Genom Res. 30, 1012-1026. (doi:10.1101/gr.257006.119) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Konig J, Zarnack K, Rot G, Curk T, Kayikci M, Zupan B, Turner DJ, Luscombe NM, Ule J

. 2010 iCLIP fərdi nukleotid rezolyusiyasında hnRNP hissəciklərinin birləşmə funksiyasını ortaya qoyur. Nat. Struktur. Mol. Biol. 17, 909-915. (doi:10.1038/nsmb.1838) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2008 HITS-CLIP, beynin alternativ RNT emalına dair genom miqyaslı anlayışlar verir. Təbiət 456, 464-469. (doi:10.1038/nature07488) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2010 Ribonükleoprotein komplekslərində qarşılıqlı təsir göstərən zülalların və transkriptlərin identifikasiyası üçün yeni mRNT yaxınlığının təmizlənməsi texnikası. RNT 16, 2277-2290. (doi:10.1261/rna.2091710) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2018 Canlı hüceyrələrdə RNT-protein qarşılıqlı təsirinin aşkarlanması. Nat. Metodlar. 15, 207-212. (doi:10.1038/nmeth.4601) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Fazal FM, Han S, Parker KR, Kaewsapsak P, Xu J, Boettiger AN, Chang HY, Ting AY

. APEX-Seq tərəfindən aşkar edilmiş hüceyrəaltı RNT lokalizasiyasının 2019 Atlası. Hüceyrə 178, 473-490. (doi:10.1016/j.cell.2019.05.027) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Coppin L, Leclerc J, Vincent A, Porchet N, Pigny P

. 2018 Xərçəng hüceyrələrində Messenger RNT həyat dövrü: ənənəvi və qeyri-ənənəvi RNT bağlayan zülalların ortaya çıxan rolu? Int. J. Mol. Sci. 19, 650. (doi:10.3390/ijms19030650) Crossref, ISI, Google Scholar