Məlumat

In vivo görüntüləmə üçün yanal, axional və temporal qətnamələr

In vivo görüntüləmə üçün yanal, axional və temporal qətnamələr


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aşağıdakı optik görüntüləmə üsulları ilə əldə edilməsi gözlənilən məkan (yanal və eksenel) və müvəqqəti qətnamələr hansılardır?

  • Optik Bioluminissensiya Görüntüləri (BLI)
  • Optik Flüoresan Görüntüləmə (FLI)
  • Multifotonlu mikroskopiya (məsələn, 2-fotonlu mikroskopiya)

Onlar daha yüksək qətnamə təmin etməkdə digərlərindən daha yaxşıdır?


Yanal və eksenel ayırdetmə obyektivinizin ədədi aperturasından asılıdır (lateral = lambda/2NA; eksenel = 2lambda/NA^2). Konfokal yanaşma və ya 2-fotonlu mikroskop (2PM) ilə FLI ilə eksenel ayırdetməni təkmilləşdirə bilərsiniz. 2PM-də emissiya əldə etmək üçün iki infraqırmızı fotonun udulması lazımdır. 2 infraqırmızı udma ehtimalı həyəcanın intensivliyindən kvadrat olaraq asılıdır. Buna görə də, işıqlandırma şüasının cəmləşdiyi yerlərdə flüoresans məhdudlaşdırılır ki, bu da daha yaxşı kəsiyi verir. 2PM-in üstünlüyü daha yüksək nüfuz dərinliyi və fototoksikliyi azaltmaqdır. Həqiqətən, görünən həyəcan tələb edən flüoroforu həyəcanlandırmaq üçün 2 infraqırmızı fotondan istifadə edə bilərsiniz.

Müvəqqəti həlletmə ölçmək istədiyiniz sahədən və inteqrasiya müddətindən asılıdır.

Qətnamə difraksiya ilə məhdudlaşır. Ən yaxşı halda qeyd etdiyiniz 3 təsvir texnikası ilə yanal ayırdetmədə ~200-300 nm və eksenel ayırdetmədə 500 - 800 nm əldə edə bilərsiniz. Super ayırdetmə üsullarından istifadə etməklə daha yüksək ayırdetmə əldə etmək olar. Onlar iki qrupa ayrılır. Birincisi, flüoroforun foto-fiziki xüsusiyyətlərini onu həyəcanlandırmaq və söndürmək üçün istifadə edir. Bu, subdifraksiya sahələrini həll etməyə imkan verir. Bu, STED (Stimulated emission depletion) mikroskopiyası və ya SSIM (doymuş strukturlaşdırılmış işıqlandırma mikroskopiyası) vəziyyətinə aiddir. İkinci qrup flüorofor emissiyasının dəyişməsindən onu daha yaxşı lokallaşdırmaq üçün istifadə edir. Buraya STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy, PALM (Photo-Activated Localization Microscopy)) və SOFI (super rezolyusiyaya malik optik dalğalanma təsviri) kimi üsullar daxildir.


In vivo görüntüləmə üçün yanal, axional və temporal qətnamələr - Biologiya

In vivo canlı anesteziya edilmiş siçanların siyatik sinirində aksonal nəqliyyatın görüntülənməsi.

Siqnal verən endosomlar flüoresan zondlar və konfokal mikroskopiyadan istifadə etməklə izlənilir.

Motor və sensor neyronlarda aksonal nəqliyyat fərqləndirilə bilər.

Bu üsul asanlıqla digər yüklərin aksonal daşınmasını öyrənmək üçün uyğunlaşdırıla bilər.

Bunun potensial istifadəsi in vivo narkotik skrininqində görüntüləmə yanaşması.


Giriş

Bu protokolda biz döş triangularis əzələsinin kəskin sinir əzələ eksplantında motor aksonlarını zamanla öyrənmək üçün görüntüləmə texnikasını təsvir edirik ("triangularis sterni eksplantı"). Triangularis sterni əzələsi döş sümüyünün daxili tərəfindən əmələ gəlir və daxili qabırğa qəfəsinə daxil olur. O, yuxarı qabırğaarası sinirlərin budaqları ilə innervasiya olunur, bunlar əzələ vasitəsilə səthi uzanır və adətən döş sümüyünün sərhədinə paralel olaraq kraniokaudal ox boyunca lokallaşdırılan son lövhə bandı əmələ gətirir (şək. 1) 1. Beləliklə, triangularis sterni eksplantında distal motor aksonları, onların əzələdaxili arborizasiyaları, sinir-əzələ sinapsları və innervasiya olunmuş əzələ lifləri var. Triangularis sterni eksplantının bir variantı ilk dəfə McArdle tərəfindən təsvir edilmişdir və b. 1 və əvvəllər sinir-əzələ fiziologiyası və patofiziologiyasını öyrənmək üçün istifadə edilmişdir 2 – 5 . Laboratoriyamız tərəfindən nəşr olunan metodlar əsasında burada sadələşdirilmiş hazırlığı təsvir edirik 6 , 7 . Bu əzələ görüntüləmə təcrübələri üçün bir sıra üstünlüklər təmin edir. Birincisi, bu, yalnız bir neçə (υ) əzələ lifi təbəqəsindən ibarət olan xüsusilə nazik əzələdir. Nəticədə, innervasiya edən motor aksonları və onların budaqları səthi şəkildə hərəkət edir və sinir-əzələ son plitələrindəki presinaptik terminallara qədər bütün kurs boyunca izlənilə bilər. İkincisi, triangularis sterni əsasən heç bir hiss innervasiyasına malik deyil, buna görə də əzələyə budaqlanan bütün nevritlər motor aksonlarıdır 8 . Üçüncüsü, əzələ yarandığı və qabırğa qəfəsinin sümüklü komponentlərinə daxil olduğu üçün əzələyə zərər vermədən asanlıqla parçalana bilər. Bu, əzələnin çox gənc yaşlarda təcrid olunmasına imkan verir (embrionun 13-cü günündə, sinir-əzələ birləşmələrinin ilk meydana gəldiyi zaman). Dördüncüsü, triangularis sterni eksplantı əzələyə daxil olan qabırğaarası motor aksonlarının bütün arborizasiyalarını və bütün son lövhələrini ehtiva edir. Bu, motor aksonlarının bir alt çoxluğunda 9 flüoresan zülalları ifadə edən və ya fərdi neyronlarda 10 spektral olaraq müxtəlif flüoresan zülalların kombinator ifadəsini göstərən transgen siçan xətlərindən istifadə etməklə motor vahidlərinin yenidən qurulmasına imkan verir. Nəhayət, əzələ çoxseqmentlidir və nəticədə o, müxtəlif qabırğaarası sinirlərdən alınan aksonlarla innervasiya olunur və onlar yalnız son lövhəyə çatdıqdan sonra anastomozlanır. Bu anatomik nümunə bəzi girişlərin stimullaşdırıldığı və ya kəsildiyi və qalan aksonların kompensasiya reaksiyasının təhlil edildiyi selektiv stimullaşdırma və ya qismən denervasiya təcrübələrinə imkan verir.

Triangularis sterni əzələsinin innervasiya nümunəsi. (a𠄼) Triangularis sterni əzələsi və onun innervasiyası a sənin 1–YFP16 YFP etiketli aksonlu siçan 18 . (a) Aksonların (yaşıl), sinapsların (qırmızı) və əzələlərin (boz şkala) birləşdirilmiş etiketlənməsi. (b) Aksonal etiketləmə. (c) Əzələ ləkəsi. Bənövşəyi xətt bc döş sümüyünün daxili səthi ilə proksimal qabırğa qəfəsi arasında triangularis sterni əzələsini təsvir edir. (d) Ərazinin konfokal yenidən qurulması a, triangularis sterni əzələsinin multiseqmental innervasiyasını göstərir. (e) Son lövhə zolağının bir hissəsinin yüksək güclü konfokal rekonstruksiyası (qutulu sahə). d). (f) İki fərdi sinir-əzələ birləşməsini göstərən konfokal şəkil e. Mitoxondrilərin yığılması presinaptik terminallarda tapıla bilər. YFP (aksonal sitoplazma), yaşıl BTX (asetilxolin reseptorları), qırmızı phalloidin (əzələ), boz rəng. Tərəzi çubuqları, 500 μm in d və 10  milyard sm f.

Aydındır ki, bu eksplant sisteminin müəyyən məhdudiyyətləri də var ki, bunlar da nəzərə alınmalıdır (ətraflı məlumat üçün NASIL GEDİLMƏ cədvəlinə baxın). Aşkar məhdudiyyətlərdən biri odur ki, eksplantın hazırlanması zamanı döş triangularis əzələsini innervasiya edən qabırğaarası sinirlər onların neyron hüceyrə gövdələrindən ayrılır. Nəticədə, aksotomize edilmiş aksonlar hazırlandıqdan 12 saat sonra Vallerian degenerasiyaya uğramağa başlayır. Bu, eksplantın ömrünü və beləliklə, aksonal dəyişikliklərin təsvir oluna biləcəyi müddəti məhdudlaşdırır. Tədqiqatlarımız göstərir ki, aksonal morfologiya və hətta daşınan mitoxondriyaların sürəti (yəni, etibar nişanını keçən mitoxondriyaların sayı) kimi hüceyrədaxili proseslər, digərləri ilə müqayisədə dəyişməz qalır. in vivo hazırlıqdan sonra ən azı ilk 2 saat ərzində vəziyyət 6, 7. Vallerian degenerasiyasının gecikdirildiyi mutant siçanlardan (WLD S siçanları) əldə edilən əzələlərdən istifadə edilən əlavə tədqiqatlar, WLD S mutasiyasından təsirlənməyən bəzi eksperimental paradiqmalarda preparatın ömrünün uzadıla biləcəyi yolu göstərir 11 . Aydındır ki, sinir fəaliyyətinin olmaması ilə bağlı dəyişikliklər (məsələn, asetilkolin reseptorlarının daxililəşdirilməsi Şəkil 2f-ə baxın) baş verə bilər, lakin xarici stimullaşdırmanın tətbiqi asandır. Üçbucaqlı sistem kəskin aksonal fiziologiya və ya patologiya haqqında dəyərli məlumat verə bilsə də, onu əvəz edə bilməz. in vivo kimi bir neçə gün ərzində təkrar monitorinq tələb edən xroniki aksonal dəyişikliklərin öyrənilməsi üçün yanaşmalar in vivo sternomastoid əzələnin təsviri 12 – 14 . üçün in vivo görüntüləmə, triangularis sterni əzələsinin döş qəfəsinin daxili tərəfindəki anatomik yeri qadağandır, birbaşa in vivoex vivo bu əzələdən istifadə edərək müqayisə.

Bu protokolda təsvir olunduğu kimi hazırlanmış canlı triangularis sterni eksplantlarından yüksək keyfiyyətli şəkillər. (a) Postnatal gündə sinapsın aradan qaldırılması zamanı iki aksonal giriş (oxlar) ilə sinir-əzələ birləşməsinin inkişafı (P) 9. Flüoresanla işarələnmiş BTX (qırmızı) postsinaptik akteilxolin reseptorlarını vurğulayır, aksonlar transgenik olaraq YFP (yaşıl) ilə etiketlənir. sənin 1-YFP-16 siçanı) və əzələ əyri işıqlandırma ilə aşkar edilir (boz miqyas). #, myonucleus *, solda daha dərin sinapsı innervasiya etmək üçün fokus müstəvisindən çıxan motor akson. (b) qabırğaarası sinirdə səthi aksonlar. Miyelin örtükləri əyri işıqlandırma (boz şkala) ilə vizuallaşdırılır, aksonal mitoxondriya isə transgenik olaraq CFP (mavi) ilə işarələnir. sənin 1-mitoCFP-S siçanı 7 . Oklar, Schmidt–Lantermann incisures *, Ranvier node. (c) Sinir-əzələ birləşməsinin inkişafı (c1 birləşdirin c3, BTX, qırmızı) üç akson (oxlar) ilə innervasiya olunur (c2, CFP, yaşıl) Schwann hüceyrələri ilə örtülmüş (c4, GFP, mavi) P10-da sənin 1-CFP5 × s100-GFP Kosmos ikiqat transgen siçan 21 . *, Schwann hüceyrə nüvəsi. Qutulu sahə c3 daha yüksək böyütmə ilə göstərilir f. (d𠄿) Eksplantlarda hüceyrə və hüceyrəaltı aksonal dinamikaların vaxtaşırı seriyası. (d) Təxminən 20 dəqiqə ərzində təsvir olunan inkişaf etməkdə olan (P11) sinir-əzələ birləşməsindən uzanan (mavi ox başları) və geri çəkilən (narıncı ulduzlar) transgen etiketli aksonal filopodiya (YFP, yaşıl). (e) Akson daxilində daşınan transgen etiketli mitoxondri (CFP, mavi) (çərçivə sürəti, 1º20132 Hz). (f) 𢏁 saat müddətində əzələ lifi tərəfindən endositozlanan postsinaptik asetilkolin reseptorları (BTX, qırmızı) (qeyd edək ki, bu sürətli dövriyyə çox güman ki, bu stimullaşdırılmamış eksplantda neyrotransmissiyanın olmaması nəticəsində baş verir). Ölçək çubuqları, 10 μm in ab 5  milyard sm in c 2,5  milyard sm in d 0,5  milyard sm in e.

Triangularis sterni eksplantının əsas tətbiqi periferik motor aksonlarının, onların sinapslarının və onları əhatə edən qlial hüceyrələrin qısamüddətli, yüksək keyfiyyətli təsviridir. Motor aksonları görüntüləmə tədqiqatları üçün idealdır, çünki onların böyük diametri aksondaxili prosesləri vizuallaşdırmağa imkan verir. Bundan əlavə, motor aksonları və əzələ lifləri arasında sinir-əzələ birləşmələri məməlilərin sinir sistemindəki ən böyük və ən asan əldə edilən sinapslardan biridir 15 . Nəhayət, sinir-əzələ sisteminin komponentlərini vurğulayan əla flüoresan zondlar və transgen heyvanlar mövcuddur 16, bunlar asanlıqla bu eksplant sistemi ilə birlikdə istifadə edilə bilər (Eksperimental dizayna baxın). Əvvəllər sabit toxumada həll edilmiş motor akson fiziologiyası və patologiyasının bir çox aspektləri indi vaxta uyğun olaraq təhlil edilə bilər. Bir nümunə, etiketli neyronal mitoxondriya 7 olan yeni transgen siçanlardan istifadə edən aksonal nəqliyyatın son araşdırması ilə təmin edilir. Bu araşdırmada, kəskin eksplantlarda aksonal nəql sürətlərinin canlı siçanların siyatik sinirlərində ölçülənlərlə oxşar diapazonda olduğunu göstərdik. Bununla belə, əzələ və sinirlərin kəsilməsindən 2 saat sonra, aksonal daşınma sürəti azalmağa başladı, ola bilsin ki, ayrılmış hüceyrə cisimləri tərəfindən yeni mitoxondriya təmin olunmayıb.

Triangularis sterni eksplantının başqa bir tətbiqi sinir-əzələ inkişafının öyrənilməsidir. Sinir-əzələ qovşağı uzun müddət inkişaf edən sinir sistemində sinapsın aradan qaldırılmasını öyrənmək üçün bir model kimi istifadə edilmişdir 17 . Sinapsın aradan qaldırılmasının əsas aspektləri izlənilə bilər ex vivo erkən postnatal siçanlardan əldə edilən triangularis sterni eksplantlarında. Bir araşdırmada biz birləşməsindən istifadə etdik in vivo mikroskopiya, ex vivo sinapsın aradan qaldırılması zamanı aksonların necə itirildiyini anlamaq üçün görüntüləmə və serial elektron mikroskopiyası 6. Hızlandırılmış görüntüləmə, aksonların materialının bir hissəsini kiçik aksosomlar kimi tökərək sinapslardan geri çəkildiyini ortaya qoydu. Aksosom tökülməsinin dinamik xüsusiyyətləri yalnız ona görə aydın oldu ki, biz eksplantda yüksək temporal və məkan həlli ilə geri çəkilən aksonları təsvir edə bildik.

Nəhayət, triangularis sterni eksplantından istifadə edilən görüntüləmə tədqiqatları mühüm nevroloji xəstəliklərin patogenezini tədqiq etməyə kömək edə bilər. Motor aksonları, amiotrofik yanal skleroz və ya irsi polineyropatiyalar kimi degenerativ şərtləri, həmçinin travmatik lezyonları və periferik sinirin iltihabi xəstəliklərini (məsələn, Guillian-Barr sindromu) əhatə edən bir sıra insan xəstəliklərində təsirlənir. Bir çox hallarda hüceyrə mədəniyyətindəki təcrid olunmuş motor neyronları qeyri-qənaətbəxş bir model təmin edir, çünki motor aksonlarının ətrafdakı glial hüceyrələrlə qarşılıqlı əlaqəsi və immun hüceyrələrini işğal etməsi xəstəlik prosesinin həlledici aspektləridir. Bununla belə, bu cür qarşılıqlı təsirlər sinir və əzələnin yerli mühitini qoruyan kəskin sinir əzələ eksplantlarında izlənilə bilər. Motor aksonlarına əlavə olaraq, sinir-əzələ birləşmələri, eləcə də postsinaptik əzələ lifləri, siçanların mövcudluğundan asılı olaraq, üçbucaqlı sterni eksplantından istifadə etməklə tədqiq edilə bilən myasteniya gravis və ya müxtəlif iltihablı, metabolik və degenerativ miopatiyalar kimi xəstəliklərə hədəflənir. modellər.

Xülasə olaraq, üçbucaqlı sterni əzələsinin canlı eksplantında motor aksonlarının görüntülənməsinə imkan verən bir protokol təqdim edirik. Bu preparatın xüsusi üstünlükləri sayəsində aksonal morfologiya və fiziologiyanın bir sıra aspektləri yüksək zaman və məkan ayırdetmə qabiliyyəti ilə öyrənilə bilər. İlkin tədqiqatlar artıq bu yanaşmanın inkişaf, sağlamlıq və xəstəlikdə motor aksonlarının dinamik davranışına dair yeni anlayışları necə təmin edə biləcəyini göstərir 6, 7.

Eksperimental dizayn

Görüntüləmə sistemi

Triangularis sterni eksplantında motor aksonlarını və onların sinapslarını təsvir etmək üçün geniş sahəli epiflüoresan mikroskopiya sistemindən istifadə edirik. Triangularis sterni əzələsi düz və səthi əzələdir, aksonların əksəriyyəti səthə paralel olaraq uzanır və preparatı əhatə edən parietal plevranın birbaşa altında yerləşən bir çox sinapsdır (şək. 1). Bu anatomik xüsusiyyətlər iki fotonlu mikroskopiya kimi dərin toxumaların nüfuz etməsinə imkan verən daha bahalı üsullara müraciət etmədən geniş sahəli epiflüoresan mikroskopiyadan (şək. 3) istifadə etməyə imkan verir. Bununla belə, əgər eksperimental dizayn daha mürəkkəb təsvir tələb edirsə, ya konfokal, ya da iki fotonlu mikroskopiya sistemindən istifadə etmək olar.

Triangularis sterni eksplantının hazırlanması. (a) Sol iki şəkil siçanı öldürdükdən sonra parçalanan bütöv döş qəfəsini göstərir (soldan birinci şəkil, ön görünüş ikinci şəkil, 90° fırlanmadan sonra sağ tərəfdən yanal görünüş). Üçüncü şəkildə döş qəfəsinin daxili orqanları çıxarıldıqdan sonra döş qəfəsi divarının daxili görünüşü göstərilir (kiçik mavi oxlar, diafraqmanın qalığı *, xiphoid qığırdaq). İkinci şəkildə kəsikli xətt paravertebral kəsimi göstərir (simmetrik kəsik sol tərəfdə aparılır). Dördüncü şəkildə, döş qəfəsinin divarı qatlanmış şəkildə açıq və bir qaba bərkidilmiş şəkildə göstərilir. Dəqiq sancaqlar üçün uyğun mövqelər mavi dairələrlə göstərilir. Mavi ox döş sümüyünün ox uclarının sümüklü hissəsinə işarə edir, sağ daxili məmə damarlarını göstərir. (b) Üçbucaqlı sterni eksplantlarının təsviri üçün istifadə edilən epiflüoresan mikroskop qurğusu. (c) Mikroskop mərhələsinin görüntüləmə kamerası ilə yaxından görünüşü (qutuda b).

Transgen siçan xətləri

Motor aksonlarının və onların sinapslarının təsviri transgenik siçanların istifadəsinə əsaslanır, burada motor neyronlarının hamısı və ya bir hissəsi flüoresan zülallarla etiketlənir 18 . İndi bir çox belə siçan xətləri mövcuddur ki, onlar etiketləmə sıxlıqlarında (yəni etiketlənmiş aksonların faizi), ifadə olunan flüoresan zülalların spektral xüsusiyyətlərində və ya bu zülalların hədəfləndiyi yerlərdə (Şəkil 2) 7, 10, 19 ilə fərqlənir. Fərqli sinir hüceyrə tiplərində flüoresan zülalları ifadə edən transgen siçan xətlərinin icmalını son araşdırma məqaləmizdə tapa bilərsiniz 20 . Schwann hüceyrələri (Şəkil 2) 10, 21, əzələ hüceyrələri 22 və ya makrofaqlar 23 kimi digər periferik sinir sistemi (PNS) strukturlarının transgenik etiketlənməsi də bildirilmişdir və asanlıqla həyati boya etiketi ilə birləşdirilə bilər (məsələn, flüoresanla işarələnmiş kimi). α-bungarotoksin (BTX), Invitrogen Şəkil 2).

Şəkil təhlili

Təhlil edilən parametrlər təcrübədən asılıdır. Təcrübələrimizin çoxunda ilkin məlumat dəsti qeydə alınmış şəkillər seriyasından ibarət filmdir. Yaxşı filmlər əldə etmək üçün iki şərt vacibdir: fokusun sabitliyi (yoxluğu z- yerdəyişmə) və sürüşmənin olmaması (x–y yerdəyişmə). Birincini yalnız superfusion və udma xətlərinin diqqətli qurulması və təcrübə zamanı diqqətli fokuslanma ilə təmin etmək olarsa, ikincisini müəyyən dərəcədə istifadə edərək sonrakı emal yolu ilə korrektə etmək olar. x–y uyğunlaşdırma proqramı (məsələn, Autoquant, Molecular Devices və ya ‘stackreg’ plaqini ilə açıq mənbəli proqram ImageJ, http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/). Nəticədə x–y düzülmüş şəkil seriyası daha sonra kəsilə və yığılmış tiff formatı kimi saxlanıla bilər və ya alternativ olaraq .avi və ya .mov kimi standart film formatından istifadə etməklə vizuallaşdırıla bilər (Metamorph proqramı bu imkanları təklif edir, lakin getdikcə daha çox oxşar xüsusiyyətlər açıq mənbəli ImageJ ilə tapıla bilər, xüsusilə http://rsb.info.nih.gov/ij/ çoxlu plaginlərdən bəzilərini əlavə edərkən).


Nəticələr

Sağlam onurğa beyninin in Vivo MR görüntüsü

EKQ tetiklemesi və tənəffüs qapısı ilə Gradient-echo MR görüntüləmə, əhəmiyyətli hərəkət artefaktları olmadan in vivo olaraq bütöv torakal siçovulların onurğa beyninin yüksək qətnamə şəkillərini verdi (Şəkil 1). Tipik kəpənək formalı boz maddəni ətrafdakı daha az intensiv ağ maddə aksonal traktlarından aydın şəkildə ayırmaq olar. Onurğa beynini əhatə edən CSF daha uzun T2 və T2* relaksasiya müddətinə görə onurğa beyninə bitişik kiçik hiperintens halqa kimi görünürdü. Tətbiq olunan ardıcıllıqla vertebral cisimlər tamamilə qaranlıq, vertebral disklər isə parlaq görünür.

17.6T-də bütöv onurğa beyninin in vivo MR görüntüsü. Panellər AB torakal onurğa beyni vasitəsilə sagittal skanları göstərin (bölmə qalınlığı, 239 μm FOV, 40 × 30 mm müstəvidə ayırdetmə, 156 × 117 μm TR, ~200 millisaniyə, ürək dərəcəsi TE-dən asılı olaraq, 4,4 millisaniyə). Panellər CD torakal onurğa beyni vasitəsilə eksenel taramaları göstərin (bölmə qalınlığı, 500 μm FOV, 17.7 × 35.5 mm müstəvidə təsvir, 69 × 69 μm TR və TE, yuxarıdakı kimi). Ölçək çubuğu, 2 mm. A, Daha çox yanal sagittal skan, yanal ventral buynuzun boz maddəsini əks etdirən bəzi uzununa yönümlü daha çox hiperintens quruluşa malik ağ maddəni (aşağı siqnal intensivliyi) təsvir edir. CSF hiperintens görünür, vertebral orqanlar hipointensdir. B, Burada göstərilən onurğa beyni parenximasının əksəriyyəti onurğa beyni vasitəsilə paramedian sagittal skanda ağ maddə traktları (hipointense) ilə əhatə olunmuş boz maddəni (hiperintens) təmsil edir. C, Torakal onurğa beyni vasitəsilə eksenel tarama onurğa beyninin boz maddəsinin tipik kəpənək görünüşü ilə ətrafdakı hipointens ağ maddə arasında aydın fərq qoymağa imkan verir. Həmçinin qeyd etmək lazımdır ki, onurğa kökləri bu səviyyədə aydın şəkildə müəyyən edilə bilər. D, Sonrakı skan daha caudally onurğa beyni onurğa kökünün giriş zonasından uzaqda kəsiyində göstərir.

Contuziya Onurğa beyninin Ex Vivo MR Görüntüsü

Döş qəfəsinin kontuziya zədələnməsindən 4 həftə sonra kəsilmiş onurğa beyninin spin-echo təsvirləri eksenel hissələrdə zədə episentrindən uzaqda siqnal intensivliyi nümunəsini aşkar etdi (Şəkil 2), bu, zədələnməmiş heyvanlarda in vivo qradiyent-echo təsvirləri ilə demək olar ki, eyni idi (Şəkil 1)C, -D). Boz maddə ağ maddə ilə müqayisədə hiperintens idi. Mərkəzi kanal aydın şəkildə müəyyən edilə bilərdi. Boz/ağ maddə fərqi kontuziya mərkəzində tamamilə yox oldu (Şəkil 2G, -H). Onurğa beyni mərkəzində tələffüz edilən və kordonun səthinə doğru bütün istiqamətlərdə azalan homojen hiperintens siqnal intensivliyi yalnız kordonun mərkəzində, əsasən boz maddə ilə məhdudlaşan siqnal intensivliyinin itirilməsi sahələri ilə kəsildi. (Şəkil 2G). Travma nəticəsində yaranan qanaxma və ardıcıl hemosiderin çöküntüləri zədədən sonra onurğa beyninin boz maddəsində tez-tez baş verdiyi təsvir edilən bu siqnal intensivliyi olmayan sahə üçün ehtimal olunan patoloji korrelyasiyadır. 17 Lezyon mərkəzindəki hipotenziyalar (xüsusilə sagittal MR görüntülərində) - təsvir edilən hemosiderinlə əlaqəli dəyişikliklər kimi aydın deyil - sagittal histoloji bölmələrdə GFAP deyil, III tip kollagen üçün immunreaktivliyə uyğun gəlir (Şəkil 3).B, -J, -N), beləliklə, gliotik çapıqdan daha çox lifli komponentləri təmsil edir. Şnurun ümumi diametri azaldıldı. Xüsusilə dorsolateral sütunlar həcmcə simmetrik olaraq azalmışdır (Şəkil 2G, -H), zədədən 4 həftə sonra əhəmiyyətli dərəcədə geri dönməz atrofiyanı əks etdirir. Bəzi Nissl ilə boyanmış hissələrdə (Şəkil 3G) bütün növ mütəşəkkil toxumalar yox idi ki, bu da maye ilə doldurulmuş boşluğun inkişaf etdiyini göstərir, lakin müvafiq MR görüntüləmələri homojen hiperintensivlik göstərmədi (Şəkil 3).C), bu, kistik lezyon qüsurunun MR ekvivalenti olacaqdır. Bunun əvəzinə, yalnız kiçik bir hiperintens zolaq - əsl kistik lezyon qüsurunun korrelyasiyası - hipointens nüvəni əhatə etdi. Beləliklə, çox güman ki, bu hipointens bölgədə qeyri-mütəşəkkil material (iltihab hüceyrələri və hemosiderin çöküntüləri ilə qarışmış hüceyrə zibilləri) var idi, bu da histoloji analiz zamanı müntəzəm olaraq itirilir.

Siçovulların onurğa beyninin kontuziyasının eks vivo MR görüntüləmə skanları. Ex vivo MR görüntüləmənin eksenel bölmələri, orta torakal səviyyədə kontuziya zədələnməsindən 4 həftə sonra zədələnmiş siçovulların onurğa beynindəki morfoloji dəyişikliklərin mikroskopiya dərəcəli vizualizasiyasını göstərir (2D multisection spin-echo bölməsinin qalınlığı, 300 μm FOV, 6 × 6 mm müstəvidə ayırdetmə, 23 × 23 μm TE, 7,5 millisaniyə TR, 2 saniyə). Ölçək çubuğu, 1 mm. Panellər A–L rostral-kaudal istiqamətdə ardıcıl kəsikləri göstərin. Siçovullarda dorsal sütunlar yalnız dorsal sütunun dorsal yarısında yerləşən yüksələn proprioseptiv proqnozları ehtiva etmir. Çapraz kortikospinal trakt insanlardan fərqli olaraq dorsal sütunların ventral yarısında uzanır, burada əksər kortikospinal akson yan sütunlarda yerləşir. AF, Kontuziya yerinə rostral hissələrdə onurğa beyni morfologiyası hələ də ağ və boz maddənin aydın diferensiasiyası ilə saxlanılır. Dorsal sütunların dorsal hissəsində hipointensivliyə diqqət yetirin (ox uçları) yüksələn proprioseptiv proyeksiyalarla eynidir. GI, Lezyon mərkəzində onurğa beyninin diametri azalır və boz və ağ maddə artıq ayrıla bilməz. Mərkəzdə yerləşən hipotenziyalar (G) hemosiderin yataqlarını əks etdirir. JL, Lezyon üçün kaudal, boz-ağ maddə kontrastı qorunur. Həm rostral, həm də kaudal skanlarda (BDJL) hiperintens siqnallar dorsal sütunlarda kistik qüsurlarla uyğun gəlir (həmçinin Şəkil 3-ə baxın). Lezyona rostral oxlu skanlarda hipotenziyalar yüksələn sensor proyeksiyalara uyğundur, kaudal skanlarda isə kortikospinal traktın sahəsini təmsil edir (JL, ox başlıqları).

Əzilmiş siçovulların onurğa beyninin sagittal ex vivo MR görüntüləmə skanları və müvafiq histologiya. Midtorasik kontuziya zədəsi Şəkil 2 ilə eyni nümunənin zədələnməsindən 4 həftə sonra (2D multisection spin-echo bölməsinin qalınlığı, 208 μm FOV, 20 × 6 mm müstəvidə ayırdetmə, 23 × 78 μm TE, 7,5 millisaniyə TR, 2 saniyə). Ölçək çubuğu, 2 mm. A–D, Ex vivo MR görüntüləmə lateraldən mediala doğru skan edir. E–H, Müvafiq Nissl ilə boyanmış bölmələr. I–L, Müvafiq GFAP immunolənglənmiş bölmələr. M–P, Müvafiq kollagen tip III immunolənglənmiş bölmələr. Zədə mərkəzində homogen hiperintensivliklər (A) histoloji bölmələrdə kistik lezyon qüsurlarına uyğundur (E, İ, və M). Digər bölmələrdə. lezyon mərkəzində qarışıq hipo/hiperintensiyalar (BC, oxlar) ya kistik lezyon qüsurları, hemosiderin çöküntüləri və ya fibrotik çapıq əmələ gəlməsi ilə əlaqələndirilir (F, N, G, və O, oxlar). Dorsal kortikospinal traktın quyruğunun zədələnməyə gedən yolu ilə davam edən hipointensivlik - eksenel MR şəkillərində dorsal sütunlardakı hipointensivliyə uyğundur (Şəkil 2) - aşağıdakılarla vurğulanır. ox uçları (B).

Lezyon mərkəzindən uzaqda bəzi neyroanatomik cəhətdən məhdudlaşdırılmış siqnal intensivliyində dəyişikliklər müşahidə edilə bilər (Şəkil 2).A, -JL Şəkil 3B). Ya zədənin keçmiş əsas dorsal kortikospinal traktının quyruğunda və ya lezyonun rostral hissəsində yüksələn proprioseptiv yollarla (gracile fascicle) ciddi şəkildə məhdudlaşan hipotenziyalar müəyyən edilmişdir. Dorsal sütunlar içərisində rostral və kaudal hiperintens bölgələr (Şəkil 2BD, -JL Şəkil 3A, -B) müvafiq sagittal histoloji bölmələrdə müəyyən edilmiş kistik nekrotik zonalara aid edilə bilər (Şəkil 3).F). Kontuziya zədələnməsindən 2 həftə sonra alınan onurğa beyni nümunəsi ilə müqayisədə ümumi siqnal intensivliyində heç bir fərq yox idi (məlumatlar göstərilmir).

Contuziya Onurğa beyninin in Vivo MR görüntüsü

IH Impactor tərəfindən tətbiq edilən döş səviyyəsində onurğa beyni kontuziyaları olan beş heyvan və bir bütöv heyvan əməliyyatdan 2, 6 və 8 həftə sonra MR görüntüləmə ilə təhlil edildi. 5 yaralı heyvandan yalnız 2-si MR görüntüləmə prosedurundan sağ qaldı və beləliklə, histoloji qiymətləndirmə üçün hazır idi. Kontuziya edilmiş onurğa beynində ex vivo spin-echo şəkillərində müşahidə edilən siqnal intensivliyindəki dəyişikliklərin əksəriyyəti kontuziya edilmiş onurğa beyninin in vivo qradient-echo təsvirləri ilə demək olar ki, eyni idi. Xüsusilə lezyon mərkəzində kordonun diametri azaldı, dorsolateral tərəflər atrofik idi (Şəkil 4).AF və 5E, -F), müvafiq Nissl ilə boyanmış histoloji bölmələrdə eyni tapıntılarla təsdiq edilmişdir. Lezyonun episentrinə doğru boz/ağ maddə fərqi tamamilə yox oldu (Şəkil 5).DG). Sağlam onurğa beynindəki boz maddənin siqnal intensivliyi nümunəsi (Şəkil 1C, -D) kordonun mərkəzində dorsal və ventral tərəfdən hiperintens halqa ilə əhatə olunmuş hipointens sahələrlə əvəz olundu (Şəkil 5).DG). Ex vivo MR-də təsvir edildiyi kimi (Şəkil 2F, -G), lezyon mərkəzindəki hipointensivliklər, Nissl- və Prussiya-mavi-boyanmış kəsiklərdəki qaranlıq nahiyələrə uyğun gələn travma nəticəsində yaranan qanaxmanın qalıqları olan hemosiderin çöküntülərini təmsil edir (Şəkil 4).K, -N). Bundan əlavə, həm sagittal, həm də eksenel skanlarda zədənin rostral və kaudal dorsal sütunlarında məhdudlaşan hipointensivliklər aşkar edilmişdir (Şəkil 4).B, -E, və 5H), bu da ex vivo MR görüntüləmə tapıntıları ilə paraleldir. Bu hipointensivliklər onurğa beyninin müvafiq hissələrinin Prussiya Mavisi ilə boyanması ilə təsvir edildiyi kimi hemosiderin çöküntüləri ilə əlaqələndirilə bilər (Şəkil 4).K). Makrofaq/monosit infiltrasiya sahələri ilə heç bir əlaqə yox idi (Şəkil 4LO), zədə mərkəzinə bitişik yerləşməklə yanaşı, adətən davam edən Wallerian degenerasiya sahələrini vurğulayan lezyon yerindən uzaqda yerləşən ağ maddə traktlarında müəyyən edilir (N. Weidner, dərc edilməmiş müşahidə).

Sagittal in vivo MR görüntüləmə, kontuziyaya uğramış siçovulların onurğa beyninin və müvafiq histologiyanın skanları. Torakal kontuziya zədələnməsindən sonra 2 və 8 həftələrdə yetkin siçovullarda in vivo MR görüntüləmə ex vivo MR görüntüləmə məlumatlarına (2D çoxsection gradient-echo) paralel olan siqnal intensivliyində dəyişikliklər göstərir. A–C, bölmə qalınlığı, 311 μm FOV, 30 × 30 mm müstəvidaxili ayırdetmə, 117 × 117 μm TE, 4,4 millisaniyə TR, ~200 millisaniyə, ürək döyüntüsündən asılı olaraq D–F, bölmə qalınlığı, 300 μm FOV, 40 × 25 mm müstəvidaxili ayırdetmə, 156 × 98 μm TE, 3,7 millisaniyə TR, ürək dərəcəsindən asılı olaraq 200 millisaniyə). Ölçək çubuğu AF, 5 mm G–O, 1 mm. Ardıcıl sagittal MR görüntüləri 2 həftədə göstərilir (AC) və 8 həftə (DF) müvafiq histoloji Nissl ilə zədədən sonra (GI) və Prussiya-mavi (JL) – boyanmış kəsiklər və ED1 immunohistokimyası üçün işlənmiş bölmələr (makrofaqlar, monositlər) MO), hamısı eyni heyvandan. Oxlar in AB təsir yerini vurğulayın. Dorsal sütunlarda artan və enən akson proyeksiyaları boyunca hipotenziyalar (BE) hemosiderin yataqları ilə əlaqələndirilir (K) makrofaq/monosit infiltrasiyasından daha çox (O müvafiq sahələr ilə göstərilir ox uçları). Bu dəyişikliklər 2 həftədən sonra artır (C) 8 həftəyə qədər (G) zədədən sonrakı. Zamanla şnurun diametrinin aydın azalması (B vs EC vs F) histoloji bölmələrdə görülən atrofiyaya uyğundur (GO).

Kontuziyalı siçovulların onurğa beyninin eksenel in vivo MR görüntüləmə skanları. Yaralanmadan 6 həftə sonra yetkin siçovullarda in vivo MR eksenel skanları (2D multisection gradient-echo bölməsinin qalınlığı, 370 μm FOV, 20 × 20 mm müstəvidə ayırdetmə, 78 × 78 μm TE, 4,2 millisaniyə TR, ~200 millisaniya, ürəkdən asılı olaraq) dərəcəsi). Ölçək çubuğu, 2 mm. Kontuziyaya rostral skan edir (AC), lezyon mərkəzində (DG) və lezyon üçün kaudal (H). Ağ və boz maddə arasındakı aydın fərq sonrakı hissələrdə yox olur. Lezyon mərkəzində hipointensivliklər kordon səthinə doğru daha az ifadə olunan hiperintensivliklərlə əhatə olunur (EF). Lezyon yerində onurğa beyninin dorsal tərəfi daha homojen hiperintensiv görünür, çox güman ki, kistik dəyişiklikləri təmsil edir (DE, ox ucları). Dorsolateral onurğa beynində atrofiya əlamətləri mövcuddur (EF).

Nissl ilə boyanmış histoloji kəsiklərdə (Şəkil 4H), ölçüləri rostral olaraq azalan kiçik siqarşəkilli kistik nahiyələr müəyyən edilmişdir ki, bunlar travma sonrası sirinx əmələ gəlməsinin başlanğıcını təmsil edir. In vivo MR görüntüləmə müvafiq olaraq müəyyən edilə bilən siqnal intensivliyi yaratmadı (Şəkil 4B,-E). Çox güman ki, seçilmiş sagittal görüntüləmə təyyarələri mərkəzi kanalın yerini əhatə etməmişdir.


NƏTİCƏLƏR

Lateral afferent periferik arborların struktur müxtəlifliyi

Lateral afferent neyronlar tərəfindən müstəvi qütbləşmiş saç hüceyrələrinin seçilməsindən məsul olan mexanizmləri açmaq üçün biz yüksək məkan qətnaməsində optik olaraq təcrid olunmuş aksonal arborların ətraflı yenidən qurulmasını həyata keçirdik. Bu analiz sadədir, çünki zebra balığı sürfəsindəki hər bir yan xətt orqanı yalnız iki və ya üç afferent neyron tərəfindən innervasiya olunur (Şəkil 1A) (Faucherre et al., 2009). Əvvəlcə, biz tək lateralis afferentlərinin UV-vasitəçiliyi ilə fotokonversiyasından istifadə edərək aksonal arborların işlənməsini araşdırmaq istədik. Tg(HuC:Kaede) (HuC kimi də tanınır elavl3 – Zebrafish İnformasiya Şəbəkəsi) yanal xəttin afferent neyronlarını vurğuladığı bildirilən sabit transgenik balıqdır (Caron et al., 2008). Lakin, biz efferent marker arasında xaç nəticəsində sürfələri aşkar Tg(ada1:gfp)Tg(HuC:Kaede), yanal xəttin efferent neyronları da Kaede tərəfindən etiketlənmişdir (Şəkil 1B). Beləliklə, biz birmənalı olaraq yan xəttin neyronlarına afferent şəxsiyyət təyin edə bilmədik. Tg(HuC:Kaede).

Yanal afferent neyronların mərkəzi və periferik proyeksiyaları. (A) HGn39D transgen zebrafish xəttində GFP-müsbət periferik proqnozlar. Bir neyromasta proyeksiya edən üç afferent neyron təsvir edilmişdir. (B) a-da neyromastın innervasiyası HuC: Kaedeada 1: gfp Kaede fotokonversiyasından sonra ikiqat transgen sürfə. Yaşıl neyronlar GFP müsbət, qırmızı neyronlar Kaede müsbət və sarı neyronlar GFP/Kaede müsbətdir. Neyromastlar həm qırmızı, həm də sarı neyronlar tərəfindən innervasiya olunur. Ok başları neyromastları göstərir. Kəsik xətlər onurğa beynini məhdudlaşdırır. (C) HGn39D transgen balığının GFP-müsbət posterior qanqliyonunda tək TdTomato-müsbət afferent neyronun soması. TdTomato ifadə edən soma posterior yanal xətt ganglionunda lokallaşdırılmışdır. (D) Tək TdTomato etiketli afferent neyronun mərkəzi proyeksiyası. Anterior sola, posterior isə sağa doğrudur. (E,F) Tək TdTomato etiketli afferent neyronun iki fərqli zaman çərçivəsində (10 dəqiqəlik interval) periferik proyeksiyaları. Ox qabarıq ekstremitəni, ox ucları isə nazik və hərəkətli neyritləri göstərir. (G,H) Anti-Ribeye B immunoləkməsi. Afferent neyron (qırmızı) və saç hüceyrələri (yaşıl) arasında lent sinapslarının meydana gəlməsi Ribeye B zülalının (siyan) iştirakı ilə görünür. Ox ucları (G) tük hüceyrəsi ilə təmasda olmayan nazik neyriti və (H) Ribeye B zülalını ehtiva edən qabarıq neyritləri göstərir. (I) Vəhşi tip (wt) üçün hər zaman nöqtəsində mövcud olan neyritlərin orta sayı və tmie mutant balıq. Səhv çubuqları s.e.m. Vəhşi tip, n=6 tmie, n=6. Ölçək çubuqları: A,G,H-də 10 μm, B-D-də 20 μm, E,F-də 5 μm.

Yanal afferent neyronların mərkəzi və periferik proyeksiyaları. (A) HGn39D transgen zebrafish xəttində GFP-müsbət periferik proqnozlar. Bir neyromasta proyeksiya edən üç afferent neyron təsvir edilmişdir. (B) a-da neyromastın innervasiyası HuC: Kaedeada 1: gfp Kaede fotokonversiyasından sonra ikiqat transgen sürfə. Yaşıl neyronlar GFP müsbət, qırmızı neyronlar Kaede müsbət və sarı neyronlar GFP/Kaede müsbətdir. Neyromastlar həm qırmızı, həm də sarı neyronlar tərəfindən innervasiya olunur. Ok başları neyromastları göstərir. Kəsik xətlər onurğa beynini məhdudlaşdırır. (C) HGn39D transgen balığının GFP-müsbət posterior qanqliyonunda tək TdTomato-müsbət afferent neyronun soması. TdTomato ifadə edən soma posterior yanal xətt ganglionunda lokallaşdırılmışdır. (D) Tək TdTomato etiketli afferent neyronun mərkəzi proyeksiyası. Anterior sola, posterior isə sağadır. (E,F) Tək TdTomato etiketli afferent neyronun iki fərqli zaman çərçivəsində (10 dəqiqəlik interval) periferik proyeksiyaları. Ox qabarıq ekstremitəni, ox ucları isə nazik və hərəkətli neyritləri göstərir. (G,H) Anti-Ribeye B immunoləkməsi. Afferent neyron (qırmızı) və saç hüceyrələri (yaşıl) arasında lent sinapslarının meydana gəlməsi Ribeye B zülalının (siyan) iştirakı ilə görünür. Ox başları (G) tük hüceyrəsi ilə təmasda olmayan nazik neyriti və (H) Ribeye B zülalını ehtiva edən qabarıq neyritləri göstərir. (I) Vəhşi tip (wt) üçün hər zaman nöqtəsində mövcud olan neyritlərin orta sayı və tmie mutant balıq. Səhv çubuqları s.e.m. Vəhşi tip, n=6 tmie, n=6. Ölçək çubuqları: A,G,H-də 10 μm, B-D-də 20 μm, E,F-də 5 μm.

Bunun əvəzinə, əvvəllər bildirildiyi kimi HuC:mem-TdTomato kodlayan plazmid yeritməklə afferent neyron morfunu təyin etdik (Faucherre et al., 2009). Təhlil üçün yalnız bir qırmızı-flüoresan neyronları olan nümunələri seçdik, onların soması HGn39D transgen xətti ilə qeyd oluna bilən lateralis afferent ganglion daxilində lokallaşdırıldı (Şəkil 1C) (Faucherre et al., 2009). Enjeksiyonlar stabil şəraitdə aparılıb Tg(brn3c:gfp) (brn3c kimi də tanınır pou4f3 – Zebrafish Information Network) yumurtaları EGFP ilə bütün saç hüceyrələrini vizuallaşdırmaq üçün (Xiao et al., 2005). Aksonal arborsların yenidən qurulması üçün biz ucuz və geniş istifadə edilə bilən kommersiya alətlərindən istifadə edərək sadə bir üsul hazırladıq.

Optik olaraq təcrid olunmuş neyronların 3D rekonstruksiyası göstərdi ki, lateralis afferentləri arxa beyinə daxil olan və bifurkasiya edən stereotipik mərkəzi aksonları layihələndirərək, ön budaq və arxa budaq əmələ gətirir (Şəkil 1D) (Metcalfe et al., 1985). Bunun əksinə olaraq, periferik aksonal arbors struktur olaraq müxtəlif idi (Şəkil 1E, F), adətən müxtəlif növ neyritlər meydana gətirirdi. Ribeye B (Ctbp2l – Zebrafish İnformasiya Şəbəkəsi) antikoru ilə immunobelinqlə aşkar edilən qabarıqlıqlar sinaptik lentlərə bitişik olduğu üçün qabarıq neyritlər sinaptik əlaqə ola bilən tük hüceyrələri ilə sabit şəkildə əlaqələndirilmişdir (Şəkil 1G,H) (Sidi et al., 2004). İncə neuritlər daha uzun idi və həmişə saç hüceyrələri ilə əlaqə saxlamırdı (Şəkil 1E-G). Periferik akson quruluşunun müxtəlifliyi üçün bir izahat onların dinamik olmasıdır.

Onların davranışını araşdırmaq üçün yüksək zaman və məkan ayırdetmədə canlı görüntüləmə vasitəsilə periferik terminalları yenidən qurduq. əldə etdik z- 1 saat ərzində hər 10 dəqiqədən bir bütün aksonal arborun yığınları və sonradan onları zamanla 3D halına gətirdi (n=6). Arbors, hər zaman nöqtəsində bütün filamentlərin yarı əllə izlənilməsi ilə yenidən quruldu, bu da bizə müxtəlif neyritlərin davranışını kəmiyyətcə qiymətləndirməyə imkan verdi (əlavə materialda Cədvəl S1-ə baxın). Bu analiz göstərdi ki, nevritlər daim uzunluq və mövqe dəyişir. Orta hesabla, neyritlər dəqiqədə 100 nm sürətlə böyüdü və ya geri çəkildi və 10 dəqiqə ərzində 5 mkm-ə qədər uzana bildi (Şəkil 1E, F). Formadakı bu sürətli dəyişikliklərə baxmayaraq, arbor mürəkkəbliyi dəyişmədi, çünki qeydə alınan dövrdə neuritlərin orta sayı saxlanılıb (Şəkil 1I). Bu, neyritin cücərmə sürətinin budama sürətinə bərabər olduğuna dair əvvəlki canlı görüntüləmə müşahidələrinə uyğundur (Faucherre et al., 2009). Neurit cücərməsinin interstisial budaqlanma ilə baş verdiyini və budamaların geri çəkilmə yolu ilə baş verdiyini aşkar etdik, çünki neyrit tökülməsi və ya degenerasiyasını heç vaxt müşahidə etmədik. Biz belə nəticəyə gəlirik ki, afferent periferik arborların struktur müxtəlifliyi neyrit istehsalı, uzadılması və geri çəkilməsinin çox aktiv prosesindən qaynaqlanır.

Periferik arborizasiya saç hüceyrələrinin fəaliyyəti ilə modullaşdırılır

Sakit neyromastlarda neyronların cücərmə fəaliyyətinin regenerasiyaya məruz qalanlara nisbətən daha az olması müşahidəsi onu göstərir ki, periferik arborlar hiss epitelindən gələn siqnallara cavab olaraq yenidən qurulur (Faucherre et al., 2009). Funksiya itkisi mutasiyası olan zebra balığı ştammından istifadə edərək bu işarələrin tük hüceyrə fəaliyyətindən qaynaqlandığını soruşduq. tmie, məməlilərin karlıq geninin transmembran daxili qulağının ortoloqu. Homoziqot tmie mutant zebrafish canlı və məhsuldardır, lakin tük hüceyrələrinin mexaniki qəbulunda qüsurlar səbəbindən dərindən kardır (Gleason et al., 2009).

HuC:mem-TdTomato DNT-ni yabanı tipli və tmie mutant yumurtaları da daşıyan Tg(brn3c:gfp) transgen. Yenə də aksonların postotik qanqliyonda yerləşən somaya qədər izlənilə bildiyi zaman afferent olaraq təyin olundu. Biz 4D təsvirləri əldə etdik və gördük ki, hər bir halda periferik arbors əhəmiyyətli dərəcədə daha mürəkkəbdir. tmiebalıq (n=6) vəhşi tipli idarəetmələrə nisbətən (n=6) 7 dpf-də. Biz müxtəlif strategiyalar qəbul etməklə arborun mürəkkəbliyini kəmiyyətcə qiymətləndirdik. Biz arbor başına neyrit sonlarının ümumi sayını hesablayaraq ədədi mürəkkəbliyi təyin etdik. Dinamik mürəkkəblik üçün biz hər bir neyrit terminalına rəngli nöqtə qoyaraq arborların vizual təsvirini yaratdıq. Sonradan hər bir terminalın mövqeyi 3D məkanda hər 10 dəqiqədən bir 1 saat ərzində izlənildi. Termini bütün qeyd müddətini bölən altı vaxt nöqtəsinin hər birində fərqli rəng təyin edildi (Şəkil 2 və 3, əlavə materialda Filmlər 1-4-ə baxın). Vəhşi tip və arasında ədədi və dinamik mürəkkəbliyin müqayisəsi tmie heyvanlar mutantlar qrupunun hər bir zaman nöqtəsində neyritlərin sayında orta hesabla 2 dəfə artım olduğunu göstərdi (Şəkil 1I və əlavə materialda Şəkil S1A-ya baxın). Məsələn, tmie Şəkil 2-dəki mutantın ilk zaman çərçivəsində 16 neyriti var idi, halbuki vəhşi tipli balıqlar eyni vaxtda yalnız altı budaq göstərirdilər.

Tək etiketli afferent neyronun dördölçülü yenidən qurulması. (A-G) Vəhşi tipdə (A-C) və afferent neyronun dördölçülü təsvirləri tmie mutant (E-G) balıq. (A,E) mem-TdTomato etiketli neyron GFP-ifadə edən saç hüceyrələri ilə əlaqə saxlayır. Hər bir neyronun terminal nöqtəsi fərqli bir rənglə tərtib edilmişdir. Hər terminal nöqtəsi üçün (yəni hər rəng üçün) mövqelər zamanla, hər 10 dəqiqədən bir 1 saat ərzində tərtib edilmişdir. (B,F) A,E ilə eynidir, lakin saç hüceyrələri yoxdur. (C,G) B,F ilə eynidir, lakin yalnız terminal nöqtəsini təmsil edən nöqtələrlə. Unikal mavi nöqtə neyron arborunun başlanğıc nöqtəsini göstərir. Ağ çərçivə ilk zaman çərçivəsinin neyron arborunun yenidən qurulmasına uyğundur. (D,H) Maksimal proqnozlar və zamanla eyni neyronun neyron arborunun yenidən qurulması. T1-T6 şəkilləri 1 saat ərzində hər 10 dəqiqədən bir çəkilib. Başlanğıc nöqtəsi mavi, terminal nöqtələri yaşıl, budaqlanma nöqtələri qırmızı, xüsusi budaqlanma nöqtələri (çoxlu bifurkasiya) mavi rəngdədir. Ox başları keçici neyritlərin nümunələrini göstərir. Ölçək çubuqları: 5 μm.

Tək etiketli afferent neyronun dördölçülü yenidən qurulması. (A-G) Vəhşi tipdə (A-C) və afferent neyronun dördölçülü təsvirləri tmie mutant (E-G) balıq. (A,E) mem-TdTomato etiketli neyron GFP-ifadə edən saç hüceyrələri ilə əlaqə saxlayır. Hər bir neyronun terminal nöqtəsi fərqli bir rənglə tərtib edilmişdir. Hər bir terminal nöqtəsi üçün (yəni hər rəng üçün) mövqelər zamanla, hər 10 dəqiqədən bir 1 saat ərzində tərtib edilmişdir. (B,F) A,E ilə eynidir, lakin saç hüceyrələri yoxdur. (C,G) B,F ilə eynidir, lakin yalnız terminal nöqtəsini təmsil edən nöqtələrlə. Unikal mavi nöqtə neyron arborunun başlanğıc nöqtəsini göstərir. Ağ çərçivə ilk zaman çərçivəsinin neyron arborunun yenidən qurulmasına uyğundur. (D,H) Maksimal proqnozlar və zamanla eyni neyronun neyron arborunun yenidən qurulması. T1-T6 şəkilləri 1 saat ərzində hər 10 dəqiqədən bir çəkilib. Başlanğıc nöqtəsi mavi, terminal nöqtələri yaşıl, budaqlanma nöqtələri qırmızı, xüsusi budaqlanma nöqtələri (çoxlu bifurkasiya) mavi rəngdədir. Ox başları keçici neyritlərin nümunələrini göstərir. Ölçək çubuqları: 5 μm.

Tək etiketli afferent neyronun dördölçülü təsvirləri. Altı vəhşi tipdə (yuxarıda) və tək etiketli afferent neyronun dördölçülü təsvirləri tmie mutant (aşağıda) balıq. Hər bir neyronun terminal nöqtəsi fərqli bir rənglə tərtib edilmişdir. Hər bir terminal nöqtəsi üçün (yəni hər rəng üçün) mövqelər zamanla, hər 10 dəqiqədən bir 1 saat ərzində tərtib edilmişdir.

Tək etiketli afferent neyronun dördölçülü təsvirləri. Altı vəhşi tipdə (yuxarıda) və tək etiketli afferent neyronun dördölçülü təsvirləri tmie mutant (aşağıda) balıq. Hər bir neyronun terminal nöqtəsi fərqli bir rənglə tərtib edilmişdir. Hər bir terminal nöqtəsi üçün (yəni hər rəng üçün) mövqelər zamanla, hər 10 dəqiqədən bir 1 saat ərzində tərtib edilmişdir.

Sonra, təsvir olunan altı zaman nöqtəsində (sabit neyritlər) mövcud olan neyritlərin sayını və həmçinin yalnız bir-beş zaman çərçivələrində müşahidə olunanları (keçici neyritlər) hesablayaraq arbor sabitliyini müqayisə etdik. In tmie mutantlar Neyritlərin 40%-i keçici olub, yabanı tipli nümunələrdə tapılan 12%-dən əhəmiyyətli dərəcədə yüksəkdir (P<0.01) (Şəkil 4A və əlavə materialda Şəkil S1B-ə baxın). Sonra bir-beş zaman aralığında görünən neyritlərin sayını hesabladıq və "əzmkarlığı" bir neyritin müəyyən bir müddət ərzində mövcud qalma qabiliyyəti kimi təyin etdik. Bu təhlil göstərdi ki, vəhşi tipli neyritlərin əksəriyyəti (88%) bütün qeydə alınmış dövr ərzində mövcud olub, halbuki neyritlərin yalnız 59%-i tmie balıq bütün altı zaman çərçivəsində mövcud idi. 14% olduğunu gördük tmie neurites vəhşi növü (Şəkil. 4B) 7% ilə müqayisədə, yalnız bir zaman çərçivəsində mövcud idi. Buna görə də, nevritlər tmie mutantlar daha az davamlı idi.

Biz daha sonra vəhşi tipli və tmie onların 'ardıcıllığı' üçün nevritlər. Davranışlarının davamlılığı kimi ardıcıllığı müəyyən etdik (şəkil 4C). Məsələn, bütün qeydə alınmış müddət ərzində nə böyüməmiş, nə də geri çəkilməmiş neyritlər yüksək ardıcıl olaraq təsnif edilir, halbuki bir sıra əks davranışları yerinə yetirənlər (məsələn, böyümə, sonra geri çəkilmə) daha aşağı tutarlılıq dərəcəsini müəyyənləşdirir. In tmie mutantlar, neyritlərin yalnız 11% -i tamamilə ardıcıl idi, halbuki 42% böyüdü və ya geri çəkildi və 36%, 9% və 2% müvafiq olaraq iki, üç və ya dörd əks hadisələrin ardıcıllığını həyata keçirdi. Müqayisə üçün, vəhşi növ balıqlarda müvafiq dəyərlər 40%, 37%, 23%, 0% və 0% olmuşdur. Beləliklə, neyritlər tmie mutantlar daha az ardıcıldır.

Neyrit dinamikasının kəmiyyət təhlili. (A) Stabil (altı zaman çərçivəsində mövcud olan) vəhşi tipli və keçici (altı zaman çərçivəsindən az) neyritlərə qarşı orta göstəricisi tmie mutant balıq. Səhv çubuqları s.e.m. *, P<0.01. (B) Neyrit davamlılığı. Neyritlərin davamlılığı yalnız bir, iki, üç, dörd, beş və ya altı zaman çərçivəsində mövcud olan neyritlərin faizindən hesablanmışdır. (C) Neyrit konsistensiyası. 'Ardıcıl' altı zaman çərçivəsində nə böyüməmiş, nə də geri çəkilməmiş bir neyritə aiddir. 'Bir hadisə' altı zaman çərçivəsində yalnız böyümüş və ya geri çəkilmiş bir neyritə aiddir. 'İki hadisə' iki əks hərəkət ardıcıllığını tamamlayan neyritə aiddir, yəni böyümədən sonra geri çəkilmə və ya əksinə. Eynilə, "üç hadisə" üç əks hərəkətin ardıcıllığına aiddir. (D-F) Neurites ipuçlarının dinamikası. İlk vaxt nöqtəsində terminal nöqtəsinin mövqeyinin dəyəri sıfıra normallaşdırıldı və neyrit ucunun qət etdiyi məsafəni təyin etmək üçün eyni dəyər sonrakı vaxt nöqtələrindən çıxarıldı. Hər bir qrafikin sağ tərəfində bir zaman çərçivəsi ərzində hər bir növ neyritin qət etdiyi orta məsafə (μm) göstərilir. Stabil nevritlərdə qabarıq ekstremitə yoxdur, lakin altı zaman çərçivəsində mövcuddur. (D) qabarıq neyritlərin dinamikası. (E) Sabit qabarıq olmayan neyritlərin dinamikası. (F) Keçici neyritlərin dinamikası. Qırmızı xətlər, vəhşi tipli kəsikli yaşıl xətlər, tmie. Səhv çubuqları s.e.m. *, ***, ****, P<0,01 **, PVəhşi tip ulduzların sayı ilə göstərilən cütlər üçün <0.1, n=6 tmie, n=6.

Neyrit dinamikasının kəmiyyət təhlili. (A) Stabil (altı zaman çərçivəsində mövcud olan) vəhşi tipli və keçici (altı zaman çərçivəsindən az) neyritlərə qarşı orta göstəricisi tmie mutant balıq. Səhv çubuqları s.e.m. *, P<0.01. (B) Neyrit davamlılığı. Neyritlərin davamlılığı yalnız bir, iki, üç, dörd, beş və ya altı zaman çərçivəsində mövcud olan neyritlərin faizindən hesablanmışdır. (C) Neyrit konsistensiyası. 'Ardıcıl' altı zaman çərçivəsində nə böyüməmiş, nə də geri çəkilməmiş bir neyritə aiddir. 'Bir hadisə' altı zaman çərçivəsində yalnız böyümüş və ya geri çəkilmiş bir neyritə aiddir. 'İki hadisə' iki əks hərəkət ardıcıllığını tamamlayan neyritə aiddir, yəni böyümədən sonra geri çəkilmə və ya əksinə. Eynilə, "üç hadisə" üç əks hərəkətin ardıcıllığına aiddir. (D-F) Neurites ipuçlarının dinamikası. İlk vaxt nöqtəsindəki terminal nöqtəsinin mövqeyinin dəyəri sıfıra normallaşdırıldı və neyrit ucunun qət etdiyi məsafəni təyin etmək üçün eyni dəyər sonrakı vaxt nöqtələrindən çıxarıldı. Hər bir qrafikin sağ tərəfində bir zaman çərçivəsi ərzində hər bir növ neyritin qət etdiyi orta məsafə (μm) göstərilir. Stabil nevritlərdə qabarıq ekstremitə yoxdur, lakin altı zaman çərçivəsində mövcuddur. (D) qabarıq neyritlərin dinamikası. (E) Sabit qabarıq olmayan neyritlərin dinamikası. (F) Keçici neyritlərin dinamikası. Qırmızı xətlər, vəhşi tipli kəsikli yaşıl xətlər, tmie. Səhv çubuqları s.e.m. *, ***, ****, P<0,01 **, PVəhşi tip ulduzların sayı ilə göstərilən cütlər üçün <0.1, n=6 tmie, n=6.

Nəhayət, ilk zaman nöqtəsindən hər bir neyritin qət etdiyi məsafəni ölçdük. Daha dəqiq təhlil üçün biz onları üç kateqoriyaya ayırdıq: altı zaman çərçivəsində mövcud olan qabarıq neyritlər (qabarıq) altı zaman çərçivəsində mövcud olan, lakin qabarıq olmayan (sabit) neyritlər və aşağı davamlılığa malik neyritlər (keçici). Vəhşi tipli və mutant keçici neyritlər sabit və qabarıq neyritlərə nisbətən bir vaxt ərzində xeyli uzun məsafələr qət etmişlər (Şəkil 4D-F).

Müşahidə olunan təsirlərin saç hüceyrələrinin fəaliyyətinin itirilməsi ilə bağlı olduğunu təsdiqləmək üçün eyni strategiyanı morfolino (MO) yeridilmiş heyvanlara tətbiq etdik. kaderin 23 (cdh23). Cdh23 morphants fenocopy sputnik mutasiyaya malik zebra balığı ştammı cdh23 Bu da ucluq əlaqələrinin olmaması səbəbindən karlığa və mexaniki qəbul etmənin olmamasına səbəb olur (Sollner et al., 2004). Tədqiqat maksimum MO səmərəliliyi üçün 4 dpf-də aparılmışdır. oxşar tmie mutantlar, Cdh23 morphants nəzarət balıqlarına nisbətən daha mürəkkəb periferik arbors göstərdi. Orta hesabla, neyritlərin sayında 1,7 dəfə artım müşahidə etdik, neyritlərin 46%-i morfanlarda keçici olur, nəzarətdə isə 17%-dir. Biz həmçinin neyritlərin Cdh23 morfanlarında (nəzarət, n=3 cdh23 MO, n=3) (əlavə materialda Şəkil S2 və Cədvəl S2-yə baxın). Bu nəticələrdən belə nəticəyə gəlirik ki, afferent neyron periferik arborların mürəkkəbliyi hiss epitelindən təsirlənir və arborun sabitliyi oyanmış saç hüceyrələrinin fəaliyyətindən asılıdır.

Dərin kar zebra balığında mərkəzi aksonlar normal görünür

Daha sonra dərin karlığın neyron mərkəzi aksonlarına da təsir edib-etmədiyini soruşduq. Biz lateralis afferent mərkəzi somatotopiyanı və posterior arxa beyində xarakterik ikinci dərəcəli hədəf olan Mauthner hüceyrəsi ilə təmasları qiymətləndirdik (Kimmel et al., 1982 Metcalfe et al., 1985). Mauthner hüceyrəsinin yanal dendritinin lateral ucunda dorsal proyeksiyası var ki, bu da lateralis afferent proyeksiyalarının hədəfi olur (Şəkil 5C). Mauthner hüceyrəsini aşkar etmək üçün onurğa beyninə yaşıl floresan dekstranı yeritdik. tmie mutant sürfə. Bu boya Mauthner hüceyrəsinin aksonuna daxil olur və onun iki dendriti də daxil olmaqla bütün hüceyrəyə retrograd şəkildə yayılır. Biz həmçinin bu neyromastları innervasiya edən afferent neyronları retrograd şəkildə etiketləmək üçün qırmızı (arxa yanal xəttin terminal neyromastında) və qırmızı (ön yan xəttin supra-orbital neyromastında) flüoresan dekstranı yeritdik (Sapède et al., 2005) .

Birinci dərəcəli yan xətt sensor neyronlarının mərkəzi proqnozları tmie mutantlar. Mərkəzi somatotopiya və Mauthner hüceyrəsinin hədəflənməsi qorunur tmie mutantlar. (Aa-d) Floresan dekstran inyeksiyaları tmie −/− brn3c:gfp posterior (b) və anterior (c) neyromastlardan gələn birinci dərəcəli yan xətt sensor neyron proyeksiyalarının somatotopiyasını göstərən transgen balıq. P9 (PLL) neyromastlardan (b Alexa 647-dekstran) və SO2 (ALL) neyromastlardan (c Rodamin-dekstran) gələn proqnozlar arxa beyində dorsoventral şəkildə (a) layihələndirilir. (d) Qulaqdan gələn proqnozlar (Brn3c:GFP). (Ba-c) Floresan dekstran inyeksiyaları tmie −/− brn3c:gfp Mauthner lateral dendritinin arxa və ön yan xətt proyeksiyaları ilə mərkəzi hədəflənməsini göstərən transgen balıq (a). P9 (PLL) neyromastından (b Alexa 647-dekstran) gələn proqnozlar (ox başları) ventrodorsal olaraq uzanan Mauthner hüceyrə yanal dendritinin (c fluorescein-dekstran) ən yan hissəsinə bağlanır. (C) Birinci dərəcəli yanal xətt sensor neyron proyeksiyalarının mərkəzi somatotopiyasını və onların Mauthner hüceyrəsinin yanal dendritinə yönəlməsini təsvir edən sxem (miqyaslı deyil). In tmie balıq, yan xəttin neyromastın anteroposterior oxu vəhşi tipli balıqlarda olduğu kimi Mauthner yanal dendrit dorsal proyeksiyasının ventrodorsal oxuna doğru uzanır. ALL, anterior lateral line PLL, posterior lateral line.

Birinci dərəcəli yan xətt sensor neyronlarının mərkəzi proqnozları tmie mutantlar. Mərkəzi somatotopiya və Mauthner hüceyrəsinin hədəflənməsi qorunur tmie mutantlar. (Aa-d) Floresan dekstran inyeksiyaları tmie −/− brn3c:gfp posterior (b) və anterior (c) neyromastlardan gələn birinci dərəcəli yan xətt sensor neyron proyeksiyalarının somatotopiyasını göstərən transgen balıq. P9 (PLL) neyromastlardan (b Alexa 647-dekstran) və SO2 (ALL) neyromastlardan (c Rodamin-dekstran) gələn proqnozlar arxa beyində dorsoventral şəkildə (a) layihələndirilir. (d) Qulaqdan gələn proqnozlar (Brn3c:GFP). (Ba-c) Floresan dekstran inyeksiyaları tmie −/− brn3c:gfp Mauthner lateral dendritinin arxa və ön yan xətt proyeksiyaları ilə mərkəzi hədəflənməsini göstərən transgen balıq (a). P9 (PLL) neyromastından (b Alexa 647-dekstran) gələn proyeksiyalar (ox başları) ventrodorsal olaraq uzanan Mauthner hüceyrə yanal dendritinin (c fluorescein-dekstran) ən yan hissəsinə bağlanır. (C) Birinci dərəcəli yanal xətt sensor neyron proyeksiyalarının mərkəzi somatotopiyasını və onların Mauthner hüceyrəsinin yanal dendritinə yönəlməsini təsvir edən sxem (miqyaslı deyil). In tmie balıq, yan xəttin neyromastın anteroposterior oxu vəhşi tipli balıqlarda olduğu kimi Mauthner yanal dendrit dorsal proyeksiyasının ventrodorsal oxuna doğru uzanır. ALL, anterior lateral line PLL, posterior lateral line.

Afferent neyronların arxa beyinə qədər izlənilməsi onların mərkəzi təşkilatının təsirsiz olduğunu göstərdi tmie mutantlar (n=7) (Şəkil 5B və əlavə materialda 5-ci Filmə baxın). Bundan əlavə, anterior və posterior neyromast afferentlərindən olan mərkəzi proqnozlar normal şəkildə uzandı və arxa beyində somatotopik ox boyunca düzgün şəkildə yerləşdirildi (Şəkil 5A). Biz müşahidə etdik ki, arxa və ön yan xətt mərkəzi aksonları Mauthner hüceyrəsinin lateral dendriti ilə dorsal proyeksiya səviyyəsində (Şəkil 5Ba və əlavə materialda Film 5-ə baxın) vəhşi tipli nəzarətlərdə olduğu kimi (məlumatlar göstərilmir) əlaqə qurur. ). Bundan əlavə, periferik arborlara tətbiq olunanlarla eyni qətnamələrdə canlı görüntüləmə neyron mərkəzi arborlarında heç bir dinamik dəyişikliyi aşkar etmədi (məlumatlar göstərilmir). Bu nəticələr göstərir ki, evokasiya edilmiş saç hüceyrələrinin fəaliyyətinin olmaması lateralis neyronlarının mərkəzi aksonal təşkilinə heç bir əsas təsir göstərmir.

Afferent neyronlar, saç hüceyrələrinin mexanik qəbulu olmadıqda hədəf oriyentasiyasını ayırd edə bilməzlər.

Karlıq periferik arborizasiyaya kəskin şəkildə təsir etdiyi üçün biz oyanmış saç hüceyrəsi fəaliyyətinin afferent neyronlar tərəfindən müstəvi qütbləşmiş hədəflərin seçilməsində hər hansı rol oynayıb-oynamadığını soruşduq. Biz səpələnmiş etiketli neyronları yaydıq və onların apikal stereosiliyalarını flüoresan phalloidin ilə etiketləyərək saç hüceyrələrinin oriyentasiyasını aşkar etdik (Şəkil 6A,B). Homoziqot tmie mutant balıqlar normal planar hüceyrə polaritesi olan saç hüceyrələrini inkişaf etdirir (Şəkil 6B) (Gleason et al., 2009). Vəhşi balıqlarda qabarıq neyritlərin 88%-i yalnız bir polariteli saç hüceyrələri ilə əlaqələndirilir (n=17), aşkar edilən 38%-dən əhəmiyyətli dərəcədə yüksəkdir tmie mutantlar (n=21) (Şəkil 6C). In tmie mutantlar, qabarıq nevritlərin 62%-i hər iki qütbün tüklü hüceyrələri ilə əlaqələndirilmişdir, bu hal vəhşi heyvanlarda (12%) daha az rast gəlinir. In tmie və vəhşi tipli nümunələr, qabarıq neyritlər, Ribeye B puncta-nın lokallaşdırılmış konsentrasiyası ilə aşkar edildiyi kimi tük hüceyrələri ilə sinapslar qurdular (Şəkil 6D-I) (vəhşi tip, n=6 tmie, n=7). Bundan əlavə, saç hüceyrələri ilə sinapslar yaratmaq üçün bir neçə nazik neyrit də ortaya çıxdı (Şəkil 6J-L).

Saç hüceyrəsi və onun afferent neyronları arasında mexaniki ötürülmə neyronlarda AMPA reseptorlarını aktivləşdirən saç hüceyrəsindən qlutamatın sərbəst buraxılması ilə vasitəçilik edir (Bailey və Sewell, 2000). Neyronlar tərəfindən saç hüceyrələrinin polarite ayrı-seçkiliyini daha da araşdırmaq üçün glutamat reseptor agonistləri və antaqonistlərindən istifadə edərək farmakoloji yanaşmaya cəhd etdik. Biz balıqları CNQX (rəqabətli AMPA/kainat glutamat reseptor antaqonisti), domoik turşusu (AMPA/kainat glutamat reseptorlarının güclü agonisti), kanaik turşusu (kainat/qlutamat reseptorunun agonisti), maleat (rəqabətli olmayan NMDA) ilə müalicə etdik. reseptor antaqonisti) və siklotiyazid (reseptor qapısını dəyişdirən AMPA reseptor desensitizasiyasının allosterik inhibitoru). Bu dərmanların heç biri balıqda sinaptik inhibə ilə uyğun gələn bir fenotip yaratmadı (məlumatlar göstərilmir və bu, in vivo eksperimental quruluşumuzda hədəflərinə effektiv təsir göstərmədiyini göstərir. Biz həmçinin lateralis afferentlərində daxilə doğru düzəldici kalium ion kanalı Kir2.1 ifadə edərək neyron fəaliyyətini elektriklə susdurmağa çalışdıq (Hua et al., 2005). Afferent neyronlarda Kir2.1 ifadəsi onların inkişafına təsir etməsə də, neyritogenezə dərin təsir göstərdi və həmçinin gec başlayan neyron degenerasiyasına səbəb oldu (məlumatlar göstərilmir). Beləliklə, bu yanaşma da uğursuz oldu. Buna baxmayaraq, nəticələrimizi dərindən karlardan şərh edirik tmie mutantlar, afferent neyronların eyni yönümlü hədəfləri düzgün seçməsi üçün oyanmış saç hüceyrəsi fəaliyyətinin zəruri olduğunun aydın göstəricisi kimi.

dan afferent neyronlar tmie mutantlar ciddi polarite seçiciləri deyil. (A-C) HuC-də polarite-spesifik innervasiyanın təhlili:mem-TdTomato-injected brn3c:gfp tmie mutantlar. (A) Tək etiketli afferent neyron tərəfindən innervasiya edilən neyromastın maksimal proyeksiyası və (B) phalloidin boyanması tmie mutant. A-dakı oxlar saç hüceyrələri ilə əlaqə quran qabarıq nevritləri göstərir. B-dəki ulduzlar innervasiya edilmiş saç hüceyrələrini göstərir. (C) Afferent neyron ilə eyni qütblü saç hüceyrələri və ya iki əks qütblü saç hüceyrələri arasında qurulan təmasların faizi. Mötərizədə olan rəqəmlər neyromastların sayını göstərir (vəhşi tip, n=17 tmie, n=21). (D-L) Vəhşi tipdə lent sinapslarının immunodeteksiyası (D-F) və tmie (G-L) Ribeye B antikorundan (siyan) istifadə edən balıq.Saç hüceyrələri (yaşıl) ilə TdTomato (qırmızı) ifadə edən afferent neyronların qabarıq kontaktları vəhşi tipdə (D-F) və sinapsların olması ilə əlaqələndirilir. tmie (G-I) balıq (ox başları hər bir halda nümunə göstərir). İncə neyritlər saç hüceyrələri ilə sinapslar da yarada bilər ki, bu da neyromastda Ribeye B ləkəsinin olması ilə göstərilir. tmie mutant (J-L). J-də qutulu sahə K, L-də böyüdülür. Ölçək çubuqları: A,D,G,J-də 10 μm, B-də 5 μm.

dan afferent neyronlar tmie mutantlar ciddi polarite seçiciləri deyil. (A-C) HuC-də polarite-spesifik innervasiyanın təhlili:mem-TdTomato-injected brn3c:gfp tmie mutantlar. (A) Tək etiketli afferent neyron tərəfindən innervasiya edilən neyromastın maksimal proyeksiyası və (B) phalloidin boyanması tmie mutant. A-dakı oxlar saç hüceyrələri ilə əlaqə quran qabarıq nevritləri göstərir. B-dəki ulduzlar innervasiya edilmiş saç hüceyrələrini göstərir. (C) Afferent neyron ilə eyni qütblü saç hüceyrələri və ya iki əks qütblü saç hüceyrələri arasında qurulan təmasların faizi. Mötərizədə olan rəqəmlər neyromastların sayını göstərir (vəhşi tip, n=17 tmie, n=21). (D-L) Vəhşi tipdə lent sinapslarının immunodeteksiyası (D-F) və tmie (G-L) Ribeye B antikorundan (siyan) istifadə edən balıq. Saç hüceyrələri (yaşıl) ilə TdTomato (qırmızı) ifadə edən afferent neyronların qabarıq kontaktları vəhşi tipdə (D-F) və sinapsların olması ilə əlaqələndirilir. tmie (G-I) balıq (ox başları hər bir halda nümunə göstərir). İncə neyritlər saç hüceyrələri ilə sinapslar da yarada bilər ki, bu da neyromastda Ribeye B ləkəsinin olması ilə göstərilir. tmie mutant (J-L). J-də qutulu sahə K, L-də böyüdülür. Ölçək çubuqları: A,D,G,J-də 10 μm, B-də 5 μm.


Nəşrlər

Davamlı daxili kortikal fəaliyyət həm heyvanlarda, həm də insanlarda qavrayış və davranışda böyük rol oynayır. Əvvəllər göstərmişdik ki, oriyentasiya xəritələrinə bənzəyən kortəbii nümunələr anesteziya edilmiş pişiklərin ilkin vizual korteksindəki böyük kortikal sahələr üzərində görünür. Bununla belə, hələ də naməlum olaraq qalır: 1) primatdakı kortəbii fəaliyyət də oxşar nümunələri göstərirmi və 2) anesteziya edilmiş və oyaq primatda kortikal davamlı fəaliyyət arasında əhəmiyyətli fərq varmı. Biz bu sualları gərginliyə həssas boya təsvirini çox vahid və yerli sahə potensial qeydləri ilə birləşdirərək araşdırdıq. 6 x 6 mm(2) ölçüsündə kortəbii şəkildə yaranan oriyentasiya və okulyar dominantlıq xəritələri anesteziya edilmiş, lakin oyaq olan meymunlarda asanlıqla müşahidə edilmişdir. Buna baxmayaraq, oyaq meymunlarda oriyentasiya-domenləri əhatə edən korrelyasiyalı fəaliyyət müşahidə edilmişdir. Həm anesteziya edilmiş, həm də oyaq şəraitdə spontan korrelyasiyalı fəaliyyət hərəkət edən dalğalarla üst-üstə düşürdü. Oyan heyvanlarda oriyentasiya xəritələrinə bənzəyən kortəbii fəaliyyətin hər bir nümunədə daha kiçik kortikal sahələri əhatə etdiyini, lakin zaman keçdikcə bütün V1-də göründüyünü aşkar etdik. Bundan əlavə, oyaq meymunda əldə etdiyimiz nəticələr, funksional arxitekturanın fərqli elementləri arasında əlaqələr də daxil olmaqla, sinaptik gücün tamamilə yenidən təşkil edildiyini göstərir. Bu tapıntılar, davam edən fəaliyyətin kortikal funksiya və davranışda mühüm rol oynayan daha sürətli keçid təmsillərinə malik olduğu fikrini dəstəkləyir.

Kritik dinamikanın neyron məlumat emalında mühüm rol oynadığı düşünülür: kritik şəbəkələrin yaxınlığında neyron uçqunları, miqyassız məkan-zaman fəaliyyətinin kaskadları nümayiş etdirilir və məlumat tutumunu və ötürülməsini gücləndirir. Bununla belə, tənqidilik, məlumatlılıq və informasiya inteqrasiyası arasında dəqiq əlaqə qeyri-müəyyən olaraq qalır. Bu əlaqəni xarakterizə etmək üçün biz müxtəlif anesteziklər altında müxtəlif növ heyvanlardan toplanmış gərginliyə həssas boya görüntüləmə məlumatlarına çoxmiqyaslı uçqun analizini tətbiq etdik. Biz anesteziyanın sinir dinamikasının miqyaslı davranışını sistematik şəkildə dəyişdirdiyini, azalmış sinir mürəkkəbliyində əks olunan bir dəyişiklik olduğunu gördük. Bu tapıntılar eyni analizləri biofiziki cəhətdən real kortikal şəbəkə modelinə tətbiq etməklə təsdiqləndi, burada çox miqyaslı kritiklik tədbirləri şəbəkə xüsusiyyətləri və məlumat inteqrasiyası qabiliyyəti ilə əlaqələndirildi. Nəticələrimiz göstərir ki, çoxmiqyaslı kritiklik tədbirləri şüur ​​səviyyəsini qiymətləndirmək üçün potensial biomarkerlərdir.

Pişiklərin erkən vizual korteksində, anesteziya altında öz-özünə yaranan oriyentasiya xəritələrinə bənzəyən sinir fəaliyyəti nümunələri. Belə nümunələrin yarımkürələr arasında sinxronizasiya olub-olmadığını yoxlamaq üçün yeni təkmilləşdirilmiş gərginliyə həssas boyadan istifadə edərək anesteziya edilmiş pişiklərdə ikitərəfli görüntüləmə apardıq. Biz eyni vaxtda hər iki yarımkürədə erkən vizual korteksi əhatə edən xəritəyə bənzər fəaliyyət nümunələrini müşahidə etdik. Kardinal və əyri istiqamətlərlə əlaqəli xəritələrlə faktiki olaraq eyni olan naxışlar kortəbii dalğalanmaların aparıcı əsas komponentləri kimi meydana çıxdı və keçici oriyentasiya hallarının gücü onların müddəti ilə əlaqələndirildi və bu xəritələrin müvəqqəti olaraq dövlətləri cəlb etdiyini sübut etdi. Hazırladığımız neyron kütlə modeli eksperimental olaraq müşahidə edilən həm hamar, həm də kəskin oriyentasiya vəziyyəti keçidlərinin dinamikasını təkrarladı. Model göstərir ki, xəritəyə bənzər fəaliyyət həyəcan və inhibə arasındakı qarşılıqlı əlaqə ilə kortəbii atəşdə yavaş modulyasiyalardan yaranır. Nəticələrimiz interhemisferik əlaqənin səmərəliliyini və funksional dəqiqliyini vurğulayır.

Məqsəd: Retina funksiyasının görüntüləyicisinin (RFI) klinik tətbiqlərini və diaqnostik dəyərini nəzərdən keçirmək, RFI-ni digər optik görüntüləmə cihazları ilə qısaca müqayisə etmək və son inkişafları təsvir etmək. Metodlar: Axtarış sözləri "Retinal Funksional Görüntüler", "optik görüntüləmə," "retina angioqrafiyası", "avaskulyar zona", "foveal avaskulyar zona" və digər yaxından əlaqəli terminlər PubMed-də RFI ilə bağlı cari ədəbiyyatı nəzərdən keçirmək üçün istifadə edilmişdir. Nəticələr: RFI-nin funksiyaları 44-dən çox mikrovaskulyar tədqiqatda istifadə edilmişdir. bir sıra göz, nevroloji və ya sistemli xəstəliklərdən təsirləndikdə mikrodamarların sürəti, morfologiyası və oksimetriyası dəyişə bilər. Böyük retinal nahiyələrin qeyri-invaziv angioqrafiyası, damarların seqmentləşdirilməsi, qan axınının, qan sürətinin, damar diametrinin və oksimetriyanın ölçülməsi üçün bu yaxınlarda hazırlanmış avtomatik alqoritmlər RFI-nin klinik tətbiqlərini genişləndirə bilər. Nəticə: RFI müxtəlif şəraitdə retinal mikrovaskulaturanı xarakterizə etmək üçün istifadə edilmişdir. bəzi mərkəzi sinir sistemi (CNS) və sistemik xəstəliklərə əlavə olaraq bütün yayılmış retinal xəstəliklərin şərtləri. RFI-nin tədqiqat və klinik şəraitdə tətbiqi erkən diaqnoza kömək etməli, xəstəliklərin qarşısının alınmasını dəstəkləməli və müalicənin idarə edilməsini təkmilləşdirməlidir.

Yüksək beyin funksiyalarında spontan daxili fəaliyyət böyük rol oynayır. Onun hissiyyatdan qaynaqlanan fəaliyyəti və davranışı necə modullaşdırdığı sualı anesteziya edilmiş gəmiricilərdə, pişiklərdə, meymunlarda və insan subyektlərinin davranışında tədqiq edilmişdir. Bununla belə, qısa bir sensor girişin in vivo olaraq daxili yaradılan fəaliyyəti necə modullaşdırdığına dair tamamlayıcı sual həll edilməmiş qalır və bu iki istiqamətli qarşılıqlı təsirlərin yüksək qətnamə xəritələşdirilməsi heç vaxt həyata keçirilməmişdir. Əhali və tək hüceyrə səviyyələrində tamamlayıcı metodologiyaları birləşdirərək bu sualı araşdırdıq. Anesteziya edilmiş siçovulların somatosensor korteksində populyasiyanın aktivliyinin gərginliyə həssas boya təsviri göstərdi ki, bircə zəif bığ sapmasından sonra belə, spontan yuxarı vəziyyətlər 2 saniyəyə yaxın azalıb. Bu təsir stimullaşdırılan bareldə maksimum idi, lakin bir neçə kortikal sahəyə yayıldı. Daha yüksək sürət bığının əyilməsi 15Hz-ə bənzər fəaliyyətə səbəb oldu. İki fotonlu kalsium görüntüləmə fəaliyyəti və hüceyrəyə əlavə edilmiş qeydlər VSD nəticələrini təsdiqlədi və bir neçə saniyə ərzində tək hüceyrələrin əksəriyyətinin atəşi azaltdığını, lakin kiçik bir hissəsinin atəşi artırdığını aşkar etdi. Tək əyilmə ilə uzun qatar stimullaşdırılmasını müqayisə edərək, ilk əhali artımının dominant təsirini tapdıq. Biz təklif edirik ki, sensor girişin başlanğıcında, müvafiq daxil olan sensor məlumatların işlənməsinin həddən artıq yüklənməsinin qarşısını almaq üçün bəzi daxili mesajlar susdurulsun.

Məqsəd: Qlaukoma xəstələrində müxtəlif texnologiyalarla tor qişada, görmə sinirində və xoroiddə qan dövranı pozğunluqları aşkar edilmişdir. Bununla belə, qlaukomada qan axınının rolu haqqında dəqiq bir anlayış yoxdur. Bu tədqiqatın məqsədi qlaukoma və sağlam subyektlər arasında tor qişa funksiyasının görüntüsünü (RFI) istifadə edərək retinal qan axını sürətlərini müqayisə etmək idi. Materiallar və üsullar: Birincili açıq bucaqlı qlaukoma (POAG) olan 46 xəstənin əlli doqquz gözü, 51 göz 31 sağlam fərd və qlaukomatoz optik neyropatiya (GON) olan, lakin perimetri normal olan 23 xəstənin 28 gözü bu tədqiqat üçün cəlb edilmişdir. Qlaukoma qrupunda 2 xəstənin 3 gözündə, GON qrupunda 1 xəstənin 2 gözündə diaqnoz qoyulan zaman təzyiq normal idi. Qlaukoma xəstələrinin 83%-i və GON qrupundakı xəstələrin 73%-i qlaukoma əleyhinə dərmanlarla müalicə olunub. Bütün xəstələr RFI tərəfindən skan edildi. Qruplar arasında fərqlər qarışıq xətti modellərlə qiymətləndirilmişdir.Nəticələr: GON qrupunda orta venoz sürət (3,8 mm/s) qlaukoma (3,3 mm/s, p = 0,03) və sağlam (3,0 mm/s) ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə sürətli olmuşdur. , p = 0,005) qrupları. GON qrupunda arterial sürət digər tədqiqat qruplarının heç birindən fərqlənmirdi (4,7 mm/s). POAG gözlərində arterial və venoz sürət sağlam gözlərdən fərqli deyildi (arterial: 4,3 qarşı 4,2 mm/s, p = 0,7 venoz: 3,3 qarşı 3,0 mm/s, p = 0,3). Bir gözündə perimetrik qlaukoma və digər gözdə normal görmə sahəsi (VF) olan 13 qlaukoma xəstəsi olan bir alt qrup qlaukoma gözlərində aşağı sürət tendensiyası göstərdi. Nəticələr: Retinal qan axınının sürətindəki dəyişikliklər yalnız müayinədən əvvəl aşkar edilmişdir. -perimetrik vəziyyət, lakin perimetrik qlaukomada deyil. Bu tapıntılar retina damarlarında erkən tənzimləmə pozğunluğunu göstərə bilər.

Böyük miqyaslı iki fotonlu qeydlərdən neyronların sıçrayış fəaliyyətini çıxarmaq, xüsusən də böyük səslərin siqnalları çirkləndirdiyi in vivo məməlilərdə çətin olaraq qalır. Biz ölçülmüş kalsium flüoresansının altında yatan ən çox ehtimal olunan sünbül qatını qaytaran MLspike metodunu təklif edirik. O, sintetik və genetik olaraq kodlanmış göstəricilər üçün əsas dalğalanmalar və fərqli qeyri-xəttiliklər daxil olmaqla fizioloji modelə əsaslanır. Model parametrləri ya istifadəçi tərəfindən təmin edilə bilər, ya da məlumatların özlərindən təxmin edilə bilər. MLspike, ehtimal təqdimatlarının orijinal diskretləşdirilməsi sayəsində hesablama baxımından səmərəlidir, üstəlik, sünbül ehtimallarını və ya nümunələri də qaytara bilər. Geniş simulyasiyalar və yeddi müxtəlif hazırlıqdan əldə edilən real məlumatlar əsasında müqayisə edilən o, ən müasir alqoritmləri üstələyib. Fotonik səs-küyün mütləq əsas məhdudlaşdırıcı amil olmadığına dair sistemli məlumatların tədqiqindən əldə edilən tapıntı ilə birlikdə (səs-küy səviyyəsi, sıçrayış sürəti və s.), bizim metodumuz akusto-optik üçölçülü sistemlərdə nümayiş etdirildiyi kimi, geniş miqyaslı qeydlərdən sünbül çıxarmağa imkan verir. in vivo 1000-dən çox neyron qeydləri.

Sensor qavrayış, idrak və motor nəzarətinin əsasını təşkil edən sinir hesablamaları müxtəlif anatomik və temporal miqyaslarda neyronların populyasiyaları tərəfindən həyata keçirilir. Hal-hazırda yerli və geniş populyasiyaların dinamikasını araşdırmaq üçün bir neçə üsul mövcuddur. Gərginliyə həssas boya görüntüləmə (VSDI) bir neçə on mikrondan bir neçə santimetrə qədər və ya iki sahəyə qədər olan ərazilərdə sinir populyasiyasının aktivliyini aşkar edir.

10 sm aralı. VSDI sub-millisaniyəlik müvəqqəti ayırdetmə qabiliyyətini və təxminən 50 mum məkan qətnaməsini təmin edir. Boya siqnalı eşikaltı sinaptik potensialları vurğulayır. VSDI siçan, siçovul, gerbil, ferret, ağac iti, pişik və meymun kortekslərində retinotopik və ya somatotopik aktivasiyanın yanal yayılmasını, somatosensor, qoxu, eşitmə daxil olmaqla, sensor aktivləşdirmə nəticəsində yaranan dinamik məkan-zaman modelini araşdırmaq üçün tətbiq edilmişdir. , və vizual üsullar, eləcə də motor hazırlığı və spontan baş verən əhalinin fəaliyyətinin xüsusiyyətləri. Bu fəsildə biz VSDI in-vivo üzərində dayanırıq və laboratoriyamızda əsasən vizual sistemdə əldə edilən nəticələri nəzərdən keçiririk.

Neyron şəbəkə analizində əsas sual fərdi neyronlar arasındakı qarşılıqlı əlaqənin davranış və davranış dəyişikliklərini necə yaratdığıdır. Bu tapşırıq kritik olaraq siqnalların mürəkkəb əməliyyat vahidləri kimi fəaliyyət göstərən fərdi sinir hüceyrələri tərəfindən necə dəqiq inteqrasiya olunduğundan asılıdır. Hər hansı bir neyronun giriş-çıxış funksiyasını təyin edən budaqlanan neyron proseslərinin regional elektrik xüsusiyyətləri fövqəladə mürəkkəbdir, dinamikdir və ümumi halda, təfərrüatlı ölçmələr olmadıqda proqnozlaşdırmaq mümkün deyil. Belə bir ölçmə əldə etmək üçün, ideal olaraq, bir çox yerlərdə, mənşə yerindən (dital dendritlərdə sinaptik kontaktlar) hərəkət edərkən alt hədd hadisələrini izləmək və fəaliyyət potensialının başlanmasına təsir etmək üçün müəyyən yerlərdə yekunlaşdırmaq istərdim. Hüceyrədaxili gərginliyə həssas boyalarla membran potensialının dəyişməsinin yüksək rezolyusiyada multisite qeydindən istifadə etməklə bu tip ölçməni həyata keçirmək bu yaxınlarda mümkün olmuşdur. Bu fəsildə ayrı-ayrı neyronlardan gərginliyə həssas boya qeydi metodunun inkişafı və əsasları nəzərdən keçirilir. Hal-hazırda, bu yanaşma dendritik ağacın bütün hissələrindən, eləcə də akson girovlarından və fərdi dendritik tikələrdən membran potensial keçidlərini izləməyə imkan verir.

Neyroelm üçün tətbiq olunan və geniş məkan və müvəqqəti miqyasları əhatə edən funksional görüntüləmə üsullarının inkişafı idrak, davranış və elektrik beyin fəaliyyəti arasındakı əlaqələrin tədqiqini xeyli asanlaşdırdı. Məməlilər üçün neokorteks həssas qavrayış yaratmaqda, könüllü hərəkətə nəzarət etməkdə, yüksək idrak funksiyalarını idarə etməkdə və məqsədyönlü davranışların planlaşdırılmasında xüsusilə dərin rol oynayır. Neokorteksin bu əlamətdar funksiyaları sadə model hazırlıqlarında və ya anesteziya edilmiş heyvanlarda tədqiq edilə bilmədiyi üçün, davranışın sinir əsasları oyaq davranan subyektlərdə araşdırılmalıdır. Neokortikal funksiya sürətlə qarşılıqlı təsir göstərən bir çox bölgədə yüksək paylandığı üçün, real vaxtda kortikal fəaliyyətin məkan-zaman dinamikasını ölçmək vacibdir. Anesteziya edilmiş məməlilərdə aparılan geniş iş göstərdi ki, in vivo Gərginliyə Həssas Boya Görüntüləri (VSDI) neokortikal populyasiya membranının potensial dinamikasını millisaniyəlik temporal rezolyusiyada və alt sütunlu məkan həllində aşkar edir. Burada VSDI-nin meymunların və siçanların davranışında kortikal funksiyanı araşdırmaq üçün artıq yaxşı işlənib hazırlandığını göstərən son nailiyyətləri təsvir edirik. İlk heyvan modeli, qeyri-insan primat, yüksək səviyyəli idrak funksiyası və davranışının əsaslı tədqiqi üçün çox uyğundur. İkinci heyvan modeli olan siçan molekulyar və genetik texnologiyaların zəngin arsenalından faydalanır. Meymunda, eyni korteks yamaqdan dəfələrlə görüntüləmə uzun müddət, bir ilə qədər mümkündür. Gəmiricidə VSDI sərbəst hərəkət edən və oyaq başını tutmuş siçanlara şamil edilir. Fərqli kortikal sahələr və müxtəlif kortikal sütunlar arasındakı qarşılıqlı əlaqə buna görə də indi VSDI vasitəsilə dinamik şəkildə xəritələşdirilə və müvafiq davranışla əlaqələndirilə bilər. Beləliklə, VSDI-ni siçanlara və meymunlara tətbiq etməklə, müxtəlif kortikal bölgələrdə yaşayan neyron şəbəkələrində davranışın neyron fəaliyyətindən necə yarandığını tədqiq etməyə başlaya bilərsiniz.

Tədqiqatın məqsədi/məqsədi: Erkən və neovaskulyar yaşa bağlı makula degenerasiyası (AMD) olan xəstələrdə retinal qan axını sürətindəki dəyişiklikləri öyrənmək. Qan axınının sürətini ölçmək üçün qeyri-invaziv diaqnostik yanaşma olan Retinal Funksiya Görüntüleyicisindən (RFI, Optical Imaging Ltd., Rehovot, İsrail) istifadə etdik. Materiallar və Metodlar: 43 AMD xəstəsinin 60 gözü və 50 yaşdan yuxarı 35 sağlam insanın 53 gözü bu tədqiqat üçün cəlb edilmişdir. Bütün xəstələr arteriya və venaların ikinci və üçüncü budaqlarının qan axınının sürətinin təhlili ilə RFI tərəfindən skan edildi. Qruplar arasında fərqlər qarışıq xətti modellərlə qiymətləndirilmişdir. Nəticələr: AMD xəstələrinin orta sürəti arteriyalarda (3,6 +/- 1,4 qarşı 4,3 +/- 1,0 mm/san, p=0,009) nəzarətlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə aşağı idi, lakin venalarda yox (2,6 +/- 0,9 və 3,1 +/) - 0,6 mm/san, p = 0,08). Aşağı və yüksək dərəcəli AMD gözləri arasında sürəti müqayisə edərkən, yüksək dərəcəli AMD gözlərində venoz sürət yalnız "dar" damarlar qrupunda daha yavaş idi. Nəticələr: AMD olan xəstələrdə retinal arteriyalarda qan axınının sürətinin azalması aşkar edilmişdir. AMD-nin mahiyyətcə xoroidal xəstəlik olmasına baxmayaraq, retinal damarlar funksional anormallıq göstərir və bu, bu xəstəlikdə damar anomaliyasının daha ümumiləşdiyini göstərə bilər.

Kortikal toxuma və fərdi mikrodamarlarda mikrovaskulyar xüsusiyyətlərin ölçülməsi funksional görüntüləmə, biotibbi tədqiqat və klinik diaqnostika üçün mühüm tətbiqlərə malikdir. Multifotonlu flüoresan mikroskopiya yanaşmaları ən effektivdir və ayrı-ayrı damarlarda qırmızı qan hüceyrələrinin (RBC) sürətini etibarlı şəkildə qeyd etməyə imkan verir, lakin flüoresan izləyicilərin inyeksiyasını tələb edir. Üstəlik, kiçik bir ərazidə yalnız bir və ya bir neçə gəmi eyni anda təsvir edilə bilər. Makroskopik damar şəbəkələrində daxili udma və ya əks etdirmə dəyişikliklərinin geniş sahəli CCD/CMOS əsaslı optik təsviri bir neçə mm2 kortikal səth üzərində qırmızı qan hüceyrələrinin trayektoriyalarını qeyd etməklə bu çatışmazlıqları aradan qaldırmağa imkan verir. RBC sürəti daha sonra xüsusi alqoritmlərdən istifadə edərək bu geniş sahə məlumatlarından çıxarıla bilər. Burada, müstəqil olan və beləliklə digəri üçün nəzarət kimi istifadə edilə bilən sağlam RBC sürət təxminlərini təmin edən onlardan ikisini təsvir edirik. Baxmayaraq ki, bu yanaşma bədənin optik olaraq əlçatan qan damarları olan hər hansı bir yerində istifadə edilə bilər, burada biz onun tətbiqini iki halda göstəririk: əvvəlcə beyin qabığı, sonra isə göz. Bu sonuncu tətbiqdə biz retina funksiyasının görüntüləyicisini (RFI) təsvir etməkdə daha ətraflı məlumat veririk: retinal qırmızı qan hüceyrələrinin sürəti, oksimetrik vəziyyət və fotoaktivləşməyə metabolik reaksiyalar kimi hemodinamik parametrləri birbaşa ölçən unikal, qeyri-invaziv multiparametrli funksional görüntüləmə aləti. Bundan əlavə, heç bir kontrast agenti olmadan kapilyar perfuziya xəritəsini tərtib etməyə imkan verir. Retinal funksiyanın bu parametrləri retinal anomaliyalarla pozulur. Beləliklə, burada mikrodamarların xüsusiyyətlərinin səciyyələndirilməsinə diqqət yetiririk. Həqiqətən, klinik tədqiqatlar göstərir ki, bu xüsusiyyətləri bilmək torlu qişa xəstəliklərinin erkən diaqnostikası, onların müalicəsinin mümkün kritik rəhbərliyi, eləcə də qabıq və gözün damar xəstəlikləri üçün təsirlər üçün çoxsaylı klinik tətbiqlər təmin etməlidir.

Yüksək koqnitiv funksiyaların əsas anlayışı, insan olmayan primatda yüksək məkan-zaman ayırdetmə qabiliyyətinə malik kortikal fəaliyyətin görüntülənməsindən çox faydalana bilər. Spontan və evokasiya edilmiş fəaliyyətin kortikal təsvirlərinin yüksək qətnamə dinamikasının sürətli təsvirinə nail olmaq üçün gərginliyə həssas boyalarla optik görüntüləmənin davamlı seanslarında çoxlu stimulları sürətlə interleaving edərək sensor stimullaşdırma üçün yeni məlumat əldə etmə protokolunu hazırladıq.Biz həmçinin yeni məlumat əldə etmə protokolumuz üçün hazırlanmış, lakin yalnız simulyasiya edilmiş verilənlər üzərində sınaqdan keçirilmiş çoxölçülü zaman seriyasının "müvəqqəti strukturlaşdırılmış komponent analizi" (TSCA) üçün yeni alqoritmi sınaqdan keçirdik (Blumenfeld, 2010). Xam məlumatlara əlavə olaraq, alqoritm məlumatların müvəqqəti strukturu, eləcə də digər məlumatların daxil edilməsi haqqında əvvəlki bilikləri özündə birləşdirir. Burada biz göstərdik ki, TSCA funksional siqnal komponentlərini səs-küy adlanan digər siqnallardan uğurla ayıra bilir. Gərginliyə həssas boyalardan istifadə edərək, çoxlu vizual stimullara cavabların təsviri oyaq meymunların vizual korteksində aparılmışdır. Oriyentasiya və okulyar dominantlıq xəritələri, eləcə də oriyentasiya stimullarının indiyədək əlçatmaz retinotopik təsviri də daxil olmaqla bir çox kortikal təsvirlər yalnız 10 saniyəlik görüntüləmə zamanı adi üsullarla əldə ediləndən təxminən iki böyüklük daha sürətli çıxarıldı. Yanaşma olduqca ümumi olduğundan, digər görüntüləmə üsulları da eyni stimullaşdırma protokolundan faydalana bilər. Beləliklə, bu metodologiya meymunlarda, gəmiricilərdə və digər növlərdə əvvəllər mümkün olmayan çox yönlülük və sürətlə sürətli optik təsvir tədqiqatlarını asanlaşdıra bilər. (C) 2013 Elsevier Inc tərəfindən nəşr edilmişdir.

MƏQSƏD VƏ MƏQSƏD: Retinal Funksiya Görüntüleyicisi (RFI) (Optik Imaging Ltd., Rehovot, İsrail) retinal qan axınının sürətini qeyri-invaziv şəkildə ölçür. Müəlliflər bu ölçmələrin təkrarlanma qabiliyyətini öyrənmiş və onlara fizioloji komponentlərin təsirini qiymətləndirmişlər. XƏSTƏLƏR VƏ METODLAR: Retinal patologiyası olmayan 67 nəfər işə götürüldü. Sürətin təkrar istehsalı təkrar RFI ölçmələrinin müqayisəsi ilə təsdiq edilmişdir. Sürətin fizioloji parametrlərlə əlaqəsi qarışıq xətti və Qauss modelləri ilə qiymətləndirilmişdir. NƏTİCƏLƏR: Orta sürət arterial 4,2 +/- 0,9 mm/san və venoz 3,3 +/- 0,8 mm/san olmuşdur. Dəyişkənlik 7,5% +/- 3,7%, siniflərarası korrelyasiya əmsalı r = 0,744 idi. 40 yaşdan sonra venoz sürət azalıb (hər onillikdə 0,32 mm/san, P <.01). Orta arterial təzyiq artdıqca arterial sürət artdı (10 mm Hg-ə 0,25 mm/san, P <.01). Sürətlər və ürək dərəcəsi arasında da müsbət əlaqə var idi (arteriyalar: 10 vuruşda 0,21 mm/san, P <.05 damarlar: 10 vuruşda 0,22 mm/san, P <.01). NƏTİCƏ: RFI retinal sürətləri qiymətləndirmək üçün təkrarlana bilən, qeyri-invaziv texnika təmin edir.

MƏQSƏD. İntravitreal bevasizumabın (Avastin) retinal qan axınının sürətinə qısamüddətli təsirini öyrənmək və onları optik koherens tomoqrafiya (OKT) və görmə kəskinliyi testləri ilə qiymətləndirilən klinik nəticələrlə müqayisə etmək. ÜSULLAR. Retina Funksiya Görüntüleyicisi (RFI) retinal qan axınının sürətini ölçmək üçün qeyri-invaziv və kəmiyyətcə istifadə edilmişdir. Bu tədqiqata xoroidal neovaskulyarizasiya (CNV) üçün Avastin intravitreal enjeksiyonu alan səkkiz xəstə daxil edilmişdir. Hamısı RFI preinjection və enjeksiyondan 1 və 7 gün sonra təsvir edilmişdir. Görmə kəskinliyi (VA) və OKT enjeksiyondan əvvəl və enjeksiyondan 1 ay sonra qeydə alınıb. Müqayisələr qoşalaşmış Student t testindən və Spearman rütbə testindən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir. NƏTİCƏLƏR. VA və OCT ölçmələrində 1 aylıq dəyişiklik və qan axını sürətində yaranan qısamüddətli dəyişiklik arasında yaxşı korrelyasiya tapıldı. Enjeksiyondan 1 gün sonra arterial və venoz sürət dəyişikliyi VA dəyişməsi ilə əlaqələndirilir (p.

Hemodinamikaya əsaslanan funksional görüntüləmədə istifadə olunan siqnalları dəstəkləmək üçün damar reaksiyasının məkan-zaman dinamikası haqqında hərtərəfli məlumat lazımdır. Bu yaxınlarda göstərilmişdir ki, qırmızı qan hüceyrələrinin (RBCs) sürəti və onun dəyişiklikləri korteksdə daxili udma dəyişikliklərinin geniş sahəli optik görüntüləmə qeydlərindən çıxarıla bilər. Burada, kortikal şəbəkələrdə etibarlı RBC sürətinin qiymətləndirilməsi üçün tam bir emal iş axını təsvir edirik. Bir neçə ilkin emal addımları həyata keçirilir: damarların kiçik hərəkətlərini düzəltmək üçün zəruri olan təsvirin birgə qeydiyyatı, sürətli və təkrarlana bilən damar seçimi üçün yarı avtomatik təsvirin seqmentasiyası, hər bir mikro damar üçün RBC traektoriya nümunələrinin yenidən qurulması və məkan-zaman İstənilən məlumat xüsusiyyətlərini artırmaq üçün filtrləmə. Əsas təhlil mərhələsi qırmızı qan hüceyrələrinin sürət sahəsini qiymətləndirmək üçün iki etibarlı alqoritmdən ibarətdir. Gəminin diametri və onun dəyişiklikləri də təxmin edilir, həmçinin arxaya səpələnmiş işıq intensivliyində yerli dəyişikliklər. Bu tam emal zənciri sərbəst paylanan proqram dəsti ilə həyata keçirilir. Proqram in vivo optik görüntüləmə ilə əldə edilən çox böyük məlumat dəstlərini idarə etmək üçün səmərəli məlumat idarəetməsindən istifadə edir. O, məlumat və nəticələri göstərmək və araşdırmaq üçün vizuallaşdırma vasitələri ilə tam və istifadəçi dostu qrafik istifadəçi interfeysi təklif edir. Verilənlərin bir neçə xarakteristikasına görə alqoritmin performansını optimallaşdırmaq üçün tam məlumat simulyasiyası çərçivəsi də təmin edilmişdir. Biz in vivo məlumatların üç fərqli vəziyyətində metodumuzun performansını təsvir edirik. Əvvəlcə anesteziya edilmiş siçovulların somato-sensor korteksində yayılan depressiyanın yaratdığı kütləvi RBC sürət reaksiyasını sənədləşdiririk. İkincisi, anesteziya edilmiş pişiklərin vizual korteksində vizual stimullaşdırmanın yaratdığı sürət reaksiyasını göstəririk. Nəhayət, ilk dəfə olaraq oyaq meymun ekstrastriat korteksindəki geniş damar şəbəkəsində RBC sürət reaksiyalarını vizual olaraq oyatdıq. (C) 2011 E

Məqsəd: Diabetik retinopatiya ilə bağlı heç bir morfoloji dəyişikliyi olmayan erkən şəkərli diabet (DM) xəstələrinin kiçik damarlarında retinal qan axınının sürətini nəzarət qrupunda olanlarla müqayisə etmək. Metodlar: Müəlliflər eyni vaxtda bir çox kiçik damarlardan qan axınının sürətini ölçmək üçün torlu qişa funksiyasının görüntüləyicisindən istifadə ediblər. Erkən DM olan 14 xəstənin 23 gözü və 31 sağlam subyektin 51 gözü daxil edilmişdir. Xəstələr və nəzarət qrupu arasındakı fərqlər qarışıq xətti modellərlə qiymətləndirilmişdir. Nəticələr: Sağlam insanlarla müqayisədə DM qrupunda venoz orta sürət əhəmiyyətli dərəcədə artmışdır (3,8 +/- 1,2-yə qarşı 2,9 +/- 0,5 mm/saniyə, P <0,0001). DM xəstələrinin arterial sürəti də əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (4,7 +/- 1,7 ilə müqayisədə 4,1 +/- 0,9 mm/saniyə, P = 0,03). Yaş, cins, ürək dərəcəsi və sistolik qan təzyiqində qruplar arasında statistik əhəmiyyətli fərq yox idi. DM olan xəstələrdə diastolik qan təzyiqi sağlam qrupdan daha aşağı idi (P = 0,03). Nəticə: Diabetik retinopatiya olmayan erkən DM olan xəstələrdə arterial və venoz retinal qan axınının sürətində artım müşahidə edilmişdir. Bu tapıntılar struktur dəyişikliklərinin inkişafından əvvəl diabetik gözlərdə damar funksiyasında anormallıqların mövcud olduğu fikrini dəstəkləyir. Bu qeyri-invaziv yanaşma erkən hemodinamik anormallıqların qiymətləndirilməsini asanlaşdırdı və skrininq və monitorinqdə kömək edə bilər. RETİNA 32:112-119, 2012

Bir çox növlərin neokorteksinin 2 və 3-cü təbəqələrindəki piramidal hüceyrələr kollektiv şəkildə yanal aksonal proyeksiyaların çoxluqlu sistemini əmələ gətirir (səthi yamaq sistemi-Lund JS, Angelucci A, Bressloff PC. 2003. Makaka meymununun ilkin vizual korteksindəki funksional sütunlar üçün anatomik substratlar Cereb Cortex. 13:15-24. və ya papatya memarlığı-Douglas RJ, Martin KAC. 2004. Neuronal circuits of neocortex. Annu Rev Neurosci. 27:419-451.), lakin bu ümumi xüsusiyyətin yerinə yetirdiyi funksiya kortikal memarlıq qaranlıq olaraq qalır. Etiketli yamaqların məkan konfiqurasiyasını sürüklənən ızgara stimullarına cavabların konfiqurasiyası ilə müqayisə edərək, həm yamaq sisteminin, həm də kortikal reaksiyanın məkan təşkilatlarının pişik və meymun ilkin vizual korteksi arasında yüksək dərəcədə qorunduğunu gördük. Daha da əhəmiyyətlisi, səthi yamaq sisteminin konfiqurasiyası meymunun ilkin vizual korteksində funksiyaların düzülüşündə birbaşa əks olunur. Nəticələrimiz səthi yamaq sisteminin strukturu ilə vizual korteksin səthi boyunca vahid bir dəyəri kodlayan kortikal reaksiyalar arasında sıx əlaqə olduğunu göstərir (öz-özünə ardıcıl vəziyyətlər). Bu əlaqə davam edən kortikal fəaliyyət zamanı oriyentasiya reaksiyasına bənzər fəaliyyət nümunələrinin kortəbii ortaya çıxması ilə uyğun gəlir (Kenet T, Bibitchkov D, Tsodyks M, Grinvald A, Arieli A. 2003. Vizual atributların kortikal təmsilləri. Təbiət. 425:954). -956.). Biz belə nəticəyə gəlirik ki, səthi yamaq sistemi öz-özünə ardıcıl kortikal vəziyyətlərin fiziki kodlaşdırılmasıdır və eyni vaxtda etiketlənmiş yamaqlar dəsti kortikal girişin qarşılıqlı ardıcıl təmsilləri şəbəkəsində iştirak edir.

Yerli yanıb-sönən və hərəkət edən stimullara cavab olaraq vizual korteksin bir neçə millimetrində fəaliyyət dinamikasının əsas qeyri-xətti xüsusiyyətlərini özündə cəmləşdirən sinir sahəsi modeli təqdim olunur. Biz yüksək məkan-zaman ayırdetmədə mezoskopik populyasiya aktivliyini bildirən gərginliyə həssas boya (VSD) görüntüləməsi ilə əldə edilmiş fizioloji məlumatları nəzərə alırıq. Stimulyasiyaya tək parlayan kvadrat, tək parlayan çubuq, xətt-hərəkət paradiqması daxil idi - bunun üçün psixofiziki tədqiqatlar göstərdi ki, çubuqdan əvvəl kvadratın qısa müddət ərzində yanıb-sönməsi çubuqda illüziya hərəkəti hissi yaradır - və hərəkət edən kvadratlara nəzarət. Biz qeyri-xətti inteqro-diferensial tənliklərin birləşdirilmiş sistemi kimi neyronların həyəcanverici və tormozlayıcı təbəqəsini təsvir edən iki qatlı sinir sahəsi (NF) modelini nəzərdən keçiririk. Hər iki təbəqənin məcmu fəaliyyətinin VSD təsviri ilə əks olunduğu fərziyyəsi altında, bizim fenomenoloji modelimiz müşahidə olunan məkan-zaman fəaliyyət nümunələrini kəmiyyətcə hesablayır. Üstəlik, model müxtəlif sürətlə hərəkət edən kvadratların yaratdığı fəaliyyətə uyğunlaşdığı üçün oxşar stimulları ümumiləşdirir. Nəticələrimiz göstərir ki, xəyali xətt-hərəkət paradiqması vəziyyətində hərəkət nümunələri yaratmaq üçün daha yüksək beyin bölgələrindən rəy tələb olunmur. Modelin fizioloji təfsiri, VSD siqnalının əhəmiyyətli bir hissəsinin inhibitor fəaliyyətlə bağlı ola biləcəyini göstərir, bu, inhibitor və həyəcanverici populyasiyalar arasında balanslaşdırılmış təbəqədaxili kortikal qarşılıqlı əlaqənin erkən vizual korteksdə dinamik stimul təmsillərinin formalaşmasında böyük rol oynadığı fikrini dəstəkləyir. .

Məqsəd: Bu tədqiqatın məqsədi diabetli xəstələrin və sağlam nəzarət subyektlərinin retinal qan axınının sürətlərini müqayisə etmək idi. Biz retinal funksiyanın qeyri-invaziv diaqnostikasını təklif edən yeni cihazdan istifadə etdik. Metodlar: Noproliferativ diabetik retinopatiyası olan 42 xəstənin 58 gözündə və 32 normal subyektin 51 gözündə tor qişanın arteriolları və venulalarında axın sürətləri tor qişa funksiyasının görüntüləyicisi vasitəsilə kəmiyyətcə təhlil edilmişdir. Qrup fərqləri qarışıq model effekti ilə qiymətləndirilmişdir. Nəticələr: Arterial bölmələrdə orta sürət (mm/s) diabetik qrup üçün 3,74 +/- 1,09 və nəzarət subyektləri üçün 4,19 +/- 0,99 olmuşdur. Bütün seqmentlərin orta sürəti, əlaqəli ürək dərəcəsi və fərdi seqment genişlikləri nəzərə alınmaqla, diabetik qrupda 17% daha yavaş olmuşdur (P <0.0001). Hər iki qrupda venoz bölmənin orta sürəti arterial sürətdən aşağı olmuşdur (diabet qrupu üçün 2,61 +/- 0,65, nəzarət subyektləri üçün 3,03 +/- 0,59). Ürək dərəcəsi və seqment genişlikləri nəzərə alınmaqla fərdi damar sürətləri diabetik qrupda orta hesabla 17% daha yavaş olmuşdur (P <0.0001). Nəticə: Ölçməmiz sağlam nəzarət subyektləri ilə müqayisədə diabetli xəstələrin retinal arteriollarında və venulalarında axın sürətlərinin əhəmiyyətli dərəcədə azaldığını göstərdi ki, bu da qeyri-proliferativ diabetik retinopatiya olan gözlərdə anormal damar funksiyasının görünüşünü dəstəkləyir. RETİNA 30:765-773, 2010

İlkin vizual sahələrdə hər hansı yerli giriş əvvəlcə üfüqi bağlantılar vasitəsilə ötürülür və ətraf mühitin yayılması ilə keçici fəaliyyət zirvəsinə səbəb olur. Stimul hərəkət etməyə başlayanda bu ssenari necə dəyişir? Psixofiziki təcrübələr göstərir ki, qıcıqlanma tarixindən asılı olaraq stasionar parlayan və hərəkət edən obyektlər üçün lokalizasiya fərqlidir. Biz burada ardıcıl olaraq təqdim olunan stimulların kortikal aktivləşdirmə dinamikasını necə dəyişdirdiyini nümayiş etdiririk. Gərginliyə həssas boyadan istifadə edərək elektrofizioloji və optik qeydlərin kombinasiyası nəticəsində belə nəticəyə gəlirik ki, sub-həssas yayılma fəaliyyəti talamik girişdən çox irəlidə olan kortikal bölgələri əvvəlcədən aktivləşdirir. Belə bir gözlənilən mexanizm insan psixofizikasında flaş-lag effekti və xətt-hərəkət illüziyası üçün müşahidə edildiyi kimi qəbul edilən mövqenin dəyişməsinə kömək edə bilər.

Oyanış mürəkkəb orqanizmlərin qabiliyyətlərini açıq şəkildə dəyişdirir. EEG və LFP ölçmələrində göründüyü kimi kortikal fəaliyyətdə tipik dəyişikliklər oyanma vəziyyətindəki dəyişiklik ilə əlaqəli olsa da, bu cür dövlətdən asılı fəaliyyətin konstitusiyasında qabiliyyətin bu dərin inkişafını təmin edən şey aydın deyil. Oyanışın kortikal fəaliyyəti məlumatı təmsil etmək üçün daha uyğun hala gətirərək modullaşdırdığı fərziyyəsini irəli sürdük. Biz iddia edirik ki, təmsil qabiliyyəti ikili xarakter daşıyır - bu, təkcə kortikal toxumanın mürəkkəb fəaliyyət (yəni, məkan-zaman neyron hadisələri) yaratmasını deyil, həm də kompleks kortikal fəaliyyət məkanını (bu cür məkan-zaman hadisələrindən ibarətdir) tələb edir. Biz izah edirik ki, mürəkkəblik-homologiya-topoloji anlayışı neyron fəaliyyət fəzalarının mürəkkəbliyinin müvafiq ölçüsüdür, çünki homoloji struktur təkcə əsas fəaliyyətin mahiyyətcə qruplaşma dərəcəsini deyil, həm də bu cür hərəkətlərin yaratdığı konfiqurasiyaların effektiv ölçüsünü qeyd edir. klasterlər. Kortikal fəaliyyət boşluqlarının strukturunda bu cür dəyişikliklər oyanmanın yaratdığı qavrayış/davranış fərqlərini yaratmaq qabiliyyətinin əsası kimi xidmət edə bilər. Bu fikirlərin mümkünlüyünü göstərmək üçün, fərqli həyəcan vəziyyətlərində primatın vizual korteksindən əldə edilən gərginliyə həssas boya görüntüləmə (VSDI) məlumatlarını təhlil etdik. Nəticələrimiz nəzəriyyəyə bir qədər dəstək verir: əvvəlcə oyanma artdıqca fəaliyyətin mürəkkəbliyi də artdı (bu, VSDI filmlərinin mürəkkəbliyidir). Üstəlik, davamlı homologiya ilə ölçülən fəaliyyət məkanının strukturunun mürəkkəbliyi (yəni VSDI film məkanı) - mürəkkəbliyin çox miqyaslı topoloji ölçüsü - həyəcanla da artdı.

Retinal Function Imager (RFI Optical Imaging, Rehovot, İsrail) retinal qan axınının sürəti, oksimetrik vəziyyət və fotik aktivləşdirməyə metabolik reaksiyalar kimi hemodinamik parametrləri birbaşa ölçən unikal, qeyri-invaziv multiparametrli funksional görüntüləmə alətidir. Bundan əlavə, heç bir kontrast agenti olmadan kapilyar perfuziya xəritəsini tərtib etməyə imkan verir. Retinal funksiyanın bu parametrləri retinal anomaliyalarla pozulur. Bu baxış bu parametrlərin inkişafını təsvir edir və bir neçə üsulda retinal funksiyanın qeyri-invaziv aşkarlanması üçün onların klinik tətbiqi imkanlarını nümayiş etdirir. Nəticələr torlu qişa xəstəliklərinin erkən diaqnostikası və onların müalicəsinin mümkün kritik rəhbərliyi üçün çoxsaylı klinik tətbiqləri təklif edir.

Müxtəlif texnologiyalar, o cümlədən optik təsvir üsulları, f-MRT, PET və digərləri ilə əldə edilən funksional xəritələr damar nümunələri və ya böyük parenxima yamaqları kimi bioloji artefaktlarla çirklənə bilər. Bu artefaktlar əsasən mikrosirkulyasiyada ya aktivliyə bağlı həcmdə dəyişikliklər nəticəsində, ya da neyron fəaliyyəti ilə birlikdə lokallaşdırılmayan oksimetrik dəyişikliklər nəticəsində yaranır. Standart üsullar həmişə belə artefaktları azaltmaq üçün kifayət etmir, bu halda nəzərə çarpan məkan artefaktları əsas fəaliyyət nümunələrinin təfərrüatlarını gizlədir. Burada biz yüksək rezolyusiyaya malik funksional xəritələri çirkləndirən məkan bioloji artefaktları effektiv şəkildə aradan qaldıran sadə alqoritm təklif edirik. Biz bu proseduru gərginliyə həssas boya siqnallarına və ya daxili siqnallara əsaslanan optik görüntüləmə nəticəsində yaranan kortikal xəritələrə tətbiq etməklə təsdiq etdik. Damar məkan nümunələrini aradan qaldırmaq üçün ilk növbədə stimullaşdırma olmadan əldə edilmiş ilkin məlumatlardan əldə edilən prinsipial komponentlərdən istifadə edərək, tipik artefaktların (damar/ürək pulsasiyası/vasomotion) şablonunu yaratdıq. Sonra, çirklənmiş məlumatlar və artefakt şablonu arasında qonşuluq oxşarlığını ölçməklə və sonra oxşarlığı ləğv etməklə əldə edilən yerli oxşarlığın minimuma endirilməsi (LSM) vasitəsilə bu şablonu dəyişdirdik. Beləliklə, LSM, kapilyar parenximanın böyük sahələri də daxil olmaqla, kortikal damar komponentlərindən yaranan məkan nümunələrini aradan qaldırdı və bu damar artefaktları tərəfindən başqa şəkildə maskalanan neyron fəaliyyət nümunələrinin təfərrüatlarını açmağa kömək etdi. Anesteziya edilmiş pişiklər və davranan meymunlarla görüntüləmə təcrübəmizdən əldə etdiyimiz nümunələr göstərdi ki, LSM metodu həm ümumi, həm də təkrarlana bilir və çox vaxt digər mövcud prosedurlardan üstündür. (C) 2008 Elsevier B.V. Bütün hüquqlar qorunur.

Neokorteksdə oxşar reaksiya xüsusiyyətlərinə malik neyronlar tez-tez sütuna bənzər strukturlarda birləşərək funksional arxitektura kimi tanınan şeyə səbəb olur - müxtəlif stimul xüsusiyyətlərinin ölçülərinin kortikal təbəqə üzərində xəritələşdirilməsi. Ən azı qismən, biz bu tapıntıya son iki nəsildə mövcud olan, aktiv neyronların məkan təşkili haqqında məlumat verməklə nevrologiyada inqilab edən həm ölümdən sonra, həm də in-vivo bir neçə funksional beyin təsviri texnikasının mövcudluğuna borcluyuq. beyin. Burada biz bu cür funksional arxitekturaya dair anlayışımızın həmin funksional görüntüləmə metodologiyalarının inkişafı ilə, xüsusən də neyron fəaliyyətini birbaşa elektrik aktivliyinin ölçülməsi ilə deyil, metabolik və ya hemodinamik siqnallar vasitəsilə dolayı şəkildə təsvir edənlərlə necə əlaqəli olduğuna diqqət yetiririk. Bu yanaşmalardan bəziləri funksional arxitekturanı digərlərinə nisbətən daha yüksək məkan ayırdında araşdırmağa imkan verir. Xüsusilə, daxili siqnalların optik təsviri 50 m m-ə yaxın heyrətamiz detallara çatır və digər metodologiyalarla birlikdə, həssas neyronların aktivliyi ilə yaranan metabolik və hemodinamik reaksiyaları xarakterizə etməyə imkan verdi. Burada biz neyrovaskulyar birləşmənin məkan-zaman xüsusiyyətləri ilə bağlı həmin tapıntıları nəzərdən keçiririk və onların funksional beyin görüntüləməsi, o cümlədən mövqe emissiyası tomoqrafiyası və insan beyninə də tətbiq olunan funksional maqnit rezonans görüntüləmə kimi qeyri-invaziv neyroimaging üsulları üçün təsirlərini müzakirə edirik.

Qəbuledici sahənin "tərs" sahəsi haqqında çox az şey məlumdur - elektrik fəaliyyətinin məkan-zaman modelinə müəyyən bir həssas stimul təsir edən kortikal məkan bölgəsi. Biz bu aktivləşdirilmiş sahəyə kortikal cavab sahəsi kimi müraciət edirik, onun xassələri tədqiq edilməmiş qalır. Burada gərginliyə həssas boyalardan istifadə edərək kiçik, yerli sürüşməyə yönəlmiş ızgaralar tərəfindən vizual korteksdə yaranan kortikal reaksiya sahələrinin dinamikası tədqiq edilmişdir. Biz gördük ki, kortikal reaksiya sahəsi tez-tez fəaliyyət platosu ilə xarakterizə olunur, onun hüdudlarından kənarda fəaliyyət sürətlə azalır. Plato halqasının yeri əsasən stimul oriyentasiyasından asılı deyildi. Bununla belə, yaylanın başlanğıcından təxminən 20 ms sonra onun üzərində 1-3 zirvə meydana çıxdı və 25 ms üçün gücləndirildi. Spiking, yeri stimul oriyentasiyasından çox asılı olan pik zonalarla məhdudlaşdı.Beləliklə, məkan baxımından məhdudlaşdırılmış həddən yuxarı reaksiyanın seçici gücləndirilməsi ilə yanaşı, eşikdən bir qədər aşağıya qədər daha geniş aktivləşmə cari stimulun dəqiq müəyyən edilmiş retinotopik yaxınlığında bütün oriyentasiya sahələrini əhatə edir və korteksi sonrakı stimulların işlənməsi üçün hazırlayır.

Onurğalı beynində xarici stimullar tez-tez kortikal səthdə paylanmış fərqli funksional sahələrdə təmsil olunur. Əhali aktivliyinin nümunələrini ölçmək üçün istifadə edilən sürətli görüntüləmə üsulları çoxlu piksel və çoxlu kadrlar, yəni yüksək ölçülü məlumat dəstləri olan filmləri qeyd edir. Burada biz nümayiş etdiririk ki, əsas komponent analizi (PCA) və ardınca məkan müstəqil komponent analizi (sICA), siçanların qoxu ampulündə və somatosensor korteksində, eləcə də meymunların vizual korteksində qeydə alınan məlumat dəstlərinin ölçüsünü azaltmaq üçün istifadə edilə bilər. stimula xas cavabları itirmədən. Fərqli neyron populyasiyaları, stimulun spesifik məkan-zaman aktivləşməsinə əsasən ayrılır. Həm məkan, həm də müvəqqəti reaksiya xüsusiyyətləri eyni vaxtda obyektiv olaraq əldə edilə bilər. Olfaktör lampada müxtəlif cavab gecikmələri olan glomeruli qrupları müəyyən edilə bilər. Bu, kalsiuma həssas akson izləyicisi ilə ölçülən qoxu reseptor neyron girişinin qeydləri və gərginliyə həssas RH 1838 boyası ilə ölçülən şəbəkə dinamikası üçün göstərilir. Somatosensor korteksdə tək bığların stimullaşdırılmasına cavab verən çəlləklər avtomatik aşkarlana bilər. Vizual korteksdə oriyentasiya sütunları çıxarıla bilər. Bütün hallarda hərəkət, ürək döyüntüsü və ya tənəffüslə bağlı artefaktlar sICA tərəfindən funksional siqnaldan ayrıldı və məlumat dəstindən çıxarıla bildi. Buna görə də PCA-dan sonra sICA yüksək məkan və zaman ayırdetmə ilə toplanmış əhalinin fəaliyyətinin görüntüləmə məlumatlarının məlumatların sıxılması, qərəzsiz təhlili və parçalanması üçün güclü bir texnikadır. (c) 2006 Elsevier Inc. Bütün hüquqlar qorunur.

Optik görüntüləmə, pozitron emissiya tomoqrafiyası və funksional maqnit rezonans görüntüləmə (fMRI) hamısı neyronların təsvirinə damar reaksiyalarına əsaslanır. Baxmayaraq ki, bu təsvir üsulları funksional beyin xəritələşdirilməsi üçün uğurla istifadə olunur, müxtəlif mikrovaskulyar bölmələrdə hemodinamik hadisələrin təfərrüatlı məkan-zaman dinamikası naməlum olaraq qalır. Burada müxtəlif kortikal mikrovaskulyar bölmələrdə hissiyyatdan qaynaqlanan beyin qan həcminin (CBV) dəyişikliklərini seçici şəkildə araşdırmaq üçün anesteziya edilmiş pişiklərin 18-ci sahəsində yüksək keyfiyyətli optik görüntüləmədən istifadə etdik. Hematokrit və oksimetriya dəyişikliklərinin çaşdırıcı təsirlərinin qarşısını almaq üçün biz yeni flüoresan qan plazması izləyicisi hazırladıq və istifadə etdik və bu ölçmələri hemoglobin üçün (565 nm) yaxın izosbestik dalğa uzunluğunda daxili siqnalların optik təsviri ilə birləşdirdik. Damar reaksiyası arteriollar səviyyəsində başladı, sürətlə kapilyarlara və venulalara doğru yayıldı. Daha böyük damarlar geridə qaldı. Kapilyarlarda qan həcmində aydın dəyişikliklər müşahidə edilir. Arteriollar və arteriyalar ən böyük reaksiyaya malikdir, venoz reaksiya isə ən kiçik idi. Bölmə-xüsusi oksigen gərginliyi dinamikası haqqında məlumat 605 nm işıqlandırmadan istifadə edərək görüntüləmə seanslarında əldə edilmişdir, dalğa uzunluğu əsasən oksimetrik dəyişiklikləri əks etdirir və beləliklə, CBV dəyişikliklərindən daha çox elektrik aktivliyi ilə bağlıdır. Bu görüntülər köklü şəkildə fərqli idi: cavab parenxima səviyyəsində başladı, sonra isə digər mikrovaskulyar bölmələr izlədi. Bu nəticələrin fMRI cavablarının modelləşdirilməsi üçün təsirləri var (məsələn, şar modeli). Bundan əlavə, kapilyar CBV cavabının görüntülənməsi ilə əldə edilən funksional xəritələr bu iki hemodinamik prosesin altında yatan müxtəlif tənzimləyici mexanizmlərin mövcudluğunu nəzərdə tutan erkən oksimetrik siqnaldan istifadə etməklə əldə edilənlərə oxşar idi, lakin eyni deyildi.

Kortikal xəritələr və əks əlaqə əlaqələri görmə beyin qabığının hər yerdə mövcud xüsusiyyətləridir. Bununla belə, əks əlaqə əlaqələrinin rolu aydın deyil. Bu tədqiqat V2 sahəsindən əks əlaqə proqnozları ilə V1 sahəsində oriyentasiya və retinotopiyanın funksional xəritələri arasında mümkün təşkilati əlaqələri aşkar etmək məqsədi daşıyırdı. Daxili siqnalların optik təsviri bayquş meymunlarında sitoxrom oksidaz histokimyası və əlaqə anatomiyası ilə birləşdirildi. Tracer inyeksiyaları bu zolaqlar arasındakı sərhədə bitişik solğun və qalın sitoxrom oksidaz zolaqlarının bölgələrində oriyentasiya-selektiv domenlərdə tətbiq edilmişdir. V2-dən geribildirim proqnozlarının V1 daxilindəki daxili üfüqi əlaqələrdən daha diffuz olduğu aşkar edildi, lakin buna baxmayaraq, onlar çoxluq nümayiş etdirdilər. Əks əlaqə aksonlarının klasterləri daha çox interblob sitoxrom oksidaz bölgələrinə proqnozlaşdırılır. V1-də alıcı domenlərinin üstünlük verilən istiqamətlərinin paylanması geniş idi, lakin V2-də proyeksiya edən hüceyrələrin üstünlük verilən oriyentasiyasına oxşar dəyərlərə qarşı qərəzli görünürdü. V1-də əks əlaqə proqnozlarının qlobal məkan paylanması anizotrop idi. Anizotropiyanın əsas oxu sistematik olaraq V2-də mənşəli hüceyrələrin üstünlük verilən oriyentasiyasına uyğun olaraq V1-də retinotopik oxa paralel idi. Belə nəticəyə gəldik ki, V2-dən V1-ə əks əlaqə əlaqələri V1-də kollinear kontur elementlərinə reaksiyanın artırılmasında rol oynaya bilər.

Korluğun müalicəsində irəliləyiş xəstəliyin erkən aşkarlanması, izlənilməsi və müalicəsini təmin edən yeni texnologiyaların inkişafından asılıdır. Müəlliflər dörd parametrin birbaşa, qeyri-invaziv təsvirini təsvir edirlər: qan axını, qan oksimetriyası, metabolik vəziyyət və gizli damar sistemi, xüsusən də kapilyarlar. Bunlar tor qişanın xəstəlikləri nəticəsində pozulduğu bilinən retinanın funksional parametrləridir. Yeni Retinal Funksiya Görüntüleyicisi (Optical Imaging, Ltd., Rehovot, İsrail) bütün dörd parametri tor qişanın səthi üzərində daxili əksetmə intensivliyi fərqləri kimi təsvir edə bilər. Son 2 onillikdə kiçik optik siqnalların təsviri neokorteksdə yüksək ayırdetməli funksional xəritəçəkmə üçün güclü bir vasitə olmuşdur. Bu məqalədə: bu texnologiya retinaya tətbiq edilir və bir çox üsullarda tor qişa funksiyasının qeyri-invaziv müayinəsi üçün ümumi aləti nümayiş etdirir. Anatomik nəticələr yaranmazdan əvvəl funksional dəyişikliklərin təsviri torlu qişa xəstəliyinin erkən diaqnostikası və müalicəsi üçün güclü bir vasitə kimi vəd edir.

Bu fəsil göstərir ki, tək neyronların kortəbii atəşi onların yerləşdiyi kortikal şəbəkələrlə sıx bağlıdır. Şəbəkə ideyası nəzəri beyin tədqiqatında mərkəzi konsepsiyadır və nəhayət, kortikal şəbəkələri və onların vəziyyətlərini yüksək məkan-zaman ayırdetmə qabiliyyəti ilə birbaşa görüntüləmək mümkündür.

Son bir neçə onillikdə nevroloqlar geniş məkan və müvəqqəti miqyasları əhatə edən bir çox güclü funksional görüntüləmə üsullarının yaranmasından faydalandılar. İndi biz hüceyrələrin diferensiasiyasına, böyüməsinə və ölümünə nəzarət edən tək hüceyrələr və onların neyritləri elektrik girişlərini emal edən və in vitro sinir hesablamalarını həyata keçirən neyron sxemləri və bütöv beyini təsvir edə bilərik. Hazırda gərginliyə həssas boyalara (VSDI) əsaslanan görüntüləmə canlı beyində neokortikal funksiyaların təsviri üçün ən yüksək məkan və zaman ayırdetmə qabiliyyətini təklif edir və kortikal dinamikanın funksional təsvirində yeni dövrə yol açmışdır. Bu, kortikal sütunun təməl səviyyəsində neokortikal inkişafın, funksiyanın və plastikliyin əsasını təşkil edən əsas mexanizmlərin tədqiqini asanlaşdırdı.

Yüksək dəqiqlikli funksional beyin xəritələşdirilməsinin son məqsədi diferensial görüntüləmə (iki "stimul xəritəsi"ni müqayisə etməklə) deyil, tək şərtdir (stimul və stimulsuz xəritələr), çünki müvafiq ("ortoqonal") stimullar nadir hallarda mövcuddur. Bu, yüksək keyfiyyətli funksional bir şərtli xəritələr əldə etmək üçün əvvəllər göstərilən deoksihemoqlobinin erkən artımı kimi elektrik aktivliyi ilə yaxından əlaqələndirmək üçün fəaliyyətdən asılı olan hemodinamik siqnalların bəzi komponentlərini tələb edir. Əksinə, beyin qan həcminə (CBV) əsaslanan tək vəziyyət xəritələrində yerli olmayan damar reaksiyaları üstünlük təşkil edir. Diferensial CBV xəritələri əsasən parenxima ilə məhdudlaşır, bu da CBV reaksiyasının bir hissəsinin incə məkan miqyasında elektrik aktivliyi ilə birgə lokallaşdırıldığını göstərir. Səth damarlarının aktivləşdirilməsini optik görüntüləmə məlumatlarından silməklə, biz incə məkan miqyasında tənzimlənən və 100 ana ayırdetmə qabiliyyətinə bənzər tək şərtli xəritələr verən kapilyar CBV reaksiya komponentinin mövcudluğunu sənədləşdiririk. Kapilyar reaksiya komponentinin seçici şəkildə təsvir edilməsi şərti ilə, sütun səviyyəsində qan həcmi və axını əsaslı tək şərtli funksional xəritələşdirmə mümkün olmalıdır.

Vizual illüziyaları araşdırmaq kortikal emalın əsas prinsiplərini ortaya qoyur. Hərəkət etməyən stimulların illüziyalı hərəkət qavrayışı təxminən bir əsr əvvəl Gestalt psixoloqları tərəfindən təsvir edilmişdir(1,2). Bununla belə, əsas neyron mexanizmləri naməlum olaraq qalır. 'Hətti hərəkət' illüziyasının (3) altında yatan kortikal mexanizmləri araşdırmaq üçün biz həddən artıq fəaliyyətə yüksək həssas olan real vaxt optik görüntüləmədən (4-6) istifadə etdik. Biz anesteziya edilmiş pişiyin görmə qabığında beş stimula reaksiyaları araşdırdıq: stasionar kiçik kvadrat və uzun çubuq, hərəkət edən kvadrat, çəkilmiş çubuq və məşhur xətt-hərəkət illüziyası(3), qısaca əvvəl stasionar kvadrat. uzun stasionar bar təqdimatı. Çubuğun tək başına yanıb-sönməsi gözlənilən lokallaşdırılmış, qısa gecikmə və yüksək amplitudalı fəaliyyət nümunələrini (7,8) oyatdığı halda, bir çubuqdan 60 - 100 ms əvvəl kvadrat təqdim edərək sürətli hərəkətə bənzər dinamik fəaliyyət nümunələri yaradır. Əvvəlki kvadrat, fiziki cəhətdən hərəkət etməsə də, bu sahədə real hərəkətin kortikal təsvirlərindən fərqlənmədiyi üçün illüziya hərəkətinə kömək etməli olan asta-asta kortikal fəaliyyətin tədricən yayılmasını yaratdı. Bu tapıntılar eşikaltı sinaptik potensialların məkan-zaman modellərinin kortikal emal və qavrayışın formalaşmasına təsirini nümayiş etdirir.

Gəmiricinin ilkin somatosensor korteksi həm anesteziya altında, həm də sakit oyaqlıq zamanı sakit hiperpolarizasiya dövrləri (AŞAĞI vəziyyətlər) ilə ayrılan yerli sinxron membran depolarizasiyası (UP vəziyyətləri) şəklində kortəbii olaraq aktivdir. İn vivo bütün hüceyrə qeydləri və tetrod vahidi qeydləri 2/3 təbəqədə fərdi piramidal neyronların fəaliyyətinin kortəbii depolarizasiyaların ansambl məkan-zaman dinamikası ilə əlaqəsini təhlil etmək üçün gərginliyə həssas boya təsviri ilə birləşdirildi. Bunlar ya qısa idi və barel sütununun bir sahəsinə lokallaşdırıldı və ya 2/3 təbəqədə yerli glutamaterjik sinaptik ötürülmədən asılı olaraq yayılan dalğalar kimi meydana gəldi. Kortəbii fəaliyyət, hissiyyatdan qaynaqlanan postsinaptik potensialların və fəaliyyət potensiallarının böyük sınaqdan sınaq dəyişkənliyini demək olar ki, tamamilə nəzərə alaraq, bığların əyilməsi ilə yaranan həssas reaksiyaları maneə törətdi. Kortikal sahə kortəbii depolarizasiya edilərkən, eşik altındakı sensor sinaptik reaksiyalar daha kiçik, daha qısa və məkan baxımından daha məhdud idi. Təəccüblüdür ki, neyronların ərəfəyə daha yaxın olmasına baxmayaraq, spontan depolarizasiya zamanı bığların əyilmələri daha az fəaliyyət potensialı doğurdu. Davam edən kortəbii fəaliyyət beləliklə, 2/3 barrel korteksindəki həssas reaksiyanın amplitudasını və zamandan asılı yayılmasını tənzimləyir.

Spontan kortikal fəaliyyət - qəsdən duyğu girişi olmadıqda davam edən fəaliyyət - EEG (elektroensefaloqrafiya) (2-4) və gərginliyə həssas boya görüntüləmə (5-7) vasitəsilə qeydlərə qədər müxtəlif üsullardan istifadə etməklə geniş şəkildə öyrənilmişdir(1). tək neyronlardan (8,9). Davamlı kortikal fəaliyyətin inkişafda kritik rol oynadığı göstərilmişdir (10-14) və həmçinin sensor qavrayışın işlənməsi üçün vacib olmalıdır, çünki o, stimulun yaratdığı fəaliyyəti modullaşdırır (5,15,16) və davranışla əlaqələndirilir ( 17). Bununla belə, onun xarici məlumatların emalındakı rolu və duyğu atributlarının daxili təmsilləri ilə əlaqəsi naməlum olaraq qalır. Gərginliyə həssas boya görüntüləməsindən istifadə edərək, biz əvvəllər anesteziya edilmiş pişiklərin vizual korteksində davam edən fəaliyyət ilə tək bir neyronun kortəbii atəşi arasında sıx əlaqə qurduq(6). Burada bildiririk ki, bu cür fəaliyyət dinamik olaraq dəyişən kortikal vəziyyətlər toplusunu əhatə edir, onların çoxu oriyentasiya xəritələrinə yaxındır. Belə bir oriyentasiya vəziyyəti kortəbii olaraq yarandıqda, o, bir neçə hipersütunları əhatə edirdi və tez-tez proksimal oriyentasiyaya uyğun bir vəziyyət izlədi. Biz təklif edirik ki, kortikal vəziyyətlərin dinamik olaraq dəyişdirilməsi beynin daxili kontekstini təmsil edə bilər və buna görə də yaddaşı, qavrayışı və davranışı əks etdirir və ya təsir edir.

Sensor emal və onun qavranılması yerli məlumatın qlobal səviyyədə də mövcud olmasını tələb edir. Həqiqətən də, məməlilərin yeni korteksində yerli həyəcan 2/3-cü təbəqədəki uzun məsafəli üfüqi birləşmələr vasitəsilə böyük məsafələrə yayılır və həyəcanverici polisinaptik yollar da aktivləşərsə, bütün kortikal sahəyə yayıla bilər. Buna görə də, yerli həyəcan və ətrafdakı inhibə arasında tarazlıq tələb olunur. Burada biz uretanla anesteziya edilmiş siçovulların kortikal depolarizasiyasının və hiperpolarizasiyasının məkan-zaman aspektlərini araşdırırıq. Yeni gərginliyə həssas boyalar (VSDs) bığın əyilmələrinə və bığ yastığının dəri stimulyasiyalarına kortikal reaksiyaların yüksək dəqiqlikli real vaxt vizuallaşdırılması üçün istifadə edilmişdir. Bu irəliləyişlər davam edən fəaliyyətin təsvirini asanlaşdırdı və siqnalın orta hesablanması olmadan belə cavabları oyatdı. Tək bir bığının hərəkətinin bir və ya üç faza nümayiş etdirən kortikal reaksiyaya səbəb olduğunu gördük. Üç fazalı reaksiya zamanı əvvəlcə tək kortikal barel ölçüsündə kiçik bir kortikal bölgədə kortikal depolarizasiya baş verdi. Sonradan, bu depolarizasiya artdı və oval şəkildə yanal olaraq, daha çox barel sahəsinin sıraları boyunca yayıldı. İkinci fazada oyandırılmış reaksiyanın amplitudası, ehtimal ki, təkrarlanan inhibə səbəbindən sürətlə azaldı. Sonradan depolarizasiya reboundunu nümayiş etdirən üçüncü faza müşahidə edildi və aydın oldu və 16 Hz-ə bənzər salınımlar aşkar edildi. İkinci fazada ətraf mühitin xalis hiperpolyarizasiyasını aşkar edən stimul şəraiti də aşkar edilmişdir. Yeni, təkmilləşdirilmiş VSD istifadə edərək, mövcud tapıntılar inhibə və həyəcanın mürəkkəb məkan-zaman kortikal qarşılıqlı təsirinin məkan parametrlərinə yeni işıq salır.

Tək neyronların kortikal fəaliyyəti çox vaxt ya səs-küy kimi rədd edilir, ya da heç bir funksional əhəmiyyət daşımır və buna görə də nəzərə alınmır. Nəticələrimiz göstərir ki, bu cür anlayışlara yenidən baxılmalıdır. Sensor girişi olmadıqda, ilkin sensor sahədə neyron birləşmələrinin əlaqəli populyasiya fəaliyyətini araşdırdıq. Gərginliyə həssas boyalar (VSDI) əsasında real vaxt rejimində optik görüntüləmə sahəsində son nailiyyətlər əhalinin aktivliyini və onun fərdi kortikal neyronların fəaliyyəti ilə yaxın əlaqəsini araşdırmağa kömək etdi. İn vivo hüceyrədaxili qeydlərlə göstərilmişdir ki, boya siqnalı bütün kortikal təbəqələrdəki neyronlardan yaranan neyron arborizasiyalarında eşikaltı sinaptik potensialları və dendritik fəaliyyət potensiallarını vurğulayaraq, təsvir edilən ərazidə bütün neyron elementlərində membran potensialı dəyişikliklərinin cəmini ölçür. dendritlər səthi kortikal təbəqələrə çatır. Beləliklə, VSDI bizə neyron dendritlərində bir vahid qeydləri ilə asanlıqla tədqiq edilə bilməyən olduqca illüziyalı fəaliyyəti təsvir etməyə imkan verdi. Təəccüblüdür ki, bu növ davam edən həddən artıq fəaliyyətin amplitudasının oyandırılmış fəaliyyətlə eyni miqyasda olduğunu gördük. Bu davamlı fəaliyyətin bir çox millimetr korteks üzərində yüksək sinxronizasiya nümayiş etdirdiyini də tapdıq. Daha sonra davam edən fəaliyyətin oyandırılan reaksiyaya təsirini araşdırdıq və ikisinin güclü qarşılıqlı əlaqədə olduğunu göstərdik. Bundan əlavə, biz əvvəllər yalnız evoked fəaliyyəti ilə bağlı olan kortikal dövlətlər həqiqətən stimullaşdırılması olmadıqda da müşahidə edilə bilər ki, aşkar, məsələn, müəyyən bir oriyentasiya kortikal təmsil heç bir vizual giriş olmadan görünə bilər. Bu nümayiş, davam edən fəaliyyətin kontekst, davranış, yaddaş və idrak funksiyasının digər aspektlərindən sensor məlumatların işlənməsinin asılılığı üçün neyron substratı təmin etməklə digər kortikal funksiyalarda da böyük rol oynaya biləcəyini göstərir.

Vizual korteksdə oriyentasiya və istiqamətə üstünlük verilməsinin optik görüntüləmə tədqiqatları adətən bucaq və böyüklük xəritələrini əldə etmək üçün vektor ortalamasından istifadə etmişdir. Bu üsul aşağı oriyentasiya vektoru böyüklüyünə malik bölgələrdə yerləşən yarım fırlanma oriyentasiya təkliklərini (pinwheels) göstərdi. İstiqamətə üstünlük ümumiyyətlə oriyentasiya seçiminə ortoqonaldır, lakin çox vaxt bundan kənara çıxır, xüsusən aşağı istiqamət vektorunun böyüklüyü olan bölgələrdə. İstiqamət üstünlüklərinin sürətli dəyişməsinin xətti bölgələri oriyentasiya təkliklərində və ya yaxınlıqda sona çatır. Bununla belə, vektor-ortalama metodu problemlidir, çünki o, oriyentasiya tənzimləmə genişliyində fəza dəyişikliyini hündürlüyün dəyişməsindən aydın şəkildə ayırmır. O, həmçinin üstünlüklərin zəif olduğu bölgələrdə üstünlük verilən istiqaməti səhv qiymətləndirə bilər. Bu yazıda biz cavablara model tənzimləmə funksiyalarını uyğunlaşdırmaqla pişiklərin vizual korteksinin optik xəritələrini təhlil edirik. Bu yeni üsul əvvəllər görünməyən xüsusiyyətləri ortaya qoyur. Orientasiya tənzimləmə hündürlüyü və eni xəritədə müstəqil olaraq dəyişir: tənzimləmə hündürlüyü həmişə təkliklər yaxınlığında aşağı olur, lakin geniş və dar oriyentasiya tənzimləmə eni bölgələri aşağı tuning hündürlüyü olan bölgələrdə tapıla bilər, tez-tez təkliklər ətrafında danışıq tərzində dəyişir. Oriyentasiya və istiqamət üstünlük bucaqları həmişə yaxından ortoqonaldır. İstiqamət üstünlüklərindəki dönüşlər dəqiq oriyentasiya təkliklərində yaranan xətləri əmələ gətirir.

Birincil somatosensor korteksin 2/3 təbəqəsindəki həssas reaksiyanın məkan-zaman dinamikası, anesteziya edilmiş siçovulda eyni vaxtda gərginliyə həssas boya (VSD) görüntüləmə və bütün hüceyrə (WC) gərginlik qeydləri ilə tədqiq edilmişdir. L2/3 piramidalarının dendritik və aksonal arborlarının yenidən qurulması. Piramidal hüceyrələrdən alınan tək və ikili tualet qeydləri yerli VSD populyasiya reaksiyası ilə həm amplituda, həm də zaman kursunda eyni vaxtda ölçülən eşikaltı postsinaptik potensial dəyişikliklər arasında güclü korrelyasiya olduğunu göstərdi. Ən erkən VSD reaksiyası 10-12 msn-dən sonra lülənin üstündə mərkəzləşmiş, stimullaşdırılmış əsas bığa izomorf olan bığ sapmasından sonra aşkar edilmişdir. L2/3-də çəllək-sütunla əlaqəli piramidaların dendritik çardaqları ilə birgə tək barel-sütun ölçüsü ilə üfüqi olaraq məhdudlaşdırılmışdır. Həyəcanlanmanın üfüqi yayılması zəif bığ sapması olan bir barel sütunu ilə məhdudlaşdı. Aralıq əyilmələrlə, yenidən qurulmuş piramidal neyronların L2/3-də üstünlük verilən aksonal arborizasiyalara uyğun olaraq, lülə sahəsinin cərgələri boyunca qövslərə nisbətən iki dəfə daha sürətlə yayılaraq, bitişik barel sütunlarına yayıldı.Nəhayət, daha böyük bığ əyilmələri, növbəti oxşar -250 ms-də azalmadan əvvəl, 50 ms-ə bənzər bir müddət ərzində bütün barel sahəsinə yayılan həyəcan doğurdu. Beləliklə, bir bığ sapmasını təmsil edən alt eşik kortikal xəritə millisaniyəlik zaman miqyasında dinamikdir və stimulun gücündən çox asılıdır. L2/3-də həyəcanverici neyron şəbəkəsinin sadə bir hiss stimulu ilə ardıcıl məkan-zaman aktivləşdirilməsi, beləliklə, ilk növbədə L4-dən L2/3-ə qədər həyəcanverici birləşmələrin sütunlu məhdudlaşdırılması və barrellə əlaqəli piramidaların aksonal sahəsi ilə izah edilə bilər.

Davranış meymunlarının neokorteksindəki daha yüksək idrak funksiyalarının əsasını təşkil edən məkan və müvəqqəti nümunələrin tədqiqini asanlaşdırmaq üçün yeni gərginliyə həssas boyalara (VSD) əsaslanan yeni xroniki optik görüntüləmə üsulu hazırlanmışdır. Bu sistemdən istifadə edərək, eyni korteks yamasından 1 ildən az və ya bərabər bir müddət ərzində yüksək məkan və zaman ayırdetmə qabiliyyətinə malik kortikal dinamikanı araşdıra bildik. Təlim edilmiş makakaların vizual korteksləri həftədə bir-üç dəfə rəngləndi və hər boyama seansından dərhal sonra meymun davranış tapşırığını yerinə yetirməyə başladı, birincili və ikincili vizual sahələr (V1 və V2) sürətli optik görüntüləmə ilə təsvir edildi. sistemi. Eyni kortikal sahədən uzunmüddətli təkrarlanan VSD görüntüləmə (VSDI) daxili siqnallara əsaslanan optik görüntüləmə ilə dəfələrlə təsdiqləndiyi kimi normal kortikal arxitekturanı pozmadı. VSDI tərəfindən əldə edilən funksional xəritələrin məkan nümunələri daxili siqnallara əsaslanan görüntüləmə yolu ilə eyni korteks yamasından əldə edilənlərlə mahiyyətcə eyni idi. Uyarılan siqnalların nisbi amplitüdlərini və bu iki fərqli görüntüləmə metodologiyasından istifadə edərək əldə edilmiş diferensial xəritəni müqayisə etdikdə, VSDI-nin daxili siqnallara əsaslanan görüntüləmədən daha çox alt hədd fəaliyyətini vurğuladığını və bu, daha çox spiking fəaliyyətini vurğuladığını gördük. V1-də VSD-dən qaynaqlanan cavabın gecikmə müddəti müxtəlif meymunlarda 46 ilə 68 ms arasında dəyişdi. V2 reaksiyasının amplitudası V1-dəkinin yalnız 20-60%-i idi. Anatomiyadan gözlənildiyi kimi, yerli vizual qıcıqlara retinotopik reaksiyalar kortikal səth boyunca yanal olaraq 0,15-0,19 m/s sürətlə daha geniş əraziyə yayılır. klassik böyütmə əmsalı ilə gözləniləndən daha yüksəkdir və 40 ms-ə yaxın maksimum anizotrop məkan ölçüsünə çatır. Biz kortikal aktivləşdirmə nümunələrinin müşahidə olunan dinamikasını meymunun sakkadik göz hərəkətləri ilə əlaqələndirdik və kortikal reaksiyanın onun hərəkətlərinə nisbətən yavaş ofsetinə görə tapdıq.

Optik təsvirin müxtəlif elektrod əsaslı üsullarla birləşməsini asanlaşdırmaq üçün biz kəllə sümüyünün bərkidilməsi üçün “sürüşən kranial pəncərə” və çıxarıla bilən “elektrod yerləşdirici mikrodrive” dizayn və istehsal etdik. Bu yeni qurğular pişik və meymunların beyin qabıqlarında xroniki və kəskin eksperimentlərdə sensor emalın öyrənilməsi üçün istifadə edilib. Bu montaj hüceyrədənkənar qeyd (tək və çox vahid qeyd və yerli sahə potensialı), hüceyrədaxili qeyd, mikrostimulyasiya və ya izləyicilərin hədəflənmiş inyeksiyası ilə birlikdə daxili siqnalların və ya gərginliyə həssas boyaların eyni vaxtda optik təsvirinə imkan verir. Optik görüntüləmə ilə funksional arxitektura müəyyən edildikdən sonra, elektrodlar geniş bir kortikal sahəyə daxil olaraq, müxtəlif nüfuz bucaqlarında (30-90 dərəcə) tam vizual nəzarət altında seçilmiş kortikal sahəyə yönəldilir. Cihaz üç hissədən ibarətdir: (1) kəllə montaj kamerası, (2) sürüşmə qapaq və (3) mikrodisk. Mikrodrive asanlıqla çıxarıla bilər və sonra kranial pəncərə möhürlənir və düz qoruyucu örtüklə örtülür. Xroniki təcrübələr üçün bu tənzimləmə heyvanın uzun müddət ərzində minimal həcmdə və çəkidə möhürlənmiş kranial pəncərə ilə təchiz edilmiş və təsadüfi zədələnmə və ya infeksiya riski cüzi olmaqla uzun müddət idarə edilməsinə imkan verir. (C) 2002 Elsevier Science B.V. Bütün hüquqlar qorunur.

Yeni bir zondla gərginliyə həssas boya görüntüləmə (VSDI) istifadə edərək, siçovul və siçan əsas iybilmə lampasında (MOB) qoxuya səbəb olan fəaliyyətin məkan-zaman dinamikasını araşdırdıq. VSDI-nin yüksək temporal həlli glomerular aktivasiyanın qoxuya xas ardıcıllığını ortaya qoydu. Artan qoxu konsentrasiyası cavab gecikmələrini azaldır, cavab amplitüdlərini artırdı və yeni glomerular vahidləri işə götürdü. Bununla belə, glomerulyar aktivləşmə ardıcıllığı qorunub saxlanılmışdır. Bundan əlavə, burun tənəffüs dövrünə kilidlənmiş paylanmış MOB fəaliyyətini tapdıq. Onun amplitudasının və fazasının məkan paylanması heterojen idi və qoxuya uyğun olaraq sensor girişlə dəyişdirildi. Bizim məlumatlarımız göstərir ki, məməlilərin iybilmə lampasında qoxu şəxsiyyəti və konsentrasiyası təkcə məkan nümunələri ilə deyil, məkan-zaman nümunələri ilə təmsil olunur.

Oyanıq davranan meymunlarda kortikal dinamikaların görüntülənməsi üçün son 7 ildə istifadə etdiyimiz şəffaf silikon dural əvəzedicisini təqdim edirik. Bu əvəzedici bizə bir ildən çox daxili və ya gərginliyə həssas boya siqnallarını optik olaraq qeyd etməyə imkan verdi. O, elektrodu arzu olunan qeyd sahəsinə yönəltmək üçün tam vizual nəzarətdən istifadə edərək, mikroelektrodun heç bir zədə olmadan keçməsinə imkan verəcək qədər nazik və elastikdir. Bu implant korteksi yaxşı fizioloji vəziyyətdə saxlamaq və optik təsvir üçün zəruri olan optik xüsusiyyətlərini qorumaq üçün çox vacib olduğunu sübut etdi. Silikon dural əvəzedicisinin cərrahi implantasiyasının təfərrüatlarını, məruz qalmış korteksin uzun müddət ərzində saxlanmasını, bu implanta kortikal reaksiyanı və onun insanlarda mümkün klinik təsirlərini və meymunlarda reabilitasiya prosedurunu təsvir edirik. (C) 2002 Elsevier Science B.V. Bütün hüquqlar qorunur.

Primat korteksinin frontal göz sahəsi və qonşu 8Ar sahəsi sakkadların proqramlaşdırılmasında və icrasında iştirak edir. Bu bölgələrdə elektrik mikrostimulyasiyası qısa müddətli kontralateral sakkadlara səbəb olur. Mikrostimulyasiyadan qaynaqlanan fəaliyyətin məkan-zaman dinamikasının sakkad planlarına necə çevrildiyini müəyyən etmək üçün biz meymunların davranışında real vaxt optik görüntüləmə və mikrostimulyasiya birləşməsindən istifadə etdik. Qısa stimullaşdırıcı qatarlar, gözlənilməz böyük və uzun müddətli hiperpolyarizasiyanın ardınca sürətli və geniş yayılmış depolarizasiya dalğasına səbəb oldu. Bu hiperpolarizasiya zamanı sakkadlar demək olar ki, yalnız ipsilateral olur və bu, sakkada məqsədinin müəyyən edilməsində hiperpolyarizasiyanın mühüm rolunu göstərir.

Görmə korteksində stimul oriyentasiyasına yüksək seçicilik necə yaranır? Orientasiya seçiciliyinin talamik irəli ötürülməsinin üstünlük təşkil etdiyi modelləri vizual reaksiya zamanı daimi seçiciliyi proqnozlaşdırır, intrakortikal təkrarlanan modellər isə seçiciliyin dinamik inkişafını proqnozlaşdırır. Böyük bir neyron populyasiyasının oriyentasiya-tənzimləmə dinamikasını ölçmək üçün gərginliyə həssas boyalarla pişik vizual korteksini təsvir etdik. Tuning-əyri eni cavab başlayandan sonra daralmadı, halbuki üstünlük verilən və ortoqonal cavablar (modulyasiya dərinliyi) arasındakı fərq əvvəlcə artdı, sonra azaldı. Uyarılmış yavaşlama-sürətlənmə (DA) çentiği olaraq adlandırılan, ortoqonal reaksiya üçün daha böyük olan, evokasiya edilmiş cavabların yatırılmasını müəyyən etdik. Bu tapıntılar göstərir ki, pişik beynində davamlı vizual kortikal emal oriyentasiya tənzimləməsini daraltmır, əksinə, kortikal qarşılıqlı təsirlər modulyasiya dərinliyini gücləndirə və ortoqonal reaksiyanı üstünlük veriləndən nisbətən daha çox sıxışdıra bilər. .

Sensor tərəfindən oyandırılan kortikal qan həcminin və oksigenləşmə dəyişikliklərinin məkan-zaman xüsusiyyətlərinin başa düşülməsi fizioloji baxımdan, eləcə də optik görüntüləmə, PET və f-MRT kimi müxtəlif neyroirnaging üsulları ilə əldə edilən nəticələrin şərhi üçün vacibdir. və onların təkmilləşdirilməsi üçün. Bununla belə, təfərrüatlı mənzərə bir əsrdən artıqdır ki, əlçatmaz olaraq qalır. İzosbestik və digər dalğa uzunluqlarında daxili görüntüləmə, lazer Doppler, görüntüləmə spektroskopiyası, fosforesensiyanın söndürülməsi və flüoresan görüntüləmə istifadə edərək, anesteziya edilmiş pişiklərdə və oyaq meymunlarda qan həcmi və oksigenləşmə dəyişikliklərini tədqiq etdik. Qanın oksigenləşməsinin sürətlə azalması ilə əlaqədar olaraq, qan volurne dəyişikliklərinin başlanğıcının gecikdiyini (> 300 ms) aşkar etdik. Beləliklə, qan həcminin təsirləri yalnız "ilkin düşüşü" izah edə bilməz. 570 nm ölçmələr və qan dövranına yeridilmiş flüoresan izləyicinin yüksək rezolyusiyalı təsviri (80 ms, 7 pm) müxtəlif mikrovaskulyar bölmələrin cavablarının həllini asanlaşdırdı. İlkin nəticələr arteriolların qan həcminin artmasına səbəb olduğunu və sürətlə digər mikrovaskulyar bölmələrə doğru yayıldığını göstərir. Damarlar geridə qaldı. Şüurlu makakada və anesteziya edilmiş pişikdə stimulun blankına qarşı funksional xəritələri (tək vəziyyət xəritələri) yalnız 605 nm-də erkən deoksigenasiya mərhələsində əldə edilmişdir. Sonrakı dövrlərdə və ya 570 nm-də gəmi artefaktları üstünlük təşkil edirdi. Bu nəticələr kortikal sütun səviyyəsində yaxşı tənzimlənməyən sonrakı həcm və axın artımı ilə müqayisədə oksigen istehlakının və elektrik fəaliyyətinin daha güclü birgə lokalizasiyasını göstərdi. (C) 2002 Elsevier Science B.V. Bütün hüquqlar qorunur.

Makaka meymununun əsas somatosensor korteksindəki (S-I sahəsi) somatotopik əl təmsilinin yüksək qətnamə şəkilləri daxili siqnallara əsaslanan optik görüntüləmə ilə əldə edilmişdir. Somatotopik xəritələri vizuallaşdırmaq üçün hər bir fərdi barmaq ucunun yumşaq toxunma stimullaşdırılmasına optik reaksiyaları təsvir etdik. Tək barmağın stimullaşdırılması ilə yaranan aktivasiya postsentral girus boyunca dar eninə zolaqda (1 x 4 mm-ə bənzər) ən güclü idi. Gözlənildiyi kimi, bu qrupların ardıcıl təşkili tapıldı. Bununla belə, xüsusilə 3-5 barmaqların aktivləşdirilmiş sahələri üçün əhəmiyyətli bir üst-üstə düşmə aşkar edilmişdir. Təəccüblüdür ki, barmağa xüsusi sahələrə əlavə olaraq, biz aşkar etdik ki, barmaqların hər biri üçün zəif stimullaşdırma həm də barmağın təmsilçiliyinin medial hissəsində yerləşən korteksin ikinci "ümumi yamaqlarını" aktivləşdirir. Bu nəticələr optik xəritələrin rəhbər tutulduğu hədəflənmiş çoxillik və tək vahidli qeydlərlə təsdiq edilmişdir. Bir çox saatlıq qeydlər ərzində xəritələr çox sabit qaldı. Görüntüləmə prosedurlarını optimallaşdıraraq, funksional xəritələri çox sürətlə əldə edə bildik (məsələn, makaka meymununda beş barmağın xəritəsini 5 dəqiqəyə qədər əldə etmək olar). Bundan əlavə, biz neyrocərrahiyyə zamanı insan beynində əl təsvirinin əməliyyatdaxili optik təsvirini təsvir edirik və sonra mikrosirkulyasiyanın hissiyyatla əlaqəli elektrik fəaliyyətinə reaksiyalarına əsaslanaraq, digər neyroimaging üsulları ilə yerinə yetirilən məkan həlli üçün mövcud nəticələrin təsirlərini müzakirə edirik. Bu tədqiqat kortikal təsvirlərin etibarlı qısa və uzunmüddətli plastikliyini araşdırmaq, eləcə də klinik şəraitdə tətbiqlər üçün yüksək qətnamə optik görüntüləmədən istifadənin mümkünlüyünü nümayiş etdirir.

Öyrənmə və yaddaşın, digər uzunmüddətli plastik dəyişikliklərin və davranan primat beynindəki əlavə idrak funksiyalarının tədqiqi, eyni korteks yamaqda, sütun səviyyəsində, uzun müddət ərzində funksional arxitekturanı təsvir etmək qabiliyyətindən böyük fayda verəcəkdir. vaxt. Biz daxili siqnallara əsaslanan uzunmüddətli optik görüntüləmə üsullarını işləyib hazırladıq və 1 ildən çox müddətə makaka korteksinin davranışında eyni funksional sahələri təkrar-təkrar vizuallaşdırdıq. Optik görüntüləmə və görüntüləmə spektroskopiyasından istifadə edərək, biz ilk növbədə oyanıq davranan primatda elektrik aktivliyi ilə hemodinamik hadisələr arasındakı əlaqəni araşdırdıq və onu anesteziya edilmiş preparatlarla müqayisə etdik. Biz aşkar etdik ki, oyaq heyvanda daxili siqnalın amplitudası daha böyük olduğu halda, onun temporal modeli anesteziya edilmiş heyvanlarda müşahidə edilənə bənzəyir. Hər iki qrupda deoksihemoqlobinin konsentrasiyası stimulun başlanmasından 2-3 saniyə sonra pik həddə çatdı. Bundan əlavə, deoksihemoqlobinin konsentrasiyasında aktivliyə bağlı erkən artım ("ilkin daldırma") qan axınının artması ilə əlaqəli olduğu bilinən oksihemoqlobinin konsentrasiyasının gecikmiş artımından daha çox elektrik aktivliyi ilə daha sıx birləşdi. Bu nəticələrin qanın oksigenləşməsi səviyyəsindən asılı olaraq funksional maqnit rezonans görüntüləməsinin məkan rezolyusiyasının yaxşılaşdırılması üçün təsiri müzakirə olunur. Davranış edən primatda daxili siqnalın xarakteristikasından sonra, makaka əsas vizual korteksindəki kortikal xəritələrin sabitliyini araşdırmaq üçün bu yeni görüntüləmə metodundan istifadə etdik. Orientasiya və okulyar dominantlıq sütunlarının funksional xəritələrinin 1 ildən çox müddətə sabit olduğu aşkar edilmişdir.

Pişiklərin vizual korteksi vizual məkanın topoqrafik xəritəsini, üstəgəl göz üstünlüyünün, məkan tezliyinin və oriyentasiyanın üst-üstə qoyulmuş, məkan baxımından dövri xəritələrini ehtiva edir. Bu xəritələrin tərtibatının iki məhdudiyyətlə müəyyən edildiyi fərz edilir: kortikal səth boyunca stimul xüsusiyyətlərinin davamlılığı və ya hamar xəritələşdirilməsi və əhatə dairəsinin vahidliyi və ya vizual məkanda xəritə xüsusiyyətlərinin birləşməsinin vahid təmsili. Burada kortikal xəritələrin əhatə dairəsi üçün optimallaşdırıldığı fərziyyəsini yoxlamaq üçün əhatə dairəsinin vahidliyinin kəmiyyət ölçüsündən (c') istifadə edirik. Korteksin tək bölgələrində əldə edilən oküler dominantlıq, məkan tezliyi və oriyentasiya xəritələri arasındakı məkan münasibətlərini pozduqda, kortikal xəritələrin c' üçün yerli minimumda olduğunu gördük. Bu, əhatə dairəsinin optimallaşdırılmasının kortikal xəritənin işlənməsini tənzimləyən mühüm təşkilati prinsip olduğunu göstərir.

Kortikal xəritələrin tərtibatını aşkar etmək həm onların inkişafında iştirak edən prosesləri başa düşmək, həm də sinir hesablamalarının altında yatan mexanizmləri açmaq üçün vacibdir. Pişiklərin vizual korteksindəki oriyentasiya xəritələrinin tipik təşkili radial tam oriyentasiya dövrlərinin oriyentasiya təklikləri ətrafında xəritələşdirilməsidir. Bunun əksinə olaraq, oriyentasiya təmsilinin uzun xətti zonaları ağac sivrisinin ilkin vizual korteksində aşkar edilmişdir. Bu işdə biz Eat vizual korteksinin oriyentasiya üstünlük xəritələrində uzun xətti ardıcıllıqların və geniş xətti zonaların mövcudluğunu axtardıq. daxili siqnallara əsaslanan optik təsvirdən istifadə edilmişdir. Uzun xətti ardıcıllıqlar və üstünlük verilən oriyentasiyanın geniş xətti zonaları bəzən 17 və 18-ci sahələr arasındakı sərhəd boyunca, eləcə də 18-ci sahə daxilində aşkar edilmişdir. Bir yarımkürənin fs sahəsi boyunca fərqli radial və xətti təşkilatların bitişik zonaları müşahidə edilmişdir. Bununla belə, radial və xətti təşkilatlar mütləq uzun (7,5 mm) ayrılmayıb, üstünlük verilən oriyentasiyanın xətti ardıcıllıqları tipik pinwheel kimi oriyentasiya təşkilatı daxilində yerləşmiş tapılıb. Belə bir nəticəyə gəldik ki, radial təşkilat dominant olsa da, mükəmməl xətti təşkilat pişiklərin vizual korteksində oriyentasiya ilə bağlı emalları inkişaf etdirə və həyata keçirə bilər.

Tək bir neokortikal neyronun fəaliyyəti ilə onun daxil olduğu şəbəkənin dinamikası arasındakı əlaqə bir vahidli qeydlər və real vaxt optik görüntüləmə ilə tədqiq edilmişdir. Kortəbii olaraq aktiv olan tək neyronun atəş sürəti böyük bir kortikal sahədə davam edən populyasiya fəaliyyətinin ani məkan modelindən çox asılıdır. Əhali aktivliyinin çox oxşar fəza nümunələri həm neyron kortəbii atəş açdıqda, həm də onun optimal stimulu ilə idarə edildikdə müşahidə edilmişdir. Uyarılan nümunələr tək neyronların spontan fəaliyyətini yenidən qurmaq üçün istifadə edilə bilər.

Ənənəvi görüntüləmə üsulları istər məkan, istərsə də temporal sahədə yüksək rezolyusiyaya malik təsvirləri təmin etmişdir. Gərginliyə həssas boyalardan istifadə edən optik görüntüləmə uzun müddətdir ki, millisaniyəlik dəqiqliklə alt sütunlu fəza təfərrüatını təmin edərək, eyni vaxtda hər iki sahədə yüksək qətnamə əldə etmək üçün reallaşdırılmamış potensiala malikdir. Burada, korteksin tədqiqini xeyli asanlaşdıran həm anesteziya edilmiş, həm də oyaq davranış hazırlıqlarında kortikal dinamikanın funksional təsvirini praktiki hala gətirən gərginliyə həssas boyalar və cihazlarda bir sıra inkişafları təqdim edirik. Biz pişiklərin vizual korteksində oriyentasiya xəritələrinin millisaniyə-millisaniyə əmələ gəlməsini təhlil edərək bu irəliləyişi göstəririk.

Müasir funksional beyin xəritəsi neyronların elektrik fəaliyyətinin kortikal mikrosirkulyasiya ilə qarşılıqlı əlaqəsinə əsaslanır. Yüksək lokallaşdırılmış, stimullaşdırıcı ilkin deoksigenasiyanın mövcudluğu mübahisəli olaraq qalır. Burada mikrosirkulyasiyada aktivliyə bağlı oksigen gərginliyinin dəyişməsi ekzogen göstəricinin oksigendən asılı fosforessensiya ilə söndürülməsindən istifadə etməklə birbaşa ölçüldü. Sensor stimulyasiyadan sonra ilk hadisə oksigen istehlakının artması, sonra isə qan axınının artması idi. Oksigen istehlakı və neyron aktivliyi bir yerdə olduğundan, lakin gecikmiş qan axını olmadığından, bu ilkin fazaya yönəldilmiş funksional maqnit rezonans görüntüləmə daha yüksək məkan qətnaməsi verəcək və nəticədə insan beynindəki fundamental emal modullarının qeyri-invaziv vizuallaşdırılmasına imkan verəcəkdir.

İşləyən beyni birbaşa vizuallaşdırmaq üçün bir sıra yeni görüntüləmə üsulları alimlərin ixtiyarındadır və görünməmiş detalları ortaya qoyur. Bu görüntüləmə üsulları kortikal inkişafın, təşkilinin və funksiyasının əsasını təşkil edən prinsiplərin yeni bir anlayışını təmin etdi. Bu fəsildə biz bir-birini tamamlayan iki təsvir üsulundan istifadə edərək canlı məməlilərin beynində optik təsvirlərə diqqət yetirəcəyik. Birinci texnika daxili siqnallara əsaslanır. İkinci texnika gərginliyə həssas boyalara əsaslanır. Hal-hazırda, bu iki optik görüntüləmə texnikası ən yaxşı məkan və zaman ayırdetmə qabiliyyətini təklif edir, lakin həm də özünəməxsus məhdudiyyətlərə malikdir. Daha çox laboratoriyamızda aparılan işlərdə əldə edilən yeni tapıntılardan bir neçə nümunə verəcəyik. Diqqət, öz növbəsində bu təsvir üsullarından optimal istifadəyə kömək etməli olan metodoloji aspektlərin başa düşülməsinə yönəldiləcəkdir. Daha sadə hazırlıqlar üzərində görülmüş əvvəlki işləri təsvir edən ümumi rəylər başqa yerlərdə dərc edilmişdir (Cohen, 1973 Tasaki and Warashina, 1976 Wagoner and Grinvald, 1977 Waggoner, 1979 Salzberg, 1983 Grinvald, 1984 Grinvald et al., De Weer1985 and Salhenberg 1985). Lesher, 1986 Salzberg və başqaları, 1986 Loew, 1987 Orbach, 1987 Blasdel, 1988, 1989 Grinvald et al., 1988 Kamino, 1991 Cinelli and Kauer, 1992 Frostig, 1994).

Pozitron-emissiya tomoqrafiyası (PET), daxili siqnalların optik təsviri və funksional MRT (fMRI) kimi müasir funksional neyroimaging üsulları beyində yaranan elektrik aktivliyinin dolayı xəritələrini əldə etmək üçün fəaliyyətdən asılı hemodinamik dəyişikliklərdən istifadə edir.PET və axına həssas MRT-də beyin qan axınının (CBF) dəyişməsi, optik görüntüləmə və qan oksigenləşməsi səviyyəsindən asılı MRT xəritəsində deoksigenləşdirilmiş hemoglobinin (HbR) konsentrasiyasında dəyişikliklər olduğu halda, lakin funksional aktivləşdirmə zamanı CBF və HbR arasındakı əlaqə heç vaxt eksperimental olaraq sınaqdan keçirilməmişdir, Buna görə də, duyğuların stimullaşdırılması zamanı anesteziya edilmiş pişiklərin vizual korteksində eyni vaxtda görüntüləmə spektroskopiyası və lazer-Doppler flowmetry üsullarından istifadə edərək bu əlaqəni araşdırdıq. HbR artımından sonra CBF artımı bir saniyədən çox gecikdiyi halda, HbR artımı ümumi hemoglobin konsentrasiyasının (Hbt) eyni vaxtda artması ilə müşayiət olundu, ehtimal ki, erkən qan həcminin artımını əks etdirir. CBF dəyişikliklərinin cavab boyu Hbt dəyişikliyindən sonra 1-2 saniyə geridə qaldığını aşkar etdik. Bu nəticələr kapilyar yataqda qan həcminin aktiv neyrovaskulyar tənzimlənməsi və kapilyar dolmanın gecikmiş, passiv prosesinin mövcudluğu anlayışını dəstəkləyir.

Birincili vizual korteksdə oxşar reaksiya xüsusiyyətlərinə malik neyronlar sütunlarda düzülür. Getdikcə daha çox sütunlu sistemlər kəşf olunduqca, müxtəlif sütunlar arasında həndəsi əlaqələri tənzimləyən qaydaların yaradılması getdikcə daha vacib olur. Bu məsələni araşdırmaq üçün ilk addım olaraq biz 17-ci pişik zonasında oriyentasiya, okulyar dominantlıq və məkan tezlik domenləri arasında fəza əlaqəsini araşdırdıq. Daxili siqnalların optik təsvirindən istifadə edərək, eyni kortikaldan bu stimullaşdırıcı xüsusiyyətlərin hər biri üçün yüksək ayırdetməli xəritələr əldə etdik. bölgələr. Oriyentasiya və okulyar dominantlıq sütunları arasında aydın əlaqələr tapdıq: bir çox izo-oriyentasiya xətləri okulyar dominantlıq sərhədləri arasındakı sərhədləri sağ bucaq altında kəsdi və oriyentasiya təklikləri okulyar dominantlıq sütunlarının mərkəzi bölgələrində cəmləşdi. Oxşar, oriyentasiya və məkan tezlik sahələri arasında daha zəif həndəsi əlaqələr müşahidə edildi. Okulyar dominantlıq və məkan tezlik xəritələrinin də məkanla əlaqəli olduğu aşkar edildi: aşağı məkan tezlik domenləri üçün göz dominantlıq sütunlarının sərhəd bölgələrindən qaçmaq tendensiyası var idi. Fərqli sütunlu sistemlərin bu xüsusi təşkili stimul xüsusiyyətlərinin bütün mümkün birləşmələrinin ən azı bir dəfə görmə qabığının hər hansı bir bölgəsində təmsil olunmasını təmin edə bilər, beləliklə, görmə sahəsində müəyyən bir stimul atributunun funksional kor nöqtələrinin meydana gəlməsinin qarşısını alır.

Məkan və müvəqqəti tezliklər vizual səhnənin vacib atributlarıdır. Bu atributların pişiklərin ilkin vizual korteksində məkan olaraq təşkil olunmuş şəkildə təmsil olunub-olunmaması çoxdankı sualdır(1-4). Daxili siqnalların (5-10) optik təsvirindən istifadə edərək, burada göstəririk ki, müxtəlif sürətlərdə sürüşən müxtəlif məkan tezliklərinin ızgara stimulları fərqli fəaliyyət nümunələri yaradır. Kortikal səthdə davamlı dəyişən məkan tezlik üstünlüklərinin xəritəsini müşahidə etmək əvəzinə, biz yalnız iki fərqli domen dəstini tapdıq, biri aşağı məkan tezliyinə və yüksək sürətə, digəri isə yüksək məkan tezliyinə və aşağı sürətə üstünlük verir. Biz bu məkan-zaman tezlik domenlərinin düzülməsini primat zolaqlı korteksdəki işə əsaslanan vizual korteksin müxtəlif emal axınlarına bölməsini əks etdirdiyi düşünülən sitoxrom oksidaz boyama nümunəsi ilə müqayisə etdik. Biz tapdıq ki, pişik zolaqlı korteksindəki sitoxrom oksidaz blobları vizual səhnənin aşağı məkan və yüksək temporal tezlik məzmunlarının işlənməsi ilə məşğul olan domenlərlə üst-üstə düşür. Digər son nəticələrlə (11) birlikdə məlumatlarımız göstərir ki, məkan-zaman tezlik domenləri pişiklərin vizual korteksindəki paralel axınların təzahürüdür, talamik girişlərin və ekstrastriat proqnozlarının fərqli nümunələri ilə.

Açar sözlər: BLOOD-FLOW INVIVO

Bu tədqiqatın məqsədi pişik sahəsində 18 hərəkət istiqamətinin funksional təşkilini araşdırmaq idi. Optik görüntüləmə neyronların populyasiyalarının fəaliyyətini qeyd etmək üçün istifadə edilmişdir. Hərəkət, İstiqamətə üstünlük verilən qruplaşma dərəcəsi oriyentasiya üçün müşahidə ediləndən iki-dörd əhəng kiçik idi. Ümumiyyətlə, kortikal səth boyunca istiqamət üstünlükləri rəvan dəyişdi, lakin istiqamət xəritələrində fasilələr müşahidə edildi. Bu kəsiklər əks istiqamətlərə üstünlük verən yamaq cütlərini ayıran xətlər meydana gətirdi. İstiqamət və oriyentasiya üstünlükləri üçün funksional xəritələr adətən bir-biri ilə sıx əlaqəli idi, bir izo-oriyentasiya yaması əks istiqamətlərə üstünlük verən, ortoqonal olan bölgələrə bölündü. Bundan əlavə, istiqamət xəritəsindəki kəsilmə xətləri tez-tez oriyentasiya xəritəsindəki təklik nöqtələrini birləşdirdi, hər iki sahənin təşkili əlaqəli olsa da, istiqamət və oriyentasiya seçmə cavabları bir-birindən ayrıla bilərdi, halbuki hərəkət istiqamətinə görə seçici reaksiya təxminən idi. vizual stimullaşdırma üçün istifadə olunan çubuqların uzunluğundan asılı olmayaraq, çubuqların uzunluğunun azalması ilə oriyentasiyaya seçici reaksiya əhəmiyyətli dərəcədə azalmışdır. Funksional xəritələrin seçilmiş domenlərinə yönəlmiş geniş tək və çox bölməli elektrik qeydləri, optik görüntüləmə ilə aşkar edilən xüsusiyyətləri təsdiqlədi. Bu nəticəyə gəldik ki, hərəkət istiqamətinin əhəmiyyətli işlənməsi pişik vizual yolunun erkən mərhələsində həyata keçirilir.

Məməlilərin korteksindəki oyandırılmış fəaliyyət və nəticədə davranış reaksiyaları eyni stimulun təkrar təqdimatlarına böyük dəyişkənlik nümayiş etdirir. Bu iş dəyişkənliyin davam edən fəaliyyətə aid edilə biləcəyini araşdırdı, pişik görmə korteksindəki davam edən və oyandırılan məkan-zaman fəaliyyət nümunələri real vaxt optik görüntüləmə ilə yerli sahə potensialları ölçüldü və tək neyronların boşalmaları eyni vaxtda, elektrofizioloji üsullarla qeyd edildi. Uyarılan fəaliyyət deterministik göründü və dəyişkənlik, ehtimal ki, kortikal şəbəkələrin ani vəziyyətini əks etdirən davam edən fəaliyyətin dinamikasından qaynaqlanır, Böyük dəyişkənliyə baxmayaraq, tək sınaqlarda oyanmış cavablar deterministik cavabın xətti yekunu ilə proqnozlaşdırıla bilər. Davam edən fəaliyyətdən əvvəl, Davam edən fəaliyyət kortikal funksiyada mühüm rol oynamalıdır və idrak proseslərinin araşdırılmasında nəzərə alınmamalıdır.

Video analoq siqnalların təqdim edildiyi, istinad analoq təsvirinin seçildiyi və təsvirin siqnallarının rəqəmsallaşdırıldığı, rəqəmsallaşdırılmış siqnalların video analoq istinad siqnallarına çevrildiyi, istinad siqnallarının gücləndiriləcək video analoq siqnalları ilə sinxronlaşdırıldığı bir təsvirin təkmilləşdirilməsi üsulu. , çevrilmiş analoq istinad siqnalları video analoq siqnallarından çıxarılır və yalnız bundan sonra çıxarılan analoq siqnallar gücləndirilir ki, real vaxt rejimində gücləndirilmiş şəkillər ardıcıllığını əldə etsin. Həmçinin təsvirin təkmilləşdirilməsi sistemi də təqdim olunur.

1. Ayrı-ayrı neyronların kortəbii fəaliyyəti ilə əlaqədar olaraq, 17 və 18 nömrəli pişiklərin vizual bölgələrində davam edən fəaliyyətin məkan-zaman təşkilini araşdırdıq. Koherent aktivliyi axtarmaq üçün gərginliyə həssas boya siqnalları tək neyronların fəaliyyəti ilə sünbüllə tetiklenen ortalamanın istifadəsi ilə əlaqələndirildi. Hər bir qeyd seansında 124 diodla ən azı 2 X 2 mm korteks sahəsi təsvir edilmişdir. Bundan əlavə, iki təcrid olunmuş bölmədən elektrik qeydləri, eyni mikroelektrodlardan yerli sahə potensialı (LFP) və səth elektroensefaloqramması (EEQ) eyni vaxtda qeydə alınıb. 2. Boyadan qeydə alınan optik siqnallar eyni saytdan qeydə alınan LFP ilə oxşar idi. Fərqli kortikal yerlərdən qeydə alınan optik siqnallar fərqli bir zaman kursu nümayiş etdirdi. Buna görə də, real vaxt rejimində optik görüntüləmə çoxlu sayt LFP qeydlərinə bir çox cəhətdən ekvivalent olan məlumat verir. 3. Tək neyronların kortəbii atəşi optik siqnallarla və LFP ilə yüksək dərəcədə əlaqələndirilmişdir. Kortəbii fəaliyyət zamanı qeydə alınan neyronların 88% -ində bir sünbülün meydana gəlməsi ilə qeyd yerini əhatə edən böyük bir kortikal bölgədə qeydə alınan optik siqnal arasında əhəmiyyətli bir əlaqə tapıldı. Bu nəticə göstərir ki, tək neyronların kortəbii fəaliyyəti müstəqil bir proses deyil, zamanın atəşə və ya çoxlu neyronların sinaptik girişlərinə bağlıdır, hamısı sensor giriş olmadan da əlaqəli şəkildə aktivləşir. 4. Optik siqnalla korrelyasiyanı göstərən hallar üçün sünbüllərin yaranması zamanı optik siqnalın 27-36%-i 2 X 2 mm sahədə tək bir neyronda spontan sünbüllərin meydana gəlməsi ilə birbaşa əlaqəli idi. Eyni kortikal sahədə fəaliyyətin 43-55% -i vizual stimulla birbaşa əlaqəli idi. 5. Təəccüblüdür ki, biz optik olaraq qeydə alınan bu ardıcıl davam edən fəaliyyətin amplitudasının, demək olar ki, optimal vizual stimullaşdırmanın yaratdığı fəaliyyət qədər böyük olduğunu gördük. Ampli

Əsasən vizual hərəkətin emalında iştirak etdiyi düşünülən kortikal bölgə olan bayquş meymun sahəsi MT-nin funksional arxitekturasını araşdırmaq üçün daxili siqnallara əsaslanan optik görüntüləmədən istifadə etdik. Əvvəlki tək vahidli hesabatlarda proqnozlaşdırıldığı kimi, vizual stimulların hərəkət istiqaməti üçün xüsusi kortikal xəritələr tapdıq. Bununla belə, bu istiqamət xəritələri MT sahəsinin hamısında bərabər paylanmamışdır. İstiqamətə aid bölgələrdə əks istiqamətlərdə hərəkət edən stimulların yaratdığı aktivasiya əhəmiyyətli dərəcədə üst-üstə düşür. Eyni istiqamətdə hərəkət edən müxtəlif formalı stimulların MT sahəsi daxilində müxtəlif kortikal bölgələri aktivləşdirdiyini, hərəkət istiqamətinin bayquş meymununun MT sahəsinin təşkil olunduğu yeganə parametr olmadığını göstərir. Həqiqətən, biz MT sahəsində oriyentasiya üçün möhkəm bir təşkilat üçün aydın dəlil tapdıq. Təcrid olunmuş xətt və ya nöqtə formalı kəsilmələr istisna olmaqla, bütün MT-də oriyentasiya üstünlükləri rəvan dəyişir. Ümumiyyətlə, əks istiqamətə üstünlük verilən qoşalaşmış bölgələr bir oriyentasiya sahəsi daxilində əhatə olunurdu. Orientasiya xəritələrində seqreqasiya dərəcəsi istiqamət xəritələrindəkindən 3-5 dəfə çox olmuşdur. Bu nəticələr onu göstərir ki, V1 və V2 kimi MT sahəsi zəngin və çoxölçülü funksional təşkilata malikdir və oriyentasiya, forma dəyişəni bu ölçülərdən biridir.

Retinal şəkillərin işlənməsi kortikal neyronların saysız-hesabsız dendritik arborizasiyalarında həyata keçirilir. Bu cür emal çoxsaylı girişlərin kompleks dendritik inteqrasiyasını əhatə edir və sonrakı çıxış geniş aksonal arbors vasitəsilə çoxsaylı hədəflərə ötürülür. İndiyə qədər bu mürəkkəb emalın təfərrüatları yoxlanılmaz olaraq qaldı. Bu hesabat əhalinin aktivliyinin öyrənilməsində və kortikal dendritik emalın tədqiqində real vaxt rejimində optik görüntüləmənin faydalılığını təsvir edir. Tək vahidli qeydlərdən fərqli olaraq, optik siqnallar ilk növbədə neyron elementlərinin populyasiyasının transmembran potensialındakı dəyişiklikləri, o cümlədən kortikal hüceyrələrin geniş arborizasiyasına təsir edən tez-tez qeyri-müəyyən həddə çatan sinaptik potensialları ölçür. Kəskin sərhədləri olan kiçik vizual stimullardan və kortikal reaksiyaların real vaxt görüntülərindən istifadə edərək, kortikal aktivliyin başlanmasından qısa müddət sonra retinotopik başlanğıc yerindən yayıldığını, kortikal təbəqələrin ən azı 10 qat daha böyük bir sahəsi əhatə etdiyini gördük. Fəaliyyət 100-dən 250 mu m/ms-ə qədər sürətlə yayılır. V1/V2 sərhədinin yaxınlığında birbaşa aktivasiya anizotropdur və biz həmçinin anizotrop yayılma aşkar etdik ki, yayılma üçün '' boşluq sabiti'' sərhədə paralel 2,7 mm və perpendikulyar ox boyunca 1,5 mm-ə oxşar idi. Bundan əlavə, kiçik bir ''mərkəz stimulu'' və klassik qəbuledici sahədən kənarda yerləşən böyük ''ətraflı stimullar'' tərəfindən oyandırılan kortikal fəaliyyətlər arasında kortikal qarşılıqlı əlaqə tapdıq. İstifadə olunan bütün ətraf qıcıqlandırıcılar mərkəzi stimulun kortikal reaksiyasını boğdu. Bəzi stimullaşdırıcı şəraitdə izo-oriyentasiyanın yatırılması ortoqonal oriyentasiya yatırılmasından daha aydın görünürdü. Bastırmanın oriyentasiyadan asılılığı və bəzi xüsusi stimulların ölçüsündən asılılığı mərkəzi əhatə edən inhibitor qarşılıqlı təsirin ən azı bir hissəsinin kortikal mənşəli olduğunu göstərir. Burada bildirilən tapıntılar yayılma ehtimalını artırır

Açar sözlər: Anatomiya və Morfologiya İnkişaf Biologiyası Neyrologiya

Primatların ilkin vizual korteksində oxşar reaksiya xüsusiyyətlərini paylaşan neyronlar birləşərək yamaqlar və ya zolaqlar mozaikası kimi görünən funksional domenlər əmələ gətirir, tez-tez piadan ağ maddəyə qədər bütün kortikal dərinliyi keçir. Eynilə, hər bir kortikal sahə çoxlu qruplarda (yamaqlarda) təşkil edilən və bir neçə millimetrə qədər məsafələrə çatan geniş daxili proqnozlar şəbəkəsi vasitəsilə yanal olaraq birləşir. Funksional domenlər və bu lateral əlaqəli yamalar arasındakı əlaqə intensiv tədqiqat səylərinə baxmayaraq mübahisəli məsələ olaraq qalır. Bu əlaqəni araşdırmaq üçün in vivo optik görüntüləmə ilə kortikal arxitekturanın yüksək keyfiyyətli funksional xəritələrini əldə etdik. Sonradan, həssas anterograd izləyici biositinin hüceyrədənkənar enjeksiyonları seçilmiş funksional sahələrə yönəldilmişdir. Okulyar dominantlıq sistemi daxilində biz uzun məsafəli daxili əlaqələrin eyni gözlü okulyar dominantlıq sütunlarının monokulyar bölgələrini birləşdirməyə meylli olduğunu gördük. Bundan əlavə, biz aşkar etdik ki, binokulyar domenlər V1 sahəsində ayrı bir əlaqə dəsti əmələ gətirir, binokulyar bölgələr öz aralarında selektiv şəkildə bağlanır, lakin ciddi monokulyar bölgələrlə əlaqəsi yoxdur və bu, onların fərqli sütunlu sistem təşkil etdiyini göstərir. Orientasiya üstünlüklərinə tabe olan digər alt sistemdə daxili bağlantıların yamaqları oxşar oriyentasiya seçimlərini paylaşan domenləri əlaqələndirməyə meyllidir. Bu əlaqələrin dəqiqliyinin təhlili göstərdi ki, hər iki funksional alt sistemdə

Bu işdə biz pişik görmə qabığının 18-ci sahəsində müxtəlif istiqamətlərdə hərəkət edən müxtəlif istiqamətli ızgaralara cavab verən hüceyrələrin paylanmasını müəyyən etmək üçün fəaliyyətdən asılı olan daxili siqnallara əsaslanan optik görüntüləmədən istifadə etdik. Neyronların istiqamətli-selektiv qruplaşmasını sınamaq üçün, eyni oriyentasiyalı, lakin əks istiqamətlərdə hərəkət edən iki ızgara ilə stimullaşdırma ilə əldə edilən kortikal fəaliyyət xəritələrini müqayisə etdik. Biz bu xəritələrin demək olar ki, eyni olduğunu gördük və bu, neyronların istiqamət sütunlarında xüsusi qruplaşdırılmadığını göstərir. Biz həmçinin müxtəlif istiqamətli ızgaralarla əldə edilmiş fəaliyyət xəritələrini müqayisə etdik. Orientasiya xəritələrinin hər biri əvvəllər bildirilmiş 2-deoksiqlükoza xəritələrinə bənzəyirdi. Fərqli oriyentasiyalardan əldə edilmiş məlumatları bir "oriyentasiya üstünlük xəritəsi"ndə toplayandan sonra, əvvəlki hesabatlardan fərqli olaraq, izo-oriyentasiya domenlərinin uzadılmış paralel zolaqlar deyil, onların ətrafında "fırıldaq"larda təşkil edilmiş kiçik yamaqlar olduğunu gördük. ''oriyentasiya mərkəzləri'' adlandırdığımız nöqtələrdir. Bundan başqa göstəririk ki, oriyentasiya üstünlüklərinin sürətlə dəyişdiyi yeganə yerlər xətlər və ya döngələr deyil, bu oriyentasiya mərkəzləridir. Bundan əlavə, bu hesabat aydınlaşdırır ki, pişik sahəsi 18-in funksional arxitekturasına dair müşahidələrimiz, ilk baxışdan əvvəlki müşahidələrdən fərqli olsa da, əslində onlarla tam uyğundur. Buna görə də təklif edirik ki, pişiklərin vizual korteksində fırıldaq kimi oriyentasiya nümunələri kvadrat millimetr üçün orta sıxlığı 1,2 pinwheels olan modul vahidlərdən ibarət nizamsız bir mozaika təşkil edir.

Sitokrom oksidaz blobları, okulyar dominant sütunlar və izo-oriyentasiya domenləri, vizual qavrayışın əsasını təşkil edən alt sistemlər arasındakı əlaqələr makaka meymununun ilkin vizual korteksində tədqiq edilmişdir. Bu üç alt sistemin yüksək rezolyusiyaya malik xəritələri alınmışdır. Fəaliyyətdən asılı olan daxili siqnallara əsaslanan optik görüntüləmə, oriyentasiya üstünlüklərinin ən görkəmli təşkilati xüsusiyyətinin təklik nöqtəsini əhatə edən fırıldaq kimi bir quruluş meydana gətirən radial bir quruluş olduğunu ortaya qoydu. Bu fırıldaqçıların 80%-dən çoxu okulyar üstünlük təşkil edən sütunların orta xətti boyunca mərkəzləşmişdir. Qonşu pinwheels izo-oriyentasiya konturları təqribən düz bucaq altında ocular-dominance sütunların sərhədləri keçdi. Orientasiya və üstünlük dəyişməsinin eyni və ya əks istiqamətləri olan fırıldaqlar bir-biri ilə rəvan birləşdi. Orta hesabla bütün istiqamətlər bərabər şəkildə təmsil olunub. Eyni kortikal sahədə, sitoxrom oksidaz histologiyasından istifadə edərək, rəng emalında iştirak etdiyi düşünülən sitoxrom oksidaz blobları da xəritələndi. Fırıldaqların mərkəzləri kimi, ləkələrin mərkəzləri də okulyar üstünlük təşkil edən sütunların orta xətti boyunca uzanır. Bununla belə, pinwheels mərkəzləri blobların mərkəzləri ilə üst-üstə düşmür, bu iki alt sistem məkan baxımından müstəqildir. "Hipersütun" modulları, hər biri tamamlayıcı okulyarlığın iki bitişik sütununda iki tam fırıldaq çarxı, eləcə də bir neçə blobin hissələri tez-tez tapıldı, lakin kortikal təşkilatın əsas vahidi kimi görünmürdü. Hipersütunlara alternativ təklif olunur.

Qavrayışın əsasını təşkil edən beyin mexanizmləri ilə bağlı uzun müddətdir davam edən suallar, nəhayət, məməlilərin korteksinin arxitekturasının və funksiyasının birbaşa vizuallaşdırılması ilə həll edilə bilər. Bu irəliləyiş, beynin necə işlədiyini görmək üçün iki optik görüntüləmə texnikasının köməyi ilə əldə edilmişdir. Bu texnologiyanın yetişdirilməsi beyin tədqiqatını üzvi kimya, spektroskopiya, biofizika, kompüter elmləri, optika və təsvirin emalı ilə birləşdirən çoxşaxəli yanaşma tələb edirdi. Texnoloji nəticələrdən başqa, son tədqiqatlar sensor qavrayışın altında yatan kortikal mexanizmlərə yeni işıq saldı. Neyrocərrahiyyə zamanı xəstələrin kortikal səthinin dəqiq xəritələşdirilməsi üçün bu texnologiyanın klinik tətbiqlərinə başlanılmışdır. Aşağıda öz araşdırmamızın qısa xülasəsi və iki optik görüntüləmə texnikasının texniki xüsusiyyətlərinin təsviri verilmişdir. Hər bir texnika kimi, optik görüntüləmə də ciddi məhdudiyyətlərdən əziyyət çəkir. Burada biz əsasən hazırda istifadə edilən bütün alternativ təsvir üsullarına nisbətən onun bəzi üstünlüklərini vurğulayırıq. Məhdudiyyətlər son rəylərimizdə tənqidi şəkildə müzakirə olunur. Bir sıra digər rəylər üçün baxın Cohen (1989).

Daxili siqnallara əsaslanan korteksin funksional arxitekturasının optik təsviri canlı məməlilərin beyninin inkişafı, təşkili və funksiyasının öyrənilməsi üçün faydalı vasitədir. Bu nisbətən qeyri-invaziv texnika korteksin optik xassələrində fəaliyyətdən asılı olan kiçik dəyişikliklərə əsaslanır. İndiyə qədər funksional görüntüləmə yalnız anesteziya edilmiş heyvanlar üzərində aparılmışdır. Burada müəyyən edirik ki, bu texnika oyaq davranan primatların beynini araşdırmaq üçün də uyğundur.Biz xroniki möhürlənmiş kamera dizayn etdik və şəffaf şüşə pəncərədən görüntü əldə etməyə imkan vermək üçün onu sinomolgus meymunun (Macaca fascicularis) kəlləsinə ilkin vizual korteks üzərində quraşdırdıq. Yalnız baş mövqeyinin məhdudlaşdırılması oyaq meymun görüntüləmə təcrübələrində hərəkət səs-küyünü aradan qaldırmaq üçün kifayət idi. Oküler dominantlıq sütunlarının və sitoxrom oksidaz ləpələrinin yüksək keyfiyyətli təsviri sadəcə olaraq oyaq meymun hər bir gözü ilə alternativ olaraq video filmlərə baxarkən açıq korteksin şəkillərini çəkməklə əldə edilmişdir. Bundan əlavə, funksional xəritələr heyvanın tənəffüsü və elektrokardioqramma ilə məlumatların alınması sinxronizasiyası olmadan əldə edilə bilər. Daxili siqnalın dalğa uzunluğundan asılılığı və zaman kursu anesteziya edilmiş və oyaq meymunlarda oxşar idi, bu da siqnal mənbələrinin eyni olduğunu göstərir. Buna görə də belə qənaətə gəlirik ki, optik görüntüləmə primatın daha yüksək koqnitiv beyin funksiyaları ilə əlaqəli funksional təşkilatı araşdırmaq, həmçinin funksional kortikal sərhədləri müəyyən etmək və neyrocərrahiyyə zamanı insan xəstələrinin düzgün funksiyalarını qiymətləndirmək üçün diaqnostik vasitə təmin etmək üçün yaxşı uyğun gəlir.

Məməlilərin korteksi sütunvari bir şəkildə təşkil edilmişdir: piadan ağ maddəyə qədər bir-birinin altında yerləşən neyronlar adətən bir çox funksional xüsusiyyətlərə malikdir. Kortikal səthdə oxşar reaksiya xüsusiyyətlərinə malik hüceyrələr də uzunsov lentlər və ya yamalar əmələ gətirərək bir araya toplanır. Bəzi reaksiya xüsusiyyətləri, məsələn, vizual korteksdə oriyentasiya üstünlükləri kortikal səthdə tədricən dəyişir və "oriyentasiya xəritələri" yaradır. İzo-oriyentasiya sahələrinin dəqiq tərtibatını müəyyən etmək üçün təkcə birinə deyil, bir çox stimul oriyentasiyasına cavabların biliyi vacibdir. Buna görə də oriyentasiya xəritələrinin dəqiq təsviri texniki çətinliklərlə üzləşmiş və otuz ilə yaxın mübahisəli olaraq qalmışdır. Burada korteks parçasının bir çox müxtəlif istiqamətlərdə ızgaralara verdiyi reaksiyalar haqqında məlumat toplamaq üçün daxili siqnallara əsaslanan in vivo optik görüntüləmədən istifadə edirik. Cavabların bu tam dəsti daha sonra pişiyin 18-ci sahəsindən böyük bir korteks yamasında oriyentasiya xəritəsinin strukturu haqqında ətraflı məlumat verir. Bir oriyentasiyaya ən yaxşı cavab verən kortikal bölgələrin uzadılmış lentlər deyil, yüksək nizamlı yamaqlar meydana gətirdiyini görürük. Bu izo-oriyentasiya yamaqları "oriyentasiya mərkəzləri" ətrafında təşkil edilir və hüceyrələrin oriyentasiya üstünlüklərinin korteks boyunca davamlı olaraq dəyişdiyi fırıldaq kimi nümunələr yaradır. Biz həmçinin oriyentasiya seçimində sürətli dəyişikliklər üçün məlumatlarımızı təhlil etdik və bu "sınıqların" oriyentasiya mərkəzləri ilə məhdudlaşdığını gördük. Fırıldaq çarxları və oriyentasiya mərkəzləri o qədər görkəmli təşkilati xüsusiyyətdir ki, onların inkişafını və vizual məlumatın emalında funksiyasını başa düşmək vacibdir.

Fotoqrafiya linzaları ilə qurulmuş makroskopun dizaynı təsvir edilmiş və bir neçə tətbiqi nümayiş etdirilmişdir. Makroskop 1,5-20 mm diametrli geniş sahələrin təsviri üçün epi-işıqlandırma, 0,4 ədədi diyaframı və 40 mm iş məsafəsini özündə birləşdirir. 1x-dən 2.5x-ə qədər böyütmələrdə makroskopla əldə edilən flüoresan təsvirlər oxşar böyütmələrdə ticari mikroskop obyektivləri ilə əldə edilənlərdən 100-700 dəfə daha parlaq idi. Bir sıra bioloji tətbiqlərdə təkmilləşdirilmiş işıq toplama səmərəliliyi (20 dəfə, tipik) nəinki ağartma effektlərini minimuma endirdi, həm də təkmilləşdirilmiş işıq ötürmə qabiliyyəti (15 dəfə, tipik) ilə birlikdə obyektin görmə qabiliyyətini də əhəmiyyətli dərəcədə artırdı. Gərginliyə həssas boyalardan istifadə edərək kortikal aktivliyin in vivo real vaxtda optik görüntüləməsində fototoksikliyin azalması və siqnal-küy nisbətlərinin artması müşahidə edilmişdir. Bundan əlavə, makroskop adi aşağı güclü mikroskopdan 5-10 dəfə incə olan sahə dərinliyinə malikdir. Bu dayaz sahə dərinliyi canlı primatın beynindəki fəaliyyətdən asılı olan daxili kortikal siqnallara əsaslanan kortikal arxitekturanın təsvirini asanlaşdırdı. Bu əksetmə ölçmələrində adi linzalarla müşahidə edilən səthi qan damarlarından böyük artefaktlar makroskopla yox edilib.

Bu kitabda neyron populyasiyaları ilə bağlı suallar ilk növbədə elektrodlarla tək və çox vahidli qeydlərdən istifadə etməklə araşdırılmışdır. Bu tədqiqatların aşkar etdiyi funksional təşkilatın mürəkkəbliyi mikroelektrodlarla çətin və ya qeyri-mümkün olan tamamlayıcı məlumatları əldə edə bilən yeni üsullara ehtiyac olduğunu göstərir. Böyük kortikal sahələrin kortikal təşkilatının yüksək məkan və ya müvəqqəti qətnamə xəritələrini təmin edən görüntüləmə üsulları, funksional təşkilatın tədqiqatları üçün xüsusi ümidvericidir.

Yeni Ca2+ göstəricisi Fura-2 ilə yüklənmiş siçovulların optik sinirindən alınan optik ölçmələr məməlilərin mərkəzi sinir sisteminin (CNS) miyelinli aksonlarında aktivliyə bağlı sürətli hüceyrədaxili [Ca2+] keçidlərinin mövcudluğunun ilk sübutunu təqdim edir. Nəticələr göstərir ki, bəzi miyelinli aksonlarda gərginliyə bağlı Ca2+ kanalları mövcuddur. Anteroqrad olaraq daşınan gərginliyə həssas boya ilə boyanmış aksonların optik ölçmələri bu aksonlarda Ca2+-dan asılı kalium keçiriciliklərinin olduğunu göstərir. Bu hesabat həmçinin Fura-2-nin elektrik fəaliyyəti nəticəsində hüceyrələrin daxilində [Ca2+] dəyişikliklərini asanlıqla aşkar edə bildiyini nümayiş etdirir və onun hüceyrədaxili Ca2+ keçidlərinin millisaniyəlik zaman domenində ölçülməsi üçün uyğunluğunu müəyyən edir.

Uyğun gərginliyə həssas boyaların və fotodetektorların massivlərinin mövcudluğu həm mədəniyyətdə, həm də onurğasız qanqliyalarda tək sinir hüceyrələrinin proseslərində yüzlərlə saytdan eyni vaxtda elektrik aktivliyinin optik monitorinqini asanlaşdırdı. Bu üsul həm də xüsusi davranış reaksiyalarına nəzarət edən bütün onurğasız qanqlionda bir çox fərdi neyronlarda aktivliyi aşkar etmək üçün unikal imkan verir. Məməlilərin beyin dilimlərində və ya təcrid olunmuş beyin strukturlarında bir çox qonşu lokuslarda neyron elementlərinin ayrı-ayrı populyasiyalarının (hüceyrə cisimləri, aksonlar, dentritlər və ya sinir terminalları) in vitro fəaliyyəti tədqiq edilmişdir. Bu yaxınlarda təbii qıcıqlar tərəfindən bütöv onurğalılarda və ya məməlilərin beynində yaranan elektrik fəaliyyətinin dinamik nümunələri də izlənilmişdir. Kompüterləşdirilmiş optik qeyd və displey prosessorundan istifadə etməklə, neyron elementlərinin video-göstərilən təsvirləri optik olaraq aşkar edilmiş elektrik aktivliyinin müvafiq nümunələri üzərinə əlavə oluna bilər, beləliklə, hüceyrədaxili fəaliyyətin məkan-zaman nümunələrini yavaş hərəkətdə görüntüləməyə imkan verir.

Bu fəsil sinir sistemlərində elektrik fəaliyyətinin məkan-zaman paylanmasını araşdırmaq üçün yeni yanaşmanı təsvir edir. Gərginliyə həssas boyalar və elektro-optik ölçmə sistemindən istifadə edərək, bu yaxınlarda ya mədəniyyətdə, ya da in vitro mühitdə bütöv bir mərkəzi sinir sistemində (MSS) tək sinir hüceyrələrinin prosesləri üzərində bir neçə yerdən elektrik aktivliyini eyni vaxtda izləmək mümkün olmuşdur. onurğasız qanqliyalarda davranış reaksiyasına nəzarət edən bir çox fərdi neyronların fəaliyyətini aşkar etmək və ya məməlilərin beyin dilimlərində və ya bütöv beyində bir çox qonşu lokuslarda neyron populyasiyalarının fəaliyyətini izləmək. Optik qeydlər və displey prosessorundan istifadə edərək sinir hüceyrələrinin təsvirləri elektriklə aktiv olduqda TV monitorunda işıqlanır. Beləliklə, elektrik fəaliyyətinin yayılması yavaş hərəkətdə sanki görünə bilər. Bu fəsildə bu yeni texnikanın tətbiqində son irəliləyişlər təsvir olunur.


Mikroskopiya

Əsas prinsiplər

Floresans mikroskopiyasının yaranması canlı hüceyrələrin tədqiqində irəliyə doğru böyük addım olmuşdur. Flüoresan zülallar kimi həyəcanlı bioloji flüoroforların xarakterik emissiyalarından istifadə edərək, hüceyrə quruluşu və funksiyası haqqında fikir əldə etmək mümkündür (Şəkil 2). Ənənəvi flüoresan mikroskopiyadan sonra flüoroforların iki və ya daha çox foton tərəfindən həyəcanlandığı multifoton metodlarının inkişafı olmuşdur [35]. Nümunə üzərində difraksiya ilə məhdudlaşan nöqtəyə fokuslanmış tək impulslu lazerlə çox fotonun udulması təmin edilir. Daha yüksək pik güclə, flüoroforun həyəcanlanmasına səbəb olan çox-foton udma ehtimalında artım var. İki fotonlu flüoresan Şəkil 3a-da təsvir edilmişdir. Bu vəziyyətdə həyəcan enerjisini qarşılamaq üçün iki 800 nm foton istifadə olunur. 400 nm-lik bir foton, tək foton həyəcanlandırmasında istifadə oluna biləcəyi kimi ekvivalent enerjiyə malikdir, lakin çox foton üsulları ilə yalnız nümunə üzərində lazer fokusunun sahəsi həyəcanlanır. Daha çox fokuslanmış həyəcan səbəbindən daha aşağı ümumi fototoksik təsir var. Həmçinin, daha uzun dalğa uzunluğuna malik fotonların səpilməsi daha az olduğu üçün, tək foton həyəcanlandırması ilə müqayisədə çoxfotonlu üsullar daha dərin nüfuza malikdir.

Floresan protein tətbiqləri. (a) GFP-rac1 və dsRed-E-cadherin ilə üç Madin-Darby köpək böyrək epitelial hüceyrəsi. Rac1 hüceyrə-hüceyrə yapışması və hüceyrə hərəkətliliyi ilə sıx əlaqəli olan pleiotropik siqnal molekuludur. E-cadherin iki əlaqə hüceyrəsi arasında əlaqəni asanlaşdırmaqdan məsul olan hüceyrə-hüceyrə yapışma zülalıdır. Ölçək çubuğu: 10 μm. Lance Kam (Kolumbiya Universiteti, Nyu York) tərəfindən hazırlanmışdır. (b) EYFP istifadə edərək görüntülənən insan göbək endotel hüceyrələrinin membranları. Ölçək çubuğu: 40 μm. (c) GFP-aktin etiketli insan göbək kordonu endotel hüceyrəsi mitoz keçir, aktin filamentləri sentriollara doğru düzülür. Ölçək çubuğu: 30 μm. Samuel Sia (Kolumbiya Universiteti, Nyu York) tərəfindən hazırlanmışdır.

İki fotonlu mikroskop in vivo beyin funksiyası. (a) İki fotonlu flüoresansın əsas mexanizmi. (b) Möhürlənmiş şüşə pəncərə və mikroskopun obyektiv yerləşdirilməsi ilə açıq korteksin cərrahi hazırlanmasının sxemi. Yaşıl nöqtə iki fotonlu flüoresansın yerini göstərir. (c) Dekstran-konjuge flüoreseinin venadaxili yeridilməsindən sonra damar sisteminin iki fotonlu xəritələrinin nümunələri. Qara nöqtələr və zolaqlar qırmızı qan hüceyrələrinin hərəkətini göstərir. (d) Neyron (yaşıl) və damar (qırmızı) siqnalların iki kanallı təsviri: (solda) Oreqon Yaşıl 488 BAPTA-1 AM kalsiuma həssas boya ilə boyanmış neyronlar və (sağda) subpopulyasiyada yaşıl flüoresan zülalı (GFP) ifadə edən transgenik siçan neyronların (Cefri M. Fridman tərəfindən təchiz edilmiş siçan, Rokfeller Universiteti, Nyu York) [101]. Texas dekstran qırmızı hər iki halda damardaxili izləyicidir. (e) Amiloid hədəfləyən boya (mavi), neyronları və dendritləri (yaşıl) ifadə edən GFP və damar sistemi (qırmızı) ilə Tg2576 APP Alzheimer xəstəliyi siçan modelinin üç kanallı təsviri. [52]-dən uyğunlaşdırılmış və Elizabeth Hillman (Kolumbiya Universiteti, Nyu York) tərəfindən hazırlanmışdır.

STED (Stimulated Emission Depletion) mikroskopiyasında [36, 37] difraksiya maneəsini qırmaq üçün iki impulslu lazer tandemdə istifadə olunur. Birinci lazer nəbzi flüoroforları həyəcanlandıran dalğa uzunluğuna malikdir və dərhal flüoresansı azaldan ikinci lazer nəbzi gəlir. Floresansın tükənməsi ikinci lazerin dalğa uzunluğunun flüoresan emissiyasından daha uzun olması üçün tənzimləndiyi üçün əldə edilir. İkinci lazerdən bir fotonun udulması elektronları daha aşağı enerji səviyyəsinə (stimullaşdırılmış emissiya) endirərək tipik flüoresansiyanın qarşısını alır. Fokuslanmış iki şüanın sahəsindəki fərq flüoresansın aşkar edildiyi yerdən yalnız çox kiçik bir sahəni tərk edir. Bu sahə difraksiya ilə məhdudlaşan nöqtədən kiçikdir. STED-dən istifadə edərək, təsvirlər qətnamə ilə çəkilmişdir

30 nm [35]. Romadin amidindən və fotoşəkilləmə texnikasından istifadə edilən başqa bir araşdırmada 15 nm qətnamə əldə edilmişdir [38]. [39, 40]-da RNT polimerazanın cüt əsaslı pilləli addımlarının angstrom ayırdetmə ölçmələrini etmək üçün optik tutma sistemi istifadə edilmişdir və bununla da molekulyar biologiyada mühüm ayırdetmə meyarını yaratmışdır.

Elektron mikroskopiya bir həll təklif etdi

Bioloji toxumanın təsviri üçün 5 nm [41]. Bununla belə, elektron mikroskopla təsvir ediləcək nümunənin hazırlanması canlı nümunələrin təsvirinə imkan verməyən ciddi bir prosesdir [42]. Ümumi nümunə hazırlama üsullarından biri elektron mikroskopiyada kontrastla nəticələnən yüksək təzyiq və dərin dondurma üsulu olan kriyofiksasiyadır [43]. Nümunələr artıq həyat qabiliyyətli olmasa da, elektron mikroskopiya orqanoidlərin və membranların struktur detalları haqqında əvəzsiz fikirlər təmin etmişdir [44].

Atom qüvvəsi mikroskopları məlumatı optik olaraq deyil, daha çox zond ucu ilə səth arasında molekullararası qüvvələri qeyd etməklə əldə edir. Atom güc mikroskopunun əsas məlumat əldə etmə komponenti nanometr miqyaslı silikon ucu olan konsoldur. Ucu nümunə ilə yaxın məsafəyə gətirilir və nümunə səthinin kontur xəritəsini yaratmaq üçün Van der Waals qüvvələrinin təsirindən konsolun əyilməsi qeydə alınır [45, 46]. Elektron mikroskopla müqayisədə nümunənin faktiki olaraq nümunəni məhv edəcək və təkrar istifadəsinə mane olacaq hər hansı xüsusi müalicəyə ehtiyac yoxdur. Bununla belə, gərginlik kimi ölçmələr əldə etmək üçün nümunə səthinə təsir edən atom qüvvəsi mikroskopunun kontakt və ya vurma rejimindən istifadə hüceyrələrə və toxumalara mexaniki zərər verə bilər. Digər zond mikroskopiya üsullarına skan edən tunel mikroskopiyası və yaxın sahədə skan edən optik mikroskop daxildir [47].

Cari tətbiqlər

Flüoresan mikroskopiya sistem biologiyasında tez-tez istifadə olunur və yüksək ötürmə metodlarının inkişafı üçün güclü təkan var. Hər bir bastırılmış gen üçün fenotipi sənədləşdirmək üçün genom geniş RNT ekranlarının tətbiqində [48, 49], bir ekrandan bir neçə terabayt məlumat təşkil edə bilən milyonlarla görüntü ola bilər [50]. Məhz sistem biologiyasının modelləşdirilməsi effektiv təsnifat vasitəsi təmin etməklə bu böyük həcmdə RNTi ekran görüntüsü məlumatının işlənməsi problemini aradan qaldırır. Yüksək ötürmə qabiliyyəti mikroskopiyası ilə annotasiya edilə bilən və ya əl ilə qiymətləndirilə biləndən daha çox məlumat yaradılır və buna görə də yüksək ötürmə qabiliyyəti metodlarının potensialını açmaq üçün incə tənzimlənmiş və səmərəli təsnifat modelinin hazırlanması çox vacibdir.

Şəkil 2-də göründüyü kimi, flüoresan zülallar hüceyrələrin bir çox funksional və struktur aspektlərini vizuallaşdırmaq üçün istifadə edilə bilər. Çox foton metodlarından istifadə də hüceyrənin struktur və biokimyəvi dəyişiklikləri haqqında məlumat verə bilər [51]. Multi-foton metodları da daxil olmaqla geniş tətbiq sahəsinə malikdir in vivo heyvanlarda beyin təsviri (Şəkil 3) [52-54], burada kortikal mikro-arxitektura tək hüceyrə həlli ilə tədqiq edilmişdir [55]. Makromolekulun strukturunu aydınlaşdırmaq üçün elektron mikroskoplardan istifadə edilmişdir [41]. Xərçəng tətbiqlərinə gəldikdə, atom qüvvəsi mikroskopları DNT-nin super qıvrılmış vəziyyətini izləmək üçün istifadə edilmişdir, bu, şişi boğan p53 zülalının bağlanmasına üstünlük verir [56]. Hüceyrələrdə p53 səviyyəsinin aşkarlanması ilə əlaqədar olaraq, onkolitik adenovirusların effektivliyini müəyyən etmək üçün flüoresan mikroskopiyadan istifadə edilmişdir. Xüsusi olaraq hazırlanmış onkolitik adenoviruslar xərçəngli toxumaları hədəf alır və hüceyrə p53 səviyyəsi aşağı olduqda təkrarlanmaq üçün proqramlaşdırılmışdır. Viral onkolitik terapiya xərçəngin müalicəsi üçün intensiv tədqiqat sahəsidir və mikroskopiya üsulları irəlilədikcə, şişin ablasiyası üçün viral vektorların effektivliyini qiymətləndirmək imkanı da artacaqdır [57, 58].

Üstünlüklər və məhdudiyyətlər

Uzun müddətdir ki, işığın dalğa təbiəti mikroskopun həlledici gücünə zahirən fundamental məhdudiyyətlər qoyur. Məhdudiyyət görünən işığın dalğa uzunluğunun təxminən yarısı və ya 200 nm idi. Bu yaxınlarda mikroskopiyadakı irəliləyişlərlə 10 dəfədən çox ayırdetmə yaxşılaşması müşahidə edilmişdir [35, 38]. Bununla belə, optik üsullar məhdud nüfuza malikdir, çünki işıq asanlıqla toxumaya səpilir. Bu, daha güclü lazerlərdən istifadə etməklə qismən düzəldilə bilər, lakin bu, öz növbəsində, eksperimentin davam edə biləcəyi vaxtın miqdarını məhdudlaşdıra bilən foto ağartma effektlərinin artmasına səbəb ola bilər.

Mikroskopiya, digər müasir təsvir üsullarında olduğu kimi, görüntü əldə etmək və təhlil etmək üçün proqram təminatından daha çox asılı olmuşdur. Təsvir texnologiyası birləşdirildiyi proqram təminatı ilə təkmilləşdirilə və ya məhdudlaşdırıla bilər. Cədvəl 2-də cari mikroskopiya görüntü analizi proqram təminatının icmalı var. Alqoritmlər və optika sahəsindəki irəliləyişlərlə holoqrafik mikroskopiya əldə edilmişdir ki, bunun vasitəsilə bir təsvirdə tam üçölçülü məlumat əldə edilə bilər [59, 60]. Nəticədə, fokusun dəyişdirilməsinə və çoxlu z-təyyarələrinin skan edilməsinə ehtiyac olmadan həcmli zaman seriyası məlumatları toplana bilər.


Müzakirə

Burada biz beyin qabığında WD-nin məkan-zaman modellərini və mexanizmlərini öyrəndik. Fərdi miyelinsiz kortikal aksonal arbours üçün WD-nin tam miqyasını izləmək üçün kranial pəncərə və lazer vasitəçiliyi ilə lezyonlar vasitəsilə flüoresan membran izləyicisinin in vivo 2-fotonlu vaxt fasiləsi görüntüsünü birləşdirdik (Şəkil 1). Kortikal akson degenerasiyası ilə bağlı yeni anlayışlar təqdim edirik: (1) aşağıdakı seqmentlər

600 μm uzunluğunda ardıcıl olaraq daha sürətli WD formasına (roWD) məruz qalır (2) sinaptik sıxlıq, lakin arbor mürəkkəbliyi deyil, kortikal akson vaxtına kömək edir WD (3) AAD zədələnmiş kortikal aksonlarda əhəmiyyətsizdir və (4) WD-yə bənzər sinir sisteminin digər hissələrində və AAD, bir NAD + -asılı siqnal yolu, transkripsiyadan asılı olmayaraq, kortikal akson roWD və WD-ni gecikdirir.

Onurğa beyni zədəsinin in vivo optik görüntüləri son illərdə akson degenerasiyası və bərpası mexanizmləri haqqında unikal fikirlər təmin etmişdir [20, 23, 58]. Bununla belə, biz məməlilərin beynində akson degenerasiyası və bərpası prinsiplərini anlamaq üçün bu alətdən yalnız indi istifadə etməyə başlayırıq [37,38,39, 59,60,61]. Yerli zədələnməyə səbəb olmaq üçün şüşə pəncərələr vasitəsilə optik metodların məhdudiyyətlərinə travmatik beyin zədəsi və ya dağınıq skleroz kimi daha mürəkkəb tipli zədə şəraitlərinin modelləşdirilməsinin mümkünsüzlüyü və yerli mühitlə manipulyasiya etmək üçün beyinə terapevtik birləşmələrin daxil olmasının çətinliyi daxildir. in vivo [62]. Əvvəllər bildirilmiş metodlarla müqayisədə lazer vasitəçiliyi ilə aksonal kəsilmənin üç əsas üstünlüyü var. Birincisi, lazer mikrocərrahiyyəsi bütün degenerasiya prosesini zədə yerindən aksonun son ucuna qədər 4-10 μm məsafədə aşkar edir [13, 38]. Bunun əksinə olaraq, mexaniki və ya iynə yaralanmasından sonra anatomik təhriflər o deməkdir ki, aksonal dəyişikliklər yalnız zədə yerindən bir məsafədə (> 100 μm) müşahidə edilə bilər. İkincisi, yerli aksonal zədə dura mater və yuxarıdakı qan damarlarını qırmadan, iltihab vasitəçilərinin töhfələrini azaltmadan induksiya edilə bilər, bununla da hüceyrə qarşılıqlı təsirlərinin mürəkkəbliyini azaldır və eksperimental təkrarlanma qabiliyyətini yaxşılaşdırır [38, 63]. Üçüncüsü, bir neçə neyron və ya hətta bir neyron hissələri [25], eyni vaxtda ətrafdakı toxumalara minimal ziyan vurmaqla hədəf alına bilər [13, 36, 38, 64,65,66,67].Bu lezyon metodunun əvvəlki tədqiqatlarda olduğu kimi aksoplazmanın yox, aksolemmanın selektiv monitorinqi ilə birləşməsi bizə akson degenerasiyasının icra fazalarının vaxtını dəqiq ölçməyə imkan verdi, sitoplazma parçalanmasının birbaşa itkisi ilə müşayiət olunmayan hallarını istisna etdi. membranın bütövlüyü (əvvəllər bildirildiyi kimi [4, 15] və bizim məlumatlarımız AAD üçün belədir, Şəkil 5). Bu nəticələr göstərir ki, mikrotubullar və neyrofilamentlər kimi aksoplazmatik komponentlər WD-də ilk dəyişikliyə məruz qalır, aksonal membran isə bu əvvəlki hesabatlara uyğun olaraq daha uzun müddət davam edir [4, 15]. Biz gözləyirik ki, bu paradiqma və onun təkmilləşdirmələri, məsələn, sitoskeletal [68], mitoxondriya [69] və membran markerlərinin eyni vaxtda görüntülənməsi yolu ilə digər siçan xəstəlik modellərində (məsələn, Alzheimer xəstəliyi) və ya insan-siçan kimerikində aksonal degenerasiyanı araşdırmaq üçün faydalı olacaq. xəstəyə məxsus genetik fonları istifadə edən modellər [31, 70].

Bildiyimizə görə, bizim tədqiqatımız tək akson rezolyusiyasında məməlilərin beyin qabığındakı WD-nin məkan-zaman dinamikasının monitorinqi, eləcə də mexanizmlərinə işıq salmaq problemini həll edən ilk tədqiqatdır. Bir neçə neyrodejenerativ və kəskin zədə şəraitində zəifliklərinə görə, əsasən kortikal təbəqə 2/3/5/6 və talamusdan yaranan həyəcanlandırıcı miyelinsiz aksonlara yönəlmiş bir etiketləmə strategiyasından istifadə etdik. Bildirilən degenerasiya kinetikası siçanın onurğa beynində [20], periferik sinirlərdə [71] və optik sinirdə [18] WD üçün dərc edilmiş vaxt çərçivələrinə düşür, lakin kortikal akson seqmentlərinin kəsildiyini göstərir.

600 μm həm WD, həm də AAD ilə müqayisədə fərqli məkan və müvəqqəti degenerasiya inkişaf modelinə malikdir. Zədələnmiş zaman aksonal arborun yalnız kiçik bir faizi (< 1%) roWD-yə məruz qalsa da, roWD AAD ilə müqayisədə 2-3 dəfə daha çox akson uzunluğuna təsir edir [20] (bax. Əlavə fayl 5).

Zebra balığı sürfələrində əvvəlki işlərdə, ayrılmış aksonal seqmentin uzunluğu kritik parametr deyildi, geriləmə mərhələsinin (burada başlanğıc adlandırırıq) müddətinə təsir göstərmədi və yalnız parçalanma sürətinə bir qədər təsir etdi [13]. Məməlilərin kortikal neyronlarında WD və roWD arasında parçalanma dərəcələrindəki fərq (Şəkil 2d, g) növlər və sinir sistemi arasında degenerasiya prosesinin təbii dəyişkənliyini əks etdirə bilər. Məlumdur ki, degenerasiya kinetikası böyüklərdə aksonlar arasında dəyişir [11] və daha çox inkişaf zamanı. Məsələn, inkişaf etməkdə olan zebra balığında aksotomizləşdirilmiş trigeminal aksonlarda degenerasiyanın başlanması zamanı embrion mərhələdən asılı fərqlər və AAD-nin aşkar olmaması göstərilir [13]. Digər akson alt tipləri, məsələn, zebra balığının yanal xətt proyeksiyaları, parçalanma dəlili aşkar edilməsə də, lezyonun hər iki tərəfində sürətlə boşluq əmələ gəlməsi ilə AAD-yə bənzəyən prosesdən keçir [29].

Kortikal aksonlar üçün həm başlanğıcın (başlanğıc, Şəkil 2d, e) və həm də icra mərhələsinin (parçalanma kinetikası, Şəkil 2d və 3c) vaxtı təqribən 600 μm olan kəsmə uzunluğundan asılı olaraq fərqlənir. Bizim məlumatlarımız kortikal akson degenerasiyasının başlanğıcını izah etmək üçün xətti uzunluğa əsaslanan mexanizmlə uyğun gəlmir, məsələn, kəsilmiş zebra balığı trigeminal aksonlarında, daha uzun kəsilmiş seqmentlərin degenerasiyaya başlamasının daha uzun sürdüyünü aşkar edən başqaları tərəfindən təklif olunur [13]. Əlavə faylda göstərildiyi kimi, "ərəfədən asılı" mexanizm, ehtimal ki, kortikal roWD və WD-ni idarə edir (bax. Əlavə fayl 2). Bu, ya "qoruyucu amil" və ya "degenerasiya tetikleyici amili" səviyyəyə əsaslanan hədd ola bilər. “Qoruyucu faktor” səviyyəsinə əsaslanan hədd üçün degenerasiya inhibitorunun miqdarı (məsələn, NAD+ və ya neyro-qoruyucu NAD sintez edən ferment Nmnat2 [14, 72, 73]) dayandırılmadan əvvəl kritik hədd səviyyəsindən [74] aşağı düşəcək. qırılan membranın yenidən bağlanması prosesinin (in vitro zədədən 30 dəqiqə sonra baş verə bilər [75]), parçalanmanın sürətlə başlamasına səbəb olur. Daha uzun seqmentlərdə, kəsilmiş ucundan olan membran tükənməzdən əvvəl yenidən bağlanır və beləliklə, bu fraqmentlər davam edir. 'Dejenerasiya tetikleyici faktor' səviyyəsinə əsaslanan hədd üçün, kəsilmiş uc vasitəsilə hüceyrədənkənar kalsium axını ilə vasitəçilik edilən kalsium axını (məsələn, calpains [76] kimi aşağı axın effektorları vasitəsilə) kimi kritik bir trigger miqdarı [77, 78], daha qısa seqmentlərdə sürətlə əldə ediləcək və buna görə də uzun seqmentlərlə müqayisədə tez parçalanacaq. Qısa, zədələnmiş aksonal seqmentlərin neyropildən sürətlə çıxarılması beyin homeostazını sürətlə bərpa etmək və neyropili zibildən azad saxlamaq mexanizmi kimi inkişaf etmiş ola bilər.

Kortikal roWD və WD-nin NAD + - asılı mexanizmlər tərəfindən tənzimlənməsinə dair nəticələrimiz (Şəkil 6) Wld S siçanlarında [79, 80] gecikmiş dopaminerjik və striatal sinaptik degenerasiyanın əvvəlki məlumatları ilə uyğun gəlir, bu da Wld S-əsaslı neyroprotektiv terapevtiklər təkcə miyelinli deyil, həm də miyelinsiz, boz maddə liflərinin degenerasiyası üçün hazırlana bilər. Bu nəticələr məməlilərin sinir sisteminin müxtəlif sahələrində degenerasiyanın müxtəlif məkan-zaman modellərinə baxmayaraq, WD-yə nəzarət edən molekulyar mexanizmlərin daha da qorunduğunu nümayiş etdirir [26].

Kortikal aksonların sinaptik əlaqələrinin sıxlığı nə qədər yüksək olarsa, degenerasiya daha gecikir (Şəkil 4). Neyrodegenerasiyada sinaps itkisi aksonal və hüceyrə bədəni itkisindən asılı olmayaraq baş verə bilər ki, bu da müxtəlif mexanizmlərin bu bölmələrin degenerasiyasını tənzimlədiyini göstərir [81,82,83]. Biz fərz edirik ki, sinapsların olması akson qoruyucu faktorlarının tükənməsini və ya degenerasiya tetikleyicilərinin yığılmasını, ola bilsin, akson boyunca daha yavaş diffuziya yolu ilə və ya sinaptik mexanizmlə çarpaz əlaqəyə malik olması səbəbindən parçalanmadan əvvəl gecikmə mərhələsini uzatmaqla məhdudlaşdırır.

Gələcəkdə burada istifadə edilən in vivo optik görüntüləmə yanaşması kortikal akson degenerasiyasını tənzimləyən molekulyar və hüceyrə mexanizmlərinin daha yaxşı başa düşülməsinə səbəb ola bilər ki, bu da akson və sinaptik itkilərin inkişafının qarşısını almaq və ya sabitləşdirmək üçün effektiv müalicələrin inkişafında zəruri addımdır. həm xəstə, həm də zədələnmiş beyində.


Super Qətnamə ilə Biologiyanı İrəli İlə

Super rezolyusiyaya malik mikroskopiya molekulyar dünyaya difraksiya həddini aşan işıq salmaqla biologiya anlayışımızda inqilab etdi. Ənənəvi işıq mikroskopiyası ideal şəraitdə təqribən 200 nm ayırdetmə ilə məhdudlaşır, burada ayırdetmə buraxılan işığın dalğa uzunluğunun təxminən yarısıdır. Bu hədddən kiçik olan hər şey a kimi görünür difraksiya məhdud nöqtəsi.

Difraksiya həddi (d) buraxılan işığın dalğa uzunluğu (λ) və obyektin ədədi aperturası (NA) ilə bağlıdır.

Super rezolyusiyaya malik mikroskopiya biologiyada əvvəllər məlum olmayan strukturları aşkar etdi və bizə ayrı-ayrı molekulların dinamik davranışını göstərdi. Super rezolyusiyaya malik mikroskopiya difraksiya həddini aşmaq üçün fiziki fəndlərdən istifadə edir, o cümlədən nümunələri dəyişkən naxışla işıqlandırmaq, həyəcan şüasının kənarında flüoresansiyanın tükənməsi və tək molekulların görüntülənməsi. Bu üsullar boyanın yaradılması, əldə etmə sürəti və fototoksikliyin azaldılması sahəsində irəliləyişlərlə daim təkmilləşir.

Talley J. Lambert (2015). Aktin (qara), mitoxondri (qırmızı) və DNT (mavi) hüceyrə komponentlərini vurğulayan inək ağciyər arteriya hüceyrəsi. Nikon Kiçik Dünya Müsabiqəsi. https://www.nikonsmallworld.com/galleries/2015-photomicrography-competition/cow-lung-artery-cell

Strukturlaşdırılmış İşıqlandırma Nümunələri vizuallaşdırır və Canlı Görünüş üçün İdealdır

Strukturlaşdırılmış işıqlandırma mikroskopiyası (SIM) difraksiya həddini aşan naxışları və strukturları vizuallaşdırmaq üçün daşınan barmaqlıqdan istifadə edir. İki şəbəkə yanlış hizalandıqda, onlar kimi tanınan müdaxilə nümunələri yaradırlar Moire saçaqları. Bir torun kimliyini bilirsinizsə, onda siz riyazi olaraq Moire saçaqlarından ikinci şəbəkəni çıxara və yenidən qura bilərsiniz. SİM şəbəkə yaratmaq üçün zolaqlı naxışa yönəldilmiş həyəcan işığından istifadə edir. Nümunə yenidən qurulan naməlum şəbəkə kimi çıxış edir.

"Şəbəkə arxada digəri ilə səhv uyğunlaşdırıldıqda, bu Moiredir." https://i.gifer.com/CfiN.gif

SİM sürətli əldə edilməsi və aşağı işıqlandırma intensivliyinə görə canlı nümunələrin super ayırdetmə təsviri üçün idealdır, baxmayaraq ki, onun həlli digər super ayırtetmə üsullarından daha təvazökardır. SİM 100 nm yanal ayırdetmə və təxminən 300 nm eksenel ayırdetmə ilə optik bölmə əldə edir. SİM-in digər üstünlüyü ondan ibarətdir ki, o, xüsusi boyalara ehtiyac duymur, standart boyalardan istifadə edərək rəng spektri üzrə super rezolyusiyada təsvir etməyə imkan verir. Buna görə də istifadəçinin konfokal və ya geniş sahəli mikroskopiya üçün hazırlanmış nümunə götürməsi və SİM-i yerinə yetirməsi mənasızdır.

SİM-də bəzi xəbərdarlıqlar var. Nümunə yenidən qurulduğundan, yekun təsvirlər kəmiyyət xarakteri daşımır, buna görə də SİM şəkillərin kolokalizasiyası təhlili piksel intensivliyinin korrelyasiyasından istifadə etməklə deyil, daha çox obyektə əsaslanan üsullarla, məsələn, seqmentləşdirilmiş obyektlərin üst-üstə düşməsinin ölçülməsi ilə aparılmalıdır (bax: Hong et al. , (2017)). Diqqətlə biologiya və rekonstruksiya parametrlərini nəzərə almaq vacibdir, çünki fokusdan kənar (“bal pətək”) psevdostrukturlar, xüsusən də hüceyrə doldurmaları kimi punktat olmayan siqnallarda çox yayılmışdır. Nəhayət, SİM toxumanın dərin hissələrini təsvir edərkən yaxşı işləmir, çünki səpilmə işıqlandırma və emissiya nümunələrini təhrif edir.

STED ilə daha kəskin şəkil üçün flüoresansın basdırılması

Stimullaşdırılmış emissiya tükənməsi (STED) mikroskopiyası şüa skan edən konfokal ilə eyni işləyir, lakin stimullaşdırılmış emissiyadan istifadə edərək flüoresan ləkənin ölçüsünü azaldır və təxminən 50 nm yanal ayırdetmə yaradır. Təsvirdə olduğu kimi, həyəcan şüasının nümunəyə fokuslanması difraksiya ilə məhdudlaşır. STED, flüoresanlaşan həyəcanlı sahəni azaltmaq üçün həyəcan şüasını əhatə edən pişi formalı tükənmə şüasından (həmçinin STED şüası adlanır) istifadə edir.

Effektiv fluoressensiya nöqtəsinin yayılması funksiyasını (PSF) azaltmaq üçün STED tükənməsinin sxemi. Hiersemenzel və digərlərindən, (2013)

STED sabit və canlı görüntüləmə üçün faydalıdır, lakin millisaniyəlik miqyasda vaxt ayırdetmə qabiliyyətinə malik olmaq üçün görüntü sahəsi kiçildilməlidir və yüksək intensivlikli STED şüası uzunmüddətli görüntüləmə ilə fototoksikliyə kömək edə bilər. Nümunələr STED şüası ilə tükənən CF®405M, CF®488A və CF®680R kimi STED uyğun flüoresan zülalların və ya boyaların istifadəsindən başqa minimal xüsusi hazırlıq tələb edir. Digər super ayırdetmə üsullarından fərqli olaraq, STED kəmiyyətdir, çünki o, post-processing və ya rekonstruksiyaya etibar etmir.

Peroksizomların (mavi), vimentin (yaşıl), giantin (qırmızı) və nüvə məsamələrinin (boz) konfokal (yuxarı) vs STED (aşağı) şəkilləri. Winter və digərlərindən uyğunlaşdırılmışdır, (2017)

Üstün Boya və Lazerlərlə STED-in təkmilləşdirilməsi

Çoxlu STED şüalarından istifadənin qeyri-mümkünlüyünə görə STED adətən hər sınaq üçün bir və ya iki STED kanalı ilə məhdudlaşır. Boya mühəndisliyindəki irəliləyişlərlə hiperspektral STED (“Hyper-STED”) tək bir STED şüasından istifadə etməklə CF®680R daxil olmaqla dörd boyaya qədər eyni vaxtda təsvir etmək üçün hazırlanmışdır (Winter et al., 2017). Spektral aşkarlama ilə birlikdə bu texnika görüntüləmə sürətini artırır və fototoksikliyi azaldır. Hyper-STED-də istifadə edilən ağ işıqlı supercontinuum lazeri hazırda çox xərc tələb edir, lakin gələcəkdə daha aşağı aparat xərcləri və daha çox STED-ə uyğun boyaların mövcudluğu ilə əlçatanlıq yaxşılaşdırılmalıdır.

Tubulin (yaşıl), endoplazmatik retikulum (mavi) və endosomları (qırmızı) etiketləyən canlı hüceyrələrdə 3 rəngli Hyper-STED. Winter və digərlərindən uyğunlaşdırılmışdır, (2017)

Tək Molekulların Görüntülməsi Struktur və Molekulyar Dinamikalar haqqında məlumat verir

Parlaq və fotosabit boyaların və flüoresan zülalların yaranması ultrastrukturun və ayrı-ayrı molekulların dinamik davranışını aşkar etmək üçün tək molekullu görüntüləmənin yeni dövrünü təmin etdi. İzolyasiya olunmuş ləkələrdən fotonları toplayaraq, tək molekul üsulları 20 nm ayırdetmədə molekulun ən çox ehtimal olunan mövqeyini hesablayır. Stokastik optik rekonstruksiya mikroskopiyası (STORM) işıq və qaranlıq vəziyyətlər arasında boyaların təsadüfi fotoşəkilləndirilməsinə əsaslanır, onun bacısı olan fotoaktivləşdirmə lokalizasiya mikroskopiyası (PALM) isə görüntü yaratmaq üçün təcrid olunmuş tək molekulların birləşmələrinin fotoaktivləşdirilməsindən istifadə edir. Tək hissəciklərin izlənməsi (SPT) bizə molekulların hərəkət edərkən dinamik davranışını göstərir.

Difraksiya məhdud nöqtə-yayılma funksiyasından tək molekulun lokalizasiyası (Gustafsson et al., n.d.).

STORM bir qiymətə misilsiz həlli təmin edir

STORM optik mikroskopiyada ən yüksək rezolyusiyanı təklif edir. Tək molekulları lokallaşdırmaqla, STORM çoxlu fotoaktivləşdirmə və ağartma dövrü ilə bu lokallaşdırılmış ləkələrdən ibarət kompozit təsvir yaradır. STORM adi üsullarla mümkün olmayan zərif aksonal sitoskeleton da daxil olmaqla hüceyrədaxili birləşmələrin mürəkkəb quruluşuna malikdir. Bununla belə, STORM nümunənin intensiv fotoaktivləşdirmə lazerinə daimi məruz qalması səbəbindən aşağı əldəetmə sürəti və fototoksiklikdən əziyyət çəkir.

STORM, aksonun dövri quruluşunu ortaya qoydu (Xu et al., 2013).

STORM fərqli işıq və qaranlıq vəziyyətə malik bir neçə CF® boyası kimi fotoşəkilli, “yanıb-sönən” boyalardan istifadə edir. STORM ilə canlı görüntüləmə mümkün olsa da, kifayət qədər təsvir dövrünün həyata keçirilə biləcəyi sabit nümunələrə və ya obyektin hərəkətinin minimal olduğu canlı nümunələrə ən yaxşı şəkildə tətbiq edilir. Boya keçidini təşviq etmək üçün tamponlar, etiketləmə və montaj şərtləri diqqətlə optimallaşdırılmalıdır. Digər super ayırdetmə üsullarında olduğu kimi, boya yenilikləri STORM-da təkmilləşdirmələrə təkan verir. STORM intensiv və daimi işıqlandırmaya əsaslanır və çoxrəngli STORM spektral olaraq ayrıla bilən boyalar tələb edir. Spektral olaraq fərqlənən, təkmilləşdirilmiş molekulyar parlaqlığa malik yanıb-sönən boyalar işığın işıqlandırılmasının və fototoksikliyin intensivliyini azaldır və sadə üzvi boyalarla çoxrəngli STORM-a imkan verir.

Tək Molekul İzləmə Molekulyar Davranışı aşkar edir

STORM struktur anlayışları əldə etmək üçün istifadə edilsə də, tək molekul izləmə (SMT) molekulların dinamik davranışını öyrənir. STED, SIM və ya adi mikroskop şəklini istifadə edərək canlı görüntüləmə təcrübələri orta etiketli molekulların populyasiyasının davranışı, lakin SMT təcrübələri ayrı-ayrı molekulların öyrənilməsinə imkan verir, diffuz molekulların və molekulyar tərəfdaşların fərqli populyasiyalarının mövcudluğu kimi qiymətli fikirlər verir.

SPT təcrübələri PSD-95 (psevdorəngli sıxlıq xəritəsi) ilə (SEP-TM-Bind) və ya PSD-95 bağlama domeni (SEP-TM-Nonbind) ilə qarşılıqlı əlaqədə olan transmembran zülalların (bənövşəyi izlər) diffuziya sürətlərini izləyir (Li & Blanpied, 2016).

Tək molekulun izlənməsi fotosabit flüoroforlara əsaslanır. Kvant nöqtələri yüksək parlaqlıq və fotostabilliyə görə istifadə edilmişdir, lakin üzvi boyalar və flüoresan zülallarla müqayisədə böyükdür. İnkişaf yüksək molekulyar parlaqlığa və aşağı fotoağartma sürətinə malik fotosabit üzvi boyalar və flüoresan zülalların istehsalına yönəldilmişdir. CF® boyaları CF®633 və CF®680R tək molekulun izlənilməsi üçün idealdır, çünki onların qırmızı və uzaq qırmızı həyəcanları fototoksikliyi azaldır.

2 Fotonlu Mikroskopiya ilə Dərinlikdə Görünüş

Super rezolyusiya və adi mikroskopiya toxumanın dərinliklərində və ya davranan orqanizmlərdə şəkil çəkməyə cəhd edərkən əziyyət çəkir. Görünən işıq toxuma tərəfindən udulur və ya səpilir, onun nüfuzunu məhdudlaşdırır, lakin infraqırmızı və yaxın IR işığı daha az təsirlənir. Ənənəvi tək fotonlu mikroskopiya udulmuş işığın dalğa uzunluğuna malik bir flüoroforu həyəcanlandırsa da, 2-fotonlu mikroskop əvəzinə daha uzun dalğa uzunluğu olan iki fotondan istifadə edir. 2-fotonlu mikroskop adətən CF®488A, CF®594 və CF®680R daxil olmaqla boyalarla orqan səviyyəli təşkilatı təsvir etmək üçün uzun iş məsafəsi məqsədləri ilə hüceyrə və ya makroskopik səviyyədə istifadə olunur.

2-fotonlu mikroskopiya, həmçinin kalsium kimi biosensorların təsviri və son zamanlarda dopamin ifrazının ultrafast görüntülənməsi üçün də geniş istifadə olunur (Patriarchi et al., 2018). Beləliklə, boyama mühəndisliyi vasitəsilə əldəetmə sürəti və hüceyrə miqyasında ayırdetmə qabiliyyətinin yaxşılaşdırılması üzrə 2-fotonlu mikroskopiyada inkişaflar. 2-fotonlu mikroskop boya molekullarını həyəcanlandırmaq üçün toxumaya daha yaxşı nüfuz edə bilsə də, yayılan flüoresan da səpilməyə məruz qalır. Bu məqsədlə, dərin təsvirlərdə ayırdetmə qabiliyyətini yaxşılaşdırmaq üçün CF®680R kimi qırmızıya dəyişdirilmiş boyalar hazırlanmışdır.

İrəlidə Super Resolution Trends

Super ayırdetmə mikroskopiyası təkmilləşməyə davam edir. Təkmilləşdirmə üçün əsas sahələr boyalar və nümunələrin hazırlanmasıdır. Bu yaxınlarda, SİM, həlletmə qabiliyyətini daha da genişləndirmək üçün STORM prinsipləri ilə birləşdirildi (D. Li et al., 2015). Super ayırdetmə mikroskopiyası, molekulyar quruluşa daha da dərindən baxmaq üçün genişləndirmə mikroskopiyası kimi yeni nümunə hazırlama üsulları ilə birləşdirildi (Tillberg et al., 2016 Wang et al., 2018 H. Xu et al., 2019).

  1. Dodgson, J., Chessel, A., Cox, S., & amp Carazo Salas, R. E. (2015). Super Rezolyutsiya Mikroskopiyası: SIM, STED və Lokalizasiya Mikroskopiyası. T. E. S. Dahms və K. J. Czymmek (Red.), Mikologiyada təkmil mikroskopiya (səh. 47–60). Springer Beynəlxalq Nəşriyyatı. https://doi.org/10.1007/978-3-319-22437-4_3
  2. Hiersemenzel, K., Brown, E. R., & Duncan, R. R. (2013). Tək İon Kanallarının Böyük Kohortlarının və Onların Fəaliyyətinin Görünüşü. Endokrinologiyada sərhədlər, 4. https://doi.org/10.3389/fendo.2013.00114
  3. Hong, S., Wilton, D. K., Stevens, B., & amp Richardson, D. S. (2017). Sinaptik strukturun və funksiyanın tədqiqi üçün Strukturlaşdırılmış İşıqlandırma Mikroskopiyası. Molekulyar Biologiyada Metodlar (Clifton, N.J.), 1538, 155–167. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6688-2_12
  4. Gustafsson, M. G. L., Betzig, E., Hess, H. F., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., & amp Davidson, M. W. (n.d.). ZEISS Mikroskopiya Onlayn Kampusu | Super rezolyutsiya mikroskopiyasına giriş. Mikroskopiya və Rəqəmsal Görünüşdə Zeiss Təhsili. 7 iyul 2020-ci ildə http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/introduction.html saytından alınıb.
  5. Li, D., Shao, L., Chen, B.-C., Zhang, X., Zhang, M., Moses, B., Milkie, DE, Beach, JR, Hammer, JA, Pasham, M., Kirchhausen, T., Baird, MA, Davidson, MW, Xu, P., & Betzig, E. (2015). TƏKLİFİ TƏSİR. Endositik və sitoskeletal dinamikanın genişləndirilmiş qətnamə strukturlaşdırılmış işıqlandırma təsviri. Elm (Nyu York, N.Y.), 349(6251), aab3500. https://doi.org/10.1126/science.aab3500
  6. Li, T. P. və Blanpied, T. A. (2016). Sinxron Tək Molekullu İzləmə və Lokalizasiya Mikroskopiyası ilə qiymətləndirilən Postsinaptik Sıxlıq daxilində Transmembran Zülal Diffuziyasına Nəzarət. Sinaptik Neyrologiyada Sərhədlər, 19. https://doi.org/10.3389/fnsyn.2016.00019
  7. Patriarx, T., Cho, JR, Merten, K., Howe, MW, Marley, A., Xiong, W.-H., Folk, RW, Broussard, GJ, Liang, R., Jang, MJ, Zhong, H., Dombeck, D., Zastrow, M. von, Nimmerjahn, A., Gradinaru, V., Williams, JT, & Tian, ​​L. (2018).Dizayn edilmiş genetik kodlu sensorlar ilə dopamin dinamikasının ultrafast neyron görüntüləməsi. Elm, 360(6396), eaat4422. https://doi.org/10.1126/science.aat4422
  8. Tillberg, P. W., Chen, F., Piatkevich, K. D., Zhao, Y., Yu, C.-C. (Jay), İngilis, BP, Gao, L., Martorell, A., Suk, H.-J., Yoshida, F., DeGennaro, EM, Roossien, DH, Gong, G., Seneviratne, U., Tannenbaum , SR, Desimone, R., Cai, D., & Boyden, ES (2016). Standart flüoresan zülallar və antikorlardan istifadə edərək etiketlənmiş hüceyrə və toxumaların zülal saxlama genişləndirici mikroskopiyası. Təbiət Biotexnologiyası, 34(9), 987–992. https://doi.org/10.1038/nbt.3625
  9. Wang, Y., Yu, Z., Cahoon, C. K., Parmely, T., Thomas, N., Unruh, J. R., Slaughter, B. D., & Hawley, R. S. (2018). Zülal komplekslərinin təhlili üçün strukturlaşdırılmış işıqlandırma mikroskopiyası ilə birləşdirilmiş genişləndirmə mikroskopiyası. Təbiət protokolları. https://doi.org/10.1038/s41596-018-0023-8
  10. Winter, F. R., Loidolt, M., Westphal, V., Butkevich, A. N., Gregor, C., Sahl, S. J., & Hell, S. W. (2017). Tək STED şüası və hiperspektral aşkarlama ilə sabit və canlı hüceyrələrin çoxrəngli nanoskopiyası. Elmi Hesabatlar, 7(1), 46492. https://doi.org/10.1038/srep46492
  11. Xu, H., Tong, Z., Ye, Q., Sun, T., Hong, Z., Zhang, L., Bortnick, A., Cho, S., Beuzer, P., Axelrod, J., Hu, Q., Wang, M., Evans, SM, Murre, C., Lu, L.-F., Sun, S., Corbett, KD, & Cang, H. (2019). Genişlənmə STORM mikroskopiyası ilə aşkar edilən məməlilərin meiotik xromosom oxunun molekulyar təşkili. Milli Elmlər Akademiyasının Materialları, 116(37), 18423–18428. https://doi.org/10.1073/pnas.1902440116
  12. Xu, K., Zhong, G., & Zhuang, X. (2013). Aktin, Spektrin və Əlaqəli Zülallar Aksonlarda Periodik Sitoskeletal Struktur təşkil edir. Elm, 339(6118), 452–456. https://doi.org/10.1126/science.1232251

Christopher Pratt, PhD

Kristofer Pratt 2016-cı ildə PhD Marcel Bruchez-in rəhbərliyi altında Karnegi Mellon Universitetində hüceyrə biologiyası və nevrologiya üzrə fəlsəfə doktoru dərəcəsini qazanmışdır. Dissertasiyası üçün o, beyində sinaptik vezikül və ion kanalı alverini başa düşmək üçün yeni flüoresan zondlar hazırladı və tətbiq etdi və onu alovlu bir mikroskopist etdi. Elm və məlumat ötürmək həvəsi ilə Kristofer Biotium-un Tam Spektr Bloguna müntəzəm olaraq töhfə verir və Çikaqoda, İllinoysda yerləşən müstəqil elm və tibb yazıçısı, analitik və tədqiqat məsləhətçisidir. Onun veb saytına, twitter və ya LinkedIn-ə daxil olun və əlaqə saxlayın!


Mücərrəd

Qlutatyon hidropersulfidlərin (GSSH) siqnal ötürülməsində, redoks homeostazında və metabolik tənzimləmədə mühüm rol oynadığı deyilir. Bununla belə, GSSH-nin bu aspektlərdə ətraflı bioloji funksiyaları son dərəcə qeyri-müəyyəndir. GSSH-nin bioloji sistemlərdə rolunu başa düşmək üçün əsas maneə yüksək məkan-zaman ayırdetmə qabiliyyətinə malik aşkarlama vasitələrinin olmamasıdır. Problemləri həll etmək üçün biz GSSH aşkarlanması üçün yeni kimyəvi alətlər axtarırıq. Biz burada canlı hüceyrələrdə və toxumalarda yüksək məkan və zaman ayırdetmə qabiliyyətinə malik GSSH aşkarlanması üçün ilk iki fotonlu nisbətli flüoresan zondunu (TP-Dise) inkişaf etdiririk. TP-Dise zondumuz əsasında biz GSSH-nin biosintezini araşdırırıq və nəticələr GSSH-nin əsasən iki kükürd transferazından, CBS və CSE-dən olduğunu göstərir. Bundan əlavə, biz ilk dəfə olaraq hüceyrələri civə ionunun səbəb olduğu hüceyrə zədələnməsindən qorumaqda GSSH-nin bioloji funksiyasını araşdırırıq. Eksperimental nəticələr göstərir ki, civə ionları mitoxondrial autofagiyaya səbəb olaraq hüceyrə ölümünə səbəb ola bilər. GSSH həm antaqonist, həm də antioksidant kimi fəaliyyət göstərir və civə stressinin yaratdığı zərəri effektiv şəkildə azalda bilər.


MATERİALLAR VƏ METODLAR

Heyvanlar

Heyvanları əhatə edən bütün tədqiqatlar və prosedurlar təcrübi və digər elmi məqsədlər üçün istifadə edilən onurğalı heyvanların mühafizəsi üzrə Avropa Birliyinin Direktivinin (2010/63/UE) tövsiyələrinə ciddi şəkildə uyğundur. Layihə xüsusi olaraq Institut Curie CEEA-IC #118 və Institut Pasteur (istinad №2015-0008) və Fransanın Tədqiqat Nazirliyi tərəfindən (səlahiyyət arayışları #0424003, #13310-20180201125714-3-) etika komitələri tərəfindən xüsusi olaraq təsdiq edilmişdir. 2016080912028839-v4, #11206-2017090816044613-v2). Biz beynəlxalq səviyyədə müəyyən edilmiş dəyişdirmə, ixtisar və təkmilləşdirmə prinsiplərinə riayət edirik Laboratoriya Heyvanlarının Baxımı və İstifadəsi üzrə Bələdçi (Milli Araşdırma Şurası 2011). Təcrübələrdən əvvəl və sınaqlar zamanı Curie İnstitutunun Heyvanlar Müəssisəsində (obyektin lisenziyası № C75-05-18) heyvandarlıq, heyvanların tədarükü, həmçinin siçanlara qulluq və qulluq heyvanların ehtiyaclarını və rifahını tam ödəmişdir. Heyvanların əziyyəti minimuma endirildi.

Bu işdə aşağıdakı siçan xətlərindən istifadə edilmişdir: R26 mTmG siçan (24), NMRI-Foxn1 nu/nu (Janvier Labs-dan alınıb), Pax7 CreERT2 siçan (30), və Rag KO/KO -GFP siçanlar [B6(Cg)-Rag2 tm1.1Cgn /JTg(UBC-GFP) (25, 26)]. Bütün təcrübələr 4-8 həftəlik dişi siçanlarda aparılıb.

Prototipləşdirmə

Pəncərə, qəlib və tutucunun üçölçülü (3D) konsepsiyası SOLIDWORKS 2018 (Dassault Systèmes) istifadə edərək həyata keçirilib. Pəncərə tutucu prototiplərinin 3D çapı evdə hazırlanmış sistem [Fused deposition modeling (FDM)] və MultiJetFusion [Hewlett-Packard (HP)] istifadə edərək müxtəlif materiallardan, əsasən generik akrilonitril butadien stirol (FDM) və poliamid və polipropilendən (PP) istifadə etməklə həyata keçirilib. ) (füzyon). Daha yüksək çap ayırdetmə qabiliyyəti, temperatur və hiqroskopik sabitlik üçün PP füzyonunu tövsiyə edirik.

Pəncərə istehsalı

Biouyğun şəffaf silikon (Elkem) komponentləri (A və B) istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq 1:1 nisbətində (A:B) 50 q qarışıq üçün 5 dəqiqə ərzində qarışdırıldı. Qarışıq daha sonra 5 və 10 dəqiqə (<10 mbar) müddətində havanın çıxarılmasını maksimum dərəcədə artırmaq üçün aralarında vakuum buraxmaqla qazsızlaşdırıldı. Havanın çıxarılması qarışığın 1000-də sentrifuqalanması ilə tamamlandıg 5 dəq. Spontan polimerləşmənin qarşısını almaq üçün qazı alınmış silikon qarışığı maksimum 24 saat 4°C temperaturda saxlanılmışdır. Pəncərələr, qəlibləmə zamanı 100°C-də saxlanılan işlənmiş poladdan hazırlanmış xüsusi üç mərhələli tək izli sıxılma qəlibindən istifadə edilməklə istehsal edilmişdir. Kalıbı bağlamadan və 10 dəqiqə ərzində 5 ton sıxılma tətbiq etməzdən əvvəl ayaq izinə təxminən 1 ml silikon qoyuldu. Polimerləşdirilmiş pəncərələr daha sonra ən azı 24 saat 60°C-də saxlanılır və avtoklavlamadan əvvəl mütləq etanolda yuyulur. Bu günə qədər sınaqdan keçirilməsə də, tikişsiz təmir üçün tələb olunan cihazın mexaniki xüsusiyyətlərini qorumaq üçün elastomer sərtliyini optimallaşdırmaq şərti ilə implant ölçüləri dəyişdirilə bilər (məsələn, xüsusi toxuma sahələri üçün daha kiçik versiyalar).

PDMS pəncərələrinin optik xarakteristikası

Optik, xromatik və morfoloji aberrasiyalar obyektiv və mikroskop nüvəsini əhatə edən optik yoldan asılıdır. Buna görə də, bütün analizlər bir mikroskop qurğusundan və görüntüləmə mühiti kimi sudan istifadə edilərək aparılmışdır. Bütün ölçmələr dik fırlanan disk mikroskopunda (Yokoqava Carl Zeiss, Roper Scientific, Fransadan CSU-X1 skan başlığı) 40×/1 ədədi diafraqma (NA) Su DIC PL APO VIS-IR obyektivindən istifadə etməklə əldə edilmişdir. CoolSNAP HQ2 şarj ilə əlaqəli cihaz (CCD) kamerası (Fotometrika) və MetaMorph proqramı.

Optik sapmalar (PSF). RI dəyişikliklərindən yaranan optik aberrasiyaları təmsil edən PSF-ni ölçmək üçün 1:200 flüoresan və 1:400 seyreltilmiş FluoSpheres karboksilatla dəyişdirilmiş mikrosferləri (0,2 μm diametr) ehtiva edən 2% agaroz jeli hazırladıq. Həm şüşə, həm də PDMS pəncərələri üçün pəncərə/gel interfeysindən artan dərinliklərdə addım ölçüsü 0,2 μm olan 100 μm-lik səkkiz yığın əldə etdik (flüoresan kanalında fon siqnalından istifadə edərək müəyyən edilmiş Z0). PSF MetroloJ plaginindən istifadə edərək hesablanmışdır (33) Fici (ImageJ v1.53) hər bölmədə ən azı 20 muncuqda.

Xromatik aberrasiyalar. Dalğa uzunluğuna səciyyəvi RI dəyişiklikləri nəticəsində yaranan optik aberrasiyaları təmsil edən xromatik aberrasiyaları ölçmək üçün biz 1:400 nisbətində seyreltilmiş TetraSpeck Microspheres (4 μm diametr) olan 2% agaroz gel hazırladıq. Həm şüşə, həm də PDMS pəncərələri üçün Z-də aşkar edilən ilk muncuqdan 200 μm-dən çox məlumat əldə edildi. Lazer intensivliyi və ekspozisiyaları oxşar intensivlik diapazonunu (12 bit) əldə etmək üçün təyin edilmişdir. R və Rref MetroloJ plaginindən istifadə etməklə hesablanmışdır (33) Ficidə (ImageJ v1.53) hər şərt üçün ən azı 30 muncuq.

Morfoloji aberasiyalar. Pəncərənin qeyri-bərabər səthindən yarana biləcək morfoloji aberrasiyaları ölçmək üçün biz yalnız su (açıq), şüşə, rahat PDMS və ya dartılmış () vasitəsilə 405 nm lazer həyəcanlandırma dalğasından istifadə edərək mikroqrid (Argolight SLG-075, naxış B) təsvir etdik. 200%-ə qədər PDMS (dalğalı) pəncərəsi dublikatlarda. Nöqtə torları Fiji v1.53 (ərəfəsində və gt analiz hissəcikləri) istifadə edərək seqmentlərə bölündü və nöqtə koordinatları çıxarıldı. Mərkəzi motivdən (xaç 00) və yuxarı sol nöqtədən (−105 −75) istifadə edərək, biz müxtəlif materialların altındakı torun fırlanmasını düzəltdik və hər bir nöqtənin düzəldilmiş koordinatlarını ya “yalnız orta” (ölçülmüş) ilə müqayisə etdik. nəzəri (15 × 15 μm) model B matrisi. Qrafik deformasiya xəritələri R paketindən istifadə etməklə yaradılmışdır ggplot2 (34).

Pəncərə implantasiyası

Əməliyyatdan əvvəl bütün alətlər avtoklav və ya istilik sterilizasiyası ilə sterilizasiya edilmişdir. PDMS pəncərələri qaralmamaq üçün avtoklavla sterilizasiya edildi. Prosedur boyu sterilliyi təmin etmək üçün siçanın hazırlanması və idarə edilməsi, anesteziya axınının sürətinin tənzimlənməsi və oxşar vəzifələr cərrahı yalnız steril cərrahi alətlərlə və cərrahi sahə ilə təmasda saxlamaqla məhdudlaşdıran köməkçi tərəfindən yerinə yetirildi. Anesteziya edilmiş siçanın fizioloji bədən temperaturu qızdırılan induksiya kamerası və qızdırılan cərrahi stansiyadan istifadə edərək prosedur boyunca saxlanıldı.

Əməliyyatdan əvvəl qulluq

Anesteziyadan əvvəl siçanlara 125 mq/kq Noroklav (140 mq/ml amoksisillin 35 mq/ml klavulan turşusu) və analjezik kokteyl [0,1 mq/kq buprenorfin (Buprecare) və 5 mq/kq karprofen (RIMADYL) verildi. )] dərialtı inyeksiya ilə. PDX modellərində implantasiyadan başqa bütün təcrübələr üçün boyun dəri qatına analjeziklər yeridildi, burada onların arxa ayaq dəri qatına yeridildi.

Cərrahi sahənin hazırlanması

Siçanlar 4% izofluran (ISOFLURIN) istifadə edərək induksiya kamerasında anesteziya edilmişdir. Anesteziya edildikdən sonra siçanlar istilik yastığına köçürüldü və anesteziya 1,5-2% izofluran konsentrasiyasından istifadə edilərək saxlanıldı. Kornea qurumasının qarşısını almaq üçün gözlərə oftalmik məlhəm tətbiq edilmişdir. Planlaşdırılan implantasiya yerində siçan tükləri ev heyvanları üçün elektron qayçı (Aesculap Exacta) istifadə edərək kəsildi. Dərinin zədələnməsi və quruması riskini minimuma endirmək üçün qalıq tüklər maksimum 2 dəqiqə ərzində depilyasiya kremi ilə çıxarıldı. Sabunla steril su ilə yaxalanmazdan əvvəl 4% Betadine Scrub istifadə edərək küy tükləri və krem ​​çıxarıldı. Qırxılmış dəri və ətraf ərazilər daha sonra dermal Betadine 10% istifadə edərək dezinfeksiya edildi. Nəhayət, hazırlanmış cərrahi sahə əvvəlcədən kəsilmiş steril film (Tegaderm) ilə örtülmüşdür.

İmplantasiya (cərrah tərəfindən həyata keçirilir). Dərinin və toxumaların zədələnməsini məhdudlaşdırmaq üçün aşağıdakı cərrahi alətləri tövsiyə edirik: Graefe əlavə incə düz 1 × 2 diş maşası [dəri və membranlar üçün Fine Science Tools (FST) #11153-10], düz küt forseps (pəncərə və toxuma üçün), dişli küt forseps (pəncərə üçün), incə və iti düz qayçı (dəri və membranlar üçün FST №14568-09) və Strabismus küt düz qayçı (dərialtı cib FST №14574-09 üçün).

PDSM pəncərəsini (Ø18mm) hazırlanmış cərrahi nahiyəyə implantasiya etmək üçün maraq edilən toxumanın üzərində yerləşən dəridə 10 mm-lik kəsik aparıldı [uzandıqda təxminən 15 mm-ə uyğundur (Şəkil 2A)]. Sonra, küt qayçı istifadə edərək, implantasiya edilmiş pəncərə üçün kifayət qədər yer yaratmaq üçün dəri kəsik ətrafında təxminən 5-10 mm dərinlikdəki toxumalardan diqqətlə ayrıldı. Prosedur boyu toxumaların susuzlaşmasının qarşısını almaq üçün əvvəlcədən isidilmiş salin məhlulu (steril 0,9% NaCl) istifadə edilmişdir. Pəncərəni yerləşdirməzdən əvvəl, implantasiya zamanı pəncərənin altına hava daxil olma riskini minimuma endirmək üçün kəsik yeri əvvəlcədən isidilmiş şoran məhlulu ilə dolduruldu. Küt və düz kənarları olan nazik forsepslərdən istifadə edərək, PDMS pəncərəsi yarıya qatlanmış və dərinin altında açıldığı kəsik cibinə yerləşdirilmişdir. Tipik olaraq, ilk kəsikdən pəncərənin dəri altında yerləşdirilməsinə qədər prosedur 3 dəqiqədən az müddətdə həyata keçirilir (şək. S2, A və B). Pəncərəni yerinə yerləşdirmək üçün dərinin kənarları yuxarı çərçivəni tutmaq və dərini pəncərə ətrafında sürüşdürmək arasında dəyişən iki forsepsdən istifadə edərək pəncərə yivinə yerləşdirildi (halqada təkərin tənzimlənməsi texnikasına bənzər). Bu addım zamanı, lazım gələrsə, dərini pəncərənin ətrafında sıx şəkildə bağlamaq üçün kəsik ölçüsü tənzimlənə bilər. Təcrübəli istifadəçilər bütün cərrahi əməliyyatı həyata keçirə bilirlər

Əməliyyatdan sonrakı qayğı

Əməliyyatdan sonra siçanlar anesteziyadan xilas olmaq üçün əvvəlcədən isidilmiş qəfəsə (istilik yastığına) yerləşdirildi. Pəncərə implantasiyasından sonra siçanlar ağrı, narahatlıq və infeksiya əlamətləri üçün yaxından izlənildi. Noroclav antibiotikinin ikinci və sonuncu dozası əməliyyatdan bir gün sonra dərialtı inyeksiya ilə təmin edilmişdir. Pəncərəni əhatə edən dəri infeksiyanın qarşısını almaq üçün hər 2-4 gündə bir dermik Betadine 1% istifadə edərək təmizlənir. İltihab və ağrıları minimuma endirmək üçün əməliyyatdan sonra 7 gün ərzində İbuprofen içməli suda (0,4 mq/ml) verildi. Ağrı əlamətləri müşahidə olunarsa, əməliyyatdan sonrakı gün dərialtı inyeksiya yolu ilə əməliyyatdan sonrakı analjeziklər [0,1 mq/kq buprenorfin (Buprecare) və 5 mq/kq karprofen (RIMADYL)] tətbiq oluna bilər.

Siçan daşıyan pəncərələr əməliyyatdan sonra mümkün olduğu yerlərdə qruplaşdırıldı və əməliyyatdan sonrakı bərpa üçün uyğun olan qəfəs zənginləşdirməsi, o cümlədən yuva materialı, yuva və çeynəmə çubuqları ilə təmin edildi. Mexanik gərginliyin qidalandırıcıya çatmasını məhdudlaşdırmaq üçün qəfəsdə bərpa qidası (DietGel Recovery, ClearH20) təmin edilmişdir. Ətraf mühitin kifayət qədər zənginləşdirilməsi olmadan tək saxlanılan siçanlar əməliyyatdan sonrakı ilk 1-2 gün ərzində cihazı zədələmək ehtimalı daha yüksək ola bilər. Ciddi aseptik cərrahi texnika, o cümlədən profilaktik antibiotik və ibuprofen müalicəsi iltihabı və qıcıqlanmanı azaltmaqla bu riski minimuma endirir. Ümumiyyətlə, gənc heyvanlar prosedurdan irəli gələn dəri zədələrinə daha çox meyllidirlər, bu, pəncərə/heyvan ölçüsü nisbəti və/yaxud erkən yaşlarda aktivliyin artması ilə əlaqədar ola bilər. Qəfəsin təmizliyi implantın infeksiyası riskinə təsir göstərmir. Tipik olaraq, siçanlar əməliyyatdan bir gün sonra cüzi çəki itkisi nümayiş etdirdilər (-4,20 ± 4,74%, etik məhdudiyyətlər daxilində), 2-ci günə (+2,93 ± 3,18%) bərpa edildi. Gözlənildiyi kimi, PDMS pəncərələri implantasiyadan sonra öz ölçü xüsusiyyətlərini saxlayır, tədqiqat müddətləri ərzində (maksimum 35 gün sınaqdan keçirilmiş) bioloji mayelərə marjinal məruz qalma nəticəsində heç bir nəzərə çarpan şişlik nümayiş etdirmir.

Pəncərə daşıyan siçanlarla işləmək

İmplantasiya ciddi aseptik üsullarla düzgün yerinə yetirildikdə, heç bir siçan implantasiya edilmiş pəncərələrini kortəbii şəkildə itirməməlidir. Pəncərələr əməliyyatdan sonrakı ilk bir neçə gündə adi məhdudlaşdırma üsullarından istifadə edərək siçanlarla işləyərkən yerdəyişmə riski altındadır. Beləliklə, biz pəncərə implantasiyasından dərhal sonra günlərdə siçanları qiymətləndirərkən idarəetmə üsullarını uyğunlaşdırmağı tövsiyə edirik və mümkün olduqda, məsələn, mədə daxili inyeksiya kimi prosedurları yerinə yetirərkən yüngül qaz anesteziyasının istifadəsini nəzərdən keçirək.

İmplantasiya proseduru üçün problemlərin aradan qaldırılması təlimatı

(A) İmplantasiya zamanı pəncərənin altında hava tutulur. Steril, əvvəlcədən isidilmiş 0,9% NaCl və 30 kalibrli iynə ilə 1 ml-lik şpris hazırlayın. Siçanı elə yerləşdirin ki, inyeksiya portu yuxarıya baxsın və onu 70% etanol ilə dezinfeksiya edin. İncə forsepslərdən istifadə edərək, inyeksiya yerini tutun və pəncərənin altına 200-500 μl şoran məhlulu yeridin: Hava qabarcığı(lar)ı inyeksiya yerinə yaxınlaşacaq. Havanı və mümkün qədər çox duzlu məhlulu çıxarmaq üçün şprisdən istifadə edərək yavaş-yavaş aspirasiya edin (S4 filmində göstərildiyi kimi). Enjeksiyon portunu qurutun. Şəkil çəkməzdən əvvəl salin məhlulunun udulmasını gözləyin.

(B) İmplantasiyadan sonra pəncərənin altında hava görünür. Əməliyyat zamanı düz bir kəsik etməyə diqqət yetirin. Düzensiz və cırıq kəsiklər hava sızması riskini artırır. Pəncərənin bütövlüyünü yoxlayın: Pəncərə perforasiya olunubsa, o zaman atılmalıdır. Yivdəki dərini qırıqlar üçün diqqətlə yoxlayın, çünki kiçik kəsiklər hava sızmasına səbəb ola bilər. Kiçik bir qırılma və ya nick (maksimum 1 ilə 2 mm) müşahidə edilərsə, sızıntını möhürləmək üçün yivə az miqdarda yapışqan qoyun və (A) ilə davam edin. Ertəsi gün hava kabarcıklarının olub olmadığını diqqətlə yoxlayın.

(C) Toxuma ilə pəncərə arasında az miqdarda maye (eksudat) və immun hüceyrələrin olması. Bu əməliyyatdan bir neçə gün sonra ümumi olur və 2-3 gündən sonra yox olmalıdır. Bu riski minimuma endirmək üçün ciddi asepsiyanı təmin etmək üçün əməliyyat prosedurunu nəzərdən keçirin, içməli suda ibuprofeni yoxlayın/dəyişin və mexaniki stressi məhdudlaşdırmaq üçün qidanın əlçatan olmasını təmin edin. Eksudat görüntüləməni maneə törədirsə, pəncərənin altına yumaq üçün inyeksiya portu vasitəsilə əvvəlcədən isidilmiş şoran məhlulu verin (bax (A) şək. S3E]. İmmunitet hüceyrələri əməliyyatdan sonrakı günlərdə qızardıqdan sonra sahəyə qayıda bildiyindən, bu addımın istənilən görüntüləmə tezliyindən asılı olaraq sonrakı alış seansında təkrarlanması lazım ola bilər.

(D) Pəncərənin altındakı saçlar. Hazırlıq mərhələsini nəzərdən keçirin. Lazım gələrsə, daha böyük bir sahəni kəsin. Qalıq saçları tutmaq üçün kəsikdən əvvəl bir sprey gips istifadə edilə bilər.

(E) Pəncərənin ətrafında dəri nazikləşir və ya quruyur. Bu problem implantasiyadan sonra ilk 7 gün ərzində baş verərsə, depilyasiya kreminin inkubasiyasını azaldın və/və ya markanı dəyişdirin. Dərinin zədələnməsini azaltmaq üçün 1 × 2 diş forsepsindən istifadə edin. Dərini ayırmaq üçün küt parçalanma apararkən damarların zədələnməsini məhdudlaşdırın. Bu problem uzunmüddətli baxımdan (>2 həftə) sonra ortaya çıxa bilər, lakin bizim təcrübəmizə görə, əməliyyatdan sonrakı qayğı düzgün yerinə yetirildikdə görüntüləmə (infeksiya, hava kabarcıkları yoxdur) təsir göstərmir.

(F) Dəri və ya toxuma nekrotik olur. Təcrübəni dərhal dayandırın. Bu heç vaxt baş verməməlidir, cərrahiyyə prosedurunu nəzərdən keçirin (aseptika, toxumaların qurudulması və damarların zədələnməsi daxil olmaqla).

PDMS pəncərələri vasitəsilə intravital görüntüləmə

Cərrahiyyə sahəsinə əlavə stress və pəncərənin həddindən artıq sıxılmasının qarşısını almaq üçün implantasiya günü görüntünün aparılması tövsiyə edilmir. İmplantasiyadan dərhal sonra pəncərənin altında qalan fizioloji salin də görüntü dərinliyinə təsir edə bilər. Bunun əvəzinə, görüntüləməni ən tez ertəsi gün (1-ci gün) həyata keçirin. Siçan anesteziya edilərkən, əməliyyatdan sonrakı antibiotikləri subkutan inyeksiya ilə idarə edin. Cihazı diqqətlə yoxlayın və yuxarıda göstərildiyi kimi əməliyyat sahəsini təmizləyin. Siçanlar əvvəlcə 4% izofluran (ISOFLURIN) ilə qaz anesteziyasına məruz qalır və qısamüddətli görüntüləmə üçün 1,5-2,5% izofluran istifadə edərək saxlanılır.Bir neçə saat ərzində fasiləsiz görüntüləmə həyata keçirərkən, izofluran konsentrasiyasını 0,8 ilə 1,2% arasında azaldın. Bu anesteziya səviyyələri siçanların yavaş, sabit və məcburi tənəffüs nümunəsi ilə reaksiya verməyən vəziyyətdə uzunmüddətli saxlanması üçün optimaldır. Qeyri-müntəzəm və anormal tənəffüs nümunələri 1,5%-dən çox davamlı anesteziya ilə əlaqələndirilir ki, bu da görüntüləməni pozur (hərəkətdən qaynaqlanan görüntü deformasiyalarını artırır) və sağ qalma müddətini azalda bilər (35). Sürətli tənəffüs və refleks reaksiyalar qeyri-kafi anesteziyadan xəbər verir ki, bu da təsviri narahat edir və görüntüləmə zamanı siçanın oyanması riskini artırır.

Şəkil çəkmədən əvvəl

Qısamüddətli görüntüləmə (

50-100 μl/saat) daimi xətt vasitəsilə. Dik mikroskoplar üçün uyğunlaşdırılmış (S1 məlumat faylında təqdim olunan STL fayllarını çap etməyə hazır olan) xüsusi hazırlanmış tutucumuz sıxılma vasitəsilə bədənin regional immobilizasiyasına imkan verir. Sərt konusvari konstruksiya (tərkibində daldırma mühiti, adətən su) pəncərənin kənarına basaraq, toxuma və pəncərənin üzə çıxmasına və siçan köpük yatağına söykənərək obyektiv altında uzanmasına imkan verir ki, bu da hərəkətləri yumşaltarkən nəfəs almağı qoruyur. Siçan görüntü tutucunun üzərində yerləşdirilir və pəncərəni konusvari diyaframda mərkəzləşdirərək statik səhnəyə yumşaq bir şəkildə basdırılır. Siçan sıx şəkildə bağlanmalıdır ki, köpük həddindən artıq sıxılmanı udur. Sonra siçan tənəffüsü və anesteziyanın sabitliyini yoxlamaq üçün 5 dəqiqə müşahidə edilir. Saxlayıcını mikroskop səhnəsinə yerləşdirməzdən əvvəl konusvari boşluq 2-3 ml təmiz su ilə doldurulur. Saxlayıcı təsvir üçün su əvəzinə gel əsaslı immersion mühitdən istifadə edərək tərs mikroskop konfiqurasiyaları üçün uyğunlaşdırıla bilər. Kritik: PDMS pəncərələri ilə yağ əsaslı təsvir mühitindən istifadə etməyin, çünki hidrofobik həlledicilər pəncərənin şişməsinə, kövrəkliyə və altda yatan toxumalara toksikliyə səbəb ola bilər. PDMS pəncərəsi üzərində şüşə örtük yerləşdirmək səthi toxuma strukturlarının təsviri üçün yağ əsaslı məqsədlərdən istifadə etməyə imkan verə bilər, bu şərtlə ki, əsas material bütün boyunca qorunsun.

Təsvir zamanı

Okulyarlarla parlaq sahə və ya flüoresandan istifadə edərək maraqlı strukturları tapın. Skanlama zamanı fototoksikliyi və piksel doymasını minimuma endirmək üçün lazer gücünü və məruz qalma vaxtlarını optimallaşdırın. PDMS pəncərələri yüksək güclü lazer partlayışlarına davamlıdır və buna görə də lokallaşdırılmış fotoağartma və fotoablyasiya tətbiqləri ilə uyğun gəlir.

Görüntüdən sonra

Görüntü mühiti kağız dəsmaldan istifadə edərək konusvari diyaframdan çıxarılmalıdır. Siçan tutucudan buraxılır və bərpa üçün qızdırılan yastığa (38°C-də qoyulmuş) yerləşdirilir. Bu müddət ərzində pəncərə kağız dəsmal və 70% etanol istifadə edərək təmizlənir və ətrafdakı dəri dermik Betadine 1% ilə dezinfeksiya edilir.

Təsvir prosedurları üçün problemlərin aradan qaldırılması təlimatı

(G) Pəncərə konik diyaframa düzgün yerləşdirilə bilməz. Tutacaqda istənilən mövqeyə uyğunlaşmağa imkan verən daha yumşaq köpükdən istifadə edin.

(H) Təsvir mühiti (su) sızır. Konik diafraqma pəncərənin mərkəzində deyil. Yerini dəyişdirin və ya gel əsaslı görüntü mühitindən istifadə edin.

(I) Tutucu nəfəs almağa mane olur. İzofluran dozasını azaldın. Heyvanın üzərində sıxılmanı azaldın. Siçanın tənəffüs yolunun məhdudlaşdırılmamasını təmin edərək, köpüyü düzəldin. Siçan mövqeyini dəyişdirmək üçün köpüyü kəsin (üfüqi müstəvi maraqlı toxuma üçün optimal olmaya bilər).

(J) Çəkiliş zamanı zəif görmə. Pəncərənin altında ekssudat yığılması və/yaxud epitelioid “membran” əmələ gəlməsi (uzun müddətli saxlanma ilə inkişaf edə bilər) görüntüyə mane ola bilər. Bu, şüşə/titan pəncərələrdə də müşahidə edilmişdir (6, 13) və ehtimal ki, cərrahi müdaxiləyə cavab olaraq iltihab reaksiyaları ilə əlaqədardır. Bu riski minimuma endirmək üçün cərrahi proseduru nəzərdən keçirin, toxuma zədələnməsini məhdudlaşdırmağa diqqət yetirin və bütün müddət ərzində ciddi asepsiyə riayət edin. Epitelioid membrana bənzər struktur toxuma təsvirinin dərinliyinə təsir etsə də, ümumilikdə görüntü keyfiyyətinə heç bir zərərli təsir göstərmir. Bununla belə, immun hüceyrələri və/yaxud fibroz ilə birləşdikdə, görüntüləməni istisna edə bilər. Bu problemi aradan qaldırmaq üçün, pəncərənin altına yumaq üçün inyeksiya portu vasitəsilə əvvəlcədən isidilmiş şoran tətbiq oluna bilər [(A) şək. S3E və film S4). Alternativ olaraq, pəncərəni maraq toxumasının fərqli bir sahəsinə dəyişdirin və ya təcrübəni dayandırın.

İntravital mikroskopiya

Heyvanlar anesteziyaya məruz qaldı və yuxarıda təsvir olunduğu kimi xüsusi hazırlanmış tutucudan istifadə edərək görüntüləmə üçün yerləşdirildi. İntravital görüntüləmə impulslu Spectra-Physics Insight DeepSee lazeri (680-dən 1300 nm, 120-fs pulslar, avtomatik hizalama ilə) ilə təchiz olunmuş dik Nikon A1R MP multifoton konfokal mikroskopda aparıldı, Luigs & Neumann XY motorlu mərhələ və SP492, BP 525/50, BP 575/50 və BP 629/56 filtr dəstləri ilə dörd GaAsP skan edilməmiş detektoru. Mikroskop 38°C-də saxlanılan qızdırılan qaranlıq qutu ilə əhatə olunmuşdu. Bütün şəkillər 16× NA 0.8 və ya 25× NA 1.1 Plan Apo LambdaS su məqsədləri ilə əldə edilmişdir. Kollagenin SHG görüntüsünə əlavə olaraq GFP və TdTomato üçün 960 nm həyəcan dalğa uzunluğu istifadə edilmişdir.

Şəkillərin işlənməsi və vizuallaşdırılması

Hərəkətlər və sürüşmələr üçün “Correct 3D Drift” plaginindən (36) Ficidə (ImageJ v1.53) istinad kimi SHG kanalından istifadə etməklə.

TdTomato-ifadə edən PDX şiş hüceyrələrinin yaradılması

Ewing sarkoması PDX şişləri (IC-pPDX-87) cərrahi yolla çıxarıldı və Stewart-da təsvir edilən protokoldan istifadə edərək enzimatik olaraq tək hüceyrə səviyyəsinə dissosiasiya edildi. və b. (37). Hüceyrələr 1% penisilin-streptomisin və 2% B27 (hamısı Thermo Fisher Scientific-dən) ilə əlavə edilmiş Dulbecco-nun dəyişdirilmiş Eagle mühitində/F12-də yenidən dayandırıldı (1,5 ml-də 2,25 × 107 hüceyrə) və bir gecədə Td-to-2 virusu ilə transduksiya edildi. ml boru Intelli-Mixer RM-2L (Hollandiya), proqram F1, dəqiqədə 5 dövriyyə, 5% CO ilə 37°C inkubatorda2. TdTomato-lentivirus Lenti-sgRNA-GFP plazmidində GFP ardıcıllığını Pomidor tandem ilə əvəz etməklə yaradılıb (Addgene plazmid № 65656 http://n2t.net/addgene:65656 C. Vakocdan hədiyyə). Ertəsi gün hüceyrələr 500-də fırlandıg 10 dəq. Bir inyeksiya üçün 1 × 10 7 hüceyrə 50 μl mediada yenidən dayandırıldı və buz üzərində saxlanıldı. Əlli mikrolitr Matrigel (Corning, ref. 354234) insulin şprisindən (BD, ref. 324891) istifadə edərək kəllələrarası piy toxumasına yeridilməzdən əvvəl hüceyrə suspenziyasına əlavə edilmişdir.

Əzələ regenerasiyası tədqiqatları

Əzələ zədəsi edildi Pax7 CreERT2 R26 mTmG 0,9% NaCl-də seyreltilmiş 50 μl kardiotoksinin (1 μM Latoxan, L8102) əzələdaxili yeridilməsi ilə PDMS görüntüləmə pəncərəsinin implantasiyası zamanı yetkin siçanlara. Kardiotoksin ya pəncərə yerləşdirmədən əvvəl, ya da enjeksiyon portundan sonra tətbiq edilmişdir. Siçanlar intravital görüntüləmədən 2 gün əvvəl intraperitoneal inyeksiya ilə 3 mq tamoksifensiz baza (Euromedex) qəbul etdilər.

IVIS görüntüləmə

NIR flüoresan görüntüləmə işıq keçirməyən nümunə qutusuna quraşdırılmış yüksək həssas CCD kameradan istifadə etməklə həyata keçirilmişdir (IVIS 50 Living Image versiyası: 4.3.1.0.15880). Heyvanlar 4% izofluran istifadə edərək isti bir induksiya kamerasında anesteziya edildi və sonra kamera qutusunun içərisində isidilmiş səhnəyə yerləşdirildi və görüntüləmə zamanı anesteziya saxlamaq üçün 1,5-2% izofluran ilə təchiz edildi. Buraxılan flüoresan siqnal IVIS kamera sistemi tərəfindən aşkar edilib, inteqrasiya olunub, rəqəmsallaşdırılıb və nümayiş etdirilib. Pomidor və GFP floresansı üçün həyəcan filtrləri müvafiq olaraq 535 (DsRed filtri, mövqe 3) və 465 (GFP filtri, mövqe 2) idi. Ekspozisiya vaxtları və piksellərin yığılması həddindən artıq ifşanı minimuma endirmək üçün hər bir flüoressensiya kanalı üçün avtomatik optimallaşdırılıb və normallaşdırılmış_intensivlik = (ölçülən_intensivlik/məruzə_vaxtı)/binning_faktoru 2 formulundan istifadə etməklə müqayisə üçün normallaşdırılıb. Xam parametrlər S2 məlumat faylında verilir.


Videoya baxın: طريقة تركيب استوديو تصوير و شرح ازراره (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Vikinos

    Excellent variant

  2. Hu

    İstedad, heç nə deməyəcəksən.

  3. Johnathon

    I congratulate, you were visited with simply brilliant idea

  4. Deston

    It's a shame, but sometimes you need to change your lifestyle. And write such competent posts.

  5. Wajih

    Əla yazı, bu mövzuda bir neçə məqalə oxuduqdan sonra başa düşdüm ki, mən hələ də digər tərəfdən baxmamışam, amma yazı nədənsə çox maraqlı idi.

  6. Healy

    Razıyam, bu çox yaxşı fikir lazımlı olacaq.

  7. Fekazahn

    Təbriklər, nə sözlər..., əla fikir

  8. Vudole

    the incomparable phrase



Mesaj yazmaq