Məlumat

4.4.2: Heyvan Viruslarının Toxuma Mədəniyyəti - Biologiya

4.4.2: Heyvan Viruslarının Toxuma Mədəniyyəti - Biologiya


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Viruslar standart mikrobioloji bulyonlarda və ya agar plitələrində yetişdirilə bilməz, bunun əvəzinə onlar uyğun host hüceyrələrin içərisində yetişdirilməlidir.

Öyrənmə Məqsədləri

  • Ev sahibi hüceyrələrdə heyvan viruslarının becərilməsinin istifadəsini və səbəblərini kəşf edin

Əsas Nöqtələr

  • Toxuma kulturası virus daşıdığından şübhələnən klinik nümunələrin becərilməsi üçün faydalı üsuldur. Bu üsul laboratoriyada virusların aşkarlanmasına, identifikasiyasına və xarakteristikasına kömək edir.
  • Heyvan viruslarının toxuma mədəniyyəti müxtəlif bulyon mühitlərindən istifadə edərək, kolbalarda heyvan hüceyrələrinin böyüməsini və sonra bu hüceyrələri virusla yoluxdurmasını əhatə edir.
  • Transfeksiya kalsium fosfatdan istifadə etməklə, elektroporasiya yolu ilə və ya hüceyrə membranı ilə birləşən və yüklərini içəriyə yerləşdirən liposomlar istehsal etmək üçün material ilə kationik lipidi qarışdırmaqla həyata keçirilə bilər.
  • Sitopatik təsir virusların hüceyrələrə verdiyi qeyri-litik ziyandır. Bunlar təzahürləri və zərərverici təsirləri ilə fərqlənir.

Əsas Şərtlər

  • hüceyrə mədəniyyəti: Hüceyrələrin nəzarət edilən şəraitdə, ümumiyyətlə təbii mühitlərindən kənarda yetişdirildiyi mürəkkəb proses.
  • sitopatik təsir göstərir: Hüceyrələrdə, xüsusən də toxuma mədəniyyətində degenerativ dəyişikliklərə aiddir və müəyyən virusların çoxalması ilə əlaqəli ola bilər.

Hüceyrə mədəniyyəti, hüceyrələrin nəzarət olunan şəraitdə, ümumiyyətlə təbii mühitlərindən kənarda yetişdirildiyi mürəkkəb prosesdir. Təcrübədə "hüceyrə mədəniyyəti" termini indi çoxhüceyrəli eukariotlardan, xüsusən də heyvan hüceyrələrindən əldə edilən hüceyrələrin becərilməsinə aiddir. Bununla birlikdə, viruslar, bakteriyalar və protistlər də daxil olmaqla bitkilərin, göbələklərin və mikrobların mədəniyyətləri də var. Hüceyrə mədəniyyətinin tarixi inkişafı və üsulları toxuma mədəniyyəti və orqan mədəniyyəti ilə sıx bağlıdır. Heyvan hüceyrə mədəniyyəti 1900-cü illərin ortalarında ümumi laboratoriya texnikasına çevrildi, lakin canlı hüceyrə xətlərinin orijinal toxuma mənbəyindən ayrılaraq saxlanılması konsepsiyası 19-cu ildə kəşf edildi.ci əsr.

Viruslar çoxalmaq üçün canlı hüceyrələrə ehtiyac duyan məcburi hüceyrədaxili parazitlərdir. Virus təcrid etmək üçün mədəni hüceyrələr, yumurtalar və laboratoriya heyvanları istifadə edilə bilər. Müəyyən virusların təcrid edilməsi üçün rüşeymlənmiş yumurtalar və laboratoriya heyvanları çox faydalı olsa da, əksər laboratoriyalarda hüceyrə mədəniyyətləri virus təcrid etmək üçün yeganə sistemdir. Heyvan hüceyrələrinin becərilməsi üsullarının inkişafı heyvan virusologiyasının inkişafı üçün vacib olmuşdur. Hüceyrə kulturalarını hazırlamaq üçün əvvəlcə toxuma fraqmentləri adətən tripsin və ya kollagenazın köməyi ilə dissosiasiya olunur. Sonra hüceyrə suspenziyası uyğun maye mühitlə birlikdə düz dibli şüşə və ya plastik qaba (petri qabı, kolba, butulka, sınaq borusu) yerləşdirilir. məs. Qartal və heyvan serumu. Dəyişən bir gecikmədən sonra hüceyrələr qabın dibinə yapışacaq və yayılacaq və sonra bölünməyə başlayacaq və ilkin mədəniyyətə səbəb olacaqdır. Möhkəm bir dəstəyə bağlanma normal hüceyrələrin böyüməsi üçün vacibdir.

Hüceyrə mədəniyyətləri müxtəlif viruslara qarşı həssaslıq baxımından çox fərqlidir. Müəyyən bir şübhəli virus üçün ən həssas hüceyrə kulturalarının istifadə edilməsi çox vacibdir. Hüceyrə mədəniyyəti üçün nümunələr götürüldükdən sonra mümkün qədər tez laboratoriyaya daşınmalıdır. Swablar virus daşıyıcısı olan flakona qoyulmalıdır. Bədən mayeləri və toxumaları steril konteynerə yerləşdirilməlidir. Qəbul edildikdən sonra nümunə nümunənin təbiətindən və kliniki təqdimatdan asılı olaraq bir neçə müxtəlif növ hüceyrə mədəniyyətinə aşılanır. Baxım mediası bir saatdan sonra və ya növbəti səhər dəyişdirilməlidir. Peyvənd edilmiş borular 35-37-də inkubasiya edilməlidiroC fırlanan barabanda. Rotasiya respirator virusların təcrid olunması üçün optimaldır və bir çox viruslar üçün sitopatik effektlərin (CPE) daha erkən görünməsi ilə nəticələnir. Əgər stasionar borular istifadə olunursa, kultura borularının hüceyrə monolayının qida mühitində yuyulması üçün yerləşdirilməsi çox vacibdir.


Donuzlarda quş və donuz qripi A virusunun birgə infeksiyası zamanı toxuma tropizmləri ötürülən reassortantları seçir.

Təməl Elmlər Bölməsi, Baytarlıq Tibb Kolleci, Missisipi Dövlət Universiteti, Starkville, Missisipi ştatı, Missisipi, Amerika Birləşmiş Ştatları, Baytarlıq Tibb Kolleci, Cənubi Çin Kənd Təsərrüfatı Universiteti, Quançjou, Guangdong, Çin

Bu işə bərabər töhfə verdilər: Xiaojian Zhang, Hailiang Sun, Fred L. Cunningham, Lei Li

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Təşkilat Missisipi Sahə Stansiyası, Milli Vəhşi Təbiət Tədqiqat Mərkəzi, Vəhşi Təbiət Xidmətləri, Heyvan və Bitki Sağlamlığının Müfəttişliyi Xidməti, Amerika Birləşmiş Ştatları Kənd Təsərrüfatı Departamenti, Starkville, Missisipi ştatı, Missisipi, Amerika Birləşmiş Ştatları

Bu işə bərabər töhfə verdilər: Xiaojian Zhang, Hailiang Sun, Fred L. Cunningham, Lei Li

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Təməl Elmlər Bölməsi, Baytarlıq Tibb Kolleci, Missisipi Dövlət Universiteti, Starkville, Missisipi ştatı, Missisipi, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Təşkilat Mississippi Sahə Stansiyası, Milli Vəhşi Təbiət Tədqiqat Mərkəzi, Vəhşi Təbiət Xidmətləri, Heyvan və Bitki Sağlamlığının Müfəttişliyi Xidməti, Amerika Birləşmiş Ştatları Kənd Təsərrüfatı Departamenti, Starkville, Missisipi ştatı, Missisipi, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Əlaqələr Milli Vəhşi Təbiət Tədqiqat Mərkəzi, Vəhşi Təbiət Xidmətləri, Heyvan və Bitki Sağlamlığının Müfəttişliyi Xidməti, ABŞ Kənd Təsərrüfatı Departamenti, Fort Collins, Kolorado, Amerika Birləşmiş Ştatları, Mikrobiologiya, İmmunologiya və Patologiya Departamenti, Kolorado Dövlət Universiteti, Fort Kollinz, Kolorado Ştat , Kolorado, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Patobiologiya və Əhali Təbabəti Departamenti, Baytarlıq Kolleci, Missisipi Dövlət Universiteti, Starkville, Missisipi ştatı, Missisipi, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Təməl Elmlər Departamenti, Baytarlıq Tibb Kolleci, Missisipi Dövlət Universiteti, Starkville, Missisipi ştatı, Missisipi, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Affiliasiya Milli Vəhşi Təbiət Tədqiqat Mərkəzi, Vəhşi Təbiət Xidmətləri, Heyvan və Bitki Sağlamlığının Təftiş Xidməti, Amerika Birləşmiş Ştatları Kənd Təsərrüfatı Departamenti, Fort Collins, Kolorado, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Affiliasiya Viral Xəstəliklər Şöbəsi, Walter Reed Army Institute of Research, Silver Spring, Merilend, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Affiliasiya Milli Vəhşi Təbiət Tədqiqat Mərkəzi, Vəhşi Təbiət Xidmətləri, Heyvan və Bitki Sağlamlığının Təftiş Xidməti, Amerika Birləşmiş Ştatları Kənd Təsərrüfatı Departamenti, Fort Collins, Kolorado, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Affiliation Viral Xəstəliklər Şöbəsi, Walter Reed Army Institute of Research, Silver Spring, Merilend, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Patobiologiya və Əhali Təbabəti Departamenti, Baytarlıq Kolleci, Missisipi Dövlət Universiteti, Starkville, Missisipi ştatı, Missisipi, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Affiliation Viral Xəstəliklər Şöbəsi, Walter Reed Army Institute of Research, Silver Spring, Merilend, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Affiliasiya Milli Vəhşi Təbiət Tədqiqat Mərkəzi, Vəhşi Təbiət Xidmətləri, Heyvan və Bitki Sağlamlığının Təftiş Xidməti, Amerika Birləşmiş Ştatları Kənd Təsərrüfatı Departamenti, Fort Collins, Kolorado, Amerika Birləşmiş Ştatları

Rolların yazılması – nəzərdən keçirmək və redaktə etmək

Təməl Elmlər Departamenti, Baytarlıq Tibb Kolleci, Missisipi Dövlət Universiteti, Starkville, Missisipi ştatı, Missisipi, Amerika Birləşmiş Ştatları


1. Giriş

Cinsin üzvü olan donuz epidemik diareya virusu (PEDV). Alfakoronavirus ailədə Koronaviruslar sifarişin Nidovirales, yeni doğulmuş donuz balalarında kəskin ishal, qusma, susuzluğa və yüksək ölümə səbəb olur. Xəstəlik son 30 ildə Avropa və Asiya donuz sənayesində bildirilmişdir, virus ilk dəfə 1970-ci illərin sonlarında İngiltərə (Wood, 1977) və Belçikada (Pensaert və de Bouck, 1978) ortaya çıxmışdır. PEDV ilk dəfə 2013-cü ildə ABŞ-da bildirilmişdir (Stevenson et al., 2013). Aylar ərzində virus ölkə daxilində sürətlə yayıldı (Cima, 2013), əhəmiyyətli iqtisadi itkilərə səbəb oldu (Jung və Saif, 2015). ABŞ-da olan donuz epidemiyası diareya (PED) xəstəliyinə iki müxtəlif genoqrup (G) PEDV, S INDEL [sünbül (S) zülalının S1 alt bölməsində çoxsaylı silinmə və insertləri ehtiva edən PEDV variantı, G1b] və səbəb olmuşdur. qeyri-S INDEL (G2b) suşları (Lee, 2015 Vlasova et al., 2014).

Ailə Koronaviruslar dörd nəsildən ibarətdir: Alfakoronavirus, Betakoronavirus, Qammacoronavirus,Deltakoronavirus (Woo et al., 2012). Kliniki olaraq PEDV-yə bənzəyən alfakoronavirus ötürülən qastroenterit virusu (TGEV) ilk dəfə 1946-cı ildə ABŞ-da təsvir edilmişdir (Saif et al., 2012). 1984-cü ildə donuz respirator koronavirusunun (PRCV) ortaya çıxmasından bəri, sünbül zülalında delesiyaları olan TGEV-in təbii mutantı, TGEV infeksiyaları azalmışdır (Saif et al., 2012). Kliniki olaraq PEDV və TGEV-ə bənzəyən yeni bir deltakoronavirus, donuz deltakoronavirusu (PDCoV) 2014-cü ildə ishallı ABŞ donuzlarında aşkar edilmişdir (Wang et al., 2014a). Çində 2016�-ci ildə başqa bir yeni alfakoronavirus (yarasa HKU2-yə bənzər), genetik cəhətdən fərqli, lakin kliniki olaraq digərlərinə bənzəyir, diareyalı donuzlarda təsbit edildi və donuzlarda kəskin diareya sindromu koronavirusu (SADS-CoV) təyin edildi (Gong et al., 2017 Pan et al., 2017 Zhou et al., 2018). Bu dörd donuz enterik koronavirusunun yaratdığı klinik əlamətlər fərqlənmir. Buna görə də, donuzlarda viral epidemik ishallara nəzarət etmək üçün diferensial diaqnoz çox vacibdir. Bu baxış PEDV infeksiyasının etiologiyası, ötürülməsi, patogenezi, profilaktikası və nəzarəti haqqında mövcud anlayışın yenilənməsinə yönəlmişdir.


NƏTİCƏLƏR

Köpək Burun Boşluğu Ekplantlarında SARS-CoV-2 və SARS-CoV-nin Məhdud Məhsuldar Replikasiyası

Beagle-lərdə [20] SARS-CoV-2-nin in vivo çağırış tədqiqatına uyğun olaraq, tədqiqatımızda SARS-CoV-2-nin həm insan, həm də it təcridləri 4 köpək eksplant sistemində zəif təkrarlandı (Şəkil 1). Burun boşluğunun eksplantlarında məhdud məhsuldar replikasiya olmuşdur, kultura supernatantında virus titrləri 3,1-3,2 log TCID-ə çatmışdır.50/mL 96 hpi, bu qismən SARS-CoV-2-nin itlərin burun tamponlarında aşağı müsbət sporadik aşkarlanmasına uyğun ola bilər [2]. Digər eksplantlarda təkrarlanma minimal və ya aşkar edilməmiş olaraq qaldı. Baxmayaraq ki, 2 SARS-CoV-2 izolatı 7 amin turşusu fərqi ilə aydın şəkildə fərqlənirdi (Cədvəl 1), o cümlədən, it təcridindəki G614-ün insanlarda daha yüksək virus yükü ilə əlaqəli olduğu sünbül zülalının 614 (D/G) mövqeyi [21] ], biz it eksplantlarında viral uyğunluqda heç bir açıq fərq müşahidə etmədik. Eynilə, biz SARS-CoV-nin yalnız itlərin burun boşluğunda, yumşaq damaqda və ağciyər eksplantlarında məhdud məhsuldar replikasiyasını müşahidə etdik, pik virus titrləri 3,6 və 4,0 log TCID arasındadır.50/mL 72-96 at gücündə (Şəkil 1). Traxeya eksplantları SARS-CoV-ə icazə vermədi.

İnsan və Köpək SARS-CoV-2 İzolatları Arasındakı Amin Turşu Fərqləri

. . Amin turşusu. .
Protein. Vəzifə. İnsan təcrid a. Köpək təcrid b. Əhəmiyyəti.
ORF1ab poliprotein/RNT-dən asılı RNT polimeraza (nsp12) 4715 P L L4715 [ 22]
Daha yüksək ölüm nisbəti
Spike qlikoprotein 367 F V Reseptor bağlayan domen daxilində [23].
614 D G G614 [ 21, 22]
Hazırkı dominant pandemiya forması
Xəstələrdə daha yüksək virus yükü
Daha yüksək ölüm nisbəti
ORF8 zülalı 62 L V
84 S L
Nukleokapsid fosfoproteini 203 R K Viral kapsidin formalaşmasında iştirak edən serin-argininlə zəngin motiv daxilində [24]
204 G R
. . Amin turşusu. .
Protein. Vəzifə. İnsan təcrid a. Köpək təcrid b. Əhəmiyyəti.
ORF1ab poliprotein/RNT-dən asılı RNT polimeraza (nsp12) 4715 P L L4715 [22]
Daha yüksək ölüm nisbəti
Spike qlikoprotein 367 F V Reseptor bağlayan domen daxilində [23].
614 D G G614 [ 21, 22]
Hazırkı dominant pandemiya forması
Xəstələrdə daha yüksək virus yükü
Daha yüksək ölüm nisbəti
ORF8 zülalı 62 L V
84 S L
Nukleokapsid fosfoproteini 203 R K Viral kapsidin formalaşmasında iştirak edən serin-argininlə zəngin motiv daxilində [24]
204 G R

a BetaCoV/HongKong/VM20001061/2020 (GISAID qoşulma nömrəsi EPI_ISL_412028).

b SARS-CoV-2/canine/HKG/20-03695/2020 (GENBANK qoşulma nömrəsi MT270814).

İnsan və Köpək SARS-CoV-2 İzolyatları Arasındakı Amin Turşu Fərqləri

. . Amin turşusu. .
Protein. Vəzifə. İnsan təcrid a. Köpək təcrid b. Əhəmiyyəti.
ORF1ab poliprotein/RNT-dən asılı RNT polimeraza (nsp12) 4715 P L L4715 [22]
Daha yüksək ölüm nisbəti
Sünbül glikoprotein 367 F V Reseptor bağlayan domen daxilində [23].
614 D G G614 [ 21, 22]
Hazırkı dominant pandemiya forması
Xəstələrdə daha yüksək virus yükü
Daha yüksək ölüm nisbəti
ORF8 zülalı 62 L V
84 S L
Nukleokapsid fosfoproteini 203 R K Viral kapsidin formalaşmasında iştirak edən serin-argininlə zəngin motiv daxilində [24]
204 G R
. . Amin turşusu. .
Protein. Vəzifə. İnsan təcrid a. Köpək təcrid b. Əhəmiyyəti.
ORF1ab poliprotein/RNT-dən asılı RNT polimeraza (nsp12) 4715 P L L4715 [ 22]
Daha yüksək ölüm nisbəti
Sünbül glikoprotein 367 F V Reseptor bağlayan domen daxilində [23].
614 D G G614 [ 21, 22]
Hazırkı dominant pandemiya forması
Xəstələrdə daha yüksək virus yükü
Daha yüksək ölüm nisbəti
ORF8 zülalı 62 L V
84 S L
Nukleokapsid fosfoproteini 203 R K Viral kapsidin formalaşmasında iştirak edən serin-argininlə zəngin motiv daxilində [24]
204 G R

a BetaCoV/HongKong/VM20001061/2020 (GISAID qoşulma nömrəsi EPI_ISL_412028).

b SARS-CoV-2/canine/HKG/20-03695/2020 (GENBANK qoşulma nömrəsi MT270814).

Köpək toxuması eksplantlarında SARS-CoV-2 və SARS-CoV-nin replikasiya kinetikası. Eksplantlar təxminən 1 × 10 6 PFU/mL virusu ilə yoluxmuşdur. 1, 24, 48, 72 və 96 hpi-də mədəniyyət supernatantında virus titrləri TCID tərəfindən müəyyən edilmişdir.50 1,5 log TCID aşkarlama limiti ilə analiz50/mL, nöqtəli xətlərlə işarələnir. Hər bir sütun virus ştammına görə replikasiya kinetikasını göstərir. Hər bir sıra hər bir eksplant sistemi üzrə nəticələri göstərir. Hər bir xətt rəngi fərdi bir itin məlumatlarını tək replikada təmsil edir. Təcrübələr ən azı 3 fərqli itin toxumalarından istifadə edilməklə aparılıb. İxtisarlar: hpi, infeksiyadan sonrakı saatlar L, ağciyər NC, burun boşluğu PFU, lövhə əmələ gətirən vahid SARS-CoV-2, ağır kəskin respirator sindromlu coronavirus 2 SP, yumşaq damaq T, traxeya TCID50, 50% toxuma mədəniyyətinin infeksiya dozası.

Köpək toxuması eksplantlarında SARS-CoV-2 və SARS-CoV-nin replikasiya kinetikası. Eksplantlar təxminən 1 × 10 6 PFU/mL virusu ilə yoluxmuşdur. 1, 24, 48, 72 və 96 hpi-də mədəniyyət supernatantında virus titrləri TCID tərəfindən müəyyən edilmişdir.50 1,5 log TCID aşkarlama limiti ilə analiz50/mL, nöqtəli xətlərlə işarələnir. Hər bir sütun virus ştammına görə replikasiya kinetikasını göstərir. Hər bir sıra hər eksplant sistemi üzrə nəticələri göstərir. Hər bir xətt rəngi fərdi bir itin məlumatlarını tək replikada təmsil edir. Təcrübələr ən azı 3 fərqli itin toxumalarından istifadə edilməklə aparılıb. İxtisarlar: hpi, infeksiyadan sonrakı saatlar L, ağciyər NC, burun boşluğu PFU, lövhə əmələ gətirən vahid SARS-CoV-2, ağır kəskin respirator sindromlu coronavirus 2 SP, yumşaq damaq T, traxeya TCID50, 50% toxuma mədəniyyətinin infeksiya dozası.

Köpəklərin burun boşluğunda və yumşaq damaq epiteliyasında ACE2 reseptorlarının bolluğu

SARS-CoV-2 və SARS-CoV üçün giriş reseptoru olan ACE2 üçün boyanma, itlərin burun boşluğunda və yumşaq damaq epiteliyasında, müvafiq olaraq, orta və alt hüceyrə təbəqələrində ən sıx boyanma ilə bol ifadələr aşkar etdi (Şəkil 2). Köpəklərin traxeyasında və ağciyər epiteliyasında ACE2 ifadələri nadirdən mülayimə qədər dəyişdi.

Köpəklərin tənəffüs və yumşaq damaq toxumalarında angiotenzin çevirən ferment 2 (ACE2) reseptorlarının paylanması. 10% formalinlə fiksasiya olunmuş parafinə daxil edilmiş itlərin burun boşluğunda, yumşaq damaqda, nəfəs borusu və ağciyər (bronxiollar və alveollar) toxuma eksplantlarında ACE2 (qəhvəyi) üçün immunohistokimyəvi rəngləmə. Ölçək çubuqları = 50 μm.

Köpəklərin tənəffüs orqanlarında və yumşaq damaq toxumalarında angiotenzin çevirən ferment 2 (ACE2) reseptorlarının paylanması. 10% formalinlə fiksasiya olunmuş parafinə daxil edilmiş itlərin burun boşluğunda, yumşaq damaqda, nəfəs borusu və ağciyər (bronxiollar və alveollar) toxuma eksplantlarında ACE2 (qəhvəyi) üçün immunohistokimyəvi rəngləmə. Ölçək çubuqları = 50 μm.

Köpək toxuması eksplantlarında müxtəlif qrip alt növlərinin effektiv replikasiyası

Müxtəlif alt tipli qrip virusları asanlıqla yoluxmuş və köpək toxumasının eksplantlarında təkrarlanmışdır (Şəkil 3). Köpəklərdə yüksək yoluxucu olan Canine H3N2 burun boşluğunda, traxeyada və ağciyər eksplantlarında effektiv şəkildə təkrarlanır və 6,6 log TCID qədər yüksək virus titrləri yaradır.50/mL 72 hpi daxilində (Şəkil 3A). 7 insan/quş İAV alt tipi və 2 IBV izolatı arasında HPAI H5N1, H5N6 və H7N9 və bildirçin H9N2 burun boşluğunun eksplantlarında ən effektiv şəkildə təkrarlanır. Onlar replikasiya kinetik əyriləri (AUC) altında it H3N2 ilə müqayisə edilə bilən sahələri 24-72 hpi arasında bölüşdürdülər (Şəkil 3B). Onların pik virus titrlərinin 24-dən 72 hpi-a qədər olan vasitələri 4.7 ilə 5.7 log TCID arasında dəyişdi.50/mL, ən az effektiv IBV-lər isə 2,6-2,7 log TCID idi.50/ml. Yumşaq damaq eksplantlarında HPAI H5N1, H5N6 və H7N9 ən replikativ viruslar olaraq qaldılar, onların pik virus titrləri 5,1-6,2 log TCID-ə çatdı.50/mL və AUC dəyərləri it H3N2-dən statistik olaraq yüksəkdir. Canine H3N2, 2009 H1N1 pdm, HPAI H5N8 və bildirçin H9N2 3,2-3,5 log TCID-də pik virus titrlərinin vasitələri ilə bir qədər məhsuldar replikasiya göstərdi.50/ml. İnsan mövsümi H3N2 və IBV-lərin təkrarlanması əsasən marjinal və ya aşkar olunmamış səviyyələrdə olmuşdur. Traxeya eksplantlarında bütün insan/quş İAV-larının və İBV-lərinin AUC dəyərləri it H3N2-dən statistik olaraq aşağı olmuşdur. Bununla belə, insan mövsümi H3N2 və Viktoriyaya bənzər IBV istisna olmaqla, onların pik virus titrlərinin vasitələri hamısı ≥ 3,6 log TCID idi.50/ml. HPAI H5N6 və H7N9 və bildirçin H9N2 olanlar 4,9-5,1 log TCID-ə çatdı.50/mL, bu, it H3N2-dən təxminən 1 log aşağıdır. Ağciyər eksplantlarında, insan/quş İAV-lərində, Viktoriyaya bənzər IBV və it H3N2, 4,5 və 5,7 log TCID arasında dəyişən pik virus titrlərinin vasitələri ilə müqayisə edilə bilən AUC dəyərləri göstərdi.50/ml. Yamaqata bənzər IBV aşkar edilməmiş səviyyə (≤ 1.5 log TCID) arasında pik virus titrlərini verdi.50/mL) və 3.3 log TCID50/ml.

Köpək toxuması eksplantlarında İAV və İBV-lərin replikasiya kinetikası. A, Eksplantlar 1 × 10 6 PFU/mL virusu ilə yoluxmuşdur.1, 24, 48 və 72 hpi-də mədəniyyət supernatantında virus titrləri TCID tərəfindən müəyyən edilmişdir.50 1,5 log TCID aşkarlama limiti ilə analiz50/mL, nöqtəli xətlərlə işarələnir. Hər bir sütun virus ştammına görə replikasiya kinetikasını göstərir. Hər bir sıra hər eksplant sistemi üzrə nəticələri göstərir. Hər bir xətt rəngi fərdi bir itin məlumatlarını tək replikada təmsil edir. Təcrübələr ən azı 3 fərqli itin toxumalarından istifadə edilməklə aparılıb. B, AUC TCID-dən yuxarı50 aşkarlama limiti virus titrlərindən 24-72 hpi (orta ± SD) arasında hesablanmışdır. Hər bir eksplant sistemindəki digər viruslarla müqayisədə it H3N2-nin AUC dəyərləri arasında statistik əhəmiyyət Bonferroni posttestləri ilə 1-yollu ANOVA istifadə edərək təhlil edilmişdir. *P ≤ .05, **P ≤ .01, ***P ≤ .001, ****P ≤ .0001. İxtisarlar: ANOVA, AUC dispersiyasının təhlili, replikasiya kinetik əyrisi altında olan sahə hpi, infeksiyadan sonrakı saatlar IAV, qrip A virusu IBV, qrip B virusu L, ağciyər NC, burun boşluğu PFU, lövhə əmələ gətirən vahid SP, yumşaq damaq T, traxeya TCID50, 50% toxuma mədəniyyətinin infeksiya dozası.

Köpək toxuması eksplantlarında İAV və İBV-lərin replikasiya kinetikası. A, Eksplantlar 1 × 10 6 PFU/mL virusu ilə yoluxmuşdur. 1, 24, 48 və 72 hpi-də mədəniyyət supernatantında virus titrləri TCID tərəfindən müəyyən edilmişdir.50 1,5 log TCID aşkarlama limiti ilə analiz50/mL, nöqtəli xətlərlə işarələnir. Hər bir sütun virus ştammına görə replikasiya kinetikasını göstərir. Hər bir sıra hər eksplant sistemi üzrə nəticələri göstərir. Hər bir xətt rəngi fərdi bir itin məlumatlarını tək replikada təmsil edir. Təcrübələr ən azı 3 fərqli itin toxumalarından istifadə edilməklə aparılıb. B, AUC TCID-dən yuxarı50 aşkarlama həddi virus titrlərindən 24-72 hpi (orta ± SD) arasında hesablanmışdır. Hər bir eksplant sistemindəki digər viruslarla müqayisədə it H3N2-nin AUC dəyərləri arasında statistik əhəmiyyət Bonferroni posttestləri ilə 1-yollu ANOVA istifadə edərək təhlil edilmişdir. *P ≤ .05, **P ≤ .01, ***P ≤ .001, ****P ≤ .0001. İxtisarlar: ANOVA, AUC dispersiyasının təhlili, replikasiya kinetik əyrisi altında olan sahə hpi, infeksiyadan sonrakı saatlar IAV, qrip A virusu IBV, qrip B virusu L, ağciyər NC, burun boşluğu PFU, lövhə əmələ gətirən vahid SP, yumşaq damaq T, traxeya TCID50, 50% toxuma mədəniyyətinin infeksiya dozası.

Köpəklərin tənəffüs və yumşaq damaq epiteliyasında α2,3- və α2,6 ilə əlaqəli sial turşusu reseptorlarının bolluğu

Köpək toxumalarında sialik turşu (SA) reseptorlarının paylanmasını müəyyən etmək üçün lektin histokimyasını həyata keçirdik. SNA bağlanması (α2,6 ilə əlaqəli SA-ya qarşı spesifik) burun boşluğunun, traxeyanın və bronxiolların epiteliyasında bol, lakin yumşaq damaq və alveollarda orta səviyyədə idi (Şəkil 4). Üstünlüklə bağlanan MAAI və MAAII izotipləri N- bağlı və ya əsas 2 O- SAα2,3-Galβ1,4GlcNAc ehtiva edən əlaqəli qlikanlar və O-müvafiq olaraq SAα2,3-Galβ1,3GalNAc ehtiva edən əlaqəli qlikanlar [25, 26] fərqli paylanma nümunələri nümayiş etdirdi. MAAI bağlanması yumşaq damağın və bronxiolların epiteliyasında bol, burun boşluğu səviyyəsində orta, traxeya və alveollarda isə nadirdir. MAAII bağlanması bütün toxuma eksplantlarının epiteliyasında bol olmuşdur. Qeyd edək ki, MAAI və MAAII, həmçinin tərkibində SO olan SA olmayan qlikanlara yüksək yaxınlıq ilə bağlandığı bilinir.4-3-Galβ1,4GlcNAc və SO4-3-Galβ, müvafiq olaraq [25, 26].

Köpəklərin tənəffüs orqanlarında və yumşaq damaq toxumalarında SA reseptorlarının paylanması. SNA-nın α2,6-qalaktoza ilə əlaqəli SA-ya, MAAI-ə daha çox bağlanması (çəhrayı qırmızı) N- bağlı və ya əsas 2 O- SAα2,3-Galβ1,4GlcNAc olan əlaqəli qlikanlar və tərkibində SO olan qeyri-SA qlikanlar4-3-Galβ1,4GlcNAc və MAAII üstünlük təşkil edir O- tərkibində SAα2,3-Galβ1,3GalNAc olan əlaqəli qlikanlar və tərkibində SO olan qeyri-SA qlikanlar4-3-Galβ, itlərin burun boşluğunda, yumşaq damaqda, nəfəs borusu və ağciyər (bronxiollar və alveollar) toxuma eksplantlarında. Ölçək çubuqları = 50 μm. İxtisarlar: MAAI, Maackia amurensis lektin I MAAII, Maackia amurensis lektin II SA, sial turşusu SNA, Qara sambucus lektin.

Köpəklərin tənəffüs orqanlarında və yumşaq damaq toxumalarında SA reseptorlarının paylanması. SNA-nın α2,6-qalaktoza ilə əlaqəli SA-ya, MAAI-ə daha çox bağlanması (çəhrayı qırmızı) N- bağlı və ya əsas 2 O- SAα2,3-Galβ1,4GlcNAc olan əlaqəli qlikanlar və tərkibində SO olan qeyri-SA qlikanlar4-3-Galβ1,4GlcNAc və MAAII üstünlük təşkil edir O- tərkibində SAα2,3-Galβ1,3GalNAc olan əlaqəli qlikanlar və tərkibində SO olan qeyri-SA qlikanlar4-3-Galβ, itlərin burun boşluğunda, yumşaq damaqda, nəfəs borusu və ağciyər (bronxiollar və alveollar) toxuma eksplantlarında. Ölçək çubuqları = 50 μm. İxtisarlar: MAAI, Maackia amurensis lektin I MAAII, Maackia amurensis lektin II SA, sial turşusu SNA, Qara sambucus lektin.


MATERİALLAR VƏ METODLAR

Qarğıdalı-soya unu əsaslı donuz püresi pəhrizi (Cədvəl 1) Kanzas Dövlət Universitetində O.H. Manhattan, KS-dəki Kruse Feed Texnologiya İnnovasiya Mərkəzi və bütün təcrübələrdə istifadə olunur. Bu yemin alt nümunəsi peyvənddən əvvəl alınmış və kəmiyyət tərs transkripsiya PZR ilə mənfi olduğu təsdiq edilmişdir (qRT-PCR) Manhettendə, KS-də Kanzas Dövlət Universitetinin Tədqiqat Parkının Molekulyar Diaqnostika İnkişafı Laboratoriyasında PEDV RNT-nin olması üçün.

Exp istifadə pəhriz tərkibi. 1 və 2

Maddə. Mənfi nəzarət.
Tərkib, %
qarğıdalı 79.30
Soya unu, 46,5 CP 15.70
Seçim ağ yağ 1.00
Monokalsium fosfat 1.40
Əhəngdaşı, torpaq 1.15
Duz 0.50
L-treonin 0.03
İz mineral premiks 1 0.15
2-ci paket əlavə edin 0.50
Vitamin premiks 3 0.25
Fitaza 4 0.02
Ümumi 100.00
Formullaşdırılmış analiz, %
DM 91.4
CP 17.1
Xam lif 3.7
Efir ekstraktı 3.5
Ca 0.78
P 0.52
Maddə. Mənfi nəzarət.
Tərkibi, %
qarğıdalı 79.30
Soya unu, 46,5 CP 15.70
Seçim ağ yağ 1.00
Monokalsium fosfat 1.40
Əhəngdaşı, torpaq 1.15
Duz 0.50
L-treonin 0.03
İz mineral premiks 1 0.15
2-ci paket əlavə edin 0.50
Vitamin premiks 3 0.25
Fitaza 4 0.02
Ümumi 100.00
Formullaşdırılmış analiz, %
DM 91.4
CP 17.1
Xam lif 3.7
Efir ekstraktı 3.5
Ca 0.78
P 0.52

1 Hər kiloqramda 26,4 q Mn, 110 q Fe, 110 q Zn, 11 q Cu, 198 mq I və 198 mq Se var.

2 Hər kiloqramda 220.000 mq xolin, 88 mq biotin, 660 mq fol turşusu və 1.980 mq piridoksin var.

3 Hər kiloqramda 4.400.000 IU vitamin A, 660.000 IU vitamin D var.3, 17,600 IU E vitamini, 1,760 mq menadion, 3,300 mq riboflavin, 11,000 mq pantotenik turşu, 19,800 mq niasin və 15,4 mq B vitamini12.

4 High Phos 2700 GT (DSM Nutritional Products, Parsippany, NJ).

Exp istifadə pəhriz tərkibi. 1 və 2

Maddə. Mənfi nəzarət.
Tərkib, %
qarğıdalı 79.30
Soya unu, 46,5 CP 15.70
Seçim ağ yağ 1.00
Monokalsium fosfat 1.40
Əhəngdaşı, torpaq 1.15
Duz 0.50
L-treonin 0.03
İz mineral premiks 1 0.15
2-ci paket əlavə edin 0.50
Vitamin premiks 3 0.25
Fitaza 4 0.02
Ümumi 100.00
Formullaşdırılmış analiz, %
DM 91.4
CP 17.1
Xam lif 3.7
Efir ekstraktı 3.5
Ca 0.78
P 0.52
Maddə. Mənfi nəzarət.
Tərkib, %
qarğıdalı 79.30
Soya unu, 46,5 CP 15.70
Seçim ağ yağ 1.00
Monokalsium fosfat 1.40
Əhəngdaşı, torpaq 1.15
Duz 0.50
L-treonin 0.03
İz mineral premiks 1 0.15
2-ci paket əlavə edin 0.50
Vitamin premiks 3 0.25
Fitaza 4 0.02
Ümumi 100.00
Formullaşdırılmış analiz, %
DM 91.4
CP 17.1
Xam lif 3.7
Efir ekstraktı 3.5
Ca 0.78
P 0.52

1 Hər kiloqramda 26,4 q Mn, 110 q Fe, 110 q Zn, 11 q Cu, 198 mq I və 198 mq Se var.

2 Hər kiloqramda 220.000 mq xolin, 88 mq biotin, 660 mq fol turşusu və 1.980 mq piridoksin var.

3 Hər kiloqramda 4.400.000 IU vitamin A, 660.000 IU vitamin D var.3, 17,600 IU E vitamini, 1,760 mq menadion, 3,300 mq riboflavin, 11,000 mq pantotenik turşu, 19,800 mq niasin və 15,4 mq B vitamini12.

4 High Phos 2700 GT (DSM Nutritional Products, Parsippany, NJ).

Donuz Epidemik Diareya Virus İzolyatı

Donuz yemi ABŞ/IN/2013/19338, keçid 8 (PEDV19338) təcrid olunmuş ABŞ PEDV prototipi ştamm hüceyrə kulturası ilə aşılanmışdır. Virusların təcrid edilməsi, yayılması və titrasiyası Vero hüceyrələrində (ATCC CCL-81 Amerika tipli mədəniyyət kolleksiyası, Manassas, VA) Chen və digərləri tərəfindən təsvir edildiyi kimi həyata keçirilmişdir. (2014). Stok virus titrində 4,5 · 106 toxuma kulturasının infeksion dozası (hüceyrələrin 50%-də sitopatik effekti görmək üçün istifadə edilən konsentrasiya) var. TCID)50/mL və istifadə etməzdən əvvəl -80°C-də saxlanılan 500 ml-lik hissələrə bölünüb, hər təkrarlamada 1 alikot istifadə olunub.

Təcrübə 1

Təcrübə 1 PEDV miqdarı və yoluxuculuq üzrə pelletləmə zamanı PEDV dozasının və dəyişən vaxt · temperatur birləşmələrinin rolunu qiymətləndirdi. Müalicələr 3 qranul dəyirmanı kondisioner temperaturu (68,3, 79,4 və 90,6°C), 3 kondisionerləmə vaxtı (45, 90 və 180 s) və 2 PEDV dozası ilə 3 · 3 · 2 + 1 + 2 faktorlu tənzimləmə ilə təşkil edilmişdir. (aşağı doza, 1 · 10 2 TCID50/g və 20 dövrə vaxtı [Ct] və yüksək doza, 1 · 10 4 TCID50/g və 13 Ct). İki növ nəzarətə tək peyvənd olunmamış yemək əsaslı neqativ nəzarət və termal olaraq emal olunmamış 2 PEDV ilə aşılanmış yemək əsaslı müsbət nəzarət (hər dozada 1) daxildir. PEDV dozaları Şumaxer və digərləri tərəfindən müəyyən edilmiş donuz yemində PEDV-nin məlum minimum yoluxucu dozası əsasında seçilmişdir. (2015). Pellet dəyirmanının kondisioner temperaturları və vaxtları qranul keyfiyyəti üçün ənənəvi sənaye parametrləri və digər bioloji təhlükələri azaltmaq üçün gigiyenik qranullaşma üçün ekstremal parametrlər əsasında seçilmişdir. Salmonella spp. (Cochrane et al., 2015).

Donuz Epidemik Diareya Virus İnokulu

Bazal pəhriz qarışdırıldıqdan sonra mənfi nəzarət püresi nümunələri toplandı. Sonra, 500 ml-lik ehtiyat virusunu 4,5 kq-lıq yem partiyasına qarışdırmaqla yem inokulumu yaradılmışdır. Yem və virus, skamya üstü laboratoriya miqyasında paslanmayan poladdan hazırlanmış avar qarışdırıcıdan (Cabela's Inc., Sidney, NE) istifadə edərək saniyədə 1 dəfə fırlanma ilə 2,5 dəqiqə ərzində qarışdırıldı.

Yuxarıdakı prosedurlar daha sonra yüksək dozalı peyvənd üçün təkrarlandı. Hər bir püresi pəhrizinin nümunələri qranullaşmadan əvvəl müsbət aşağı və yüksək dozalı yem nəzarəti kimi aseptik qaydada toplanmışdır.

Termal emal

Aşağı və yüksək dozalı aşılanmış yemlər pilot miqyaslı tək keçidli kondisioner və qranul dəyirmanından (model CL5 CPM, Waterloo, IA) istifadə edərək termik emal edilmişdir. Birinci emaldan əvvəl peletlənməmiş yem yemin çıxış temperaturu hədəf temperaturda sabit olana qədər işlənmişdir. Çarpaz çirklənmənin azaldılmasına kömək etmək üçün aşağı dozalı partiyalar yüksək dozalı partiyalardan əvvəl qranullara salındı. Termik emal zamanı, hər bir dozada, ilk olaraq, ən aşağı temperatur və ən uzun saxlama müddəti ilə müalicə qranullandı. Sonra digər 2 saxlama müddəti əldə olunana qədər temperatur sabit saxlanıldı və nümunələr toplandı. Sonra bu proses 2 daha yüksək temperaturda təkrarlandı. Hər bir müalicə üçün temperatur kondisionerdən qranullar üçün qidalandırıcı vintinə axıdılan zaman ölçüldü. Aşağı dozalı müalicələr başa çatdıqdan sonra, eyni prosedur yüksək dozalı müalicələri qranullaşdırmaq üçün istifadə edilmişdir. Hər temperatur, vaxt və doza birləşməsi üçün qRT-PZR və bioanaliz analizi üçün 3 qranul nümunə toplandı. Bundan əlavə, hər bir aşılanmış partiya arasında qranul dəyirmanı vasitəsilə minimum 5 kq virussuz yem emal edilmişdir. Bu, müalicələr arasında virus ötürülməsinin qarşısını almaq və çirklənmiş yemin vahid temperatur şəraitində işlənməsini təmin etmək üçün kondisioner temperaturunu sabitləşdirmək üçün edilib.

Nümunələrin hazırlanması və saxlanması

Hər yem partiyasının üç 100 q nümunəsi 500 ml-lik şüşələrdə (kvadrat Nalgene butulkaları Thermo Scientific, Waltham, MA) 400 mL soyuq PBS (Life Technologies, Grand Island, New York pH 7.4) əlavə edildi və hərtərəfli qarışdırıldı və 4°C temperaturda təxminən 12 saat saxlanılır. Daha sonra Kanzas Dövlət Universitetində (Manhetten, KS) PEDV N geninə əsaslanan qRT-PCR istifadə edərək 2 ml-lik yem süspansiyonunun alikotu qiymətləndirildi. 20 ml-lik alikot da yığılmış və bioanalizdə istifadə üçün -80°C-də dondurulmuşdur.

Bioanaliz

Ayova Dövlət Universitetinin İnstitusional Heyvanlara Qulluq və İstifadə Komitəsi donuz bioanalizi protokolunu nəzərdən keçirdi və təsdiqlədi. Qarışıq cinsdən olan cəmi 63 donuz, əvvəllər PEDV-ə məruz qalmadan, tək bir kommersiya, çapraz cinsi cücə-süddən kəsilmiş sürüdən əldə edilmişdir. Bundan əlavə, bütün donuzlarda PEDV, donuz deltası koronavirusu və nəcis çubuquna əsaslanan ötürülən qastroenterit virusu üçün mənfi olduğu təsdiqləndi. PEDV-mənfi statusu daha da təsdiqləmək üçün toplanmış qan serumu, Ayova Dövlət Universitetinin Baytarlıq Diaqnostika Laboratoriyasında (Ames, IA) aparılmış, dolayı flüoresan anticisim analizi ilə PEDV antikorları və ötürülən qastroenterit virusu anticisimləri üçün ELISA tərəfindən təhlil edilmişdir. Bioanaliz başlamazdan əvvəl donuzlara yeni qələmlərə 2 gün uyğunlaşma icazəsi verildi.

Cəmi 21 otaq (63 donuz, hər otaqda 3) müalicə qruplarına 1 mənfi nəzarət otağı, 2 müsbət nəzarət otağı (aşağı və yüksək doza) və müalicə pəhrizlərini təmsil edən 18 otaq (3 kondisioner temperaturu · 3 kondisioner dəfə) ayrıldı. 2 PEDV doza səviyyəsi). Hər otaqdakı 3 donuzun hər biri ağız boşluğu vasitəsilə eksperimental pəhrizin ayrıca yem nümunəsi aldı. Məsələn, PEDV-nin aşağı dozası (1 · 10 2 TCID) ilə aşılanmış yem nümunələri50/g və 20 Ct) və 68,3°C-də 45 s kondisioner 1 otağa verildi. Həmin otaqda hər bir donuz eksperimental müalicədən fərqli yem nümunəsi ilə aşılanmışdır. Bu, hər dəfə 3 donuz · temperatur · doza müalicəsi ilə nəticələndi.

Bioanaliz zamanı rektal tamponlar peyvənddən sonra 0, 2, 4, 6 və 7 günlərdə toplandı (dpi) bütün donuzlardan alınmış və PEDV RNT qRT-PCR üçün sınaqdan keçirilmişdir. 7 dpi-də humanist evtanaziyadan sonra nazik bağırsaq, kor bağırsaq və kolon nümunələri nekropsiyada bir alikot kor bağırsaq məzmunu ilə birlikdə toplandı. Histopatologiya və immunohistokimya üçün formalinlə sabitlənmiş proksimal, orta və distal jejunum və ileumun bir hissəsi donuz başına toplandı (IHC Chen və başqaları, 2014).

Təcrübə 2

Exp nəticələrinə əsasən. 1-də, pellet dəyirmanı temperaturlarının artırılmasının PEDV inaktivasiyasına təsirini qiymətləndirmək üçün ikinci bir araşdırma hazırlanmışdır. Təcrübə qranul dəyirmanı tıxacları olan yem dəyirmanında baş verə biləcək real həyat vəziyyətini təqlid etmək üçün hazırlanmışdır. Bu vəziyyətdə, yem qranul dəyirmanına yerləşdiriləcək və kalıp içərisindəki materialı azad etmək üçün buxar söndürüləcəkdir. Bu vəziyyət yemin hədəf qranul temperaturuna çatmamasına səbəb olur. Bu səbəblə məqsədi Uzm. Şəkil 2, pellet dəyirmanında tıxac yaranarsa, PEDV inaktivasiyası zamanı 37 ilə 71°C arasında dəyişən 5 artan kondisioner temperaturunu qiymətləndirməli idi.

Donuz Epidemik Diareya Virus İnokulu

Təcrübə 2 Kanzas Dövlət Universitetində (Manhetten, KS) Cargill Yem Təhlükəsizliyi Araşdırma Mərkəzində həyata keçirilmişdir. Exp üçün məqsədi yerinə yetirmək üçün. 2, PEDV-siz yem əvvəlcə toplandı, PEDV-mənfi nəzarət kimi istifadə edildi və PEDV inokulumunu hazırlamaq üçün istifadə edildi. Yalnız yüksək dozalı PEDV ehtiyat virusu (1 · 10 4 TCID50/g və 16 Ct) Exp üçün istifadə edilmişdir. 2. 500 ml-lik ehtiyat virusunun 4,5 kq-lıq donuz yemi partiyasına qarışdırılması ilə inokulum premiksi yaradılmışdır. 1. Yem və inokulum bir dəzgah üstü laboratoriya miqyasında paslanmayan poladdan hazırlanmış avarlı qarışdırıcıdan (Cabela's Inc.) istifadə edərək, avarların saniyədə 1 fırlanması ilə cəmi 2,5 dəqiqə ərzində qarışdırıldı.

PEDV yem inokulumu (4,5 kq yem + 500 ml ehtiyat virusu) daha sonra 0,11 m 3 elektrik avarlı qarışdırıcıda (model nömrəsi SS-L1 HC Davis Sons) müsbət nəzarət yaratmaq üçün 45 kq PEDV-siz donuz pəhrizinə əlavə edildi. Manufacturing Co., Inc., Bonner Springs, KS). Bütün partiya daha sonra 5 dəqiqə qarışdırıldı, PEDV-müsbət nəzarət yaradıldı, 10 dəqiqə ərzində biotəhlükəli konteynerlərə axıdıldı və nəhayət, termik emal olunana qədər -2°C-də təxminən 1 saat saxlanıldı.

Termal emal

Donuz epidemiyası diareya virusu olmayan yem, Exp. 1. Qranullama sistemindəki tıxacı təqlid etmək üçün pellet dəyirmanı normal istehsal temperaturunu əks etdirən 71°C kondisioner temperaturu ilə PEDV-siz yemi qranullaşdırmaqla qızdırılıb. Bütün pelet dəyirmanının optimal temperatura çatması üçün qranul dəyirmanı 60 dəqiqə ərzində 71°C-yə qədər qızdırılıb. Temperatur yenidən kondisionerdən qranul qidalandırıcı vintinə axıdılan zaman termometrlə ölçüldü. 60 dəqiqədən sonra buxar klapan kondisionerdə və ya qranulda tıxacın aradan qaldırılması üçün ümumi istifadə edilən prosedurları təqlid etmək üçün kondisioner temperaturu 37°C-dən aşağı düşənə qədər söndürüldü. Sonra, PEDV ilə aşılanmış yem qranul dəyirmanının bunkerinə yerləşdirildi. PEDV ilə aşılanmış yem qranul dəyirmanından keçməyə başladıqdan sonra buxar yavaş-yavaş əlavə edildi və 5 ədəd qranul nümunəsi 37, 46, 54, 62 və 71°C (±1,2°C) isti püresi kondisioner temperaturunda toplandı. 30-s kondisioner vaxtı. Bu kondisioner temperaturları xüsusi pelet dəyirmanı üçün əvvəlcədən müəyyən edilmiş proqnoz tənliyinə əsasən seçilmişdir.

Təcrübə 2, 3 həqiqi təkrar yaratmaq üçün hər qaçış arasında obyektin tam zərərsizləşdirilməsi ilə yem təhlükəsizliyi tədqiqat mərkəzi daxilində 3 ayrı dəfə (gün) yerinə yetirildi.

Nümunələrin hazırlanması və saxlanması

Hər yem partiyasının üç 100 q nümunəsi 500 ml-lik şüşələrdə (kvadrat Nalgene butulkaları Thermo Scientific) 400 mL soyuq PBS (Life Technologies pH, 7.4) əlavə edildi və hərtərəfli qarışdırıldı və təxminən 4°C temperaturda təxminən 112 saat saxlanıldı. . Daha sonra Kanzas Dövlət Universitetində PEDV N geninə əsaslanan qRT-PCR istifadə edərək 2 ml-lik yem süspansiyonu qiymətləndirilir. 20 ml-lik alikot da yığılmış və bioanalizdə istifadə üçün -80°C-də dondurulmuşdur.

Bioanaliz

Qarışıq cinsdən olan cəmi 48 donuz, əvvəllər PEDV-ə məruz qalmadan, tək bir kommersiya, melezləşmiş cücədən süddən kəsilmiş sürüdən əldə edilmişdir. Bioanaliz üçün prosedurlar və qiymətləndirmələr Exp. 1 bioanaliz.

Cəmi 16 otaq (48 donuz, hər otaqda 3) 1 mənfi nəzarət otağı və müalicə pəhrizlərini təmsil edən 15 otaq (5 kondisioner temperaturu · 3 təkrar/temperatur) olan müalicə qruplarına ayrıldı. Hər otaqdakı 3 donuzun hər biri oral gavaj vasitəsilə eksperimental pəhrizin 3 emal günündən 1-ni əks etdirən ayrıca yem nümunəsi aldı. Hər otaqda Donuz 1 Termal Emal 1-ci gündə hazırlanmış nümunəni, Donuz 2 Termal Emal 2-də hazırlanmış nümunəni və Donuz 3 Emal 3-də hazırlanmış nümunəni qəbul etdi. Bu, hər kondisioner temperaturu üçün 9 donuzla nəticələndi.

Mənfi nəzarət otağından gələn hər donuza 0,11 m3 elektrik avarlı qarışdırıcıdan yaradılmış 10 mL alikot inokulum verildi. Mənfi nəzarət otağından fərqli olaraq, hər sınaq otağındakı hər donuza təkrarlama, temperatur və emal günündən bir alikvoum inokulum verildi, nəticədə eyni temperaturla müalicədən və fərqli emal günlərindən 3 nümunə əldə edildi. Bir otaq hər müalicə üçün 3 otaqdan ibarət müalicəni təmsil edirdi. Rektal tamponlar və bağırsaq kəsikləri Uzm ilə eyni şəkildə qiymətləndirildi. 1 bioanaliz.

Statistik təhlil

Statistik təhlil SAS 9.4 versiyasından istifadə etməklə aparılmışdır (SAS Inst. Inc., Cary, NC). Exp ildə. 1, SAS-ın PROC MIXED PEDV RNT qidalanma Ct dəyərlərini, villusun hündürlüyünü, kript dərinliyini, villöz hündürlükdən kript dərinliyinə nisbəti və IHC-ni qiymətləndirmək üçün istifadə edilmişdir.Sabit təsirlərə temperatur, vaxt, doza və onların kombinasiyası daxildir. Exp ildə. Şəkil 2, kondisioner temperaturunun yem Ct dəyərlərinə, villusun hündürlüyünə, kript dərinliyinə və villusun hündürlüyü-kript dərinliyi nisbətinə təsiri ilə bağlı məlumatlar SAS-da PROC GLIMMIX-dən istifadə edərək, təcrübə vahidi olaraq ikili şəkildə ikili şəkildə tamamilə təsadüfi dizayn kimi təhlil edilmişdir. müqayisə. Müalicə sabit təsir idi. Müalicə meyarları üçün nəticələr əhəmiyyətli hesab edildi P ≤ 0,05 və marjinal əhəmiyyətlidir P > 0,05 ilə P ≤ 0.10.


3 NƏTİCƏ

3.1 EAE siçanlarının onurğa beynindəki MDSC-lərin sıxlığı demiyelinləşdirilmiş lezyonlarda oliqodendrositlərin prekursor hüceyrələrinin paylanması ilə birbaşa əlaqələndirilir.

EAE siçanlarının demiyelinləşdirilmiş onurğa beyni lezyonlarında Arg-I + MDSC-lərin sıxlığı, xəstəliyin gedişatının zirvəsində ən yüksək sıxlığa çatan bu heyvan modelinin klinik göstəricisinə paraleldir (Moliné-Velázquez et al., 2011). MDSC-lərin paylanmasının OPC-lərin (NG2 + hüceyrələri kimi müəyyən edilir) davranışına təsir edərək neyroreparatda rol oynayıb-oynamayacağını qiymətləndirmək üçün ilk növbədə bu hüceyrə növlərinin hər ikisinin EAE siçanlarının demyelinləşdirilmiş lezyonlarında paylanmasını təhlil etdik. simptomlar. Lezyon sahəsini, müvafiq bitişik periplağı və ətrafdakı təsirsiz ağ maddəni (NAWM) təyin etdikdən sonra MDSC-lər əsasən lövhə daxilində, OPC-lər isə əsasən periplak sahəsində aşkar edilmişdir (Şəkil 1a-e). MDSC və OPC-lərin bu tamamlayıcı paylanması onlar arasında əhəmiyyətli birbaşa korrelyasiya ilə əks olundu (r = .630, səh < .001), beləliklə, lövhə daxilində MDSC-lərin sıxlığı nə qədər yüksək olarsa, bitişik periplakda OPC-lərin sıxlığı bir o qədər yüksək olar (Şəkil 1f). Eyni şəkildə, lövhədəki MDSC-lərin sıxlığı da NAWM-də OPC-lərin olması ilə əhəmiyyətli dərəcədə əlaqələndirildi (Şəkil 1g: r = .403, səh < .01). Nəhayət, MDSC-lərin paylanması ilə bitişik NAWM-də OPC-lərin periplak/sıxlığında bu hüceyrələrin sıxlığı arasındakı nisbət kimi hesablanan OPC-lərin gradienti arasında korrelyasiyanın mövcudluğu təhlil edilmişdir. Lövhədəki MDSC-lərin sıxlığı birbaşa OPC-lərin nisbəti ilə əlaqəli olsa da (Şəkil 1h: r = .257, səh = .0587), periplakdakı MDSC-lər vəziyyətində əhəmiyyətli, lakin təvazökar bir əlaqə var idi (Şəkil 1i: r = .301, səh < .05). Xülasə, bu məlumatlar remiyelinasiyanın baş verə biləcəyi bölgələrdə OPC-lərin səfərbər edilməsində MDSC-lərin potensial rolunu təklif edir.

3.2 MDSCs tərəfindən istehsal olunan həll olunan amillərin oliqodendrosit prekursor hüceyrələrinin biologiyasına təsiri

MDSC-lərin OPC-lərə birbaşa təsir göstərib-göstərmədiyini araşdırmaq üçün MDSC-CM-nin onların sağ qalması, yayılması, miqrasiyası və differensiasiyasına təsirini sınaqdan keçirdik. OPC-lərin sağ qalması apoptotik stimul olmadıqda öyrənildi, OPC yayılma mühiti ilə 1:2 nisbətində MDSC-CM varlığında 48 saat ərzində OPC-ləri kultivasiya etdi (Şəkil 2a). MDSC-CM, nəqliyyat vasitəsi və ya nəzarət mühiti (yalnız yayılma mühiti) hüceyrə yapışmasına və bərpasına icazə vermək üçün OPC-lərin toxumlanmasından 1 saat sonra əlavə edildi. 48 saatdan sonra OPC-lər sabitləndi və Olig2 üçün boyandı və apoptotik hüceyrələri aşkar etmək üçün TUNEL tərəfindən təhlil edildi (Şəkil 2b, c). Maraqlıdır ki, MDSC-CM-nin mövcudluğu nəzarət və avtomobil şəraitinə nisbətən sabit vəziyyət şəraitində apoptozdan erkən OPC-ləri (A2B5 +) qorudu (Şəkil 2e).

MDSC-lər tərəfindən istehsal olunan həll olunan amillərin mövcudluğunda OPC-lərin yayılması standart bir prosedurdan sonra BrdU-nun 6 saat ərzində in vitro birləşməsi ilə təhlil edildi (Medina-Rodríguez et al., 2013 Merchán et al., 2007). A2B5 + hüceyrələrinin yayılması nəzarət mühitinə nisbətən nəqliyyat vasitəsinin iştirakı ilə güclənsə də (Şəkil 3b, c), OPC-lər MDSC-lər tərəfindən ifraz olunan həll olunan amillərə məruz qaldıqda, digər iki şərtlə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi (Şəkil 3). 3b-e).

Hüceyrə dövrünün aktivləşdirilməsinə əlavə olaraq, effektiv miyelin bərpası, xüsusilə ağ maddə lezyonlarında, lezyon bölgələrinə düzgün OPC cəlb edilməsini tələb edir (Kuhlmann et al., 2008 Strijbis, Kooi, van der Valk, & Geurts, 2017, OPC işə götürülməsi ilə bağlı müvafiq araşdırmalar üçün insan MS lezyonlarında bax de Castro et al., 2013 Murphy & Franklin, 2017). Beləliklə, biz MDSC-CM-nin kemotaktik kameralarda OPC-lərin hərəkətliliyinə təsirini öyrəndik (Əlavə Şəkil S1a). Baxmayaraq ki, MDSC-CM nəzarət şərtlərinə nisbətən membranlar arasında aşağı kameraya doğru OPC miqrasiyasını azaldır (Əlavə Şəkil S1b-e), nəqliyyat vasitəsinin mədəniyyət mühitinin mövcudluğunda da azalma aşkar edilmişdir. Bu məlumatlar güclü şəkildə göstərir ki, təsir MDSCs-CM-də mövcud olan həll olunan amillə deyil, mədəniyyət mühitinin özü ilə bağlıdır. Bundan əlavə, üç fərqli şəraitdə (Əlavə Şəkil S1b-d) saxlanılan OPC-lər arasında heç bir morfoloji fərq müşahidə edilmədi, bu da hüceyrələrin hərəkətliliyində birbaşa dəyişiklik olduğunu göstərir.

MDSC-lərin oliqodendrogliogenezə və miyelinləşməyə necə təsir göstərə biləcəyini daha ətraflı öyrənmək üçün MDSC-CM-nin OPC fərqləndirməsini təşviq edib-etmədiyini yoxladıq (Şəkil 4a). Düzgün in vitro fərqləndirməni qiymətləndirmək üçün hüceyrələri oliqodendrositlərin yetişməsinin markerlərinə, yəni 2′,3′-siklik-nükleotid 3′-fosfodiesteraza (CNPase) və MBP (Şəkil 4b,) qarşı iki antikorla birlikdə immuno- boyandıq. . MDSC-CM-ə məruz qalma nəzarət elementlərindən əhəmiyyətli dərəcədə daha çox yetkin hüceyrələrə səbəb oldu (CNPase + hüceyrələr: 25,4 ± 4,2 və 45,3 ± 7,2 -Mann-Whitney U test: səh = .017- CNPase + /MBP + ikiqat ləkələnmiş hüceyrələr: 16,9 ± 3,2 və 31,4 ± 5,4 -Mann-Whitney U test: səh = .014- Şəkil 4a, b), həmçinin MBP üçün boyanmış hüceyrələrin tutduğu sahədə nəzərəçarpacaq artım, bu, MDSC-lərin buraxdığı həll olunan amillərə aid olduğu ortaya çıxdı, çünki oliqodendrogliaya heç bir təsir tək nəqliyyat vasitəsi tərəfindən həyata keçirilməmişdir. (Şəkil 4e). Birlikdə, bu məlumatlar göstərdi ki, MDSC-lər OPC-lərin sağ qalmasını, yayılmasını və differensiasiyasını təşviq edir, lakin onların miqrasiyasına təsir göstərmir.

MDSC-lərin miyelinin effektiv bərpasında ehtimal olunan rolunu daha da nümayiş etdirmək üçün biz neonatal siçanlardan beyincik dilimlərinin ex vivo orqanotipik mədəniyyətindən istifadə etdik (P7). MDSC-lərin dilimdəki OPC-lərə birbaşa təsirini immunitet sisteminin ümumi modulyasiyasından ayırmaq üçün toxuma zədələnməsi, rezident mikrogliaların yüngül aktivləşməsinə səbəb olan membran ikiqatlı narahat edən toksin olan LPC ilə təhrik edilmişdir. Bu ex vivo proseduru dövran edən immun hüceyrələrin hər hansı infiltrasiyasının qarşısını alır və 7 DIV-dən sonra eksperimentə başlamaqla dilimi əldə etmək üçün prosedur zamanı stimullaşdırılan reaktiv mikroqliyadan mümkün müdaxilənin qarşısını alır, mikrogliaların sabit vəziyyətə qayıtmasına üstünlük verir. Remiyelinasiyanın təhlili iki vaxt nöqtəsində, 4 və 8 dpl (müvafiq olaraq 11 və 15 DIV) hər bir təcrübədə daxili nəzarət kimi həmişə zədələnməmiş dilimlərdən istifadə etməklə həyata keçirilmişdir (Şəkil 5a). Əldə edilən məlumatlar, həm 4, həm də 8 dpl-də üç eksperimental qrup arasında remiyelinasiyada heç bir fərq olmadığını göstərdi (Şəkil 5b-h). Bununla belə, MDSC-CM varlığında saxlanılan dilimlərdə, 4 dpl ilə müqayisədə 8-də remiyelinləşdirilmiş aksonların əhəmiyyətli dərəcədə yüksək nisbəti var idi, bu fərq nəqliyyat vasitəsində və ya nəzarət şəraitində yetişdirilmiş dilimlərdə aydın deyildi (Şəkil 5h) . Bu məlumatlar MDSC-CM-nin miyelin əmələ gətirən hüceyrələrə OPC diferensiasiyasını təşviq etmək qabiliyyətinin ideyasını gücləndirdi. Maraqlıdır ki, miyelin istehsalının MDSC-CM təşviqi, LPC-yə məruz qalmayan, lakin 1 4 DIV üçün MDSC-CM-də saxlanılan dilimlər 11 DIV-dən daha çox NFH və MBP birgə lokalizasiyasını göstərdiyi üçün əvvəlki demiyelinləşdirici təhqirdən müstəqil görünürdü (Şəkil 5i).

Nəhayət, biz OPC yayılması, sağ qalma və differensiasiya üzərində müşahidə olunan təsirlərə cavabdeh ola biləcək ifraz olunmuş faktorları müəyyən etməyə başladıq. Beləliklə, MDSCs-CM-ni pro- və antiinflamatuar sitokinlər, kemokinlər, böyümə və fərqləndirmə amilləri, hüceyrədənkənar matris (ECM) komponentləri, proteazlar, membrana bağlı reseptorlar və hüceyrədaxili siqnal molekulları üçün proteom profilindən istifadə edərək təhlil etdik. Təhlil edilən 25 kemokin və 53 angiogenezlə əlaqəli faktorlar arasında MDSC-CM-də nəqliyyat vasitəsi ilə müqayisədə osteopontin və CXCL10 görkəmli idi. Üstəlik, RANTES və IL-1Rα-da daha mülayim olsa da, artım oldu (Şəkil 6a,b). Osteopontinin demyelinizasiyanın müxtəlif immunopatogen aspektlərində iştirakı bu molekulun prosesdə ümumi təsiri ilə bağlı orta dərəcədə mübahisələrə səbəb oldu (Hur və digərləri, 2007 Zhao et al., 2018 Zhao, Fancy, Ffrench-Constant və Franklin, 2008). ). Normal şəraitdə və xəstəliyin müxtəlif heyvan modellərində, o cümlədən demyelinasiya/MS (Jiang, Prell, & Lonnerdal, 2019 Mazaheri et al., 2018 Nam, Seo, Nahm, & Chang, 2019 Selvaraju et al., 2004). Əksinə, CXCL10 OPC-lərə birmənalı mənfi təsir göstərir (Liu, Keirstead, & Lane, 2001 Mills Ko et al., 2014 Tirotta, Ransohoff, & Lane, 2011). Bu səbəbdən, biz tədqiqatımızı OPC biologiyasına MDSC-CM-nin səbəb olduğu təsirlərə vasitəçilik etmək üçün ən çox ehtimal olunan namizəd kimi osteopontinə yönəltdik.

İlk addım olaraq, EAE siçanlarının onurğa beynində yüksək iltihablı bölgələrlə məhdudlaşan MDSC-lərdə osteopontinin varlığını təsdiqlədik (Şəkil 6c-f). Bu məlumatlar bizi MDSC-CM-dən osteopontini aradan qaldırmağa və OPC biologiyasına təsirini yoxlamağa sövq etdi. Bizim yanaşmamızla osteopontin MDSC-CM-dən tamamilə çıxarıldı (Əlavə Şəkil S2) və biz bunu MDSC-CM-OPN adlandırdıq. Osteopontinin aradan qaldırılması, OPC-lərin sağ qalması üzərində MDSC-CM qorunmasına ciddi təsir göstərdi (Şəkil 7a-c), nəzarət şərtləri səviyyəsinə çatdı (Şəkil 7d). Eyni mənada, nəzarət şərtlərinə bənzəyən MDSC-CM-OPN-də OPC yayılmasının təşviqi əhəmiyyətli dərəcədə pozuldu (Şəkil 8a-d).

OPC diferensiasiyasına gəldikdə, MDSC-CM varlığında yetkin oliqodendrositlərin (MBP +) tutduğu ümumi səthdə əhəmiyyətli artım, osteopontin sekretomdan xaric edildikdə kəskin şəkildə azaldı (Şəkil 9a-d). Ümumilikdə, bu nəticələr OPC biologiyasına təsir edən MDSC-CM-də bəlkə də ən vacib amillər kimi osteopontini güclü şəkildə göstərir.


Müzakirə

Bu işdə siçanlarda pH1N1 infeksiyası və onun hüceyrədənkənar və hüceyrədaxili tənəffüs yollarının pH-a təsiri araşdırılmışdır. Təxminən 20% ölüm və 15% maksimum çəki itkisi ilə nəticələnən 750 PFU WT virusu ilə infeksiya infeksiyanın ilk 2-5 günü ərzində burun, yumşaq damaq və traxeya toxumalarına pik virus yükü və limfosit infiltrasiyasını verdi. İnfeksiyadan əvvəl yuxarı tənəffüs yollarında hüceyrədənkənar pH təxminən 7,8 idi. pH1N1 ilə yoluxma 5 DPI-da pH-da maksimum azalma ilə mülayim turşulaşma ilə nəticələndi: naris 5.9, burun sinus 6.2, yumşaq damaq 6.5 və nəfəs borusu 6.5. Hüceyrədaxili olaraq infeksiya erkən və gec endosomların pH səviyyəsini də azaldır. WT virusunun aktivasiya pH-ı 5,5 olan HA proteini var idi, bu siçanlarda infeksiya üçün optimala yaxın hesab edilir [39] və pH 6,4 mühiti [38] ilə hüceyrədənkənar inaktivasiyaya davamlı olduğu göstərilmişdir. Mutant virus HA1-Y17H pH 6.0-da aktivləşən destabilləşdirilmiş HA proteininə malik idi və bu virusun pH 6.4 mühitində inaktivasiyaya həssas olduğu göstərilmişdir [38]. 750 PFU Y17H ilə yoluxmuş siçanlarda replikasiya və host reaksiyaları yüksək dərəcədə zəifləmişdir. Y17H heç bir kilo itkisinə və ya ölümə səbəb olmadı və burun, yumşaq damaq və traxeya toxumalarında VT ilə müqayisədə viral titrlər təxminən 100 dəfə azaldı. Y17H ilə 750-PFU infeksiyası yerli lenfosit infiltrasiyasını stimullaşdırdı və əvvəllər dendritik hüceyrələrdə I tip interferon reaksiyalarını gücləndirdiyi göstərildi [38]. Zəifləmiş infeksiya pH-da maksimum azalma ilə nəmlənmiş hüceyrədənkənar turşulaşma ilə nəticələndi: naris 6.8, burun sinus 6.8, yumşaq damaq 6.5 və nəfəs borusu 7.1. Y17H əvvəllər pH 6.4, lakin pH 7.0 mühiti ilə inaktivləşməyə həssas olduğu göstərilmişdir [38], beləliklə onun zəifləməsi və nəticədə nəmlənmiş turşulaşmanın yalnız yumşaq damaqda əks əlaqənin inaktivasiyasına gətirib çıxaracağı gözlənilir, lakin naris, burun sinusu və ya yox. nəfəs borusu. Y17H-nin 500 qat daha yüksək dozada (yəni, 375.000 PFU) aşılanması çəki itkisini, ölümü, virus yüklərini və lenfosit infiltrasiyasını 750 PFU WT ilə infeksiya ilə müqayisə edilə bilən səviyyələrə qaldırdı. Bundan əlavə, Y17H ilə 375K infeksiyası, hüceyrədənkənar pH-da aşağıdakı maksimum azalmalarla WT ilə göründüyü kimi tənəffüs yollarının turşulaşmasına səbəb oldu: naris 6.5, nazal sinus 6.5, yumşaq damaq 6.4 və traxeya 6.4. Bu mülayim asidik şəraitdə Y17H inaktivasiyaya getdikcə daha həssas olur [38], buna görə də zəifləmənin öhdəsindən gəlmək üçün Y17H dozasının artırılması, daha əvvəl təsvir edilən I tip interferon reaksiyalarından daha çox replikasiyanı zəiflətməsi gözlənilən mənfi əks əlaqə dövrəsinə səbəb oldu [38].

Bütövlükdə, bu tədqiqatlar göstərir ki, siçanlarda pH1N1 infeksiyası tənəffüs yolu pH-ni stabilləşdirilmiş HA zülalları (aktivasiya pH-ı təxminən 6.0) ilə IAV-ləri təsirsiz hala gətirə biləcək səviyyəyə qədər azaldır, lakin çox güman ki, orta stabilliyə malik olanlar (pH 5.5) deyil. İnfeksiyaya cavab olaraq tənəffüs yollarının yüngül turşulaşması tənəffüs patogenlərinin təkamülünə təsir göstərə bilən ilkin antiviral mexanizmdən xəbər verir. Ferretlərə intranazal yolla peyvənd edildikdə, Y17H ilə yoluxmuş heyvanlar burun titrələrini azaldıb və gecikdiriblər və hava-damcı yolu ilə ötürülə bilmirdilər, lakin aktivləşdirmə pH-ı 5,3 olan stabilləşdirilmiş HA variantının (H17H/R106K) seçilməsi havada ötürülməni təmin etmişdir [30] ]. A/İngiltərə/195/2009 (H1N1) fonunda hava ilə yayılan Y17H virusu aktivləşdirmə pH-ı 5,3 olan E31K tərəfindən istehsal edilənlərdən xeyli az lövhə əmələ gətirdi [40]. 2009-cu ildə təcrid olunmuş dövran edən pH1N1 viruslarının HA aktivasiya pH dəyərləri 5,5 [14,30,39] idi, 2010-2012-ci illərdə dövr edənlər isə HA aktivasiya pH-nı 5,2-5,4-ə salan bir və ya daha çox stabilləşdirici mutasiya əldə etmişdilər [30,35] 37]. Beləliklə, nisbətən qeyri-sabit HA zülalları olan mutant virusların bərələrdə və insanlarda fitnes baxımından mənfi cəhətləri olduğu göstərilmişdir.

In vivo fiber-optik pH sensoru əvvəllər itlərdə [46], siçanlarda [47], donuzlarda [48] və insanlarda [49,50] istifadə edilmişdir. Bu, pH1N1-ə yoluxmuş heyvanların tənəffüs yollarında hüceyrədənkənar pH-ı ölçmək üçün bizim məlumatımız olan ilk araşdırmadır. Bu tədqiqatlar infeksiyanın hüceyrədaxili pH-a təsirinin ex vivo tək hüceyrəli analizləri ilə tamamlandı. Ümumiyyətlə, hüceyrədənkənar və hüceyrədaxili pH arasında homeostatik tarazlıq qorunur, ola bilsin ki, fermentativ fəaliyyətlərdə və siqnal ötürülməsində dəyişiklikləri tənzimləyir [47]. Bu tədqiqatın nəticələri pH1N1 infeksiyasının bu balansı dəyişdirə biləcəyini göstərir.

Hüceyrə səthi virusla əlaqəli hüceyrələrin pH-ni ölçən əvvəlki bir araşdırma, həmçinin İAV infeksiyası zamanı hüceyrədənkənar pH-da dəyişikliklər və hüceyrədaxili pH-ın azaldığını göstərdi [51]. Bu halda, pH-da dəyişikliklər virusun daxil olması və qönçələnmə zamanı turşu endosomundan protonları təmizləyən M2 ion kanallarının protonasiyası ilə əlaqələndirilir, viral genomun sərbəst buraxılmasına imkan verən membran birləşməsini stimullaşdırır. M2 aktivasiyası daha sonra sitoplazmaya H + sərbəst buraxılmasına başlayır ki, bu da sitoplazmik pH-ın azalmasına səbəb olur [52-54]. Yüksək ATP istehlakı İAV replikasiyası və artan RNT sintezi ilə əlaqələndirilir [55,56]. Yüksək ATP qəbuluna cavab olaraq, yoluxmuş hüceyrələr oksidləşdirici metabolizm və qlikoliz yolu ilə ATP sintez edir [57]. Bunun ardınca piruvatın laktata geri çevrilə bilən çevrilməsi baş verir, nəticədə yoluxmuş hüceyrələrdə plazma membranı boyunca laktat və H+ qradiyenti arasında yüksək qarşılıqlı əlaqə yaranır [58,59]. Bu tapıntılarla razılaşaraq, həm WT, həm də Y17H İAV ilə yoluxmanın infeksiya zamanı hüceyrədənkənar və hüceyrədaxili pH-nı dəyişdiyini aşkar etdik. Dəyişmiş pH mexanizmi burada müəyyən edilmişdir, lakin hələ də həll edilməmişdir. Ola bilsin ki, sitoplazmada H+ istehsalı hüceyrə membranlarının yaxınlığında hüceyrədənkənar mühitin artmasına səbəb olur. Yüksək qlikoliz səviyyələri və viral replikasiya sahibi hüceyrələr üçün lazım olan artan ATP istehsalı da rol oynaya bilər. Digər tədqiqatlarda qlikolizin sitoplazmada daha çox metabolik turşu və H+ əmələ gətirdiyi göstərilmişdir [58,59].

Hüceyrədənkənar asidik pH və 2 və 5 DPI-də yüksək duzluluq tapmamız göstərir ki, İAV infeksiyası tənəffüs yollarının turşulaşmasına gətirib çıxarır ki, bu zaman yoluxmuş hüceyrələrdə ev sahibi ATPase [55] və ion səviyyələri dəyişilir [60,61]. Hüceyrədənkənar pH dəyişmələri hüceyrə membranının hər iki tərəfində ion və bufer mübadiləsi ilə əlaqələndirilir və hüceyrədaxili pH sitoplazmada uyğun gəlmir [62,63]. Hüceyrə membranının bir neçə ion kanalı (məsələn, Na+, Cl− və K+) su və ion köçürmələri vasitəsilə həcmlə tənzimlənən anion kimi fəaliyyət göstərərək hüceyrələri tənzimləyir [64]. H+ nasosu və plazma membranında Na+/H+ mübadiləsi hüceyrədaxili pH-ı idarə edir və tənzimləyir [65]. Müxtəlif hüceyrə tiplərində pH modifikasiyasına və membran keçirici zəif turşulara və əsaslara cavab olaraq artan kalsium konsentrasiyaları bildirilir [66,67]. Sitozolik qələviləşmə epiteliya mayesinin ifrazını modullaşdırır və daxili saxlama bölmələrindən kalsiumun mobilizasiyası ilə sitozolik kalsiumu nəzərəçarpacaq dərəcədə artırır [26,66].

İAV infeksiyası zamanı hüceyrədaxili pH-ın azalması ilə bağlı tapıntımız Sindbis virusu infeksiyası zamanı hüceyrədaxili pH-ın azaldığını göstərən tədqiqatlarla dəstəklənir [21]. Bu azalmış hüceyrədaxili pH plazma membranında müxtəlif nəqliyyat sistemlərini dəyişdirən vezikulyar stomatit virusu [68], poliovirus [69] və herpes simplex virusu [70] kimi bir sıra digər viruslarla litik infeksiyalardan sonra da baş verə bilər. Eynilə, bu tədqiqatda İAV infeksiyasından sonra hüceyrədaxili pH-ın azalması çox güman ki, İAV-ə giriş və qönçələnmə üçün lazım olan M2 ion kanalının protonasiyası ilə bağlıdır. Bundan əlavə, M2 trans-Golgi şəbəkəsinin lümenindəki pH ilə sitoplazmanın pH-nı balanslaşdırır və bununla da çıxış zamanı viral HA-da vaxtından əvvəl konformasiya dəyişikliklərini maneə törədir [71]. Bu, trans-Golgi şəbəkəsi daxilində pH-ı artıra və sitoplazmada pH-ı azalda bilər və hüceyrədaxili bölmədən H + ixracının artması ilə idarə oluna bilər [72].

Tənəffüs yollarında yerli anadangəlmə immun hüceyrələri İAV infeksiyalarına qarşı müdafiənin kritik birinci xəttidir. İnfeksiyaya yoluxmuş hüceyrələrin hüceyrədaxili və hüceyrədənkənar turşulu pH-ı çoxsaylı hüceyrə siqnal kaskadlarını (məsələn, antiviral istehsal, sitokinlərin sərbəst buraxılması və proqramlaşdırılmış hüceyrə ölümü) aktivləşdirməklə İAV infeksiyası zamanı yerli immun hüceyrələrin funksiyasına təsir göstərə bilər [73]. Hər iki qrupda hüceyrədaxili pH-ın 2 DPI-də artmasına dair tapıntımız yerli immun hüceyrələri (məsələn, neytrofillər, makrofaqlar, monositlər, DC-lər, təbii qatillər) cəlb edən yoluxmuş hüceyrələrin hava yolu epitelindən sitokin ifrazının stimullaşdırılmasının nəticəsi ola bilər. hüceyrələr və limfositlər) infeksiya yerinə. Bu hüceyrələr viral infeksiya ilə mübarizə aparmaq və tənəffüs yollarının epitelini qorumaq və adaptiv immun cavabını tetiklemek üçün aktivləşdirilir [74].İAV infeksiyasına qarşı diferensial host reaksiyaları infeksiyanı daha yaxşı tanıyan və aydınlaşdıran rezistent sahibləri, infeksiya ilə əlaqəli immunopatologiyanı və toxuma zədələnməsini minimuma endirən fitri müqavimətə malik tolerant hostlar və zəiflədilməmiş infeksiyası olan və ya immun reaksiyaların mənfi nəticələrinə qeyri-adekvat müqaviməti olan həssas hostlarla nəticələnir. infeksiya [75]. Bu cür təsirlər qismən Y17H və ya WT ilə yoluxmuş siçanlarda 7 və 10 DPI-da göstərilir. Bu vaxtlarda Y17H tərəfindən infeksiyaya qarşı fitri immun cavabların stimullaşdırılması, xüsusilə infeksiyanın erkən mərhələlərində virus replikasiyasına nəzarət etməyə kömək edə bilər, sonrakı CD4 və CD8 aktivasiyası isə virusun təmizlənməsini və bərpasını təşviq edir [76]. Y17H qrupunda DC-lərin və alveolyar makrofaqların aktivləşdirilməsi faqositləri, makrofaqları və təbii öldürücü hüceyrələri cəlb etməklə virusla yoluxmuş hüceyrələrin təmizlənməsində də mühüm rol oynaya bilər [77]. WT pH1N1 virusu anadangəlmə immun cavabların daha zəif induktorudur [78,79].

Sonda, tapıntılarımız siçanlarda pH1N1 infeksiyası zamanı hüceyrədənkənar və hüceyrədaxili pH-da dəyişiklikləri təsvir edir. İAV-lər HA zülallarının sabitliyinə görə turşu mühitlər tərəfindən inaktivasiyaya həssasdırlar. Siçanlarda İAV infeksiyası hüceyrədənkənar pH-nın 6.0-a yaxın HA aktivasiya pH dəyərləri ilə virionları təsirsiz hala gətirmək üçün kifayət qədər yüngül turşu səviyyəyə qədər azalmasına səbəb oldu. PH 5.5-də aktivləşdirilmiş HA zülalları olan viruslar tənəffüs yollarının yüngül turşulaşması ilə belə inaktivasiyanın qarşısını almaq üçün kifayət qədər sabit olacaq. İAV infeksiyasının tənəffüs yollarının pH-nı dəyişdirdiyi mexanizmləri və bu fenomenin İAV təkamülünə və növlərarası uyğunlaşmaya təsirini tam xarakterizə etmək üçün əlavə tədqiqatlara ehtiyac var.


İcazələr və Məhdudiyyətlər

CITES İxrac və İdxal İcazələri

Nəsli kəsilməkdə olan Vəhşi Fauna və Flora Növlərinin Beynəlxalq Ticarəti Haqqında Konvensiyada (CITES) siyahıya alınmış növlərdən əldə edilən hər hansı materialın ATCC tərəfindən beynəlxalq daşınması Birləşmiş Ştatlar Balıq və Vəhşi Təbiət Xidməti tərəfindən ATCC-yə etibarlı ixrac icazəsinin verilməsi ilə şərtlənir. ATCC bu ixrac icazəsini alır, bu ixrac icazəsi üçün heç bir tədbir görməyinizə ehtiyac yoxdur. Biz bu icazəni alana qədər bu maddəni göndərə bilmərik. İxrac icazəsi ixrac tələblərinə cavab vermək üçün daşımalara daxil ediləcək.

Sizdən ATCC tərəfindən alınmış ixrac icazəsinə əlavə olaraq idxal icazəsi almağınız tələb oluna bilər. Birincisi, milli CITES idarəetmə orqanı və ya CITES icazə sisteminin idarə edilməsinə cavabdeh olan orqanlar ilə maraqlandığınız elementin idxal icazəsi tələb edib-etmədiyini soruşun.


Əsas Xüsusiyyətlər

  • Stomatologiya elmlərində kök hüceyrə biologiyası və toxuma mühəndisliyi ilə bağlı bütün aspektləri diqqətlə əhatə edir: əsas elm, tədqiqat, klinik tətbiq və kommersiyalaşdırma
  • Kök hüceyrələr, biomateriallar və nanotexnologiyada ən son nailiyyətlərin təfərrüatları daxil olmaqla toxuma mühəndisliyi tədqiqatları sahələrində istifadə edilən yeni, müasir texnologiyaların, istehsal üsullarının ətraflı təsvirini təqdim edir.
  • Ağız və kraniofasiyal kök hüceyrələrə yönəlmiş təfərrüatlar və onların tibbdə potensial tədqiqat tətbiqi ilə kök hüceyrə biologiyasının təsviri daxildir.
  • Çap kitabı mövcuddur və ağ-qara, elektron kitab isə tam rənglidir

Giriş

Genişləndirici mikroskopiyada (ExM) konservləşdirilmiş bioloji nümunələr şişən hidrogelin içərisinə yerləşdirilir və fiziki olaraq izotrop şəkildə genişlənir, bu da adi diffraksiya ilə məhdud mikroskoplarda nanoölçülü ayırdetmə və aberasiyasız mikroskop təsvirinə imkan verən optik şəffaf nümunələrə gətirib çıxarır (Chen, Tillberg, & Boyden). , 2015). Bu yaxınlarda iki yeni ExM versiyası hazırlanmışdır, bunlar protein saxlama genişlənmə mikroskopiyası (proExM Tillberg et al., 2016) və genişlənmə flüoresansı adlanır. yerində hibridləşmə (ExFISH Chen et al., 2016), burada zülal (proExM) və RNT (ExFISH) molekulları kimyəvi olaraq hidrogelə bağlanır və genişləndikdən sonra yoxlanılır. Bu bölmə proExM və ExFISH nümunəsinin hazırlanması üçün ən ümumi ssenariləri, eləcə də nümunə ilə işləmə və təsvirin əldə edilməsi üçün ümumi təlimatları təsvir edir.

ProExM-də zülallar kovalent şəkildə zülallardakı ilkin amin qruplarına bağlanan kommersiyada mövcud olan kiçik molekul (Acryloyl-X SE və ya AcX üçün Tillberg et al., 2016) ilə hidrogel matrisinə lövbərlənir (Şəkil 1E, sol) və sonra polimerləşmə prosesi zamanı hidrogel polimerinə daxil edilir (həmçinin Şəkil 1A-dan 1C-ə qədər sxemləşdirilmiş hidrogelin gelləşməsi kimi tanınır). Proteinaz K (ProK) istifadə edərək fermentativ həzm və ya yuyucu vasitə ilə yüksək temperaturda emal, suda izotrop genişlənməyə imkan verən daxili nümunəni mexaniki olaraq pozur. AcX istifadə edərək yerli zülalları gelə lövbərləmək və genişlənmədən sonra flüoresan anticisimlər tətbiq etmək olar (genişlənmədən sonrakı boyanma, Şəkil 1C). Bu versiyada proteaz olmadan yüksək temperatur və yuyucu vasitə ilə mexaniki homogenləşdirmə metodundan istifadə edilir. Alternativ olaraq, flüoresan zülalları ifadə edən və/yaxud artıq flüoresan anticisimlərlə etiketlənmiş sabit nümunələrə AcX tətbiq oluna bilər, bunları birbaşa gelə daxil edir (əvvəlcədən genişlənmə boyanması, Şəkil 1A və ya genişlənmədən əvvəl flüoresan zülal ifadəsi, Şəkil 1B). Flüoresan zülallar və antikorlar proteolizə kifayət qədər davamlıdırlar ki, onlar ProK tətbiqindən böyük ölçüdə sağ qalırlar. 300 nm difraksiya ilə məhdud rezolyusiyaya malik linzadan istifadə etməklə, daxil edilmiş nümunələrin nəticədə ~4,5 × xətti genişlənməsi (~90 × həcmli genişlənmə) nümunənin ~300 nm/4,5-60-dan 70-nm-ə qədər effektiv həlli ilə təsvir edilməsinə imkan verir. .

ExFISH-də RNT-lər guaninə bağlanan (RNT və DNT-də, Şəkil 1E, sağda) LabelX adlandırdığımız (kommersiyada mövcud olan iki molekulun reaksiyası ilə asanlıqla sintez oluna bilən) kiçik molekulla hidrogel matrisinə kovalent şəkildə bağlanır. və həmçinin hidrogel polimerinə (Chen et al., 2016). ExFISH boru kəməri Şəkil 1D-də göstərilmişdir: nümunələr LabelX ilə müalicə olunur, şişən hidrojel polimeri əmələ gəlir, ProK tətbiq edilir və sonra nümunə fosfat tamponlu şoran məhlulu (PBS) ilə yuyulur. Daha sonra RNT-FISH zondları maraqlı RNT molekullarını etiketləmək üçün hibridləşdirmə tamponunda nümunəyə tətbiq edilir. Sonra nümunə genişləndirilir və az duzlu buferdə təsvir edilir. RNT-FISH zondlarının sabit bağlı qalmasına imkan verən bu sıfırdan fərqli duz konsentrasiyası ~3 × xətti genişlənmə (~27 × həcmli genişlənmə) və ya ~300 nm/ 300 nm difraksiya ilə məhdud olan lens üçün effektiv ayırdetmə ilə nəticələnir. 3 ~ 100 nm.

Bu bölmə aşağıdakı bölmələrə bölünür. Əsas Protokollar 1 və 2-də genişlənmədən əvvəl immunolənglənmiş (genişlənmədən əvvəl boyanma proExM) və ya genişlənmədən əvvəl ifadə olunan flüoresan zülallara malik hüceyrələr və bütöv toxumalar (<200 μm-dən əvvəlki genişlənmə qalınlığı) üçün proExM protokollarını təsvir edirik. Şəkil 1A,B. Bu iki əsas protokol müstəqil şəkildə yazılır ki, oxucular digərinə minimal istinadla hər ikisindən başlaya bilsinlər. Növbəti bölmə, Əsas Protokol 3, genişlənmədən əvvəl immunolənglənmiş və ya floresan zülalları olan qalın toxumaların və ya toxuma dilimlərinin (məsələn, 200-500 μm qalınlığında və ya potensial olaraq daha qalın) işlənməsinə kömək edən addımları təsvir edir (Şəkil 1-də göstərildiyi kimi). 1A, B). Dəstək Protokolu 1 genişlənmədən sonra immun boyama protokolunu təsvir edir (şəkil 1C-də göstərildiyi kimi genişlənmədən sonrakı proExM boyanması). Biz həmçinin Dəstək Protokolu 2-də proExM üçün anticisimlər və boyalar seçərkən əsas mülahizələri qısa şəkildə müzakirə edirik. Əsas Protokollar 4 və 5-də biz müvafiq olaraq kultivasiya edilmiş hüceyrələr və bütöv toxumalar üçün ExFISH metodologiyasını təsvir edirik. Son protokolda, Əsas Protokol 6-da biz ters çevrilmiş konfokal mikroskoplarda və Zeiss Z.1 işıq təbəqəsi mikroskopunda təsvir üçün genişləndirilmiş ExM nümunələrinin hazırlanması üçün müxtəlif montaj strategiyalarını təsvir edirik. Təsvirə dair bu bölmə burada təsvir edilən proExM və ExFISH protokollarının məhsulları da daxil olmaqla bütün ExM ilə işlənmiş nümunələrə aiddir.

Qeyd etmək faydalı ola bilər ki, proExM və ExFISH ilə nümunənin hazırlanması və təsviri yalnız adi biologiya laboratoriyasında və ya görüntüləmə müəssisəsində tapılan kimyəvi maddələr və mikroskoplar tələb edir, anker reagentləri və natrium akrilat istisna olmaqla, kommersiyada ucuz qiymətə satılır. Demək olar ki, bütün protokol addımları otaq temperaturunda nəm laboratoriya skamyasında həyata keçirilə bilər (protokolda başqa hal nəzərdə tutulmayıbsa). Tələb olunan əsas avadanlıqlara dəzgah üstü burulğan mikser, çalkalayıcı, 37°C inkubator (və mədəni hüceyrələrin ExFISH üçün 60°C inkubator), desikator, 4°C soyuducu və -20°C dondurucu daxildir. Bu bölmədə istifadə olunan bütün materiallar və ləvazimatlar ticarətdə mövcuddur. Başqa cür qeyd edilmədiyi halda, bu vahiddə “su” xüsusi olaraq “ikiqat distillə edilmiş su” deməkdir.

1: Mədəni Hüceyrələr üçün proExM

Materiallar

  • Suda 1 M kalium hidroksid (KOH).
  • Suda 30% (h/v) etanol
  • Fosfat tamponlu şoran məhlulunda 10 mq/ml steril fibronektin (PBS Current Protocols, 2001)
  • Maraqlanan hüceyrələr, məsələn, insan embrion böyrəyi (HEK) hüceyrələri
  • Seçilmiş hüceyrə növü üçün uyğun hüceyrə mədəniyyəti mühiti (məsələn, insan embrion böyrəyi (HEK) hüceyrələri üçün Dulbecco-nun Modified Eagle Medium (DMEM))
  • PBS-də 4% (ağırlıq/həc) paraformaldehid (PFA) və ya daha güclü fiksasiya üçün PBS-də 4% (ağırlıq/həc) PFA və 0,1% (ağırlıq/həc) qlutaraldehid qarışığı
  • PBS-də 100 mM qlisin
  • PBS-də 0,1% (w/v) Triton X-100
  • Bloklama buferi: 5% (h/v) normal eşşək zərdabında 0,1% (ağırlıq/həc) Triton X-100 PBS-də (4°C temperaturda 1 aya qədər və ya daha uzun müddət saxlanılır) zərdab heyvan sahibindən olmalıdır. ikincili anticisimlər, ona görə də ikincili antikorlar başqa heyvanlardan olarsa, normal eşşək zərdabının əvəzinə başqa növ seralardan istifadə edilməlidir.
  • İmmun boyama üçün ilkin və ikincili antikorlar
  • AcX/DMSO ehtiyat həlli (reseptə baxın)
  • Mədəni hüceyrələrin proExM üçün jelləşdirmə məhlulu (reseptə baxın)
  • Həzm tamponu (reseptə baxın)
  • Hüceyrə mədəniyyəti substratları (məsələn, seçilmiş mədəniyyət protokoluna uyğun ölçülər, formalar və səth dəyişiklikləri), məsələn, 12 mm-lik yuvarlaq örtüklər və ya çıxarıla bilən kamera örtüyü şüşəsi, məsələn, Sigma, cat. yox. GBL 112358
  • Kameranın qapağını şüşə çıxaran alət (Sigma, kataloq № GBL 103259)
  • 35 mm-lik petri qabları
  • Mikrosentrifuqa boruları
  • Şaker
  • 22 × 22 mm № 1,5 örtüklər (0,15 - 0,19 mm qalınlıq)
  • 22 × 22 mm № 2 örtüklər (0,19 - 0,23 mm qalınlıq)
  • Mikroskop slaydları
  • Buz banyosu və ya soyuq blok 4 ° C-yə qədər soyudulur
  • Parafilm
  • Ülgüc bıçağı
  • Forseps
  • Nunc 4 quyulu düzbucaqlı boşqab (Thermo Fisher, cat. no. 267061)
  • Boya fırçası
  • İncə şüşəni kəsmək (yazmaq) üçün almaz qələm
  • Diseksiyon mikroskopu

Hüceyrə mədəniyyəti

Hüceyrələr seçdiyiniz protokollara uyğun olaraq becərilə bilər. Bununla belə, güclü üstünlük yoxdursa, asan gelləşmə üçün kultura quyusundan ayrıla bilən substratda (məsələn, örtüklərdə) və ya çıxarıla bilən kamera qapaq şüşəsində (məsələn, Sigma, cat. No. GBL 112358) kultivasiya etməyi tövsiyə edirik. və sonrakı addımlarda nümunə ilə işləmə.

Aşağıda təsvir edilən hüceyrə mədəniyyəti protokolu birləşən hüceyrə xətlərindən (məsələn, HEK və ya COS7) istifadə edir və ardıcıl nəticələr nümayiş etdirir. Hüceyrə mədəniyyəti üçün çıxarıla bilən kameralı qapaq şüşələri istifadə edilərsə, 2-ci addımda fibronektin şüşə səthinin modifikasiyası ilə başlayın.

1. 12 mm-lik yuvarlaq örtükləri suda 1 M KOH ilə 30 dəqiqə müalicə edin, üç dəfə su ilə yuyun və suda 30% (v/v) etanolda saxlayın.

2. Təmizlənmiş 12 mm-lik yuvarlaq örtükləri steril mühitdə (yəni, biotəhlükəsizlik şkafında) hava ilə qurutun, 35 mm-lik petri qabına qoyun və sonra 37°-də 30 dəqiqə ərzində PBS-də 10 mq/ml steril fibronektin ilə müalicə edin. C. Hüceyrə örtüyündən dərhal əvvəl fibronektin məhlulunu çıxarın.

3. Hüceyrələr ya 12 mm-lik örtüklərin, ya da çıxarıla bilən kameranın qapaq şüşəsinin səthində 5% CO-də nəmləndirilmiş inkubatorda 50%-80% birləşməsinə qədər örtülür və kulturlanır.2 və 37°C.

Hüceyrə fiksasiyası

Hüceyrələr seçdiyiniz protokollardan istifadə edərək düzəldilə bilər. Məsələn, PBS-də 4% (w/v) paraformaldehid (PFA) istifadə edilə bilər. Daha çox ultrastrukturu qoruyan daha güclü fiksasiya üçün, tərkibində qlutaraldehid olmasına baxmayaraq, siz PFA qarışığından və az miqdarda qlutaraldehiddən (məsələn, 4% (ağırlıqda) PFA və PBS-də 0,1% (ağırlıqda) qlutaraldehid) istifadə etməyə cəhd edə bilərsiniz. fiksatorlar bu günə qədər genişlənmə mikroskopiyası tədqiqatlarında nadir hallarda istifadə edilmişdir. PBS-də 4% (ağırlıq/həc) PFA adətən fiksasiyadan əvvəl təzə hazırlanır.

Aşağıda təsvir edilən fiksasiya protokolu ardıcıl nəticələr nümayiş etdirdi. Nəzərə alın ki, nümunənin susuzlaşmasının qarşısını almaq üçün bütün yuma addımları tez yerinə yetirilməlidir.

4. PBS-də 4% (ağırlıq/həc) PFA ilə hüceyrə mədəniyyət mühitini dəyişdirin və otaq temperaturunda 10 dəqiqə inkubasiya edin.

DİQQƏT: Bu kimyəvi başlıqda edilməlidir, çünki PFA potensial kanserogen hesab olunur.

5. PFA həllini çıxarın və fiksasiyanı söndürmək üçün PBS-də 100 mM qlisin ilə 5 dəqiqə hüceyrələri yuyun.

6. Glycine məhlulunu çıxarın və hüceyrələri iki dəfə hər biri 5 dəqiqə PBS ilə yuyun.

7. Biz dərhal protokolun növbəti addımlarına keçməyi tövsiyə edirik.

Lazım gələrsə, sabit hüceyrələr protokolun növbəti addımlarına qədər bir neçə həftəyə qədər PBS-də 4°C-də qaranlıqda saxlanıla bilər.

İmmun boyama/immunohistokimya (isteğe bağlı)

Fiksasiyadan sonra immuno-boyanma üçün seçdiyiniz protokollara əməl edin, siz mahiyyətcə şərti histologiyanı həyata keçirə bilərsiniz. Aşağıda təsvir edilən protokol əvvəllər təsvir edilmiş protokollar tərəfindən hazırlanmış sabit hüceyrələrlə ardıcıl nəticələr nümayiş etdirdi.

8. 15 dəqiqə otaq temperaturunda PBS-də 0,1% (w/v) Triton X-100 tətbiq edərək sabit hüceyrələri keçirin. Qeyri-spesifik antikor bağlanmasını azaltmaq üçün bloklama tamponunu otaq temperaturunda 15 dəqiqə tətbiq edin.

9. Müvafiq konsentrasiyada bloklama buferində əsas antikorları olan hüceyrələri inkubasiya edin. İnkubasiya antikor spesifikasiyalarından asılı olaraq 1 saatdan gecəyə qədər, otaq temperaturunda və ya 4°C-də aşağı sürətlə çalkalayıcıda aparıla bilər.

10. Antikor məhlulunu çıxarın və bloklama tamponu ilə hər dəfə 5 dəqiqə olmaqla dörd dəfə yuyun.

11. Otaq temperaturunda 2-4 saat və ya gecə 4°C temperaturda aşağı sürətlə çalkalayıcıda bloklama buferində ikincil antikorları olan hüceyrələri inkubasiya edin. Əgər boyalarla konyuqasiya edilmiş antikorlardan istifadə edilərsə, proExM-in genişlənmədən əvvəl boyanma ilə boya uyğunluğu müzakirəsi üçün Dəstək Protokolu 2-ə baxın.

12. Antikor məhlulunu çıxarın və bloklama tamponu ilə hər dəfə 5 dəqiqə olmaqla dörd dəfə yuyun.

13. Biz dərhal protokolun növbəti addımlarına keçməyi tövsiyə edirik.

Lazım gələrsə, nümunələr protokolun növbəti addımlarına qədər bir neçə həftəyə qədər PBS-də 4°C-də qaranlıqda saxlanıla bilər.

Gelləşmə

14. Acryloyl-X SE (AcX)/DMSO ehtiyat məhlulunu, monomer məhlulunu (Stock X) TEMED ehtiyat məhlulunu və ammonium persulfat (APS) ehtiyat məhlulunu Reagentlər və Məhlullarda göstərildiyi kimi hazırlayın.

15. Nümunə tamponunu (məsələn, yuxarıdakı protokollara uyğun olaraq immunolənglənmişsə bloklama buferi) PBS-də 0,1 mq/ml Acryloyl-X SE (AcX) ilə əvəz edin.

Bu AcX məhlulu 10 mq/ml AcX/DMSO ehtiyat məhlulunu PBS-də 1:100 nisbətində seyreltməklə hazırlanır.

16. Hüceyrələri otaq temperaturunda 0,1 mq/ml AcX məhlulunda 2-3 saat buraxın.

Əvvəlki protokollar >6 saat və ya gecəni təklif edirdi, lakin biz müntəzəm olaraq 2-3 saatın sarsıntı olmadan kifayət qədər vaxt olduğunu görürük.

17. Hüceyrələr petri qabında becərildikdə, bu arada, bir slaydda iki aralayıcı yerləşdirməklə, bir-birindən kifayət qədər böyük məsafədə, nümunə örtüyü şüşəsinin arasına sığması üçün gelasiya kamerası tikilə bilər (Şəkil 2). 2A). İncə və yastı obyektlər, məsələn, örtük yığınları aralayıcılar kimi xidmət edə bilər. Məsələn, iki №1,5 örtükdən ibarət bir yığın örtüklərin sayını və ya növlərini dəyişdirməklə təxminən 0,30 ilə 0,38 mm hündürlüyə malikdir, boşluqların hündürlüyü hüceyrə mədəniyyəti substratına (yəni, nümunəyə) uyğun olaraq tənzimlənə bilər. qapaq şüşəsi) hündürlüyü. Nümunənin üstündə həddindən artıq gel qalmaması üçün boşluq hündürlüyü hüceyrə kulturası substratının hündürlüyünə yaxın saxlanılmalıdır, lakin gelin ümumi qalınlığı [yəni, (araçının hündürlüyü) – (hüceyrə kulturası substratının hündürlüyü)] ən azı olmalıdır. Sonrakı addımlarda daha asan gel ilə işləmək üçün 0,15 mm. Aralayıcılara bir damcı su (məsələn, bir neçə µl) tətbiq oluna bilər ki, onları slaydın üzərinə yapışdırın (və əgər bir neçə boşluq varsa, bir-birinə). 2-3 addımlar zamanı hüceyrə kulturası üçün çıxarıla bilən kameralı qapaq şüşəsi istifadə edilərsə, qapaq şüşəsinin özü və conta müvafiq olaraq gelləşmə kamerası və boşluq kimi xidmət edə bilər. Bu halda, çıxarıla bilən kameralı qapaq şüşəsinin yuxarı strukturu sökücü alət vasitəsilə çıxarıla bilər (Sigma, cat. No. GBL 103259). Gelləşdirmə kamerasının qapağı üçün Parafilm ilə bükülmüş qalın və möhkəm örtükdən (məsələn, №2 örtük) istifadə oluna bilər, Parafilm sonrakı addımlarda qapağı çıxararkən gelin örtüklə yapışmasının qarşısını alır. Parafilm səthinin düz, təmiz və qıvrımsız olduğundan əmin olun. Növbəti mərhələyə keçməzdən əvvəl gelləşdirmə kamerasının və qapağın hazırlanmasını bitirməyi məsləhət görürük.

18. Hüceyrələri AcX məhlulunda inkubasiya etdikdən sonra hüceyrələri PBS ilə hər dəfə 15 dəqiqə olmaqla iki dəfə yuyun. proExM üçün jelləşdirmə məhlulu üçün komponentləri əritməyə başlayın - Stock X, APS və TEMED ehtiyat həlləri. Soyudulmuş məhlulları buz banyosunda və ya soyuq blokda (4°C-yə qədər soyudulmuş) saxlayın.

19. Hazır X, suyu, TEMED məhlulunu və APS ehtiyat məhlulunu 47:1:1:1 nisbətində qarışdırmaqla proExM üçün jelləşdirmə məhlulunu yaradın (jelləşdirmə məhlulu həmçinin Reagentlər və Məhlullar bölməsində reseptlərə baxın), bu ardıcıllıqla ( yəni, APS son) mikrosentrifuqa borusunda və bir neçə saniyə burulğanda.

Jelləşdirmə məhlulunun miqdarı jelləşdirmə kamerasının ölçüsünə uyğun olaraq artır və ya azaldılmalıdır. Məsələn, jelləşdirmə kamerasını 22 × 22 × 0,38 mm boşluqla doldurmaq üçün 200 µl jelləşdirmə məhlulu kifayətdir. Qarışıq jelləşdirmə məhlulu buz banyosunda və ya soyuq blokda (4°C-ə qədər soyudulmuş) saxlanmalıdır. Məsələn, borunun gövdəsini deyil, mikrosentrifuqa borusunun qapağını tutaraq, jelləşdirmə məhlulunun həddindən artıq istiləşməsinin qarşısını alın. Jelləşdirmə məhlulu hazırlandıqdan sonra, vaxtından əvvəl gelləşmənin qarşısını almaq üçün növbəti bir neçə addımı (24-cü addımda jelləşdirmə kamerasını 37°C inkubatora yerləşdirənə qədər) 5 dəqiqə ərzində tamamlamağı tövsiyə edirik.

20. Əvvəlki addımdan dərhal sonra bir pipetdən istifadə edərək hüceyrələrdən PBS-ni çıxarın və hüceyrə mədəniyyəti substratında olan hüceyrələrə az miqdarda qarışıq jelləşdirmə məhlulu əlavə edin. Çıxarılan kameralı qapaq şüşəsi istifadə edilərsə, PBS-ni çıxarın və kameranı doldurmaq üçün jelləşdirmə məhlulu əlavə edin, sonra 22-ci addıma davam edin.

21. Hüceyrə mədəniyyəti substratını (yəni, hüceyrələrin yetişdirildiyi örtük) götürüb yerləşdirmək üçün bir cüt maşadan istifadə edin və gelasiya kamerasındakı boşluqlar arasında mədəni hüceyrələrlə birlikdə. Hüceyrələrin yuxarıya baxdığından əmin olun. Yerində saxlamaq üçün hüceyrə mədəniyyətinin substratını bir az aşağı basın. Jelləşdirici məhlul axırsa, hüceyrələrə az miqdarda jelləşdirmə məhlulu yenidən tətbiq edin.

22. Parafilmlə örtülmüş qapağın bir tərəfinə bir damcı (~20 µl) jelləşdirmə məhlulu əlavə edin və onu çevirin ki, damcı səth gərginliyinə görə səthdən asılsın (Şəkil 2A).Qapağı yavaş-yavaş aşağı salın ki, damlacıq nümunə örtüyü üzərindəki gelləşmə məhlulu ilə birləşsin (Şəkil 2B). Birləşdikdən sonra qapağı endirməyə davam edin ki, o, boşluqlara söykənsin. Bu proses zamanı məhlulun içərisinə heç bir hava cibinin daxil olmadığından əmin olun.

23. İncə ucu olan pipetdən istifadə edərək qapaq, aralayıcılar və slayd arasındakı boşluq jelləşdirmə məhlulu ilə doldurulana qədər kameranın hər iki açıq tərəfinə əlavə jelləşdirmə məhlulu əlavə etməyə davam edin (şək. 2C).

Kapilyar qüvvələr jelləşdirmə məhlulunun boşluğu bərabər şəkildə doldurmasına səbəb olmalıdır.

24. Gelləşdirmə kamerasını polimerləşmə üçün 1 saat ərzində 37°C-də inkubatora qoyun. Köçürmə və jelləşdirmə zamanı kameranı əyməmək və ya silkələməmək üçün diqqətli olun.

Həzm

25. Gelləşmə kamerasını inkubatordan çıxarın.

26. Yavaş-yavaş ülgüc bıçağını yan tərəfdən qapaq və boşluqlar arasına daxil edin və qapağı çıxarın. Qapaq geldən ayrıldıqdan sonra aralayıcıları çıxarmaq üçün ülgücdən istifadə edin (şək. 2D). Çıxarıla bilən kameralı qapaq şüşəsi istifadə olunursa, qapağı çıxarın, sonra qapaq şüşəsindən geli çıxarmadan qara contanı soymaq üçün maşadan istifadə edin.

27. Ülgücdən istifadə edərək, geli nümunənin ətrafında kiçik həcmdə kəsin. Bu, geli yığcam saxlayacaq və sonrakı addımlarda hüceyrələri tapmağa kömək edəcəkdir. Hüceyrə mədəniyyəti substratını və geli birlikdə şüşə slayddan çıxarmaq üçün ülgüc bıçağından istifadə edin. Çıxarılan kameralı qapaq şüşəsi istifadə olunursa, geli kəsin, lakin geli qapaq şüşəsindən çıxarmayın.

Siz geli asimmetrik formada kəsmək istəyə bilərsiniz ki, onun oriyentasiyası sonrakı addımlarda sadəcə formanı yoxlayaraq asanlıqla ölçülə bilsin [https://www.youtube.com/watch?v=OksNCAJwxVI (videomuza baxın) toxumalar üçün proExM: gelasiya nümayişi)].

28. Reagentlər və Məhlullarda təsvir olunduğu kimi həzm tamponunu hazırlayın (ProK-nun son konsentrasiyası: 8 U/ml).

29. Həzm zamanı gel təxminən 1,5 × genişlənəcəyi üçün həzm üçün uyğun böyük bir qab (məsələn, petri qabı) seçin. Həmçinin, nümunənin qarışdırılmaması üçün hər bir nümunə üçün ayrıca konteyner istifadə edin. Hüceyrə mədəniyyətinin substratını gel ilə konteynerə qoyun və onu geldən ən azı 10 dəfə artıq həcmdə həzm tamponu ilə doldurun (Şəkil 2E). Nümunə örtüyündən təbii şəkildə soyulana qədər geli ən azı 2-3 saat həzm tamponuna batırın (Şəkil 2F). Çıxarıla bilən kameralı qapaq şüşəsi istifadə olunursa, hər bir nümunəni və qapaq şüşəsinin müvafiq parçasını ayırmaq üçün almaz çubuqdan istifadə edin. Qapaq şüşəsinin hər bir hissəsini gel ilə birlikdə bir konteynerə qoyun və yuxarıda göstərildiyi kimi həzm tamponuna batırın. Nunc 4 quyulu düzbucaqlı boşqab, məsələn, həzm üçün bir neçə örtük şüşəsini ehtiva etmək üçün əlverişlidir. Ayrılmış hüceyrə substratı həzm tamponunda yalnız hüceyrə tərkibli geli tərk etmək üçün forseps istifadə edərək çıxarıla bilər.

30. Həzm tamponuna batırılmış geli qaranlıqda otaq temperaturunda bir gecədə buraxın.

Saxlama və genişləndirmə

31. Əgər əvvəllər edilməmişdirsə, indi ayrılmış hüceyrə substratını (məsələn, örtük) nümunə geli narahat etmədən forsepsdən istifadə edərək diqqətlə həzm konteynerindən çıxarın. Həzm tamponunu çıxarın və PBS əlavə edin və sonradan görüntüləmək üçün saxlama istənirsə, geli qaranlıqda 4°C-də saxlayın.

Pipetləmə zamanı geli udmamaq üçün diqqətli olun. Gel bu mərhələdə işığı bir qədər səpələyir, ona görə də gələn işığın bucağının dəyişdirilməsi onu məhlulun içərisində yerləşdirməyə kömək edə bilər.

32. Əgər gelin başqa konteynerə köçürülməsi lazımdırsa (məsələn, kəsmə üçün daha böyük konteyner və ya təsvir üçün nümunə tutucu), geli götürmək və daşımaq üçün uyğun ölçülü boya fırçasından istifadə edə bilərsiniz. Gel susuzlaşdırmasının qarşısını almaq üçün konteynerə bir az PBS əlavə edin.

33. Nümunəni genişləndirməzdən əvvəl geli lazımi minimum ölçüyə qədər kəsməyi məsləhət görürük. Maraqlanan bölgəni tapmaq üçün diseksiyon mikroskopundan və ya aşağı böyüdücü geniş sahəli mikroskopdan istifadə edə bilərsiniz. Nümunə hərəkətini minimuma endirmək üçün kəsmə zamanı ətrafdakı mayenin çoxu müvəqqəti olaraq çıxarıla bilər. Mikroskop altında, maraq bölgəsindən kənarda geli kəsmək və çıxarmaq üçün ülgücdən istifadə edin. Oriyentasiyanı asanlıqla çıxarmaq üçün geli asimmetrik formada kəsməyi məsləhət görürük. Jeli idarə etmək və təsvir etmək üçün ağlabatan ölçüyə qədər kəsdiyinizə əmin olun, çünki genişləndirmə əlavə olaraq 2 ilə 2,5× (ümumilikdə təxminən 4,5×) xətti artım gətirəcək. Maraq bölgələri ilə geli genişləndirilmiş geli ehtiva edəcək qədər böyük bir konteynerə köçürün (məsələn, genişləndirmək üçün uyğun ölçülü bir petri qabı və ya görüntüləmə üçün nümunə sahibi).

34. Konteyneri doldurun və geli suya batırın və 20 dəqiqə gözləyin. Suyu dəyişdirin və başqa 20 dəqiqə gözləyin. Mübadiləni bir dəfə daha təkrarlayın (təzə suda 20 dəqiqə, cəmi üç dəfə).

Nümunə Şəkil 3-də olduğu kimi tam genişləndirilməli və optik cəhətdən təmizlənməlidir və təsvir üçün hazır olmalıdır (bu vaxtlar əvvəlki nəşrlərdən daha qısadır, lakin laboratoriyamızda müntəzəm istifadə üçün işləyən rəqəmləri əks etdirir). Uzunmüddətli görüntüləmə üçün, məsələn, böyük həcmli nümunənin təsviri zamanı nümunənin quraşdırılması genişləndirmədən sonra və təsvirdən əvvəl lazımdır (bax. Əsas Protokol 6). Nümunə montajı nümunəni nümunə tutucuya bağlayır və beləliklə, onun sürüşməsinin qarşısını alır, həmçinin nümunəni obyektiv linzanın iş məsafəsində saxlamağa kömək edə bilər. Genişləndirilmiş nümunəni mikroskop altında tez yoxlamaq üçün (<5 dəq) adətən nümunənin quraşdırılmasına ehtiyac yoxdur. Məsələn, ters çevrilmiş mikroskopda, sürüşməsinin qarşısını almaq üçün jelin ətrafındakı suyu müvəqqəti olaraq (<5 dəq) çıxarmaq üçün pipetdən istifadə edə bilərsiniz.

35. Genişləndirilmiş geli yeni konteynerə köçürmək lazımdırsa, genişlənmiş vəziyyətdə bir qədər zərif olduğundan ehtiyatla işlənməlidir. Əvvəlcə ətrafdakı suyun çox hissəsini çıxarın və sonra jeli eyni konteynerə yerləşdirilmiş təmiz şüşə örtüyə daşımaq üçün bir fırça istifadə edin. Bundan sonra, örtüyü (üstdə gel ilə) maşa ilə qabdan yumşaq bir şəkildə qaldırın. Gel yavaş-yavaş örtüyü silməklə yeni konteynerə köçürülə bilər. Bu üsul, gelin yanlış istiqamətə baxması halında, jeli daşıyan örtüyü tərsinə çevirərək jeli çevirmək üçün də istifadə edilə bilər.

2: bütöv toxumalar üçün proExM

Zərərsiz toxumalar üçün əsas protokol mədəni hüceyrələrdən bir qədər fərqlənir. Nümunələrin qalınlığına görə bütöv toxumalar AcX diffuziyası üçün daha uzun vaxt tələb edir. Bundan əlavə, polimerləşmə başlamazdan əvvəl gelləşmə məhlulunun nümunələr vasitəsilə daha uzun diffuziyasına imkan vermək üçün jelləşmə məhlulu polimerləşmə inhibitoru ilə əlavə olunur.

Materiallar

  • Fosfat tamponlu salin (PBS Current Protocols, 2001)
  • PBS-də 4% (ağırlıq/həc) paraformaldehid (PFA) və ya daha güclü fiksasiya üçün PBS-də 4% (ağırlıq/həc) PFA və 0,1% (ağırlıq/həc) qlutaraldehid qarışığı
  • Batma həlli (reseptə baxın)
  • Quru buz
  • 2-metilbutan
  • Optimal kəsmə temperaturu qarışığı (OCT), M-1 və ya başqa bir yerləşdirmə matrisi
  • PBS-də 0,1% (w/v) Triton X-100
  • Bloklama buferi: 5% (v/v) normal eşşək zərdabında 0,1% (ağırlıq/həc) Triton X-100 PBS-də (4°C temperaturda 1 aya qədər və ya daha uzun müddət saxlanılır): zərdab heyvan sahibliyindən olmalıdır. ikincili anticisimlər, ona görə də ikincili antikorlar başqa heyvanlardandırsa, normal eşşək zərdabının əvəzinə digər növ seralardan istifadə edilməlidir.
  • İmmun boyama üçün ilkin və ikincili antikorlar
  • AcX/DMSO ehtiyat həlli (reseptə baxın)
  • Qüsursuz toxumaların genişlənməsi üçün jelləşdirmə məhlulu (reseptə baxın)
  • Həzm tamponu (reseptə baxın)
  • Vibratom və ya kriostat mikrotomu
  • 22 × 22 mm № 1,5 örtüklər (0,15 - 0,19 mm qalınlıq)
  • 22 × 22 mm № 2 örtüklər (0,19 - 0,23 mm qalınlıq)
  • Mikroskop slaydları
  • Parafilm
  • Mikrosentrifuqa boruları
  • Boya fırçası
  • Buz banyosu və ya soyuq blok 4 ° C-yə qədər soyudulur
  • Ülgüc bıçağı
  • Forseps
  • Petri qabları
  • Diseksiyon mikroskopu

Toxumanın hazırlanması

Bu əsas proExM toxuma protokolunda toxumanın və ya toxuma diliminin qalınlığının ən incə ölçüsündə <200 µm olduğu qəbul edilir. Qalınlığı 200 μm-dən yuxarı olan toxuma nümunələri üçün Əsas Protokol 3-ə baxın.

Dokular seçdiyiniz protokollardan istifadə edərək düzəldilə bilər. Məsələn, PBS-də 4% (ağırlıq/həc) paraformaldehid (PFA) ilə immersion və ya perfuziya fiksasiyası istifadə edilə bilər. Daha çox ultrastrukturu qoruyan daha güclü fiksasiya üçün, tərkibində qlutaraldehid olan fiksasiya vasitələrinə baxmayaraq, siz PFA və kiçik bir faiz qlutaraldehid qarışığını (məsələn, 4% (ağırlıq/həc) PFA və PBS-də 0,1% (ağırlıq/həc) qlutaraldehid) sınaya bilərsiniz. bu günə qədər genişləndirici mikroskopiya protokollarında daha az istifadə edilmişdir. PBS məhlulunda 4% (ağırlıq/həc) PFA adətən fiksasiyadan əvvəl təzə hazırlanır.

1. Fiksasiyadan sonra toxumalar 200 µm-dən qalındırsa, onları vibratomdan istifadə edərək <200 µm-lik dilimlərə kəsin. Alternativ olaraq, bir kriostatda dilimləmək üçün toxuma dibinə batana qədər əvvəlcə onu batma məhluluna batıraraq kriomühafizə edilməlidir. Sonra toxuma çıxarılır və quru buz və 2-metilbutan istifadə edilərək dondurulur. OCT, M-1 və ya başqa bir yerləşdirmə matrisinə daxil edildikdən sonra nümunə kriotomdan istifadə edərək dilimlənməyə hazırdır.

İstənilən dilimləmə metodundan sonra dərhal protokolun növbəti addımlarına keçməyi tövsiyə edirik.

Lazım gələrsə, sabit toxumalar və ya toxuma dilimləri protokolun növbəti addımlarına qədər bir neçə həftəyə qədər PBS-də 4°C-də qaranlıqda saxlanıla bilər.

İmmun boyama/immunohistokimya (isteğe bağlı)

Fiksasiyadan sonra immun boyama üçün seçdiyiniz protokollara əməl edin. Aşağıda təsvir edilən protokol daha əvvəl təsvir edilən protokollarla hazırlanmış sabit beyin toxumaları ilə ardıcıl nəticələr nümayiş etdirdi.

2. 0,1% (w/v) Triton X-100-ni PBS-də 15 dəqiqə otaq temperaturunda, sonra 6 saat ərzində otaq temperaturunda bloklama buferində tətbiq etməklə sabit toxumanı keçirin.

3. Bloklama buferində ilkin antikorlarla toxumaları inkubasiya edin. İnkubasiya otaq temperaturunda və ya 4°C-də gecə ərzində aşağı sürətlə çalkalayıcıda aparıla bilər.

4. Antikor məhlulunu çıxarın və bağlanmamış əsas antikorları çıxarmaq üçün dörd dəfə hər dəfə 30 dəqiqə bloklama tamponu ilə yuyun.

5. Otaq temperaturunda və ya 4°C-də gecə ərzində aşağı sürətlə çalkalayıcıda bloklama buferində ikincili antikorlarla toxumaları inkubasiya edin. Əgər boyalarla konyuqasiya edilmiş antikorlardan istifadə edilərsə, boyanın performansının təsviri və genişlənmədən əvvəl boyanma proExM ilə uyğunluq üçün Dəstək Protokolu 2-ə baxın.

6. Antikor məhlulunu çıxarın və bağlanmamış ikincili antikorları çıxarmaq üçün hər dəfə 30 dəqiqə ərzində bloklama tamponu ilə dörd dəfə yuyun.

7. Dərhal jelləşmə mərhələlərinə keçməyi tövsiyə edirik.

Lazım gələrsə, nümunələr jelləşmədən bir neçə həftə əvvəl PBS-də 4°C-də qaranlıqda saxlanıla bilər.

Gelləşmə

8. Acryloyl-X SE (AcX)/DMSO ehtiyat məhlulu, monomer məhlulu (Stock X), TEMED ehtiyat məhlulu, ammonium persulfat (APS) ehtiyatı və 4-hidroksi-TEMPO (4HT) məhlulunu Reagentlər və Məhlullarda göstərildiyi kimi hazırlayın.

9. Nümunə tamponunu (məsələn, yuxarıdakı protokollara uyğun olaraq immunolənglənmişsə bloklama buferi) PBS-də 0,1 mq/ml Acryloyl-X SE (AcX) ilə əvəz edin.

AcX məhlulu 10 mq/ml AcX/DMSO ehtiyat məhlulunu PBS-də 1:100 nisbətində seyreltməklə hazırlanır.

10. Toxumaları AcX məhlulunda silkələmədən otaq temperaturunda >6 saat (gecə yaxşı olar) buraxın.

11. Bu vaxt, gelasiya kamerasını qurmaq üçün bir-birindən ayrılmış slaydda iki boşluq qoyun (şəkil 4A). İncə və yastı obyektlər, məsələn, örtük yığınları aralayıcılar kimi xidmət edə bilər. Məsələn, 1,5 nömrəli iki örtükdən ibarət yığının hündürlüyü 0,30-dan 0,38 mm-ə qədərdir və örtüklərin sayını və ya növlərini dəyişdirməklə, aralayıcıların hündürlüyü toxuma qalınlığına uyğunlaşdırıla bilər. Nümunənin üstündə həddindən artıq gel qalmaması üçün boşluq hündürlüyü toxuma qalınlığına yaxın saxlanılmalıdır, lakin sonrakı addımlarda gellə daha asan işləmək üçün gelin ümumi qalınlığı (yəni, boşluq hündürlüyü) ən azı 0,15 mm olmalıdır. Bir damcı su (məsələn, bir neçə µl) aralayıcılara tətbiq oluna bilər ki, onları slaydın üzərinə yapışdırsın (və əgər bir neçə aralayıcı varsa, bir-birinə). Gelləşdirmə kamerasının qapağı üçün Parafilm ilə bükülmüş qalın və möhkəm örtükdən (məsələn, №2 örtük) istifadə oluna bilər, Parafilm sonrakı addımlarda qapağı çıxararkən gelin örtüklə yapışmasının qarşısını alır. Parafilm səthinin düz, təmiz və qıvrımsız olduğundan əmin olun. Növbəti mərhələyə keçməzdən əvvəl jelləşdirmə kamerasını və qapağı hazırlamağı bitirməyi məsləhət görürük.

12. AcX məhlulunda toxumaları inkubasiya etdikdən sonra toxumaları hər dəfə 15 dəqiqə olmaqla iki dəfə PBS ilə yuyun. proExM üçün jelləşdirmə məhlulu üçün komponentləri əritməyə başlayın: Stock X, 4HT, APS və TEMED ehtiyat məhlulları. Soyudulmuş məhlulları buz banyosunda və ya soyuq blokda (4°C-yə qədər soyudulmuş) saxlayın.

13. X, 4HT, TEMED və APS-ni bu ardıcıllıqla 47:1:1:1 nisbətində (yəni, sonuncu APS) mikrosentrifuqa borusuna əlavə edin (jelləşdirmə məhlulu, həmçinin Reagentlər və Məhlullar bölməsindəki reseptə baxın) və bir neçə saniyə. Jelləşdirici məhlulun miqdarı jelləşmə kamerasının ölçüsünə və toxuma və ya toxuma diliminin ölçüsünə uyğun olaraq artırılmalı və ya azaldılmalı və həcmdə ən azı 100 dəfə artıq olmalıdır. Məsələn, siçan beyninin 100 μm-lik tək tac dilimini inkubasiya etmək üçün ən azı 400 µl jelləşdirmə məhlulu istifadə olunur ki, bu da jelləşmə kamerasını 22 × 22 × 0.38 mm boşluqla doldurmaq üçün kifayətdir və bu, tam tac siçan beyin dilimi ilə uyğunlaşa bilər. . Jelləşdirici məhlulun vaxtından əvvəl polimerləşməsinin qarşısını almaq üçün burulğandan əvvəl məhlula ən son APS əlavə edilməlidir. Bundan əlavə, qarışıq jelləşdirmə məhlulu buz banyosunda və ya soyuq blokda (4 ° C-yə qədər soyudulmuş) saxlanmalıdır. Məsələn, borunun gövdəsini deyil, mikrosentrifuqa borusunun qapağını tutaraq, jelləşdirmə məhlulunun həddindən artıq istiləşməsinin qarşısını alın. Nəhayət, vaxtından əvvəl gelləşmənin qarşısını almaq üçün növbəti addımları (15-ci addımda 4°C-də jelləşdirmə məhlulu və nümunə ilə mikrosentrifuqa borusu yerləşdirənə qədər) 5 dəqiqə ərzində tamamlamağı tövsiyə edirik.

14. Əvvəlki addımdan dərhal sonra yumşaq boya fırçasından istifadə edərək toxumaları mikrosentrifuqa borusunda jelləşdirmə məhluluna köçürün və batırın.

15. Nümunə və jelləşdirmə məhlulu olan mikrosentrifuqa borusunu qaranlıqda 30 dəqiqə 4°C-də saxlayın. 30 dəqiqəlik inkubasiyadan sonra, vaxtından əvvəl gelləşmənin qarşısını almaq üçün növbəti bir neçə addımı (19-cu addımda gelasiya kamerasını 37°C inkubatora yerləşdirənə qədər) 5 dəqiqə ərzində tamamlamağı tövsiyə edirik.

16. Toxuma dilimini köçürmək və jelləşdirmə kamerasındakı boşluqlar arasında yerləşdirmək üçün boya fırçasından istifadə edin. Dilimin qırışlar və təhriflər olmadan düz olduğundan əmin olun. Əvvəlcə aralayıcılar arasına 20 µl jelləşdirici məhlul damcısı əlavə etməyi, toxuma dilimini damlacığa köçürməyi və maye mühitdə toxumanı yavaş-yavaş düzləşdirmək üçün boya fırçasından istifadə edərək şüşə səthinə yumşaq bir şəkildə basmağı tövsiyə edirik.

17. Qapağın bir tərəfinə 20 µl jelləşdirmə məhlulu damcısı əlavə edin və onu çevirin ki, damcı səth gərginliyinə görə səthdən asılsın (Şəkil 4A). Qapağı yavaş-yavaş aşağı salın ki, damlacıq nümunə örtüyü üzərindəki gelləşmə məhlulu ilə birləşsin (Şəkil 4B). Birləşdikdən sonra qapağı endirməyə davam edin ki, o, boşluqlara söykənsin. Bu proses zamanı məhlulun içərisinə heç bir hava cibinin daxil olmadığından əmin olun.

18. Pipetkadan və incə pipet ucundan istifadə edərək, qapaq, boşluqlar və slayd arasındakı boşluq doldurulana qədər kameranın hər iki açıq tərəfinə əlavə jelləşdirmə məhlulu əlavə etməyə davam edin (Şəkil 4C).

Kapilyar qüvvələr jelləşdirmə məhlulunun kameranı bərabər şəkildə doldurmasına səbəb olacaqdır.

19. Gelləşdirmə kamerasını polimerləşmə üçün 2 saat ərzində 37°C-də inkubatora qoyun. Transfer və jelləşdirmə zamanı kameranı əyməmək və ya silkələməkdən çəkinin.

Həzm

20. Gelləşmə kamerasını inkubatordan çıxarın.

21. Yavaş-yavaş ülgüc bıçağını yan tərəfdən qapaq və boşluqlar arasına daxil edin və qapağı açın. Qapaq geldən ayrıldıqdan sonra, aralayıcıları oxşar şəkildə çıxarmaq üçün ülgücdən istifadə etməyə davam edin (şək. 4D).

22. Ülgüc istifadə edərək, artıq geli kəsin.

Gelin kəsilməsi onu yığcam saxlayacaq və sonrakı addımlarda maraq dairələrini tapmağa kömək edəcəkdir. Siz geli asimmetrik formaya malik olmaq üçün kəsmək istəyə bilərsiniz ki, onun oriyentasiyası sonrakı addımlarda sadəcə formanı yoxlayaraq asanlıqla ölçülə bilsin [https://www.youtube.com/watch?v=OksNCAJwxVI (videomuza baxın) toxumalar üçün proExM: gelasiya nümayişi)].

23. Reagentlər və Məhlullarda təsvir olunduğu kimi həzm tamponunu hazırlayın (ProK-nun son konsentrasiyası 8 U/ml-dir).

Həzm tamponunun kifayət qədər hazırlanmasını tövsiyə edirik ki, gel ilə müqayisədə ən azı 10 qat artıq olsun.

24. Jeli və onun tərəflərini həzm tamponu ilə islatmaq üçün boya fırçasından istifadə edin. Həzm tamponu gel sərhədini hopdurana qədər 10-30 saniyə gözləyin.

Bu, jelin dibinə boya fırçası ilə daxil olmağa kömək edəcək ki, gel şüşə substratdan daha asan soyulsun.

25. İncə boya fırçası ilə gel və şüşə səthi arasındakı boşluğu yumşaq bir şəkildə yoxlayaraq, jeli soyun. Həzm zamanı gel təxminən 1,5 × genişlənəcəyi üçün həzm mərhələsi üçün petri qabı kimi uyğun böyük bir qab seçin. Kiçik toxuma və toxuma dilimi nümunələri üçün konteyner kimi 1,5 ml mikrosentrifuqa boruları istifadə edilə bilər. Hər bir nümunə üçün həzm tamponu ilə doldurulmuş ayrı qablardan istifadə edin. Gelləri qaranlıqda otaq temperaturunda >8 saat (gecə yaxşı olar) həzm tamponuna batırılmış vəziyyətdə buraxın (Şəkil 4E, F).

Saxlama və genişləndirmə

26. Həzm tamponunu çıxarın və PBS əlavə edin və sonradan görüntüləmək üçün saxlama istənirsə, geli qaranlıqda 4°C-də saxlayın. Pipetləmə zamanı geli udmamaq üçün diqqətli olun.

Daxil edilmiş toxuma bu mərhələdə bir qədər səpələnir, buna görə də işığın gələn bucağının dəyişdirilməsi onu məhlulun içərisində tapmağa kömək edə bilər.

27. Əgər gelin başqa konteynerə köçürülməsi lazımdırsa (məsələn, kəsmə üçün daha böyük konteyner və ya təsvir üçün nümunə tutucu), geli götürmək və daşımaq üçün uyğun ölçülü boya fırçasından istifadə edə bilərsiniz. Nümunənin susuzlaşmasının qarşısını almaq üçün yeni konteynerə bir qədər PBS əlavə edin.

28. Nümunəni genişləndirməzdən əvvəl geli lazımi minimum ölçüyə qədər kəsməyi məsləhət görürük. Maraqlanan bölgəni tapmaq üçün diseksiyon mikroskopundan və ya aşağı böyüdücü geniş sahəli mikroskopdan istifadə edə bilərsiniz. Nümunənin hərəkətini minimuma endirmək üçün kəsmə zamanı ətrafdakı mayenin çoxu müvəqqəti olaraq çıxarıla bilər. Mikroskop altında, maraq bölgəsindən kənarda geli kəsmək və çıxarmaq üçün ülgücdən istifadə edin. Orientasiyanı asanlıqla çıxarmaq üçün geli asimmetrik bir forma kəsməyi məsləhət görürük. Jeli idarə etmək və təsvir etmək üçün ağlabatan ölçüyə qədər kəsdiyinizə əmin olun, çünki genişləndirmə əlavə olaraq 2 × 2,5 × (ümumilikdə təxminən 4,5 ×) ölçüsündə xətti artım təqdim edəcəkdir. Maraq bölgələri ilə geli genişləndirilmiş geli ehtiva edəcək qədər böyük bir konteynerə köçürün (məsələn, genişləndirmək üçün uyğun ölçülü bir petri qabı və ya görüntüləmə üçün nümunə sahibi).

29.Konteyneri doldurun, jeli suya batırın və 20 dəqiqə gözləyin. Suyu təzə su ilə əvəz edin və başqa 20 dəqiqə gözləyin. Mübadiləni bir dəfə daha təkrarlayın (cəmi üç dəyişiklik üçün təzə suda 20 dəqiqə). Nümunə tam genişləndirilməli və optik olaraq təmizlənməlidir (genişlənmiş siçan beyin yarım dilimi üçün Şəkil 3-ə baxın) və görüntüləmə üçün hazır olmalıdır (bu vaxtlar əvvəlki nəşrlərdən daha qısadır, lakin laboratoriyamızda gündəlik istifadə üçün işləyən nömrələri əks etdirir). Brainbow 3.0-ifadə edən neyronları ehtiva edən beyin diliminin genişlənmədən əvvəl və genişlənmədən sonrakı təsvirlərinə bir nümunə Şəkil 5-də göstərilmişdir. Uzunmüddətli görüntüləmə üçün, məsələn, böyük həcmli nümunənin təsviri zamanı genişlənmədən sonra nümunə montajı lazımdır. və təsvirdən əvvəl (bax. Əsas Protokol 6). Nümunə montajı nümunəni nümunə tutucuya bağlayır və beləliklə, onun sürüşməsinin qarşısını alır, həmçinin nümunəni obyektiv linzanın iş məsafəsində saxlamağa kömək edə bilər. Genişləndirilmiş nümunəni mikroskop altında tez yoxlamaq üçün (<5 dəq) adətən nümunənin quraşdırılmasına ehtiyac yoxdur. Məsələn, ters çevrilmiş mikroskopda, sürüşməsinin qarşısını almaq üçün jelin ətrafındakı suyu müvəqqəti olaraq (<5 dəq) çıxarmaq üçün pipetdən istifadə edə bilərsiniz.

30. Genişləndirilmiş geli yeni konteynerə köçürmək lazımdırsa, genişlənmiş vəziyyətdə bir qədər zərif olduğundan ehtiyatla işlənməlidir. Əvvəlcə ətrafdakı suyun çox hissəsini çıxarın və sonra jeli eyni konteynerə yerləşdirilmiş təmiz şüşə örtüyə daşımaq üçün bir fırça istifadə edin. Bundan sonra, örtüyü (üstdə gel ilə) maşa ilə qabdan yumşaq bir şəkildə qaldırın. Gel yavaş-yavaş örtüyü silməklə yeni konteynerə köçürülə bilər. Bu üsul, gelin yanlış istiqamətə baxması halında, jeli daşıyan örtüyü tərsinə çevirərək jeli çevirmək üçün də istifadə edilə bilər.

3: Qalın bütöv toxuma nümunələri üçün proExM (200 - 500 μm)

200-500 μm qalınlığında toxumalar və toxuma dilimləri üçün əsas toxuma protokolu (Əsas Protokol 2) reagentlərin daha dərindən nüfuz etməsinə imkan vermək üçün dəyişdirilməlidir. Bundan əlavə, həzm müddətini uzatmaq lazımdır. Biz bu protokoldan 500 μm qalınlığa qədər nümunələri genişləndirmək üçün uğurla istifadə etdik, 500 μm-dən daha qalın nümunələri genişləndirmək də mümkün ola bilər.

Əlavə materiallar (həmçinin Baxın Əsas Protokol 2)

  • 2-(N-morfolino)etansülfonik turşu (MES) – tamponlu şoran məhlulu (MBS): suda 100 mM MES/150 mM NaCl, pH 6-a uyğunlaşdırılmışdır

1. Toxuma nümunəsinin yaradılması Əsas Protokol 2-nin 1-7 addımlarında təsvir edilmişdir və daha qalın toxuma nümunələri üçün istifadə edilə bilər.

2. AcX addımı üçün (Əsas Protokol 2, addım 9) toxumaya daha dərindən nüfuz etmək üçün AcX molekulunun NHS efirinin reaktivliyini boğmaq üçün bir qədər turşulu tampon istifadə edilməlidir. Biz adətən bu az turşulu bufer üçün MES-tamponlu şoran (MBS) istifadə edirik. 10 mq/ml AcX/DMSO ehtiyat məhlulunu MBS-də 1:100 nisbətində seyreltin. Nümunənin qalınlığından asılı olaraq otaq temperaturunda 24 saata qədər MBS məhlulunda olan AcX-də toxuma buraxın. Biz adətən qalın toxumalar üçün daha çox vaxt veririk. Məsələn, 500 μm beyin dilimini AcX/MBS məhlulunda 24 saat buraxırıq.

3. Jelləşdirici məhlulun hazırlanması üçün (Əsas Protokol 2, addım 13) inkubasiya zamanı polimerləşmənin daha uzun müddət dayanması üçün 4HT miqdarını 50% artırın (yəni, X və 4HT ehtiyatı arasında 47: 1,5 nisbət). İnkubasiya üçün (Əsas Protokol 2, addım 15) gelləşdirmə kamerasına köçürməzdən əvvəl nümunəni 4°C temperaturda 45-60 dəqiqə (30 dəqiqə əvəzinə) jelləşdirmə məhluluna batırın.

4. Həzm üçün (Əsas Protokol 2, addım 25) daha uzun və daha güclü həzm lazımdır. ProK həzmi toxumanın bioloji tərkibindən və fiksasiyadan sonra onun nə qədər güclü çarpaz bağlanmasından asılı olaraq daha uzun müddət və/və ya daha yüksək temperaturda (50°-dən 60°C-dək) ​​həyata keçirilə bilər. Məsələn, 250 μm qalınlığında siçan beyin dilimi üçün otaq temperaturunda 2 günlük həzm nümunənin adekvat həzmini təmin etdi. Bu halda, gelləşdirilmiş beyin dilimi 1 gün ərzində otaq temperaturunda həzm tamponunda (ProK ilə) həzm olundu, sonra köhnə bufer təzə həzm tamponu ilə (ProK ilə) dəyişdirildi və başqa bir gün üçün həzm edildi.

1: proExM üçün genişlənmə sonrası immunoqrafik

Şəkil 1C-də göstərildiyi kimi, genişlənmədən sonra immun boyama aparıla bilər. ProK istifadə edərək mexaniki homogenləşdirmə mərhələsini yerinə yetirə, sonra antikor əlavə edə bilərsiniz. Bununla belə, yalnız bəzi epitoplar, məsələn, YFP, ProK müalicəsindən sağ çıxa bilər və genişlənmədən sonra ləkələnə bilər, əksər epitoplar yox.

Əksər epitopları qorumaq üçün qələvi yuyucu vasitə ilə zəngin tamponda avtoklavlama yolu ilə zülalın denaturasiyası (və ya alternativ olaraq LysC kimi zülalların içərisində yalnız az sayda sahəni kəsən yumşaq proteaz ilə müalicə) kimi daha yumşaq bir üsul ola bilər. mexaniki homogenləşdirmə üçün istifadə olunur (Şəkil 1C, həmçinin Tillberg et al., 2016-nın Əlavə Şəkil 1-ə baxın). Biz aşağıda avtoklav vasitəçiliyi ilə pozulma protokolunu təsvir edirik. Müxtəlif antikorlardan istifadə edən nümunələr üçün Tillberg et al., 2016-nın Əlavə Şəkil 1-ə baxın.

Aşağıdakı protokol Əsas Protokol 2-yə aiddir və Thy1-YFP siçan beyin dilimləri və genişlənmə sonrası anti-GFP boyanmasından istifadə edən bir nümunə daxildir (Şəkil 6).

Əlavə materiallar (həmçinin Baxın Əsas Protokol 2)

1. Siçan beyni dilimini AcX ilə infuziya edin və Əsas Protokol 2-də təsvir olunduğu kimi hidrogelə yerləşdirin.

Jelləşmədən sonra nümunə şüşə substratdan soyulur və növbəti addımdan əvvəl müvəqqəti olaraq 1M NaCl məhlulunda (məsələn, dəqiqələrlə saatlarla) saxlanıla bilər.

2. Nümunəni qələvi buferdə 15 dəqiqə isladın, sonra məhlulu eyni tərkibli təzə qələvi tamponla əvəz edin. Buferə batırılmış nümunəni otoklavla bilən konteynerə (məsələn, polipropilen şüşə) yerləşdirin və təzyiqi azaltmaq üçün qapağı bir qədər açıq qoyun. Nümunələri qələvi tamponda maye sterilizasiya rejimində, 121°C temperaturda 1 saat avtoklavlayın. Bu və sonrakı addımlar zamanı nümunə görünən şəkildə genişlənəcək.

3. Nümunəni otaq temperaturuna qədər soyudun və hər dəfə 15 dəqiqə ərzində iki dəfə PBS ilə yuyun.

4. Nümunəni 0,1% (ağırlıq/həc) Triton X-100 plus 5% (v/v) normal eşşək zərdabında PBS (bloklama buferi) içərisində aşağı sürətlə çalkalayıcıda otaq temperaturunda və ya 4°-də gecə ərzində ilkin antikorlarla inkubasiya edin. C.

Bloklama buferindəki zərdab ikincili antikorların heyvan sahibindən olmalıdır, ona görə də ikincili antikorlar digər heyvanlardan olarsa, normal eşşək zərdabının əvəzinə digər növ seralardan istifadə edilməlidir.

5. Birincil antikor məhlulunu çıxarın və bloklama buferi ilə hər dəfə 30 dəqiqə ərzində dörd dəfə yuyun.

6. Nümunəni flüoresanla işarələnmiş ikinci dərəcəli antikorla bloklama buferində gecə ərzində otaq temperaturunda və ya 4°C-də aşağı sürətlə inkubasiya edin.

7. İkinci antikor məhlulunu çıxarın və bloklama tamponu ilə hər dəfə 30 dəqiqə olmaqla dörd dəfə yuyun.

8. İstəyirsinizsə, saxlama üçün (bir neçə həftəyə qədər) tamponu PBS ilə əvəz edin. Suda üç dəfə 20 dəqiqəlik yuyulma ilə ~4,5× son əmsalına qədər genişləndirin və sonra görüntüləməyə davam edin (bax. Əsas Protokol 6).

Yuxarıdakı xüsusi addımları necə yerinə yetirmək barədə ətraflı məlumat üçün, məsələn, nümunə ilə işləmə ilə bağlı Əsas Protokol 2-də müvafiq addımlara baxın.

2: Flüoresan zülallar, antikorlar və proeksm üçün boyalar

Şəkil 1C-də təsvir olunan proExM-in dəyişməsi üçün (genişlənmədən sonrakı boyanma proExM) ikincili antikorla konyuqasiya edilmiş istənilən boya protokola uyğun olmalıdır, çünki boya yalnız prosesin sonunda tətbiq olunur.

Şəkil 1A,B-də təsvir olunan proExM varyasyonları üçün (pre-genişləmə boyanması proExM), əksər flüoresan zülallar əvvəllər təsvir edilmiş əsas proExM protokolları ilə uyğun gəlir (bax. Fig. 1b of Tillberg et al., 2016). Məsələn, β-barrel (məsələn, GFP kimi) flüoresan zülallar proteaza davamlıdır və ProK həzminə kifayət qədər yaxşı dözə bilir (məsələn, bir çox flüoresan zülallar üçün >50% flüoresan saxlama), lakin qeyri-β-barrel flüoresan zülallar (məsələn, infraqırmızı) bakteriofitokromlara əsaslanan flüoresan zülallar) ProK addımı ilə parçalanır. Floresan boyalarla birləşmiş antikorlar üçün, siyanin ailəsi boyaları istisna olmaqla, əksər boyalar əsas proExM protokollarına (məsələn, >40% flüoresan saxlama) uyğun gəlir (Tillberg et al., 2016-cı il Şəkil 1c). Cy3, Cy5 və Alexa Fluor 647 kimi siyanin ailəsi boyaları polimerləşmə reaksiyaları zamanı parçalanır. Uzaq qırmızı boyalar üçün, müvafiq olaraq, biz Atto 647N və ya CF 633 tövsiyə edirik.

4: Mədəni Hüceyrələr üçün Exfish

ExFISH nümunələr daxilində endogen RNT molekullarını ExM-in şişən gelinə kovalent şəkildə bağlamaq üçün LabelX adlandırdığımız kiçik molekullu bağlayıcıdan istifadə edərək RNT-nin genişləndirici mikroskopiyasına imkan verir. LabelX proExM-də AcX-in analoqudur, lakin RNT molekullarını RNT FISH istifadə edərək genişlədikdən sonra sorğu-sual etməyə imkan verir. ExFISH ilə işlənmiş mədəni hüceyrələr üçün genişlənmədən sonra RNT molekullarını ləkələmək üçün tək molekullu FISH (smFISH) istifadə olunur.

Materiallar

  • Fosfat tamponlu salin (PBS Current Protocols, 2001)
  • 10% neytral tamponlu formalin (NBF EMS, kat. № 15742-10)
  • Nukleazsız suda 70% (h/v) etanol
  • MOPS tamponu (reseptə baxın)
  • LabelX (reseptə baxın)
  • VA-044 ehtiyat məhlulu (reseptə baxın)
  • Azot qazı mənbəyi
  • Həzm tamponu (reseptə baxın)
  • Nukleazsız su
  • smFISH üçün yuma tamponu (WA-10 reseptinə baxın)
  • smFISH hibridləşmə tamponu (reseptə baxın)
  • smFISH zondları: biz ilk növbədə kommersiyada mövcud smFISH zondlarından istifadə edirik (məsələn, LGC Biosearch Technologies-dən Stellaris ® RNT-FISH zondları). Alternativ olaraq, hər kəsin seçdiyi flüorofora konyuqasiya edilmiş xüsusi smFISH zondlarını dizayn etmək mümkündür (Raj & Tyagi, 2010).
  • Parafilm
  • Tupperware konteyneri (aşağıdakı mətndə təsvir edildiyi kimi dəyişdirilib) hava keçirməyən kamera kimi
  • Grace Bio Labs-dan 16 quyu Culturewell çıxarıla bilən kameralı qapaq eynəkləri (Sigma, cat. No. GBL112358)
  • Kamera örtüyü şüşəsini çıxarmaq üçün alət (Sigma, cat. No. GBL 103259)
  • Vakuum desikatoru və vakuum mənbəyi
  • Şüşə mikroskop slaydları, 1 mm qalınlığında
  • Kapton lenti və ya skotç lenti
  • 60°C inkubator
  • Ülgüc bıçaqları
  • İncə şüşəni kəsmək (yazmaq) üçün almaz qələm
  • Forseps
  • Nunc 4 quyulu düzbucaqlı lövhələr (məsələn, Thermo Fisher, kataloq № 267061)
  • Epoksi yapışqan

Hüceyrə mədəniyyətinin hazırlanması

Hüceyrələr eksperimental ehtiyaclara uyğun olaraq istəyə görə böyüdülə bilər. Bununla belə, jelləşmə və görüntüləmə asanlığı, eləcə də rəftar üçün biz Grace Bio Labs (Sigma, cat. No. GBL112358)-dan 16 quyu Culturewell çıxarıla bilən kamera qapaqlı eynəklərin genişlənmə öncəsi flüoresans üçün əlverişli olduğunu gördük. yerində hibridləşmə (ExFISH) görüntüləmə, eləcə də sonrakı gelləşmə və həzm. Tək molekullu FISH (smFISH) jelləşmə və genişlənmədən əvvəl həyata keçirildiyi hallarda, hüceyrələri 8 quyu Nunc Lab-Tek kameralı qapaqlı şüşələrdə (Thermo Fisher, kataloq №155411) boşqab qoymağı rahat gördük.

Mədəniyyət hüceyrələrinin fiksasiyası və keçiriciliyi

1. Hər hansı istilik şokunun qarşısını almaq üçün hüceyrələri 37°C-yə qədər qızdırılmış PBS ilə bir dəfə yuyun.

2. 10% neytral tamponlu formalin əlavə edin və hüceyrələri 10 dəqiqə otaq temperaturunda fiksasiya edin (başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə bütün addımlar otaq temperaturundadır). Otaq temperaturunda 2 dəqiqə hər dəfə iki dəfə PBS ilə yuyun.

3. Permeabilizasiya üçün buferi nukleazsız suda 70% (v/v) etanol ilə əvəz edin. Sabit hüceyrələr 70% (v/v) etanolda nukleazsız suda 4°C temperaturda 2 həftəyə qədər saxlanıla bilər. Dərhal istifadə üçün sabit hüceyrələr otaq temperaturunda 1 saat ərzində nukleazsız suda 70% (v/v) etanol ilə keçiriciləşdirilməlidir.

Mədəni hüceyrələrin LabelX müalicəsi

4. Otaq temperaturunda hər yuma üçün 5 dəqiqə ərzində iki dəfə PBS ilə yuyulmaqla nukleazsız suda 70% (v/v) etanol ilə keçirici hüceyrələri rehidrat edin. 5 dəqiqə üçün 20 mM MOPS buferi ilə sabit mədəni hüceyrələri əvvəlcədən inkubasiya edin.

5. LabelX-i Reagentlər və Məhlullarda təsvir olunduğu kimi hazırlayın və sonra 20 mM MOPS buferində istənilən konsentrasiyaya qədər seyreltin.

LabelX-dən istifadə edərkən 0,006 mq/ml son Label-IT amin konsentrasiyasında RNT-nin demək olar ki, tam saxlanmasını müşahidə etdik. smFISH təcrübələri üçün 0,006 mq/ml son Label-IT amin konsentrasiyasından istifadə etməyi tövsiyə edirik (yəni, Reagentlər və Məhlullarda reseptdə təsvir edilmiş LabelX məhlulundan 1:150 nisbətində seyreltmə).

6. İnkubasiya öncəsi MOPS buferini çıxarın və sabit kulturasiya edilmiş hüceyrələrə MOPS buferində LabelX əlavə edin. Çıxarılan kameralı qapaq şüşəsində böyüdülmüş hüceyrələr üçün MOPS buferində 80 μl LabelX istifadə edin. Nunc Lab-Tek kameralı qapaq şüşələrində yetişdirilən hüceyrələr üçün 120 μl həcmdən istifadə edin. Gecədə 37 ° C-də inkubasiya edin. Daha sonra, hər biri 5 dəqiqə otaq temperaturunda iki dəfə PBS ilə yuyun.

Bu mərhələdə hüceyrələr müvəqqəti olaraq bir həftəyə qədər PBS-də 4°C-də saxlanıla bilər.

Gelləşmə

Grace çıxarıla bilən kameralı qapaq şüşəsi kamera örtüyü şüşəsi çıxarma aləti (Sigma, cat. no. GBL 103259) ilə çıxarıla bilən yuxarı quruluşa malikdir. Kamera çıxarıldıqdan sonra 1 mm-lik silikon boşluq qapaq şüşəsində qalır və gel tökmək üçün istifadə edilə bilər (protokol aşağıda təsvir edilmişdir, həmçinin Əsas Protokol 2-də). Hüceyrələr bir örtük üzərində böyüdülürsə, o zaman örtük boşluqlarından istifadə edərək kamera hazırlana bilər (bax. Əsas Protokol 2). Hüceyrələr Nunc Lab-Tek kameralı qapaqlı şüşələrdə yetişdirilirsə, biz gördük ki, alt örtük 1 mm-lik conta ilə birlikdə boşqabın qalan hissəsindən çıxarıla bilər və gel tökmək üçün istifadə edilə bilər.

ExFISH üçün sabit kultivasiya edilmiş hüceyrələrin gelləşməsi digər ExM variantlarından fərqlidir, çünki APS əvəzinə VA-044 polimerləşmə təşəbbüskarı kimi istifadə olunur. Biz aşkar etdik ki, APS/TEMED-in istifadəsi smFISH kontekstində əhəmiyyətli olan tutqun avtomatik flüoresan fon verir, burada siqnallar özləri son dərəcə zəifdir. VA-044-ə üstünlük verilir, çünki onun istifadəsi smFISH təsviri üçün ideal olan minimal avtomatik floresanla nəticələnir. Bununla belə, VA-044 daha yüksək parçalanma temperaturuna malikdir və daha yavaş polimerləşmə prosesinə səbəb olur. Nəticədə, ətrafdakı oksigen səbəbiylə inhibə gel əmələ gəlməsinə təsir göstərə bilər. Biz aşkar etdik ki, deqazasiya və ardınca azotla perfuziya jelləşmə məhlulunda həll olunmuş oksigeni sıxışdırır və gel əmələ gəlməsini asanlaşdırır. Buna görə jelləşdirmə azotla dolu bir mühit təmin edən və buxarlanmanı minimuma endirən nəmləndirilmiş kamerada azot atmosferi altında həyata keçirilir.

Biz adətən Tupperware qabından istifadə edirik, lakin nəmləndirilmiş kamera üçün hermetik möhürlə təmin edən istənilən konteyner istifadə edilə bilər (şək. 7). Bir şpris iynəsindən istifadə edərək Tupperware-in qapağında iki deşik yaradırıq. Kameranı nəmləndirmək üçün Tupperware-in dibinə az miqdarda su əlavə edirik. Tupperware-in ən aşağı hissəsində boş 24 quyulu plastik alt boşqab yerləşdiririk ki, onun üzərinə hücrələr və jelləşdirmə məhlulu olan qapaq şüşəsini yerləşdiririk və suyun səviyyəsi 24 quyunun hündürlüyündən xeyli aşağı olmalıdır. boşqab ki, jelləşdirilən nümunə suyun üstündə saxlanılsın.

7. Grace çıxarıla bilən kamera örtüyü şüşəsi üçün: Qara silikon contasını arxada qoyaraq üst quyuları çıxarmaq üçün kamera qapağı şüşə çıxarma alətindən istifadə edin. Hüceyrələri nəmləndirmək üçün quyunun içərisində 40 μl PBS buraxın. Lab-Tek kameralı qapaq şüşəsi üçün əvvəlcə örtük şüşəsinin altını epoksi yapışqan istifadə edərək mexaniki dəstək üçün 1 mm qalınlığında mikroskop şüşə slaydına yapışdırın. Yapışqan bərkidikdən sonra ülgücdən istifadə edərək plastik contanın arxasında qalan üst quyulardan qapaq şüşəsini ayırın. Hüceyrələri nəmləndirmək üçün quyunun içərisində 100 μl PBS buraxın.

8. ExFISH üçün jelləşdirmə məhlulunu aşağıdakı kimi hazırlayın.

VA-044-ü monomer məhlulunda 0,5% (ağırlıq/həc) yekun konsentrasiyasına qədər seyreltin (yəni monomer məhlulunda ehtiyatı 1:50 nisbətində seyreltin). Məsələn, 1 ml gelləşmə məhlulu hazırlamaq üçün 940 μl monomer məhluluna 20 μl VA-044 məhlulu və 40 μl su əlavə edin.

Jelləşmə məhlulu 4°C temperaturda hazırlanmalı və dərhal növbəti addım üçün istifadə edilməlidir.

9. Soyuq blokda və ya buz üzərində ExFISH üçün jelləşdirmə məhlulunu mikrosentrifuqa borularında 200 μl alikotlara paylayın. Vakuum desikatorunda 10 dəqiqə qazsızlaşdırın.

10. Qapaq şüşələrindəki quyulardan hər hansı qalan PBS-ni çıxarın və ExFISH üçün qazı alınmış jelləşdirmə məhlulunu əlavə edin. Grace çıxarıla bilən kamera örtüyü şüşəsi üçün 40 μl jelləşdirmə məhlulu əlavə edin. Lab-Tek kameralı qapaq şüşəsindən istifadə edirsinizsə, 200 μl jelləşdirmə məhlulu əlavə edin. Qapaq şüşəsini vakuum desikatoruna qoyun və başqa 10 dəqiqə qazsızlaşdırın. Bu vaxt, qapaq kimi Parafilm ilə örtülmüş bir şüşə slayd hazırlayın (Şəkil 2-ə və yuxarıdakı mətnə ​​baxın). Parafilm səthinin düz, təmiz və qıvrımsız olduğundan əmin olun. Parafilm, sonrakı addımlarda qapağı çıxararkən gelin qapağa yapışmasının qarşısını alır. Qapaq şüşəsini desikatordan çıxarın və dərhal Parafilm şüşə slaydını birbaşa qapaq şüşəsinin üstünə qoyun. İstənilən artıq jelləşmə məhlulu yanlara tökülə bilər. Gecikmədən aşağıdakı addımlara keçin.

11. Qapaq şüşəsini nəmləndirilmiş kameranın plastik platformasına qoyun. Kameranı möhürləyin (Şəkil 7A,B).

12. Delikləri əhatə edən lenti çıxarın. Azot xəttinin girişini şprisin ucuna birləşdirin və ucunu bir dəlikdən daxil edin (şək. 7C). Azotu kameraya tökmək üçün yavaş-yavaş azot axını tənzimləyicisini yandırın. Digər çuxurdan çıxan hava axını hiss edənə qədər axını artırın. Kameranı 10 dəqiqə azotla yuyun. Hazır olduqda, girişi çıxarın və dərhal hər iki dəliyi yenidən lentlə bağlayın (məsələn, Kapton Tape və ya Scotch Tape).

13. Jelləşməni başlamaq üçün kameranı 60°C inkubatora 2 saat qoyun (Şəkil 7D). Transfer və jelləşdirmə zamanı kameranı əyməmək və ya silkələməkdən çəkinin.

Həzm

14. Jelləşmə başa çatdıqdan sonra nəmləndirilmiş kameranı 60°C inkubatordan çıxarın və qapaq şüşəsini çıxarın. Ülgücdən istifadə edərək, quyuların yuxarı hissəsindən Parafilmlə örtülmüş qapağı yumşaq bir şəkildə açın. Grace Biolabs çıxarıla bilən kamera örtüyü şüşəsi üçün qara silikon contasını əllərinizlə və ya bir cüt maşa ilə soyaraq yumşaq bir şəkildə çıxarın. Lab-Tek kameralı qapaq şüşəsi üçün plastik contasını çıxarmağa çalışmayın. Bu zaman qapaq şüşəsinin üzərindəki ayrı-ayrı quyularda gellərin əmələ gəldiyini görəcəksiniz.

15. Həzm üçün qapaq şüşəsini Nunc 4 quyulu düzbucaqlı boşqaba qoyun. Reagentlər və Məhlullarda təsvir olunduğu kimi proteinaz K ilə həzm tamponunu hazırlayın. Qapaq şüşəsi olan quyuya 6 ml həzm tamponu əlavə edin (əgər hər hansı başqa qabdan istifadə edilərsə, qapaq şüşəsini və gelləri tamamilə örtmək üçün gel həcminin ən azı 10 misli həcmində həzm tamponu əlavə edin). Gelin nümunə örtüyünün şüşəsindən təbii şəkildə soyulana qədər ən azı 2-3 saat ərzində tamamilə batırıldığından əmin olun (Şəkil 2F). Çıxarıla bilən kameralı qapaq şüşəsi istifadə olunursa, hər bir nümunəni və qapaq şüşəsinin müvafiq parçasını ayırmaq üçün almaz çubuqdan istifadə edin, üzlük şüşəsini cızaraq və hər bir şüşə parçasını gel parçası ilə sındıraraq ayırın. Nəzərə alın ki, hüceyrə mədəniyyətinin substratı elə yerləşdirilir ki, gel substratın üstündə, mədəni hüceyrələr isə gelin alt səthində olsun.İsteğe bağlı olaraq, ayrılmış hüceyrə substratı yalnız həzm tamponunda hüceyrə tərkibli geli tərk etmək üçün forseps istifadə edərək diqqətlə çıxarıla bilər.

16. Həzm tamponuna batırılmış geli gecə boyu otaq temperaturunda qaranlıqda buraxın.

Saxlama və genişləndirmə

17. Həzm edildikdən sonra gelləri bir petri qabında və ya gelləri saxlamaq üçün kifayət qədər böyük olan hər hansı bir qabda genişləndirmək olar (müvəqqəti olaraq, aşağıya baxın). Tam genişləndirmək üçün gelləri hər yuma üçün ən azı 1 saat olmaqla, artıq həcmdə nukleazsız su ilə üç dəfə yuyun. Həmçinin Əsas Protokol 1-ə baxın.

Genişlənmədən sonra mədəni hüceyrələrin smFISH boyanması

18. Yuxarıdakı kameralı qapaq şüşələrindən hər hansı birində əmələ gələn gellər genişlənmədən əvvəl ~1 mm qalınlığa malik olduğundan, gel vasitəsilə FISH zondlarının səmərəli yayılmasını asanlaşdırmaq üçün genişləndirilmiş gellərin qalınlığını azaltmaq lazımdır. Tam genişlənmiş gelləri 1 mm qalınlığa qədər qırxmaq üçün aşağıdakı kimi 1 mm qalınlıqda mikroskop şüşə slaydlarından ayırıcı kimi istifadə edirik. Kəsmə taxtası kimi istifadə etmək üçün böyük bir plastik qab hazırlayın. Biz tez-tez Nunc 4 quyulu düzbucaqlı plitələrin plastik örtüklərindən istifadə edirik, baxmayaraq ki, hər hansı oxşar ölçülü düz plastik səth işləyə bilər. 1 mm qalınlığında iki şüşə mikroskop slaydını düz slaydda plastik səthə yapışdırmaq üçün az miqdarda epoksidən istifadə edin. İki şüşə slaydı elə yerləşdirin ki, onlar ən uzun ölçüləri boyunca aralarında 2,5-3 sm boşluq qalsınlar. Epoksi qatının sərtləşməsinə icazə verin.

19. Tamamilə genişlənmiş geli plastik qapağın üzərindəki iki şüşə slayd arasında yerləşdirin. Genişləndirilmiş gel iki şüşə slayd arasında yerləşməlidir. Əgər yoxsa, geli ülgüclə kəsin. Geli elə yerləşdirin ki, gelin mədəni hüceyrələri olan tərəfi aşağı baxsın.

20. Şüşə slaydlar üzərində ülgüc bıçağı qoyun ki, slaydlar arasında körpü olsun. Tərkibində hüceyrələr olan gelin 1 mm alt hissəsindən başqa hər şeyi qırxmaq üçün ülgüc bıçağını şüşə slaydlar boyunca və geldən diqqətlə sürüşdürün.

21. Tərkibində sabit və genişlənmiş hüceyrələri olan qırxılmış geli diqqətlə toplayın və onu PBS-ə köçürün. Lazım gələrsə, bu nöqtədə qırxılmış gellər PBS-də 4°C-də 1 aya qədər saxlanıla bilər.

22. İstənilən qabda həyata keçirilə bilən smFISH boyanmasına davam edin, baxmayaraq ki, biz tez-tez boyandıqdan dərhal sonra görüntünün rahatlığı üçün şüşə dibi 24 quyu boşqablardan istifadə edirik.

23. Otaq temperaturunda 30 dəqiqə yuma tamponu (WA-10) ilə inkubasiya edərək gelləri hazırlayın.

24. smFISH hibridləşmə buferində satıcı tərəfindən smFISH üçün göstərilən konsentrasiyada seyreltməklə zondları hazırlayın. Biz adətən hibridləşdirməni 100 nM ümumi zond konsentrasiyasında həyata keçiririk. Qarışdırmaq üçün burulğan.

25. Yuma tamponunu gellərdən çıxarın. Gellərin üzərinə zondlarla hibridləşmə tamponunu əlavə edin. Ləkələnəcək geli tamamilə örtmək üçün kifayət qədər həcm əlavə edin (24 quyu boşqablar üçün 300 µl tövsiyə edirik). Gecədə (və ya >6 saat) 37°C-də inkubasiya edin.

26. Gelləri iki dəfə artıq həcmdə (məsələn, 24 quyu üçün 500 μl) WA-10 ilə 37°C-də hər yuma üçün 30 dəqiqə ilə yuyun.

27. 30 dəqiqə ərzində 37°C-də artıq PBS həcmi ilə bir dəfə yuyun.

28. Təsvir PBS və ya hər hansı digər seçim buferində həyata keçirilə bilər [genişlənmə faktoru duz konsentrasiyası ilə müəyyən edilir: müntəzəm PBS-dən istifadə 0,02 × PBS (suda seyreltilmiş) istifadə edərək ~2 × genişlənmə ilə nəticələnir, eyni zamanda hələ də qorunub saxlanılmaqla ~3 × genişlənir. hibridləşmə].

HeLa hüceyrələri ilə nümunə Şəkil 8-də göstərilmişdir. Ən çox yayılmış mikroskop qurğularında genişləndirilmiş gelləri necə təsvir etmək üçün Əsas Protokol 6-a baxın. Əldə edilmiş təsvirin keyfiyyəti təsvirin qurulmasından asılı olsa da, konfokal görüntüləmə zamanı müşahidə olunan smFISH ləkələrinin fotoağartması səbəbindən konfokal görüntüləmə üzərində geniş sahəli təsvirlər tövsiyə olunur.

Toxumalarda ExFISH-in icrası üçün protokol bir neçə əsas aspektdə mədəni hüceyrə protokolundan fərqlidir. Birincisi, toxuma ExFISH protokolu FISH həyata keçirdikdən sonra siqnal gücləndirilməsini tələb edir, çünki adi smFISH konfokal görüntüləmə və toxumalar üçün lazım olan oxşar 3-D təsvir üsulları üçün çox zəifdir. Nəticədə, FISH zondlarından gələn siqnalı gücləndirmək üçün hibridləşmə zəncirvari reaksiyasından (HCR) istifadə edirik. İkincisi, jelləşdirmə proseduru, mədəni hüceyrələr üçün prosedurdan daha çox toxumalar üçün proExM protokolunda (Əsas Protokol 2) təsvir edilənə bənzəyir. Üçüncüsü, daha yüksək konsentrasiyalarda LabelX istifadə olunur, çünki daha yüksək konsentrasiyalarda toxumalarda daha yaxşı RNT tutma məhsuldarlığı müşahidə olunur. Nəhayət, Label-X müalicəsindən sonra flüoresan zülalları saxlamaq üçün AcX-dən istifadə etmək mümkündür.

Materiallar

  • Nukleazsız su
  • Fosfat tamponlu salin (PBS Current Protocols, 2001)
  • PBS-də 4% (w/v) paraformaldehid (PFA).
  • Nukleazsız suda 70% (h/v) etanol
  • MOPS tamponu (reseptə baxın)
  • LabelX (reseptə baxın)
  • HCR-FISH üçün yuma tamponu (WA-20 reseptinə baxın)
  • HCR-FISH hibridləşmə tamponu (reseptə baxın)
  • HCR-FISH zond dizaynı: HCR-FISH üçün zondlar LGC Biosearch Technologies şirkətinin Stellaris Probe Designer proqram təminatından istifadə etməklə hazırlanmışdır. Bir-birindən 2 bp məsafədə yerləşən 22 bp bağlama ardıcıllığı proqram təminatından istifadə etməklə tərtib edilmişdir. Biz tez-tez maraq doğuran hər bir transkripti hədəfləyən ən azı 20 ardıcıllığı hədəfləyirik. HCR-FISH zondlarını dizayn etmək üçün HCR təşəbbüskar ardıcıllıqları (Choi, Beck, & Pierce, 2014) 2 əsaslı boşluq (AA) vasitəsilə hər bir bağlama ardıcıllığına əlavə olunur. Təşəbbüskar ardıcıllıqlar hər bir bağlama ardıcıllığının ya 5′ sonuna, ya da 3′ sonuna əlavə edilə bilər. Bu prosedurla yaradılan HCR-FISH zondlarının son uzunluğu 60 bp-dir.
  • Gücləndirmə tamponu (reseptə baxın)
  • HCR saç sancaqları (hər saç ipi Molekulyar Alətlərdən alınır, saxlama buferində 3 µM konsentrasiyada gəlir)
  • 5 × SSCT (reseptə baxın) və 0,05 × SSCT (reseptə baxın)
  • Vibratom
  • 24 quyu mədəniyyət lövhələri
  • Transkardial perfuziya üçün əlavə reagentlər və avadanlıqlar (Chen et al., 2015), vibratom kəsmə (Chen et al., 2015) və bütöv toxumalar üçün proExM (Əsas Protokol 2)

Dokuların bərkidilməsi və dilimlənməsi

Dokular seçdiyiniz protokollardan istifadə edərək düzəldilə bilər. Aşağıda ardıcıl nəticələr nümayiş etdirən siçan beyin dilimləri üçün perfuziya fiksasiyası və dilimləmə protokolu var.

1. Transkardial olaraq siçan beynini (Chen et al., 2015) buz kimi soyuq PBS (5-10 ml) və PBS-də (~30 ml) buz kimi soyuq 4% (w/v) paraformaldehid ilə perfuziya edin.

2. 4°C-də gecə ərzində PBS-də 4% (w/v) paraformaldehiddə beyini post-fix.

3. Dilimləri kəsməzdən əvvəl beyini bir dəfə 30 dəqiqə PBS ilə yuyun.

4. PBS-də bir vibratome (Chen et al., 2015) üzərində beyin dilimlərini kəsin.

Genişlənmədən sonra FISH zondları ilə effektiv boyanmağa imkan vermək üçün dilimlərin qalınlığı 200 µm-dən az olmalıdır.

5. Dilimlər dərhal istifadə edildikdə (1-2 gün ərzində) və ya 70% (h/v) etanolda 4°C-də daha uzun müddət ərzində nukleazsız suda saxlanılırsa, PBS-də saxlanıla bilər.

LabelX müalicəsi, jelləşdirmə və toxumaların və toxuma dilimlərinin həzm edilməsi

6. Əgər toxumalar və ya toxuma dilimləri nukleazsız suda 70% (h/v) etanolda saxlanılıbsa, otaq temperaturunda hər yuma üçün 15 dəqiqə ərzində iki dəfə PBS ilə yuyulmaqla rehidratlayın. Əks halda, protokolun qalan hissəsi ilə davam edin.

7. 30 dəqiqə ərzində 20 mM MOPS buferi ilə toxumaları və ya toxuma dilimlərini əvvəlcədən inkubasiya edin.

8. LabelX-i 20 mM MOPS buferində 0,1 mq/ml yekun Label-IT amin konsentrasiyasında seyreltməklə hazırlayın (yəni, LabelX ehtiyat məhlulundan 1:10 nisbətində seyreltmə).

9. İnkubasiya öncəsi MOPS buferini çıxarın və dilimlərə MOPS buferində LabelX əlavə edin. Rahatlıq üçün toxumalar və ya toxuma dilimləri 24 və ya 48 quyu boşqablarında işlənə bilər. Dilimləri örtmək üçün kifayət qədər həcmdən istifadə edin: məsələn, 24 çuxurlu boşqabda 50 µm-lik dörd bölmə 250 µl məhlulda birlikdə inkubasiya edilə bilər.

10. LabelX ilə toxumaları və ya toxuma dilimlərini MOPS-də gecə ərzində 37°C-də inkubasiya edin. Daha sonra, hər turda 15 dəqiqə PBS ilə iki dəfə yuyun.

11. Könüllü: Transgen nümunələrdən toxuma dilimlərində flüoresan zülalları saxlamaq üçün AcX ilə əlavə inkubasiya etmək mümkündür. Ən azı 6 saat otaq temperaturunda PBS-də 0,05 mq/ml AcX ilə dilimləri inkubasiya edin. Hər yuma üçün 15 dəqiqə PBS ilə iki dəfə yuyun.

12. Əsas Protokol 2-də təsvir olunduğu kimi gelləşmə və həzm prosesinə keçin.

Becərilmiş hüceyrələr üçün ExFISH jelləşdirmə prosedurundan fərqli olaraq, burada APS/TEMED ilə gelləşdirmə proExM protokolunda olduğu kimi həyata keçirilə bilər, çünki HCR ilə siqnal gücləndirilməsi APS/TEMED-dən yaranan zəif avtomatik flüoresansı əhəmiyyətsiz edir.

13. Həzm edildikdən sonra gelləri PBS ilə iki dəfə, hər dəfə 30 dəqiqə yuyun. Gellər bu addımdan sonra 2 aya qədər PBS-də 4°C temperaturda qaranlıqda saxlanıla bilər.

HCR-FISH ilə jelləşdirilmiş dilimlərin rənglənməsi

Boyanma hər hansı bir kamerada həyata keçirilə bilsə də, biz tez-tez 24 quyu boşqablardan istifadə edirik.

14. Otaq temperaturunda 30 dəqiqə yuma tamponu (WA-20) ilə inkubasiya edərək gelləri hazırlayın.

15. HCR-FISH hibridləşmə tamponunda istənilən konsentrasiyada (hər prob üçün ~1 nM) seyreltməklə probları hazırlayın. Qarışdırmaq üçün burulğan.

16. Yuma tamponunu gellərdən çıxarın. Gellərin üzərinə zondlarla hibridləşmə tamponunu əlavə edin. Ləkələnəcək geli tamamilə örtmək üçün kifayət qədər həcm əlavə edin (24 quyu boşqablar üçün, hər quyu üçün 300 µl). Gecədə 37 ° C-də inkubasiya edin.

17. Gelləri iki dəfə artıq həcmdə (məsələn, 24 quyu üçün 500 µl) WA-20 ilə 37°C-də hər yuma üçün 30 dəqiqə yuyun. Jelləşmədən əvvəl 100 µm-dən qalın dilimlər üçün yuma vaxtını hər yuma üçün 45 dəqiqəyə qədər artırın.

18. 2 saat ərzində 37°C-də artıq həcmdə PBS ilə bir dəfə yuyun.

19. 2 saat otaq temperaturunda PBS artıq həcmi ilə bir dəfə yuyun. Jelləşmədən əvvəl 100 µm-dən qalın dilimlər üçün yuyulma müddətini 4 saata qədər artırın. Lazım gələrsə, bu addımdan sonra FISH zondları ilə boyanmış gellər HCR gücləndirilməsindən əvvəl gecə ərzində 4°C-də PBS-də saxlanıla bilər.

HCR gücləndirilməsi (Choi et al., 2014-dən uyğunlaşdırılmışdır)

20. Otaq temperaturunda 30 dəqiqə gücləndirici bufer ilə dilimləri əvvəlcədən inkubasiya edin.

21. Flüoresan etiketli saç sancaqlarını hazırlayın (hər saç ipini 90 saniyə ərzində 95°C-ə qədər qızdırın, sonra çekmecedə otaq temperaturunda 30 dəqiqə soyudun). İstifadə olunacaq hər 500 µl ümumi gücləndirmə buferi üçün (növbəti addımda biz 48 quyu boşqabının hər quyusu üçün 150 µl gücləndirmə buferindən və ya 24 quyu boşqabının hər quyusu üçün 250 µl gücləndirici buferdən istifadə edirik), hər saç tıxacından 10 µl lazımdır. .

22. İstənilən son həcmə çatmaq üçün gücləndirici buferin lazımi həcmindən istifadə edərək, otaq temperaturunda gücləndirici buferdə bütün sıxıcı soyudulmuş saç sancaqlarını birləşdirərək saç sancağı məhlulu hazırlayın. Məsələn, iki saç sancağı ilə 500 µl ümumi gücləndirmə tamponu hazırlamaq üçün 480 µl gücləndirici buferə hər saç sancağından 10 µl əlavə edin. Qarışdırmaq üçün burulğan.

23. Qabaqcıl gücləndirmə məhlulunu çıxarın, saç ipi məhlulunu gellərə əlavə edin və otaq temperaturunda 3-6 saat inkubasiya edin.

24. 5× SSCT ilə 30 dəqiqəlik dörd yuma ilə gücləndirməni dayandırın.

Genişləndirmə və görüntüləmə

25. Bu nöqtədə nümunələr təsvir edilə bilər. Nümunələri genişləndirmək üçün üç dəfə, hər dəfə 0,05× SSCT ilə 10 dəqiqə yuyun. Genişlənmə faktoru duz konsentrasiyasının təsvirini dəyişdirməklə tənzimlənə bilər, həmçinin ~2 × genişlənmə üçün müntəzəm PBS-də həyata keçirilə bilər. Nümunə siçan beyin dilimi Şəkil 9-da göstərilmişdir. Ən çox yayılmış mikroskop qurğularında genişləndirilmiş gelləri necə təsvir etmək üçün Əsas Protokol 6-a baxın.

6: Genişləndirilmiş Nümunələrin Görünüşü

Materiallar

  • Genişləndirilmiş nümunə (yuxarıdakı protokollara baxın)
  • Etanol
  • BALIQ zondları
  • Suda 0,1% (ağırlıq/həc) poli- L-lizin
  • Azot mənbəyi
  • Aşağı ərimə nöqtəli agaroza
  • Super yapışqan
  • Diseksiyon və ya geniş sahəli mikroskop
  • Ülgüc bıçağı
  • Qapaqlar (məsələn, 24 × 60 mm № 1,5 (qalınlıq: 0,15 - 0,19 mm))
  • Şüşə dibli qablar və ya çoxlu boşqablar (məsələn, Mattek, kataloq № P35G-0.170-14-C)
  • Boya fırçası
  • Kağız salfetlər (məsələn, Kimwipes)
  • Tərs, dik və ya yüngül təbəqə mikroskop

Təsvir üçün nümunə genişləndirilməsi

1. PBS-də gel daxil edilmiş, həzm olunmuş nümunəni (məsələn, Əsas Protokol 1-də 30-cu addım, 2-ci Əsas Protokolda 25-ci addımın sonu, 4-cü Əsas Protokolda 17-ci addım və ya Əsas Protokol 5-də 13-cü addım) petri qabına qoyun. .

2. Maraqlanan bölgəni tapmaq üçün diseksiyon mikroskopu və ya aşağı böyüdücü (məsələn, 4× və ya 10×) obyektivli geniş sahəli mikroskopdan istifadə edin.

ExFISH nümunələri üçün bu, FISH zondları ilə boyanmadan əvvəl (yəni, Əsas Protokol 4-də 18-ci addımdan əvvəl və ya Əsas Protokol 5-də 14-cü addımdan əvvəl) edilməlidir.

3. Mikroskop altında artıq geli çıxarmaq üçün ülgücdən istifadə edin (məsələn, maraq dairəsindən uzaq).

Kulturasiya edilmiş hüceyrə ExFISH nümunələri də qalınlığı azaltmaq üçün eksenel olaraq kəsilməlidir (Əsas Protokol 4-də 18-21-ci addımlara baxın).

4. ProExM nümunələrini su ilə tam genişləndirin. ExFISH nümunələri əvvəllər təsvir edilmiş protokollara (yəni, Əsas Protokol 4-də 22-28-ci addımlar və ya Əsas Protokol 5-də 14-25-ci addımlar) əməl edərək, FISH zondları ilə rənglənməli və mədəni hüceyrələr üçün seyreltilmiş PBS və ya toxumalar üçün seyreltilmiş SSC buferində genişləndirilməlidir. ).

Montaj nümunəsi

Genişlənmiş ExM nümunəsinin sabit səthə quraşdırılması nümunənin təsvir zamanı sürüşməsinin qarşısını almağa kömək edə bilər ki, bu da yüksək keyfiyyətli şəkillər əldə etmək üçün vacibdir. Ən yaxşı quraşdırma metodu mikroskopunuzun həndəsələrindən və nümunə tutucudan (məsələn, örtük, Petri qabı və ya çoxqulu boşqab quyusu), eləcə də görüntüləmə vaxtı, obyektiv tip və böyütmə kimi təsvir tələblərinizdən asılı olacaq.

Quru obyektivli ters çevrilmiş və ya dik mikroskopdan istifadə etməklə genişləndirilmiş nümunələrin sürətli təftişi (<5 dəq) üçün adətən nümunənin quraşdırılmasına ehtiyac yoxdur. Siz gel ətrafında mayenin üzməsinin və ya sürüşməsinin qarşısını almaq üçün onu müvəqqəti olaraq (<5 dəq) çıxarmaq üçün pipetdən istifadə edə bilərsiniz.

Minimum nümunə sürüşməsi tələb edən uzunmüddətli (>5 dəq) görüntüləmə və ya görüntüləmə üçün (məsələn, z-stack), siz genişləndirilmiş nümunələri fiziki olaraq nümunə tutucuya əlavə etməklə nümunəni quraşdırmaq istəyə bilərsiniz. Aşağıdakı bölmələrdə biz üç ümumi montaj üsulunu təsvir edirik: agaroza, poli-L-lizin və superglue. Ters çevrilmiş mikroskoplar üçün geli sabit bir səthə quraşdırmaq üçün poli-L-lizin istifadə edə bilərsiniz. Dik mikroskoplar üçün agaroza, poli-L-lizin və ya super yapışqan istifadə edə bilərsiniz. Yüngül təbəqə mikroskopları üçün superglue və ya poli-L-lizin istifadə edə bilərsiniz.

Poli-L-lizin metodunun üstünlüyü ondan ibarətdir ki, o, gel ilə nümunə tutucunun səthi arasında şəffaf interfeys təmin edir. Buna görə də, tərs mikroskop kimi nümunə tutucu vasitəsilə təsvir tələb edən mikroskop konfiqurasiyaları üçün uyğundur. Müqayisə üçün, agaroza optik səpilmə və aberrasiya təqdim edə bilər və superglue müalicədən sonra şəffaf deyil. Agaroz metodunun üstünlüyü ondan ibarətdir ki, nümunənin montajı geri çevrilə bilən olduğundan, görüntüləmədən sonra nümunənizi əldə edə bilərsiniz. Nümunə təsvir edildikdən sonra yüksək duzlu buferə yerləşdirməklə kiçilə bilər (və sonra agarozadan ayrıla bilər). Superglue metodunun üstünlüyü digər üsullarla müqayisədə güclü yapışmadır. Dik mikroskopda və ya işıq təbəqəli mikroskopda, hətta günlərlə belə uzunmüddətli görüntüləmə üçün uyğundur.

Poli-L-lizin ilə nümunə montajı

5a. Nümunə saxlayan kimi örtüklər, şüşə dibli qablar və şüşə dibi çoxlu quyu boşqablarından istifadə edilə bilər. Slaydlar və ya plastik çox quyulu lövhələr də istifadə edilə bilər, lakin nümunə tutucunun qalınlığı hədəflərin seçimini məhdudlaşdıra və/və ya ters çevrilmiş mikroskoplarda aberrasiyaya səbəb ola bilər.

6a. Nümunə tutucunun səthini su və sonra etanol ilə yuyun. Durulandıqdan sonra tutucunun havada qurumasına icazə verin.

7a. Şüşə səthini 0,1% (ağırlıq/həc) poli-L-lizinlə 20 dəqiqə suda isladın.

8a. 0,1% (ağırlıq/həc) poli-L-lizin məhlulunu çıxarın və örtülmüş şüşə səthini üç dəfə su ilə yuyun.

9a. Şüşə səthini təmiz mühitdə 1 saat hava ilə qurutun və ya səthi fenlə qurutmaq üçün azot qazından istifadə edin.

  1. Əvvəlcə gel ətrafındakı mayenin çox hissəsini çıxarın. Sonra gelin yanına təmiz örtük qoyun və jeli örtük üzərinə sürüşdürmək üçün boya fırçasından istifadə edin.
  2. Sonra bir cüt forseps ilə örtüyü (üstdə gel ilə) qabdan çıxarın.
  3. Geli poli-L-lizinlə dəyişdirilmiş səthə köçürməzdən əvvəl yaxşı yapışma üçün yapışdırılacaq gel səthi qurudulmalıdır. Artıq mayeni çıxarmaq üçün kiçik bir Kimwipe parçasından istifadə edə bilərsiniz. Gelin kənarlarından artıq mayeni udmağa başlayın və sonra diqqətlə istifadə edin, məsələn, jelin dibi ilə örtük arasında mayeni udmaq üçün kağız salfetin ucundan istifadə edin.

Jeli örtükdən poli-L-lizinlə dəyişdirilmiş səthə sürüşdürmək üçün boya fırçasından istifadə edin. Sonrakı mikroskopiya işiniz kontekstində gelin oriyentasiyasından xəbərdar olun: məsələn, tərs bir quruluşda obyektiv (məsələn, obyektiv iş məsafəsi daxilində) nümunə tutucuya baxan tərəfə daha asan çatacaq. Bunun əksinə olaraq, şaquli mikroskop qurğusunda nümunə tutucudan uzağa baxan tərəf obyektiv üçün daha əlçatan olacaq. Buna görə də, əgər maraq bölgəsi gelin müəyyən bir tərəfinə daha yaxındırsa, nümunəni quraşdırarkən həmin tərəfi obyektivinə yaxın qoyun. Bu təcrübə genişləndirilmiş nümunələr üçün vacib olur, çünki nümunə qalınlığı və gel qalınlığı genişləndirmə faktoru ilə böyüdülür.

Bu gel transferi gelin susuzlaşmasının qarşısını almaq üçün vaxtında aparılmalıdır: bu addımı 5 dəqiqə ərzində bitirməyi məsləhət görürük.

11a. Quraşdırıldıqdan sonra geli nəm saxlamaq və gel büzülməsinin qarşısını almaq üçün dərhal az miqdarda su (və ya ExFISH nümunələri üçün seyreltilmiş PBS) əlavə edin.

Agaroza ilə nümunə montajı

5b. Nümunə saxlayan kimi örtüklər, şüşə dibli qablar və şüşə dibi çoxlu quyu boşqablarından istifadə edilə bilər. Slaydlar və ya plastik çoxqulu boşqablar da istifadə edilə bilər, lakin nümunə tutucunun qalınlığı hədəflərin seçimini məhdudlaşdıracaq və/yaxud ters çevrilmiş mikroskoplarda aberrasiyalara səbəb olacaq.

6b. Düzgün təsvir mühitində 0,5% (ağırlıq/həc) aşağı əriyən agaroza məhlulunu hazırlayın. Məsələn, proExM nümunələri üçün suda 0,5% (ağırlıq/həc) agaroza hazırlayın. ExFISH nümunələri üçün seyreltilmiş PBS və ya seçdiyiniz digər buferlərdə 0,5% (ağırlıq/həc) agaroza hazırlayın. Erkən sərtləşməmək üçün agaroza məhlulunu 40°C su banyosunda isti saxlayın. Əgər bərkimişsə, agaroza məhlulunu əritmək üçün qısa bir mikrodalğalı dövrədən (10-20 saniyə) istifadə edin. Alternativ olaraq, onu ~60°C-yə qədər qızdırmaq onu da yenidən əridir.

7b. Genişləndirilmiş geli seçdiyiniz nümunə sahibinə köçürün (məsələn, örtüklər və şüşə dibli qablar). Köçürmə zamanı mayeni genişləndirilmiş geldən çıxarın və çıxarın (yuxarıda 10a addımına baxın).

8b. Bir pipetdən istifadə edərək, ərinmiş agaroza məhlulunu jelin kənarlarına diqqətlə çəkin. Lazım gələrsə, ərinmiş agaroza məhlulundan istifadə edərək bütün geli agaroza daxil edə bilərsiniz.

9b. Otaq temperaturunda və ya 4°C-də agarozun sərtləşməsini gözləyin və sonra susuzlaşmanın qarşısını almaq üçün az miqdarda su (və ya ExFISH nümunələri üçün seyreltilmiş PBS) əlavə edin.

10b. Təsvir tamamlandıqdan sonra siz quraşdırılmış nümunəni PBS kimi yüksək duzlu buferə yerləşdirə bilərsiniz. Bu, geli kiçildir, lakin agarozu deyil. Fırçalar və ya forsepslərdən istifadə edərək, jeli agarozadan ayıra bilərsiniz. Gel daha sonra istifadə üçün PBS-də saxlanıla bilər.

Superglue ilə nümunə montajı

5c. Nümunə saxlayan kimi örtüklər, şüşə dibli qablar və şüşə dibi çoxlu quyu boşqablarından istifadə edilə bilər.Slaydlar və ya plastik çox quyu plitələr də istifadə edilə bilər. Bununla belə, superglue quruduqdan sonra qeyri-şəffaf olur, bu montaj üsulu nümunə tutucu vasitəsilə təsvir tələb edən tərs mikroskoplara uyğun gəlmir.

6c. Nümunə tutucunun səthini su və sonra etanol ilə yuyun. Durulandıqdan sonra tutucunun havada qurumasına icazə verin.

7c. Nümunə tutucunun səthinə super yapışqan tətbiq edin. Yapışqanı yalnız gelin yapışdırılmalı olduğu yerə tətbiq edin. Həmçinin həddindən artıq superglue kağız salfetlər ilə silinib, yalnız nazik bir təbəqə qaldığından əmin olun.

8c. Genişləndirilmiş geli seçdiyiniz nümunə sahibinə köçürün. Köçürməzdən əvvəl mayeni genişləndirilmiş geldən çıxarın və çıxarın (bax addım 10a).

9c. Gel yapışqanın üzərinə qoyulduqdan sonra, geli nəmləndirmək üçün su (və ya ExFISH nümunələri üçün seyreltilmiş PBS) əlavə etməzdən əvvəl superglyenin bərkiməsi üçün 20-30 saniyə gözləyin.

Quruduqdan sonra gel və superglue arasında qeyri-şəffaf bir interfeys olmalıdır.

ExM nümunələrinin ters çevrilmiş mikroskoplarla görüntülənməsi (məsələn, ters çevrilmiş diskli konfokal mikroskoplar)

Tipik ters çevrilmiş mikroskop qurğusu Şəkil 10-da göstərilmişdir. Poli-L-lizin quraşdırma metodu tərs mikroskoplar üçün tövsiyə olunur, çünki gel və poli-L-lizin dəyişdirilmiş səth arasındakı şəffaf interfeys nümunə tutucu vasitəsilə təsvir etməyə imkan verəcəkdir.

Ters çevrilmiş mikroskopda təsvir etmək üçün əvvəlcə maraq dairəsini tapmaq üçün aşağı böyüdücü (4× və ya 10×) məqsədlərlə başlamağı, sonra isə yüksək böyüdücü hədəflərə keçməyi tövsiyə edirik. Hava məqsədləri adətən aşağı böyüdücü məqsədlərdir (məsələn, 4× və ya 10×) və nümunələri və maraq dairələrini tapmaq üçün başlanğıcda istifadə edilə bilər. Yüksək böyüdücü təsvir (>20×) üçün sulu montaj mühiti ilə örtük və ya yağ arasında qırılma indeksinin uyğunsuzluğundan yaranan aberrasiyaların qarşısını almaq üçün suya batırma obyektlərindən istifadə etməyi tövsiyə edirik. Ümumiyyətlə qısa iş məsafələrinə görə, yağa batırma məqsədləri əsasən genişləndirilmiş gel örtüyə yaxın (~10 μm daxilində) quraşdırıldıqda və nümunə və ya maraq obyekti obyektə yaxın olduqda (məsələn, mədəni hüceyrələrdə və ya nazik toxumalarda). Əgər gel nümunə tutucuya düzgün quraşdırılıbsa (yəni, gelin nümunə tərəfi poli-L-dən istifadə etməklə obyektiv tərəfə baxaraq quraşdırılıbsa) mədəni hüceyrələr kimi nazik nümunələr üçün obyektin işləmə məsafəsi adətən problem yaratmır. lizin üsulu). Bununla belə, bəzi toxuma nümunələri üçün, gelin dərinliklərində (məsələn, >300 µm) təsvir edildikdə iş məsafəsi problemə çevrilir. Bu halda, uzun iş məsafəsində suya batırma məqsədləri tövsiyə olunur. Hər bir mikroskopiya təcrübəsində olduğu kimi, obyektivdəki korreksiya yaxası (əgər varsa) örtüklərin qalınlığına uyğunlaşdırıldığına əmin olun.

Biologiya laboratoriyalarında və görüntüləmə qurğularında istifadə olunan geniş sahəli və konfokal mikroskopların çoxu tərs mikroskoplardır. Biz fırlanan diskli konfokal mikroskopların ayırdetmə və sürətin yaxşı birləşməsini təklif etdiyini və genişlənmiş toxumaların sürətli nanoölçülü təsviri üçün yüksək uyğun olduğunu gördük. Lazer skan edən konfokal mikroskoplar mədəni hüceyrələr kimi nazik və kiçik nümunələrin yüksək siqnaldan fona görüntülənməsi üçün ən effektiv şəkildə istifadə edilə bilər.

Dik mikroskoplarla görüntüləmə

Dik mikroskoplar üçün üç montaj metodundan hər hansı biri, poli-L-lizin, agaroza və ya superglue istifadə edilə bilər. Əgər görüntüləmədən sonra nümunənizi götürməyi planlaşdırırsınızsa, biz agaroza montaj üsulunu tövsiyə edirik. Digər iki üsulda gel fiziki olaraq nümunə tutucuya yapışdırılır, lakin nümunənin götürülməsinə ehtiyac yaranarsa, ülgüc bıçağı ilə potensial olaraq sərbəst şəkildə kəsilə bilər (diqqət etməsəniz, bu proses nümunəyə zərər verə bilər). Uzunmüddətli görüntüləmə üçün (məsələn, bir neçə gün ərzində) biz superglue montaj metodundan istifadə etməyi məsləhət görürük, çünki o, nümunə tutucuya ən güclü yapışma təmin edir. Poli-L-lizin metodu gel və nümunə tutucu arasında şəffaf bir interfeys təmin edir və beləliklə, ters çevrilmiş mikroskopda da təsvir edilə bilər. Dik mikroskopda təsvir etmək üçün əvvəlcə maraq dairəsini tapmaq üçün aşağı böyüdücü (4× və ya 10×) hədəflərdən başlamağı, sonra isə tərs mikroskopdakı prosedura bənzər yüksək böyüdücü hədəflərə keçməyi tövsiyə edirik. Yüksək böyüdücü görüntülər üçün (>20×) biz suya batırma və ya suya batırma obyektivlərindən istifadə etməyi tövsiyə edirik, çünki gel sulu montaj mühitinə batırılır.

Nümunə yuxarıdan asılmış mikroskoplarla görüntüləmə (məsələn, işıq təbəqəli mikroskoplar)

Yüngül təbəqə mikroskopları uzun məsafəli məqsədlərdən istifadə edərək, genişlənmiş toxuma nümunələrinin yüksək sürətlə görüntülənməsi üçün uyğundur. Məqsədləri yerinə yetirmək üçün bəzi işıq təbəqəli mikroskoplar nümunələri yuxarıdan asırlar. Məsələn, işıq təbəqəli mikroskopun (Zeiss Z.1 işıq təbəqəsi mikroskopu) tipik görüntüləmə quruluşu Şəkil 11-də göstərilmişdir. Z.1 işıq təbəqəsi mikroskopu nümunələri obyektivlərin üstündən perpendikulyar asmaq üçün çubuqdan istifadə edir. mikroskopun işıq yolu. Nümunə daha sonra sulu montaj mühiti ilə doldurulmuş görüntüləmə kamerasına bağlanır. Genişləndirilmiş ExM nümunələri üçün, jeli fiziki olaraq dəstəkləmək üçün nazik örtükdən istifadə edilə bilər, sonra örtük dəstəyi veb resursumuzda yükləmək üçün mövcud olan kiçik 3-D çaplı adapter vasitəsilə çubuğa əlavə edilə bilər. http://expansionmicroscopy.org. Geli örtük arxasına əlavə etmək üçün biz superglue montaj üsulunu tövsiyə edirik, çünki o, geli örtüklə ən güclü şəkildə bağlayır. Poli-L-lizin montajı qısamüddətli görüntüləmə üçün də istifadə oluna bilər, lakin quraşdırma düzgün yerinə yetirilmədikdə (məsələn, vaxtı keçmiş poli-L-lizin, sürətli mərhələ hərəkətləri və ya kifayət qədər su olmaması səbəbindən) gelin ayrılmasını müşahidə etdik. yerləşdirmədən əvvəl geldən çıxarılması). Jeli lamel dayağına quraşdırdıqdan sonra, örtük dayağı superglue ilə adapterə yapışdırıla bilər. Adapter çubuğa mexaniki şəkildə bərkidilməsi üçün çubuğun ucundakı çuxurlara uyğunlaşdırmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur.

Zeiss Z.1 yüngül vərəqli mikroskopda biz yüksək ayırdetməli təsvir üçün adətən 1,0 NA, 20 × uzun iş məsafəsi olan suya batırma obyektivindən istifadə edirik. Şəklin həcmi böyükdürsə və uzun görüntüləmə vaxtı tələb olunursa, nümunənin aşağı rezolyusiyada, sürətli icmalını əldə etmək üçün aşağı böyüdücü məqsədlərdən (5×) istifadə edə bilərik. Z.1 işıq təbəqəli mikroskopu iki kameralı quraşdırma, sürətli təsvir əldə etmə və eyni vaxtda iki rəng kanalını çəkmək qabiliyyəti ilə böyük, çoxrəngli nümunələrin təsviri üçün uyğundur. Bundan əlavə, obyektin uzun işləmə məsafəsi böyük şəffaf nümunələri təsvir etmək üçün istifadə edilə bilər. Z.1 işıq təbəqəsi mikroskopunun bu spesifikasiyası ExM nümunələrinin təsviri üçün xüsusilə əlverişlidir.

Biz ilk olaraq HCR-ExFISH nümunəsinin ~575 × 575 × 160 µm həcmini (üç rəngdə ~6 × 10 10 voksel) təqribən 3 saat ərzində görüntüləməklə bu üstünlükləri nümayiş etdirdik. genişlənmiş toxuma (Şəkil 11D-F Chen et al., 2016). Millimetr diapazonunda daha böyük nümunələr bu sistemlə uğurla təsvir edilmişdir. Belə bir nümunə Şəkil 11G-də göstərilmişdir ki, burada Brainbow 3.0 AAV virusu (Şəkil 5) ilə yoluxmuş siçan hipokampusunun subregionu daha əvvəl təsvir edilən proExM protokolu ilə genişləndirilmişdir. Əvvəlcədən genişləndirmə vahidlərində təsvirin həcmi ~1,5 × 0,8 × 0,1 mm idi və məlumat dəsti 180 fərdi 3-D şəkil yığınının tikilməsini tələb etdi, nəticədə təxminən 60 nm effektiv yanal piksel ölçüsü ilə 5 Terabayt, 0,7 Teravoksel məlumat dəsti əldə edildi. .


Videoya baxın: Korona virusun gedişini izləmək xəritəsi, virus haqqında məlumatlar (Iyul 2022).


Şərhlər:

  1. Mentor

    Təbrik edirəm, bu böyük düşüncə lazımlı olacaq.

  2. Sacage

    Nə yaraşıqlı düşüncə

  3. Arshavir

    İçində bir şey var. Bir izahat üçün təşəkkür edirəm, daha asan, daha yaxşıdır ...



Mesaj yazmaq